JP2003252905A - 架橋ヒアルロン酸 - Google Patents
架橋ヒアルロン酸Info
- Publication number
- JP2003252905A JP2003252905A JP2002052903A JP2002052903A JP2003252905A JP 2003252905 A JP2003252905 A JP 2003252905A JP 2002052903 A JP2002052903 A JP 2002052903A JP 2002052903 A JP2002052903 A JP 2002052903A JP 2003252905 A JP2003252905 A JP 2003252905A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hyaluronic acid
- crosslinked
- cross
- hydroxyl group
- ester bond
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 title claims abstract description 198
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 198
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 title claims abstract description 193
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims abstract description 30
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 23
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 claims abstract description 13
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 4
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002411 adverse Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 abstract description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 22
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 12
- -1 hyaluronic acid oligosaccharides Chemical class 0.000 description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 10
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 10
- 239000012567 medical material Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 8
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 8
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 8
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 8
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 8
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 8
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 8
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 7
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical compound [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 6
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 6
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 6
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 229920002385 Sodium hyaluronate Polymers 0.000 description 5
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 150000002016 disaccharides Chemical group 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- 229940010747 sodium hyaluronate Drugs 0.000 description 5
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 4
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 4
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 3
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 3
- ABFPKTQEQNICFT-UHFFFAOYSA-M 2-chloro-1-methylpyridin-1-ium;iodide Chemical compound [I-].C[N+]1=CC=CC=C1Cl ABFPKTQEQNICFT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical group CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000194048 Streptococcus equi Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N aldehydo-D-glucuronic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-QTBDOELSSA-N 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 238000000569 multi-angle light scattering Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N tetrabutylammonium Chemical class CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000006098 transglycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000005918 transglycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 2
- ZUQUTHURQVDNKF-KEWYIRBNSA-N 1-[(3R,4R,5S,6R)-3-amino-2,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]ethanone Chemical group CC(=O)C1(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1N ZUQUTHURQVDNKF-KEWYIRBNSA-N 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 101000650817 Homo sapiens Semaphorin-4D Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100219325 Phaseolus vulgaris BA13 gene Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027744 Semaphorin-4D Human genes 0.000 description 1
- 241000194022 Streptococcus sp. Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical compound C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 229910003002 lithium salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000002 lithium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010995 multi-dimensional NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000006798 ring closing metathesis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000002522 swelling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 150000004044 tetrasaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒアルロン酸の分子構造の改変に起因する生
体適合性への悪影響が避けられ、実用可能な安定性と品
質管理上の優位性を有する生体適合性材料分野に有用で
ある架橋ヒアルロン酸を提供すること。 【解決手段】 （１）ヒアルロン酸のカルボキシル基が
同一のヒアルロン酸分子の水酸基に、及び／又は別のヒ
アルロン酸分子の水酸基にエステル結合によって架橋し
ていることを特徴とする架橋ヒアルロン酸、（２）ヒア
ルロン酸のカルボキシル基が同一のヒアルロン酸分子の
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位の６位の１級水酸
基に、及び／又は別のヒアルロン酸分子のＮ−アセチル
−Ｄ−グルコサミン単位の６位の１級水酸基にエステル
結合によって架橋していることを特徴とする（１）記載
の架橋ヒアルロン酸を構成とする。
体適合性への悪影響が避けられ、実用可能な安定性と品
質管理上の優位性を有する生体適合性材料分野に有用で
ある架橋ヒアルロン酸を提供すること。 【解決手段】 （１）ヒアルロン酸のカルボキシル基が
同一のヒアルロン酸分子の水酸基に、及び／又は別のヒ
アルロン酸分子の水酸基にエステル結合によって架橋し
ていることを特徴とする架橋ヒアルロン酸、（２）ヒア
ルロン酸のカルボキシル基が同一のヒアルロン酸分子の
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位の６位の１級水酸
基に、及び／又は別のヒアルロン酸分子のＮ−アセチル
−Ｄ−グルコサミン単位の６位の１級水酸基にエステル
結合によって架橋していることを特徴とする（１）記載
の架橋ヒアルロン酸を構成とする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な架橋ヒアル
ロン酸に関する。
ロン酸に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒアルロン酸は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミンとＤ−グルクロン酸が交互にβ−１，４結合
とβ−１，３結合で結合した、二糖単位から形成された
直鎖状の高分子多糖である。ヒアルロン酸は哺乳動物の
結合組織に分布するほか、ニワトリのとさか、連鎖球菌
の夾膜などにも存在が知られている。ニワトリのとさ
か、臍帯等が抽出材料として用いられているほか、連鎖
球菌の培養物からも精製物が調製されている。
ルコサミンとＤ−グルクロン酸が交互にβ−１，４結合
とβ−１，３結合で結合した、二糖単位から形成された
直鎖状の高分子多糖である。ヒアルロン酸は哺乳動物の
結合組織に分布するほか、ニワトリのとさか、連鎖球菌
の夾膜などにも存在が知られている。ニワトリのとさ
か、臍帯等が抽出材料として用いられているほか、連鎖
球菌の培養物からも精製物が調製されている。
【０００３】ヒアルロン酸は、分子量について多分散性
であるが、種及び臓器特異性をもたず、生体に移植また
は注入した場合であっても優れた生体適合性を示すこと
が知られている。さらに、新しい物性を有するヒアルロ
ン酸誘導体を得るために、多種多様な化学修飾、化学架
橋が提案されている。ヒアルロン酸の化学修飾、化学架
橋によってヒアルロン酸の水溶性を制御する技術が多く
報告されており、３次元架橋によるヒアルロン酸ゲルの
形成も知られている。
であるが、種及び臓器特異性をもたず、生体に移植また
は注入した場合であっても優れた生体適合性を示すこと
が知られている。さらに、新しい物性を有するヒアルロ
ン酸誘導体を得るために、多種多様な化学修飾、化学架
橋が提案されている。ヒアルロン酸の化学修飾、化学架
橋によってヒアルロン酸の水溶性を制御する技術が多く
報告されており、３次元架橋によるヒアルロン酸ゲルの
形成も知られている。
【０００４】これらの代表的なものとしては、ジビニル
スルホン、ビスエポキシド類、ホルムアルデヒド等の二
官能性試薬を架橋剤に使用して、得られた高膨潤性の架
橋ヒアルロン酸ゲルを挙げることができる（米国特許第
４，５８２，８６５号明細書、特公平６−３７５７５号
公報、特開平７−９７４０１号公報、特開昭６０−１３
０６０１号公報参照）。
スルホン、ビスエポキシド類、ホルムアルデヒド等の二
官能性試薬を架橋剤に使用して、得られた高膨潤性の架
橋ヒアルロン酸ゲルを挙げることができる（米国特許第
４，５８２，８６５号明細書、特公平６−３７５７５号
公報、特開平７−９７４０１号公報、特開昭６０−１３
０６０１号公報参照）。
【０００５】また、ヒアルロン酸のテトラブチルアンモ
ニウム塩がジメチルスルフォキシド等の有機溶媒に溶解
する特徴を利用したヒアルロン酸の化学的修飾方法が開
示されている（特開平３−１０５００３号）。
ニウム塩がジメチルスルフォキシド等の有機溶媒に溶解
する特徴を利用したヒアルロン酸の化学的修飾方法が開
示されている（特開平３−１０５００３号）。
【０００６】また、共有結合を形成する化学的試薬を使
用しない方法として、ヒアルロン酸とアミノ基あるいは
イミノ基を有する高分子化合物とを、ヒアルロン酸のカ
ルボキシル基と高分子化合物のアミノ基あるいはイミノ
基をイオン複合体として結合させてヒアルロン酸高分子
複合体を調製する方法が開示されている（特開平６−７
３１０３号公報参照）。
用しない方法として、ヒアルロン酸とアミノ基あるいは
イミノ基を有する高分子化合物とを、ヒアルロン酸のカ
ルボキシル基と高分子化合物のアミノ基あるいはイミノ
基をイオン複合体として結合させてヒアルロン酸高分子
複合体を調製する方法が開示されている（特開平６−７
３１０３号公報参照）。
【０００７】二官能性試薬を使用してヒアルロン酸を架
橋する場合、ヒアルロン酸水溶液が低濃度であるため、
架橋効率は著しく低くなる。つまり二官能性試薬のひと
つの反応性基がヒアルロン酸と反応し、もうひとつの反
応性基が未反応のまま残留してしまう。二官能性試薬の
両方の反応性基がヒアルロン酸と反応して架橋が形成さ
れる効率は低くなる。最終的にヒアルロン酸の構造単位
に対する置換度が高い架橋物が得られる。このような架
橋ヒアルロン酸では、ヒアルロン酸の分子構造が持って
いる本来の性質が著しく減じるばかりではなく、化学的
反応性物質の結合量が多くなるため、毒性や生体不適合
性等の危険性を本質的に抱え込まざるをえなくなる。
橋する場合、ヒアルロン酸水溶液が低濃度であるため、
架橋効率は著しく低くなる。つまり二官能性試薬のひと
つの反応性基がヒアルロン酸と反応し、もうひとつの反
応性基が未反応のまま残留してしまう。二官能性試薬の
両方の反応性基がヒアルロン酸と反応して架橋が形成さ
れる効率は低くなる。最終的にヒアルロン酸の構造単位
に対する置換度が高い架橋物が得られる。このような架
橋ヒアルロン酸では、ヒアルロン酸の分子構造が持って
いる本来の性質が著しく減じるばかりではなく、化学的
反応性物質の結合量が多くなるため、毒性や生体不適合
性等の危険性を本質的に抱え込まざるをえなくなる。
【０００８】二官能性試薬による架橋ブリッジを介さず
に架橋ヒアルロン酸を得る方法も提案されている。ヒア
ルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩をジメチルスル
フォキシド中で、トリエチルアミンとヨウ化２−クロロ
−１−メチルピリジニウムを加え反応させ、ヒアルロン
酸のカルボキシル基と水酸基間でエステル結合を形成さ
せる方法も開示されている（欧州特許０３４１７４５Ａ
１）。この方法では、ヒアルロン酸のカルボキシル基を
活性化剤と反応させ活性化エステル中間体を形成し、活
性化エステル中間体が無水環境下でヒアルロン酸の水酸
基と反応し、二官能性試薬による架橋ブリッジを介さな
い内部エステルが形成するとしている。しかし、ヒアル
ロン酸を構成する２糖単位の４種類の水酸基と、ラクト
ン結合を含めてどのような構造のエステル結合が形成さ
れるか明示されていない。
に架橋ヒアルロン酸を得る方法も提案されている。ヒア
ルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩をジメチルスル
フォキシド中で、トリエチルアミンとヨウ化２−クロロ
−１−メチルピリジニウムを加え反応させ、ヒアルロン
酸のカルボキシル基と水酸基間でエステル結合を形成さ
せる方法も開示されている（欧州特許０３４１７４５Ａ
１）。この方法では、ヒアルロン酸のカルボキシル基を
活性化剤と反応させ活性化エステル中間体を形成し、活
性化エステル中間体が無水環境下でヒアルロン酸の水酸
基と反応し、二官能性試薬による架橋ブリッジを介さな
い内部エステルが形成するとしている。しかし、ヒアル
ロン酸を構成する２糖単位の４種類の水酸基と、ラクト
ン結合を含めてどのような構造のエステル結合が形成さ
れるか明示されていない。
【０００９】ヒアルロン酸のカルボキシル基を利用して
エステル結合によって架橋したヒアルロン酸架橋物の生
分解性が良好なことが知られている。活性化試薬として
二または多官能性エポキシドを使用し、ヒアルロン酸の
カルボキシル基とエポキシ基を反応させてエステル結合
を形成する。二官能性試薬による架橋ブリッジを介した
エステル結合による架橋ヒアルロン酸が得られる。この
方法で得られた架橋ヒアルロン酸のリン酸緩衝生理的食
塩水中での分解性が良好なこと、すなわちこのエステル
結合の加水分解性が良好なことが開示されている（特公
平７−１１６２４２公報、特表紹３−５０３５５１公報
参照）。
エステル結合によって架橋したヒアルロン酸架橋物の生
分解性が良好なことが知られている。活性化試薬として
二または多官能性エポキシドを使用し、ヒアルロン酸の
カルボキシル基とエポキシ基を反応させてエステル結合
を形成する。二官能性試薬による架橋ブリッジを介した
エステル結合による架橋ヒアルロン酸が得られる。この
方法で得られた架橋ヒアルロン酸のリン酸緩衝生理的食
塩水中での分解性が良好なこと、すなわちこのエステル
結合の加水分解性が良好なことが開示されている（特公
平７−１１６２４２公報、特表紹３−５０３５５１公報
参照）。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】ヒアルロン酸自体が本
来持っている優れた生体適合性の特徴を最大限生かすた
めに、ヒアルロン酸の構造単位に対する置換度が最小限
で、すなわち架橋効率が高く、生体適合性医用材料とし
て使用可能な安定性を有している、品質管理可能な分子
構造が制御されている架橋ヒアルロン酸は未だ開発され
ていない。
来持っている優れた生体適合性の特徴を最大限生かすた
めに、ヒアルロン酸の構造単位に対する置換度が最小限
で、すなわち架橋効率が高く、生体適合性医用材料とし
て使用可能な安定性を有している、品質管理可能な分子
構造が制御されている架橋ヒアルロン酸は未だ開発され
ていない。
【００１１】本発明者らは、上記目的を達成するため
に、ヒアルロン酸自体の物理化学的性質を鋭意検討して
きた。その結果、新規な（１）ヒアルロン酸のカルボキ
シル基と水酸基にエステル結合によって架橋している架
橋ヒアルロン酸、特に（２）ヒアルロン酸のカルボキシ
ル基が同一のヒアルロン酸分子のＮ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミン単位の６位の１級水酸基に、及び／又は別の
ヒアルロン酸分子のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単
位の６位の１級水酸基にエステル結合によって架橋して
いる架橋ヒアルロン酸が、ヒアルロン酸自体が本来持っ
ている優れた生体適合性の特徴を最大限生かすことので
きる架橋効率が高い、生体適合性医用材料として使用可
能な安定性を有している、品質管理可能な分子構造が制
御されている架橋ヒアルロン酸であることを見出した。
に、ヒアルロン酸自体の物理化学的性質を鋭意検討して
きた。その結果、新規な（１）ヒアルロン酸のカルボキ
シル基と水酸基にエステル結合によって架橋している架
橋ヒアルロン酸、特に（２）ヒアルロン酸のカルボキシ
ル基が同一のヒアルロン酸分子のＮ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミン単位の６位の１級水酸基に、及び／又は別の
ヒアルロン酸分子のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単
位の６位の１級水酸基にエステル結合によって架橋して
いる架橋ヒアルロン酸が、ヒアルロン酸自体が本来持っ
ている優れた生体適合性の特徴を最大限生かすことので
きる架橋効率が高い、生体適合性医用材料として使用可
能な安定性を有している、品質管理可能な分子構造が制
御されている架橋ヒアルロン酸であることを見出した。
【００１２】また、従来法による改質ヒアルロン酸は、
幾多の努力にもかかわらず化学的反応性物質を用いるた
め、新たな改質による毒性や生体不適合性等の危険性を
本質的に抱え込まざるをえないという課題があった。
幾多の努力にもかかわらず化学的反応性物質を用いるた
め、新たな改質による毒性や生体不適合性等の危険性を
本質的に抱え込まざるをえないという課題があった。
【００１３】例えば、化学的修飾・架橋、及び金属塩等
を用いるイオン的方法による、ヒアルロン酸誘導体は、
たとえ生体内の貯留性等を改善できても、改質されたヒ
アルロン酸は架橋物質や金属等を共有結合やイオン結合
でヒアルロン酸の分子中に内包するため、もはや天然ヒ
アルロン酸と構造が異なり、その生理作用や生体適合
性、毒性を含む安全性が本質的にヒアルロン酸と同等で
あるとは言い難く、さらにこれら架橋剤等の残留毒性
や、生体内に於ける分解産物に含まれる架橋剤の安全性
の問題を完全に回避することは難しかった。
を用いるイオン的方法による、ヒアルロン酸誘導体は、
たとえ生体内の貯留性等を改善できても、改質されたヒ
アルロン酸は架橋物質や金属等を共有結合やイオン結合
でヒアルロン酸の分子中に内包するため、もはや天然ヒ
アルロン酸と構造が異なり、その生理作用や生体適合
性、毒性を含む安全性が本質的にヒアルロン酸と同等で
あるとは言い難く、さらにこれら架橋剤等の残留毒性
や、生体内に於ける分解産物に含まれる架橋剤の安全性
の問題を完全に回避することは難しかった。
【００１４】二官能性試薬等の架橋剤を使用しないで、
ヒアルロン酸に架橋構造を導入する方法として、ヒアル
ロン酸自体が有する官能基、つまりカルボキシル基、水
酸基、アセトアミド基を直接結合させる方法がある。こ
の方法で得られる架橋構造はエステル結合とアミド結合
である。分子間エステル結合で形成した架橋構造は、生
体内において加水分解してヒアルロン酸自体の構造に戻
るため、生体適合性の面で有利である。
ヒアルロン酸に架橋構造を導入する方法として、ヒアル
ロン酸自体が有する官能基、つまりカルボキシル基、水
酸基、アセトアミド基を直接結合させる方法がある。こ
の方法で得られる架橋構造はエステル結合とアミド結合
である。分子間エステル結合で形成した架橋構造は、生
体内において加水分解してヒアルロン酸自体の構造に戻
るため、生体適合性の面で有利である。
【００１５】ヒアルロン酸を構成する二糖単位に存在す
る官能基は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのアセト
アミド基、Ｃ−４に結合した２級水酸基とＣ−６に結合
した１級水酸基、Ｄ−グルクロン酸のカルボキシル基、
Ｃ−２に結合した２級水酸基とＣ−３に結合した２級水
酸基である。エステル結合は１種類のカルボキシル基と
４種類の水酸基間で形成することができる。糖環に直接
結合した２級水酸基とカルボキシル基間のエステル結合
は、糖環に直接結合していない１級水酸基間のエステル
結合に比べて不安定である。
る官能基は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのアセト
アミド基、Ｃ−４に結合した２級水酸基とＣ−６に結合
した１級水酸基、Ｄ−グルクロン酸のカルボキシル基、
Ｃ−２に結合した２級水酸基とＣ−３に結合した２級水
酸基である。エステル結合は１種類のカルボキシル基と
４種類の水酸基間で形成することができる。糖環に直接
結合した２級水酸基とカルボキシル基間のエステル結合
は、糖環に直接結合していない１級水酸基間のエステル
結合に比べて不安定である。
【００１６】加水分解等に対して不安定な分子間エステ
ル結合によって架橋した架橋ヒアルロン酸は、最終製品
である医用材料の貯蔵安定性が乏しく、実用上の大きな
障害となる。また安定性の異なる４種類の分子間エステ
ル結合が混在していることは、品質管理上に致命的な問
題を生起し、実用上の大きな障害となる。
ル結合によって架橋した架橋ヒアルロン酸は、最終製品
である医用材料の貯蔵安定性が乏しく、実用上の大きな
障害となる。また安定性の異なる４種類の分子間エステ
ル結合が混在していることは、品質管理上に致命的な問
題を生起し、実用上の大きな障害となる。
【００１７】本発明者らは、本発明で得られた架橋ヒア
ルロン酸が医用材料として理想的な生体適合性を有し、
しかも生体適合性医用材料として使用可能な安定性と、
品質管理可能に分子構造が制御されていることを見出
し、本発明を完成させるに至った。
ルロン酸が医用材料として理想的な生体適合性を有し、
しかも生体適合性医用材料として使用可能な安定性と、
品質管理可能に分子構造が制御されていることを見出
し、本発明を完成させるに至った。
【００１８】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、（１）
ヒアルロン酸のカルボキシル基が同一のヒアルロン酸分
子の水酸基に、及び／又は別のヒアルロン酸分子の水酸
基にエステル結合によって架橋していることを特徴とす
る架橋ヒアルロン酸、（２）ヒアルロン酸のカルボキシ
ル基が同一のヒアルロン酸分子のＮ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミン単位の６位の１級水酸基に、及び／又は別の
ヒアルロン酸分子のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単
位の６位の１級水酸基にエステル結合によって架橋して
いることを特徴とする（１）記載の架橋ヒアルロン酸で
ある。
ヒアルロン酸のカルボキシル基が同一のヒアルロン酸分
子の水酸基に、及び／又は別のヒアルロン酸分子の水酸
基にエステル結合によって架橋していることを特徴とす
る架橋ヒアルロン酸、（２）ヒアルロン酸のカルボキシ
ル基が同一のヒアルロン酸分子のＮ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミン単位の６位の１級水酸基に、及び／又は別の
ヒアルロン酸分子のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単
位の６位の１級水酸基にエステル結合によって架橋して
いることを特徴とする（１）記載の架橋ヒアルロン酸で
ある。
【００１９】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられるヒアルロン酸は、動物組織から抽出
したものでも、また発酵法で製造したものでもその起源
を問うことなく使用できる。発酵法で使用する菌株は自
然界から分離されるストレプトコッカス属等のヒアルロ
ン酸生産能を有する微生物、又は特開昭６３−１２３３
９２号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ
−１００（微工研菌寄第9027号) 、特開平２−２３４６
８９号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ
−３００（微工研菌寄第2319号) のような高収率で安定
にヒアルロン酸を生産する変異株が望ましい。上記の変
異株を用いて培養、精製されたものが用いられる。
本発明に用いられるヒアルロン酸は、動物組織から抽出
したものでも、また発酵法で製造したものでもその起源
を問うことなく使用できる。発酵法で使用する菌株は自
然界から分離されるストレプトコッカス属等のヒアルロ
ン酸生産能を有する微生物、又は特開昭６３−１２３３
９２号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ
−１００（微工研菌寄第9027号) 、特開平２−２３４６
８９号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ
−３００（微工研菌寄第2319号) のような高収率で安定
にヒアルロン酸を生産する変異株が望ましい。上記の変
異株を用いて培養、精製されたものが用いられる。
【００２０】本発明でいう架橋ヒアルロン酸は、ヒアル
ロン酸が架橋構造を保持し、溶媒に可溶性であれば、原
料となるヒアルロン酸よりも分子量が増大している。分
子量は一般的にＧＰＣを使って測定することができる
が、架橋構造を保持している、すなわち分岐構造を有し
ているヒアルロン酸の分子量はＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ（多
角度光散乱）を用いて測定する方が正確である。原料と
して使用するヒアルロン酸の分子量と架橋度を制御する
ことにより、溶媒に対して不溶性の架橋ヒアルロン酸も
得られる。
ロン酸が架橋構造を保持し、溶媒に可溶性であれば、原
料となるヒアルロン酸よりも分子量が増大している。分
子量は一般的にＧＰＣを使って測定することができる
が、架橋構造を保持している、すなわち分岐構造を有し
ているヒアルロン酸の分子量はＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ（多
角度光散乱）を用いて測定する方が正確である。原料と
して使用するヒアルロン酸の分子量と架橋度を制御する
ことにより、溶媒に対して不溶性の架橋ヒアルロン酸も
得られる。
【００２１】本発明でいう架橋ヒアルロン酸の架橋度、
すなわち導入する分子間エステル結合量は、架橋ヒアル
ロン酸の使用目的や要求特性に合わせて任意に制御する
ことができる。エステル結合量は、ヒアルロン酸中のカ
ルボキシル基の全数に対する割合として定義できる。関
節注入剤等ではヒアルロン酸は水溶液として使用され
る。ヒアルロン酸水溶液の粘弾性特性を改善する目的で
水溶性の架橋ヒアルロン酸を調製する場合、原料として
使用するヒアルロン酸の分子量にも左右されるが、導入
する分子間エステル結合量は０．５％未満が好ましい。
すなわち導入する分子間エステル結合量は、架橋ヒアル
ロン酸の使用目的や要求特性に合わせて任意に制御する
ことができる。エステル結合量は、ヒアルロン酸中のカ
ルボキシル基の全数に対する割合として定義できる。関
節注入剤等ではヒアルロン酸は水溶液として使用され
る。ヒアルロン酸水溶液の粘弾性特性を改善する目的で
水溶性の架橋ヒアルロン酸を調製する場合、原料として
使用するヒアルロン酸の分子量にも左右されるが、導入
する分子間エステル結合量は０．５％未満が好ましい。
【００２２】溶媒に不溶性の架橋ヒアルロン酸の場合、
原料として使用するヒアルロン酸の分子量にも左右され
るが、導入する分子間エステル結合量は１％未満が好ま
しい。導入する分子間エステル結合量が１％以上では、
不十分な膨潤特性の架橋ヒアルロン酸となり、ヒアルロ
ン酸本来の特性が発現し難くなる。
原料として使用するヒアルロン酸の分子量にも左右され
るが、導入する分子間エステル結合量は１％未満が好ま
しい。導入する分子間エステル結合量が１％以上では、
不十分な膨潤特性の架橋ヒアルロン酸となり、ヒアルロ
ン酸本来の特性が発現し難くなる。
【００２３】本発明でいう架橋ヒアルロン酸の分子構造
はＮＭＲを使って確かめることができる。ヒアルロン酸
自体の分子構造はＮＭＲを使って、その末端基まで含め
て詳しく解析されている（Carbohydr.Res.Vol245,p113-
128,1993、Macromolecules Vol29,p2894-2902,1996）。
ヒアルロン酸の修飾や架橋によってヒアルロン酸の構造
が改変された場合、スペクトル上の新規のピークを、多
次元ＮＭＲ等の各種手法を用いて帰属し、構造を決定す
ることができる。構造が改変された割合が小さく、その
検出が難しい場合、酵素分解等の分子構造に対する認識
性の大きい分解反応を利用して、検出目的の構造を濃縮
してから解析することもできる。
はＮＭＲを使って確かめることができる。ヒアルロン酸
自体の分子構造はＮＭＲを使って、その末端基まで含め
て詳しく解析されている（Carbohydr.Res.Vol245,p113-
128,1993、Macromolecules Vol29,p2894-2902,1996）。
ヒアルロン酸の修飾や架橋によってヒアルロン酸の構造
が改変された場合、スペクトル上の新規のピークを、多
次元ＮＭＲ等の各種手法を用いて帰属し、構造を決定す
ることができる。構造が改変された割合が小さく、その
検出が難しい場合、酵素分解等の分子構造に対する認識
性の大きい分解反応を利用して、検出目的の構造を濃縮
してから解析することもできる。
【００２４】ヒアルロン酸を分解する酵素は、放線菌由
来ヒアルロニダーゼや羊睾丸由来ヒアルロンダーゼ等多
種類存在する。ヒアルロン酸の主鎖の分解部位が使用す
る酵素の種類によって異なることが知られている。羊睾
丸由来ヒアルロンダーゼで分解したヒアルロン酸オリゴ
糖では、生成する末端基の構造まで含めて構造が解析さ
れている。ヒアルロン酸の酵素分解では、分解条件によ
ってトランスグリコシレーションが起こることが知られ
ている。トランスグリコシレーションを避けるために、
ヒアルロン酸水溶液のｐＨを低く調製する必要がある(T
he Journal Biological Chemistry.Vol. 270 ,p3741-37
47,1995)。
来ヒアルロニダーゼや羊睾丸由来ヒアルロンダーゼ等多
種類存在する。ヒアルロン酸の主鎖の分解部位が使用す
る酵素の種類によって異なることが知られている。羊睾
丸由来ヒアルロンダーゼで分解したヒアルロン酸オリゴ
糖では、生成する末端基の構造まで含めて構造が解析さ
れている。ヒアルロン酸の酵素分解では、分解条件によ
ってトランスグリコシレーションが起こることが知られ
ている。トランスグリコシレーションを避けるために、
ヒアルロン酸水溶液のｐＨを低く調製する必要がある(T
he Journal Biological Chemistry.Vol. 270 ,p3741-37
47,1995)。
【００２５】本発明でいう架橋ヒアルロン酸はラクトン
結合を含まない。ラクトン結合はエステル結合の一種で
ある。ラクトン結合は閉環によるひずみを持ったエステ
ル結合であり、赤外線吸収スペクトルで観測されるカル
ボニルの伸縮振動が、ひずみを持たないエステル結合に
比べて高波数側へシフトしていることが知られている。
本発明でいう架橋ヒアルロン酸では、ひずみを持ったエ
ステル結合は、赤外線吸収スペクトルで観測されない。
結合を含まない。ラクトン結合はエステル結合の一種で
ある。ラクトン結合は閉環によるひずみを持ったエステ
ル結合であり、赤外線吸収スペクトルで観測されるカル
ボニルの伸縮振動が、ひずみを持たないエステル結合に
比べて高波数側へシフトしていることが知られている。
本発明でいう架橋ヒアルロン酸では、ひずみを持ったエ
ステル結合は、赤外線吸収スペクトルで観測されない。
【００２６】本発明に用いられるヒアルロン酸は、動物
組織抽出又は発酵法で得られた高分子精製品でも、更に
加水分解処理等をして得た低分子量のものでも同様に好
ましく使用できる。なお、本発明にいうヒアルロン酸
は、そのアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム、カリウ
ム、リチウムの塩をも包含する概念で使用される。
組織抽出又は発酵法で得られた高分子精製品でも、更に
加水分解処理等をして得た低分子量のものでも同様に好
ましく使用できる。なお、本発明にいうヒアルロン酸
は、そのアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム、カリウ
ム、リチウムの塩をも包含する概念で使用される。
【００２７】本発明に用いられるヒアルロン酸の水溶液
は、ヒアルロン酸の粉末と水を混合し、撹拌して得られ
る。
は、ヒアルロン酸の粉末と水を混合し、撹拌して得られ
る。
【００２８】本発明では、温和な反応条件でエステル化
することにより、エステル化反応の選択性を向上させて
いる。ヨウ化２−クロロ−１−メチルピリジニウム等の
活性化剤を使用した活性化エステル中間体は反応性が強
いため、ヒアルロン酸を構成する２糖単位の４種類の水
酸基に対する反応の選択性がない。よって、ひずみを持
ったエステル結合まで形成されてしまう。
することにより、エステル化反応の選択性を向上させて
いる。ヨウ化２−クロロ−１−メチルピリジニウム等の
活性化剤を使用した活性化エステル中間体は反応性が強
いため、ヒアルロン酸を構成する２糖単位の４種類の水
酸基に対する反応の選択性がない。よって、ひずみを持
ったエステル結合まで形成されてしまう。
【００２９】温和な反応条件でエステル化することによ
り、エステル化反応以外の副反応を抑制することができ
る。ヒアルロン酸は容易に主鎖切断反応によって低分子
量化する。加水分解による主鎖切断反応は、中性と比較
して酸性やアルカリ性で著しく促進される。ラジカル分
解によって、主鎖切断が著しく促進されることも知られ
ている。加熱によってこれらの反応は更に促進される。
副反応による低分子量化は結果的に架橋効率の低下を引
き起こす。
り、エステル化反応以外の副反応を抑制することができ
る。ヒアルロン酸は容易に主鎖切断反応によって低分子
量化する。加水分解による主鎖切断反応は、中性と比較
して酸性やアルカリ性で著しく促進される。ラジカル分
解によって、主鎖切断が著しく促進されることも知られ
ている。加熱によってこれらの反応は更に促進される。
副反応による低分子量化は結果的に架橋効率の低下を引
き起こす。
【００３０】本発明では、ヒアルロン酸水溶液を酸性に
調整し、解離しているカルボキシル基を酸型に変換して
架橋ヒアルロン酸を得る。ヒアルロン酸水溶液を酸性に
調製し加熱する方法が、低分子量ヒアルロン酸の調製方
法として開示されている。（特開平１−２６６１０２公
報参照）ヒアルロン酸水溶液を酸性で加熱すると、Ｎ−
アセチル−Ｄ−グルコサミン単位の脱アセチル化反応も
起こることが記載されている。
調整し、解離しているカルボキシル基を酸型に変換して
架橋ヒアルロン酸を得る。ヒアルロン酸水溶液を酸性に
調製し加熱する方法が、低分子量ヒアルロン酸の調製方
法として開示されている。（特開平１−２６６１０２公
報参照）ヒアルロン酸水溶液を酸性で加熱すると、Ｎ−
アセチル−Ｄ−グルコサミン単位の脱アセチル化反応も
起こることが記載されている。
【００３１】分子間エステル化反応による架橋形成と競
争する、酸加水分解による低分子量化を抑制するために
は、反応温度を低くすることが必要になる。架橋形成を
優先させる反応温度としては、室温以下が好ましく、更
に好ましい反応温度は１０℃以下である。
争する、酸加水分解による低分子量化を抑制するために
は、反応温度を低くすることが必要になる。架橋形成を
優先させる反応温度としては、室温以下が好ましく、更
に好ましい反応温度は１０℃以下である。
【００３２】分子間エステル化反応を促進するために
は、ヒアルロン酸濃度を高くする必要がある。脱水縮合
によるエステル化反応が平衡反応であることからも、反
応系中に存在する水の量を減ずるため、ヒアルロン酸濃
度を高くする必要がある。ヒアルロン酸濃度は５質量％
以上が好ましく、更に好ましくは１０質量％以上であ
る。
は、ヒアルロン酸濃度を高くする必要がある。脱水縮合
によるエステル化反応が平衡反応であることからも、反
応系中に存在する水の量を減ずるため、ヒアルロン酸濃
度を高くする必要がある。ヒアルロン酸濃度は５質量％
以上が好ましく、更に好ましくは１０質量％以上であ
る。
【００３３】反応系に脱水縮合反応を触媒する物質を添
加することは、分子間エステル化反応を促進するために
重要である。脱水縮合反応を促進する触媒としては、酸
性触媒が一般的であり、硫酸、塩酸や芳香族スルホン酸
誘導体等が使用できる。
加することは、分子間エステル化反応を促進するために
重要である。脱水縮合反応を促進する触媒としては、酸
性触媒が一般的であり、硫酸、塩酸や芳香族スルホン酸
誘導体等が使用できる。
【００３４】架橋度は、反応温度、ヒアルロン酸濃度、
添加する脱水縮合触媒の種類及び量と共に、反応時間で
制御できる。
添加する脱水縮合触媒の種類及び量と共に、反応時間で
制御できる。
【００３５】得られた架橋ヒアルロン酸は、ヒアルロン
酸の酸加水分解を避けるために、酸性に調整するために
用いた酸等の成分を除く必要がある。酸等の成分を除く
ためには、通常は水性溶媒による洗浄もしくは透析を行
う。架橋ヒアルロン酸の機能を損なわないものであれば
特に制限はないが、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩
衝液等が用いられるが、好ましくは、生理食塩水、リン
酸緩衝液等が用いられる。
酸の酸加水分解を避けるために、酸性に調整するために
用いた酸等の成分を除く必要がある。酸等の成分を除く
ためには、通常は水性溶媒による洗浄もしくは透析を行
う。架橋ヒアルロン酸の機能を損なわないものであれば
特に制限はないが、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩
衝液等が用いられるが、好ましくは、生理食塩水、リン
酸緩衝液等が用いられる。
【００３６】洗浄された架橋ヒアルロン酸に酸型のカル
ボキシル基が残っている場合には、ヒアルロン酸の酸加
水分解を避けるために、ナトリウム型等に塩化する必要
がある。水酸化ナトリウム水溶液で架橋ヒアルロン酸水
溶液のｐＨを７に調製するか、架橋ヒアルロン酸を生理
的食塩水やリン酸緩衝生理的食塩水に浸漬することで塩
化することができる。
ボキシル基が残っている場合には、ヒアルロン酸の酸加
水分解を避けるために、ナトリウム型等に塩化する必要
がある。水酸化ナトリウム水溶液で架橋ヒアルロン酸水
溶液のｐＨを７に調製するか、架橋ヒアルロン酸を生理
的食塩水やリン酸緩衝生理的食塩水に浸漬することで塩
化することができる。
【００３７】この洗浄、塩化された架橋ヒアルロン酸
は、その使用目的に応じて、溶液状、溶媒中に浸漬した
状態、溶媒を含ませた湿潤状態、風乾、減圧乾燥あるい
は凍結乾燥等の処理を経た乾燥状態で医用材料として供
される。
は、その使用目的に応じて、溶液状、溶媒中に浸漬した
状態、溶媒を含ませた湿潤状態、風乾、減圧乾燥あるい
は凍結乾燥等の処理を経た乾燥状態で医用材料として供
される。
【００３８】医用材料として用いるためには、生体適合
性が高いことが必須であり、一般的に細胞毒性がないこ
とを証明する必要がある。本発明の架橋ヒアルロン酸
は、これらの条件を十分に満たすものであり、生体分解
性医用材料としてまたヒアルロン酸が用いられる分野で
あれば特に制限なく使用することができる。例えば、癒
着防止材、関節注入剤、軟質組織注入剤、代用硝子体、
化粧料、診断・治療に用いる医療器具・医療用具等の生
物医学的製品又は医薬組成物への使用が挙げられる。
性が高いことが必須であり、一般的に細胞毒性がないこ
とを証明する必要がある。本発明の架橋ヒアルロン酸
は、これらの条件を十分に満たすものであり、生体分解
性医用材料としてまたヒアルロン酸が用いられる分野で
あれば特に制限なく使用することができる。例えば、癒
着防止材、関節注入剤、軟質組織注入剤、代用硝子体、
化粧料、診断・治療に用いる医療器具・医療用具等の生
物医学的製品又は医薬組成物への使用が挙げられる。
【００３９】架橋ヒアルロン酸及びその成形加工品は、
単一形態での使用は当然ながら、異なる架橋ヒアルロン
酸の形態との混合又は併用、更にヒアルロン酸溶液との
混合又は併用による組合せ処方により効果の増強が期待
できる。
単一形態での使用は当然ながら、異なる架橋ヒアルロン
酸の形態との混合又は併用、更にヒアルロン酸溶液との
混合又は併用による組合せ処方により効果の増強が期待
できる。
【００４０】医用材料として用いるために、ヒアルロン
酸と同様に生体適合性に優れる材料、例えば、コンドロ
イチン硫酸、カルボキシメチルセルロース等を架橋ヒア
ルロン酸に添加することができる。これらの材料を架橋
ヒアルロン酸を形成させる反応中で、混合、複合化する
こともできるものであり、何ら制限されないものであ
る。また、架橋ヒアルロン酸に、薬学的又は生理学的に
活性な物質を添加して、これらを含有する架橋ヒアルロ
ン酸を調製させることもできるものであり、何ら制限さ
れないものである。
酸と同様に生体適合性に優れる材料、例えば、コンドロ
イチン硫酸、カルボキシメチルセルロース等を架橋ヒア
ルロン酸に添加することができる。これらの材料を架橋
ヒアルロン酸を形成させる反応中で、混合、複合化する
こともできるものであり、何ら制限されないものであ
る。また、架橋ヒアルロン酸に、薬学的又は生理学的に
活性な物質を添加して、これらを含有する架橋ヒアルロ
ン酸を調製させることもできるものであり、何ら制限さ
れないものである。
【００４１】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳しく説明
する。なお、本発明はこれにより限定されるものではな
い。
する。なお、本発明はこれにより限定されるものではな
い。
【００４２】実施例１
分子量が２．８×１０4 ダルトンのヒアルロン酸ナトリ
ウムを蒸留水に溶解し、６．０質量％のヒアルロン酸の
水溶液を調整した。調整されたヒアルロン酸の水溶液の
ｐＨは、６．０であった。この水溶液のｐＨを、１Ｎ塩
酸でｐＨ１．２に調整した。ヒアルロン酸の酸性水溶液
５０ｍｌを−２０℃に設定した冷凍庫に入れた。１５０
日間凍結した後、２５℃で解凍した。その結果、架橋ヒ
アルロン酸が得られた。架橋ヒアルロン酸の酸性水溶液
を０．２ＮのＮａＯＨ水溶液でｐＨ７．０に中和した。
中和したヒアルロン酸水溶液を凍結乾燥し、架橋ヒアル
ロン酸を回収した。分子量は８．７×１０4であった。
ウムを蒸留水に溶解し、６．０質量％のヒアルロン酸の
水溶液を調整した。調整されたヒアルロン酸の水溶液の
ｐＨは、６．０であった。この水溶液のｐＨを、１Ｎ塩
酸でｐＨ１．２に調整した。ヒアルロン酸の酸性水溶液
５０ｍｌを−２０℃に設定した冷凍庫に入れた。１５０
日間凍結した後、２５℃で解凍した。その結果、架橋ヒ
アルロン酸が得られた。架橋ヒアルロン酸の酸性水溶液
を０．２ＮのＮａＯＨ水溶液でｐＨ７．０に中和した。
中和したヒアルロン酸水溶液を凍結乾燥し、架橋ヒアル
ロン酸を回収した。分子量は８．７×１０4であった。
【００４３】実施例２
分子量が２．０×１０6ダルトンのヒアルロン酸ナトリ
ウムを蒸留水に溶解し、１．０質量％のヒアルロン酸の
水溶液を調整した。調整されたヒアルロン酸の水溶液の
ｐＨは、６．０であった。この水溶液のｐＨを、１Ｎ硝
酸でｐＨ１．５に調整した。ヒアルロン酸の酸性水溶液
５０ｍｌを凍結乾燥した。得られた乾燥体を冷蔵庫に一
晩放置した。溶媒に不溶化した架橋ヒアルロン酸が得ら
れていた。得られた架橋ヒアルロン酸を蒸留水で水洗
し、続いて生理的食塩水に５０ｍＭ濃度でリン酸緩衝成
分を加えてｐＨ７に調整したリン酸緩衝生理的食塩水に
浸漬、洗浄し、続いて蒸留水で洗浄した。乾燥して架橋
ヒアルロン酸を回収した。
ウムを蒸留水に溶解し、１．０質量％のヒアルロン酸の
水溶液を調整した。調整されたヒアルロン酸の水溶液の
ｐＨは、６．０であった。この水溶液のｐＨを、１Ｎ硝
酸でｐＨ１．５に調整した。ヒアルロン酸の酸性水溶液
５０ｍｌを凍結乾燥した。得られた乾燥体を冷蔵庫に一
晩放置した。溶媒に不溶化した架橋ヒアルロン酸が得ら
れていた。得られた架橋ヒアルロン酸を蒸留水で水洗
し、続いて生理的食塩水に５０ｍＭ濃度でリン酸緩衝成
分を加えてｐＨ７に調整したリン酸緩衝生理的食塩水に
浸漬、洗浄し、続いて蒸留水で洗浄した。乾燥して架橋
ヒアルロン酸を回収した。
【００４４】実施例３
実施例１で得られた架橋ヒアルロン酸と原料として使用
したヒアルロン酸ナトリウムのＨ1−ＮＭＲとＣ13−Ｎ
ＭＲを測定した。ＮＭＲの測定は日本電子社製ＪＮＭα
−５００を使用して行った。測定溶媒は０．１５ＭのＮ
ａＣｌと２０ｍＭのリン酸緩衝成分（ｐＤ＝６．５）を
溶解した重水を使用した。
したヒアルロン酸ナトリウムのＨ1−ＮＭＲとＣ13−Ｎ
ＭＲを測定した。ＮＭＲの測定は日本電子社製ＪＮＭα
−５００を使用して行った。測定溶媒は０．１５ＭのＮ
ａＣｌと２０ｍＭのリン酸緩衝成分（ｐＤ＝６．５）を
溶解した重水を使用した。
【００４５】架橋ヒアルロン酸のＨ1−ＮＭＲとＣ13−
ＮＭＲのスペクトルは、原料として使用したヒアルロン
酸ナトリウムのスペクトルと完全に一致した。すなわち
架橋ヒアルロン酸の架橋点の構造と架橋ヒアルロン酸を
調製する反応中の副反応に起因する構造変化は検出され
ていない。ヒアルロン酸を対象とするＮＭＲ測定の検出
感度は、ヒアルロン酸の２糖構造単位に対して約１モル
％である。架橋ヒアルロン酸に存在する微量の架橋点の
構造を検出するため、架橋点を濃縮する必要がある。
ＮＭＲのスペクトルは、原料として使用したヒアルロン
酸ナトリウムのスペクトルと完全に一致した。すなわち
架橋ヒアルロン酸の架橋点の構造と架橋ヒアルロン酸を
調製する反応中の副反応に起因する構造変化は検出され
ていない。ヒアルロン酸を対象とするＮＭＲ測定の検出
感度は、ヒアルロン酸の２糖構造単位に対して約１モル
％である。架橋ヒアルロン酸に存在する微量の架橋点の
構造を検出するため、架橋点を濃縮する必要がある。
【００４６】実施例４
架橋ヒアルロン酸の酵素分解
実施例１で得られた架橋ヒアルロン酸２．０ｇを０．１
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、ＮａＣｌ０．１５Ｍ）４０
ｍｌに溶解した。この溶液を無菌的に０．２μｍのメン
ブランフィルターでろ過した。ヒアルロニダーゼ（シグ
マ、タイプ５、約３０００単位／ｍｇ）８０ｍｇを０．
１Ｍ酢酸緩衝液に溶解し、無菌的に加えた。４０℃で４
０時間攪拌後、冷却し、酵素分解物溶液を得た。
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、ＮａＣｌ０．１５Ｍ）４０
ｍｌに溶解した。この溶液を無菌的に０．２μｍのメン
ブランフィルターでろ過した。ヒアルロニダーゼ（シグ
マ、タイプ５、約３０００単位／ｍｇ）８０ｍｇを０．
１Ｍ酢酸緩衝液に溶解し、無菌的に加えた。４０℃で４
０時間攪拌後、冷却し、酵素分解物溶液を得た。
【００４７】比較例１
ヒアルロン酸の酵素分解
分子量が２．８×１０4 ダルトンのヒアルロン酸ナトリ
ウムを０．２ｇを０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、Ｎ
ａＣｌ０．１５Ｍ）４ｍｌに溶解した。この溶液を無菌
的に０．２μｍのメンブランフィルターでろ過した。ヒ
アルロニダーゼ（シグマ、タイプ５、約３０００単位／
ｍｇ）８ｍｇを０．１Ｍ酢酸緩衝液に溶解し、無菌的に
加えた。４０℃で４０時間攪拌後、冷却し、酵素分解物
溶液を得た。
ウムを０．２ｇを０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、Ｎ
ａＣｌ０．１５Ｍ）４ｍｌに溶解した。この溶液を無菌
的に０．２μｍのメンブランフィルターでろ過した。ヒ
アルロニダーゼ（シグマ、タイプ５、約３０００単位／
ｍｇ）８ｍｇを０．１Ｍ酢酸緩衝液に溶解し、無菌的に
加えた。４０℃で４０時間攪拌後、冷却し、酵素分解物
溶液を得た。
【００４８】実施例５
架橋ヒアルロン酸の加水分解
実施例１で得られた架橋ヒアルロン酸２５ｍｇを０．１
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、ＮａＣｌ０．１５Ｍ）０．
５ｍｌに溶解した。この溶液に酵素を添加せず、４０℃
で４０時間放置し、冷却した。この溶液中の架橋ヒアル
ロン酸の分子量は８．４×１０4であった。すなわち、
架橋ヒアルロン酸の加水分解は、実施例４の酵素分解条
件下ではほとんど起こらないことがわかる。
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、ＮａＣｌ０．１５Ｍ）０．
５ｍｌに溶解した。この溶液に酵素を添加せず、４０℃
で４０時間放置し、冷却した。この溶液中の架橋ヒアル
ロン酸の分子量は８．４×１０4であった。すなわち、
架橋ヒアルロン酸の加水分解は、実施例４の酵素分解条
件下ではほとんど起こらないことがわかる。
【００４９】実施例６
酵素分解物の分子サイズ測定
実施例４と比較例１で得られた酵素分解物の分子サイズ
は、ＧＰＣを使って測定した。ＧＰＣカラムとして昭和
電工社製ＳＢ８０２．５ＨＱを１本使用し、示差屈折率
検出器として日本分光社製８３０−ＲＩを使用して、溶
媒硝酸ナトリウムの０．２Ｍ水溶液、測定温度４０℃、
流速０．６ｍｌ／分で測定した。測定結果を図１に示
す。
は、ＧＰＣを使って測定した。ＧＰＣカラムとして昭和
電工社製ＳＢ８０２．５ＨＱを１本使用し、示差屈折率
検出器として日本分光社製８３０−ＲＩを使用して、溶
媒硝酸ナトリウムの０．２Ｍ水溶液、測定温度４０℃、
流速０．６ｍｌ／分で測定した。測定結果を図１に示
す。
【００５０】図１の結果から、ヒアルロン酸の酵素分解
物では６糖、４糖、２糖単位のオリゴ糖の混合物が生成
しているのに対して、架橋ヒアルロン酸の酵素分解物で
は６糖単位よりも分子サイズの大きいオリゴ糖が存在し
ていることがわかる。架橋ヒアルロン酸の架橋点の立体
的構造は、直鎖構造を有するヒアルロン酸の立体的構造
と異なるため、ヒアルロニダーゼによる分解が６糖単位
以下の分子サイズまで進行しない。
物では６糖、４糖、２糖単位のオリゴ糖の混合物が生成
しているのに対して、架橋ヒアルロン酸の酵素分解物で
は６糖単位よりも分子サイズの大きいオリゴ糖が存在し
ていることがわかる。架橋ヒアルロン酸の架橋点の立体
的構造は、直鎖構造を有するヒアルロン酸の立体的構造
と異なるため、ヒアルロニダーゼによる分解が６糖単位
以下の分子サイズまで進行しない。
【００５１】実施例７
架橋ヒアルロン酸由来の分子サイズの大きいオリゴ糖の
精製 実施例４で得られた酵素分解物溶液を０．２μｍメンブ
ランフィルターで濾過した。この溶液約４０ｍｌに、塩
化ナトリウム１．２ｇを加え、更にエタノール約１５０
ｍｌを攪拌下で滴下した。得られた析出物をろ別し、硝
酸ナトリウムの０．２Ｍ水溶液３０ｍｌに溶解した。不
溶化したヒアルロニダーゼをろ別し、溶液を回収した。
ＧＰＣカラムとして昭和電工社製ＳＢ２００２．５ＨＱ
を１本使用し、日本分析工業社製ＬＣ−９０８を使用し
て、溶媒硝酸ナトリウムの０．５Ｍ水溶液、室温、流速
２．０ｍｌ／分、サンプル注入量１ｍｌで分取精製し
た。分取ＧＰＣクロマトグラムを図２に示す。１９．０
〜２０．５分を分子サイズの大きいオリゴ糖として分取
した。分取溶液は０．２μｍメンブランフィルターでろ
過した。分取溶液に対して、５倍容積のエタノールを加
えて、分子サイズの大きいオリゴ糖を析出させた。析出
物を重水に溶解し、凍結乾燥して回収した。
精製 実施例４で得られた酵素分解物溶液を０．２μｍメンブ
ランフィルターで濾過した。この溶液約４０ｍｌに、塩
化ナトリウム１．２ｇを加え、更にエタノール約１５０
ｍｌを攪拌下で滴下した。得られた析出物をろ別し、硝
酸ナトリウムの０．２Ｍ水溶液３０ｍｌに溶解した。不
溶化したヒアルロニダーゼをろ別し、溶液を回収した。
ＧＰＣカラムとして昭和電工社製ＳＢ２００２．５ＨＱ
を１本使用し、日本分析工業社製ＬＣ−９０８を使用し
て、溶媒硝酸ナトリウムの０．５Ｍ水溶液、室温、流速
２．０ｍｌ／分、サンプル注入量１ｍｌで分取精製し
た。分取ＧＰＣクロマトグラムを図２に示す。１９．０
〜２０．５分を分子サイズの大きいオリゴ糖として分取
した。分取溶液は０．２μｍメンブランフィルターでろ
過した。分取溶液に対して、５倍容積のエタノールを加
えて、分子サイズの大きいオリゴ糖を析出させた。析出
物を重水に溶解し、凍結乾燥して回収した。
【００５２】比較例２
ヒアルロン酸オリゴ糖の精製
実施例７で分取ＧＰＣクロマトグラムの２３．０〜２
３．５分をヒアルロン酸オリゴ糖として分取した。分取
溶液は０．２μｍメンブランフィルターでろ過した。分
取溶液に対して、５倍容積のエタノールを加えて、ヒア
ルロン酸オリゴ糖を析出させた。析出物を重水に溶解
し、凍結乾燥して回収した。
３．５分をヒアルロン酸オリゴ糖として分取した。分取
溶液は０．２μｍメンブランフィルターでろ過した。分
取溶液に対して、５倍容積のエタノールを加えて、ヒア
ルロン酸オリゴ糖を析出させた。析出物を重水に溶解
し、凍結乾燥して回収した。
【００５３】実施例８
架橋点成分のＮＭＲ測定
実施例７で回収した分子サイズの大きいオリゴ糖と比較
例２で回収したヒアルロン酸オリゴ糖を、実施例２で使
用した溶媒に溶解してＮＭＲの測定を行った。化学シフ
トはＴＳＰを基準物質とした。測定結果を図３及び図４
に示す。すなわち、分子サイズの大きいオリゴ糖のＣ13
−ＮＭＲスペクトルを図３に、ヒアルロン酸オリゴ糖の
Ｃ13−ＮＭＲスペクトルを図４に示した。
例２で回収したヒアルロン酸オリゴ糖を、実施例２で使
用した溶媒に溶解してＮＭＲの測定を行った。化学シフ
トはＴＳＰを基準物質とした。測定結果を図３及び図４
に示す。すなわち、分子サイズの大きいオリゴ糖のＣ13
−ＮＭＲスペクトルを図３に、ヒアルロン酸オリゴ糖の
Ｃ13−ＮＭＲスペクトルを図４に示した。
【００５４】図３と図４のＣ13−ＮＭＲスペクトルの結
果から、分子サイズの大きいオリゴ糖ではヒアルロン酸
オリゴ糖に見られない小強度のピークが多数存在してい
る。ここで主ピークから大きくシフトしているピークは
１７１ｐｐｍと６７ｐｐｍのピークである。この両者の
ピークは、ヒアルロン酸のＤ−グルクロン酸単位のカル
ボキシル基とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位の１
級水酸基間のエステル結合の形成により主ピークからシ
フトし、それぞれエステル結合したＤ−グルクロン酸単
位のＣ−６とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位のＣ
−６に帰属される。１７１ｐｐｍと６７ｐｐｍ以外の小
強度のピークは、エステル結合の導入に伴う遠隔効果に
より主ピークから分離したピークである。すなわち、本
発明の架橋ヒアルロン酸はヒアルロン酸のＤ−グルクロ
ン酸単位のカルボキシル基とＮ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミン単位の１級水酸基間の選択的なエステル結合の形
成により架橋していることがわかる。図４のＣ13−ＮＭ
Ｒスペクトルの結果は、Carbohydr. Res. Vol245,p113-
128,1993記載のヒアルロン酸オリゴ糖のＣ13−ＮＭＲス
ペクトルと一致している。
果から、分子サイズの大きいオリゴ糖ではヒアルロン酸
オリゴ糖に見られない小強度のピークが多数存在してい
る。ここで主ピークから大きくシフトしているピークは
１７１ｐｐｍと６７ｐｐｍのピークである。この両者の
ピークは、ヒアルロン酸のＤ−グルクロン酸単位のカル
ボキシル基とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位の１
級水酸基間のエステル結合の形成により主ピークからシ
フトし、それぞれエステル結合したＤ−グルクロン酸単
位のＣ−６とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位のＣ
−６に帰属される。１７１ｐｐｍと６７ｐｐｍ以外の小
強度のピークは、エステル結合の導入に伴う遠隔効果に
より主ピークから分離したピークである。すなわち、本
発明の架橋ヒアルロン酸はヒアルロン酸のＤ−グルクロ
ン酸単位のカルボキシル基とＮ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミン単位の１級水酸基間の選択的なエステル結合の形
成により架橋していることがわかる。図４のＣ13−ＮＭ
Ｒスペクトルの結果は、Carbohydr. Res. Vol245,p113-
128,1993記載のヒアルロン酸オリゴ糖のＣ13−ＮＭＲス
ペクトルと一致している。
【００５５】実施例９
実施例２で得られた架橋ヒアルロン酸を実施例２記載の
リン酸緩衝生理的食塩水に入れ、室温で２日間放置し、
十分膨潤させた。膨潤した架橋ヒアルロン酸を蒸留水で
洗浄し、実施例４記載の溶媒５０ｍｌに膨潤させた。ア
ジ化ナトリウムを１０ｍｇ加えた。実施例４記載のヒア
ルロニダーゼ３０ｍｇを加え、４０℃で４０時間攪拌
後、冷却し、酵素分解物溶液を得た。この溶液から実施
例７と同じ方法で分子サイズの大きいオリゴ糖を回収
し、実施例８と同様にＣ13−ＮＭＲを測定した。図３と
同じパターンのスペクトルが得られた。すなわち、実施
例２で得られた架橋ヒアルロン酸もヒアルロン酸のＤ−
グルクロン酸単位のカルボキシル基とＤ−Ｎ−アセチル
グルコサミン単位の１級水酸基間の選択的なエステル結
合の形成により架橋していることがわかる。
リン酸緩衝生理的食塩水に入れ、室温で２日間放置し、
十分膨潤させた。膨潤した架橋ヒアルロン酸を蒸留水で
洗浄し、実施例４記載の溶媒５０ｍｌに膨潤させた。ア
ジ化ナトリウムを１０ｍｇ加えた。実施例４記載のヒア
ルロニダーゼ３０ｍｇを加え、４０℃で４０時間攪拌
後、冷却し、酵素分解物溶液を得た。この溶液から実施
例７と同じ方法で分子サイズの大きいオリゴ糖を回収
し、実施例８と同様にＣ13−ＮＭＲを測定した。図３と
同じパターンのスペクトルが得られた。すなわち、実施
例２で得られた架橋ヒアルロン酸もヒアルロン酸のＤ−
グルクロン酸単位のカルボキシル基とＤ−Ｎ−アセチル
グルコサミン単位の１級水酸基間の選択的なエステル結
合の形成により架橋していることがわかる。
【００５６】
【発明の効果】以上、本発明によって得られた架橋ヒア
ルロン酸は、ヒアルロン酸の分子構造の改変に起因する
生体適合性への悪影響が避けられ、実用可能な安定性と
品質管理上の優位性を有するため、生体適合性材料分野
に有用である。
ルロン酸は、ヒアルロン酸の分子構造の改変に起因する
生体適合性への悪影響が避けられ、実用可能な安定性と
品質管理上の優位性を有するため、生体適合性材料分野
に有用である。
【図１】実施例４記載の架橋ヒアルロン酸の酵素分解物
と比較例１記載のヒアルロン酸の酵素分解物のＧＰＣク
ロマトグラムである。
と比較例１記載のヒアルロン酸の酵素分解物のＧＰＣク
ロマトグラムである。
【図２】実施例４記載の架橋ヒアルロン酸の酵素分解物
の分取ＧＰＣクロマトグラムである。
の分取ＧＰＣクロマトグラムである。
【図３】実施例７で回収した分子サイズの大きいオリゴ
糖のＣ13−ＮＭＲスペクトルである。
糖のＣ13−ＮＭＲスペクトルである。
【図４】比較例２で回収したヒアルロン酸オリゴ糖のＣ
13−ＮＭＲスペクトルである。
13−ＮＭＲスペクトルである。
１ 実施例４記載の架橋ヒアルロン酸の酵素分解物のＧ
ＰＣクロマトグラム ２ 比較例１記載のヒアルロン酸の酵素分解物のＧＰＣ
クロマトグラム
ＰＣクロマトグラム ２ 比較例１記載のヒアルロン酸の酵素分解物のＧＰＣ
クロマトグラム
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
Ｆターム(参考） 4C081 AB05 AB11 AB22 BA03 BA12
BA13 BA16 BB01 BB05 BB06
BB07 CC05 CD082 DC03
EA05 EA12
4C090 AA02 BA67 BB05 BB18 BB22
BB53 BB94 BD04 BD10 BD18
BD36 BD37
Claims (2)
- 【請求項１】 ヒアルロン酸のカルボキシル基が同一の
ヒアルロン酸分子の水酸基に、及び／又は別のヒアルロ
ン酸分子の水酸基にエステル結合によって架橋している
ことを特徴とする架橋ヒアルロン酸。 - 【請求項２】 ヒアルロン酸のカルボキシル基が同一の
ヒアルロン酸分子のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単
位の６位の１級水酸基に、及び／又は別のヒアルロン酸
分子のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位の６位の１
級水酸基にエステル結合によって架橋していることを特
徴とする請求項１記載の架橋ヒアルロン酸。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002052903A JP4958368B2 (ja) | 2002-02-28 | 2002-02-28 | 架橋ヒアルロン酸 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002052903A JP4958368B2 (ja) | 2002-02-28 | 2002-02-28 | 架橋ヒアルロン酸 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003252905A true JP2003252905A (ja) | 2003-09-10 |
| JP4958368B2 JP4958368B2 (ja) | 2012-06-20 |
Family
ID=28664474
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002052903A Expired - Fee Related JP4958368B2 (ja) | 2002-02-28 | 2002-02-28 | 架橋ヒアルロン酸 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4958368B2 (ja) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006051950A1 (ja) * | 2004-11-15 | 2006-05-18 | Shiseido Co., Ltd. | 架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法 |
| JP2007520612A (ja) * | 2004-02-03 | 2007-07-26 | アンタイス エス．エイ． | 生体適合性架橋ゲル |
| WO2008041514A1 (ja) | 2006-09-22 | 2008-04-10 | Kochi University | 放射線または抗がん化学療法増感剤 |
| EP2386306A1 (en) | 2006-12-06 | 2011-11-16 | Seikagaku Corporation | Pharmaceutical agent having long-lasting effect of treating arthritic disorders |
| WO2015029892A1 (ja) | 2013-08-29 | 2015-03-05 | 大日精化工業株式会社 | 水不溶性成形体の製造方法及び水不溶性成形体 |
| WO2016167229A1 (ja) * | 2015-04-15 | 2016-10-20 | キユーピー 株式会社 | カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物およびその製造方法 |
| WO2021256427A1 (ja) | 2020-06-15 | 2021-12-23 | 株式会社Kortuc | 抗がん療法の増感剤 |
| CN115403681A (zh) * | 2022-05-13 | 2022-11-29 | 宁波格鲁康生物科技有限公司 | 生物安全注射用改性透明质酸、制备方法及其在美容整形注射材料上的应用 |
| US12109232B2 (en) | 2013-02-15 | 2024-10-08 | Kortuc Inc. | Radiation/chemotherapy sensitizer to be used for intratumoral local injection and for controlled release of hydrogen peroxide with hydrogel as carrier |
| WO2024240864A1 (en) | 2023-05-25 | 2024-11-28 | Merz Aesthetics Gmbh | Cross-linked material comprising polysaccharide moieties interconnected by ester bonds |
-
2002
- 2002-02-28 JP JP2002052903A patent/JP4958368B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007520612A (ja) * | 2004-02-03 | 2007-07-26 | アンタイス エス．エイ． | 生体適合性架橋ゲル |
| JP4875988B2 (ja) * | 2004-11-15 | 2012-02-15 | 株式会社 資生堂 | 架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法 |
| WO2006051950A1 (ja) * | 2004-11-15 | 2006-05-18 | Shiseido Co., Ltd. | 架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法 |
| JPWO2006051950A1 (ja) * | 2004-11-15 | 2008-05-29 | 株式会社資生堂 | 架橋ヒアルロン酸ゲルの製造方法 |
| CN101056891B (zh) * | 2004-11-15 | 2010-05-26 | 株式会社资生堂 | 交联透明质酸凝胶的制备方法 |
| KR101239037B1 (ko) | 2004-11-15 | 2013-03-04 | 가부시키가이샤 시세이도 | 가교 히알루론산 겔의 제조 방법 |
| US10758477B2 (en) | 2006-09-22 | 2020-09-01 | Yasuhiro Ogawa | Radiation sensitizer or anti-cancer chemotherapy sensitizer |
| US10512604B2 (en) | 2006-09-22 | 2019-12-24 | Yasuhiro Ogawa | Radiation sensitizer or anti-cancer chemotherapy sensitizer |
| US12616650B2 (en) | 2006-09-22 | 2026-05-05 | Yasuhiro Ogawa | Radiation sensitizer of anti-cancer chemotherapy sensitizer |
| WO2008041514A1 (ja) | 2006-09-22 | 2008-04-10 | Kochi University | 放射線または抗がん化学療法増感剤 |
| US10219997B2 (en) | 2006-09-22 | 2019-03-05 | Kochi University | Radiation sensitizer or anti-cancer chemotherapy sensitizer |
| US8889652B2 (en) | 2006-12-06 | 2014-11-18 | Seikagaku Corporation | Pharmaceutical agent having long-lasting effect of treating arthritic disorders |
| EP2910248A1 (en) | 2006-12-06 | 2015-08-26 | Seikagaku Corporation | Pharmaceutical agent having long-lasting effect of treating arthritic disorders |
| US9301972B2 (en) | 2006-12-06 | 2016-04-05 | Seikagaku Corporation | Hyaluronic acid derivatives |
| US9616087B2 (en) | 2006-12-06 | 2017-04-11 | Seikagaku Corporation | Pharmaceutical agent having long-lasting effect of treating arthritic disorders |
| EP2386306A1 (en) | 2006-12-06 | 2011-11-16 | Seikagaku Corporation | Pharmaceutical agent having long-lasting effect of treating arthritic disorders |
| US12109232B2 (en) | 2013-02-15 | 2024-10-08 | Kortuc Inc. | Radiation/chemotherapy sensitizer to be used for intratumoral local injection and for controlled release of hydrogen peroxide with hydrogel as carrier |
| US9879124B2 (en) | 2013-08-29 | 2018-01-30 | Dainichiseika Color & Chemicals Mfg. Co., Ltd. | Method for manufacturing water-insoluble molded article and water-insoluble molded article |
| WO2015029892A1 (ja) | 2013-08-29 | 2015-03-05 | 大日精化工業株式会社 | 水不溶性成形体の製造方法及び水不溶性成形体 |
| JP6046869B1 (ja) * | 2015-04-14 | 2016-12-21 | キユーピー株式会社 | カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物およびその製造方法。 |
| WO2016167229A1 (ja) * | 2015-04-15 | 2016-10-20 | キユーピー 株式会社 | カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の架橋物およびその製造方法 |
| WO2021256427A1 (ja) | 2020-06-15 | 2021-12-23 | 株式会社Kortuc | 抗がん療法の増感剤 |
| CN115403681A (zh) * | 2022-05-13 | 2022-11-29 | 宁波格鲁康生物科技有限公司 | 生物安全注射用改性透明质酸、制备方法及其在美容整形注射材料上的应用 |
| WO2024240864A1 (en) | 2023-05-25 | 2024-11-28 | Merz Aesthetics Gmbh | Cross-linked material comprising polysaccharide moieties interconnected by ester bonds |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4958368B2 (ja) | 2012-06-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11939433B2 (en) | Method for preparing acylated crosslinked glycosaminoglycans | |
| Muzzarelli | Carboxymethylated chitins and chitosans | |
| EP1753787B1 (en) | Method of covalently linking hyaluronan and chitosan | |
| EP2510016B1 (en) | A method of preparation of an oxidized derivative of hyaluronic acid and a method of modification thereof | |
| JP5945504B2 (ja) | ヒアルロン酸の酸化誘導体，その調製方法及びその修飾方法 | |
| CA2284606A1 (en) | Method for generating saccharide fragments | |
| RU1831487C (ru) | Способ получени о-ацилированных глюкозаминогликанов | |
| AU2001246418B2 (en) | Gels of hyaluronic acid cross-linked with bi-functional L-aminoacids or L-aminoesters or mixtures thereof | |
| JP4958368B2 (ja) | 架橋ヒアルロン酸 | |
| JP2000502141A (ja) | 低い多分散指数を有するヒアルロン酸分画の調製方法 | |
| AU2001246418A1 (en) | Gels of hyaluronic acid cross-linked with bi-functional L-aminoacids or L-aminoesters or mixtures thereof | |
| JP4356289B2 (ja) | 多糖類複合体及びその製造方法 | |
| Rinaudo | Properties and degradation of selected polysaccharides: hyaluronan and chitosan | |
| JP2587268B2 (ja) | 低粘度ヒアルロン酸又はその塩の製造方法 | |
| TW200902036A (en) | Heparins comprising at least one covalent bond with biotin or a biotin derivative, preparation process therefor and use thereof | |
| JP2008519595A (ja) | 変性アルギネートおよびその製造方法および用途 | |
| KR0155166B1 (ko) | 헤파린상 구조를 지닌 물질 및 이의 제조방법 | |
| JP2000109502A (ja) | 複合キトサン化合物及びその用途 | |
| Linhardt et al. | Properties of carbohydrates | |
| EP3252080A1 (en) | Method for preparing acylated crosslinked glycosaminoglycans | |
| JPH1171407A (ja) | 親水性キチン誘導体及びその製造方法 | |
| JP4207416B2 (ja) | 酸化ポリアミノ糖誘導体の製造方法 | |
| Bazin | Properties of carbohydrates | |
| Matthew | 10 Chitosan as a Molecular Scaffold for Biomimetic Design of Glycopolymer Biomaterials | |
| JP2006291097A (ja) | ヒアルロン酸誘導体、およびその製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050217 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080916 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081117 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20081117 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090107 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090309 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090416 |
|
| A911 | Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20090421 |
|
| A912 | Removal of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20090522 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120124 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120319 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150330 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |