JP2003265189A - ホスホジエステラーゼ１０遺伝子の破壊 - Google Patents

ホスホジエステラーゼ１０遺伝子の破壊

Info

Publication number
JP2003265189A
JP2003265189A JP2002368547A JP2002368547A JP2003265189A JP 2003265189 A JP2003265189 A JP 2003265189A JP 2002368547 A JP2002368547 A JP 2002368547A JP 2002368547 A JP2002368547 A JP 2002368547A JP 2003265189 A JP2003265189 A JP 2003265189A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
pde10a
gene
cell
cells
genetically modified
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2002368547A
Other languages
English (en)
Inventor
Frank S Menniti
サミュエル メニーチ フランク
Christopher J Schmidt
ジョセフ シュミッド クリストファー
Jeffrey L Stock
リン ストック ジェフリー
Christine A Strick
アン ストリック クリスティーン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pfizer Products Inc
Original Assignee
Pfizer Products Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer Products Inc filed Critical Pfizer Products Inc
Publication of JP2003265189A publication Critical patent/JP2003265189A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
    • C12N2517/02—Cells from transgenic animals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/60—Vectors containing traps for, e.g. exons, promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/005—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination repressible enhancer/promoter combination, e.g. KRAB
    • C12N2830/006—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination repressible enhancer/promoter combination, e.g. KRAB tet repressible
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、ホスホジエステラーゼ10A（PDE10
A）遺伝子の標的破壊を含む非ヒト哺乳動物および動物
細胞を提供することを課題とする。 【解決手段】 本発明により、破壊されたホスホジエス
テラーゼ10A（PDE10A）遺伝子を含む、遺伝子改変され
た非ヒト哺乳動物および動物細胞が提供された。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本出願は、U.S.C.第35条第119（e）項に従
って、2001年12月21日に出願された米国仮特許出願第60
/343,473号の優先権を主張する。
【０００２】
【発明の属する技術分野】本発明は、破壊されたホスホ
ジエステラーゼ10A（PDE10A）遺伝子を含む、遺伝子改
変された非ヒト哺乳動物および動物細胞に関する。
【０００３】
【従来の技術】環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ
（PDE）は、セカンドメッセンジャーであるcAMP（環状
アデノシン3'5'一リン酸）およびcGMP（環状グアニン3'
5'一リン酸）の加水分解を触媒し、多種多様なシグナル
伝達経路で重要な調節的役割を果たしている（非特許文
献1参照）。例えばPDEは、視覚（非特許文献2参照）、
嗅覚（非特許文献3参照）、血小板凝集（非特許文献4参
照）、アルドステロン合成（非特許文献5参照）、イン
スリン分泌（非特許文献6参照）、T細胞活性化（非特許
文献7参照）、および平滑筋弛緩（非特許文献8、9参
照）にかかわる過程に関与する。
【０００４】PDEは、11の主要ファミリーに分けられる
酵素のスーパーファミリーを形成している（非特許文献
1、10〜17参照）。
【０００５】異なるPDEファミリーは、一次配列の相同
性を元に、ならびに特異的な酵素特性および薬理学的プ
ロフィールを元に機能的に区別される。また各ファミリ
ーは、組織、細胞、および細胞下で異なる発現パターン
を示す（非特許文献8、9、11〜20参照）。したがって、
PDE酵素の一つのファミリーまたはサブファミリーの活
性を選択的に制御する化合物を投与することで、cAMPお
よび/またはcGMPのシグナル伝達経路を細胞または組織
に特異的な様式で調節することができる。
【０００６】PDE10Aは、一次アミノ酸配列および明確な
酵素活性を元に、固有のPDEとして同定されている。EST
データベースの相同性スクリーニングから、PDE10Aが一
つの遺伝子にコードされる特定のホスホジエステラーゼ
であることがわかっている（非特許文献21、22参照）。
ヒト、ラット、およびマウスのPDE10の相同物がクロー
ン化されており、N末端のスプライスバリアントがラッ
トとヒトの遺伝子の両方について同定されており（特許
文献1〜4、および非特許文献23〜25を参照）、種を越え
て高度の相同性が存在する。PDE10AはcAMPとcGMPを、そ
れぞれAMPとGMPに加水分解する。PDE10AのcAMPに対する
親和性（Kｍ＝0.05 μM）は、cGMPに対する親和性（Kｍ
＝3 μM）より高い。しかしcGMPに対するVｍａｘはcAMP
に対するVｍａｘより約5倍大きいことから、PDE10Aが固
有のcAMP阻害型cGMPaseではないかと考えられている
（非特許文献26参照）。
【０００７】PDE10Aは他のPDEファミリーとは異なり哺
乳動物に特異的に局在する。PDE10AのmRNAは、精巣およ
び脳で極めて高度に発現されている（LanfearおよびRob
asの特許文献5、ならびに非特許文献22、24、25を参
照）。初期の研究で、脳内では、線条体（尾状核および
被殻、側坐核、ならびに嗅結節）で発現が最も強いこと
が報告されている（LanfearおよびRobasの特許文献4を
参照）。したがって、PDE10Aを選択的に調節すること
は、上記脳内領域における環状ヌクレオチド量の調節に
使用できる可能性がある。PDE10Aを選択的に阻害すると
大脳基底核の機能が変化し（特許文献6参照）、精神
病、注意欠陥/多動性障害（ADHD）、および関連注意障
害（非特許文献27参照）、うつ病（非特許文献28、29参
照）、薬物乱用（非特許文献30参照）、パーキンソン
病、不穏下肢症候群（非特許文献31参照）、およびハン
チントン病を含む、さまざまな神経精神状態の治療に有
効な場合がある。
【０００８】PDE10Aノックアウトマウスを含む他の研究
ツールは、PDE10Aの作用の生理学的な役割、およびPDE1
0A活性の調節に関連する治療的意義をさらに明らかにす
る際に有用な場合がある。
【０００９】
【特許文献１】米国特許第5,932,465号明細書
【特許文献２】米国特許第6,133,007号明細書
【特許文献３】欧州特許第0980911 A号明細書
【特許文献４】米国特許出願第60/308,978号明細書
【特許文献５】欧州特許第0967284号明細書
【特許文献６】米国特許出願第60/285,148号明細書
【非特許文献１】Beavo、「Physiol. Rev.」、1995年、
第75巻、p.725〜748
【非特許文献２】McLaughlinら、「Nat. Genet.」、199
3年、第4巻、p.130〜134
【非特許文献３】Yanら、「Proc. Natl. Acad. Sci. US
A」、1995年、第92巻、p.9677〜9681
【非特許文献４】Dickinsonら、「Biochem. J.」、1997
年、第323巻、p.371〜377
【非特許文献５】MacFarlandら、「J. Biol. Chem.」、
1991年、第266巻、p.136〜142
【非特許文献６】Zhaoら、「J. Clin. Invest.」、1998
年、第102巻、p.869〜873
【非特許文献７】Liら、「Science」、1999年、第283
巻、p.848〜851
【非特許文献８】Boolellら、「Int. J. Impot. Re
s.」、1996年、第8巻、p.47〜52
【非特許文献９】Ballardら、「J. Urol.」、1998年、
第159巻、p.2164〜2171
【非特許文献１０】Beavoら、「Mol. Pharmacol.」、19
94年、第46巻、p.399〜305
【非特許文献１１】Soderlingら、「Proc. Natl. Acad.
Sci. USA」、1998年、第95巻、p.8991〜8996
【非特許文献１２】Fisherら、「Biochem. Biophys. Re
s. Commun.」、1998年、第246巻、p.570〜577
【非特許文献１３】Hayashiら、「Biochem. Biophys. R
es. Commun.」、1998年、第250巻、p.751〜756
【非特許文献１４】Soderlingら、「J. Biol. Che
m.」、1998年、第273巻、p.15553〜1558
【非特許文献１５】Fisherら、「J. Biol. Chem.」、19
98年、第273巻、p.15559〜15564
【非特許文献１６】Soderlingら、「Proc. Natl. Acad.
Sci. USA」、1999年、第96巻、p.7071〜7076
【非特許文献１７】Fawcettら、「Proc. Natl. Acad. S
ci. USA」2000年、第97巻、p.3702〜3707
【非特許文献１８】Beavoら、「Mol. Pharmacol.」、19
94年、第46巻、p.399〜405
【非特許文献１９】Houslay、Semin. Cell Dev. Bio
l.」、1998年、第9巻、p.161〜167
【非特許文献２０】Torphyら、「Pulm. Pharmacol. The
r.」、1999年、第12巻、p.131〜135
【非特許文献２１】Fujishigeら、「J. Biol. Che
m.」、1999年、第274巻、p.18438〜18445
【非特許文献２２】Loughneyら、「Gene」、1999年、第
234巻、p.109〜117
【非特許文献２３】Koteraら、「Biochem. Biophys. Re
s. Comm.」、1999年、第261巻、p.551〜557
【非特許文献２４】Fujishigeら、「Eur. J. Bioche
m.」、1999年、第266巻、p.1118〜1127
【非特許文献２５】Soderlingら、「Proc. Natl. Acad.
Sci. USA」、1999年、第96巻、p.7071〜7076
【非特許文献２６】Fujishigeら、「J. Biol. Che
m.」、1999年、第274巻、p.18438〜18445
【非特許文献２７】Seemanら、「Molecular Psychiatr
y」、1998年、第3巻、p.386〜396
【非特許文献２８】Kapur、「Biol. Psychiatry」、199
2年、第32巻、p.1〜17
【非特許文献２９】Willner、「Brain Res.」、1983
年、第287巻、p.225〜236
【非特許文献３０】Self、「Annals of Med.」、1998
年、第30巻、p.379〜389
【非特許文献３１】Hening、「Sleep」、1999年、第22
巻、p.970〜999
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ホスホジエ
ステラーゼ10A（PDE10A）遺伝子の標的破壊を含む非ヒ
ト哺乳動物および動物細胞を提供することを課題とす
る。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、破壊されたPD
E10A遺伝子に関してホモ接合型またはヘテロ接合型であ
る、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物および動物細胞を
特徴とする。
【００１２】第一の局面では、本発明は、改変がPDE10A
遺伝子の破壊を生じる、遺伝子改変された非ヒト哺乳動
物を特徴とする。好ましくは哺乳動物は、齧歯類であ
り、より好ましくはマウスである。
【００１３】本発明の第二の局面は、改変がPDE10A遺伝
子の破壊を含む、遺伝子改変された動物細胞を特徴とす
る。好ましい態様では、このような細胞は胚幹（EC）細
胞、ES様細胞であり、および/または細胞は、マウスま
たはヒトの細胞である。他の好ましい態様では、細胞
は、破壊されたPDE10A遺伝子を生じる改変を含む、遺伝
子改変された非ヒト哺乳動物から単離される。好ましく
は、このような細胞は神経系の細胞、例えば神経幹細
胞、初代培養ニューロン、または脳切片調製物中のニュ
ーロンである。
【００１４】第三の局面では、本発明は、細胞内のPDE1
0Aポリペプチド量の減少をもたらす遺伝子改変を含む動
物細胞の発現プロフィールを評価する段階、および同プ
ロフィールを野生型細胞で得た発現プロフィールと比較
する段階を含む、動物細胞でPDE10A活性が低下した結果
として、改変された発現を示す遺伝子を同定する方法を
特徴とする。好ましくは、遺伝子改変された動物細胞
は、PDE10A遺伝子を破壊する遺伝子改変に関してホモ接
合型である。
【００１５】本発明を説明する本明細書の本文および特
許請求の範囲において用いられる用語は、当業者であれ
ば完全に理解できると思われる。しかしながら、次の用
語は本明細書中で特に規定がない限り、以下に説明され
るとおりである。
【００１６】「遺伝子改変された」非ヒト哺乳動物また
は動物細胞は、遺伝子工学の手法によって、非ヒト哺乳
動物もしくは動物細胞に導入される改変、または非ヒト
哺乳動物もしくは動物細胞の前駆体に導入される改変に
関してヘテロ接合型またはホモ接合型である。改変を導
入する際に利用可能な遺伝子工学分野の標準的な方法に
は、相同組換え、ウイルスベクターによる遺伝子トラッ
プ、放射線照射、化学的突然変異誘発、およびアンチセ
ンスRNAがコードされているヌクレオチド配列単独また
は触媒性リボザイムと組み合わせたトランスジェニック
発現が挙げられる。遺伝子を破壊する遺伝子改変の好ま
しい方法は、「外来核酸配列」を対象遺伝子座に、例え
ば相同組換えまたはウイルスベクターによる遺伝子トラ
ップ法によって挿入することで内因性遺伝子を改変する
方法である。「外来核酸配列」とは、対象遺伝子中には
天然には存在しない外因性配列である。外来DNAの挿入
は、PDE10A遺伝子の任意の領域、例えばエンハンサー、
プロモーター、調節領域、非コード領域、コード領域、
イントロン、またはエキソンの内部で生じる場合があ
る。遺伝子を破壊する最も好ましい遺伝子工学の手法は
相同組換えである。相同組換えでは、外来核酸配列を単
独で、または内因性遺伝子配列の一部の欠失と組み合わ
せて、標的化するような様式で挿入する。
【００１７】「破壊された」PDE10A遺伝子は、破壊され
た遺伝子にコードされるPDE10Aポリペプチドの細胞活性
が、通常は野生型PDE10A遺伝子を発現している細胞内で
低下または消滅するように遺伝子改変されたPDE10A遺伝
子を意味する。遺伝子改変が、細胞内のPDE10A遺伝子の
すべての野生型コピーを効率よく除去する場合（例え
ば、遺伝子改変された、非ヒト哺乳動物または動物細胞
がPDE10A遺伝子の破壊に関してホモ接合型であるか、ま
たは元から存在するPDE10A遺伝子の野生型コピーのみが
破壊されている場合）、遺伝子改変によって、PDE10Aポ
リペプチドの活性が、野生型PDE10A遺伝子を発現してい
る対照細胞と比べて低下する。PDE10Aポリペプチド活性
のこのような低下は、低下したPDE10A遺伝子発現（すな
わちPDE10AのmRNA量の減少によってPDE10Aポリペプチド
量が効率よく低下すること）により、および/または破
壊されたPDE10A遺伝子が、野生型のPDE10Aポリペプチド
と比較して機能が変化した（例えば、低下した）変異型
ポリペプチドをコードすることで生じる。好ましくは、
遺伝子改変された非ヒト哺乳動物または動物細胞におけ
るPDE10Aポリペプチドの活性は、野生型の活性の50%ま
たはそれ未満に、より好ましくは25%またはそれ未満
に、またさらにより好ましくは10%またはそれ未満に低
下する。最も好ましくは、PDE10A遺伝子の破壊によっ
て、PDE10A活性が実質的に低下するか、または検出不可
能となる。
【００１８】破壊されたPDE10A遺伝子を含む「遺伝子改
変された非ヒト哺乳動物」とは、例えば所望の遺伝子改
変をもつ胚盤胞または胚を作製した後に胚盤胞または胚
を代理母に移植して子宮内で発生させることで、最初に
作製される非ヒト哺乳動物を意味する。遺伝子改変され
た胚盤胞または胚は、マウスの場合には、遺伝子改変さ
れた胚幹（ES）細胞をマウスの胚盤胞に移植するか、ま
たは、ES細胞を四倍体の胚と凝集させることで作製する
ことができる。あるいは、さまざまな種の遺伝子改変さ
れた胚を核移植で得ることができる。核移植法では、ド
ナー細胞は体細胞または多能性幹細胞であり、PDE10A遺
伝子を破壊する所望の遺伝子改変を含むように作製され
る。このような細胞の核を次に、受精した卵母細胞また
は単為生殖期の卵母細胞（除核したもの）に移す。結果
として得られた胚を再構成して胚盤胞を発生させる。上
記のいずれかの方法で作製された遺伝子改変された胚盤
胞を次に、当技術分野で周知の標準的な方法で代理母に
移植する。「遺伝子改変された非ヒト哺乳動物」には、
上述の方法で作製された非ヒト哺乳動物のあらゆる子孫
が含まれる（子孫が、PDE10A遺伝子が破壊された少なく
とも1コピーの遺伝子改変を遺伝する場合）。遺伝子改
変された非ヒト哺乳動物のすべての体細胞および生殖細
胞が、該当する改変を含むことが好ましい。破壊された
PDE10A遺伝子を含むように遺伝子改変された好ましい非
ヒト哺乳動物には、マウスおよびラットなどの齧歯類、
ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツ
ジ、ブタ、ならびにフェレットなどが含まれる。
【００１９】破壊されたPDE10A遺伝子を含む「遺伝子改
変された動物細胞」とは、破壊されたPDE10A遺伝子を含
むように遺伝子工学の手法で作製されたヒト細胞、およ
び破壊されたPDE10A遺伝子を遺伝する娘細胞を含む動物
細胞を意味する。このような細胞は、当技術分野で周知
の任意の標準的な方法で培地中で遺伝子改変される場合
がある。培地中で細胞を遺伝子改変する代わりに、非ヒ
ト哺乳動物細胞を、PDE10A遺伝子破壊を含む遺伝子改変
された非ヒト哺乳動物から単離することもできる。本発
明の動物細胞は、初代細胞または組織調製物、および培
養に適した腫瘍細胞または形質転換細胞株から得られ
る。このような細胞および細胞株は例えば、内皮細胞、
上皮細胞、島細胞、ニューロンおよび他の神経組織由来
の細胞、中皮細胞、骨細胞、リンパ球、軟骨細胞、造血
細胞、免疫細胞、主要な腺または器官（例えば、精巣、
肝臓、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓、および皮膚）の細
胞、筋細胞（骨格筋、平滑筋、および心筋の細胞を含
む）、外分泌細胞または内分泌細胞、繊維芽細胞、なら
びに胚および他の全能性または多能性をもつ幹細胞（例
えば、ES細胞、ES様細胞、および胚性生殖（EG）細胞、
ならびに前駆細胞および組織由来の幹細胞などの他の幹
細胞に由来する。好ましい遺伝子改変された細胞はES細
胞であり、より好ましくはマウスまたはラットのES細
胞、また最も好ましくはヒトのES細胞である。
【００２０】「PDE10A活性」とは、cAMPおよび/またはc
GMPのPDE10Aによる加水分解を意味する。
【００２１】「低下したPDE10A活性」とは、PDE10A遺伝
子を遺伝子操作して細胞内のPDE10Aポリペプチド量の減
少を引き起すか、または薬剤を投与してPDE10A活性を阻
害することによる、PDE10A酵素の活性の低下を意味す
る。
【００２２】「ES細胞」または「ES様細胞」とは、無制
限の自己複製、ならびに胚の3つの胚葉を示す細胞種へ
分化する能力をもつ、胚、始原生殖細胞、または奇形癌
由来の多能性幹細胞を意味する。
【００２３】本発明の他の特徴および利点は、以下の詳
細な説明および特許請求の範囲から明らかになると思わ
れる。本発明は、特定の態様に関して説明されている
が、実施されうる他の変更および修正も同様に本発明の
一部であり、添付の特許請求の範囲に含まれることが理
解されることは言うまでもない。本出願は、当技術分野
の既知の、または慣用な実施の範囲内に含まれる本開
示、および過度の実験を行うことなく確認されうる本開
示からの逸脱を含む、一般的に本発明の原理に従う本発
明の任意の同等物、変形物、用途、または応用が意図さ
れている。核酸およびポリペプチドの作製および使用に
関する他の手引きは、分子生物学、タンパク質科学、お
よび免疫学分野の標準的な教科書に記載されている（例
えば、Davisら、「分子生物学基本法（Basic Methods i
n Molecular Biology）」、ElsevirSciences Publishin
g, Inc.、New York、NY、1986；Hamesら、「核酸ハイブ
リダイゼーション（Nucleic Acid Hybridization）」、
IL Press、1985；「分子クローニング（Molecular Clon
ing）」、Sambrookら、「分子生物学の最新プロトコー
ル（Current Protocols in Molecular Biology）」、Au
subelら共編、John Wiley and Sons；「ヒト遺伝学の最
新プロトコール（Current Protocols in HumanGenetic
s）」、Dracopoliら共編、John Wiley and Sons；「タ
ンパク質科学の最新プロトコール（Current Protocols
in Protein Science）」、John E. Coliganら共編、Joh
n Wiley and Sons；および「免疫学の最新プロトコール
（Current Protocols in Immunology）」、John E. Col
iganら共編、John Wiley and Sonsを参照）。本明細書
で言及されるすべての刊行物は参照としてその全体が組
み入れられる。
【００２４】本発明に係る哺乳動物においては、（１）
ホスホジエステラーゼ10A（PDE10A）遺伝子の破壊が改
変によってもたらされる、遺伝子改変された非ヒト哺乳
動物であることを特徴とする。
【００２５】本発明に係る哺乳動物においては、（２）
哺乳動物が齧歯類、好ましくはマウスである、(1)記載
の哺乳動物であることを特徴とする。
【００２６】本発明に係る哺乳動物においては、（３）
破壊によって、触媒的に不活性な内因性PDE10Aタンパク
質が生じる、(1)記載の非ヒト哺乳動物であることを特
徴とする。
【００２７】本発明に係る動物細胞においては、（４）
改変に、PDE10A遺伝子の破壊が含まれる、遺伝子改変さ
れた動物細胞であることを特徴とする。
【００２８】本発明に係る動物細胞においては、（５）
細胞が胚幹（ES）細胞、またはES様細胞である、(4)記
載の動物細胞であることを特徴とする。
【００２９】本発明に係る動物細胞においては、（６）
細胞が、PDE10A遺伝子の破壊をもたらす改変を含む遺伝
子改変された非ヒト哺乳動物から単離される、(4)記載
の動物細胞であることを特徴とする。
【００３０】本発明に係る動物細胞においては、（７）
細胞が神経系の細胞である、(6)記載の動物細胞である
ことを特徴とする。
【００３１】本発明に係る動物細胞においては、（８）
細胞がマウスまたはヒトの細胞である、(4)記載の動物
細胞であることを特徴とする。
【００３２】本発明に係る方法においては、（９）細胞
内におけるPDE10Aポリペプチド量の減少をもたらす遺伝
子改変を含む動物細胞の発現プロフィールを評価する段
階、および当該発現プロフィールを野生型細胞で得た発
現プロフィールと比較する段階を含む、動物細胞でPDE1
0A活性が低下した結果として、改変された発現を示す遺
伝子を同定する方法であることを特徴とする。
【００３３】本発明に係るスクリーニングアッセイ法に
おいては、（１０）化合物がPDE10A作動物質または拮抗
物質として有効であるか否かについて評価するスクリー
ニングアッセイ法であって、（a）化合物を、(1)記載の
遺伝子改変された非ヒト哺乳動物に投与し、哺乳動物に
おいてPDE10A活性を低下させる段階、および（b）化合
物がPDE10A活性の作動物質または拮抗物質として有効で
あるか否かについて判定するために、化合物が段階(a)
で哺乳動物に及ぼす作用を、化合物の非存在下でPDE10A
活性が低下している遺伝子改変された哺乳動物と、また
はPDE10A活性を有する哺乳動物と比較する段階を含むス
クリーニングアッセイ法であることを特徴とする。
【００３４】本発明に係るスクリーニングアッセイ法に
おいては、（１１）アッセイ法が、一つまたは複数の自
発運動、精神興奮反応、学習/記憶、行動修飾、または
神経変性におけるPDE10A機能の評価に用いられる、(10)
記載のスクリーニングアッセイ法であることを特徴とす
る。
【００３５】
【発明の実施の形態】破壊されたPDE10A遺伝子を含む遺
伝子改変された非ヒト哺乳動物および動物細胞 1．遺伝子改変された非ヒト哺乳動物および動物細胞 本発明の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物の細胞、およ
びヒト細胞を含む遺伝子改変された動物細胞は、PDE10A
遺伝子を破壊する改変に関してヘテロ接合型またはホモ
接合型である。このような動物細胞は、遺伝子工学によ
り作製された培地中の細胞に由来していてもよく、非ヒ
ト哺乳動物細胞の場合は、細胞は遺伝子改変された非ヒ
ト哺乳動物から単離されていてもよい。
【００３６】PDE10A遺伝子座は、化学的突然変異誘発
（Rinchik、Trends in Genetics 7：15〜21、1991、Rus
sell、Environmental & Molecular Mutagenesis 23（Su
ppl. 24）：23〜29、1994）、放射線照射（Russell、前
掲）、PDE10A遺伝子のアンチセンスRNA単独または触媒
性RNAリボザイム配列と組み合わせたトランスジェニッ
ク発現（Luyckxら、Proc. Natl. Acad. Sci. 96：12174
〜79、1999；Sokolら、Transgenic Research 5：363〜7
1、1996；Efratら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：2
051〜55、1994；Larssonら、Nucleic Acids Research 2
2：2242〜48、1994）、および後に詳述するように、外
来核酸配列のPDE10A遺伝子座への挿入によるPDE10A遺伝
子の破壊を含む、当技術分野で周知の複数の遺伝子改変
法の一つで破壊される。好ましくは、このような外来配
列は相同組換えによって、またはウイルスベクター挿入
によって挿入される。最も好ましくは、PDE10A遺伝子を
破壊して本発明の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物およ
び動物細胞を作製する方法は相同組換えであり、内因性
PDE10A遺伝子配列の一部の欠失を含む。
【００３７】外来配列が組み込まれると、PDE10A遺伝子
が以下の一つまたは複数の機構により破壊される。すな
わち、PDE10A遺伝子の転写過程または翻訳過程に干渉す
る機構（例えば、プロモーター認識への干渉、または転
写終結部位もしくは翻訳終止コドンのPDE10A遺伝子への
導入）；正常な機能のPDE10Aポリペプチドをコードしな
いようにPDE10A遺伝子コード配列をゆがめる機構（例え
ば、外来コード配列のPDE10A遺伝子コード配列への挿
入、フレームシフト変異もしくはアミノ酸置換の導入、
または二回の交差の場合は機能性PDE10Aタンパク質の発
現に必要なPDE10A遺伝子コード配列の一部欠失）であ
る。
【００３８】外来配列を細胞ゲノムのPDE10A遺伝子座に
挿入して、本明細書の記述に基づいて本発明の遺伝子改
変された非ヒト哺乳動物および動物細胞を作る際は、エ
レクトロポレーション、カルシウム-リン酸共沈殿法、
レトロウイルス感染、マイクロインジェクション、微粒
子銃（biolistics）、リポソームトランスフェクショ
ン、DEAE-デキストラントランスフェクションまたはト
ランスフェクションなどの当技術分野で周知の標準的な
方法で外来DNA配列を細胞へ導入する（例えば、Neumann
ら、EMBO J. 1：841〜845、1982；Potterら、Proc. Nat
l. Acad. Sci USA81：7161〜65、1984；Chuら、Nucleic
Acids Res. 15： 1311〜26、1987；ThomasおよびCapec
chi、Cell 51：503〜12、1987；Baumら、Biotechniques
17：1058〜62、1994；Biewengaら、J. Neuroscience M
ethods 71：67〜75、1997；Zhangら、Biotechniques 1
5：868〜72、1993；RayおよびGage、Biotechniques 1
3：598〜603、1992；Lo、Mol. Cell. Biol. 3：1803〜1
4、1983；Nickoloffら、Mol.Biotach. 10：93〜101、19
98；Linneyら、Dev. Biol.（Orlando） 213：207〜16、
1999；ZimmerおよびGruss、Nature 338：150〜153、198
9；ならびにRobertsonら、Nature 323：445〜48、1986
を参照）。外来DNAを細胞に導入する好ましい方法はエ
レクトロポレーションである。
【００３９】2．相同組換え 相同組換え法は、PDE10A遺伝子ターゲティングベクター
をPDE10A遺伝子を含む細胞に導入することでPDE10A遺伝
子を破壊の標的とする。このベクターがPDE10A遺伝子を
破壊標的とする能力は、PDE10A遺伝子と相同、すなわち
PDE10A遺伝子と関連性のあるベクター中のヌクレオチド
配列を使用することに起因する。このような相同領域が
存在することで、ベクターと内因性PDE10A遺伝子配列と
の間のハイブリダイゼーションが促進される。ハイブリ
ダイゼーションにより、ターゲティングベクターとゲノ
ム配列間において交差が起きる確率は極めて大きくな
る。交差により、ベクター配列のPDE10A遺伝子座への組
み込み、およびPDE10A遺伝子の機能破壊が生じる。
【００４０】ターゲティングに用いられるベクターを構
築する際の一般的な原理は、ブラッドレー（Bradley）
ら（Biotechnol. 10：534、1992）の総説を参照された
い。2種の異なる種類のベクター（挿入ベクターまたは
置換ベクター）を用いて相同組換えによりDNAを挿入す
ることができる。挿入ベクターは、二本鎖切断を有する
PDE10A遺伝子と相同性のある領域を含んだ環状DNAであ
る。相同性領域と内因性PDE10A遺伝子とのハイブリダイ
ゼーション後、二本鎖切断点で一回の交差が生じて、ベ
クター配列全体が内因性遺伝子の交差部位に挿入され
る。
【００４１】相同組換えによって、本発明の遺伝子改変
された非ヒト哺乳動物および動物細胞を作製するため
の、より好ましいベクターは環状ではなく、共直線状
（colinear）の置換ベクターである。置換ベクターのPD
E10A遺伝子への組み込みには、二回の交差、すなわち、
ターゲティングベクターとPDE10A遺伝子とのハイブリダ
イゼーションに二か所の交差が必要である。このような
二回の交差により、交差の二つの部位に挟まれたベクタ
ー遺伝子のPDE10A遺伝子への組み込みと、当初二つの交
差部位間にあった対応する内因性PDE10A遺伝子配列の欠
失とが生じる（例えば、ThomasおよびCapecchiら、Cell
51：503〜12、1987；Mansourら、Nature 336：348〜5
2、1988；Mansourら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
7：7688〜7692、1990；ならびにMansour、GATA 7：219
〜227、1990を参照）。
【００４２】本発明の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物
および動物細胞の作製に用いられるターゲティングベク
ター中の相同性領域は、通常少なくとも100ヌクレオチ
ド長である。最も好ましくは、相同性領域は、長さが少
なくとも1〜5 キロ塩基対（kb）である。相同性領域に
必要な最小の長さ、または最小の関連性の程度は明らか
になっていないものの、相同性組換えのターゲティング
の効率は一般に、長さ、およびターゲティングベクター
とPDE10A遺伝子座との関連性の程度に対応する。置換ベ
クターを用いる場合、また内因性PDE10A遺伝子の一部を
相同組換えで欠失させる場合は、内因性PDE10A遺伝子の
欠失部分の長さも考慮する。内因性PDE10A遺伝子のこの
部分の長さが1 kbより大きい場合、組換え効率を高める
ために1kbを上回る相同性領域を含むターゲティングカ
セットが推奨される。本発明の説明に基づく、相同組換
えに有効な配列の選択および使用に関する他の手引きが
文献に記載されている（例えば、DengおよびCapecchi、
Mol. Cell. Biol. 12：3365〜3371、1992；Bollagら、A
nnu. Rev. Genet. 23：199〜225、1989；ならびにWaldm
anおよびLiskay、Mol. Cell. Biol. 8：5350〜5357、19
88を参照）。
【００４３】pBluescript系プラスミド（例えばBluescr
ipt KS+11）、pQE70、pQE60、pQE-9、pBS、pD10、phage
script、phiX174、pBK Phagemid、pNH8A、pNH16a、pNH1
8Z、pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、
およびpRIT5、PWLNEO、pSV2CAT、pXT1、pSG（Stratagen
e）、pSVK3、PBPV、PMSG、およびpSVL、pBR322およびpB
R322を骨格としたベクター、pMB9、pBR325、pKH47、pBR
328、pHC79、ファージCharon 28、pKB11、pKSV-10、pK1
9系プラスミド、pUCプラスミド、ならびにpGEM系プラス
ミドを含むさまざまなクローニングベクターを、本発明
のPDE10A遺伝子ターゲティングベクターを構築する際の
ベクターの骨格として使用可能であることが、当業者に
は本発明に基づいて認識されることと思われる。以上の
ベクターは、多様な業者により市販されている（例え
ば、Boehringer Mannheim Biochemicals、Indianapoli
s、IN；Qiagen、Valencia、CA；Stratagene、La Joll
a、CA；Promega、Madison、CA；およびNew England Bio
labs、Beverly、MA）。ただし、他の任意のベクター、
例えばプラスミド、ウイルス、またはこれらの一部分
を、それらが所望の宿主で複製可能かつ存在可能な場合
に限り、用いることができる。このようなベクターは、
ゲノムを改変すべき宿主内で複製が可能とされる配列を
含む場合もある。このようなベクターを使用すること
で、組換えが起こりうる相互作用期間を長くすることが
でき、ターゲティングの効率を上昇させる（「分子生物
学（Molecular Biology）」、Ausubelら共編、第9.16
章、図9.16.1参照）。
【００４４】本発明のターゲティングベクターの増殖に
用いられる特定の宿主は重要ではない。宿主には例え
ば、大腸菌K12 RR1（Bolivarら、Gene 2：95、1977）、
大腸菌K12 HB101（ATCC番号33694）、大腸菌MM21（ATCC
番号336780）、大腸菌DH1（ATCC番号33849）、大腸菌DH
5α株、および大腸菌STBL2などが挙げられる。または酵
母（C. cerevisiae）、あるいは枯草菌（B. subtilis）
などの宿主を使用することができる。上述の宿主は市販
されている（例えば、Stratagene、La Jolla、CA；およ
びLife Technologies、Rockville、MD）。
【００４５】ターゲティングベクターを作製する際に
は、PDE10A遺伝子のターゲティング構築物を上述の骨格
に連結する。本発明のPDE10A遺伝子のターゲティング構
築物は、少なくとも1個のPDE10A遺伝子相同領域を有す
る。PDE10A遺伝子の相同性領域を作製する際には、PDE1
0Aのゲノム配列またはcDNA配列を、PCRプライマーを作
製する基盤として用いる。PCR用プライマーを用いて、P
DE10A配列の所望の領域を、忠実度の高いPCR増幅法で増
殖させる（Mattilaら、Nucleic Acids Res. 19：4967、
1991；EckertおよびKunkel 1：17、1991；ならびに米国
特許第4,683,202号）。ゲノム配列は、ゲノムクローン
ライブラリーから、またはゲノムDNA調製物から、好ま
しくはPDE10A遺伝子の破壊標的となる動物種から得るこ
とができる。PDE10AのcDNA配列を用いてPDE10Aターゲテ
ィングベクターを作製することができる（例えば、マウ
ス、Genbank番号AF110507；ヒト、Genbank番号AB02059
3；ラット、欧州特許第0980911 A号；米国特許出願第60
/308,978号）。
【００４６】好ましくは、本発明のターゲティング構築
物は、正のマーカータンパク質をコードする外因性ヌク
レオチド配列も含む。ベクターの組み込み後に正のマー
カーが安定に発現することで、望ましくは、細胞の生存
能を損なうことなく、同定用の特性が細胞に付与され
る。したがって置換ベクターの場合、マーカー遺伝子
は、マーカー遺伝子が組み込み後に発現するように配置
させる様式で、二回の交差に続けてPDE10A遺伝子に組み
込むように2つの隣接する相同性領域の間に位置させ
る。
【００４７】正のマーカータンパク質は選択可能なタン
パク質であることが好ましい。つまり、このようなタン
パク質が細胞内で安定に発現することで選択可能な表現
型の特性が付与される。すなわち、このような特性によ
り、通常であれば致死的な条件下において細胞の生存が
促される。したがって選択可能な条件を課すことで、正
の選択マーカーをコードするベクター配列を安定に発現
する細胞を、ベクター配列がうまく組み込まれなかった
他の細胞から、生存能に基づいて単離することができ
る。正の選択マーカータンパク質（および選択用薬剤）
の例には、neo（G418またはカナマイシン）、hyg（ハイ
グロマイシン）、hisD（ヒスチジノール）、gpt（キサ
ンチン）、ble（ブレオマイシン）、およびhprt（ヒポ
キサンチン）などが挙げられる（例えば、Capecchiおよ
びThomas、米国特許第5,464,764号、ならびにCapecch
i、Science 244：1288〜92、1989を参照）。選択マーカ
ーに代わって使用可能な他の正のマーカーには、β-ガ
ラクトシダーゼ、ホタルのルシフェラーゼ、またはGFP
などのレポータータンパク質がある（例えば、「細胞数
測定の最新プロトコール（Current Protocols in Cytom
etry）」、第9.5章、および「分子生物学の最新プロト
コール（Current Protocols in Molecular Biolog
y）」、第9.6章、 John Wiley & Sons、New York、NY、
2000を参照）。
【００４８】上述の正の選択段階過程は、標的化相同組
換えによってPDE10A遺伝子座においてベクターを組み込
んだ細胞と、ランダムな非相同組換えによって任意の染
色体部位にベクター配列が組み込まれた細胞とを識別す
ることができない。したがって、置換ベクターを相同組
換えに用いて、本発明の遺伝子改変された非ヒト哺乳動
物および動物細胞を作製する際には、負の選択マーカー
タンパク質をコードするヌクレオチド配列をも含めるこ
とが好ましい。負の選択マーカーを発現させることで、
このマーカーを発現する細胞は、ある種の薬剤に曝露さ
せた場合に生存能を失う（すなわち、マーカータンパク
質の存在が、特定の選択条件における細胞に対して致死
的に作用する）。負の選択マーカー（および致死性薬
剤）の例には、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナー
ゼ（ガンシクロビル、または1,2-デオキシ-2-フルオロ-
α-d-アラビノフラノシル-5-ヨードウラシル）、Hprt
（6-チオグアニン、または6-チオキサンチン）、および
ジフテリア毒素、リシン毒素、ならびにシトシンデアミ
ナーゼ（5-フルオロシトシン）などが挙げられる。
【００４９】負の選択マーカーをコードするヌクレオチ
ド配列は、置換ベクターの二つの相同性領域の外側に位
置させる。このような配置とすることで細胞は、組み込
みがランダムな非相同組換えによって生じた場合には、
負の選択マーカーを細胞に組み込んで安定に発現させ
る。つまり、ターゲティング構築物中におけるPDE10A遺
伝子と2つの相同性領域間との相同組換えでは、負の選
択マーカーをコードする配列は除かれる。したがって負
の条件を課すことにより、ターゲティングベクターがラ
ンダムな非相同組換えによって組み込まれた細胞は生存
能を失う。
【００５０】一連の正および負の選択段階を、相同組換
えによってベクターの組み込みが生じたことで破壊され
たと考えられるPDE10A遺伝子を有する細胞のみを、より
効率よく選択するように設計することができるため、本
発明の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物および動物細胞
の作製に用いられるターゲティング構築物において、正
負の選択マーカーを上述のように組み合わせることは好
ましい。正負の選択スキーム、選択マーカー、およびタ
ーゲティング構築物の他の例は、例えば米国特許第 5,4
64,764号、国際公開公報第94/06908号、米国特許第5,85
9,312号、ならびにバレンシウス（Valancius）およびス
ミティーズ（Smithies）、Mol. Cell.Biol. 11：1402、
1991に記載されている。
【００５１】ベクターの組み込み後にマーカータンパク
質を安定的に発現させるために、ターゲティングベクタ
ーを、マーカーのコード配列がベクターの組み込みに際
して内因性PDE10A遺伝子のプロモーターに機能的に連結
されるように設計することができる。その後、マーカー
の発現は、細胞内で通常PDE10A遺伝子の発現にかかわ
る、PDE10A遺伝子のプロモーターによって誘導される。
または、ベクターのターゲティング構築物中の各マーカ
ーに、PDE10A遺伝子のプロモーターとは無関係の発現を
誘導する、自身のプロモーターを含ませることができ
る。後者のスキームは、PDE10A遺伝子を通常発現しない
細胞内におけるマーカーの発現を可能にするという利点
がある（SmithおよびBerg、Cold Spring Harbor Symp.
Quant. Biol.49：171、1984；SedivyおよびSharp、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 86：227、1989；Thomasおよ
びCapecchi、Cell 51：503、1987）。
【００５２】マーカー遺伝子発現の誘導に使用可能な外
因性プロモーターには、細胞特異的プロモーター、また
は段階特異的プロモーター、構成的プロモーター、およ
び誘導型または調節型プロモーターなどが挙げられる。
このようなプロモーターの例には、単純ヘルペスのチミ
ジンキナーゼプロモーター、サイトメガロウイルス（CM
V）のプロモーター/エンハンサー、SV40プロモーター、
PGKプロモーター、PMC1-neo、メタロチオネインプロモ
ーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニア
ウイルス7.5Kプロモーター、トリβグロビンプロモータ
ー、ヒストンプロモーター（例えば、マウスヒストンH3
-614）、βアクチンプロモーター、ニューロン特異的エ
ノラーゼ、筋アクチンプロモーター、およびカリフラワ
ーモザイクウイルス35Sプロモーターなどが挙げられる
がこれらに限定されない（一般的には、Sambrookら、
「分子クローニング（Molecular Cloning）」、第I〜II
I巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spr
ing Harbor、New York、1989、および「分子生物学の最
新プロトコール（Current Protocols in MolecularBiol
ogy）」、John Wiley & Sons、New York、NY、2000；St
ratagene、La Jolla、CAを参照）。
【００５３】細胞が、本発明の遺伝子改変された非ヒト
哺乳動物および動物細胞を作製する際に、標的のPDE10A
遺伝子座にベクター配列が組み込まれたか否かを確認す
るためには、所望のベクターの組み込みに特異的なプラ
イマーまたはゲノムプローブを、PCRまたはサザンブロ
ット分析と組み合わせて用いることで、所望のベクター
がPDE10A遺伝子座へ組み込まれていることを同定するこ
とができる（Erlichら、Science 252：1643〜51、199
1；ZimmerおよびGruss、Nature 333：150、1989；Mouel
licら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 37：4712、1990；
ならびにSheselyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 38：
4294、1991）。
【００５４】3．遺伝子トラップ法 本発明の説明に基づいて、外来核酸配列をPDE10A遺伝子
座へ挿入してPDE10A遺伝子を破壊するために利用できる
もう一つの方法が遺伝子トラップ法である。この方法
は、遺伝子トラップベクターコード配列を遺伝子にラン
ダムに挿入するために、エキソンをスプライスしてmRNA
の状態にする、すべての哺乳動物細胞に存在する細胞内
機構を利用する。挿入されると、この遺伝子トラップベ
クターは、トラップされたPDE10A遺伝子を破壊しうる変
異を生じる。相同組換えとは対照的に、この変異導入系
では大規模なランダム変異が生じる。したがって、破壊
されたPDE10A遺伝子を含む遺伝子改変された細胞を得る
ためには、このような特定の変異を含む細胞を、さまざ
まな遺伝子にランダムな変異を含む細胞のプールから同
定し、選択しなければならない。
【００５５】遺伝子トラップの系およびベクターは、遺
伝子改変されたマウス細胞および他の細胞種における使
用について説明されている（例えば、Allenら、Nature
333：852〜55、1988；Bellenら、Genes Dev. 3：1288〜
1300、1989；Bierら、GenesDev. 3：1273〜1287、198
9；Bonnerotら、J. Virol. 66：4982〜91、1992；Brenn
erら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：5517〜21、198
9；Changら、Virology193：737〜47、1993；Friedrich
およびSoriano、Methods Enzymol. 225：681〜701、199
3；FriedrichおよびSoriano、Genes Dev. 5：1513〜2
3、1991；Goff. Methods Enzymol. 152：439〜31、198
7；Gosslerら、Science 244：463〜65、1989；Hope. De
velop. 113：399〜408、1991；Kerrら、Cold Spring Ha
rb. Symp. Quant. Biol. 2：767〜776、1989；Reddy
ら、J. Virol. 65：1507〜1515、1991；Reddyら、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89：6721〜25、1992；Skarnes
ら、GenesDev. 6：903〜918、1992；von Melchnerおよ
びRuley、J. Virol. 63：3227〜3233、1989；ならびにY
oshidaら、Transgen. Res. 4：277〜87、1995を参
照）。
【００５６】プロモータートラップ、または5'ベクター
は、スプライスアクセプター配列と、それに続くエキソ
ンとを5'から3'の方向に含む。これは典型的には、翻訳
開始コドンならびにオープンリーディングフレーム（OR
F）、および/または、内部リボソーム侵入部位を特徴と
する。一般的には、このようなプロモータートラップベ
クターは、プロモーターまたは機能的に連結させたスプ
ライスドナー配列を含まない。したがって、宿主細胞の
細胞ゲノムへ組み込まれた後に、プロモータートラップ
ベクター配列は、上流にある遺伝子の正常なスプライシ
ングを妨害し、また末端エキソンとして作用する。ベク
ターのコード配列の発現は、破壊された遺伝子のイント
ロンに適切な読み枠で組み込まれているベクターに依存
する。この場合、細胞のスプライシング機構により、ベ
クターのコード配列の上流にあるトラップされた遺伝子
からエキソンがスプライスされる（Zambrowiczら、国際
公開公報第99/50426号および米国特許第6,080,576
号）。
【００５７】上述のプロモータートラップベクターに類
似した作用を発現させる別の方法としては、プロモータ
ートラップベクターのスプライスアクセプターと翻訳開
始コドンもしくはポリアデニル化配列との間の領域に存
在するか、またはそうでなければ同領域に操作により位
置する、入れ子状の終止コドンを組み込んだベクターが
ある。このようなコード配列はまた、コード配列が宿主
の細胞ゲノムの組み込み部位から大きく独立して発現さ
れるように、独立したリボソーム侵入部位（IRES）を含
めて作製することもできる。通常、IRESは入れ子状の終
止コドンとともに用いられるが、必ずしもこの限りでは
ない。
【００５８】別のタイプの遺伝子トラップ法のスキーム
では、3'遺伝子トラップベクターを用いる。この種類の
ベクターは、隣接コード配列の発現に関与するプロモー
ター領域、コード配列、およびコード配列のエキソンの
3'末端を規定するスプライスドナー配列を使用可能な組
み合わせで含む。宿主細胞ゲノムへの組み込み後、ベク
ターのプロモーターによって発現される転写物は、組み
込まれた遺伝子トラップベクター配列の下流に位置する
トラップされた遺伝子からスプライスアクセプター配列
にスプライスされる。したがってベクターが組み込まれ
ることによって、3'遺伝子トラップカセットのコード配
列、ならびに末端エキソンおよびポリアデニル化シグナ
ルを含む任意の下流の細胞エキソンを含む融合転写物が
発現される。このようなベクターが遺伝子に組み込まれ
ると、細胞のスプライス機構が、トラップされたベクタ
ーの3'エキソンの上流にあるベクターコード配列をスプ
ライスする。このようなベクターの利点の一つは、3'遺
伝子トラップベクターの発現が、遺伝子トラップカセッ
ト内にあるプロモーターによって開始され、宿主細胞で
通常発現される遺伝子への組み込みを必要としない点で
ある（Zambrowiczら、国際公開公報第99/50426号および
米国特許第6,080,576号）。3'遺伝子トラップベクター
に組み込まれる可能性のある転写のプロモーターおよび
エンハンサーの例には、ターゲティングベクターに関し
て上記で考察されたものが含まれる。
【００５９】プロモーターまたは3'遺伝子トラップベク
ターの構造成分として用いられるウイルスベクターの骨
格は、標的細胞のゲノムに挿入可能な広範囲のベクター
から選択することができる。適切な骨格となるベクター
には、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルス
ベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイル
スベクター、レンチウイルスベクター、仮性狂犬病ウイ
ルス、αヘルペスウイルスベクターなどが含まれるが、
これらに限定されない。ウイルスベクター、特に非複製
細胞の改変に適したウイルスベクター、およびそのよう
なベクターを外因性ポリヌクレオチド配列の発現と組み
合わせて使用する方法に関する詳しい総説は、「ウイル
スベクター：遺伝子治療および神経科学の応用（Viral
Vectors：Gene Therapy and Neuroscience Application
s）」、カプリット（Caplitt）およびローウィ（Loew
y）編、Academic Press、San Diego、1995に記載されて
いる。
【００６０】好ましくは、レトロウイルスベクターを遺
伝子トラップ法に用いる。このようなベクターは、米国
特許第5,449,614号に記載されている細胞などのレトロ
ウイルスパッケージング細胞株とともに使用することが
できる。非マウス哺乳動物細胞を遺伝子改変の標的細胞
として用いる場合、両栄養性または向汎性のパッケージ
ング細胞株を用いて適切なベクターのパッケージを行う
ことができる（Oryら、Proc. Natl. Acad. Sci.、USA 9
3：11400〜11406、1996）。ここで述べた3'遺伝子トラ
ップベクターの作製に適用可能な代表的なレトロウイル
スベクターは、例えば米国特許第5,521,076号に記載さ
れている。
【００６１】遺伝子トラップ用ベクターは、相同組換え
に用いるターゲティングベクターに関して先に考察され
た一種または複数の正のマーカー遺伝子を含む場合があ
る。ターゲティングベクターにおける使用と同様に、こ
のような正のマーカーは、ベクターを細胞ゲノムに組み
込む細胞を同定して選択するために遺伝子トラッピング
ベクターに使用される。マーカー遺伝子は、マーカーが
標的細胞ゲノムのベクター組み込み位置とはほとんど無
関係に発現されるよう、独立したリボソーム侵入部位
（IRES）を含むように操作されていてもよい。
【００６２】遺伝子トラップベクターが感染宿主細胞の
ゲノムに全くランダムに組み込まれるのであれば、破壊
されたPDE10A遺伝子を有する遺伝子改変された細胞を、
ランダムなベクターの組み込みが生じた細胞集団から同
定しなければならない。好ましくは、細胞集団における
遺伝子改変は、細胞集団が細胞ゲノム上にある実質的に
あらゆる遺伝子に変異をもち、破壊されたPDE10A遺伝子
をもつ細胞が集団から同定される可能性を高めるよう
に、十分ランダムかつ高頻度な改変である（Zambrowicz
ら、国際公開公報第99/50426号；Sandsら、国際公開公
報第98/14614号、ならびに米国特許第6,080,576号を参
照）。
【００６３】破壊されたPDE10A遺伝子を含む個々の変異
体細胞株は、例えば逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）でPDE10A遺伝子配列中の変異を同定することで
変異細胞集団から同定される。この過程はクローンをプ
ールすることで簡素化することができる。例えば、破壊
されたPDE10A遺伝子を含む個々のクローンを見つけるた
めに、遺伝子トラップベクターに対合する1本のプライ
マー、およびPDE10A遺伝子配列に対応するもう1本のプ
ライマーを用いてRT-PCRを行う。正のRT-PCRの結果が得
られれば、ベクター配列がPDE10A遺伝子転写物中にコー
ドされていることを意味し、PDE10A遺伝子が遺伝子トラ
ップの組み込みで破壊されていることが示される（例え
ば、Sandsら、国際公開公報第98/14614号、米国特許第
6,080,576を参照）。
【００６４】4．時間的、空間的、および誘導的なPDE10
A遺伝子破壊 本発明のある態様では、内因性PDE10A遺伝子の機能的破
壊は、特定の発生段階もしくは細胞周期段階で生じるか
（時間的破壊）、または特定の細胞種で生じる（空間的
破壊）。他の態様では、PDE10A遺伝子の破壊は特定の条
件で誘導される。Cre-Lox系などのリコンビナーゼ除去
系を使用することで、PDE10A遺伝子を特定の発生段階
で、特に組織または細胞種で、または特定の環境条件で
活性化もしくは不活性化することができる。一般的に
は、Cre-Lox法を用いる方法は、トレス（Torres）およ
びクーン（Kuhn）の「条件付き遺伝子ターゲティングの
実験プロトコール（Laboratory Protocols for Conditi
onal Gene Targeting）」、Oxford University Press、
1997に記載された手順で行われる。Cre-Lox系について
記載された方法に類似した方法をFLP-FRT系を用いる際
にも実施することができる。相同組換えまたはウイルス
挿入によって遺伝子を条件的に破壊するリコンビナーゼ
除去系の使用に関する他の手引きは、例えば米国特許第
5,626,159号、米国特許第5,527,695号、米国特許第5,43
4,066号、国際公開公報第98/29533号、米国特許第6,22
8,639号、オーバン（Orban）ら、Proc. Mat. Acad. Sc
i. USA 89：6861〜65、1992；オ ゴーマン（O'Gorman）
ら、Science 251：1351〜55、1991；ソウア（Sauer）
ら、Nucleic Acids Research 17：147〜61、1989；バナ
リガ（Barinaga）、Science 265：26〜28、1994；およ
びアカギ（Akagi）ら、Nucleci Acids Res. 25：1766〜
73、1997に記載されている。複数のリコンビナーゼ系を
用いて、本発明の非ヒト哺乳動物または動物細胞を遺伝
子改変することができる。
【００６５】Cre-Lox系などのリコンビナーゼ系を用い
て、相同組換えによりPDE10A遺伝子を時間的、空間的、
または誘導的に破壊する場合は、PDE10A遺伝子のコード
領域の一部がloxP部位に隣接したPDE10A遺伝子コード領
域を含むターゲティング構築物と置換させる。このよう
な遺伝子改変をもつ非ヒト哺乳動物および動物細胞は、
loxPが隣接した機能性PDE10A遺伝子を含む。PDE10A遺伝
子破壊の時間的、空間的、または誘導的な局面は、非ヒ
ト哺乳動物または動物細胞でそれぞれ空間的に調節され
た、時間的に調節された、または誘導的に調節された所
望のプロモーターの制御下で発現される付加的な導入遺
伝子である、Creリコンビナーゼ導入遺伝子の発現パタ
ーンによって生じる。CreリコンビナーゼはloxP部位を
組換え標的とする。したがってCreの発現が活性化され
ると、LoxP部位で組換えが生じて、間に挟まれているPD
E10A遺伝子コード配列が切り出されて、PDE10A遺伝子が
機能的に破壊される（Rajewskiら、J. Clin. Invest. 9
8：600〜03、1996；St.-Ongeら、Nucleic Acids Res. 2
4：3875〜77、1996；Agahら、J. Clin. invest. 100：1
69〜79、1997；Brocardら、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 94：14559〜63、1997；Feilら、Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 93：10887〜90、1996；およびKuhnら、Science
269：1427〜29、1995）。
【００６６】Creリコンビナーゼ導入遺伝子とloxPが隣
接したPDE10A遺伝子との両方を含む細胞は、標準的なト
ランスジェニック技術で作製することができる。例えば
遺伝子改変された非ヒト哺乳動物の場合は、loxPが隣接
したPDE10A遺伝子を含む一方の親に、所望のプロモータ
ーの制御下にあるCreリコンビナーゼ導入遺伝子を含む
遺伝子改変された非ヒト哺乳動物のもう一方の親を交配
することで作製することができる。リコンビナーゼ系、
および時間的、空間的、または条件的にPDE10A遺伝子を
破壊する特定のプロモーターの使用に関する他の手引き
は、例えばソウア（Sauer）、Meth. Enz. 225：890〜90
0、1993、グー（Gu）ら、Science 265：103〜06、199
4、アラキ（Araki）ら、J. Biochem. 122：977〜82、19
97、Dymecki、Proc. Natl. Acad. Sci. 93：6191〜96、
1996、およびメイヤーズ（Mayers）ら、Nature Geneti
cs 18：136〜41、1998で説明されている。
【００６７】PDE10A遺伝子の誘導的破壊は、テトラサイ
クリン応答性バイナリー系を用いて達成することもでき
る（GossenおよびBujard、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89：5547〜51、1992）。このシステムでは、細胞を遺
伝子改変して、Tetプロモーターを内因性PDE10A遺伝子
調節エレメント、およびテトラサイクリンで制御可能な
リプレッサー（TetR）を発現する導入遺伝子に導入す
る。このような細胞では、テトラサイクリンを投与する
ことでTetRが活性化され、最終的にPDE10A遺伝子の発現
が抑制されてPDE10A遺伝子が破壊される（St.-Ongeら、
Nucleic Acids Res. 24：3875〜77、1996、米国特許第
5,922,927号）。
【００６８】時間的、空間的、および誘導的にPDE10A遺
伝子を破壊する上述の系はまた、例えば本発明の遺伝子
改変された非ヒト哺乳動物および動物細胞の作製に関す
る国際公開公報第98/29533号および米国特許第6,238,63
9号に記載されているような遺伝子改変法として遺伝子
トラップ法を用いる際に応用することもできる。
【００６９】5．遺伝子改変された非ヒト哺乳動物およ
び動物細胞の作製 遺伝子改変に関する上述の方法を用いて、動物に由来す
る実質的にすべての種類の体細胞または幹細胞でPDE10A
遺伝子を破壊することで、本発明の遺伝子改変された動
物細胞を作製することができる。本発明の遺伝子改変さ
れた動物細胞は、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞、および
鳥類細胞を含むがこれらに限定されない。このような細
胞は、培養に適した細胞株、腫瘍性の細胞株、または形
質転換細胞株などの遺伝子工学により作製された任意の
動物細胞に由来する場合があり、これらは所望のPDE10A
遺伝子改変を有する遺伝子改変された非ヒト哺乳動物か
ら単離することができる。
【００７０】このような細胞は、破壊されたPDE10A遺伝
子に関してヘテロ接合型またはホモ接合型でありうる。
PDE10A遺伝子の破壊に関してホモ接合型の細胞（PDE10
-/-）を得る際には、両方の対立遺伝子を対象に直接的
で連続的なターゲティングを行うことができる。このよ
うな過程は、正の選択マーカーを再利用することで容易
となりうる。このスキームでは、正の選択マーカーをコ
ードするヌクレオチド配列は、Cre-LoxP系を用いた一方
の対立遺伝子の破壊によって除去される。したがって、
同じベクターを、続けて次のターゲティングに用いるこ
とで、第2のPDE10A対立遺伝子を破壊することができる
（AbuinおよびBradley、Mol. Cell. Biol. 16：1851〜5
6、1996；Sedivyら、T.I.G. 15：88〜90、1999；Cruz
ら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88：7170〜74、1991；
Mortensenら、Proc. Natl. Acad.Sci. USA 88：7036〜4
0、 1991；te Rieleら、Nature（London） 348：649〜6
51、1990）。
【００７１】PDE10 -/-のES細胞を得る別の方法が、PDE
10A遺伝子破壊に関してヘテロ接合型（PDE10 +/-）の細
胞集団に由来する細胞の接合化（homogenotization）で
ある。この方法では、選択用の薬剤耐性マーカーを発現
するPDE10 +/-標的クローンが極めて高濃度の薬剤の存
在下で選択されるスキームを用いる。この選択法は、薬
剤耐性マーカーをコードする配列を2コピー発現してい
る細胞、すなわちPDE10A遺伝子の破壊がホモ接合型であ
る細胞に有利に作用する（Mortensenら、Mol.Cell. Bio
l. 12：2391〜95、1992）。また遺伝子改変された動物
細胞は、後に詳述するように、生殖系列細胞においてPD
E10 +/-である非ヒト哺乳動物を交配して作製される遺
伝子改変されたPDE10 -/-非ヒト哺乳動物から得ること
ができる。
【００７２】所望の細胞または細胞株を遺伝子改変した
後、当技術分野で周知の標準的なPCRによるPCR分析また
はサザンブロッティング法によって、PDE10A遺伝子座が
改変部位であることを確認することができる（例えば、
米国特許第4,683,202号；およびErlichら、Science 25
2：1643、1991を参照）。また、PDE10A遺伝子のメッセ
ンジャーRNA（mRNA）の量、および/またはPDE10Aポリペ
プチド量が、通常はPDE10A遺伝子を発現している細胞内
で減少する場合に、PDE10A遺伝子が機能的に破壊されて
いることの検証がなされることもある。PDE10A遺伝子の
mRNA量の値は、逆転写酵素を用いたポリメラーゼ連鎖反
応（RT-PCR）、ノーザンブロット分析、またはインサイ
チューハイブリダイゼーションで測定される。細胞によ
って作られるPDE10Aポリペプチドのレベルの定量は、例
えば当技術分野で周知の標準的な免疫アッセイ法で行わ
れる。このような免疫アッセイ法には、RIA（放射性免
疫アッセイ法）、ELlSA（酵素結合免疫吸着アッセイ
法）、「サンドイッチ」免疫アッセイ法、免役放射線ア
ッセイ法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ法、イ
ンサイチュー免疫アッセイ法（例えば、金コロイド、酵
素標識、または放射性同位元素標識を用いるアッセイ
法）、ウェスタンブロット、二次元ゲル解析、沈降反
応、免疫蛍光アッセイ法、タンパク質Aアッセイ法、お
よび免疫電気泳動などの手法を用いる競合的アッセイ系
または非競合的アッセイ系が含まれるがこれらに限定さ
れない。
【００７３】本発明の好ましい遺伝子改変された動物細
胞は、胚幹（ES）細胞およびES様細胞である。このよう
な細胞は、マウス（Evansら、Nature 129：154〜156、1
981；Martin、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78：7634
〜7638、1981）、ブタおよびヒツジ（Notanianniら、J.
Reprod. Fert. Suppl.、43：255〜260、1991；Campbel
lら、Nature 380：64〜68、1996）ならびにヒトを含む
霊長類（Thomsonら、米国特許第5,843,780号、Thomson
ら、Science 282：1145〜1147、1995；およびThomson
ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92：7844〜7843、199
5）などのさまざまな種の着床前の胚および胚盤胞に由
来する。
【００７４】以上の種の細胞は多能性である。すなわち
適切な条件下では、三種すべての胚葉（外胚葉、中胚
葉、内胚葉）に由来するさまざまな細胞種に分化する。
培養条件に応じ、ES細胞の試料は幹細胞として無制限に
培養され、一つの試料において多種多様な細胞種へと分
化させたり、またはマクロファージ様細胞、神経細胞、
心筋細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞、内皮細
胞、骨格筋細胞、角質細胞、および好酸球、マスト細
胞、赤血球前駆細胞、もしくは巨核球などの造血細胞な
どの特定の細胞種への分化を誘導させることができる。
誘導的な分化は、例えばケラー（Keller）ら、Curr. Op
in. Cell Biol. 7：862〜69、1995、リー（Li）ら、Cur
r. Biol. 8：971、1998、クラッグ（Klug）ら、J. Cli
n. Invest. 98：216〜24、1996、リーシュック（Liesch
ke）ら、Exp. Hematol. 23：328〜34、1995、ヤマネ（Y
amane）ら、Blood 90：3516〜23、1997、およびヒラシ
マ（Hirashima）ら、Blood 93：1253〜63、1999にさら
に詳しく記載されているように、特定の成長因子または
マトリックス構成成分を培養条件に含めることで達成さ
れる。
【００７５】遺伝子改変に用いられる特定の胚幹細胞株
は重要ではなく、例えばマウスES細胞株にはAB-1（McMa
honおよびBradley、Cell 62：1073〜85、1990）、E14
（Hooperら、Nature 326：292〜95、1937）、D3（Doets
chmanら、J. Embryol. Exp. Morph. 87：27〜45、198
5）、CCE（Robertsonら、Nature 323：445〜48、198
6）、RW4（Genome Systems、St. Louis、MO）、ならび
にDBA/1lacJ（Roachら、Exp. Cell Res. 221：520〜2
5、1995）が含まれる。遺伝子改変されたマウスES細胞
を使用して遺伝子改変されたマウスを、公開された手順
で作製することができる（Robertson、1987、「奇形癌
と胚性幹細胞：実践的アプローチ（Teratocarcinomas a
nd Embryonic Stem Cells：A Practical Approac
h）」、E.J. Robertson編、Oxford：IRL Press、71〜11
2ページ、1987；Zjilstraら、Nature 342：435〜438、1
989；およびSchwartzbergら、Science 246：799〜803、
1989）。
【００７６】ES細胞が、PDE10A遺伝子の所望の機能的破
壊を含むことを確認した後に、これらのES細胞を、当技
術分野で周知の方法でキメラマウス作製用の適切な胚盤
胞宿主に注入する（Capecchi、Trends Genet. 5：70、1
989）。本発明に使用される特定のマウスの胚盤胞は重
要ではない。胚盤胞の例には、C57BL6マウス、C57BL6ア
ルビノマウス、スイス（Swiss）非近郊系マウス、CFLP
マウス、およびMFIマウスに由来する胚盤胞などが挙げ
られる。またはES細胞を、凝集用ウェル内において四倍
体胚の間に挟んでもよい（Nagyら、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90：8424〜8428、1993）。
【００７７】遺伝子改変されたES細胞を含む胚盤胞また
は胚を次に偽妊娠状態の雌のマウスに移植し、子宮内で
発生させる（Hoganら、「マウス胚の操作：実験マニュ
アル（Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory
Manual）」、Cold Spring Harbor Laboratory press、C
old Spring Harbor、NY、1988；および「奇形癌と胚性
幹細胞：実践的アプローチ（Taratocarcinomas and Emb
ryonic Stem Cells：APractical Approach）」、E.J. R
obertson編、IRL Press、Washington、DC、1987）。代
理母から生まれた子孫をスクリーニングして、PDE10A遺
伝子の破壊についてキメラの個体を同定することができ
る。一般的には、このような子孫は、遺伝子改変された
ドナーES細胞、ならびに当初の胚盤胞からの他の細胞に
由来する複数の細胞を含む。このような状況では、最初
にモザイクの毛色に対して子孫をスクリーニングするこ
とができる。この場合、毛色の選択法を用いてドナーの
ES細胞に由来する細胞を胚盤胞の他の細胞と区別するこ
とができる。または、子孫の尾組織から抽出したDNAを
用いて、遺伝子改変された細胞を含むマウスを同定する
ことができる。
【００７８】生殖系列細胞にPDE10A遺伝子の破壊を含む
キメラマウスどうしを交配させると、PDE10A遺伝子の破
壊をすべての生殖系列細胞および体細胞にもつ子孫が得
られる。次に、PDE10A遺伝子の破壊をヘテロでもつマウ
スを交配してホモ接合型マウスを得ることができる（例
えば、米国特許第5,557,032号、および米国特許第5,53
2,158号を参照）。
【００７９】遺伝子改変を、1個の細胞から動物個体全
体に移す、上述のES細胞操作に代わる方法では核移植を
用いる。この方法を用いて、他の遺伝子改変された非ヒ
ト哺乳動物（マウスを除く）、例えばヒツジ（McCreath
ら、Nature 29：1066〜69、2000；Campbellら、Nature
389：64〜66、1996；およびSchniekeら、Science 278：
2130〜33、1997）、およびウシ（Cibelliら、Science 2
80：1256〜58、1998）を作製することができる。簡単に
説明すると、体細胞（例えば繊維芽細胞）または多能性
幹細胞（例えばES様細胞）を核ドナーとして選択し、PD
E10A遺伝子の機能的破壊を含むように遺伝子改変する。
DNAベクターを体細胞に導入してPDE10A遺伝子に変異を
導入する場合、プロモーターのないマーカーを、PDE10A
遺伝子へのベクターの組み込みがPDE10A遺伝子プロモー
ターの制御下におけるマーカーの発現をもたらすような
ベクターに用いることが好ましい（SedivyおよびDutria
ux、T.I.G. 15：88〜90、1999；McCreathら、Nature 2
9：1066〜69、2000）。次に、適切なPDE10A遺伝子破壊
を有するドナー細胞の核を、受精したか、または単為生
殖性の除核卵母細胞へ移す（Campbellら、Nature 380：
64、1996；Wilmutら、Nature 385：810、1997）。胚を
再構成し、培養して、桑実胚/胚盤胞期へ進め、代理母
に移して子宮内で満期まで発生させる。
【００８０】本発明はまた、遺伝子改変された非ヒト哺
乳動物、および遺伝子改変された動物細胞の子孫も含
む。このような子孫は、PDE10A遺伝子を破壊する遺伝子
改変に関してヘテロ接合型またはホモ接合型であるが、
PDE10A遺伝子の当初の遺伝的破壊の他に後の世代で生じ
る可能性のある変異または環境因子が存在するために、
親の非ヒト哺乳動物および動物細胞と遺伝的に同一とい
うわけではない。
【００８１】遺伝子改変された非ヒト動物細胞は、組織
または器官から当技術分野で周知の手法により単離する
ことができる。一つの態様では、本発明の遺伝子改変さ
れた細胞は不死化される。この態様によれば、遺伝子工
学によってテロメア遺伝子、癌遺伝子（例えば、mosも
しくはv-src）、またはアポトーシス抑制遺伝子（例え
ばbcl-2）を細胞に導入することで細胞を不死化するこ
とができる。または、当技術分野で周知の手法によりハ
イブリダイゼーションのパートナーと融合させて細胞を
不死化させることができる。
【００８２】6．「ヒト化された」非ヒト哺乳動物およ
び動物細胞 破壊された内因性PDE10A遺伝子を含む、本発明の遺伝子
改変された非ヒト哺乳動物および動物細胞（非ヒト）を
さらに改変して、ヒトのPDE10A配列を発現させること
（本明細書では「ヒト化」と呼ぶ）ができる。これは、
ヒトの疾患状態に関連した変異および/または多型を含
むヒト化配列を含む。細胞をヒト化する好ましい方法に
は、内因性PDE10A配列を、ヒトPDE10A配列をコードする
核酸配列と相同組換えにより置換する段階が含まれる
（Jakobssonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96：7220
〜25、1999）。このようなベクターは、5'および3'の相
同性領域ならびに正負の選択スキームに関して従来から
ターゲティングベクターとして用いられてきたベクター
に類似している。しかし、このようなベクターは組換え
後に、ヒトPDE10Aのコード配列を内因性配列と置換する
配列か、または内因性配列を改変してヒトPDE10をコー
ドするようになる塩基対の変化、エキソンにおける置
換、またはコドンの置換に影響を及ぼす配列を含む。相
同組換え体が同定されたら、任意の選択用配列（例えば
neo）を、CreまたはFlpを介した部位特異的な組換えで
切り出すことができる（Dymecki、Proc. Natl. Acad. S
ci. 93：6191〜96、1996）。
【００８３】ヒトPDE10A配列を内因性配列と置換する場
合は、このような変化を内因性の翻訳開始部位の下流に
直接導入することが好ましい。このような配置とするこ
とで、PDE10A遺伝子の内因性の時間的および空間的な発
現パターンが維持される。ヒトの配列は、適切なプロセ
シングのために3'末端に結合させたポリ（A）テイルを
もつ完全長のヒトcDNA配列であっても、全ゲノム配列で
あってもよい（Shiaoら、Transgenic Res. 8：295〜30
2、1999）。細胞および非ヒト哺乳動物を遺伝子改変し
て内因性遺伝子の発現をヒト相対物の発現と置換する以
上の方法に関する他の詳しい手引きは、例えばサリバン
（Sullivan）ら、J. Biol. Chem. 272：17972〜80、199
7、レオーミュ（Reaume）ら、J. Biol. Chem. 271：233
80〜88、1996、およびスコット（Scott）ら、米国特許
第5,777,194号に記載されている。
【００８４】このような「ヒト化された」生物を作製す
る他の方法は、内因性遺伝子を破壊すること、それに続
く、ヒト配列をコードする導入遺伝子を前核微量注入法
によりノックアウト胚へ導入することが含まれる、二段
階過程である。
【００８５】7．遺伝子改変された非ヒト哺乳動物およ
び動物細胞の使用 PDE10Aの機能および治療上の意義は、PDE10A遺伝子の破
壊がホモ接合型（-/-）およびヘテロ接合型（+/-）の本
発明の非ヒト哺乳動物および動物細胞の表現型を調べる
ことで明らかにすることができる。例えば、遺伝子改変
されたPDE10A-/-の非ヒト哺乳動物および動物細胞を用
いて、PDE10Aが特定の疾患モデル（例えば神経精神疾患
および神経変性モデル）でみられる症状または表現型の
発現または予防に重要な役割を果たしているか否かを判
定することができる。野生型（PDE10A +/+）またはPDE1
0A +/-の非ヒト哺乳動物または動物細胞と比較して、PD
E10A -/-の非ヒト哺乳動物または動物細胞で症状または
表現型が異なる場合は、PDE10Aポリペプチドが、症状ま
たは表現型に関連した機能の調節に重要な役割を果たし
ている。PDE10A -/-マウスと野生型マウスとの比較によ
る、PDE10Aの機能の評価に使用可能な動物モデルの例に
は、自発運動、精神興奮反応、学習/記憶、行動修飾
（例えば恐怖反応）、および神経変性のモデルなどが挙
げられる。
【００８６】また任意の薬剤が、PDE10Aの作動薬または
拮抗薬（例えば、薬剤をPDE10A +/+またはPDE10A +/-の
非ヒト哺乳動物または動物細胞に投与したときに一種ま
たは複数のPDE10Aポリペプチドの活性を大きく修飾する
薬剤）として同定されている状況では、本発明の遺伝子
改変されたPDE10A -/-の非ヒト哺乳動物および動物細胞
は、PDE10Aの作用/拮抗作用を生じることがわかってい
る作用（すなわち非ヒト哺乳動物および動物細胞が負の
対照として使用されうる）以外に薬剤によって生じる他
の作用の特性解析に有用である。例えば薬剤の投与によ
って、PDE10Aのポリペプチド活性に関連することが不明
なPDE10A +/+の非ヒト哺乳動物または動物細胞に対して
作用が生じた場合は、薬剤が同作用を単独で、または主
にPDE10Aの調節を介して生じるか否かを、対応するPDE1
0A -/-の非ヒト哺乳動物または動物細胞に同薬剤を投与
することで判定することができる。作用がPDE10A -/-の
非ヒト哺乳動物または動物細胞で認められない場合、ま
たは大きく低下している場合は、同作用には少なくとも
部分的にPDE10Aが関与する。しかし、PDE10A -/-の非ヒ
ト哺乳動物または動物細胞が、PDE10A +/+またはPDE10A
+/-の非ヒト哺乳動物または動物細胞に匹敵する程度の
作用を示す場合は、同作用にはPDE10Aのシグナル伝達が
かかわらない経路が関与する。
【００８７】また、ある薬剤が、PDE10A経路を介する作
用を生じると考えられる場合、PDE10A -/-の非ヒト哺乳
動物および動物細胞が、上記仮説を検討する際に有用で
ある。薬剤がPDE10Aに作用するのであれば、PDE10A -/-
の非ヒト哺乳動物および動物細胞を同薬剤で処理して
も、PDE10A +/+の非ヒト哺乳動物または動物細胞で認め
られる作用と同様の作用はみられないはずである。
【００８８】本発明のPDE10A -/-の非ヒト哺乳動物は、
他の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物と交配する際に、
または他の疾患モデル（例えば、ヒトのハンチントン病
に類似した表現型を示すように作用するタンパク質を発
現するマウス）にも有用である。
【００８９】本発明の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物
および動物細胞を用いて、野生型の各対照と比較して、
PDE10A +/-またはPDE10A -/-の非ヒト哺乳動物または動
物細胞における発現が促進されている遺伝子群を同定す
ることもできる。当技術分野で周知の手法を用いて、本
発明の説明を元にこのような遺伝子群を同定することが
できる。例えばDNAアッセイ法により、発現がPDE10A +/
-マウス、またはPDE10A -/-マウスで促進されてPDE10A
発現の欠損を補償している遺伝子群を同定することがで
きる。DNAアレイは当技術分野で周知である（例えば、A
ignerら、Arthritis and Rheumatism 44：2777〜89、20
01；米国特許第5,965,352号；Schenaら、Science 270：
467〜470、1995；DeRisiら、Nature Genetics 14：457
〜460、1996；Shalonら、Genome Res. 6：639〜645、19
96；およびSchenaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9
3：10539〜11286、1995を参照）。
【００９０】下記の例は、本発明を説明するために示す
ものであって、本発明を制限する意図はない。
【００９１】
【実施例】A．ターゲティングベクターの構築 2.2 kbのゲノム断片を用いて、DBA/1lacJゲノムラムダ
（λ）ファージライブラリー（Stratagene、La Jolla、
CA）とハイブリダイズさせた。このゲノム断片は、1898
〜2146 bp のマウスPDE10A cDNA配列（Genbank番号AF11
0507）、および約2.0 kbのイントロンを含んでいた。3
個の重複したPDE10Aゲノムクローンを単離し、pBluescr
ipt SK+（Stratagene、La Jolla、CA）のNotI部位にサ
ブクローン化した。クローンの制限酵素地図を作製し、
5つのエキソン（cDNAの1484〜2303 bp）を含む22 kbのP
DE10Aゲノム座位を含むことを確認した。
【００９２】2.0 kbのNheI/BamHI断片を単離して、pBlu
escript SK+のXbaI/BamHI部位にクローン化した。結果
として得られたクローン中のBamHI制限酵素切断部位を
クレノウ（Roche Diagnostics、Indianapolis、IN）に
よるフィルイン（fill-in）反応で破壊した。この2.0 k
bの断片を、pBluescript SK+ ベクターをNotI/XhoIで切
断して再び単離し、pJNS2-Frtターゲティングベクター
の骨格（Dombrowiczら、Cell 75：969〜76、1993）のNo
tI/XhoI部位にクローン化して5'側の相同性領域（homol
ogy arm）とした。3'側の相同性領域は5.1 kbのBglII断
片として単離した。この5.1 kbの断片を、pJNS2-Frtタ
ーゲティングベクター（5'側の相同性領域を既に含む）
のBamHIクローニング部位にクローン化して最終的なタ
ーゲティングベクターを得た。このターゲティングベク
ターは、3.9 kbのPDE10Aのゲノム座位をPGK-ネオマイシ
ンカセットと置換するように設計した（図1）。欠失さ
せた3.9 kbのゲノム断片は、1499〜1861 bpのcDNA配列
をコードする3つのエキソンを含む。
【００９３】B．ES細胞のスクリーニング PDE10AターゲティングベクターをNotIで切断して直線化
し、エレクトロポレーションでDBA/1LacJ ES細胞に導入
した（Roachら、Exp. Cell. Res. 221：520〜25、199
5）。多能性ES細胞は、15% ES細胞適格ウシ胎児血清（I
LTI、#10439-024）、0.1 mM 2-メルカプトエタノール
（Sigma、St. Louis、MO、#M-7522）、0.2mM L-グルタ
ミン（ILTI、#25030-081）、0.1 mM MEM 非必須アミノ
酸（ILTI、#11140-050）、1000 ユニット/ml 組換え型
マウス白血病抑制因子（Chemicon International In
c.、Temecula、CA、カタログ番号ESG-1107）、およびペ
ニシリン/ストレプトマイシン（ILTI、#15140-122）を
添加したノックアウト用DMEM（Invitrogen Life Techno
logies, Inc.、（ILTI）、Gaithersburg、MD、#10829-0
18）を含む幹細胞用培地（SCML）中、マイトマイシンC
で処理した一次胚繊維芽細胞（PEF）フィーダー層上で
維持した。
【００９４】SCML中、1×１０７ 個の細胞と25 μgの直
線化したターゲティングベクターとを用いたエレクトロ
ポレーションを、電圧240 V、キャパシタンス50 μF、
および抵抗360オームに設定したBTX Electro Cell Mani
pulator 600（BTX, Inc.、San Diego、CA）で行った。
正負の選択は、文献（Mansourら、Nature 236：348〜5
2、1988）に記載されているように、200 μg/mlのG418
（ILTI、#11811-031）、および2 μMのガンシクロビル
（Syntex Laboratories、Palo Alto、CA）を含むSCML中
において、エレクトロポレーションの24時間後に開始し
た。
【００９５】8〜12日かけて選択した後に、耐性コロニ
ーをマイクロピペットで採取した。耐性ES細胞コロニー
の増殖およびスクリーニングは、モーン（Mohn）および
ケラー（Koller）（Mohn、「DNAクローニング4（DNA Cl
oning 4）」、Hames編、143〜184、Oxford University
Press、New York、1995）に記載された手順で行った。
【００９６】G418およびガンシクロビルによる選択後に
生存していた130個のES細胞コロニーからDNAを単離し
た。このDNAをBamHIで切断して0.7% アガロースゲル（B
ioWhittaker Molecular Applications、Rockland、ME）
で電気泳動を行い、Hybond N+ナイロンメンブレン（Ame
rsham Pharmacia Biotech、Buckinghamshire、Englan
d）にトランスファーしてサザン分析を行った。5'側の
相同性領域の上流にある2.2 kbのPstIゲノム断片をプロ
ーブとして用い、相同的に組換えが生じたES細胞を同定
した。この2.0 kbのプローブは、標的対立遺伝子には内
因性のBamHI部位がないことから、5.4 kbの内因性対立
遺伝子および8.4 kbの標的対立遺伝子を認識する。1個
の標的クローン（クローン#176）が5' PstIプローブ
（図2）で同定された。このクローンの3'側に対する標
的化は、1.2 kbのNheI/EcoRV断片をプローブとして用い
ることで確認した。この断片は、3'側相同性領域の下流
に位置し、新しく導入されたEcoRV部位が標的対立遺伝
子のネオマイシンカセット中に存在するため、8.0 kbの
内因性EcoRV/NheI断片および5.7 kbの標的対立遺伝子の
断片を認識する。
【００９７】C．ノックアウトマウスの作製 クローン#176に由来するES細胞を、C57BL/6Jの雌（The
Jackson Laboratory、Ber Harbor、ME）から単離した胚
盤胞期の胚に注入した。雄のキメラを同定し、DBA/1lac
Jの雌（The Jackson Laboratory）と戻し交配を行っ
て、生殖系列のPDE10Aヘテロ接合型（+/-）子孫を作製
した。
【００９８】ヘテロ接合型個体の遺伝子型は、ネオマイ
シンカセットの存在を指標にPCRによって決定した。プ
ライマー対は、Neo-833F （配列番号：1）およびNeo-1023R （配列番号：2）を用いた。このオリゴ対により、標的P
DE10A対立遺伝子の190 bp断片が増幅された。
【００９９】ヘテロ接合型の雄および雌を交配してホモ
接合型（-/-）のPDE10ノックアウト個体を作製した。こ
の子孫の遺伝子型は、2組のプライマー対を用いて決定
した。第1のプライマー対はネオマイシンカセットに特
異的であり（Neo-833FおよびNeo-1023R）、第2のプライ
マー対はPDE10ノックアウト領域に特異的である（図
3）。PDE10Aに特異的なプライマー対は、PDE10KO-649F （配列番号：3）およびPDE10KO-1262R （配列番号：4）からなり、3.9 kbのノックアウト領域
に含まれる613 bpの断片を増幅した。正常なメンデル比
が、上記の交配で得られた子孫で認められた。例えば32
匹の同腹仔からの子孫50匹が-/-、92匹が+/-、また42匹
が+/+であった。
【０１００】D．PDE10ノックアウトマウスにおけるPDE1
0A RNAの特性解析 PDE10A遺伝子のゲノム構成（Fujishigeら（2000） Eur.
J. Biochem. 267：5943〜5951）に基づいて、野生型DN
Aと比べて378ヌクレオチドの欠失を含む、-/-マウスの
脳から単離されたcDNAは、第15エキソンの3'末端に第19
エキソンの5'末端をつなぐスプライシングによって生じ
た。この欠失型cDNAは、野生型タンパク質と比較して触
媒ドメインのN末端領域の末端に126個のアミノ酸を含ま
ず、推定分子量が約75 kDaのPDE10A断片をインフレーム
でコードしていた。
【０１０１】全RNAを野生型マウスおよびノックアウト
マウスの線条体からRNAeasy（Qiagen）を用いて単離
し、第一鎖（first-strand）cDNAを、第一鎖cDNA合成キ
ット（invitrogen）およびオリゴdTプライマーを用いて
合成した。PCRは、ノックアウトマウスで生じた欠失/挿
入の下流存在するPDE10の触媒領域に対して設計したプ
ライマー（5'プライマー： （配列番号：5）、3'プライマー： （配列番号：6））、およびTaqポリメラーゼ（Roche）
を用い、94℃で3分、次に94℃で30秒、55℃で30秒、68
℃で3分30秒を35サイクル、最後に68℃で5分の伸長を行
う条件でRobocycler（Stratagene）を使用して実施し
た。予想外にも、得られた結果から、PDE10A +/+マウス
とPDE10A -/-マウスの双方の脳から単離されたRNA中に4
28 bpの産物が存在することが判明し、触媒ドメインの
配列を含むRNAがPDE10A +/+マウスとPDE10A -/-マウス
の脳の双方に存在することが示唆された。-/-個体中のR
NA種の特性を解析するために、発明者らは、上述の手順
で調製した第一鎖cDNA、および5'側のBamHI部位（5'プ
ライマー： （配列番号：7））、および3'側のSalI部位（3'プライ
マー： （配列番号：8））を含むPDE10A PCRプライマーを用い
て、cDNAをPDE10A -/-マウスの脳から単離した。PCR
は、Pfuポリメラーゼ（Stratagene）を用い、94℃で2
分、次に94℃で1分、48℃で1分、72℃で4分を4サイク
ル、94℃で1分、55℃で1分、72℃で4分を30サイクル、
最後に72℃で10分の伸長を行うサイクル条件でRobocycl
erを使用して行った。約1980 bpの産物をpCR BluntII T
OPO（Invitrogen）にサブクローン化して配列を決定し
た。
【０１０２】E．PDE10ノックアウトマウスのPDE10A活性
の消失 ウェスタン分析 以下の実施例で説明するように、ノックアウトマウスで
生じたゲノムの欠失/挿入により、PDE10A +/-マウス、
およびPDE10A -/-マウスにおける完全長のPDE10Aタンパ
ク質の発現、およびPDE10A酵素活性が消失する。PDE10A
タンパク質およびその活性は、遺伝子改変マウスの線条
体抽出物を対象に分析した。この脳領域を選択した理由
は、同領域が哺乳動物で最も高くPDE10Aを発現している
領域であるためである。場合によっては比較目的で皮質
抽出物も分析した。これは皮質が、僅かにPDE10Aを発現
しているためである。
【０１０３】PDE10Aが+/+、+/-、または-/-の各マウス
を安楽死させて脳を速やかに摘出し、顕微解剖によって
線条体と皮質を得た。組織をpH 7.5の50 mM Tris-HCl、
250mM NaCl、pH 8.0の5 mM EDTA、0.1% nonidet P-40お
よびプロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液とともにガラス-
フッ素樹脂（テフロン(登録商標)）製のダウンス（doun
ce）ホモジナイザーでホモジナイズした。溶解液を4℃
で30分間遠心し、ペレットを捨て、上清の溶解液を-80
℃で保存した。タンパク質濃度はPierce BCA法で決定し
た。
【０１０４】PDE10Aタンパク質の発現を、PDE10AのN末
端領域に対するモノクローナル抗体（24F3.F11）を用い
たウェスタンブロット法で分析した（Menniti、F.S.、S
trick、C.A.、Seeger T.F.、およびRyan、A.M. William
Harvey Research Conference 「Phosphodiesterase in
Health and Disease」、Porto、Portugal、2001年12月
5〜7日）。PDE10A +/+、+/-、または-/-の各マウスの線
条体溶解液に由来する等量のタンパク質を、MOPSランニ
ング緩衝液を用いて4〜12% NuPAGE Bis-Trisゲル（Nova
gen）上で分離した後にニトロセルロースにトランスフ
ァーした。このブロットを抗PDE10Aモノクローナル抗体
と1：1000〜1：2000の希釈率でインキュベートした後
に、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させたヒツジ抗
マウス二次抗体（Amersham）とインキュベートした。ブ
ロットはECL Detection System（Amersham）で分析し
た。
【０１０５】図4に示した通り、免疫反応性を示すバン
ドが、精製した組換え型PDE10Aの分子量約89 kDaの位置
で認められた（レーン1の左の矢印）。PDE10A +/+マウ
スの線条体抽出物（レーン2）でも、この分子量のバン
ドが認められたことから、PDE10Aタンパク質が存在する
ことがわかる。しかし同じバンドは、PDE10A +/-マウス
に由来する等量の線条体抽出物では強度が有意に弱く
（レーン3）、PDE10A -/-個体の抽出物ではバンドが認
められなかった（レーン4）。興味深いことに、同抗体
により、PDE10A -/-マウスの線条体抽出物中で欠失型PD
E10A RNAがコードするタンパク質と推定される分子量の
新しいバンドが認識されている（右の矢印）。
【０１０６】-/-マウスに由来するPDE10Aの組換え体の
発現および活性 -/-マウスに存在する変異型PDE10A mRNAが活性型タンパ
ク質を産生しなかったことを確実にするため、-/-マウ
スから単離したcDNAをBamHI/SalI断片としてpFastBacI
（Invitrogen）にサブクローン化し、これを用いて製造
業者のプロトコール（Bac-to-Bac、Invitrogen）にした
がって昆虫細胞で発現するウイルスを作製した。完全長
のPDE10A cDNA、または欠失変異型cDNAをコードするウ
イルスをSf9細胞に感染させた後に、細胞抽出物のホス
ホジエステラーゼ活性を測定した。トランスフェクトし
たSf9昆虫細胞を、SF900II-SFM（Invitrogen）中、０．
５×１０６/mlとなるように懸濁培養物に添加し、120 r
pm、27℃で一晩増殖させた。MOIが約1になるように細胞
に感染させ、72時間後に回収した。細胞を、プロテアー
ゼ阻害剤を含む50 mM TRIS緩衝液（pH 7.4）に超音波処
理しながらホモジナイズした。このホモジネートを14,0
00×gで20分間遠心し、得られた上清を用いて酵素活性
を調べた。
【０１０７】細胞抽出物のPDE活性は、文献（Fawcett
ら、2000）の方法に基づいてシンチレーション近接アッ
セイ法（Scintillation Proximity Assay; SPA）を元に
した方法で測定した。さまざまな量の細胞抽出物を、96
ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに20 μMの
[３H]cAMPを含むアッセイ緩衝液［pH 7.4の20 mM Tris-
HCl、5 mM MgCl２、1 mg/ml ウシ血清アルブミン］に添
加し（最終容量100 μl）、室温または30℃で20〜30分
インキュベートした。反応は、50 μlのケイ酸イットリ
ウムSPAビーズ（Amersham）を添加して停止させた。プ
レートを密封して20分間振盪させた後、ビーズを30分間
かけて暗条件で沈降させ、トップカウント（TopCount）
プレートリーダー（Packard、Meriden、CT）で測定を行
った。酵素活性の上昇を、SPAで検出したさまざまな希
釈率の細胞抽出物における、[３H]cAMPがホスホジエス
テラーゼで触媒されて生じた分解産物、[３H]5'-AMPの
上昇で表す。
【０１０８】非トランスフェクトSf9細胞のホモジネー
トにおいては、内因性PDE活性のレベルが低い（図5
A）。PDE活性は、完全長のPDE10A cDNAをトランスフェ
クトしたSf9細胞ホモジネート中では50倍よりも高い。
しかし1499〜1861位の塩基を欠くPDE10Aをトランスフェ
クトしたSf9細胞のホモジネートにおいては、PDE活性は
非トランスフェクト細胞における活性と区別できなかっ
た。このような破壊は、触媒的に不活性な内因性PDE10A
タンパク質を生じる。したがってPDE10A -/-マウスに存
在するPDE10A mRNAから、触媒的に活性なタンパク質は
生じ得ない。
【０１０９】PDE10A +/+マウスおよび-/-マウスに由来
する免疫沈降タンパク質のPDE10A活性PDE10A -/-マウス
でPDE10Aの発現が見かけ上みられないことを、PDE10Aタ
ンパク質を線条体抽出物から免疫沈降法および酵素活性
アッセイ法で単離することで確認した。免疫沈降法で
は、洗浄したタンパク質A/Gビーズのスラリーを、24F3.
F11抗体と22℃で2時間インキュベートした。ビーズ/抗
体複合体を洗浄後、PDE10A +/-、+/-、または-/-の各マ
ウスに由来するタンパク質抽出物とインキュベートした
（ビーズ：タンパク質の比は1：10）。この混合物を、
回転させて絶えず攪拌しながらさらに22℃で2時間イン
キュベートした。タンパク質A/Gビーズを遠心して沈殿
させ、PBSで洗浄した。次にこの免疫沈降複合体のホス
ホジエステラーゼ活性を、上述のSPA法で調べた。
【０１１０】図5Bに示すように、かなりのホスホジエス
テラーゼ活性が、PDE10A +/+マウスの線条体抽出物に由
来する免疫沈降物中に認められた。しかしPDE10A +/-マ
ウスの抽出物から回収された活性は、野生型マウスの抽
出物に由来する活性と比べて低く、さらにPDE10A -/-マ
ウスの抽出物でみられた活性と比べて大きな低下が認め
られた。3群すべての個体で、ホスホジエステラーゼ活
性が皮質組織由来の免疫沈殿物でも認められたが、活性
レベルは異なる群間で変わらず、免疫沈降反応でホスホ
ジエステラーゼが非特異的に抽出されると推定される。
ホスホジエステラーゼ活性レベルが、PDE10A -/-マウス
の線条体抽出物と皮質抽出物で同等であることは注目に
値する。この結果は、PDE10A -/-活性の線条体抽出物で
認められた活性が、残存性のPDE10A活性によるものでは
なく、他の非特異的に抽出されたホスホジエステラーゼ
活性によることを示唆している。以上のデータは、上述
の欠失型PDE10Aタンパク質のウェスタンブロット分析お
よび組換え体発現で得られたデータとあわせて、PDE10
-/-マウスではPDE10Aタンパク質の発現および酵素活性
が極めて大きく低下または消失することを示している。
【０１１１】F．PDE10A -/-マウスにおけるPDE10A阻害
剤活性の消失 PDE10Aノックアウトマウスは、任意の薬剤が、PDE10Aと
の相互作用を介して生物学的作用を生じているか否かの
判定に有用である。対象となる薬剤が実際にPDE10Aを介
して作用しているのであれば、PDE10A -/-マウスに対象
薬剤を投与するとPDE10A +/+の個体でみられる作用とは
同等の作用を示さないはずである。これは、PDE10A阻害
物質パパベリン（Papaverine；#76223 Sigma-Aldrich、
St. Louis、MO）が線条体cGMP量の変化に及ぼす作用に
関する以下の実施例で説明される。PDE10A +/+および-/
-マウスの腹腔内に32 mg/kgのパパベリンまたは溶媒を
注射した。15分後に、頭部に集束ビームマイクロ波を照
射（Litton Systems 70/50microwave、モデルBN-K2（Ge
neral Medical Engineering Corp.、Peabody、MA、US
A）における2秒間の曝露）してマウスを安楽死させ、酵
素による環状ヌクレオチド分解を防いだ。線条体領域お
よび皮質領域を単離し、分析するまで-80℃で保存し
た。試料を0.5 N HCl中でホモジナイズした後に20,000
×gで30分間遠心した。上清のcGMP濃度を、酵素免疫ア
ッセイキット（Cayman Chemical、Ann Arbor、MI、US
A）を用いて製造業者の指示にしたがって決定した。
【０１１２】溶媒とは異なりパパベリンは、PDE10A +/+
マウスの線条体抽出物でcGMP量の2倍以上の上昇をもた
らした（図6）。溶媒に比べて、パパベリンが、これら
の個体の皮質抽出物のcGMP量に及ぼす作用は認められな
かった。線条体と皮質におけるパパベリンの作用が異な
ることは、皮質に比べて線条体ではPDE10Aが高レベルで
発現していることを反映している。PDE10A +/+の個体と
は対照的に、パパベリンはPDE10A -/-マウスの組織にお
いて、線条体cGMP量の極めてわずかな増加をもたらし
た。以上の結果は、上述したPDE10A -/-の個体で検出さ
れたPDE10Aタンパク質および酵素活性が有意に低下した
ことから予測される。
【０１１３】薬剤がPDE10Aとの相互作用を介して生物学
的作用を生じるか否かの判定におけるPDE10Aノックアウ
トマウスの有用性を示す別の例は、PDE10A阻害物質であ
るパパベリンの条件回避反応に及ぼす影響を調べる方法
で説明される。条件回避反応の概念では、フットショッ
クを避けるために条件的刺激の提示に応じて、シャトル
ボックス内の暗いチャンバーから照明をつけたチャンバ
ーへ動くように動物を訓練する。ヒトにおける抗精神病
活性をもつ薬剤は、以上のような条件回避反応を抑える
ことがわかっており、新規化合物に同反応を抑える能力
があれば、ヒトにおける抗精神病作用と相関があると考
えられる（Wadenberg, M.-L.G.およびHicks、P.B., Neu
rosci. Biobehav. Rev. 23：851〜862、1999）。
【０１１４】条件回避実験に用いるシャトルチャンバー
は、プレキシグラス（Plexiglas）製の複数の行動測定
用チャンバー（Coulbourn Instruments）からなる。個
々のチャンバーはギロチンドアで2つに分けられてお
り、消音性キャビネットで囲まれている。プレキシグラ
ス製チャンバーは金属格子製の床に固定されており、こ
の床にはスクランブル/コンスタントの電流ショック発
生装置が備えられている。ケージの照明が点灯される
と、チャンバーの反対側に動き、またギロチンドアを開
けて（すべてはフットショックを与える5秒前に行
う）、フットショック（0.6ミリアンペア）を避けるよ
うにマウスを訓練する。回避反応の成功回数（個体がシ
ョックを受ける前に越える回数）、ならびに逃避した回
数（個体が足にショックを受けてから越える回数）、逃
避に失敗した回数（個体がフットショックを受けても越
えられない回数）、および回避までに要する時間（最長
5秒）、または逃避までに要する時間（最長10秒）を記
録するためにコンピュータープログラムを用いる。1日
のセッションで30回のトライアルを実施し、ギロチンド
アを閉じるトライアル間の間隔は15秒とした。薬剤投与
のセッションは、マウスが一回のセッションで回避が80
%の基準に達した時点で始める。溶媒の投与を週に1日行
い、統計解析により、日を改めて行った各薬剤の投与
と、同じ週に行った溶媒投与とを比較する。試験は、明
暗サイクルの明期（通常は午前8時〜午前11時）に行
う。データは、各個体で自身の対照をおき、対応t検定
で解析する。
【０１１５】PDE10A +/+マウスおよびPDE10A -/-マウス
は、いずれも同等の学習トライアル回数で、基準に対す
る条件回避反応を学習した。既知の抗精神病性薬剤であ
るハロペリドール（Haloperidol；#H1512、Sigma-Aldri
ch、ミシガン州セントルイス）は、両群のマウスにおい
て、条件回避反応を同等の効力で抑制した（ED50は、PD
E10A +/+マウスで0.21 mg/kg、PDE10A -/-マウスで0.29
mg/kg；ウィルコクソンの符号付き順位検定、p＞0.0
5）。PDE10A +/+マウスでは、パパベリンも条件回避反
応を20.7 mg/kgのED50で抑制した（図7）。検討した最
高用量（56 mg/kg）では、パパベリンが逃避失敗に及ぼ
す作用は認められなかった。この結果は、同化合物の条
件回避反応に及ぼす作用が運動失調の誘導によるもので
はないことを意味する。これとは対照的に、最大56 mg/
kgの用量のパパベリンでは、PDE10A-/-マウスにおける
条件回避反応の抑制は認められなかった。この実施例に
より、パパベリンの条件回避反応に及ぼす作用には、PD
E10Aとの相互作用がかかわっていることが示される。
【０１１６】
【発明の効果】本発明により、破壊されたホスホジエス
テラーゼ10A（PDE10A）遺伝子を含む、遺伝子改変され
た非ヒト哺乳動物および動物細胞が提供された。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Products Inc. <120> DISRUPTION OF THE PHOSPHODIESTERASE 10 GENE <130> PC23257A <150> US 60/343,479 <151> 2002-12-21 <160> 8 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> primer <400> 1 gcaggatctc ctgtcatctc acc 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> primer <400> 2 gatgctcttc gtccagatca tcc 23 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> primer <400> 3 ggctgctgca acatgagtgt cc 22 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> primer <400> 4 actgaggtgt ttactgtctg ttcc 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> primer <400> 5 ggaccacagg ggcttcagta acag 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> primer <400> 6 tgcccagctt cttcatctca tcac 24 <210> 7 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> primer <400> 7 tggatcctat aaatatggaa aattatatgg tttgacggat gaaaagg 47 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> primer <400> 8 attatgtcga cgtcttcaac cttcacgttc ag 32
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、PDE10A（PDE10）遺伝子ターゲティン
グベクター、内因性のマウスPDE10A遺伝子内におけるベ
クターの相同組換えの位置、および遺伝子ターゲティン
グの検証に用いるサザンブロット法を示す略図である。
【図２】 図2は、ES細胞のサザン分析の結果を示す。
クローン#176は、内因性対立遺伝子のほかに標的対立遺
伝子を含む。
【図３】 図3は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に基づ
き、破壊されたPDE10A対立遺伝子によりヘテロ接合型
（+/-）のマウスおよびノックアウト（-/-）マウスの遺
伝子型を同定した結果を示す。
【図４】 図4は、PDE10AのN末端領域に対するモノクロ
ーナル抗体（24F3.F11）を用いたウェスタンブロットの
結果を示す。おおよその分子量を示すマーカーを右に示
す。レーン1は精製した組換え型のラットPDE10Aであ
り、分子量約89kDaの範囲に1本のバンドが認められる。
レーン2〜4は、PDE10Aが+/+、+/-、または-/-の各個体
に由来する10 μgの線条体抽出物である。線条体抽出物
の約66 kDaに認められるバンドはホスホジエステラーゼ
でも、PDE10Aに関連するものでもない。
【図５Ａ】 図5Aでは、Sf9細胞抽出物（対照）のホス
ホジエステラーゼ活性（ホスホジエステラーゼ触媒によ
るcAMP分解産物、[３Ｈ]５’−ＡＭＰの蓄積における上
昇（dpm/ウェル）をX軸で示す）、完全長のPDE10A（PDE
10）をコードするcDNAをトランスフェクトしたSf9細胞
抽出物のホスホジエステラーゼ活性、またはPDE10ノッ
クアウトマウスの脳から単離されたPDE10A cDNAをトラ
ンスフェクトしたSf9細胞のホスホジエステラーゼ活性
の関係を確認することができる。PDE10Aをトランスフェ
クトした細胞からの抽出物濃度が、未トランスフェクト
細胞または変異型PDE10Aトランスフェクト細胞の濃度と
比べて100分の１であることに注意されたい。
【図５Ｂ】 図5Bは、PDE10A +/+、+/-、または-/-の各
マウスの線条体（黒いバー）、または皮質（灰色のバ
ー）に由来する等量の免疫沈殿の相対的なホスホジエス
テラーゼ活性（ホスホジエステラーゼの触媒によるcAMP
の分解産物[３Ｈ]５’−ＡＭＰの蓄積における上昇（dp
m/ウェル）をX軸で示す）を示す。各バーは2匹の個体で
得られた値の平均を示す。
【図６】 図6は、32 mg/kgのパパベリン（papaverin
e）（黒いバー）または溶媒（灰色のバー）を投与したP
DE10A +/+マウスまたはPDE10A -/-マウスの線条体
（左）または皮質（右）の抽出物に含まれるcGMP量を示
す。各バーは5匹の個体で得られた平均±SEMを示す。
【図７】 図7は、指定用量のパパベリンを投与したPDE
10A +/+マウス（黒いバー）または-/-マウス（灰色のバ
ー）でみられた回避反応の平均数を示す。各バーは、そ
れぞれ所定用量を日を変えて投与した4匹の個体から得
られた平均±SEMを示す。**印は、溶媒を投与したとき
に得られた値（パパベリン0）に対して統計学的に有意
であることを意味する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｎ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/48 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ｂ (72)発明者 クリストファー ジョセフ シュミッド アメリカ合衆国 06340 コネチカット州 グロトン市 イースタン・ポイント・ロ ード （番地なし） ファイザー・グロー バル・リサーチ・アンド・デベロップメン ト内 (72)発明者 ジェフリー リン ストック アメリカ合衆国 06340 コネチカット州 グロトン市 イースタン・ポイント・ロ ード （番地なし） ファイザー・グロー バル・リサーチ・アンド・デベロップメン ト内 (72)発明者 クリスティーン アン ストリック アメリカ合衆国 06340 コネチカット州 グロトン市 イースタン・ポイント・ロ ード （番地なし） ファイザー・グロー バル・リサーチ・アンド・デベロップメン ト内 Ｆターム(参考） 2G045 AA29 BB01 BB10 BB20 BB50 BB51 CB01 DA13 FB03 4B024 AA01 AA10 AA11 AA20 BA11 BA80 CA04 CA12 CA20 DA02 EA04 GA14 GA18 GA27 HA11 4B063 QA01 QA08 QA17 QQ02 QQ08 QQ21 QQ33 QQ41 QQ43 QQ53 QQ61 QQ79 QQ89 QR08 QR32 QR35 QR40 QR42 QR57 QR62 QR77 QR80 QS16 QS36 QX01 QX02 4B065 AA91X AA91Y AB01 AC20 BA02 BA03 BA16 BA24 CA43 CA44 CA46

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ホスホジエステラーゼ10A（PDE10A）遺
    伝子の破壊が改変によってもたらされる、遺伝子改変さ
    れた非ヒト哺乳動物。
  2. 【請求項２】 哺乳動物が齧歯類、好ましくはマウスで
    ある、請求項1記載の哺乳動物。
  3. 【請求項３】 破壊によって、触媒的に不活性な内因性
    PDE10Aタンパク質が生じる、請求項1記載の非ヒト哺乳
    動物。
  4. 【請求項４】 改変に、PDE10A遺伝子の破壊が含まれ
    る、遺伝子改変された動物細胞。
  5. 【請求項５】 細胞が胚幹（ES）細胞、またはES様細胞
    である、請求項4記載の動物細胞。
  6. 【請求項６】 細胞が、PDE10A遺伝子の破壊をもたらす
    改変を含む遺伝子改変された非ヒト哺乳動物から単離さ
    れる、請求項4記載の動物細胞。
  7. 【請求項７】 細胞が神経系の細胞である、請求項6記
    載の動物細胞。
  8. 【請求項８】 細胞がマウスまたはヒトの細胞である、
    請求項4記載の動物細胞。
  9. 【請求項９】 細胞内におけるPDE10Aポリペプチド量の
    減少をもたらす遺伝子改変を含む動物細胞の発現プロフ
    ィールを評価する段階、および該プロフィールを野生型
    細胞で得た発現プロフィールと比較する段階を含む、動
    物細胞でPDE10A活性が低下した結果として、改変された
    発現を示す遺伝子を同定する方法。
  10. 【請求項１０】 化合物がPDE10A作動物質または拮抗物
    質として有効であるか否かについて評価するスクリーニ
    ングアッセイ法であって、（a）化合物を、請求項1記載
    の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物に投与し、哺乳動物
    においてPDE10A活性を低下させる段階、および（b）化
    合物がPDE10A活性の作動物質または拮抗物質として有効
    であるか否かについて判定するために、化合物が段階
    （a）で哺乳動物に及ぼす作用を、化合物の非存在下でP
    DE10A活性が低下している遺伝子改変された哺乳動物
    と、またはPDE10A活性を有する哺乳動物と比較する段階
    を含む、スクリーニングアッセイ法。
  11. 【請求項１１】 アッセイ法が、一つまたは複数の自発
    運動、精神興奮反応、学習/記憶、行動修飾、または神
    経変性におけるPDE10A機能の評価に用いられる、請求項
    10記載のスクリーニングアッセイ法。
JP2002368547A 2001-12-21 2002-12-19 ホスホジエステラーゼ１０遺伝子の破壊 Pending JP2003265189A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34347801P 2001-12-21 2001-12-21
US60/343478 2001-12-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003265189A true JP2003265189A (ja) 2003-09-24

Family

ID=23346271

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2002368547A Pending JP2003265189A (ja) 2001-12-21 2002-12-19 ホスホジエステラーゼ１０遺伝子の破壊

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1321034A1 (ja)
JP (1) JP2003265189A (ja)
AU (1) AU2002353315A1 (ja)
WO (1) WO2003053139A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016129515A (ja) * 2005-10-18 2016-07-21 ナショナル ジューイッシュ ヘルスＮａｔｉｏｎａｌ Ｊｅｗｉｓｈ Ｈｅａｌｔｈ） 条件的に不死化された長期幹細胞ならびにそのような細胞を作製する方法および使用する方法。
US12250943B2 (en) 2019-04-08 2025-03-18 Htyr Acquisition Llc Compositions and methods for the cryopreservation of immune cells
US12370217B2 (en) 2019-05-14 2025-07-29 Htyr Acquisition Llc Compositions and methods for treating T cell exhaustion
US12496341B2 (en) 2008-08-28 2025-12-16 Htyr Acquisition Llc Methods for reducing anergy in lymphocytes using modulators of MYC

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004090126A2 (en) * 2003-04-03 2004-10-21 Memory Pharmaceuticals Corporation Phosphodiesterase 10a7 isoforms and methods of use

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2321224A1 (en) * 1998-02-23 1999-08-26 Icos Corporation Phosphodiesterase 10

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016129515A (ja) * 2005-10-18 2016-07-21 ナショナル ジューイッシュ ヘルスＮａｔｉｏｎａｌ Ｊｅｗｉｓｈ Ｈｅａｌｔｈ） 条件的に不死化された長期幹細胞ならびにそのような細胞を作製する方法および使用する方法。
US12496341B2 (en) 2008-08-28 2025-12-16 Htyr Acquisition Llc Methods for reducing anergy in lymphocytes using modulators of MYC
US12250943B2 (en) 2019-04-08 2025-03-18 Htyr Acquisition Llc Compositions and methods for the cryopreservation of immune cells
US12370217B2 (en) 2019-05-14 2025-07-29 Htyr Acquisition Llc Compositions and methods for treating T cell exhaustion

Also Published As

Publication number Publication date
EP1321034A1 (en) 2003-06-25
WO2003053139A1 (en) 2003-07-03
AU2002353315A1 (en) 2003-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2908697C (en) Targeted modification of rat genome
US6180849B1 (en) Trangenic mice with a disruption in the tiar gene
Pryzhkova et al. Adaptation of the AID system for stem cell and transgenic mouse research
EP1815245B1 (en) Prematurely ageing mouse models for the role of dna damage in ageing and intervention in ageing-related pathology
EP1321034A1 (en) Disruption of the phosphodieterase 10 gene
JP2002360119A (ja) Ｐｄｅ１１ａ活性のモジュレーション
US6927317B2 (en) Modulating ramp activity
US20030121069A1 (en) Disruption of the phosphodiesterase 10 gene
EP1319709A1 (en) Disruption of the glutathione S-transferase-omega-1 gene
US20030157076A1 (en) Disruption of the Akt2 gene
US20030051267A1 (en) Targeted disruption of kinase suppressor of RAS
US20050144659A1 (en) Animals and cells containing a mutated alpha2delta gene
US20030106085A1 (en) Disruption of the prostaglandin E synthase 2 gene
US20030188325A1 (en) Disruption of the REDK gene
US6410825B1 (en) A-myb null mutant transgenic mice
JP4030342B2 (ja) 遺伝子欠損細胞
Wong et al. Generation of adenylyl cyclase knockout mice
ZA200404167B (en) Disruption of the prostaglandin E synthase 2 gene.

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20050414

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20050711

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20050714

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20051014

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20051124