JP2003259882A - 改良されたｐｃｒ用の試薬 - Google Patents
改良されたｐｃｒ用の試薬Info
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 安価で、容易に実施でき、しかもPCR反応自
体の性能に影響を及ぼさない改良されたホットスタート
PCR法を提供すること。 【解決手段】 3〜6個のオルトヒドロキシ酸部分を有す
るポリヒドロキシアリールポリ酸を核酸増幅反応用の添
加剤として使用する。驚くべきことに、そのような添加
により、非特異的プライマーダイマー形成が防止され、
より特異的かつより高感度のPCRが行えるようになる。
体の性能に影響を及ぼさない改良されたホットスタート
PCR法を提供すること。 【解決手段】 3〜6個のオルトヒドロキシ酸部分を有す
るポリヒドロキシアリールポリ酸を核酸増幅反応用の添
加剤として使用する。驚くべきことに、そのような添加
により、非特異的プライマーダイマー形成が防止され、
より特異的かつより高感度のPCRが行えるようになる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸増幅の技術分
野に属する。より詳細には、本発明は、ポリメラーゼ連
鎖反応を改良するための化合物および方法を提供する。
野に属する。より詳細には、本発明は、ポリメラーゼ連
鎖反応を改良するための化合物および方法を提供する。
【０００２】
【従来の技術】市販のアウリントリカルボン酸(ATA)
は、多種多様な成分からなる不均一な高分子組成物であ
ることが知られている。そのような高分子組成物は、さ
まざまな数のATA低分子を有する複数の低分子量および
高分子量化合物からなることが知られている(Cushman,
M.ら, Journal of Organic Chemistry 57 (1992) 7241-
7248; Cushman, M.ら, J Med Chem 34 (1991) 337-4
2)。さらに、これらのATA低分子残基は誘導体化されて
いる可能性がある。
は、多種多様な成分からなる不均一な高分子組成物であ
ることが知られている。そのような高分子組成物は、さ
まざまな数のATA低分子を有する複数の低分子量および
高分子量化合物からなることが知られている(Cushman,
M.ら, Journal of Organic Chemistry 57 (1992) 7241-
7248; Cushman, M.ら, J Med Chem 34 (1991) 337-4
2)。さらに、これらのATA低分子残基は誘導体化されて
いる可能性がある。
【０００３】市販のATAまたは市販のATAの分別成分は、
in vivo適用のための添加剤としてだけでなく分子生物
学の分野でのin vitro反応の改良のための添加剤として
もしばしば使用されている。
in vivo適用のための添加剤としてだけでなく分子生物
学の分野でのin vitro反応の改良のための添加剤として
もしばしば使用されている。
【０００４】たとえば、ATAはin vitroタンパク質合成
の阻害剤として作用する可能性があること(Grollmann,
A. P. および Stewart, M. L., Biochemistry 61(1968)
719-725)、またはE.coli RNAポリメラーゼおよびQ-β-
レプリカーゼのポリメラーゼ活性の阻害剤として作用す
る可能性があることが示されている(Blumenthal, T.お
よび Landers, T. A., Biochem Biophys Res Commun 55
(1973) 680-8)。また、ATAの部分画分はマウスモロニ
ー白血病ウイルスの逆転写酵素活性を阻害していること
も示されている(Givens, J. F. および Manly, K. F.,
Nucleic AcidsRes 3 (1976) 405-18)。
の阻害剤として作用する可能性があること(Grollmann,
A. P. および Stewart, M. L., Biochemistry 61(1968)
719-725)、またはE.coli RNAポリメラーゼおよびQ-β-
レプリカーゼのポリメラーゼ活性の阻害剤として作用す
る可能性があることが示されている(Blumenthal, T.お
よび Landers, T. A., Biochem Biophys Res Commun 55
(1973) 680-8)。また、ATAの部分画分はマウスモロニ
ー白血病ウイルスの逆転写酵素活性を阻害していること
も示されている(Givens, J. F. および Manly, K. F.,
Nucleic AcidsRes 3 (1976) 405-18)。
【０００５】RNAおよびDNAポリメラーゼ活性の阻害がホ
ルムアウリントリカルボン酸について実証されている
が、市販の不均一な溶液とは対照的に、純粋なアウリン
トリカルボン酸は活性を示さない(Tsutsui, K.ら, Bioc
him Biophys Acta 517 (1978)14-23)。さらに、おそら
くクロマチンからヒストンや他のタンパク質が除去され
たことが原因と思われる単離された核の単離状態での転
写の刺激についても記載されている(Swennen, Lら, Arc
h Int Physiol Biochim 86 (1978) 925-6)。
ルムアウリントリカルボン酸について実証されている
が、市販の不均一な溶液とは対照的に、純粋なアウリン
トリカルボン酸は活性を示さない(Tsutsui, K.ら, Bioc
him Biophys Acta 517 (1978)14-23)。さらに、おそら
くクロマチンからヒストンや他のタンパク質が除去され
たことが原因と思われる単離された核の単離状態での転
写の刺激についても記載されている(Swennen, Lら, Arc
h Int Physiol Biochim 86 (1978) 925-6)。
【０００６】核酸ポリメラーゼの阻害に加えて、市販の
高分子ATAはまた、タンパク質の触媒部位に結合するこ
とによりRNase Aを阻害することが示されている(Gonzal
ez,R. G.ら, Biochemistry 19 (1980) 4299-303)。これ
らの研究に基づいて、高分子ATAは、転写の研究 (Schul
z-Harder, B. および Tata, J. R., Biochem Biophys R
es Commun 104 (1982) 903-10)および細胞のRNAの単離
(Skidmore, A. F. および Beebee, T. J., Biochem J 2
63 (1989) 73-80; Williams, C. および Krawisz. B.,
Methods in Molecular & Cellular Biology 1 (1989) 3
5-40)のためにRNase阻害剤として使用されている。
高分子ATAはまた、タンパク質の触媒部位に結合するこ
とによりRNase Aを阻害することが示されている(Gonzal
ez,R. G.ら, Biochemistry 19 (1980) 4299-303)。これ
らの研究に基づいて、高分子ATAは、転写の研究 (Schul
z-Harder, B. および Tata, J. R., Biochem Biophys R
es Commun 104 (1982) 903-10)および細胞のRNAの単離
(Skidmore, A. F. および Beebee, T. J., Biochem J 2
63 (1989) 73-80; Williams, C. および Krawisz. B.,
Methods in Molecular & Cellular Biology 1 (1989) 3
5-40)のためにRNase阻害剤として使用されている。
【０００７】ATAはまた、NF-κBのような転写因子のDNA
結合の阻害剤として機能する可能性もある(Sharma, R.
K.ら, Bioorg Med Chem 8 (2000) 1819-23)。さらに、A
TAは、CD4表面レセプターへの結合によりさらにはHIVウ
ィルスのGP120タンパク質に対するその高い親和性によ
り、抗ウイルス効果を有することが示されている(Cushm
an, M.ら, Journal of Medicinal Chemistry 34 (1991)
329-337; Neurath, A. R.ら, Antiviral Chemistry &
Chemotherapy 2 (1991) 303-312)。
結合の阻害剤として機能する可能性もある(Sharma, R.
K.ら, Bioorg Med Chem 8 (2000) 1819-23)。さらに、A
TAは、CD4表面レセプターへの結合によりさらにはHIVウ
ィルスのGP120タンパク質に対するその高い親和性によ
り、抗ウイルス効果を有することが示されている(Cushm
an, M.ら, Journal of Medicinal Chemistry 34 (1991)
329-337; Neurath, A. R.ら, Antiviral Chemistry &
Chemotherapy 2 (1991) 303-312)。
【０００８】核酸増幅、特にPCRに関する主要な問題
は、非特異的増幅産物の生成である。多くの場合、これ
は、熱安定性DNAポリメラーゼは室温でも中程度に活性
であるため、実際の熱サイクル工程それ自体の前に非特
異的オリゴヌクレオチドプライミングおよびそれに続く
プライマー伸長が起こることが原因である。たとえば、
偶然に生じたプライマーダイマー化およびそれに続く伸
長に起因する増幅産物がしばしば観測される。
は、非特異的増幅産物の生成である。多くの場合、これ
は、熱安定性DNAポリメラーゼは室温でも中程度に活性
であるため、実際の熱サイクル工程それ自体の前に非特
異的オリゴヌクレオチドプライミングおよびそれに続く
プライマー伸長が起こることが原因である。たとえば、
偶然に生じたプライマーダイマー化およびそれに続く伸
長に起因する増幅産物がしばしば観測される。
【０００９】この問題を克服するために、いわゆる「ホ
ットスタート」PCRを行うことが当技術分野で周知であ
る。ホットスタートPCRでは、反応混合物の温度が初め
て上昇するときまで、増幅反応に不可欠な1つの成分を
反応混合物から分離しておくかまたは不活性な状態に保
持する。これらの条件下ではポリメラーゼは機能するこ
とができないので、プライマーが非特異的に結合する可
能性のある期間中、プライマー伸長は起こらない。この
効果を達成するために、いくつかの方法が適用されてき
た。
ットスタート」PCRを行うことが当技術分野で周知であ
る。ホットスタートPCRでは、反応混合物の温度が初め
て上昇するときまで、増幅反応に不可欠な1つの成分を
反応混合物から分離しておくかまたは不活性な状態に保
持する。これらの条件下ではポリメラーゼは機能するこ
とができないので、プライマーが非特異的に結合する可
能性のある期間中、プライマー伸長は起こらない。この
効果を達成するために、いくつかの方法が適用されてき
た。
【００１０】a) DNAポリメラーゼの物理的分離
物理的分離は、たとえば、DNAポリメラーゼを含有する
区画を他の試薬の大部分を含有する区画から分離する固
体ワックスのバリヤーにより達成することができる。こ
の場合、最初の加熱ステップの間に、ワックスが自動的
に融解して流体区画が混合する(Chou, Q.ら, Nucleic A
cids Res 20 (1992) 1717-23)。これに代わる方法で
は、DNAポリメラーゼを増幅反応の前では固体担体上に
アフィニティー固定しておき、熱媒介放出により初めて
反応混合物中に放出させる(Nilsson, J.ら, Biotechniq
ues 22 (1997) 744-51)。しかしながら、これらの方法
は両方とも時間がかかり実施上不都合を生じる。
区画を他の試薬の大部分を含有する区画から分離する固
体ワックスのバリヤーにより達成することができる。こ
の場合、最初の加熱ステップの間に、ワックスが自動的
に融解して流体区画が混合する(Chou, Q.ら, Nucleic A
cids Res 20 (1992) 1717-23)。これに代わる方法で
は、DNAポリメラーゼを増幅反応の前では固体担体上に
アフィニティー固定しておき、熱媒介放出により初めて
反応混合物中に放出させる(Nilsson, J.ら, Biotechniq
ues 22 (1997) 744-51)。しかしながら、これらの方法
は両方とも時間がかかり実施上不都合を生じる。
【００１１】b) DNAポリメラーゼの修飾
このタイプのホットスタートPCRでは、DNAポリメラーゼ
を、化学修飾の結果として可逆的に不活性化しておく。
より詳細には、室温で酵素を不活性にする熱不安定性ブ
ロッキング基をTaq DNAポリメラーゼに導入する。これ
らのブロッキング基はプレPCRステップ中に高温で除去
され、その結果、酵素は活性状態になる。そのような熱
不安定性修飾は、たとえば、酵素のリシン残基にシトラ
コン酸無水物またはアコニット酸無水物を結合させるこ
とにより達成することができる(米国特許第5,677,152
号)。一方、そのような修飾を有する酵素は、Amplitaq
Gold(Moretti, T.ら, Biotechniques 25 (1998) 716-2
2)またはFastStart DNAポリメラーゼ(Roche Molecular
Biochemicals)として市販されている。
を、化学修飾の結果として可逆的に不活性化しておく。
より詳細には、室温で酵素を不活性にする熱不安定性ブ
ロッキング基をTaq DNAポリメラーゼに導入する。これ
らのブロッキング基はプレPCRステップ中に高温で除去
され、その結果、酵素は活性状態になる。そのような熱
不安定性修飾は、たとえば、酵素のリシン残基にシトラ
コン酸無水物またはアコニット酸無水物を結合させるこ
とにより達成することができる(米国特許第5,677,152
号)。一方、そのような修飾を有する酵素は、Amplitaq
Gold(Moretti, T.ら, Biotechniques 25 (1998) 716-2
2)またはFastStart DNAポリメラーゼ(Roche Molecular
Biochemicals)として市販されている。
【００１２】米国特許第6,183,998号には、熱安定性酵
素の可逆的修飾のためのアルデヒドの使用が開示されて
いる。しかしながら、ブロッキング基の導入は、酵素の
立体的に利用可能なすべてのリシン残基上で任意に起こ
る化学反応である。したがって、再現性および化学修飾
された酵素調製物の品質が変化するおそれがあり、ほと
んど制御できない。
素の可逆的修飾のためのアルデヒドの使用が開示されて
いる。しかしながら、ブロッキング基の導入は、酵素の
立体的に利用可能なすべてのリシン残基上で任意に起こ
る化学反応である。したがって、再現性および化学修飾
された酵素調製物の品質が変化するおそれがあり、ほと
んど制御できない。
【００１３】このほか、25℃で減少した活性を有する低
温感受性ポリメラーゼ突然変異体(米国特許第6,214,557
号)がより特異的なPCR産物を生じるとの開示もなされて
いる。
温感受性ポリメラーゼ突然変異体(米国特許第6,214,557
号)がより特異的なPCR産物を生じるとの開示もなされて
いる。
【００１４】c) Taq DNAポリメラーゼ抗体
Taq DNAポリメラーゼの熱不安定性阻害を達成する他の
方法は、精製済み酵素に対して形成されたモノクロナー
ル抗体の添加である(Kellogg, D. E.ら, Biotechniques
16 (1994) 1134-7; Sharkey, D. J.ら, Biotechnology
(NY) 12 (1994) 506-9)。オリゴヌクレオチドアプタマ
ーと同様に、抗体は、阻害作用を呈するように室温でTa
q DNAポリメラーゼに強い親和力で結合する。複合体
は、熱サイクル過程それ自体の前に前加熱ステップで破
壊される。このようにすると、特に、迅速な熱サイクル
のプロトコルを適用する場合、全体として増幅にかなり
の時間が費やされることになる(国際公開第97/46706
号)。
方法は、精製済み酵素に対して形成されたモノクロナー
ル抗体の添加である(Kellogg, D. E.ら, Biotechniques
16 (1994) 1134-7; Sharkey, D. J.ら, Biotechnology
(NY) 12 (1994) 506-9)。オリゴヌクレオチドアプタマ
ーと同様に、抗体は、阻害作用を呈するように室温でTa
q DNAポリメラーゼに強い親和力で結合する。複合体
は、熱サイクル過程それ自体の前に前加熱ステップで破
壊される。このようにすると、特に、迅速な熱サイクル
のプロトコルを適用する場合、全体として増幅にかなり
の時間が費やされることになる(国際公開第97/46706
号)。
【００１５】米国特許第5,985,619号には、ホットスタ
ート抗体を用いてPCRを行うための特定の実施形態が開
示されている。この実施形態では、非特異的プライマー
ダイマー中間体を消化させるために、Taqポリメラーゼ
のほかに、たとえば、E. coli由来のエキソヌクレアー
ゼIIIを補足剤として増幅混合物に添加する。上記の特
許に開示されているように、エキソヌクレアーゼIII
は、たとえば、標的/プライマーハイブリッドまたは標
的/プライマー伸長産物ハイブリッドのような2本鎖DNA
を基質として認識する。消化は、3'末端デオキシヌクレ
オチド残基の5'末端のホスホジエステル結合の開裂によ
り起こる。
ート抗体を用いてPCRを行うための特定の実施形態が開
示されている。この実施形態では、非特異的プライマー
ダイマー中間体を消化させるために、Taqポリメラーゼ
のほかに、たとえば、E. coli由来のエキソヌクレアー
ゼIIIを補足剤として増幅混合物に添加する。上記の特
許に開示されているように、エキソヌクレアーゼIII
は、たとえば、標的/プライマーハイブリッドまたは標
的/プライマー伸長産物ハイブリッドのような2本鎖DNA
を基質として認識する。消化は、3'末端デオキシヌクレ
オチド残基の5'末端のホスホジエステル結合の開裂によ
り起こる。
【００１６】このタイプのエキソヌクレアーゼは室温で
活性であるため、非特異的にアニーリングしたプライマ
ーおよびプライマー伸長産物はすべて消化される。この
結果、いくつかの実施形態では、増幅反応の特異性がさ
らに増大される。しかし、プレインキュベーションの継
続時間に依存する非特異的プライマーの消化は、プライ
マー濃度の実質的かつ無制御な減少をまねくおそれがあ
り、結果として増幅反応自体に影響を及ぼしかねない。
活性であるため、非特異的にアニーリングしたプライマ
ーおよびプライマー伸長産物はすべて消化される。この
結果、いくつかの実施形態では、増幅反応の特異性がさ
らに増大される。しかし、プレインキュベーションの継
続時間に依存する非特異的プライマーの消化は、プライ
マー濃度の実質的かつ無制御な減少をまねくおそれがあ
り、結果として増幅反応自体に影響を及ぼしかねない。
【００１７】d) エキソヌクレアーゼの使用
増幅効率を増大させる他の選択肢は、PCR反応混合物で
エキソヌクレアーゼIIIと組み合わせてホスホロチオエ
ートオリゴヌクレオチドプライマーを使用することであ
る(欧州特許第0 744 470号)。この場合、1本鎖DNA基質
だけでなく2本鎖DNA基質をも通常受容する3'エキソヌク
レアーゼは、1本鎖増幅プライマーが分解されないよう
な状態で、プライマーダイマーのような2本鎖アーテフ
ァクトを分解するとともにアンプリコンをキャリーオー
バーする。同様に、無塩基性の修飾された3'末端を有し
かつその修飾がE.coliエンドヌクレアーゼIVにより鋳型
依存的に除去されるプライマーの使用が提案されている
(米国特許第5,792,607号)。
エキソヌクレアーゼIIIと組み合わせてホスホロチオエ
ートオリゴヌクレオチドプライマーを使用することであ
る(欧州特許第0 744 470号)。この場合、1本鎖DNA基質
だけでなく2本鎖DNA基質をも通常受容する3'エキソヌク
レアーゼは、1本鎖増幅プライマーが分解されないよう
な状態で、プライマーダイマーのような2本鎖アーテフ
ァクトを分解するとともにアンプリコンをキャリーオー
バーする。同様に、無塩基性の修飾された3'末端を有し
かつその修飾がE.coliエンドヌクレアーゼIVにより鋳型
依存的に除去されるプライマーの使用が提案されている
(米国特許第5,792,607号)。
【００１８】しかしながら、この方法には次のような主
要な欠点が存在する。すなわち、立体異性体として純粋
な形でホスホロチオエートプライマーを調製することが
できない可能性があるため、この方法では酵素の調製お
よび精製が必要とされる。
要な欠点が存在する。すなわち、立体異性体として純粋
な形でホスホロチオエートプライマーを調製することが
できない可能性があるため、この方法では酵素の調製お
よび精製が必要とされる。
【００１９】e) 修飾されたプライマー
欧州特許第0 799 888号および英国特許第2293238号に
は、PCR反応液への3'ブロック化オリゴヌクレオチドの
添加が開示されている。3'ブロックにより、これらのオ
リゴヌクレオチドは、プライマーとして作用することが
できない。ブロック化オリゴヌクレオチドは、PCRプラ
イマーと競合/相互作用して非特異的産物を減少させる
ようにデザインされる。
は、PCR反応液への3'ブロック化オリゴヌクレオチドの
添加が開示されている。3'ブロックにより、これらのオ
リゴヌクレオチドは、プライマーとして作用することが
できない。ブロック化オリゴヌクレオチドは、PCRプラ
イマーと競合/相互作用して非特異的産物を減少させる
ようにデザインされる。
【００２０】延長された5'末端を有するプライマーを用
いて、パンハンドルの形成によりプライマーダイマーの
回避が行われている(Brownie, J.ら, Nucleic Acids Re
s 25(1997) 3235-41)。同様に、自己相補的領域を有す
るプライマーは非線状であり、加熱前はプライマーとし
て作用できない (Kaboev, O. K.ら, Nucleic Acids Res
28 (2000) E94; Ailenberg, M. および Silverman,
M., Biotechniques 29 (2000) 1018-20, 1022-4)。しか
しながら、これらの2つの方法では、プライマーのデザ
インがきわめて困難なものとなる。
いて、パンハンドルの形成によりプライマーダイマーの
回避が行われている(Brownie, J.ら, Nucleic Acids Re
s 25(1997) 3235-41)。同様に、自己相補的領域を有す
るプライマーは非線状であり、加熱前はプライマーとし
て作用できない (Kaboev, O. K.ら, Nucleic Acids Res
28 (2000) E94; Ailenberg, M. および Silverman,
M., Biotechniques 29 (2000) 1018-20, 1022-4)。しか
しながら、これらの2つの方法では、プライマーのデザ
インがきわめて困難なものとなる。
【００２１】欧州特許第0 866 071号には、核酸塩基の
環外アミノ基に連結される嵩高い基により修飾されたプ
ライマーの使用が記載されている。したがって、これら
のプライマーのハイブリダイゼーション能力は著しく低
減する。加熱すると、ワトソン・クリック塩基対形成に
対する妨害は低減されて、プライマーの伸長が起こる。
このほか、光除去性基を核酸塩基の環外アミノ基に連結
させてもよい。この場合、光照射により、修飾されてい
ないプライマーが生成する。
環外アミノ基に連結される嵩高い基により修飾されたプ
ライマーの使用が記載されている。したがって、これら
のプライマーのハイブリダイゼーション能力は著しく低
減する。加熱すると、ワトソン・クリック塩基対形成に
対する妨害は低減されて、プライマーの伸長が起こる。
このほか、光除去性基を核酸塩基の環外アミノ基に連結
させてもよい。この場合、光照射により、修飾されてい
ないプライマーが生成する。
【００２２】国際公開第00/43544号には、フルオレセイ
ンのようなハプテンで修飾されたプライマーを抗フルオ
レセイン抗体と組み合わせて使用することが開示されて
いる。形成された免疫複合体は、低温では非特異的PCR
を防止するが、高温では破壊される。しかしながら、化
学修飾を必要とするため、これらの選択肢は、著しく時
間およびコストがかかる。
ンのようなハプテンで修飾されたプライマーを抗フルオ
レセイン抗体と組み合わせて使用することが開示されて
いる。形成された免疫複合体は、低温では非特異的PCR
を防止するが、高温では破壊される。しかしながら、化
学修飾を必要とするため、これらの選択肢は、著しく時
間およびコストがかかる。
【００２３】f) 核酸添加剤
非特異的にアニーリングされたプライマーの伸長は、短
い2本鎖DNA断片の添加により阻害されることを示されて
いる(Kainz, P.ら, Biotechniques 28 (2000)278-82)。
この場合、プライマーの伸長は、短い2本鎖DNA断片の融
点未満の温度で阻害されるが、コンペティターDNA自体
の配列とは無関係である。しかしながら、過剰のコンペ
ティターDNAが核酸増幅反応の収率にどの程度まで影響
を及ぼすかはわかっていない。
い2本鎖DNA断片の添加により阻害されることを示されて
いる(Kainz, P.ら, Biotechniques 28 (2000)278-82)。
この場合、プライマーの伸長は、短い2本鎖DNA断片の融
点未満の温度で阻害されるが、コンペティターDNA自体
の配列とは無関係である。しかしながら、過剰のコンペ
ティターDNAが核酸増幅反応の収率にどの程度まで影響
を及ぼすかはわかっていない。
【００２４】このほか、明確な2次構造を生じる特異的
配列を有するオリゴヌクレオチドアプタマーを使用して
もよい。そのようなアプタマーは、DNAポリメラーゼに
対して非常に高い親和性を有するものがSELEX法を用い
て選択されている(米国特許第5,693,502号)(Lin, Y, お
よび Jayasena, S. D., J Mol Biol 271 (1997). 100-1
1)。この場合にもまた、実際の熱サイクル工程自体の前
に増幅混合物中にそのようなアプタマーが存在するの
で、強い親和力でDNAポリメラーゼに結合し、その結果
その活性が熱不安定的に阻害される。
配列を有するオリゴヌクレオチドアプタマーを使用して
もよい。そのようなアプタマーは、DNAポリメラーゼに
対して非常に高い親和性を有するものがSELEX法を用い
て選択されている(米国特許第5,693,502号)(Lin, Y, お
よび Jayasena, S. D., J Mol Biol 271 (1997). 100-1
1)。この場合にもまた、実際の熱サイクル工程自体の前
に増幅混合物中にそのようなアプタマーが存在するの
で、強い親和力でDNAポリメラーゼに結合し、その結果
その活性が熱不安定的に阻害される。
【００２５】しかしながら、選択方法が原因で、従来か
ら利用可能なアプタマーはいずれも、特定の1種のDNAポ
リメラーゼと組み合わせて使用することができるにすぎ
ない。ブロック化3'末端および5'末端を有するオリゴヌ
クレオチド阻害剤(国際公開第01/02559号)は、PCR反応
の感度および特異性を高めることが示されている。それ
らは、ポリメラーゼへの結合に関してプライマーと競合
する。
ら利用可能なアプタマーはいずれも、特定の1種のDNAポ
リメラーゼと組み合わせて使用することができるにすぎ
ない。ブロック化3'末端および5'末端を有するオリゴヌ
クレオチド阻害剤(国際公開第01/02559号)は、PCR反応
の感度および特異性を高めることが示されている。それ
らは、ポリメラーゼへの結合に関してプライマーと競合
する。
【００２６】g) 他のPCR添加剤
DMSO、ベタイン、およびホルムアミドのような当技術分
野で公知の他の有機添加剤(国際公開第99/46400号)(Hen
gen, P. N., Trends Biochem Sci 22 (1997) 225-6; Ch
akrabarti, R. および Schutt, C. E., Nucleic Acids
Res 29 (2001)2377-81)は、プライマーダイマー形成を
防止するのではなく、GCに富んだ配列の増幅を改良す
る。同様に、ヘパリンは、おそらく、染色体DNAを利用
できるようにヒストンのようなタンパク質を除去するこ
とにより、in vitroランオン転写を刺激する (Hildebra
nd, C. E.ら, Biochimica et Biophysica Acta 477 (19
77)295-311)。
野で公知の他の有機添加剤(国際公開第99/46400号)(Hen
gen, P. N., Trends Biochem Sci 22 (1997) 225-6; Ch
akrabarti, R. および Schutt, C. E., Nucleic Acids
Res 29 (2001)2377-81)は、プライマーダイマー形成を
防止するのではなく、GCに富んだ配列の増幅を改良す
る。同様に、ヘパリンは、おそらく、染色体DNAを利用
できるようにヒストンのようなタンパク質を除去するこ
とにより、in vitroランオン転写を刺激する (Hildebra
nd, C. E.ら, Biochimica et Biophysica Acta 477 (19
77)295-311)。
【００２７】1本鎖結合性タンパク質(米国特許第5,449,
603号)またはtRNA(Sturzenbaum, S.R., Biotechniques
27 (1999) 50-2)を添加すると、これらの添加剤とプラ
イマーとの非共有結合型会合を生じることも知られてい
る。この会合は、PCRの加熱時に破壊される。また、DNA
ヘリカーゼを添加するとプライマーのランダムなアニー
リングが防止されることも見いだされている(Kaboev,
O. K.ら, Bioorg Khim 25 (1999) 398-400)。さらに、
いくつかの場合、低温でポリメラーゼ活性を阻害するた
めに、ポリグルタメートを使用することも可能である
(国際公開第00/68411号)。
603号)またはtRNA(Sturzenbaum, S.R., Biotechniques
27 (1999) 50-2)を添加すると、これらの添加剤とプラ
イマーとの非共有結合型会合を生じることも知られてい
る。この会合は、PCRの加熱時に破壊される。また、DNA
ヘリカーゼを添加するとプライマーのランダムなアニー
リングが防止されることも見いだされている(Kaboev,
O. K.ら, Bioorg Khim 25 (1999) 398-400)。さらに、
いくつかの場合、低温でポリメラーゼ活性を阻害するた
めに、ポリグルタメートを使用することも可能である
(国際公開第00/68411号)。
【００２８】残念ながら、これらのさまざまな生物学的
化合物のいずれを調製する場合にも、コストと時間のか
かる生化学的精製処理が必要である。
化合物のいずれを調製する場合にも、コストと時間のか
かる生化学的精製処理が必要である。
【００２９】したがって、安価で、容易に実施でき、し
かも最も重要なこととしてPCR反応自体の性能に影響を
及ぼさない他のホットスタートPCR法を提供すること
が、当技術分野で必要とされている。
かも最も重要なこととしてPCR反応自体の性能に影響を
及ぼさない他のホットスタートPCR法を提供すること
が、当技術分野で必要とされている。
【００３０】
【特許文献１】米国特許第5,677,152号明細書
【特許文献２】米国特許第6,183,998号明細書
【特許文献３】国際公開第97/46706号パンフレット
【特許文献４】欧州特許第0 744 470号明細書
【特許文献５】米国特許第5,792,607号明細書
【特許文献６】欧州特許第0 799 888号明細書
【特許文献７】国際公開第99/46400号パンフレット
【特許文献８】米国特許第5,449,603号明細書
【非特許文献１】Blumenthal, T. および Landers, T.
A., Biochem Biophys Res Commun 55 (1973) 680-8
A., Biochem Biophys Res Commun 55 (1973) 680-8
【非特許文献２】Gonzalez, R. G.ら, Biochemistry 19
(1980) 4299-303
(1980) 4299-303
【非特許文献３】Sharma, R. K.ら, Bioorg Med Chem 8
(2000) 1819-23
(2000) 1819-23
【非特許文献４】Chou, Q.ら, Nucleic Acids Res 20
(1992) 1717-23
(1992) 1717-23
【非特許文献５】Kellogg, D. E.ら, Biotechniques 16
(1994) 1134-7
(1994) 1134-7
【非特許文献６】Brownie, J.ら, Nucleic Acids Res 2
5 (1997) 3235-41
5 (1997) 3235-41
【非特許文献７】Kainz, P.ら, Biotechniques 28 (200
0) 278-82
0) 278-82
【００３１】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、上記
の要件を満足する改良されたホットスタートPCR法を提
供することである。
の要件を満足する改良されたホットスタートPCR法を提
供することである。
【００３２】
【課題を解決するための手段】本発明は、ホットスター
トPCRを快適に行えるようにするための、従来法に代わ
る新しい解決法を提供する。
トPCRを快適に行えるようにするための、従来法に代わ
る新しい解決法を提供する。
【００３３】この方法は、ポリヒドロキシアリールポリ
酸のモノマー、オリゴマーおよびポリマーの混合物から
構成された市販のATAとは対照的に、特定の規定された
低分子量ポリヒドロキシアリールポリ酸が、純粋な形態
で核酸増幅混合物に添加したときに増幅反応の性能を驚
くほど改良するという本発明者らの観測結果に基づくも
のである。
酸のモノマー、オリゴマーおよびポリマーの混合物から
構成された市販のATAとは対照的に、特定の規定された
低分子量ポリヒドロキシアリールポリ酸が、純粋な形態
で核酸増幅混合物に添加したときに増幅反応の性能を驚
くほど改良するという本発明者らの観測結果に基づくも
のである。
【００３４】したがって、第1の形態において、本発明
は、核酸増幅反応用の添加剤としての、3〜6個のオルト
ヒドロキシ酸部分を有するポリヒドロキシアリールポリ
酸の使用に関する。そのような化合物の添加は、増幅反
応の感度を増大させるための手段を提供する。
は、核酸増幅反応用の添加剤としての、3〜6個のオルト
ヒドロキシ酸部分を有するポリヒドロキシアリールポリ
酸の使用に関する。そのような化合物の添加は、増幅反
応の感度を増大させるための手段を提供する。
【００３５】より具体的には、本発明は、核酸増幅反応
用の添加剤としての、3〜6個のオルトヒドロキシ酸部分
を有する化合物の使用であって、該化合物が、式
用の添加剤としての、3〜6個のオルトヒドロキシ酸部分
を有する化合物の使用であって、該化合物が、式
【化２】
を有し、A1、A2、およびA3が、同一でも異なってもよ
く、それぞれ酸部分を表し、-OH基が、A1、A2、およびA
3に対してオルト位にあり、R1およびR2が、同一でも異
なってもよく、それぞれH、低級アルキル、CH2-アリー
ル、ハロゲン、または酸部分のいずれかを表し、L1およ
びL2が、同一でも異なってもよく、それぞれ -CH2-、 -CO-、 -CR3(O-A)-(ここで、Aは、H、低級アルキル、もしくは
アリールである)、 -CR3(N(B1B2))-(ここで、B1およびB2は、H、低級アルキ
ル、もしくはアリールのいずれかである)、または -C+アリール- のいずれかを表し、R3がHもしくはアリールである、こ
とを特徴とする、上記使用に関する。
く、それぞれ酸部分を表し、-OH基が、A1、A2、およびA
3に対してオルト位にあり、R1およびR2が、同一でも異
なってもよく、それぞれH、低級アルキル、CH2-アリー
ル、ハロゲン、または酸部分のいずれかを表し、L1およ
びL2が、同一でも異なってもよく、それぞれ -CH2-、 -CO-、 -CR3(O-A)-(ここで、Aは、H、低級アルキル、もしくは
アリールである)、 -CR3(N(B1B2))-(ここで、B1およびB2は、H、低級アルキ
ル、もしくはアリールのいずれかである)、または -C+アリール- のいずれかを表し、R3がHもしくはアリールである、こ
とを特徴とする、上記使用に関する。
【００３６】好ましくは、核酸増幅反応は、ポリメラー
ゼ連鎖反応(PCR)である。さらにより好ましくは、増幅
反応は、蛍光により増幅産物の生成がリアルタイムでモ
ニターされるリアルタイムPCRである。
ゼ連鎖反応(PCR)である。さらにより好ましくは、増幅
反応は、蛍光により増幅産物の生成がリアルタイムでモ
ニターされるリアルタイムPCRである。
【００３７】第2の形態において、そのようなポリヒド
ロキシアリールポリ酸は、ヌクレオチド塩基対形成相互
作用を低減させて非特異的ハイブリダイゼーション作用
を防止する目的で、核酸を含有する混合物への添加剤と
して一般に使用することができる。
ロキシアリールポリ酸は、ヌクレオチド塩基対形成相互
作用を低減させて非特異的ハイブリダイゼーション作用
を防止する目的で、核酸を含有する混合物への添加剤と
して一般に使用することができる。
【００３８】第3の形態において、ポリヒドロキシアリ
ールポリ酸は、核酸の融点の測定、すなわち、１つの、
少なくとも部分的に2本鎖である核酸ハイブリッド分子
が2つの1本鎖分子に変性する融解温度の測定、のための
添加剤として使用することができる。
ールポリ酸は、核酸の融点の測定、すなわち、１つの、
少なくとも部分的に2本鎖である核酸ハイブリッド分子
が2つの1本鎖分子に変性する融解温度の測定、のための
添加剤として使用することができる。
【００３９】さらに他の形態において、本発明は、核酸
反応を行うのに必要な成分と開示したポリヒドロキシア
リールポリ酸とを含む組成物に関する。同様に、本発明
は、核酸反応を行うのに必要なすべての成分と先に開示
したポリヒドロキシアリールポリ酸とを含む組成物を備
えたキットに関する。
反応を行うのに必要な成分と開示したポリヒドロキシア
リールポリ酸とを含む組成物に関する。同様に、本発明
は、核酸反応を行うのに必要なすべての成分と先に開示
したポリヒドロキシアリールポリ酸とを含む組成物を備
えたキットに関する。
【００４０】
【発明の実施の形態】上述したように、本発明の目的
は、ホットスタート核酸増幅を行うための改良された方
法を提供することである。本発明によれば、改良された
核酸増幅は、3〜6個のオルトヒドロキシ酸部分を有する
ポリヒドロキシアリールポリ酸を使用することにより達
成される。言いかえれば、酸置換基およびヒドロキシル
置換基はそれぞれ、隣接する炭素原子の位置で芳香環に
結合される。
は、ホットスタート核酸増幅を行うための改良された方
法を提供することである。本発明によれば、改良された
核酸増幅は、3〜6個のオルトヒドロキシ酸部分を有する
ポリヒドロキシアリールポリ酸を使用することにより達
成される。言いかえれば、酸置換基およびヒドロキシル
置換基はそれぞれ、隣接する炭素原子の位置で芳香環に
結合される。
【００４１】そのような化合物の添加により、増幅反応
の感度が高まる。好ましくは、核酸増幅反応は、プライ
マーアニーリング期と、プライマー伸長期と、変性期と
を含む調節された熱サイクルプロトコルで増幅産物を生
成するように、フォワードおよびリバースプライマー
と、熱安定性DNAポリメラーゼと、ヌクレオシド三リン
酸とを用いるポリメラーゼ連鎖反応である。
の感度が高まる。好ましくは、核酸増幅反応は、プライ
マーアニーリング期と、プライマー伸長期と、変性期と
を含む調節された熱サイクルプロトコルで増幅産物を生
成するように、フォワードおよびリバースプライマー
と、熱安定性DNAポリメラーゼと、ヌクレオシド三リン
酸とを用いるポリメラーゼ連鎖反応である。
【００４２】また、好ましくは、本発明に係る化合物
を、塩の形態で、好ましくは1価もしくは2価カチオンを
有する塩の形態で、最も好ましくはアンモニウム塩とし
て、増幅混合物に添加する。本発明によれば、3〜6個の
オルトヒドロキシ酸部分を有するポリヒドロキシアリー
ルポリ酸が、ホットスタート効果を発揮するために、0.
001〜1mg/mlの最終濃度範囲で増幅混合物中に存在する
こともまた特筆すべき点である。好ましくは、本発明に
係る添加剤は、0.01〜0.1mg/mlの最終濃度で存在する。
しかしながら、正確な最終濃度の最適値は、使用する添
加化合物に依存するとともに、増幅混合物中の他の化合
物の性質にも依存する。
を、塩の形態で、好ましくは1価もしくは2価カチオンを
有する塩の形態で、最も好ましくはアンモニウム塩とし
て、増幅混合物に添加する。本発明によれば、3〜6個の
オルトヒドロキシ酸部分を有するポリヒドロキシアリー
ルポリ酸が、ホットスタート効果を発揮するために、0.
001〜1mg/mlの最終濃度範囲で増幅混合物中に存在する
こともまた特筆すべき点である。好ましくは、本発明に
係る添加剤は、0.01〜0.1mg/mlの最終濃度で存在する。
しかしながら、正確な最終濃度の最適値は、使用する添
加化合物に依存するとともに、増幅混合物中の他の化合
物の性質にも依存する。
【００４３】3〜6個のオルトヒドロキシ酸部分を有する
ポリヒドロキシアリールポリ酸を、RNA鋳型配列が増幅
されることを特徴とするRT-PCR反応に加える場合もま
た、本発明の範囲内である。RT-PCRは、さまざまなプロ
トコルにより行うことができる。この際、第1のストラ
ンドの合成および第2のストランドの合成は2種の異なる
酵素により行われるかまたは両方のステップで同一の酵
素を用いて行われる。
ポリヒドロキシアリールポリ酸を、RNA鋳型配列が増幅
されることを特徴とするRT-PCR反応に加える場合もま
た、本発明の範囲内である。RT-PCRは、さまざまなプロ
トコルにより行うことができる。この際、第1のストラ
ンドの合成および第2のストランドの合成は2種の異なる
酵素により行われるかまたは両方のステップで同一の酵
素を用いて行われる。
【００４４】第1のストランドの合成では、AMV逆転写酵
素やMMLV逆転写酵素などの任意の種類のRNA依存性DNAポ
リメラーゼ(逆転写酵素)を使用することができる。続い
て、RNA/cDNAハイブリッドを熱変性に付すか、またはそ
の代わりにハイブリッド内のRNA鋳型をRNase Hにより消
化させてもよい。次に、標準的なプロトコルに従ってTa
q DNAポリメラーゼなどのような任意の種類の熱安定性D
NA依存性DNAポリメラーゼを有する添加剤の存在下で第2
のストランドの合成および増幅を行うことができる。
素やMMLV逆転写酵素などの任意の種類のRNA依存性DNAポ
リメラーゼ(逆転写酵素)を使用することができる。続い
て、RNA/cDNAハイブリッドを熱変性に付すか、またはそ
の代わりにハイブリッド内のRNA鋳型をRNase Hにより消
化させてもよい。次に、標準的なプロトコルに従ってTa
q DNAポリメラーゼなどのような任意の種類の熱安定性D
NA依存性DNAポリメラーゼを有する添加剤の存在下で第2
のストランドの合成および増幅を行うことができる。
【００４５】このほか、第1のストランドの合成および
第2のストランドの合成を1種の酵素で行う場合には、本
発明に係る添加剤の存在下で、サーマス・サーモフィラ
ス（Thermus thermophilus）またはC.サーム（C.Ther
m）(Roche Diagnostics)のような熱安定性DNAポリメラ
ーゼを使用することができる。
第2のストランドの合成を1種の酵素で行う場合には、本
発明に係る添加剤の存在下で、サーマス・サーモフィラ
ス（Thermus thermophilus）またはC.サーム（C.Ther
m）(Roche Diagnostics)のような熱安定性DNAポリメラ
ーゼを使用することができる。
【００４６】特定の一実施形態では、開示したポリヒド
ロキシアリールポリ酸を、増幅がリアルタイムにモニタ
ーされるリアルタイムPCR増幅混合物への添加剤として
使用する。通常、これは蛍光を利用して行うことができ
る。
ロキシアリールポリ酸を、増幅がリアルタイムにモニタ
ーされるリアルタイムPCR増幅混合物への添加剤として
使用する。通常、これは蛍光を利用して行うことができ
る。
【００４７】たとえば、蛍光標識したハイブリダイゼー
ションプローブをリアルタイムモデリングに使用しても
よい。本発明による本発明の方法で使用されるこれらの
ハイブリダイゼーションプローブは、通常、増幅反応の
アニーリング温度で標的核酸にハイブリダイズする1本
鎖の核酸、たとえば、1本鎖のDNAもしくはRNAまたはそ
れらの誘導体あるいはPNAである。オリゴヌクレオチド
は、通常、20〜100ヌクレオチドの長さを有する。
ションプローブをリアルタイムモデリングに使用しても
よい。本発明による本発明の方法で使用されるこれらの
ハイブリダイゼーションプローブは、通常、増幅反応の
アニーリング温度で標的核酸にハイブリダイズする1本
鎖の核酸、たとえば、1本鎖のDNAもしくはRNAまたはそ
れらの誘導体あるいはPNAである。オリゴヌクレオチド
は、通常、20〜100ヌクレオチドの長さを有する。
【００４８】標識は、特定の検出方式に応じてオリゴヌ
クレオチドの任意のリボースもしくはリン酸基に導入す
ることができる。核酸分子の5'末端および3'末端での標
識が好ましい。
クレオチドの任意のリボースもしくはリン酸基に導入す
ることができる。核酸分子の5'末端および3'末端での標
識が好ましい。
【００４９】標識のタイプは、リアルタイムモードの増
幅反応で検出できるものでなければならない。これは、
蛍光標識したプローブを用いて行えるだけでなく、NMR
により検出することのできる標識を用いて行うことも可
能である。しかしながら、少なくとも1種の蛍光標識し
たハイブリダイゼーションプローブを用いて、増幅され
た核酸を検出する方法が、特に好ましい。
幅反応で検出できるものでなければならない。これは、
蛍光標識したプローブを用いて行えるだけでなく、NMR
により検出することのできる標識を用いて行うことも可
能である。しかしながら、少なくとも1種の蛍光標識し
たハイブリダイゼーションプローブを用いて、増幅され
た核酸を検出する方法が、特に好ましい。
【００５０】多種多様な試験手順が可能である。次の4
つの検出方式は、本発明の添加剤を利用するうえで特に
有用であることが判明しているが、このことを本発明の
範囲を限定するものと解釈すべきではない。
つの検出方式は、本発明の添加剤を利用するうえで特に
有用であることが判明しているが、このことを本発明の
範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【００５１】(i) FRETハイブリダイゼーションプローブ
この試験方式の場合、増幅された標的核酸の同一ストラ
ンドの隣接部位に相補的な2つの1本鎖ハイブリダイゼー
ションプローブを同時に使用する。両方のプローブは異
なる蛍光成分で標識されている。適切な波長の光で励起
すると、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従って、第1
の成分は吸収されたエネルギーを第2の成分に移動する
ので、両方のハイブリダイゼーションプローブが検出対
象の標的分子の隣接位置に結合したときに第2の成分の
蛍光放出を測定することができる。
ンドの隣接部位に相補的な2つの1本鎖ハイブリダイゼー
ションプローブを同時に使用する。両方のプローブは異
なる蛍光成分で標識されている。適切な波長の光で励起
すると、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従って、第1
の成分は吸収されたエネルギーを第2の成分に移動する
ので、両方のハイブリダイゼーションプローブが検出対
象の標的分子の隣接位置に結合したときに第2の成分の
蛍光放出を測定することができる。
【００５２】本発明の範囲内で利用可能なすべての検出
方式の中でも特に、この「FRETハイブリダイゼーション
プローブ」は、感度、精度、および信頼性が高いことが
判明した。
方式の中でも特に、この「FRETハイブリダイゼーション
プローブ」は、感度、精度、および信頼性が高いことが
判明した。
【００５３】もう1つの選択肢として、蛍光標識したプ
ライマーと１種のみの標識したオリゴヌクレオチドプロ
ーブとを使用することも可能である(Bernard ら, Analy
tical Biochemistry 235, p.1001-107 (1998))。
ライマーと１種のみの標識したオリゴヌクレオチドプロ
ーブとを使用することも可能である(Bernard ら, Analy
tical Biochemistry 235, p.1001-107 (1998))。
【００５４】(ii) TaqManハイブリダイゼーションプロ
ーブ 1本鎖ハイブリダイゼーションプローブを2つの成分で標
識する。第1の成分を適切な波長の光で励起すると、吸
収されたエネルギーは、蛍光共鳴エネルギー移動の原理
に従って、いわゆるクエンチャーである第2の成分に移
動する。このハイブリダイゼーションプローブは、PCR
反応のアニーリング期に標的DNAに結合し、それに続く
伸長期にTaqポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活
性により分解される。その結果、励起された蛍光成分と
クエンチャーとが空間的に互いに分離するので、第1の
成分の蛍光発光を測定することができる。
ーブ 1本鎖ハイブリダイゼーションプローブを2つの成分で標
識する。第1の成分を適切な波長の光で励起すると、吸
収されたエネルギーは、蛍光共鳴エネルギー移動の原理
に従って、いわゆるクエンチャーである第2の成分に移
動する。このハイブリダイゼーションプローブは、PCR
反応のアニーリング期に標的DNAに結合し、それに続く
伸長期にTaqポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活
性により分解される。その結果、励起された蛍光成分と
クエンチャーとが空間的に互いに分離するので、第1の
成分の蛍光発光を測定することができる。
【００５５】(iii) 分子ビーコン
該ハイブリダイゼーションプローブもまた、第1の成分
とクエンチャーとで標識されている。好ましくは、これ
らの標識は、プローブの両端に位置する。プローブの2
次構造の結果として、両方の成分は、溶液状態では空間
的に近接した位置にある。標的核酸にハイブリダイズし
た後では、両方の成分は互いに分離されるので、適切な
波長の光で励起すると、第1の成分の蛍光発光を測定す
ることができる(米国特許第5,118,801号)。
とクエンチャーとで標識されている。好ましくは、これ
らの標識は、プローブの両端に位置する。プローブの2
次構造の結果として、両方の成分は、溶液状態では空間
的に近接した位置にある。標的核酸にハイブリダイズし
た後では、両方の成分は互いに分離されるので、適切な
波長の光で励起すると、第1の成分の蛍光発光を測定す
ることができる(米国特許第5,118,801号)。
【００５６】(iv) SybrGreenI方式
2本鎖核酸結合性部分を用いて増幅産物を検出する場
合、本発明に係る添加剤の存在下でリアルタイムPCRを
行うならば、これもまた、本発明の範囲内である。たと
えば、適切な波長の光で励起すると2本鎖核酸との相互
作用により対応する蛍光シグナルを発光する蛍光性DNA
結合性色素を用いて本発明による各増幅産物を検出する
こともできる。色素SybrGreenIおよびSybrGold(Molecul
ar Probes)は、本出願に特に好適であることが判明し
た。このほか、インターカレートする色素を使用するこ
ともできる。しかしながら、この方式では、異なる増幅
産物を識別するために、それぞれの融解曲線分析を行う
ことが必要である(米国特許第6,174,670号)。
合、本発明に係る添加剤の存在下でリアルタイムPCRを
行うならば、これもまた、本発明の範囲内である。たと
えば、適切な波長の光で励起すると2本鎖核酸との相互
作用により対応する蛍光シグナルを発光する蛍光性DNA
結合性色素を用いて本発明による各増幅産物を検出する
こともできる。色素SybrGreenIおよびSybrGold(Molecul
ar Probes)は、本出願に特に好適であることが判明し
た。このほか、インターカレートする色素を使用するこ
ともできる。しかしながら、この方式では、異なる増幅
産物を識別するために、それぞれの融解曲線分析を行う
ことが必要である(米国特許第6,174,670号)。
【００５７】同様にリアルタイムモニタリングを含みう
る本発明の他の実施形態では、1サイクルが1分未満であ
る迅速熱サイクルを利用して本発明に係る添加剤の存在
下で増幅反応を行う。そのような迅速熱サイクルに用い
る基本的装置は、たとえば、LightCycler(Roche Molecu
lar Biochemicals)により提供され、国際公開第97/4670
7号および国際公開第97/46712号に開示されている。本
発明によれば、プライマーのアニーリングは、サンプル
中にごく少量しか存在しない標的核酸の量的増幅の律速
段階ではない。したがって、少量因子を増幅するための
それぞれの多重熱サイクルプロトコルに対する時間パラ
メーターは、当技術分野で公知のいかなる種類の熱サイ
クルプロトコルに対しても、修正する必要はない。
る本発明の他の実施形態では、1サイクルが1分未満であ
る迅速熱サイクルを利用して本発明に係る添加剤の存在
下で増幅反応を行う。そのような迅速熱サイクルに用い
る基本的装置は、たとえば、LightCycler(Roche Molecu
lar Biochemicals)により提供され、国際公開第97/4670
7号および国際公開第97/46712号に開示されている。本
発明によれば、プライマーのアニーリングは、サンプル
中にごく少量しか存在しない標的核酸の量的増幅の律速
段階ではない。したがって、少量因子を増幅するための
それぞれの多重熱サイクルプロトコルに対する時間パラ
メーターは、当技術分野で公知のいかなる種類の熱サイ
クルプロトコルに対しても、修正する必要はない。
【００５８】3〜6個のオルトヒドロキシ酸部分を有する
ポリヒドロキシアリールポリ酸を、非特異的ハイブリダ
イゼーション作用を減少させるために、核酸を含有する
混合物に対する添加剤として使用するならば、その場合
もまた本発明の範囲内である。ホットスタートPCR法に
おけるプライマーダイマー形成の防止に対するプラスの
効果に加えて、そのようなポリヒドロキシアリールポリ
酸の添加は、たとえば、サザンブロット分析、ノーザン
ブロット分析、ドットブロット分析などのような任意の
種類の分析的ハイブリダイゼーション法の特異性を増大
させることもある。
ポリヒドロキシアリールポリ酸を、非特異的ハイブリダ
イゼーション作用を減少させるために、核酸を含有する
混合物に対する添加剤として使用するならば、その場合
もまた本発明の範囲内である。ホットスタートPCR法に
おけるプライマーダイマー形成の防止に対するプラスの
効果に加えて、そのようなポリヒドロキシアリールポリ
酸の添加は、たとえば、サザンブロット分析、ノーザン
ブロット分析、ドットブロット分析などのような任意の
種類の分析的ハイブリダイゼーション法の特異性を増大
させることもある。
【００５９】本発明のさらに他の形態において、3〜6個
のオルトヒドロキシ酸部分を有するそのようなポリヒド
ロキシアリールポリ酸は、核酸の融点の測定、すなわ
ち、少なくとも部分的に2本鎖である核酸ハイブリッド
分子が2つの1本鎖分子に変性する融解温度の測定、のた
めの添加剤として使用することができる。好ましくは、
増幅反応自体に続いて融解曲線分析により単一または複
数の増幅産物を同定することを特徴とするリアルタイム
PCRの実施形態で添加することができる。実施例に示さ
れるように、本発明に係るポリヒドロキシアリールポリ
酸を添加すると、蛍光対温度プロットの1次微分におけ
る融解曲線ピークが一段とシャープな形になり、したが
って正確な融解温度をより精密に測定できるようにな
る。
のオルトヒドロキシ酸部分を有するそのようなポリヒド
ロキシアリールポリ酸は、核酸の融点の測定、すなわ
ち、少なくとも部分的に2本鎖である核酸ハイブリッド
分子が2つの1本鎖分子に変性する融解温度の測定、のた
めの添加剤として使用することができる。好ましくは、
増幅反応自体に続いて融解曲線分析により単一または複
数の増幅産物を同定することを特徴とするリアルタイム
PCRの実施形態で添加することができる。実施例に示さ
れるように、本発明に係るポリヒドロキシアリールポリ
酸を添加すると、蛍光対温度プロットの1次微分におけ
る融解曲線ピークが一段とシャープな形になり、したが
って正確な融解温度をより精密に測定できるようにな
る。
【００６０】さらに他の形態において、本発明は、核酸
増幅反応を行うのに必要な成分と3〜6個のオルトヒドロ
キシ酸部分を有するポリヒドロキシアリールポリ酸とを
含む組成物に関する。一実施形態では、本発明の組成物
は、特異的増幅プライマーが欠如している以外は核酸増
幅に必要な成分をすべて含む一般的組成物である。第2
の実施形態では、本発明の組成物は、増幅プライマーの
特異的ペアを含めて特異的増幅反応を行うのに必要な成
分をすべて含むパラメーター特異的組成物である。第3
の実施形態では、第2の実施形態に係る組成物は、適切
な蛍光性ハイブリダイゼーションプローブまたはSybrGr
eenなどの2本鎖核酸結合性化合物のような検出部分をさ
らに含む。
増幅反応を行うのに必要な成分と3〜6個のオルトヒドロ
キシ酸部分を有するポリヒドロキシアリールポリ酸とを
含む組成物に関する。一実施形態では、本発明の組成物
は、特異的増幅プライマーが欠如している以外は核酸増
幅に必要な成分をすべて含む一般的組成物である。第2
の実施形態では、本発明の組成物は、増幅プライマーの
特異的ペアを含めて特異的増幅反応を行うのに必要な成
分をすべて含むパラメーター特異的組成物である。第3
の実施形態では、第2の実施形態に係る組成物は、適切
な蛍光性ハイブリダイゼーションプローブまたはSybrGr
eenなどの2本鎖核酸結合性化合物のような検出部分をさ
らに含む。
【００６１】同様に、本発明は、核酸反応を行うのに必
要なすべての成分と3〜6個のオルトヒドロキシ酸部分を
有するポリヒドロキシアリールポリ酸とを含む組成物を
備えたキットに関する。好ましくは、これらのキット
は、先に開示したような組成物を備えている。このほ
か、増幅に必要な成分と本発明に係る添加剤とが異なる
保存容器中に存在してもよい。
要なすべての成分と3〜6個のオルトヒドロキシ酸部分を
有するポリヒドロキシアリールポリ酸とを含む組成物を
備えたキットに関する。好ましくは、これらのキット
は、先に開示したような組成物を備えている。このほ
か、増幅に必要な成分と本発明に係る添加剤とが異なる
保存容器中に存在してもよい。
【００６２】本発明に係るポリヒドロキシアリールポリ
酸添加剤の構造 3〜6個のオルトヒドロキシ酸部分を有する多種多様なポ
リヒドロキシアリールポリ酸がホットスタート効果を生
じること、したがってより有効な核酸増幅反応を可能に
することが、本発明者らにより確認された。特に、本発
明に係るポリヒドロキシアリールポリ酸が追加の酸部分
をまったく含有していない場合、すなわち、酸部分の全
数とヒドロキシル部分の全数とが同一である場合、有利
であることが判明した。
酸添加剤の構造 3〜6個のオルトヒドロキシ酸部分を有する多種多様なポ
リヒドロキシアリールポリ酸がホットスタート効果を生
じること、したがってより有効な核酸増幅反応を可能に
することが、本発明者らにより確認された。特に、本発
明に係るポリヒドロキシアリールポリ酸が追加の酸部分
をまったく含有していない場合、すなわち、酸部分の全
数とヒドロキシル部分の全数とが同一である場合、有利
であることが判明した。
【００６３】特に、これらの化合物は、次の構造：
【化３】式I：
［式中、A1、A2、およびA3は、同一でも異なってもよ
く、それぞれ酸部分を表し、-OH基は、A1、A2、およびA
3に対してオルト位にあり、R1およびR2は、同一でも異
なってもよく、それぞれH、低級アルキル、CH2-アリー
ル、ハロゲン、または酸部分のいずれかを表し、L1およ
びL2は、同一でも異なってもよく、それぞれ -CH2-、 -CO-、 -CR3(O-A)-(ここで、Aは、H、低級アルキル、もしくは
アリールである)、 -CR3(N(B1B2))-(ここで、B1およびB2は、H、低級アルキ
ル、もしくはアリールのいずれかである)、または -C+アリール- のいずれかを表し、R3はHもしくはアリールである、こ
とを特徴とする］を有し得る。
く、それぞれ酸部分を表し、-OH基は、A1、A2、およびA
3に対してオルト位にあり、R1およびR2は、同一でも異
なってもよく、それぞれH、低級アルキル、CH2-アリー
ル、ハロゲン、または酸部分のいずれかを表し、L1およ
びL2は、同一でも異なってもよく、それぞれ -CH2-、 -CO-、 -CR3(O-A)-(ここで、Aは、H、低級アルキル、もしくは
アリールである)、 -CR3(N(B1B2))-(ここで、B1およびB2は、H、低級アルキ
ル、もしくはアリールのいずれかである)、または -C+アリール- のいずれかを表し、R3はHもしくはアリールである、こ
とを特徴とする］を有し得る。
【００６４】これに関連して、「低級アルキル」とは、
1〜6個のC原子からなるアルキルを意味するものとす
る。
1〜6個のC原子からなるアルキルを意味するものとす
る。
【００６５】アリール部分とは、6〜22個のC原子からな
る芳香環構造である。しかしながら、実験合成条件を考
慮すると、6個のC原子からなる環構造が非常に好まし
い。
る芳香環構造である。しかしながら、実験合成条件を考
慮すると、6個のC原子からなる環構造が非常に好まし
い。
【００６６】本発明に関連して、アリール部分は、1個
以上の追加の置換基を有する部分を含む。そのような置
換基は、たとえば、ハロゲン、ヒドロキシル基、酸基、
または低級アルキル基であってよい。
以上の追加の置換基を有する部分を含む。そのような置
換基は、たとえば、ハロゲン、ヒドロキシル基、酸基、
または低級アルキル基であってよい。
【００６７】5個のC原子と追加のN原子とからなる複素
環式芳香環構造を有するポリ酸をPCR添加剤として使用
することもまた、本発明の範囲内である。したがって、
本発明に関連して、「アリール」とは、主として、6個
のC原子の同素環であってもよいしピリジンのような5個
のC原子と1個のN原子との複素環であってもよい芳香族6
員環構造を意味するものとする。
環式芳香環構造を有するポリ酸をPCR添加剤として使用
することもまた、本発明の範囲内である。したがって、
本発明に関連して、「アリール」とは、主として、6個
のC原子の同素環であってもよいしピリジンのような5個
のC原子と1個のN原子との複素環であってもよい芳香族6
員環構造を意味するものとする。
【００６８】さらに、式I中の1個、数個、またはすべて
の芳香環構造が、5個のC原子と1個のN原子とからなる複
素環式6員環構造で置き換えられた場合もまた、本発明
の範囲内である。
の芳香環構造が、5個のC原子と1個のN原子とからなる複
素環式6員環構造で置き換えられた場合もまた、本発明
の範囲内である。
【００６９】開示した化合物のいくつかは、以下で開示
されるように、キノイド形をとることも可能である。
されるように、キノイド形をとることも可能である。
【００７０】しかしながら、3〜6個の酸部分を有する異
なるポリヒドロキシアリールポリ酸を添加したときに定
量的に観測されるホットスタート効果は、添加剤として
使用する分子の実際のタイプに依存してさまざまであ
る。こうして、試験した異なる化合物の分子構造を比較
することにより、いくつかの特徴部分が所望のホットス
タート効果を得るのに有利であることが判明した。
なるポリヒドロキシアリールポリ酸を添加したときに定
量的に観測されるホットスタート効果は、添加剤として
使用する分子の実際のタイプに依存してさまざまであ
る。こうして、試験した異なる化合物の分子構造を比較
することにより、いくつかの特徴部分が所望のホットス
タート効果を得るのに有利であることが判明した。
【００７１】第１に、アリール部分の数を制限すると有
利である。好ましくは、本発明に係る添加剤は、3個ま
たは4個のアリール部分からなる。なぜなら、より大き
な分子の疎水性基は、増幅反応混合物のタンパク質成分
と非特異的に相互作用し得るからである。
利である。好ましくは、本発明に係る添加剤は、3個ま
たは4個のアリール部分からなる。なぜなら、より大き
な分子の疎水性基は、増幅反応混合物のタンパク質成分
と非特異的に相互作用し得るからである。
【００７２】それぞれのアリール部分について、酸性基
およびヒドロキシル基が芳香環に直接結合していてもよ
い。この場合、フェノール型構造が形成される。あるい
はまた、酸性基が芳香環に直接結合していてもよいし、
または、酸性基が好ましくは1個、2個、またはそれ以外
の少数個の残基のみからなるC原子の連結基を介して芳
香環に結合していてもよい。
およびヒドロキシル基が芳香環に直接結合していてもよ
い。この場合、フェノール型構造が形成される。あるい
はまた、酸性基が芳香環に直接結合していてもよいし、
または、酸性基が好ましくは1個、2個、またはそれ以外
の少数個の残基のみからなるC原子の連結基を介して芳
香環に結合していてもよい。
【００７３】非常に好ましい実施形態では、ヒドロキシ
ル基および酸性基はすべて、芳香環に直接結合され、互
いにオルト位に位置する。
ル基および酸性基はすべて、芳香環に直接結合され、互
いにオルト位に位置する。
【００７４】第2に、カルボン酸、スルホン酸、ホスホ
ン酸などの異なる酸性部分を有することも可能である
が、本発明に係る添加剤中に存在するすべての酸性残基
が同一である場合が有利である。さらに、少なくとも1
個、数個、またはすべての酸性残基がカルボン酸である
場合も好ましい。
ン酸などの異なる酸性部分を有することも可能である
が、本発明に係る添加剤中に存在するすべての酸性残基
が同一である場合が有利である。さらに、少なくとも1
個、数個、またはすべての酸性残基がカルボン酸である
場合も好ましい。
【００７５】第3に、本発明に従って使用される添加剤
は、アウリントリカルボン酸誘導体であってもよい。な
ぜなら、以下の実施例で示されるように、サリチル酸お
よび／またはメチレンジサリチル酸から出発して、理に
かなったほどほどの調製努力を払えば、そのような誘導
体を生成することができるからである。
は、アウリントリカルボン酸誘導体であってもよい。な
ぜなら、以下の実施例で示されるように、サリチル酸お
よび／またはメチレンジサリチル酸から出発して、理に
かなったほどほどの調製努力を払えば、そのような誘導
体を生成することができるからである。
【００７６】少なくとも3個の酸部分が7個のC原子の鎖
により他の酸部分と結合されたポリヒドロキシアリール
ポリ酸を使用することが、本発明の特徴である。鎖内の
C原子自体は、単共有結合や二重結合を介して結合され
ていてもよいし、好ましくは1個または数個の芳香環系
の一部分であってもよい。そのような構造の利点は、本
発明者らがこれまでに得た実験データからかなりはっき
りしているが、この驚くべき効果の科学的な説明は依然
として不明瞭なままである。
により他の酸部分と結合されたポリヒドロキシアリール
ポリ酸を使用することが、本発明の特徴である。鎖内の
C原子自体は、単共有結合や二重結合を介して結合され
ていてもよいし、好ましくは1個または数個の芳香環系
の一部分であってもよい。そのような構造の利点は、本
発明者らがこれまでに得た実験データからかなりはっき
りしているが、この驚くべき効果の科学的な説明は依然
として不明瞭なままである。
【００７７】特定の実施形態(以上に開示した特徴を互
いに明確に排除するものではない)では、本発明に係る
添加剤は、次のような化合物である：
いに明確に排除するものではない)では、本発明に係る
添加剤は、次のような化合物である：
【化４】式II：
[式中、A1、A2、A3、およびA4は、それぞれ、同一であ
っても異なっていてもよい酸部分を表す]。この場合に
も、A1、A2、A3、およびA4は、好ましくは、カルボン酸
である。さらに、すべてのヒドロキシル基は同一の芳香
環の対応するカルボン酸部分に対してオルト位に位置す
ることが不可欠である。
っても異なっていてもよい酸部分を表す]。この場合に
も、A1、A2、A3、およびA4は、好ましくは、カルボン酸
である。さらに、すべてのヒドロキシル基は同一の芳香
環の対応するカルボン酸部分に対してオルト位に位置す
ることが不可欠である。
【００７８】本発明に係る化合物には、ヒドロキシル基
および/または酸性基が脱プロトン化された脱プロトン
化形態のものも包含される。対応するカチオンの性質に
関してなんら制限はない。しかしながら、アンモニウ
ム、トリ/テトラアルキルアンモニウム、ナトリウムお
よびマグネシウム(または1価および2価)カチオンは、対
イオンとして好ましい。
および/または酸性基が脱プロトン化された脱プロトン
化形態のものも包含される。対応するカチオンの性質に
関してなんら制限はない。しかしながら、アンモニウ
ム、トリ/テトラアルキルアンモニウム、ナトリウムお
よびマグネシウム(または1価および2価)カチオンは、対
イオンとして好ましい。
【００７９】L1/L2の一方または両方がC+アリールであ
る式Iで表される化合物は、そのような化合物のキノイ
ド特性を強調した式により開示することもできる。なぜ
なら、たとえば、キノイド構造と式IIで表されるトリフ
ェニルメチリウム構造とが同一の化合物を記述する2つ
の異なる方法であるにすぎないからである。これらの場
合、ヒドロキシアニオン、水、アンモニア、メルカプタ
ンのような求核試薬が脱プロトン化に続いて最終的にメ
チリウム炭素原子に付加し得る。しかしながら、そのよ
うな付加が可逆的であることは当技術分野で公知であ
る。
る式Iで表される化合物は、そのような化合物のキノイ
ド特性を強調した式により開示することもできる。なぜ
なら、たとえば、キノイド構造と式IIで表されるトリフ
ェニルメチリウム構造とが同一の化合物を記述する2つ
の異なる方法であるにすぎないからである。これらの場
合、ヒドロキシアニオン、水、アンモニア、メルカプタ
ンのような求核試薬が脱プロトン化に続いて最終的にメ
チリウム炭素原子に付加し得る。しかしながら、そのよ
うな付加が可逆的であることは当技術分野で公知であ
る。
【００８０】PCR増幅混合物に添加したときに広範なホ
ットスタート効果を示す具体的な代表例の1つは、以下
の式III：
ットスタート効果を示す具体的な代表例の1つは、以下
の式III：
【化５】
で表される。
【００８１】本発明の理解に役立つように、以下の実施
例、参考文献、配列表、および図を提供する。本発明の
真の範囲は、添付の特許請求の範囲に規定する。本発明
の精神から逸脱することなく、記載の手順に変更を加え
ることができるものと解釈される。
例、参考文献、配列表、および図を提供する。本発明の
真の範囲は、添付の特許請求の範囲に規定する。本発明
の精神から逸脱することなく、記載の手順に変更を加え
ることができるものと解釈される。
【００８２】
【実施例】実施例1 ATAの合成
D.A. HOLADAY, J. Am. Chem.Soc. 62, p.989. (1940)に
より発表された手順に変更を加えて、アウリントリカル
ボン酸(ATA)のアンモニウム塩を調製した。簡潔に述べ
ると、5gの硝酸ナトリウム(Aldrich 43,160-5)を、アル
ゴン雰囲気下、室温で、36ccの硫酸(Merck 731)に、激
しく撹拌しながら徐々に添加した。この溶液に、10g(35
mmol)のメチレンジサリチル酸(ABCR, AV 12953)と5g(36
mmol)のサリチル酸(Aldrich 24,758-8)との均質混合物
を、激しく攪拌しながら少量ずつ添加した。すべての固
体物質を添加した後、混合物をときどき攪拌しながら1
時間放置した。36ccの硫酸中の5gの硝酸ナトリウムの混
合物を上述したように調製して赤褐色溶液に添加し、室
温で一晩攪拌した。反応混合物を1lの氷水に徐々に添加
し、1時間放置し、そしてブフナー漏斗で濾過した。濾
液に酸が含まれなくなるまで、ブフナー漏斗に集められ
た残渣を脱イオン水で洗浄した。減圧下、50℃で、塩化
カルシウムを用いて残渣を乾燥させた。乾燥させた生成
物の収量は、12.5gであった。
より発表された手順に変更を加えて、アウリントリカル
ボン酸(ATA)のアンモニウム塩を調製した。簡潔に述べ
ると、5gの硝酸ナトリウム(Aldrich 43,160-5)を、アル
ゴン雰囲気下、室温で、36ccの硫酸(Merck 731)に、激
しく撹拌しながら徐々に添加した。この溶液に、10g(35
mmol)のメチレンジサリチル酸(ABCR, AV 12953)と5g(36
mmol)のサリチル酸(Aldrich 24,758-8)との均質混合物
を、激しく攪拌しながら少量ずつ添加した。すべての固
体物質を添加した後、混合物をときどき攪拌しながら1
時間放置した。36ccの硫酸中の5gの硝酸ナトリウムの混
合物を上述したように調製して赤褐色溶液に添加し、室
温で一晩攪拌した。反応混合物を1lの氷水に徐々に添加
し、1時間放置し、そしてブフナー漏斗で濾過した。濾
液に酸が含まれなくなるまで、ブフナー漏斗に集められ
た残渣を脱イオン水で洗浄した。減圧下、50℃で、塩化
カルシウムを用いて残渣を乾燥させた。乾燥させた生成
物の収量は、12.5gであった。
【００８３】限外濾過およびシリカゲルクロマトグラフ
ィー(カラムクロマトグラフィーおよび分取薄層クロマ
トグラフィー)を用いてM. CUSHMANの方法により、さま
ざまなATA誘導体アンモニウム塩の調製および精製を行
った(J. Org. Chem. 57, 3861-3866 (1992)およびJ. Or
g. Chem. 57, 7241-7248 (1992))。
ィー(カラムクロマトグラフィーおよび分取薄層クロマ
トグラフィー)を用いてM. CUSHMANの方法により、さま
ざまなATA誘導体アンモニウム塩の調製および精製を行
った(J. Org. Chem. 57, 3861-3866 (1992)およびJ. Or
g. Chem. 57, 7241-7248 (1992))。
【００８４】実施例2 低分子量ATA誘導体の限外濾過および式IIIで表される化
合物Iの精製 10.5gのATA粗生成物を1lの0.1N NaHCO3溶液に溶解し、M
W1000カットオフ膜上に充填した。段階的に水を添加す
る3回の操作で、合計4lの限外濾液を集めた。限外濾液
を300mlの体積までエバポレートし、溶液をHClで酸性化
させてATA化合物を沈澱させた。濾過により沈殿を回収
し、蒸留水で洗浄して酸を除去した。希水酸化アンモニ
ウムを添加した後、溶解したATAアンモニウム塩を凍結
乾燥させた(収量; 4.6g)。
合物Iの精製 10.5gのATA粗生成物を1lの0.1N NaHCO3溶液に溶解し、M
W1000カットオフ膜上に充填した。段階的に水を添加す
る3回の操作で、合計4lの限外濾液を集めた。限外濾液
を300mlの体積までエバポレートし、溶液をHClで酸性化
させてATA化合物を沈澱させた。濾過により沈殿を回収
し、蒸留水で洗浄して酸を除去した。希水酸化アンモニ
ウムを添加した後、溶解したATAアンモニウム塩を凍結
乾燥させた(収量; 4.6g)。
【００８５】分別したATAサンプル1gをアセトン(250ml)
中に溶解させ、シリカゲル60(50g、Merck)を添加した。
溶媒を蒸発させてシリカゲルを乾燥させた。次に、同一
タイプのシリカゲルの湿潤カラム上に混合物を載せ、ク
ロロホルム/ギ酸/テトラヒドロフラン(100:4:0.3)を含
有する混合溶媒でカラムから溶出させた。TLCによりカ
ラムクロマトグラフィーをモニターした。同一の系を用
いてTLCによりモニターしながら、標的物質が溶出され
るまで、混合溶媒を100:6:2およびl00:6:10(クロロホル
ム/ギ酸/テトラヒドロフラン)に段階的に変化させた。
中に溶解させ、シリカゲル60(50g、Merck)を添加した。
溶媒を蒸発させてシリカゲルを乾燥させた。次に、同一
タイプのシリカゲルの湿潤カラム上に混合物を載せ、ク
ロロホルム/ギ酸/テトラヒドロフラン(100:4:0.3)を含
有する混合溶媒でカラムから溶出させた。TLCによりカ
ラムクロマトグラフィーをモニターした。同一の系を用
いてTLCによりモニターしながら、標的物質が溶出され
るまで、混合溶媒を100:6:2およびl00:6:10(クロロホル
ム/ギ酸/テトラヒドロフラン)に段階的に変化させた。
【００８６】化合物Iの最終的精製は、クロロホルム/ギ
酸/テトラヒドロフラン(100:6:2)の系を用いて分取TLC
により行った。
酸/テトラヒドロフラン(100:6:2)の系を用いて分取TLC
により行った。
【００８７】NMRスペクトルはBruker DPX 300で測定し
た。1H-NMRスペクトルは300MHzで記録し、13C-NMRスペ
クトルは75MHzで取得した。NMRサンプルはDMSO-d6中で
調製し、内部標準としてTMSを参照した。水/40%アセト
ニトリル中の0.02% TFAを用いてMicromass Platform II
でESI-MSを測定した。
た。1H-NMRスペクトルは300MHzで記録し、13C-NMRスペ
クトルは75MHzで取得した。NMRサンプルはDMSO-d6中で
調製し、内部標準としてTMSを参照した。水/40%アセト
ニトリル中の0.02% TFAを用いてMicromass Platform II
でESI-MSを測定した。
【００８８】UV: λmax(エタノール中): 309nm, 528nm
【００８９】TLC(シリカゲル60; イソプロパノール/25%
アンモニア/水6:3:1で展開した): Rf: 0.75
アンモニア/水6:3:1で展開した): Rf: 0.75
【００９０】1H-NMR(300MHz, DMSO-d6)
7.60 (d, J=2.4 Hz, 2H), 7.57 (d, J=21 Hz, 1H), 7.4
9 (d, J=2.3 Hz, 1H), 7.27 (m, 5H), 6.88 (d, J=8.7
Hz, 2H), 6.82 (d, J=8.5 Hz, 1H), 3.96 (s, 2H)
9 (d, J=2.3 Hz, 1H), 7.27 (m, 5H), 6.88 (d, J=8.7
Hz, 2H), 6.82 (d, J=8.5 Hz, 1H), 3.96 (s, 2H)
【００９１】13C-NMR(75MHz, DMSO-d6)
δ 173.20, 172.70, 172.66, 160.86, 160.29, 159.18,
139.05, 138.49, 136.57, 135.80, 131.64, 130.70, 1
29.74, 129.13, 127.87, 117.75, 117.29, 113.43, 11
2.99, 112.59, 79.90
139.05, 138.49, 136.57, 135.80, 131.64, 130.70, 1
29.74, 129.13, 127.87, 117.75, 117.29, 113.43, 11
2.99, 112.59, 79.90
【００９２】ESI-MS: 573.0
【００９３】実施例3 PCRにおけるプライマーダイマー形成の阻害
この実験では、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ(D
PD)cDNA(プラスミド中にクローン化)に由来する配列を
増幅するために、次のオリゴヌクレオチド(それぞれ10
μM)からなる10倍のプライマー混合物を調製した。プラ
イマーDPD rev (配列: 5'-TCT TGC GAT GCT CAC AAT AT
C AGT GAC-3') (配列番号1) プライマーDPD fwd (配列: 5'-ATG GCA TGG GAG AAA GA
G GAA TG-3') (配列番号2)
PD)cDNA(プラスミド中にクローン化)に由来する配列を
増幅するために、次のオリゴヌクレオチド(それぞれ10
μM)からなる10倍のプライマー混合物を調製した。プラ
イマーDPD rev (配列: 5'-TCT TGC GAT GCT CAC AAT AT
C AGT GAC-3') (配列番号1) プライマーDPD fwd (配列: 5'-ATG GCA TGG GAG AAA GA
G GAA TG-3') (配列番号2)
【００９４】構成的にDPDを発現する細胞系から単離し
たcDNAを含有するプラスミドの3つの段階的な単純稀釈
液を、c=10fg/μl、1fg/μl、および0.1fg/μlの水中濃
度で調製した。これとは別に、実施例1および2に従って
合成および精製した10mgの化合物1を1mlのPCRグレード
の水に溶解させた。
たcDNAを含有するプラスミドの3つの段階的な単純稀釈
液を、c=10fg/μl、1fg/μl、および0.1fg/μlの水中濃
度で調製した。これとは別に、実施例1および2に従って
合成および精製した10mgの化合物1を1mlのPCRグレード
の水に溶解させた。
【００９５】PCRを、LC DNA Master SYBRGreen Iキット
(Roche Molecular Biochemicals,カタログ番号2158817-
001, 基本的には、20μl反応液用にPCRグレードのH2O、
MgCl2(25mM)および10×Mastermixを含有する)を用い
て、実施例2から得られた式IIIで表される0.1μg/μlの
化合物の存在下または不在下で、LightCycler（商標）
装置(Roche Molecular Biochemicals)により行った。
(Roche Molecular Biochemicals,カタログ番号2158817-
001, 基本的には、20μl反応液用にPCRグレードのH2O、
MgCl2(25mM)および10×Mastermixを含有する)を用い
て、実施例2から得られた式IIIで表される0.1μg/μlの
化合物の存在下または不在下で、LightCycler（商標）
装置(Roche Molecular Biochemicals)により行った。
【００９６】変性、増幅、および融解曲線分析に対する
値を、次のようにプログラムした。
値を、次のようにプログラムした。
【００９７】
【表１】
【００９８】
【表２】
【００９９】
【表３】
【０１００】
【表４】
【０１０１】製造業者の説明書に従ってLightCycler装
置のSybrGreen方式を用いてリアルタイムで反応をモニ
ターした。標的プラスミドをまったく含まない負の対照
を含有するサンプルの蛍光シグナルを図1aに示す。図を
見てわかるように、プライマーダイマー形成に対応する
蛍光シグナルは、実施例2に係る化合物の不在下でのみ
生成される。
置のSybrGreen方式を用いてリアルタイムで反応をモニ
ターした。標的プラスミドをまったく含まない負の対照
を含有するサンプルの蛍光シグナルを図1aに示す。図を
見てわかるように、プライマーダイマー形成に対応する
蛍光シグナルは、実施例2に係る化合物の不在下でのみ
生成される。
【０１０２】増幅に続いて、キャピラリー反応容器を開
放して内容物を取り出し、ゲル電気泳動にかけた。その
ために、PCR産物をTBEサンプル緩衝液(Invitrogen LC66
78/46-5022)で5倍希釈し、7μlをTBEゲル(Invitrogen E
C63155)に充填した。200Vで70分後、ゲルをSYBRGreen I
Iで30分間染色し、Lumi-Imager F1(Roche MolecularBio
chemicals, カタログ番号2012847)(蛍光: 520nm, 20秒)
で検出を行った。
放して内容物を取り出し、ゲル電気泳動にかけた。その
ために、PCR産物をTBEサンプル緩衝液(Invitrogen LC66
78/46-5022)で5倍希釈し、7μlをTBEゲル(Invitrogen E
C63155)に充填した。200Vで70分後、ゲルをSYBRGreen I
Iで30分間染色し、Lumi-Imager F1(Roche MolecularBio
chemicals, カタログ番号2012847)(蛍光: 520nm, 20秒)
で検出を行った。
【０１０３】結果を図1bに示す。図を見てわかるよう
に、最も速く移動するバンドは単一のプライマーに対応
し、下から2番目のバンドは生成したプライマーダイマ
ーに対応し、そして上側のバンドは特異的増幅産物に対
応する。化合物Iを添加すると(右側ゲルライン4、5、
7、8、12、および13)、ごく少量の鋳型DNA(0.2fg)を増
幅させた場合でさえも、プライマーダイマー形成は完全
に阻害された。
に、最も速く移動するバンドは単一のプライマーに対応
し、下から2番目のバンドは生成したプライマーダイマ
ーに対応し、そして上側のバンドは特異的増幅産物に対
応する。化合物Iを添加すると(右側ゲルライン4、5、
7、8、12、および13)、ごく少量の鋳型DNA(0.2fg)を増
幅させた場合でさえも、プライマーダイマー形成は完全
に阻害された。
【０１０４】実施例4 リアルタイムPCR感度の増大 - SybrGreen方式
この実験では、3pg/20μlのDNAを含有する増幅混合物を
提供するために、βグロビンプライマー混合物(それぞ
れ10×5μM)とヒトゲノムDNAからなる対照DNA(15ng/μ
l)とを含むLightCycler-対照キットDNA(Roche Molecula
r Biochemicals,カタログ番号2158833)を使用した。
提供するために、βグロビンプライマー混合物(それぞ
れ10×5μM)とヒトゲノムDNAからなる対照DNA(15ng/μ
l)とを含むLightCycler-対照キットDNA(Roche Molecula
r Biochemicals,カタログ番号2158833)を使用した。
【０１０５】プライマーは、
CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC (配列番号3)
および
ACA CAA CTG TGT TCA CTA GC (配列番号4)
であった。
【０１０６】PCRを、効率的な増幅を行うために62℃の
代わりに55℃のアニーリング温度(目標温度)を用いた以
外は基本的には実施例3に開示した通りに、実施例2に係
る化合物の存在下または不在下で行った。
代わりに55℃のアニーリング温度(目標温度)を用いた以
外は基本的には実施例3に開示した通りに、実施例2に係
る化合物の存在下または不在下で行った。
【０１０７】結果を図2に示す。図を見てわかるよう
に、サイクル数が30を超えると86%までシグナルが増強
される。
に、サイクル数が30を超えると86%までシグナルが増強
される。
【０１０８】実施例5 リアルタイムPCRシグナル強度の増大 - FRET-HybProbe
方式 この実験では、実施例3に係るプライマー混合物を使用
した。完全なDPD cDNAを0.4〜40fgの範囲で含有するさ
まざまな量のプラスミドを、実施例3の条件下、0.1μg/
μlの実施例2に係る式IIIで表される化合物１の存在下
または不在下で、プライマー混合物を用いてPCRにより
増幅した。
方式 この実験では、実施例3に係るプライマー混合物を使用
した。完全なDPD cDNAを0.4〜40fgの範囲で含有するさ
まざまな量のプラスミドを、実施例3の条件下、0.1μg/
μlの実施例2に係る式IIIで表される化合物１の存在下
または不在下で、プライマー混合物を用いてPCRにより
増幅した。
【０１０９】リアルタイムPCR検出を行うために、Light
Cyclerジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ(DPD)mRNA
定量キット(Roche Molecular Biochemicals, カタログ
番号3136957)のFRETハイブリダイゼーションプローブ
を、製造業者の説明書に記載の濃度で使用した。
Cyclerジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ(DPD)mRNA
定量キット(Roche Molecular Biochemicals, カタログ
番号3136957)のFRETハイブリダイゼーションプローブ
を、製造業者の説明書に記載の濃度で使用した。
【０１１０】結果を図3〜5に示す。図3を見てわかるよ
うに、0.4fgの鋳型DNAを用いた場合、本発明に係る添加
剤の存在下でのみ特異的増幅シグナルを得ることができ
る。より高い鋳型濃度の場合(図4および5)、本発明に係
る化合物を添加すると、より少ないサイクル数で特異的
シグナルを検出することができる。
うに、0.4fgの鋳型DNAを用いた場合、本発明に係る添加
剤の存在下でのみ特異的増幅シグナルを得ることができ
る。より高い鋳型濃度の場合(図4および5)、本発明に係
る化合物を添加すると、より少ないサイクル数で特異的
シグナルを検出することができる。
【０１１１】実施例6 本発明による融解曲線分析の改良
この実験では、LightCycler LC DNA Master SYBR Green
Iキット(Roche Molecular Biochemicals, カタログ番
号2158817-001)を使用した。30ng/20μl DNAの最終濃度
で増幅混合物中に存在するヒトゲノムDNA由来の各断片
を増幅するために、βアクチンプライマー混合物(それ
ぞれ10×5μM)を使用した。プライマーは、 5'-TCA CGA TGC CAG TGG TAC GG (配列番号5) および 5'-GGA TTC ATA TGT GGG GCA TG (配列番号6) であった。
Iキット(Roche Molecular Biochemicals, カタログ番
号2158817-001)を使用した。30ng/20μl DNAの最終濃度
で増幅混合物中に存在するヒトゲノムDNA由来の各断片
を増幅するために、βアクチンプライマー混合物(それ
ぞれ10×5μM)を使用した。プライマーは、 5'-TCA CGA TGC CAG TGG TAC GG (配列番号5) および 5'-GGA TTC ATA TGT GGG GCA TG (配列番号6) であった。
【０１１２】60℃のアニーリング(標的)温度を用いるよ
うに変更を加えて、基本的には実施例3および4に従っ
て、LightCycler SYBR-Green I方式により、実施例2に
係る化合物の存在下または不在下でPCRを行った。増幅
反応に続いて、製造業者の説明書に従ってLightCycler
装置(Roche Molecular Biochemicals)を用いて融解曲線
分析を行った。融解曲線分析の結果を図6に示す。図を
見てわかるように、実施例2に従って精製した化合物を
添加すると、実施例2に係る化合物を用いない対照反応
と比較して、一段とシャープな融解ピークが得られる。
うに変更を加えて、基本的には実施例3および4に従っ
て、LightCycler SYBR-Green I方式により、実施例2に
係る化合物の存在下または不在下でPCRを行った。増幅
反応に続いて、製造業者の説明書に従ってLightCycler
装置(Roche Molecular Biochemicals)を用いて融解曲線
分析を行った。融解曲線分析の結果を図6に示す。図を
見てわかるように、実施例2に従って精製した化合物を
添加すると、実施例2に係る化合物を用いない対照反応
と比較して、一段とシャープな融解ピークが得られる。
【０１１３】
【発明の効果】以上、説明したように、本発明に係るポ
リヒドロキシアリールポリ酸を用いることにより、特異
的かつ高感度な核酸増幅反応を行うことができるととも
に、分析的ハイブリダイゼーション法の特異性の増大や
融解曲線分析の精度の向上にも寄与することができる。
リヒドロキシアリールポリ酸を用いることにより、特異
的かつ高感度な核酸増幅反応を行うことができるととも
に、分析的ハイブリダイゼーション法の特異性の増大や
融解曲線分析の精度の向上にも寄与することができる。
【０１１４】
【配列表】
<110> F. Hoffmann-La Roche AG
<120> Reagent for improved PCR
<130> PA02-564
<150> EP 01130252.8
<151> 2001-12-19
<160> 6
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 1
tcttgcgatg ctcacaatat cagtgac 27
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 2
atggcatggg agaaagagga atg 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 3
caacttcatc cacgttcacc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 4
acacaactgt gttcactagc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 5
tcacgatgcc agtggtacgg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer
<400> 6
ggattcatat gtggggcatg 20
【０１１５】
【配列表フリーテキスト】配列番号１〜６は、合成プラ
イマーの配列である。
イマーの配列である。
【図１】化合物Iの存在時のプライマーダイマー形成の
防止を示す図である。1a: リアルタイムPCRにおける検
出。1b: 後続のゲル電気泳動における検出。
防止を示す図である。1a: リアルタイムPCRにおける検
出。1b: 後続のゲル電気泳動における検出。
【図２】化合物Iの存在時のリアルタイムPCR感度の増加
を示す図である。SybrGreen方式を用いた。
を示す図である。SybrGreen方式を用いた。
【図３】完全なDPD cDNAを含有する0.4fgのプラスミド
を用いた場合の、化合物Iの存在時のリアルタイムPCR感
度の増加を示す図である。FRET-HybProbe方式を用い
た。
を用いた場合の、化合物Iの存在時のリアルタイムPCR感
度の増加を示す図である。FRET-HybProbe方式を用い
た。
【図４】完全なDPD cDNAを含有する4fgのプラスミドを
用いた場合の、化合物Iの存在時のリアルタイムPCR感度
の増加を示す図である。FRET-HybProbe方式を用いた。
用いた場合の、化合物Iの存在時のリアルタイムPCR感度
の増加を示す図である。FRET-HybProbe方式を用いた。
【図５】完全なDPD cDNAを含有する40fgのプラスミドを
用いた場合の、化合物Iの存在時のリアルタイムPCR感度
の増加を示す図である。FRET-HybProbe方式を用いた。
用いた場合の、化合物Iの存在時のリアルタイムPCR感度
の増加を示す図である。FRET-HybProbe方式を用いた。
【図６】実施例2に係る化合物Iの存在時のリアルタイム
PCR融解曲線分析の改良を示す図である。
PCR融解曲線分析の改良を示す図である。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年１２月１６日（２００２．１２．
１６）
１６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【化１】
を有し、
A1、A2、およびA3が、同一でも異なってもよく、それぞ
れ酸部分を表し、 -OH基が、A1、A2、およびA3に対してオルト位にあり、 R1およびR2が、同一でも異なってもよく、それぞれH、
低級アルキル、CH2-アリール、ハロゲン、または酸部分
のいずれかを表し、 L1およびL2が、同一でも異なってもよく、それぞれ -CH2-、 -CO-、 -CR3(O-A)-(ここで、Aは、H、低級アルキル、もしくは
アリールである)、 -CR3(N(B1B2))-(ここで、B1およびB2は、H、低級アルキ
ル、もしくはアリールのいずれかである)、または -C+アリール- のいずれかを表し、R3がHもしくはアリールである、こ
とを特徴とする、上記使用。
れ酸部分を表し、 -OH基が、A1、A2、およびA3に対してオルト位にあり、 R1およびR2が、同一でも異なってもよく、それぞれH、
低級アルキル、CH2-アリール、ハロゲン、または酸部分
のいずれかを表し、 L1およびL2が、同一でも異なってもよく、それぞれ -CH2-、 -CO-、 -CR3(O-A)-(ここで、Aは、H、低級アルキル、もしくは
アリールである)、 -CR3(N(B1B2))-(ここで、B1およびB2は、H、低級アルキ
ル、もしくはアリールのいずれかである)、または -C+アリール- のいずれかを表し、R3がHもしくはアリールである、こ
とを特徴とする、上記使用。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(72)発明者 クリスチャン ビルクナー
ドイツ連邦共和国 82449 ウッフィング,
ウィリングシュトラーセ ９
(72)発明者 ヘルベルト フォン デル エルツ
ドイツ連邦共和国 82362 ウェイルヘイ
ム，イン デル アウ 21
Ｆターム(参考） 2G045 AA24 DA13 FB02
4B024 AA11 AA20 CA04 HA20
4B063 QA01 QQ42 QR32 QR56 QR62
QS25 QS34 QX02
4H006 AA03 AB80 AB81 BJ50 BN30
BR70 BS30
Claims (8)
- 【請求項１】 核酸増幅反応用の添加剤としての、3〜6
個のオルトヒドロキシ酸部分を有するポリヒドロキシア
リールポリ酸の使用。 - 【請求項２】 核酸増幅反応用の添加剤としての、3〜6
個のオルトヒドロキシ酸部分を有する化合物の使用であ
って、該化合物が、式 【化１】 を有し、 A1、A2、およびA3が、同一でも異なってもよく、それぞ
れ酸部分を表し、 -OH基が、A1、A2、およびA3に対してオルト位にあり、 R1およびR2が、同一でも異なってもよく、それぞれH、
低級アルキル、CH2-アリール、ハロゲン、または酸部分
のいずれかを表し、 L1およびL2が、同一でも異なってもよく、それぞれ -CH2-、 -CO-、 -CR3(O-A)-(ここで、Aは、H、低級アルキル、もしくは
アリールである)、 -CR3(N(B1B2))-(ここで、B1およびB2は、H、低級アルキ
ル、もしくはアリールのいずれかである)、または -C+アリール- のいずれかを表し、R3がHもしくはアリールである、こ
とを特徴とする、上記使用。 - 【請求項３】 ヌクレオチド塩基対形成相互作用を減少
させる添加剤としての請求項１または２に記載の化合物
の使用。 - 【請求項４】 前記化合物の添加が前記増幅反応の感度
を高める、請求項１または２に記載の使用。 - 【請求項５】 前記増幅反応がリアルタイムPCRであ
る、請求項４に記載の使用。 - 【請求項６】 核酸の融点測定用の添加剤としての請求
項１または２に記載の化合物の使用。 - 【請求項７】 核酸反応を行うのに必要なすべての成分
と請求項１または２に記載の化合物とを含む組成物。 - 【請求項８】 核酸反応を行うのに必要な成分と請求項
１または２に記載の化合物とを含む組成物を備えたキッ
ト。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP01130252 | 2001-12-19 | ||
| EP01130252.8 | 2001-12-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003259882A true JP2003259882A (ja) | 2003-09-16 |
Family
ID=8179602
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002364269A Pending JP2003259882A (ja) | 2001-12-19 | 2002-12-16 | 改良されたｐｃｒ用の試薬 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20030175769A1 (ja) |
| JP (1) | JP2003259882A (ja) |
| CA (1) | CA2413669A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006098428A1 (ja) * | 2005-03-17 | 2006-09-21 | Kabushiki Kaisha Dnaform | プライマーダイマーからの非特異的増幅を減少させる方法 |
| WO2010082640A1 (ja) | 2009-01-15 | 2010-07-22 | 北海道三井化学株式会社 | 耐熱性dnaポリメラーゼを含む酵素調製物およびその製造方法、並びに検出対象生物の検出方法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006119419A2 (en) * | 2005-05-03 | 2006-11-09 | Geunsook Jeon | Materials and kits for use in hot-start pcr, and methods of amplifying nucleic acids in a polymerase chain reaction |
| EP2162551B1 (en) | 2007-07-03 | 2017-08-23 | Genaphora LTD. | Chimeric primers for improved nucleic acid amplification reactions |
-
2002
- 2002-12-05 CA CA002413669A patent/CA2413669A1/en not_active Abandoned
- 2002-12-16 JP JP2002364269A patent/JP2003259882A/ja active Pending
- 2002-12-19 US US10/326,699 patent/US20030175769A1/en not_active Abandoned
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006098428A1 (ja) * | 2005-03-17 | 2006-09-21 | Kabushiki Kaisha Dnaform | プライマーダイマーからの非特異的増幅を減少させる方法 |
| WO2010082640A1 (ja) | 2009-01-15 | 2010-07-22 | 北海道三井化学株式会社 | 耐熱性dnaポリメラーゼを含む酵素調製物およびその製造方法、並びに検出対象生物の検出方法 |
| US9243272B2 (en) | 2009-01-15 | 2016-01-26 | Hokkaido Mitsui Chemicals Inc. | Enzyme preparation containing thermostable DNA polymerase, method for producing same, and method for detecting subject organism to be detected |
| US10501813B2 (en) | 2009-01-15 | 2019-12-10 | Hokkaido Mitsui Chemicals Inc. | Enzyme preparation containing thermostable DNA polymerase, method for producing same, and method for detecting subject organism to be detected |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20030175769A1 (en) | 2003-09-18 |
| CA2413669A1 (en) | 2003-06-19 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20051206 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060530 |