JP2004141013A - 糖尿病の発症危険性判定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】糖尿病、特に２型糖尿病の相対的な発症危険度を判定するための簡便な方法を提供すること。
【解決手段】ヒトゲノムＤＮＡを含む検体より、ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−３４６４２番目、同５’上流域の−２６３７６番目、同イントロン３の−３５０番目、同イントロン４の２７２１番目、同５’上流域の−２８２５６番目、同５’上流域の−２７９１５番目、同イントロン３の３２７０番目、同イントロン３の３８３２番目、同イントロン３の−１６８番目のヌクレオチド、およびＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチドに存在する、いずれか一つまたは二つ以上の遺伝子多型、および／またはその組合せからなるハプロタイプを検出することにより、糖尿病の発症危険度を判定する方法。
【選択図】　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖尿病の発症危険性判定方法に関する。より詳しくは、ヒトゲノムＤＮＡを含む試料から、糖尿病の発症に関連した新規遺伝子多型を検出することにより、該試料提供者が糖尿病を発症する潜在的な危険度を判定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は近年その患者数が増加しており、成人病のひとつとして注目されている。糖尿病には、インスリン依存型の１型糖尿病と非依存型の２型糖尿病があるが、このうち２型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病、ＮＩＤＤＭ）は日本人に多い糖尿病のタイプであり、早期発見、早期治療がその予後の点から重要である。
【０００３】
しかし、２型糖尿病はその成因が多様であり、予想される原因についての知見は乏しい。２型糖尿病におけるインスリン作用不足の原因としては、インスリン感受性機構の異常とインスリン分泌の低下が挙げられる。欧米では多くは前者、すなわちインスリン抵抗性が２型糖尿病の主な原因であるが、日本ではインスリン分泌不全が主な原因である場合も少なくない。
【０００４】
一方、糖尿病はその合併症として、網膜症、神経症、動脈硬化、あるいは、腎症などを発症する。特に、糖尿病患者が腎症を併発すると、腎障害が原因となって高血圧症や高脂血症を悪化させ、患者の予後を更に悪化させる。そのため、糖尿病合併症の中でも、腎症の予防や治療は特に重要な問題となる。
【０００５】
近年、分子生物学の急速な進展により、インスリン作用機作に関する知見が集積されてきた。インスリン受容体構造の解明にはじまり、受容体以降のシグナル伝達機構も次第に明らかとなってきた。こうしたなかで、従来の経口血糖低下薬とは作用メカニズムの全く異なる糖尿病治療薬〔α−グリコシダーゼ阻害薬：Ａｃａｒｂｏｓｅ，　Ｖｏｇｌｉｂｏｓｅ（例えば、非特許文献１〜６参照）、インスリン抵抗性改善薬：Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ，　Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ（例えば、非特許文献７〜１１参照）〕も登場し、発売された。一方、米国では１９９６年にビグアナイド剤が糖尿病治療薬として認可され、日常診療での糖尿病治療が可能となり注目を集めている（例えば、非特許文献１２および１３参照）。これらの薬剤はいずれも、日常診療で古くから汎用されてきたスルフォニル尿素（ＳＵ）剤とは異なり、膵β細胞からのインスリン分泌を促進することなく血糖を下げる作用を有している。
【０００６】
現在、インスリン抵抗性を改善する働きをもった糖尿病治療薬の作用メカニズムとしては、以下の９項目が考えられている。インスリン受容体キナーゼの活性化、糖輸送担体の細胞膜への移行促進、糖代謝の律速酵素の働きや糖代謝異常の是正、肝糖新生の抑制、肝による糖取り込み促進、肝グリコーゲン生成の亢進、血中脂質の低下、血中脂質の低下に伴う肝糖新生の減少、血中脂質の低下に伴うインスリン感受性の亢進である。
【０００７】
最近のファーマコジェノミクス研究の進展により、遺伝子多型と薬効、あるいは遺伝子多型と副作用の関係から、個々の患者に対する薬物の効果や副作用を、遺伝子診断で予測することが可能になりつつある。また、遺伝子多型と疾患との関係を調べることにより、一部の疾患の事前診断や予後の判定も可能になりつつある。前者の例としては、薬物代謝酵素の遺伝子多型の例が挙げられる。多型により活性が増加、あるいは、減少する薬物代謝酵素としては、シトクロムＰ４５０１Ａ２、シトクロムＰ４５０２Ａ６、シトクロムＰ４５０２Ｃ９、シトクロムＰ４５０２Ｃ１９，シトクロムＰ４５０２Ｄ６、シトクロムＰ４５０２Ｅ１などが知られている。また、チオプリンメチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルクウロノシルトランスフェラーゼ、および、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼなど抱合酵素と呼ばれる一群の酵素群にも遺伝子多型が存在し、多型により活性が減少することが報告されている（例えば、非特許文献１４参照）。後者の例としては、多型解析研究から見出された、疾患原因遺伝子が多数報告されている。例えば、▲１▼潰瘍性大腸炎の原因遺伝子としてのＨＬＡ、▲２▼慢性関節リウマチの原因遺伝子としてのＴＣＲα、▲３▼アルツアイマー病の原因遺伝子としてのＡＰＯＥ４、▲４▼精神分裂症の原因遺伝子としてのドーパミンＤ３受容体、▲５▼躁鬱病の原因遺伝子としてのトリプトファン水酸化酵素、▲６▼アルブミン尿症の原因遺伝子としてのアンジオテンシン前駆体、▲７▼心筋梗塞の原因遺伝子としての血液凝固因子ＶＩＩ、▲８▼肥満の原因遺伝子としてのレプチンなどが挙げられる（例えば、非特許文献１５参照）。
【０００８】
ＴＮＦ−αは、各種炎症性疾患の病態形成に関与する重要な物質であると考えられているが、最近、ＴＮＦ−α遺伝子の５’末端側上流域にこの遺伝子の発現を亢進する多型が存在することが見出された（例えば、非特許文献１６参照）。これらの多型は、ＴＮＦ−α遺伝子の発現量を亢進させるものであるため、多型を検出することにより、若年性関節リウマチ、慢性関節リウマチ、糖尿病等のＴＮＦ−αが関与する疾患の事前診断が可能となる（例えば、特許文献１参照）。
【０００９】
糖尿病に関しても、遺伝子の変異と糖尿病発症との関連が検討されている。現在までに明らかになっている、単独の異常によって糖尿病を発症するとされている遺伝子としては、インスリン、インスリン受容体、インスリンプロモーター因子、グルコキナーゼ、ヘパトサイトニュークレアーファクター、アミリン、骨格筋グリコーゲン合成酵素、およびミトコンドリア遺伝子などがある。また、２型糖尿病の発症に関与すると考えられる遺伝子として、インスリンレセプターサブストレイト、グルコーストランスポーター、ミトコンドリアグリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、脂肪酸結合タンパク質、アドレナリンレセプター、グルカゴンレセプター、カリウムチャンネル、ＣＤ３８などが挙げられる（例えば、非特許文献１７参照）。
【００１０】
また、最近、ＣＤ３８におけるＡｒｇ１４０Ｔｒｐ多型は、糖尿病のリスクを上昇させることが報告された（例えば、非特許文献１８参照）。この多型は、日本人の糖尿病患者に約１３％の頻度で見出されていることから、糖尿病の対するリスク診断に有用であると考えられている。
【００１１】
ところで、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（以下「ＧＦＡＴ」という）は、ヘキソサミン生合成経路において、律速段階であるフルクトース−６−リン酸からグルコサミン−６−リン酸への反応を触媒する重要な酵素である。ＧＦＡＴ活性を阻害する薬剤は細胞内へのグルコースの取り込みを促進し、血糖値を低下させることができると考えられており、そのため糖尿病治療薬としての開発が期待されている。このＧＦＡＴ阻害剤の作用機作は、以下のように説明される。ヘキソサミン生合成経路はその代謝過程において、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸等を産生するが、これらはタンパク質の糖化修飾やプロテオグリカンあるいはガングリオシド等の粗原料として流れていくと考えられている。一方、インスリンが細胞表面のレセプターに結合すると細胞内シグナルが活性化され、細胞内にプールされていた糖輸送担体（ＧＬＵＴ４など）が膜表層に移行し、グルコースの取り込みが促進される。取り込まれたグルコースは解糖系により代謝され、エネルギー源としてのＡＴＰを蓄積するが、過剰に取り込まれた場合はグルコース代謝物であるフルクトース−６−リン酸がヘキソサミン生合成経路へ流れることになる。流れたフルクトース−６−リン酸は、ＧＦＡＴによりグルコサミン−６−リン酸に変換される。詳細な機構は不明であるが、様々な状況証拠から、このグルコサミン−６−リン酸代謝産物が糖輸送担体の膜移行を抑制し、それによって細胞内へのグルコース取り込みが抑制されることが判明している（例えば、非特許文献１９〜２３参照）。これらのことから、ヘキソサミン生合成経路は、その一つの役割として、グルコースの過剰取り込みに対するフィードバック機構として機能するものと考えられる。そして、ＧＦＡＴはその経路における律速酵素として重要な役割を担う。
【００１２】
また、最近、ＧＦＡＴのアンチセンスヌクレオチドを過剰発現させたトランスジェニックマウスではＧＦＡＴの発現が構成的に抑制され、膵臓のβ細胞の選択的破壊薬であるストレプトゾトシンを投与すると、β細胞のアポトーシスが抑制されて、血糖値が改善されることが報告されている（例えば、非特許文献２４参照）。糖尿病患者においては、このＧＦＡＴ活性が一般的に高いことが知られており、高血糖値を示す一つの原因であると考えられる（例えば、非特許文献２５参照）。ヒト由来のＧＦＡＴは、現在ＧＦＡＴ１（例えば、非特許文献２６参照）とＧＦＡＴ２（例えば、特許文献２、および非特許文献２７参照）の２種が知られている。ＧＦＡＴ１は６８１アミノ酸から、ＧＦＡＴ２は６８２アミノ酸からなる、それぞれ７７ｋＤａのタンパク質であることが報告されているが、ＧＦＡＴ１遺伝子については、その全長配列は未だ解明されていない。また、ヒトＧＦＡＴ１と同ＧＦＡＴ２のアミノ酸配列相同性は７８％である。また、マウス由来（例えば、非特許文献２８参照）、酵母由来ＧＦＡＴ（例えば、非特許文献２９参照）、あるいは、大腸菌由来ＧＦＡＴ（例えば、非特許文献３０参照）も報告されているが、いずれもヒトＧＦＡＴに高い相同性を示す。
【００１３】
一方、ゲノム上ＧＦＡＴ１遺伝子の５’側に存在するＨＩＲＡインタラクティングプロテイン５（以下「ＨＩＲＩＰ５」という）遺伝子は、既知蛋白との相同性より、ヒストンに結合し鉄代謝に関与することが予想されているが（例えば、非特許文献３１参照）、その詳細な機能は全く不明である。また、このＨＩＲＩＰ５遺伝子、および前述したＧＦＡＴ１遺伝子上に存在する多型と糖尿病との関係については、これまで何ら知られていない。
【００１４】
糖尿病は、単一の遺伝子の変異や多型によって生じるというよりは、複数の遺伝子多型、あるいは、食生活などの外的要因で発症すると考えられており、その発症機構には未解明な点が多い。したがって、糖尿病の発症に関与する遺伝子やその多型については、今後さらにその研究を進めることが望まれている。
【００１５】
【特許文献１】
国際公開第９８／５４３６１号パンフレット
【特許文献２】
特開平１０−１０８６８３号公報
【非特許文献１】
ダイアビティース・フロンティア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｆｒｏｎｔｉｅｒ），　３，　５５７−５６４　（１９９２）
【非特許文献２】
ドラッグス（Ｄｒｕｇｓ），　４６，１０２５−１０５４　（１９９４）
【非特許文献３】
医学のあゆみ，　１４９，　５９１−６１８　（１９８９）
【非特許文献４】
臨床と研究，６７，　２１９−２３３　（１９９０）
【非特許文献５】
臨床と研究，　６９，　９１９−９３２　（１９９２）
【非特許文献６】
臨床医２１（増刊），　５７８−５８７（１９９５）
【非特許文献７】
ダイアビティース（Ｄｉａｂｅｔｅｓ），　３７，　１５４９−１５５８　（１９９８）
【非特許文献８】
ライフ・サイエンス（Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ．），　６７，　２４０５−２４１６　（２０００）
【非特許文献９】
メタボリズム（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ），　４４，　４８６−４９０　（１９９５）
【非特許文献１０】
ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．Ｍｅｄ．），　３３１，　１１８８−１１９３　（１９９４）
【非特許文献１１】
後藤由夫編，「新しい糖尿病治療薬」，　医薬ジャーナル社，　大阪，　（１９９４）
【非特許文献１２】
ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．），　３３３，　５４１−５４９　（１９９５）
【非特許文献１３】
ダイアビティース・スペクトラム（Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ），　８，　１９４　−１９７（１９９５）
【非特許文献１４】
中村祐輔編，「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」，　中山書店，　東京，　（２０００）
【非特許文献１５】
ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔ．　Ｇｅｎｅｔ．），　２２，　１３９−１４４　（１９９９）
【非特許文献１６】
ティシュー・アンチゲンズ（Ｔｉｓｓｕｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ），　５１，　６０５−６１２　（１９９８）
【非特許文献１７】
門脇孝編，「糖尿病の最前線」，　羊土社，　東京，　（１９９７）
【非特許文献１８】
ダイアベトロジア（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ），　４１，　１０２４−１０２８　（１９９８）
【非特許文献１９】
ファセブ・ジャーナル（ＦＡＳＥＢ　Ｊ．），５，　３０３１−３０３６　（１９９１）
【非特許文献２０】
ダイアビィトロジア（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ），　３８，　５１８−５２４　（１９９５）
【非特許文献２１】
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．），　２６６，１０１５５−１０１６１　（１９９１）
【非特許文献２２】
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．），２６６，　４７０６−４７１２　（１９９１）
【非特許文献２３】
エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ），　１３６，　２８０９−２８１６　（１９９５）
【非特許文献２４】
プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテット・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），　９７，　２８２０−２８２５　（２０００）
【非特許文献２５】
ダイアビティース（Ｄｉａｂｅｔｅｓ），　４５，　３０２−３０７　（１９９６）
【非特許文献２６】
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．），　２６７，２５２０８−２５２１２　（１９９２）
【非特許文献２７】
ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ），　５７，　２２７−２３４　（１９９９）
【非特許文献２８】
ジーン（Ｇｅｎｅ），　１４０，　２８９−２９０　（１９９４）
【非特許文献２９】
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．），２６４，　８７５３−８７５８　（１９８９）
【非特許文献３０】
バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．），　２２４，　７７９−８１５　（１９８４）
【非特許文献３１】
バイオケミカ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ），　１５１７，　３７６−３８３　（２００１）
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、糖尿病、特に２型糖尿病の発症の危険度を判定するための判定方法、および該方法のための試薬およびキットを提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、糖尿病患者および健常者から単離したＤＮＡ試料を対象として、ＨＩＲＩＰ５遺伝子、およびＧＦＡＴ１遺伝子中に存在する遺伝子多型の頻度を調べた結果、糖尿病患者に高い頻度で現れる複数の遺伝子多型が存在することを見出した。そして、該遺伝子多型を検出することにより、糖尿病を発症する潜在的な危険度を高い確率で判定できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（９）を提供する。
（１）　ヒトゲノムＤＮＡを含む試料において、下記ａ）〜ｊ）から選ばれるいずれか一つまたは二つ以上の位置に存在する遺伝子多型、および／またはその組合せからなるハプロタイプを検出することにより、該試料提供者の糖尿病の発症危険度を判定する方法。
ａ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−３４６４２番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号３５２）
ｂ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２６３７６番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２７８）
ｃ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−３５０番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３１１）
ｄ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン４の２７２１番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号２６２）
ｅ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２８２５６番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号２５８）
ｆ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２７９１５番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２９９）
ｇ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３２７０番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２８８）
ｈ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３８３２番目のヌクレオチド（配列番号８のヌクレオチド番号３１０）
ｉ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−１６８番目のヌクレオチド（配列番号９のヌクレオチド番号３１３）
ｊ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）
【００１９】
（２）　糖尿病が２型糖尿病である、上記（１）記載の方法。
【００２０】
（３）　検出対象が、下記ａ）〜ｄ）の位置に存在する遺伝子多型、ならびに下記ｗ）〜ｚ）で示されるハプロタイプ、から選ばれるいずれか一つまたは二つ以上である、上記（１）または（２）に記載の方法。
ａ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−３４６４２番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号３５２）
ｂ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２６３７６番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２７８）
ｃ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−３５０番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３１１）
ｄ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン４の２７２１番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号２６２）
ｗ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２８２５６番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号２５８）、およびＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２７９１５番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２９９）に存在する遺伝子多型を組合せたハプロタイプ
ｘ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列表の配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）、およびＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３２７０番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２８８）に存在する遺伝子多型を組合せたハプロタイプ
ｙ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列表の配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）、およびＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３８３２番目のヌクレオチド（配列番号８のヌクレオチド番号３１０）に存在する遺伝子多型を組合せたハプロタイプ
ｚ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列表の配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）、およびＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−１６８番目のヌクレオチド（配列番号９のヌクレオチド番号３１３）に存在する遺伝子多型を組合せたハプロタイプ
【００２１】
（４）　検出が、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＡＳＯハイブリダイゼーション、ダイレクトシークエンス法、ＡＲＭＳ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、ＲＮａｓｅＡ切断法、化学切断法、ＤＯＬ法、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法、インベーダー法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、モレキュラー・ビーコン法、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法、パドロック・プローブ法、ＵＣＡＮ法、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法、およびＥＣＡ法からなる群より選ばれる一つまたは二つ以上の方法を用いて行われることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
【００２２】
（５）　検出が、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法またはダイレクトシークエンス法を用いて行われることを特徴とする、上記（４）記載の方法。
【００２３】
（６）　下記ａ）〜ｊ）から選ばれるいずれか一つのポリヌクレオチド、またはその標識物；
ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号３５２のヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド
ｂ）配列番号２で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号２７８のヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド
ｃ）配列番号３で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号３１１のヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド
ｄ）配列番号４で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号２６２のヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド
ｅ）配列番号５で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号２５８のヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド
ｆ）配列番号６で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号２９９のヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド
ｇ）配列番号７で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号２８８のヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド
ｈ）配列番号８で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号３１０のヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド
ｉ）配列番号９で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号３１３のヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド
ｊ）配列番号１０で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号６３２のヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド
（ただし、上記ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）。
【００２４】
（７）　下記ａ）〜ｊ）から選ばれるいずれか一つのポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長のオリゴヌクレオチド、またはその標識物；
ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号３５２のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したポリヌクレオチド
ｂ）配列番号２で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号２７８のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したポリヌクレオチド
ｃ）配列番号３で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号３１１のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したポリヌクレオチド
ｄ）配列番号４で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号２６２のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したポリヌクレオチド
ｅ）配列番号５で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号２５８のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したポリヌクレオチド
ｆ）配列番号６で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号２９９のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したポリヌクレオチド
ｇ）配列番号７で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号２８８のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したポリヌクレオチド
ｈ）配列番号８で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号３１０のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したポリヌクレオチド
ｉ）配列番号９で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号３１３のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したポリヌクレオチド
ｊ）配列番号１０で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号６３２のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したポリヌクレオチド
（ただし、上記ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）。
【００２５】
（８）　上記（６）記載のポリヌクレオチドを固定した固相化試料。
【００２６】
（９）　以下の１）〜３）から選ばれる少なくとも一つ以上を含む、糖尿病の発症危険性判定用試薬またはキット。
１）上記（６）記載のポリヌクレオチド、またはその標識物
２）上記（７）記載のオリゴヌクレオチド、またはその標識物
３）上記（８）記載の固相化試料
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、ヒトゲノムＤＮＡを含む試料において、ＨＩＲＩＰ５遺伝子および／またはＧＦＡＴ１遺伝子上に存在する新規遺伝子多型を検出することにより、該試料提供者の糖尿病の発症危険度を判定する方法である。
【００２８】
本明細書中において、「遺伝子多型」には、いわゆる単一ヌクレオチド多型（１塩基多型：ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）、および連続した複数ヌクレオチドにわたる多型、の両方を含むものとする。すなわち、ヒトの集団において、ある一個体のゲノム配列を基準として、他の１または複数の個体ゲノム中の特定部位に、１または複数ヌクレオチドの置換、欠失、挿入、転位、逆位等の変異が存在するとき、その変異が当該１または複数の個体に生じた突然変異でないことが統計的に確実か、または当該個体内突然変異でなく、１％以上の頻度で集団内に存在することが家系的に証明される場合、その変異を「遺伝子多型」とする。
【００２９】
以下、本発明の方法について詳細に説明する。
１．糖尿病の発症に関連した新規遺伝子多型
本発明で検出対象とする遺伝子多型は、糖尿病患者に高い頻度で現れることが確認された、ＨＩＲＩＰ５遺伝子またはＧＦＡＴ１遺伝子上に存在する新規遺伝子多型である。
【００３０】
なお、本明細書中において、ＨＩＲＩＰ５遺伝子における多型の位置は、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている　▲１▼ＨＩＲＩＰ５のｃＤＮＡ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１５７００．１）、▲２▼ＨＩＲＩＰ５のゲノムＤＮＡ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＡＣ１１４７７２．３）を基に記載するものとする。すなわち、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０１５７００．１におけるＨＩＲＩＰ５遺伝子のオープン・リーディング・フレームの位置は２５９〜８４９番目の塩基となっていることから、ＮＭ＿０１５７００．１における２５９番目の位置（ＨＩＲＩＰ５遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧのＡに相当）をＨＩＲＩＰ５遺伝子のエキソン１の＋１として、各多型の位置を記載する。ちなみに、現在のところ、ＨＩＲＩＰ５蛋白のＮ末端アミノ酸配列に関する報告はないため、ＨＩＲＩＰ５遺伝子の翻訳開始コドンの正確な位置は確定していない（例えば、上記の翻訳開始コドンＡＴＧの位置は、ローランらの報告［Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　１５１７，　３７６−３８３　（２００１）］におけるＡＴＧの位置とは異なっている）。そこで、本明細書中においては上記の定義「ＮＭ＿０１５７００．１における２５９番目の位置をＨＩＲＩＰ５遺伝子のエキソン１の＋１とする」をすることにより、ＨＩＲＩＰ５遺伝子上における各多型の位置を特定することとした。
【００３１】
すなわち、本発明にかかる遺伝子多型は、以下のａ）〜ｊ）の位置に存在する。
ａ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−３４６４２番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号３５２）
ｂ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２６３７６番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２７８）
ｃ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−３５０番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３１１）
ｄ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン４の２７２１番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号２６２）
ｅ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２８２５６番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号２５８）
ｆ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２７９１５番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２９９）
ｇ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３２７０番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２８８）
ｈ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３８３２番目のヌクレオチド（配列番号８のヌクレオチド番号３１０）
ｉ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−１６８番目のヌクレオチド（配列番号９のヌクレオチド番号３１３）
ｊ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）
【００３２】
本発明の方法においては、上記ａ）〜ｊ）から選ばれるいずれか一つまたは二つ以上の位置に存在する、遺伝子多型および／またはその組合せからなるハプロタイプを検出して、糖尿病の発症危険度を判定する。すなわち、判定は一つまたは二つ以上の遺伝子多型の検出結果に基づいて行っても良いし、二つ以上の遺伝子多型を組合せたハプロタイプの検出結果に基づいて行ってもよい。また、上記多型とハプロタイプを組み合わせて判定してもよい。
【００３３】
２．ヒトゲノムＤＮＡを含む試料の調製
本発明の方法で用いられる「ヒトゲノムＤＮＡを含む試料」は、被験者および臨床検体等から単離されたあらゆる細胞（生殖細胞を除く）、組織、臓器等を材料として調製される。該材料としては、末梢血から分離した白血球または単核球が好ましく、特に白血球が最も好適である。これらの材料は、臨床検査において通常用いられる方法にしたがって単離される。
【００３４】
例えば白血球を材料とする場合、まず被験者より単離した末梢血から常法に従って白血球を分離する。次いで、得られた白血球にプロテイナーゼＫとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えてタンパク質を分解、変性させた後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことによりゲノムＤＮＡ（ＲＮＡを含む）を得る。ＲＮＡは、必要に応じてＲＮａｓｅにより除去することができる。ただし、ゲノムＤＮＡの抽出は、上記の方法に限定されず、当該技術分野で周知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）：”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（２ｎｄ　Ｅｄ．）”　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ＮＹ）や、市販のＤＮＡ抽出キット等を利用して行ってもよい。
【００３５】
３．遺伝子多型の検出
次に、得られたヒトゲノムＤＮＡを含む試料から、本発明者らによって解明された、糖尿病と極めて関連の深い新規遺伝子多型を検出する。以下、代表的な遺伝子多型検出方法について説明する。
【００３６】
（１）ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法
遺伝子多型部位が制限酵素認識部位に含まれる場合、その制限酵素の消化により生じるＤＮＡ断片の長さの違いから、当該遺伝子多型の検出が可能である。この場合、▲１▼ゲノムＤＮＡを制限酵素で分解後、サザンブロットを行なう方法と、▲２▼多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅後、制限酵素で切断し、電気泳動により切断されたＤＮＡ断片の大きさを解析する方法が挙げられる。▲１▼の方法で用いられるプローブとしては、目的の多型部位を含んで、かつその多型部位から５’末端側および３’末端側にそれぞれ約０．０５〜２ｋｂにわたる配列に相当するＤＮＡ断片（アイソトープ、ビオチンあるいは蛍光色素等で標識されたもの）が好ましい。また、▲２▼の方法に用いられるＰＣＲプライマーとしては、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００３７】
（２）ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法は、遺伝子多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅後、熱変性し、電気泳動により、高次構造の異なる１本鎖ＤＮＡを分離する方法である〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　１６，２９６−２９７　（１９９４），　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　２１，　５１０−５１４　（１９９６）〕。遺伝子多型の有無により、１本鎖ＤＮＡの泳動距離が異なるため、そのパターンを解析することにより、多型のタイピングが可能である。タイピングの標準とするために、予め多型部位のヌクレオチド配列が確認されているヒトゲノム由来のＤＮＡ試料を、ＰＣＲの際の鋳型ＤＮＡとして、被検試料と同時に用いることが好ましい。ＰＣＲ増幅用プライマーとしては、５’末端を蛍光色素で標識した、多型部位を含む約５０〜５００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するための１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００３８】
（３）ＡＳＯ（Ａｌｌｅｌｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ハイブリダイゼーション法
ＡＳＯハイブリダイゼーション法は、遺伝子多型部位を含むＰＣＲ産物をナイロンフィルターなどの支持体にドットブロットし、それぞれの遺伝子多型に対応したプローブとのハイブリダイゼーション後、そのプローブのＴｍ値に準じた洗浄操作を行い、多型を検出（ミスマッチがあればハイブリッドが外れる）する方法である〔Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｉｍ．　Ａｃｔａ，　１８９，　１５３−１５７　（１９９０）〕。プローブとしては、通常１５〜２５ｍｅｒ程度の合成オリゴヌクレオチド（シグナルを得るにはラジオアイソトープ、ビオチンまたは蛍光色素による標識が必要）が用いられる。また、ＰＣＲプライマーとしては、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００３９】
（４）ダイレクトシークエンス法
ダイレクトシークエンス法は、遺伝子多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した後、増幅されたＤＮＡのヌクレオチド配列を直接ダイデオキシ法により解析する方法である〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　１１，　２４６−２４９　（１９９１）〕。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、好ましくは、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。また、シークエンスプライマーとしては、好ましくは、多型部位から５０〜３００ヌクレオチド程度５’末端側の位置に相当する１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを用いる。
【００４０】
（５）ＡＲＭＳ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｒｅｆｒａｃｔｉｎｇ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）法
ＰＣＲでは、鋳型ＤＮＡにプライマーがアニールした後、ＤＮＡポリメラーゼにより５’末端側から３’末端側に相補鎖ＤＮＡが合成される。プライマーの３’末端ヌクレオチドにミスマッチがあると、ＰＣＲの効率が低下し、電気泳動による検出が不可能になる。ＡＲＭＳ法は、その３’末端ヌクレオチドが検出しようとする変異ヌクレオチドに相補的になるように設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物の有無で遺伝子多型を検出する方法である〔Ｎｕｃ．　Ａｃｉｄｓ．　Ｒｅｓ．，　１９，　３５６１−３５６７　（１９９１），　Ｎｕｃ．　Ａｃｉｄｓ．　Ｒｅｓ．，　２０，４８３１−４８３７　（１９９２）〕。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、１つは３’末端に多型部位が位置するように設計された、好ましくは１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであり、もう１つは、好ましくは、多型部位から０．０５〜２ｋｂ程度離れた部分の１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。
【００４１】
（６）変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　Ｇｒａｄｉｅｎｔ　Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、以下「ＤＧＧＥ」という）法
ＤＧＧＥ法は、ＰＣＲ産物中の、ミスマッチを有するヘテロデュプレックスが、ホモデュプレックスよりも解離が容易であることを利用して遺伝子多型を検出する方法である〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｓ，　２７，　１０１６−１０１８　（１９９９）〕。ヘテロデュプレックスは、解離が進むにつれ、ゲル電気泳動における移動度が低下するので、使用するポリアクリルアミドゲル中に尿素およびホルムアミドの密度勾配を設定しておくと、ホモデュプレックスとの移動度の差がさらに強調され、ミスマッチを含む２本鎖ＤＮＡの存在、すなわち変異の存在が検出される。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは通常、多型部位を含む約０．０５〜０．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。
【００４２】
（７）ＲＮａｓｅＡ切断法
ＲＮａｓｅＡ（ＲＮＡ分解酵素）は、２本鎖ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡコンプレックスを分解せず、１本鎖のＲＮＡのみを分解する特性を有する。したがって、多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した後、アイソトープ標識したＲＮＡプローブを、変性して１本鎖にしたＰＣＲ産物とハイブリダイズさせ、ＲＮａｓｅＡ処理後、電気泳動により分離すれば、変異型とハイブリダイズしたＲＮＡプローブはミスマッチ部位で切断されるため、２本のバンドとして検出できる〔ＤＮＡ　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　１４，　８７−９４　（１９９５）〕。この方法で用いられるＲＮＡプローブとしては、多型部位を含む通常１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００４３】
（８）化学切断法
多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅後、２本鎖ＤＮＡのミスマッチ部位の「ｃ（シトシン）」に対してはヒドロキシルアミン、「ｔ（チミン）」に対してはオスミウムテトラオキシドで別個に修飾し、ピペリジン処理をすると、糖が切断される。標識プローブを用いて２本鎖を形成させ、上記処理を行った後、電気泳動し、プローブのサイズが短くなっていれば変異が検出されたことになる〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　２１，　２１６−２１８　（１９９６）〕。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは通常、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。
【００４４】
（９）ＤＯＬ（Ｄｙｅ−ｌａｂｅｌｅｄ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ）法
ＤＯＬ法は、遺伝子多型を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した後、蛍光標識された多型部位の直前の塩基まで含むダイプライマーと、それぞれのアレルに特異的な蛍光色素で標識されたダイターミネーターを耐熱性ＤＮＡリガーゼで連結させる方法である〔Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．，　８，　５４９−５５６　（１９９８）〕。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、通常多型部位を含む約０．０５〜２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。
【００４５】
（１０）ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法
ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法は、蛍光標識したアレル特異的オリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）とＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲを利用した方法である〔Ｇｅｎｅｔ．　Ａｎａｌ．，　１４，　１４３−１４９　（１９９９），　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　３４，　２９３３−２９３６　（１９９６）〕。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、通常多型部位を含む約０．０５〜２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。また、ＴａｑＭａｎプローブは、多型部位を含む１５〜３０塩基程度のオリゴヌクレオチドであり、５’末端は蛍光レポーター色素によって標識されており、３’末端はクエンチャー（消光物質）によって標識されている。このプローブを用いることにより、野生型と変異型のヌクレオチド変化の検出が可能である。
【００４６】
（１１）インベーダー法
インベーダー法では、２種類の非蛍光標識オリゴヌクレオチドと１種類の蛍光標識オリゴヌクレオチドが使用される。非蛍光標識オリゴヌクレオチドの一つは、その５’末端側に、検出しようとする多型部位の存在するゲノム配列（以下「鋳型」という）とは無関係な配列（以下「フラップ」という）を有しており、フラップより３’末端側は、鋳型の多型部位から５’末端側の配列に特異的な相補配列となっている（以下「アレルプローブ」という）。すなわちアレルプローブの鋳型に特異的な相補配列部分の５’末端は鋳型の多型部位に相当する。もう一つの非蛍光標識オリゴヌクレオチドは、鋳型の多型部位から３’末端側の配列に特異的な相補配列を有する（以下「インベーダープローブ」という）。インベーダープローブの３’末端も鋳型の多型部位に相当するが、鋳型の多型部位のヌクレオチドとは相補的でなくてもよい。蛍光標識オリゴヌクレオチド（以下「ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）プローブ」という）は、３’末端側部分がフラップと相補的な配列であり、５’末端側はパリンドローム配列になっているため自ら二本鎖を形成している。またＦＲＥＴプローブの５’末端近傍は蛍光色素で標識され、５’末端にはその蛍光を打ち消すクエンチャーが結合している。まず鋳型にアレルプローブとインベーダープローブをハイブリダイズさせると、アレルプローブと鋳型とが多型部位において相補的である場合は、その多型部位において、鋳型、アレルプローブの５’末端およびインベーダープローブの３’末端が特殊な構造を形成する。この構造を特異的に認識してエンドヌクレアーゼ活性を表す酵素（以下「クリベース」という）が、アレルプローブからフラップ部分を切り離す。遊離したフラップはＦＲＥＴプローブの３’末端側とハイブリダイズする。このとき、フラップとＦＲＥＴプローブとが、ＦＲＥＴプローブのクエンチャーが結合している５’末端の位置において、クリベースに特異的に認識される構造を形成するため、クエンチャーが結合している５’末端ヌクレオチドがクリベースによりＦＲＥＴプローブから切り離されて、ＦＲＥＴプローブに残った蛍光色素が蛍光を発する。一方、鋳型配列に変異が存在し、アレルプローブと鋳型とが多型部位において相補的でなく、ミスマッチとなっている場合は、クリベースに特異的に認識される構造が形成されないため、フラップはアレルプローブから切り離されない。このとき、切り離されずにアレルプローブに残ったままのフラップもＦＲＥＴプローブの３’末端側とハイブリダイズ可能であるが、アレルプローブから切り離されたフラップがハイブリダイズした場合と比較すると、クエンチャーが結合している５’末端ヌクレオチドがクリベースによってＦＲＥＴプローブから切り離される反応効率が低いため、ＦＲＥＴプローブが発する蛍光強度も低い。以上の原理により、多型の検出が可能となる〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，　５１０９，　７７８−７８３（１９９３），　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　３０，　２１３８７−２１３９４　（１９９９），　Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　１７，　２９２−２９６　（１９９９）〕。
【００４７】
（１２）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Ｍａｔｒｉｘ　Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｌａｓｅｒ　Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ　ｏｆ
Ｆｌｉｇｈｔ／Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）法
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法は、遺伝子多型のアレルに対応して異なるヌクレオチドを含む１本鎖オリゴヌクレオチドを合成してその質量を測定し、その差異を質量分析器により検出することによりタイピングする方法である〔Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．，　７，　３７８−３８８　（１９９７），　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　Ｃｌｉｎ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　３５，　５４５−５４８　（１９９７）〕。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法では、はじめに多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、その後、多型部位に隣接するプライマーを用いた伸張反応により、それぞれのアレルに特異的なＤＮＡ伸張反応物をマススペクトルに基づき解析する。このときに用いられＰＣＲプライマーは、通常多型部位を含む約０．０５〜０．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。また、多型を検出するためのプライマーは、多型部位に隣接した１５から３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを用いる。
【００４８】
（１３）ＴＤＩ（Ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）法
ＴＤＩ法は、遺伝子多型を含むＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅させた後、多型部位の直前に設計されたプライマーを用いて、プライマー伸張反応により、それぞれのアレルに対応する異なる蛍光色素で標識されたダイデオキシヌクレオチドを多型部位に取りこませる方法である〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９４，　１０７５６−１０７６１　（１９９７）〕。プライマー伸張産物は、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩプリズム３７７、アプライドバイオシステムズ社製）などを用いて解析する。このときに用いられるＰＣＲプライマーは、通常多型部位を含む約０．０５〜１ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。
【００４９】
（１４）モレキュラー・ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｅａｃｏｎｓ）法
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｅａｃｏｎｓは両末端に発光抑制体（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）と蛍光体（Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）を持ったオリゴヌクレオチドである。通常はステム部分が５−７ヌクレオチドでループ構造が１５−３０ヌクレオチドのステムループ構造である。したがって蛍光体は発光抑制体の働きにより、励起光照射下でも発光しない。一方、ループ構造内の塩基配列と相同なターゲットのＤＮＡとループ構造内の塩基配列がハイブリダイズすると、発光抑制体と蛍光体の距離が離れるために蛍光体が励起光下で励起し蛍光を発する〔Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１，　ｐ４９−５３　（１９９８）、遺伝子医学、４，ｐ４６−４８（２０００）〕。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｅａｃｏｎのステム部分の塩基配列は、ターゲットＤＮＡとは相補的でない。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｅａｃｏｎｓのステム構造のＴｍ値（溶解温度：ｍｅｌｔｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）は、ターゲットＤＮＡとＰＣＲプライマーのＴｍ値より、７−１０℃高くなるように設計する。そして、ターゲット領域をＰＣＲで増幅させるときにＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｅａｃｏｎｓを反応液にいれて、ＰＣＲのアニーリング温度で励起光を当て蛍光を測定するとＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｅａｃｏｎｓがターゲット遺伝子に完全に相同な配列であればＨｙｂｒｉｄｉｚｅするため蛍光を発する。逆にミスマッチがあれば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｅａｃｏｎｓはターゲットにハイブリダイズできず蛍光を発することができない。この方法により遺伝子多型を見つけることができる。
【００５０】
（１５）ダイナミック・アレル−スペシフィック・ハイブリダイゼーション法（Ｄｙｎａｍｉｃ　Ａｌｌｅｌｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　（ＤＡＳＨ）法
ターゲットＤＮＡ（６０−９０塩基対）をゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅する際に、末端をビオチン化したプライマーを用いて行う方法である〔Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１，　ｐ８７−８８，　（１９９９）、遺伝子医学，　４，　ｐ４７−４８　（２０００）〕。ＰＣＲ終了後、ビオチン化したプライマー側のストランド（ｓｔｒａｎｄ）はストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）でコーティングされたマイクロタイターウェルに結合する。これに対して未修飾のＰｒｉｍｅｒ側のストランドは結合することができず、アルカリ溶液でリンスすると除去される。その後、このビオチン化したプライマーのストランドに対して、プローブＤＮＡ（１５−２１ヌクレオチド）をハイブリダイズさせる。この時に２本鎖ＤＮＡに特異的に結合し蛍光を発する蛍光物質（Ｓｙｂｅｒ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ　ｄｙｅ）を一緒に取込ませる。その後、この蛍光強度を観察しながら変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）させる。ターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡが完全に相補的でなくミスマッチが有ったときには完全に相補的である場合に比べ変性し発光しなくなる温度が低くなる。この温度の違いを観察することにより、遺伝子多型を検出することができる。
【００５１】
（１６）パドロック・プローブ（Ｐａｄｌｏｃｋ　Ｐｒｏｂｅ）法
Ｌｉｚａｒｄｉらによって開発された方法である〔Ｎａｔ．　Ｇｅｎｅｔ．，　３，　ｐ２２５−２３２　（１９９８）、遺伝子医学，　４，　ｐ５０−５１　（２０００）〕。一本鎖ターゲットＤＮＡにハイブリダイズするとプローブが環状になるように設計したプローブを用い、ターゲットＤＮＡにハイブリダイズした後にＤＮＡリガーゼで結合させて完全な環状にしその後アルカリフォスファターゼ（Ｃａｌｆ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　（ＣＩＡＰ））の脱リン酸化酵素でリン酸基を除去する。末端にミスマッチがあり環状になれなかった場合リン酸基がなくなり環状化できなくなる。この環状ＤＮＡに対してプライマー（１）を設計し、ＤＮＡポリメラーゼで複製してレプリコン多量体を得る。このレプリコンに対してもプライマー（２）を設計し、この２種類のプライマーを一緒に混ぜてＤＮＡポリメラーゼで反応し、２本鎖ＤＮＡを増幅する。プライマー（１）はターゲットＤＮＡとは相補的でない部分に設計し、プライマー（２）は環状になったプローブ（Ｐａｄｌｏｃｋ　Ｐｒｏｂｅ）の末端部分（ターゲットＤＮＡと相補的な配列（３’末端に遺伝子多型を含む）に設計し、多型検出には３’末端の一塩基置換させたプライマーを用いる。環状化したプローブ（Ｐａｄｌｏｃｋ　Ｐｒｏｂｅ）に対してローリング・サイクル・反応（Ｒｏｌｌｉｎｇ　Ｃｉｒｃｌｅ−Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＲＣＲ）を改良したハイパーブランチド・ローリング−サークル増幅法（Ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ　Ｒｏｌｌｉｎｇ−Ｃｉｒｃｌｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　（ＨＲＣＡ））法を用いて増幅させた後に、Ｐａｄｌｏｃｋ　Ｐｒｏｂｅ内にある制限酵素認識サイトの制限酵素で処理し、電気泳動でバンドの有無を確認する。
【００５２】
（１７）ＵＣＡＮ法
ＵＣＡＮ法［タカラ酒造株式会社ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｋａｒａ．ｃｏ．ｊｐ）参照］は、ＲＮＡをＤＮＡが両側からはさんだ型のＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡプライマー（ＤＲＤプライマー）の３’末端のＤＮＡを化学変化させておき、ＤＮＡポリメラーゼによる鋳型ＤＮＡの複製が起こらないようにしておく。次に、一塩基変換が起こっている可能性のある塩基部分に、ＲＮＡ部分が結合するように設計したＤＲＤプライマーと鋳型ＤＮＡを対合させる。ＤＲＤプライマーと鋳型が完全にマッチしている場合のみＲＮａｓｅＨにより、対合したＤＲＤプライマーのＲＮＡ部分が切断される。この切断によって３’末端が新しく出現するのでＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進み、鋳型ＤＮＡが増幅される。一方、ＤＲＤプライマーと鋳型ＤＮＡがその場所でマッチしていない場合、つまりＳＮＰが存在するときは、ＲＮａｓｅＨがＤＲＤプライマーを切断しないので、ＤＮＡ増幅が起こらない。この遺伝子増幅の有無を検出することで遺伝子多型を検出することができる。
【００５３】
（１８）ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイ
ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイは多種類の多型部位を含むＤＮＡプローブをガラス基盤上に固定したもので、これに標識した核酸試料をハイブリダイゼーションして、蛍光シグナルによって多型の有無を検出する。一般にガラス基盤上にｃＤＮＡを乗せていくものをＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡをガラス基盤上で合成していくものをＤＮＡチップ（オリゴＤＮＡチップ）という。基盤上に固定（または合成）されるプローブは、オリゴＤＮＡアレイであれば、通常多型部位を含む２０ｍｅｒ程度のオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡマイクロアレイであれば、１００〜１５００ｍｅｒ程度の２本鎖ＤＮＡが用いられる。
【００５４】
（１９）ＥＣＡ法
ＥＣＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｒｒａｙ）法は、ＤＮＡの２本鎖に結合するインターカレーターの電気化学的性質を利用した遺伝子タイピング法である。すなわち、ゲノム上の多型を含む領域をＰＣＲ法により増幅し、基盤に固定化したそれぞれのアレルと相補するプローブとハイブリダイズ後にインターカレーターを作用させる。このとき、プローブに対して完全相補と不完全相補の場合で結合するインターカレーターの量が異なる。ＥＣＡ法で用いるインターカレーターは、電気化学的性質を有するフェロセンという物質を含有しているため、結合したインターカレーターの量に比例して電気的シグナルが異なる。ＥＣＡ法は、この違いを利用して遺伝子多型を検出する方法である〔Ａｎａｌ．　Ｃｈｅｍ．，　７２，　ｐ１３３４−１３４１，　２０００〕。
【００５５】
以上は代表的な多型検出方法であるが、これらに限定されず、他の公知の遺伝子多型検出方法を本発明の判定方法のために利用することができる。また、本発明の方法においては、これらの遺伝子多型検出方法を単独で用いても、二つ以上を組み合わせて用いてもよい。本発明の好適な実施形態の一つとして、後述する実施例では、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法またはダイレクトシークエンス法を用いた判定方法を示す。
【００５６】
４．糖尿病発症危険性判定用試薬、またはキット
本発明の判定方法では、糖尿病の発症に関連した遺伝子多型を検出するために、検出すべき遺伝子多型が存在する部位またはその近傍の配列を検出するためのプローブもしくは固相化試料、または該配列を特異的に増幅するためのプライマーが用いられる。これらのプローブ、プライマーおよび固相化試料は、本発明の判定方法を実施するための試薬、またはキットとして有用である。
【００５７】
すなわち、本発明は、ＨＩＲＩＰ５遺伝子またはＧＦＡＴ１遺伝子上の遺伝子多型を検出するためのプローブ、プライマーおよび固相化試料、ならびにこれらの少なくとも一つ以上を含む、糖尿病の発症危険性判定用試薬またはキットを提供する。
【００５８】
（１）プローブ
本発明の方法で用いられるプローブは、ＨＩＲＩＰ５遺伝子、またはＧＦＡＴ１遺伝子上の新規遺伝子多型を含む部位に特異的にハイブリダイズし、該多型部位を検出するためのポリヌクレオチドプローブである。
【００５９】
そのようなプローブは、ＨＩＲＩＰ５遺伝子（例えば、配列番号１〜９で示されるヌクレオチド配列）、あるいはＧＦＡＴ１遺伝子（例えば、配列番号１０で示されるヌクレオチド配列）上において、下記ａ）〜ｊ）から選ばれるいずれか一つのヌクレオチドを含む、１６〜５００塩基長、好ましくは２０〜２００塩基長、より好ましくは２０〜５０塩基長の連続したポリヌクレオチドとして設計される。
ａ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−３４６４２番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号３５２）
ｂ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２６３７６番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２７８）
ｃ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−３５０番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３１１）
ｄ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン４の２７２１番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号２６２）
ｅ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２８２５６番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号２５８）
ｆ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２７９１５番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２９９）
ｇ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３２７０番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２８８）
ｈ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３８３２番目のヌクレオチド（配列番号８のヌクレオチド番号３１０）
ｉ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−１６８番目のヌクレオチド（配列番号９のヌクレオチド番号３１３）
ｊ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）
【００６０】
（２）プライマー
本発明の方法で用いられるプライマーは、ＨＩＲＩＰ５遺伝子、またはＧＦＡＴ１遺伝子上の新規遺伝子多型を含む部位を特異的に増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００６１】
そのようなプライマーは、ＨＩＲＩＰ５遺伝子（例えば、配列番号１〜９で示されるヌクレオチド配列）、またはＧＦＡＴ１遺伝子（例えば、配列番号１０で示されるヌクレオチド配列）上において、前項ａ）〜ｊ）から選ばれるいずれか一つのヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を含む連続したポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長、好ましくは１８〜２５塩基長程度のオリゴヌクレオチドとして設計される。
【００６２】
増幅するポリヌクレオチドの長さは、用いられる検出方法に応じて適宜設定されるが、一般的には１６〜１０００塩基長、好ましくは２０〜５００塩基長、より好ましくは２０〜２００塩基長である。
【００６３】
以上のことから、多型部位近傍の配列（例えば、配列番号１〜１０のいずれか一つで示されるヌクレオチド配列）に含まれる、１５塩基以上の連続したヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（あるいはオリゴヌクレオチド）は、上記プライマーまたはプローブとして利用することができる。
【００６４】
本発明のプライマーまたはプローブには、その配列の末端に、検出のための適当な標識、例えば、蛍光色素、酵素、タンパク、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等が付加されたものも含むものとする。
【００６５】
なお、本発明において用いられる蛍光色素としては、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の定量、検出等に用いられるものが好適に使用でき、例えば、ＨＥＸ（４，７，２’，４’，５’，７’−ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏ−６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＮＥＤ（アプライドバイオシステムズ社商品名、黄色蛍光色素）、あるいは、６−ＦＡＭ（アプライドバイオシステムズ社商品名、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎ）またはその誘導体（例えば、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ））等を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用できる〔Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　１４，　ｐ３０３−３０８　（１９９６）〕参照」。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製　オリゴヌクレオチドＥＣＬ　３’−オリゴラベリングシステム等）。
【００６６】
また、本発明のプライマーには、その末端に多型検出のためのリンカー配列が付加されたものも含むものとする。このようなリンカー配列としては、例えば、前述したインベーダー法で用いられるオリゴヌクレオチド５’末端に付加される、フラップ（多型近傍の配列とは全く無関係な配列）等が挙げられる。
【００６７】
なお、本明細書中において、「ポリヌクレオチド」は核酸と同義であって、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むものとする。また、２本鎖であっても１本鎖であってもよく、したがって、ある配列を有するポリヌクレオチドには、これに相補的な配列を有するポリヌクレオチドも常に包含される（オリゴヌクレオチドも同様）。さらに、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表に示される塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする。
【００６８】
本発明の１つの実施形態である、ＳＳＣＰ法およびダイレクトシークエンス法を用いた検出について、上記プライマーの好適な例を以下に示す。
【００６９】
ｉ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−３４６４２番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号３５２）の遺伝子多型検出用：
センス鎖プライマーとしては、好適には配列番号１のヌクレオチド番号１から３５１に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号１５２から３５１に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列を選択する。例えば、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００７０】
アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列番号１のヌクレオチド番号３５３から７２０に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号３５３から５５２に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列のアンチセンス配列を選択する。例えば、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００７１】
ｉｉ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２６３７６番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２７８）の遺伝子多型検出用：
センス鎖プライマーとしては、好適には配列番号２のヌクレオチド番号１から２７７に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号７８から２７７に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列を選択する。例えば、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００７２】
アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列番号２のヌクレオチド番号２７９から６６０に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号２７９から４７８に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列のアンチセンス配列を選択する。例えば、配列番号１４に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００７３】
ｉｉｉ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−３５０番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３１１）の遺伝子多型検出用：
センス鎖プライマーとしては、好適には配列番号３のヌクレオチド番号１から３１０に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号１１１から３１０に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列を選択する。例えば、配列番号１５に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００７４】
アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列番号３のヌクレオチド番号３１２から７２０に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号３１２から５１１に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列のアンチセンス配列を選択する。例えば、配列番号１６に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００７５】
ｉｖ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン４の２７２１番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号２６２）の遺伝子多型検出用：
センス鎖プライマーとしては、好適には配列番号４のヌクレオチド番号１から２６１に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号６２から２６１に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列を選択する。例えば、配列番号１７に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００７６】
アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列番号４のヌクレオチド番号２６３から７２０に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号２６３から４６２に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列のアンチセンス配列を選択する。例えば、配列番号１８に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００７７】
ｖ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２８２５６番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号２５８）の遺伝子多型検出用：
センス鎖プライマーとしては、好適には配列番号５のヌクレオチド番号１から２５７に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号５８から２５７に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列を選択する。例えば、配列番号１９に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００７８】
アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列番号５のヌクレオチド番号２５９から７２０に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号２５９から４５８に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列のアンチセンス配列を選択する。例えば、配列番号２０に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００７９】
ｖｉ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２７９１５番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２９９）の遺伝子多型検出用：
センス鎖プライマーとしては、好適には配列番号６のヌクレオチド番号１から２９８に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号９９から２９８に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列を選択する。例えば、配列番号２１に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００８０】
アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列番号６のヌクレオチド番号３００から７２０に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号３００から４９９に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列のアンチセンス配列を選択する。例えば、配列番号２２に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００８１】
ｖｉｉ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３２７０番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２８８）の遺伝子多型検出用：
センス鎖プライマーとしては、好適には配列番号７のヌクレオチド番号１から２８７に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号８８から２８７に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列を選択する。例えば、配列番号２３に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００８２】
アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列番号７のヌクレオチド番号２８９から７２０に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号２８９から４８８に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列のアンチセンス配列を選択する。例えば、配列番号２４に示されるヌクレオチド配列。
【００８３】
ｖｉｉｉ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３８３２番目のヌクレオチド（配列番号８のヌクレオチド番号３１０）の遺伝子多型検出用：
センス鎖プライマーとしては、好適には配列番号８のヌクレオチド番号１から３０９に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号１１０から３０９に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列を選択する。例えば、配列番号２５に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００８４】
アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列番号８のヌクレオチド番号３１１から７２０に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号３１１から５１０に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列のアンチセンス配列を選択する。例えば、配列番号２６に示されるヌクレオチド配列。
【００８５】
ｉｘ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−１６８番目のヌクレオチド（配列番号９のヌクレオチド番号３１３）の遺伝子多型検出用：
センス鎖プライマーとしては、好適には配列番号９のヌクレオチド番号１から３１２に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号１１３から３１２に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列を選択する。例えば、配列番号２７に示されるヌクレオチド配列が挙げられる。
【００８６】
アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列番号９のヌクレオチド番号３１４から７２０に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号３１４から５１３に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチド以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列のアンチセンス配列を選択する。例えば、配列番号２８に示されるヌクレオチド配列。
【００８７】
ｘ）ＧＦＡＴ１遺伝子のイントロン１の３６番目のヌクレオチド（配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）の遺伝子多型検出用：
センス鎖プライマーとしては、好適には配列表の配列番号１０のヌクレオチド番号１３２から６３１に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号４３２から６３１に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチドまたはそれ以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列、最も好ましくは、配列表の配列番号２９に示されるヌクレオチド配列；
アンチセンス鎖プライマーとしては、好適には配列表の配列番号１０のヌクレオチド番号６３３から７８２に示されるヌクレオチド配列中、より好適には同ヌクレオチド番号６３３から６８２に示されるヌクレオチド配列中の、１５ヌクレオチドまたはそれ以上（好ましくは１５〜３０ヌクレオチド）の連続したヌクレオチド配列のアンチセンス配列、最も好ましくは、配列表の配列番号３０に示されるヌクレオチド配列。
【００８８】
上記プライマーまたはプローブとして用いられ得るポリヌクレオチドは、当該技術分野で周知の方法に基づき化学合成することにより得ることができる。これらのプローブまたはプライマーとして用いられるポリヌクレオチドは、糖尿病発症危険性判定用試薬として利用できる。
【００８９】
（３）固相化試料
本発明の固相化試料は、（１）記載のプローブとして用いられるポリヌクレオチドを、ガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリー等の固相に固定することにより作製される。固相への固定は、予め合成したポリヌクレオチドを固相上に乗せる方法であってもよいし、目的とするポリヌクレオチドを固相上で合成する方法であってもよい。固定方法は、例えばＤＮＡマイクロアレイであれば、市販のスポッター（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製等）を利用するなど、目的とする固相化試料に適した方法が、当該技術分野で周知である。このような固相化試料としては、例えば、遺伝子チップ、ｃＤＮＡマイクロアレイ、オリゴアレイ、メンブレンフィルター等を挙げることができる。
【００９０】
（４）キット
本発明のキットは、上記プローブまたはプライマーとして用いられ得るポリヌクレオチド、ならびに固相化試料から選ばれる少なくとも一つ以上を含む。本発明のキットは上記構成要素のほか、必要に応じて、ハイブリダイゼーション、プローブの標識、ラベル体の検出等、本発明の判定方法の実施に必要な他の試薬、器具等を適宜含んでいてもよい。
【００９１】
５．検出結果の解析と評価
糖尿病患者および健常人における、前記新規遺伝子多型検出の統計解析結果から、本発明の方法は高い確率で糖尿病を発症する潜在的危険度の判定が可能であることが判明している。
【００９２】
例えば、本発明の方法にしたがい、単離されたヒトゲノムＤＮＡを含む試料における遺伝子多型を調べた結果、下記のいずれか一つまたは二つ以上の条件に該当した被験者に対しては、糖尿病を発症する危険度が相対的に高いとの情報を提供することができる。
ａ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−３４６４２番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号３５２）がｃ（シトシン）である遺伝子を有する被験者
ｂ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２６３７６番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２７８）がｇ（グアニン）である遺伝子を有する被験者
ｃ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−３５０番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３１１）のｔ（チミン）の繰り返しが２回である遺伝子を有する被験者
ｄ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン４の２７２１番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号２６２）のｃ（シトシン）である遺伝子を有する被験者
【００９３】
また、二つ以上の遺伝子多型を組み合わせたハプロタイプを検出することによっても、糖尿病を発症する潜在的危険度の判定が可能である。たとえば、以下のｗ）〜ｚ）のハプロタイプの一つまたは二つ以上を検出することにより、被験者が糖尿病を発症する危険度を判定することができる。
【００９４】
ｗ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２８２５６番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号２５８）、およびＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２７９１５番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２９９）に存在する遺伝子多型を組合せたハプロタイプ
ｘ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列表の配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）、およびＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３２７０番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２８８）に存在する遺伝子多型を組合せたハプロタイプ
ｙ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列表の配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）、およびＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３８３２番目のヌクレオチド（配列番号８のヌクレオチド番号３１０）に存在する遺伝子多型を組合せたハプロタイプ
ｚ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列表の配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）、およびＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−１６８番目のヌクレオチド（配列番号９のヌクレオチド番号３１３）に存在する遺伝子多型を組合せたハプロタイプ
【００９５】
本発明によって、上記判定基準から糖尿病を発症する危険度が相対的に高いことが判明した被験者に対しては、その旨を告知し、予め糖尿病の発症を防ぐための対策を講じることができる。したがって、本発明は糖尿病を予防するための検査方法としてきわめて有用である。
【００９６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００９７】
実施例１：　末梢血からのゲノムＤＮＡの調製
日本人の健常人、および２型糖尿病患者の末梢血から白血球を分離した。この白血球より、自動ＤＮＡ抽出装置（ＮＡ−１０００：クラボウ社製）を用いて、各被験者のゲノムＤＮＡ試料を抽出した。得られたＤＮＡ試料について、２６０ｎｍの吸光度を測定し、各試料のＤＮＡ濃度を算出した。その後、滅菌蒸留水を用いてゲノムＤＮＡを５０ｎｇ／μｌに希釈し、ＰＣＲ用試料とした。
【００９８】
実施例２：　ＰＣＲ法による多型を含むＤＮＡ断片の増幅
実施例１で得られた各被験者のゲノムＤＮＡ試料を鋳型として、以下に記載する方法により、ＨＩＲＩＰ５遺伝子上の９箇所の多型部位、およびＧＦＡＴ１遺伝子上の１箇所の多型部位のうち、いずれか一つを含むＤＮＡ断片を増幅した。
【００９９】
なお、本実施例で用いた各ＰＣＲプライマーは、５’末端をＨＥＸ（４，７，２’，４’，５’，７’−ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏ−６−ｃａｒｂｏｘｙ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、緑色蛍光色素）、ＮＥＤ（アプライドバイオシステムズ社商品名、黄色蛍光色素）、あるいは、６−ＦＡＭ（アプライドバイオシステムズ社商品名、黄緑色蛍光色素）の蛍光色素で標識されたものをアプライドバイオシステムズ社に発注、購入した。
【０１００】
１）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−３４６４２番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号３５２）がｔ（チミン）であるかｃ（シトシン）であるかを検出するためのＰＣＲ：
以下のプライマーおよび反応条件でＰＣＲを行い、多型部位を含む０．１８ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲプライマー：
プライマーＮｏ．１：　５’−ＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’（配列番号１１）
プライマーＮｏ．２：　５’−ＣＧＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＡＴＧＣＡＣＴＡＣ−３’（配列番号１２）
（Ｎｏ．１、Ｎｏ．２ともに、ＦＡＭで５’末端を標識）
【０１０１】
【表１】

ＰＣＲ条件：９４℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃１分を３７サイクル
【０１０２】
２）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２６３７６番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２７８）がｇ（グアニン）であるか、ｃ（シトシン）であるかを検出するためのＰＣＲ：
以下のプライマーおよび反応条件でＰＣＲを行い、多型部位を含む０．１０ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲプライマー：
プライマーＮｏ．３：　５’−ＣＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＣＣＴ−３’（配列番号１３）、
プライマーＮｏ．４：　５’−ＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＡＴＣＴＧＧＧＣＴ−３’（配列番号１４）
（Ｎｏ．３、Ｎｏ．４ともに、ＨＥＸで５’末端を標識）
【０１０３】
【表２】

ＰＣＲ条件：９４℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃１分を３７サイクル
【０１０４】
３）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−３５０番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３１１）ｔ（チミン）の繰り返しが１回であるか２回であるかを検出するためのＰＣＲ：
以下のプライマーおよび反応条件でＰＣＲを行い、多型部位を含む０．１４ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲプライマー：
プライマーＮｏ．５：　５’−ＡＣＣＡＧＴＡＡＡＴＴＧＡＧＡＡＡＣＴＧＡ−３’（配列番号１５）
プライマーＮｏ．６：　５’−ＡＡＧＣＣＡＧＴＡＡＡＴＡＴＧＣＡＧＡＣ−３’（配列番号１６）
（Ｎｏ．５、Ｎｏ．６ともに、ＮＥＤで５’末端を標識）
【０１０５】
【表３】

ＰＣＲ条件：９４℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃１分を３７サイクル
【０１０６】
４）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン４の２７２１番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号２６２）がｃ（シトシン）であるか、ｔ（チミン）であるかを検出するためのＰＣＲ：
以下のプライマーおよび反応条件でＰＣＲを行い、多型部位を含む０．１５ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲプライマー：
プライマーＮｏ．７：　５’−ＡＣＡＣＣＡＴＴＧＣＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡ−３’（配列番号１７）、
プライマーＮｏ．８：　５’−ＴＴＡＣＣＡＴＴＴＡＣＴＧＴＴＴＣＣＴＡＴＴＴＴ−３’（配列番号１８）
（Ｎｏ．７、Ｎｏ．８ともに、ＨＥＸで５’末端を標識）
【０１０７】
【表４】

ＰＣＲ条件：９４℃３０秒、５３℃３０秒、７２℃１分を３７サイクル
【０１０８】
５）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２８２５６番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号２５８）がｇ（グアニン）であるか、ｃ（シトシン）であるかを検出するためのＰＣＲ：
以下のプライマーおよび反応条件でＰＣＲを行い、多型部位を含む０．１７ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲプライマー：
プライマーＮｏ．９：　５’−ＧＴＡＧＣＣＴＧＡＡＴＣＡＧＧＴＴＣＣＡ−３’（配列番号１９）
プライマーＮｏ．１０：　５’−ＡＣＣＣＴＧＴＡＧＡＡＧＡＣＡＣＧＡＧＴ−３’（配列番号２０）
（Ｎｏ．９、Ｎｏ．１０ともに、ＮＥＤで５’末端を標識）
【０１０９】
【表５】

ＰＣＲ条件：９４℃３０秒、５９℃３０秒、７２℃１分を３７サイクル
【０１１０】
６）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２７９１５番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２９９）がｔ（チミン）であるか、ｃ（シトシン）であるかを検出するためのＰＣＲ：
以下のプライマーおよび反応条件でＰＣＲを行い、多型部位を含む０．１６ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲプライマー：
プライマーＮｏ．１１：　５’−ＧＣＡＴＴＡＴＧＣＧＴＴＡＧＣＣＡＧＡＣ−３’（配列番号２１）
プライマーＮｏ．１２：　５’−ＧＧＡＧＣＧＡＧＡＴＡＣＡＣＴＧＧＡＡＡ−３’（配列番号２２）
（Ｎｏ．１１はＦＡＭで５’末端を標識、Ｎｏ．１２はＨＥＸで５’末端を標識）
【０１１１】
【表６】

ＰＣＲ条件：９４℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃１分を３７サイクル
【０１１２】
７）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３２７０番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２８８）がｇ（グアニン）であるか、ａ（アデニン）であるかを検出するためのＰＣＲ：
以下のプライマーおよび反応条件でＰＣＲを行い、多型部位を含む０．１９ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲプライマー：
プライマーＮｏ．１３：　５’−ＧＧＴＣＴＴＣＡＡＧＴＧＡＴＣＣＴＣＣＴ−３’（配列番号２３）
プライマーＮｏ．１４：　５’−ＧＣＴＣＡＣＡＣＡＡＴＣＴＧＣＴＧＣＣＴ−３’（配列番号２４）
（Ｎｏ．１３はＮＥＤで５’末端を標識、Ｎｏ．１４はＮＥＤで５’末端を標識）
【０１１３】
【表７】

ＰＣＲ条件：９４℃３０秒、６１℃３０秒、７２℃１分を３７サイクル
【０１１４】
８）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３８３２番目のヌクレオチド（配列番号８のヌクレオチド番号３１０）がｃ（シトシン）であるか、ｔ（チミン）であるかを検出するためのＰＣＲ：
以下のプライマーおよび反応条件でＰＣＲを行い、多型部位を含む０．２０ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲプライマー：
プライマーＮｏ．１５：　５’−ＧＴＧＧＴＴＡＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＣＴＴ−３’（配列番号２５）
プライマーＮｏ．１６：　５’−ＣＡＴＡＣＡＣＡＴＡＴＧＡＣＡＧＴＡＴＣＴ−３’（配列番号２６）
（Ｎｏ．１５はＦＡＭで５’末端を標識、Ｎｏ．１６はＦＡＭで５’末端を標識）
【０１１５】
【表８】

ＰＣＲ条件：９４℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃１分を３７サイクル
【０１１６】
９）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−１６８番目のヌクレオチド（配列番号９のヌクレオチド番号３１３）がｔ（チミン）であるか、ａ（アデニン）であるかを検出するためのＰＣＲ：
以下のプライマーおよび反応条件でＰＣＲを行い、多型部位を含む０．２２ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲプライマー：
プライマーＮｏ．１７：　５’−ＣＣＴＡＡＣＡＴＣＡＴＴＡＧＣＡＴＡＴＣＡ−３’（配列番号２７）
プライマーＮｏ．１８：　５’−ＧＣＡＡＧＴＡＣＧＡＧＴＡＴＴＡＡＡＡＣＡ−３’（配列番号２８）
（Ｎｏ．１７はＦＡＭで５’末端を標識、Ｎｏ．１８はＦＡＭで５’末端を標識）
【０１１７】
【表９】

ＰＣＲ条件：９４℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃１分を３７サイクル
【０１１８】
１０）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目（配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）のヌクレオチドがｃ（シトシン）であるかｔ（チミン）であるかを検出するためのＰＣＲ：
以下のプライマーおよび反応条件でＰＣＲを行い、多型部位を含む０．１６ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲプライマー：
プライマーＮｏ．１９：　５’−ＣＡＣＣＧＡＡＧＣＴＣＧＴＧＴＧＴＧＣＡ−３’（配列番号２９）
プライマーＮｏ．２０：　５’−ＣＧＣＣＴＴＧＧＧＣＣＴＴＡＧＣＧＧＣＡ−３’（配列番号３０）
（Ｎｏ．１９はＨＥＸで５’末端を標識、Ｎｏ．２０はＨＥＸで５’末端を標識）
【０１１９】
【表１０】

ＰＣＲ条件：９４℃１分、５５℃１分、７２℃２分３０秒を４０サイクル
【０１２０】
実施例３：　ＨＩＲＩＰ５遺伝子、およびＧＦＡＴ１遺伝子の多型の検出
１）ＤＮＡシークエンサーによる解析
ＨＩＲＩＰ５遺伝子、およびＧＦＡＴ１遺伝子の各多型部位を同定するためのヌクレオチド配列の決定は、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７：アプライドバイオシステムズ社製）を用いて常法により行った。
【０１２１】
その結果、以下の位置に各多型が存在することが確認された。
ａ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−３４６４２番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号３５２）；
ｂ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２６３７６番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２７８）；
ｃ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−３５０番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３１１）；
ｄ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン４の２７２１番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号２６２）；
ｅ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２８２５６番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号２５８）；
ｆ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２７９１５番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２９９）；
ｇ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３２７０番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２８８）；
ｈ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３８３２番目のヌクレオチド（配列番号８のヌクレオチド番号３１０）；
ｉ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−１６８番目のヌクレオチド（配列番号９のヌクレオチド番号３１３）；
ｊ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目（配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）
【０１２２】
２）ＳＳＣＰ法
実施例２で得られた各ＰＣＲ産物を、ホルムアミド溶液：ローディングバッファー（０．０３ｇ／ｍｌのブルーデキストランを含む０．０５ＭのＥＤＴＡ水溶液）＝５：１の混合液に１／５量加え混合し、９５℃で２分間の熱変性後、氷冷して電気泳動用試料とした。この試料を非変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、アレルの相違に基づくＤＮＡ断片の移動度の違いにより多型を検出した。
【０１２３】
電気泳動のゲルは、１２％ポリアクリルアミドゲルにグリセロ―ルを５％添加したもの（ゲル厚さ０．２ｍｍ）を用いた。なお、測定条件の違いにより多型検出に変化がないことを確認するために、１０％ポリアクリルアミドにグルセロ―ルを５％添加したもの、および１２％ポリアクリルアミドゲルにグルセロ―ルを１０％添加したものの２条件で行った。
【０１２４】
電気泳動は、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７：アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、３０ワット定電力でＡフィルターを使用し、３〜１２時間通電することにより実施した。蛍光バンドはＤＮＡシークエンサーの検出機能を用いて検出した。電気泳動中は、ゲル板温度を保つため、冷却装置（ＲＴＥ−ＩＩＩ、ＮＥＳＬＡＢ社製）で２０℃に調節した水をゲル板外部に循環させるようにした。なお、各ＤＮＡ断片の遺伝子型は、前項１）において多型部位のヌクレオチド配列を決定したＤＮＡ断片をポジティブコントロールとして判定した。
【０１２５】
実施例４：　ＨＩＲＩＰ５遺伝子およびＧＦＡＴ１遺伝子の多型と糖尿病との関連
ＨＩＲＩＰ５遺伝子と２型糖尿病との関連を関連解析法（アソシエーション法）により解析した。有意差検定にはχ２乗法を用いた。（フィッシャーら、バイオスタティスティクス（Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ社、１９９３年）。ハプロタイプ解析は、Ａｒｌｅｑｕｉｎプログラムを用いて行なった（Ｌａｕｒｅｎｔ　Ｅｘｃｏｆｆｉｅｒ　社製　統計解析ソフトウェア、ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｌｇｂ．ｕｎｉｇｅ．ｃｈ／ａｒｌｅｑｕｉｎ／）。有意差検定には、Ｆｉｓｈｅｒの直接確率計算法を拡張したｅｘａｃｔ　ｔｅｓｔ　ｏｆ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（ＰＤ検定）を用いた（「基礎医学統計学　改定第４版」、加納克己、高橋秀人共著、南江堂、１９９５年）。有意水準は危険率５％とし、危険率５％未満のものを有意差ありと判定した。
【０１２６】
１）２型糖尿病とＨＩＲＩＰ５遺伝子５’上流域の−３４６４２番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号３５２）との関係
日本人の健常人１９０名、日本人の２型糖尿病患者３９３名について、ＨＩＲＩＰ５遺伝子５’上流域の−３４６４２番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号３５２）におけるアレル頻度を算出し、アソシエーション法により２型糖尿病との関連を解析した。結果を表１１に示す。
【０１２７】
【表１１】

【０１２８】
表１１において、ＨＩＲＩＰ５遺伝子５’上流域の−３４６４２番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号３５２）部位がチミンの場合は「Ｔ」、あるいは、シトシンの場合は「Ｃ」として表されている。表１１の結果より、健常人と２型糖尿病患者との間において、ＨＩＲＩＰ５遺伝子５’上流域の−３４６４２番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号３５２）多型のアレル頻度が統計的に有意に異なることが示された。このことは、ＨＩＲＩＰ５遺伝子５’上流域の−３４６４２番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号３５２）の多型を調べることにより、糖尿病を発症する相対的危険度を判定できることを示すものである。
【０１２９】
２）２型糖尿病とＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２６３７６番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２７８）との関係
日本人の健常人１９１名、日本人の２型糖尿病患者３９０名について、２型糖尿病とＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２６３７６番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２７８）多型のアレル頻度を算出し、アソシエーション法により２型糖尿病との関連を解析した。結果を表１２に示す。
【０１３０】
【表１２】

【０１３１】
表１２において、ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２６３７６番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２７８）部位がグアニンの場合は「Ｇ」、あるいは、シトシンの場合は「Ｃ」として表されている。表１２の結果より、健常人と２型糖尿病患者との間において、ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２６３７６番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２７８）多型のアレル頻度および遺伝子型頻度が統計的に有意に異なることが示された。このことは、ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２６３７６番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２７８）の多型を調べることにより、糖尿病を発症する相対的危険度を判定できることを示すものである。
【０１３２】
３）２型糖尿病とＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−３５０番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３１１）との関係
日本人の健常人１９０名、日本人の２型糖尿病患者３９４名について、ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−３５０番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３１１）におけるアレル頻度を算出し、アソシエーション法により２型糖尿病との関連を解析した。結果を表１３に示す。
【０１３３】
【表１３】

【０１３４】
表１３において、ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−３５０番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３１１）におけるＴの繰り返しが１回の場合は、「Ｔ」、あるいは、２回の場合は「ＴＴ」として表されている。表１３の結果より、健常人と２型糖尿病患者との間において、ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−３５０番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３１１）多型のアレル頻度が統計的に有意に異なることが示された。このことは、ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−３５０番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３１１）の多型を調べることにより、糖尿病を発症する相対的危険度を判定できることを示すものである。
【０１３５】
４）２型糖尿病とＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン４の２７２１番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号２６２）の多型との関係
日本人の健常人１９１名、日本人の２型糖尿病患者３８８名について、２型糖尿病とＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン４の２７２１番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号２６２）多型のアレル頻度を算出し、アソシエーション法により２型糖尿病との関連を解析した。結果を表１４に示す。
【０１３６】
【表１４】

【０１３７】
表１４において、ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン４の２７２１番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号２６２）部位がシトシンの場合は「Ｃ」、あるいは、チミンの場合は「Ｔ」として表されている。表１４の結果より、健常人と２型糖尿病患者との間において、ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン４の２７２１番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号２６２）多型のアレル頻度が統計的に有意に異なることが示された。このことは、ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン４の２７２１番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号２６２）の多型を調べることにより、糖尿病を発症する相対的危険度を判定できることを示すものである。
【０１３８】
５）２型糖尿病とＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２８２５６番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号２５８）多型とＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２７９１５番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２９９）多型を組み合わせたハプロタイプとの関係
日本人の健常人１９１名、日本人の２型糖尿病患者３８６名について、ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２８２５６番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号２５８）多型とＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２７９１５番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２９９）多型を組み合わせたハプロタイプ頻度を算出し、ＰＤ検定により２型糖尿病との関連を解析した。結果を表１５に示す。
【０１３９】
【表１５】

【０１４０】
表１５において、ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２８２５６番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号２５８）がＧである遺伝子をホモで有する被験者は「Ｇ／Ｇ」、当該部位がＣ（シトシン）である遺伝子をホモで有する被験者は「Ｃ／Ｃ」、両遺伝子をヘテロで有する被験者は「Ｇ／Ｃ」として表されている。また、表１５において、ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２７９１５番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２９９）がＴである遺伝子をホモで有する被験者は「Ｔ／Ｔ」、当該部位がＣ（シトシン）である遺伝子をホモで有する被験者は「Ｃ／Ｃ」、両遺伝子をヘテロで有する被験者は「Ｔ／Ｃ」として表されている。表１５の結果より、健常人と２型糖尿病患者との比較において、それぞれのハプロタイプにおける頻度分布が有意に異なることが示された。このことは、ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２８２５６番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号２５８）多型とＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２７９１５番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２９９）多型を組み合わせたハプロタイプを調べることにより、糖尿病を発症する相対的危険度を判定できることを示すものである。
【０１４１】
６）２型糖尿病とＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３２７０番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２８８）多型とＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）多型を組み合わせたハプロタイプとの関係
日本人の健常人１８５名、日本人の２型糖尿病患者３５７名について、ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３２７０番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２８８）多型とＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）多型を組み合わせたハプロタイプ頻度を算出し、ＰＤ検定により２型糖尿病との関連を解析した。結果を表１６に示す。
【０１４２】
【表１６】

【０１４３】
表１６においてＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３２７０番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２８８）がＧである遺伝子をホモで有する被験者は「Ｇ／Ｇ」、当該部位がＡ（アデニン）である遺伝子をホモで有する被験者は「Ａ／Ａ」、両遺伝子をヘテロで有する被験者は「Ｇ／Ａ」として表されている。また、表１６において、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）がＴである遺伝子をホモで有する被験者は「Ｔ／Ｔ」、当該部位がＣ（シトシン）である遺伝子をホモで有する被験者は「Ｃ／Ｃ」、両遺伝子をヘテロで有する被験者は「Ｔ／Ｃ」として表されている。表１６の結果より、健常人と２型糖尿病患者との比較において、それぞれのハプロタイプにおける頻度分布が有意に異なることが示された。このことは、ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３２７０番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２８８）多型とＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）多型を組み合わせたハプロタイプを調べることにより、糖尿病を発症する相対的危険度を判定できることを示すものである。
【０１４４】
７）２型糖尿病とＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３８３２番目のヌクレオチド（配列番号８のヌクレオチド番号３１０）多型とＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）多型を組み合わせたハプロタイプとの関係
日本人の健常人１８５名、日本人の２型糖尿病患者３８２名について、ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３８３２番目のヌクレオチド（配列番号８のヌクレオチド番号３１０）多型とＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）多型を組み合わせたハプロタイプ頻度を算出し、ＰＤ検定により２型糖尿病との関連を解析した。結果を表１７に示す。
【０１４５】
【表１７】

【０１４６】
表１７においてＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３８３２番目のヌクレオチド（配列番号８のヌクレオチド番号３１０）がＣ（シトシン）である遺伝子をホモで有する被験者は「Ｃ／Ｃ」、当該部位がＴ（チミン）である遺伝子をホモで有する被験者は「Ｔ／Ｔ」、両遺伝子をヘテロで有する被験者は「Ｃ／Ｔ」として表されている。また、表１７において、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）がＴである遺伝子をホモで有する被験者は「Ｔ／Ｔ」、当該部位がＣ（シトシン）である遺伝子をホモで有する被験者は「Ｃ／Ｃ」、両遺伝子をヘテロで有する被験者は「Ｔ／Ｃ」として表されている。表１７の結果より、健常人と２型糖尿病患者との比較において、それぞれのハプロタイプにおける頻度分布が有意に異なることが示された。このことは、ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３８３２番目のヌクレオチド（配列番号８のヌクレオチド番号３１０）多型とＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）多型を組み合わせたハプロタイプを調べることにより、糖尿病を発症する相対的危険度を判定できることを示すものである。
【０１４７】
８）２型糖尿病とＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−１６８番目のヌクレオチド（配列番号９のヌクレオチド番号３１３）多型とＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）多型を組み合わせたハプロタイプとの関係
日本人の健常人１８６名、日本人の２型糖尿病患者３８５名について、ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−１６８番目のヌクレオチド（配列番号９のヌクレオチド番号３１３）多型とＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）多型を組み合わせたハプロタイプ頻度を算出し、アソシエーション法により２型糖尿病との関連を解析した。結果を表１８に示す。
【０１４８】
【表１８】

【０１４９】
表１８においてＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−１６８番目のヌクレオチド（配列番号９のヌクレオチド番号３１３）がＴ（チミン）である遺伝子をホモで有する被験者は「Ｔ／Ｔ」、当該部位がＡ（アデニン）である遺伝子をホモで有する被験者は「Ａ／Ａ」、両遺伝子をヘテロで有する被験者は「Ｔ／Ａ」として表されている。また、表１８において、ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）がＴである遺伝子をホモで有する被験者は「Ｔ／Ｔ」、当該部位がＣ（シトシン）である遺伝子をホモで有する被験者は「Ｃ／Ｃ」、両遺伝子をヘテロで有する被験者は「Ｔ／Ｃ」として表されている。表１８の結果より、健常人と２型糖尿病患者との比較において、それぞれのハプロタイプにおける頻度分布が有意に異なることが示された。このことは、ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−１６８番目のヌクレオチド（配列番号９のヌクレオチド番号３１３）多型とＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）多型を組み合わせたハプロタイプを調べることにより、糖尿病を発症する相対的危険度を判定できることを示すものである。
【０１５０】
【発明の効果】
本発明によれば、糖尿病、特に２型糖尿病の相対的危険度を簡便に判定することができる。すなわち、本発明は糖尿病の発症危険性判定方法と該方法のための材料を提供する。
【０１５１】
【配列表】

【０１５２】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１−変異の説明：（Ｔ）と（Ｃ）の置換による一塩基多型
配列番号２−変異の説明：（Ｃ）と（Ｇ）の置換による一塩基多型
配列番号３−変異の説明：（Ｔ）の一塩基挿入による多型
配列番号４−変異の説明：（Ｔ）と（Ｃ）の置換による一塩基多型
配列番号５−変異の説明：（Ｃ）と（Ｇ）の置換による一塩基多型
配列番号６−変異の説明：（Ｔ）と（Ｃ）の置換による一塩基多型
配列番号７−変異の説明：（Ａ）と（Ｇ）の置換による一塩基多型
配列番号８−変異の説明：（Ｃ）と（Ｔ）の置換による一塩基多型
配列番号９−変異の説明：（Ｔ）と（Ａ）の置換による一塩基多型
配列番号１０−変異の説明：（Ｔ）と（Ｃ）の置換による一塩基多型
配列番号１１〜３０−人工配列の説明：プライマー

Claims (9)

1. ヒトゲノムＤＮＡを含む試料において、下記ａ）〜ｊ）から選ばれるいずれか一つまたは二つ以上の位置に存在する遺伝子多型、および／またはその組合せからなるハプロタイプを検出することにより、該試料提供者の糖尿病の発症危険度を判定する方法。
   ａ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−３４６４２番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号３５２）
   ｂ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２６３７６番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２７８）
   ｃ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−３５０番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３１１）
   ｄ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン４の２７２１番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号２６２）
   ｅ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２８２５６番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号２５８）
   ｆ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２７９１５番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２９９）
   ｇ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３２７０番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２８８）
   ｈ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３８３２番目のヌクレオチド（配列番号８のヌクレオチド番号３１０）
   ｉ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−１６８番目のヌクレオチド（配列番号９のヌクレオチド番号３１３）
   ｊ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）
2. 糖尿病が２型糖尿病である、請求項１記載の方法。
3. 検出対象が、下記ａ）〜ｄ）の位置に存在する遺伝子多型、ならびに下記ｗ）〜ｚ）で示されるハプロタイプ、から選ばれるいずれか一つまたは二つ以上である、請求項１または２記載の方法。
   ａ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−３４６４２番目のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド番号３５２）
   ｂ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２６３７６番目のヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド番号２７８）
   ｃ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−３５０番目のヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド番号３１１）
   ｄ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン４の２７２１番目のヌクレオチド（配列番号４のヌクレオチド番号２６２）
   ｗ）ＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２８２５６番目のヌクレオチド（配列番号５のヌクレオチド番号２５８）、およびＨＩＲＩＰ５遺伝子の５’上流域の−２７９１５番目のヌクレオチド（配列番号６のヌクレオチド番号２９９）に存在する遺伝子多型を組合せたハプロタイプ
   ｘ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列表の配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）、およびＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３２７０番目のヌクレオチド（配列番号７のヌクレオチド番号２８８）に存在する遺伝子多型を組合せたハプロタイプ
   ｙ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列表の配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）、およびＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の３８３２番目のヌクレオチド（配列番号８のヌクレオチド番号３１０）に存在する遺伝子多型を組合せたハプロタイプ
   ｚ）ＧＦＡＴ１遺伝子の第１イントロンの３６番目のヌクレオチド（配列表の配列番号１０のヌクレオチド番号６３２）、およびＨＩＲＩＰ５遺伝子のイントロン３の−１６８番目のヌクレオチド（配列番号９のヌクレオチド番号３１３）に存在する遺伝子多型を組合せたハプロタイプ
4. 検出が、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＡＳＯハイブリダイゼーション、ダイレクトシークエンス法、ＡＲＭＳ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、ＲＮａｓｅＡ切断法、化学切断法、ＤＯＬ法、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法、インベーダー法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、モレキュラー・ビーコン法、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法、パドロック・プローブ法、ＵＣＡＮ法、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法、およびＥＣＡ法からなる群より選ばれる一つまたは二つ以上の方法を用いて行われることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 検出が、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法またはダイレクトシークエンス法を用いて行われることを特徴とする、請求項４記載の方法。
6. 下記ａ）〜ｊ）から選ばれるいずれか一つのポリヌクレオチド、またはその標識物；
   ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号３５２のヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド
   ｂ）配列番号２で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号２７８のヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド
   ｃ）配列番号３で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号３１１のヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド
   ｄ）配列番号４で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号２６２のヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド
   ｅ）配列番号５で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号２５８のヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド
   ｆ）配列番号６で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号２９９のヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド
   ｇ）配列番号７で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号２８８のヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド
   ｈ）配列番号８で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号３１０のヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド
   ｉ）配列番号９で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号３１３のヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド
   ｊ）配列番号１０で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号６３２のヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したポリヌクレオチド
   （ただし、上記ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）。
7. 下記ａ）〜ｊ）から選ばれるいずれか一つのポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長のオリゴヌクレオチド、またはその標識物；
   ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号３５２のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したポリヌクレオチド
   ｂ）配列番号２で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号２７８のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したポリヌクレオチド
   ｃ）配列番号３で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号３１１のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したポリヌクレオチド
   ｄ）配列番号４で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号２６２のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したポリヌクレオチド
   ｅ）配列番号５で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号２５８のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したポリヌクレオチド
   ｆ）配列番号６で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号２９９のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したポリヌクレオチド
   ｇ）配列番号７で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号２８８のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したポリヌクレオチド
   ｈ）配列番号８で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号３１０のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したポリヌクレオチド
   ｉ）配列番号９で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号３１３のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したポリヌクレオチド
   ｊ）配列番号１０で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号６３２のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したポリヌクレオチド
   （ただし、上記ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）。
8. 請求項６記載のポリヌクレオチドを固定した固相化試料。
9. 以下の１）〜３）から選ばれる少なくとも一つ以上を含む、糖尿病の発症危険性判定用試薬またはキット。
   １）請求項６記載のポリヌクレオチド、またはその標識物
   ２）請求項７記載のオリゴヌクレオチド、またはその標識物
   ３）請求項８記載の固相化試料