JP2004147501A - Ｄｎａの高感度検出法 - Google Patents

Abstract

【課題】検出しようとする核酸の鎖長に影響されない標識プローブを調製し、該標識プローブを用いた高感度検出方法を提供すること。
【解決手段】ポリアデニンヌクレオチド部分にハイブリダイズすることを特徴とする標識ポリヌクレオチドプローブ、該プローブの調製方法、該プローブを用いた標的核酸の検出方法及び該プローブを用いた発現遺伝子の解析方法。
【選択図】 なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子工学分野において有用な標識化プローブの調製方法並びに該プローブを用いた高感度検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ハイブリダイゼーション法は、細胞や組織において発現するｍＲＮＡの種類を同定するために、あるいは各ｍＲＮＡ分子量を定量するために通常よく利用される方法である。それゆえ、ｍＲＮＡの同定、定量のためのハイブリダイゼーション技術は、生物学ならびに医学の分野において非常に重要である。
上記ハイブリダイゼーション法として例えば、全ＲＮＡまたは精製されたＲＮＡをナイロン膜のような多孔性の担体上に固定化し、蛍光物質あるいは放射性同位元素（ＲＩ）等で標識した、検出しようとする遺伝子（ＲＮＡ）に相補的なプローブと混合してハイブリダイズさせる方法がある。このカテゴリーに属する技術としてノーザン・ハイブリダイゼーション法が挙げられる。
また、別法としては、検出しようとする遺伝子（ＲＮＡ）を含む混合物、若しくは該混合物から精製したＲＮＡを蛍光物質あるいは放射性同位元素等で標識し、これを膜上に固定されたプローブとハイブリダイズさせる方法がある。このカテゴリーの属する技術としては、逆ドットブロット法が挙げられる。これら２法は、遺伝子工学分野の研究の様々な実験で使用されている。
【０００３】
従来のハイブリダイゼーション法では通常、膜上に固定化された核酸が使用されてきたが、最近、上記のハイブリダイゼーション技術について、ガラスのような非多孔性の硬質の担体上に、主として既知のＤＮＡ断片を固定化して使用するハイブリダイゼーション技術が開発されている。この技術においては、担体表面上のあらかじめ定められた領域に数多くの種類のＤＮＡ断片を極めて高密度に固定することができる。このような高密度にＤＮＡ断片が固定化された担体は、一般にＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）と呼ばれている。当該ＤＮＡマイクロアレイを使用することにより、少量の試料中の多種類のｍＲＮＡの同定、定量を一度に実施することが可能になった。
【０００４】
上記ＤＮＡマイクロアレイを使用する場合には、試料中の核酸を、例えば蛍光物質を用いて標識し、担体上に固定化されたＤＮＡ断片とハイブリダイズさせて検出するのが一般的である。すなわち、試料中のｍＲＮＡをＤＮＡマイクロアレイで検出する場合には、例えば、以下のような方法で試料を標識することができる。
１．試料中のｍＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成の際に蛍光標識ヌクレオチドを添加して蛍光標識ｃＤＮＡを作成する方法、あるいは
２．試料中のｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後、蛍光標識ヌクレオチド存在下に該ｃＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼで転写反応を行い、蛍光標識ＲＮＡプローブを作成する方法。
上記方法によって作製された標識ＤＮＡあるいはＲＮＡは、試料中のｍＲＮＡ由来の塩基配列、若しくはこれに相補的な塩基配列を有しており、適切なＤＮＡ断片が固定されたマイクロアレイ上で検出することができる。
【０００５】
しかしながら、上記のような方法で試料中のｍＲＮＡ由来の塩基配列を有する標識核酸を作製する場合には、該標識核酸に取り込まれる標識化合物の数が当該核酸の鎖長に比例するため、短い鎖長の標識核酸は長鎖長のものに比較して１分子当りに取り込まれる標識ヌクレオチドの数が少なくなるという欠点がある。従って、同一分子数の標識核酸が担体、例えばマイクロアレイ上に固定化されたＤＮＡ断片とハイブリダイズしている場合、各アレイについて得られる標識化合物由来の標識シグナルの強度はハイブリダイズする核酸の鎖長に大きく影響されることになる。このことは、定量性を求められる実験においては、非常に重要な問題となる。
【０００６】
一方、標識する核酸の鎖長に影響されない核酸標識方法として、米国特許第６００４７５５号公報記載の末端標識方法が挙げられる。しかしながら、該方法は、末端標識したオリゴｄＴプライマーを使用してｃＤＮＡを合成する方法であり、プライマーに付加される標識化合物の数は限られている。従って、検出しようとする遺伝子由来のｍＲＮＡが微量であった場合、シグナル強度が弱く検出できない可能性がある。
【０００７】
細胞内では非常に多くの種類の遺伝子が発現されており、各遺伝子にコードされているポリペプチドはその構造、機能がそれぞれ異なるため、これらのポリペプチドに対応するｍＲＮＡの鎖長も広い範囲に分布している。従って、これらのｍＲＮＡをできるだけ正確に、また高い再現性で検出、定量するための定量性に優れたシグナルを与えるようなｍＲＮＡ、若しくはｍＲＮＡ由来の塩基配列を有する核酸の検出方法が求められていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、検出しようとする核酸の鎖長に影響されない標識核酸を調製し、該標識核酸を用いた高感度検出方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはハイブリダイゼーション法によるｍＲＮＡの検出、定量法について鋭意研究を行い、固定されたプローブとハイブリダイズするｍＲＮＡを、該ｍＲＮＡの３’末端に存在しているポリＡ配列を利用して検出することによって定量性及び検出感度に優れたｍＲＮＡの検出が可能な方法を見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、ポリアデニンヌクレオチド部分にハイブリダイズすることを特徴とする標識ポリヌクレオチドプローブに関する。本発明において標識ポリヌクレオチドプローブは、該プローブの鎖長が５０ヌクレオチド以上であるものが好適に使用できる。また、該プローブは、デオキシウラシルヌクレオチド及び／又はデオキシチミンヌクレオチドからなるものが好適であり、標識デオキシウラシルヌクレオチド及び／又は標識デオキシチミンヌクレオチドを含有することが好ましい。さらに、該標識ヌクレオチドは、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、リガンドあるいはレセプターで標識されたヌクレオチドのいずれもが好適に使用できる。特に限定はされないが、例えば蛍光標識としては、フルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン，Ａｌｅｘａ、テキサスレッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のいずれかの標識を有するヌクレオチドが好適に使用でき、特に好ましくは、上記標識を有するｄＵＴＰあるいはｄＴＴＰが例示される。
【００１１】
本発明の第２の発明は、ｍＲＮＡのポリＡ部分にハイブリダイズすることを特徴とする第１の発明の標識ポリヌクレオチドプローブの調製方法に関する。該標識ポリヌクレオチドプローブは、ポリリボアデニンヌクレオチドあるいはポリデオキシアデニンヌクレオチドを鋳型とし、オリゴｄＴをプライマーとしたヌクレオチド伸長反応により調製することができる。該ヌクレオチド伸長反応は、ポリリボアデニンヌクレオチドを鋳型とした逆転写反応であってもよく、鋳型となるポリリボアデニンヌクレオチドの鎖長は、５０ヌクレオチド以上であることが好ましい。また、上記ヌクレオチド伸長反応べつの態様としては、デオキシヌクレオチド重合反応であってもよい。この場合、該プローブの鎖長が５０ヌクレオチド以上であることが好ましい。上記ヌクレオチド伸長反応のいずれの場合においても、少なくとも標識デオキシウラシルヌクレオチド及び／又は標識デオキシチミンヌクレオチドを用いることができ、該反応液中でのデオキシウラシルヌクレオチドとデオキシチミンヌクレオチドの含有モル比が１：１〜１：３の範囲であるものが本発明の標識ポリヌクレオチドプローブの調製方法に使用できる。また、標識ヌクレオチドは、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、リガンドあるいはレセプターで標識されたヌクレオチドから選択することができ、特に限定はされないが蛍光物質、例えば、フルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン，Ａｌｅｘａ、テキサスレッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のいずれかから選択される標識を有するヌクレオチドが好適に使用できる。
【００１２】
本発明の第３の発明は、ポリアデニンヌクレオチド部分に標識ポリヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせることを特徴とする標的核酸の検出方法に関する。本発明の第３の発明において、ポリアデニンヌクレオチド部分は、人工的に後からポリＡテールを付加させたものでもよく、ｍＲＮＡのポリＡテールであってもよい。すなわち、本発明の第１の発明の標識ポリヌクレオチドプローブが効率良く、特異的にハイブリダイズするものであれば、特に限定はされない。本発明の第３の発明において、標識ポリヌクレオチドプローブは、少なくとも標識デオキシウラシルヌクレオチド及び／又は標識デオキシチミンヌクレオチドを含むものが好適に使用できる。該標識ヌクレオチドは、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、リガンドあるいはレセプターで標識されたヌクレオチドのいずれかから選択されるものが好ましく、特に限定はされないが例えば、標識がフルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン，Ａｌｅｘａ、テキサスレッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のいずれかから選択される標識ヌクレオチドが挙げられる。
【００１３】
本発明の第４の発明は、ポリアデニンヌクレオチド部分にハイブリダイズすることを特徴とする少なくとも２種類の異なる標識を有する標識ポリヌクレオチドプローブを用い、異なる２種類の試料中の多種類の遺伝子の発現を比較することを特徴とする発現遺伝子の解析方法に関する。本発明の第４の発明において標識は、フルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン，Ａｌｅｘａ、テキサスレッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のいずれかから選択される標識ヌクレオチドが好適に使用できる。
【００１４】
本発明の第５の発明は、ポリアデニンヌクレオチド部分にハイブリダイズすることを特徴とする標識ポリヌクレオチドプローブとｃＤＮＡ標識ポリヌクレオチドプローブを組み合わせることを特徴とする発現遺伝子の解析方法に関する。本発明の第５の発明において標識は、フルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン，Ａｌｅｘａ、テキサスレッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のいずれかから選択される標識ヌクレオチドが好適に使用できる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書においてヌクレオチドとは、デオキシリボヌクレオチドあるいはリボヌクレオチドのことをいい、例えばデオキシリボヌクレオチドの場合、糖部分がＤ−２−デオキシリボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、例えば、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、チミン，ウラシルを有するものが挙げられる。また、リボヌクレオチドの場合、糖部分がＤ−リボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルを有するものが挙げられる。さらに、当該ヌクレオチドには修飾デオキシリボヌクレオチドあるいは修飾リボヌクレオチドのいずれもが包含され、例えばα位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えた修飾リボヌクレオチド［（α−Ｓ）リボヌクレオチド、（α−Ｓ）Ｎとも記載する］やこの他の誘導体等も含まれる。
本明細書において、ポリアデニンヌクレオチドとは、リボアデニンヌクレオチドあるいはデオキシアデニンヌクレオチドの重合体のことをいう。該ポリマーは、人工的に調製したものあるいは天然に存在するもの、特に限定はされないが真核生物由来のｍＲＮＡのポリＡテールのいずれもが含まれる。
本明細書において標識ヌクレオチドとは、標識物質で標識されたヌクレオチドのことをいう。該標識物質は、上記デオキシヌクレオチドあるいはリボヌクレオチドに直接、又はリンカー等を介して結合しているもののいずれもが含まれる。
本明細書において標識ポリヌクレオチドとは、上記ヌクレオチドのポリマーのことをいい、該ポリマーは、標識ヌクレオチド及び／又は非標識ヌクレオチドで構成される重合体が好ましい。
本明細書においてヌクレオチド伸長反応とは、上記ヌクレオチドを伸長させる反応であれば特に限定はなく、逆転写反応、ＤＮＡポリメラーゼ反応あるいは、末端デオキシヌクレオチド転移反応のいずれもが好適に使用できる。
本明細書において標的核酸とは、検出しようとする核酸配列、例えば任意の遺伝子の核酸配列のことをいう。
【００１６】
（１）本発明の標識ポリヌクレオチドプローブ
本発明の標識ポリヌクレオチドプローブは、ポリアデニンヌクレオチド部分にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドプローブであればよく、特に限定はされないが、デオキシウリジンヌクレオチド（ｄＵＴＰ）のポリマー、デオキシチミンヌクレオチド（ｄＴＴＰ）のポリマー、あるいはｄＵＴＰとｄＴＴＰの混合ポリマーのいずれもが好適に使用できる。本発明の標識ポリヌクレオチドプローブは、該プローブの鎖長が特に限定はされないが、好ましくは、５０ヌクレオチド以上、さらに好ましくは、１００ヌクレオチド以上であるものが好適に使用できる。本発明の標識ヌクレオチドプローブは、プローブ１分子当りにほぼ一定量の標識化合物を含むものであれば、特に限定はされないが例えば、標識化合物が付加されたヌクレオチドを含有するものであることができる。特に限定されるものではないが例えば、標識デオキシウラシルヌクレオチド又は標識デオキシチミンヌクレオチドが好適であり、これらを混合して使用してもよい。
さらに、該標識ヌクレオチドは、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、リガンドあるいはレセプターで標識されたヌクレオチドのいずれもが好適に使用できる。特に限定はされないが、例えば^３２Ｐ、^３３Ｐのような放射性同位元素、ＡＭＰＰＤのような化学発光物質、フルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン，Ａｌｅｘａ、テキサスレッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のような蛍光物質、ビオチン、アビジン、ディゴキシゲニン等のリガンドあるいはレセプターで標識されたヌクレオチドのいずれもが好適に使用できる。本発明においては、好ましくは蛍光物質、特に好ましくはＡｌｅｘａで標識されたｄＵＴＰが好適に使用できる。
【００１７】
本発明の標識ポリヌクレオチドプローブは、特に限定はされないがストリンジェントな条件においてポリアデニンヌクレオチド部分にハイブリダイズするものが好ましい。該ストリンジェントな条件としては、例えば、モレキュラー クローニング、ア ラボラトリー マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）、第２版（１９８９）記載の条件が好適に使用できる。
【００１８】
本発明の標識ポリヌクレオチドプローブを使用するｍＲＮＡの検出において得られるシグナル強度は、ｍＲＮＡの大きさに関係なく、唯一各々のｍＲＮＡのコピー数に依存する。また、検出しようとするｍＲＮＡごとにプローブを作製する必要がなく、プローブは異なる試料にも共通して使うことができる。
さらに、本発明のプローブは、そのヌクレオチド中に複数箇所ラベルされており、エンドラベルされたポリヌクレオチドやｃＤＮＡプローブよりも強いシグナルを与える。従って、標識されたｄＵＴＰの連続した結合がヌクレオチド伸長反応に影響しない、あるいは伸長産物において立体障害を生じないとするならば、本発明の標識ポリヌクレオチドプローブは、１種類のヌクレオチド標識により同じ長さのｃＤＮＡプローブよりも約４倍強いシグナルを得ることができる。
【００１９】
（２）本発明の標識ポリヌクレオチドプローブの調製方法
本発明の標識ポリヌクレオチドプローブの調製方法は、例えば、ｍＲＮＡのポリＡ部分にハイブリダイズできる標識ポリヌクレオチドプローブを調製できる方法であればいずれでもよい。特に限定はされないが例えば、ポリリボアデニンヌクレオチドあるいはポリデオキシアデニンヌクレオチドを鋳型とし、オリゴｄＴをプライマーとしたヌクレオチド伸長反応により調製することができる。該ヌクレオチド伸長反応は、ポリリボアデニンヌクレオチドを鋳型とした逆転写反応が好適に使用できる。さらに、該ヌクレオチド伸長反応は、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成反応であってもよい。該逆転写反応には、ＡＭＶ、ＭＭＬＶ等の市販の逆転写酵素が好適に使用できる。上記鋳型となるポリリボアデニンヌクレオチドの鎖長は、好ましくは５０ヌクレオチド以上、さらに好ましくは１００ヌクレオチド以上である。該鋳型を使用した場合、調製される標識ポリヌクレオチドの範囲は、５０ヌクレオチド以上である。さらに、上記ヌクレオチド伸長反応のべつの態様としては、デオキシヌクレオチド重合反応であってもよい。この場合、末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）等の市販の修飾酵素が好適に使用できる。この場合において、該プローブの鎖長が５０ヌクレオチド以上になるように反応条件を設定することが好ましい。
【００２０】
上記ヌクレオチド伸長反応のいずれの場合において、少なくとも標識デオキシウラシルヌクレオチド及び／又は標識デオキシチミンヌクレオチドの存在下に反応を実施することにより容易に標識ポリヌクレオチドを調製することができる。上記のヌクレオチド伸長反応において、反応液中での標識（デオキシウラシル）ヌクレオチド３リン酸と非標識（デオキシチミン）ヌクレオチド３リン酸の含有モル比は、好ましくは１：１〜１：３の範囲、特に好ましくは１：２である。また、本発明の調製方法で使用する標識ヌクレオチドは、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、リガンドあるいはレセプターで標識されたヌクレオチドから選択することができ、上記ヌクレオチド伸長反応を阻害しない標識ヌクレオチドあるいは該標識ヌクレオチドのアナログであってもよい。
【００２１】
さらに、本発明の標識ポリヌクレオチドプローブの調製方法としては、上記標識化合物が付加された標識ヌクレオチドをヌクレオチド伸長反応の際に取り込ませる方法が例示されるが、別の態様として非標識のヌクレオチドをヌクレオチド伸長反応に使用し、反応終了後にさらに、酵素化学的あるいは化学的に標識化合物を導入する方法であってもよく、最終的に本発明の標識化されたポリヌクレオチドプローブを調製することができる標識導入方法のいずれもが好適に使用できる。
【００２２】
本発明において、鋳型そしてプライマーとして示されたポリリボアデニンヌクレオチド及びオリゴデオキシチミンヌクレオチドの存在下において逆転写反応によって蛍光標識されたポリデオキシウラシルヌクレオチドを調製することができる。本発明の方法によって調製された、標識デオキシウラシルヌクレオチド及び非標識デオキシチミンヌクレオチドを含有する本発明の標識ポリヌクレオチドプローブは、膜またはガラス表面（ＤＮＡチップ）上にスポットされたＤＮＡ配列とハイブリするｍＲＮＡを検出するために使用することができる。
【００２３】
（３）本発明の標的核酸の検出方法及び発現遺伝子の解析方法
本発明の標的核酸の検出方法において標的核酸のポリアデニンヌクレオチド部分に標識ポリヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせることにより検出することができる。標的核酸のポリアデニンヌクレオチド部分は、人工的に後からポリＡテールを付加させたものでもよく、天然のｍＲＮＡのポリＡテールであってもよい。すなわち、本発明の標識ポリヌクレオチドプローブが効率良く、特異的にハイブリダイズするものであれば、該標識ヌクレオチドは、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、リガンドあるいはレセプターで標識されたヌクレオチドのいずれかから選択されるものが好ましく、特に限定はされないが例えば、標識がフルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン，Ａｌｅｘａ、テキサスレッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のいずれかから選択される標識ヌクレオチドが挙げられる。
【００２４】
本発明の検出方法の別の態様としては、発現遺伝子の解析方法が挙げられる。該方法においては、少なくとも２種類の異なる標識を有する標識ポリヌクレオチドプローブを用いることにより、異なる２種類の試料中の多種類の遺伝子の発現を比較することができる。標識ポリヌクレオチドプローブは特に限定はされないが、例えば、それぞれＣｙ３及びＣｙ５で標識されたポリヌクレオチドプローブが好適に使用できる。
【００２５】
さらに発現遺伝子の解析方法の別の態様としては、ポリアデニンヌクレオチド部分にハイブリダイズする標識ポリヌクレオチドプローブとｃＤＮＡ標識ポリヌクレオチドプローブを組み合わせることができる。この方法は、例えば、３’末端のポリアデニル化又は脱アデニル化によって制御されている特定遺伝子の発現において使用することができ、前述の制御を検出することができる。
また、本発明の検出方法において標識ポリヌクレオチドプローブは、共通で使用することができるので、従来の標的核酸に合わせてｃＤＮＡプローブを調製する必要がなく、低コストで短時間で検出を行うことができる。
【００２６】
【実施例】
本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００２７】
実施例１
（１）標識ポリヌクレオチドプローブの調製
逆転写／標識反応を用いて標識ポリヌクレオチドプローブを調製した。該反応は、以下の反応液組成で行った。すなわち、１００ｐｍｏｌの合成テンプレート−プライマーのＰｏｌｙ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）_{１２−１８}（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を鋳型とし、各０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、４０μＭのｄＴＴＰ及び２０μＭのＡｌｅｘａ−ｄＵＴＰ（モレキュラープローブ社製）、１０ｍＭ ＤＴＴ、２５Ｕ リボヌクレオチドインヒビター（ギブコＢＲＬ社製）、１．５Ｕのスーパースクリプト逆転写酵素（ギブコＢＲＬ社製）を加え、反応液容量を５０μｌにした。該反応混合溶液を３０℃で６０分間保持し、次に９４℃で３分間加熱して酵素を失活させ、氷浴上で冷却した。該反応溶液をマイクロスピンＳ−３００ＨＲカラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて精製した。次に精製物を３７℃、２０分間、０．３ＮのＮａＯＨで処理し、鋳型ポリ（ｒＡ）を分解後、塩酸及びトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で中和した。この溶液を蛍光標識ポリｄＵプローブ溶液として使用した。
【００２８】
（２）細胞培養、ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡプローブの調製
ヒト ＨｅＬａ細胞とＷＩ３８細胞は、ヒューマンサイエンス研究資源バンク（Ｈｕｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ：ＨＳＲＲＢ）から入手し、１０％ ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ 血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍで培養した。全ＲＮＡは、上記培養細胞からグアニジウム−フェノール・クロロホルム法で抽出した。混入した可能性のあるゲノムＤＮＡは、ＲＮａｓｅフリー ＤＮａｓｅ（ＲＱ１ ＤＮａｓｅ，プロメガ社製）を用いて取り除いた。ｍＲＮＡは、必要に応じて、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （アマシャム・ファルマシア バイオテク社製）を用いて精製した。ｃＤＮＡプローブは、上記の６００ｎｇの精製したＲＮＡを鋳型としてＣｙ３―ｄＵＴＰ（アマシャム・ファルマシア バイオテク社製）を用いた逆転写反応によって調製した。反応条件は、３７℃、６０分間インキュベートした後、１０μｌの１Ｎの水酸化ナトリウム溶液を加えて１０分間、３７℃でインキュベートし、鋳型ＲＮＡを分解した。反応物に２５μｌの１Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて中和した後、エタノールで沈殿させた。沈殿物は、１０μｌのハイブリバッファーで再度溶解した。
【００２９】
（３）ＤＮＡ固定化メンブレン及びＤＮＡマイクロアレイの調製
ヒトＧＡＰＤＨ、ＰＣＮＡ，ｐ５３，Ｒｂ，Ｒａｓオンコジーン，ｐ１３０，ｐ１４，ｐ１６，ｐ１８，ｐ１９，ｐ２１，ｐ２７の遺伝子をターゲットとして，配列表の配列番号１〜４０記載のプライマー及びＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（宝酒造社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。なお、ｐ５３、ＲＢ、ｐ１３０、ｐ１６、ｐ１９、ｐ２７、ｐ１８、ｐ１４の遺伝子については、ＲＴ反応後、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。鋳型は、上記（２）で得られたＲＮＡを使用した。得られた増幅断片は、精製後、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔ クローニングベクター（ノバジェン社製）にサブ クローニングし、ＤＮＡ配列解析を確認した。挿入塩基配列を確認後、前述の挿入断片をＢｉｏ−Ｄｏｔ（バイオラッド社製）を用いてハイボンドＮ＋（アマシャム・ファルマシア バイオテク社製）上に固定した。また、ＤＮＡマイクロアレイは、市販のＴｅｓｔ ａｒｒａｙ（宝酒造社製）を使用した。
【００３０】
（４）ハイブリダイゼーション及び検出
上記ターゲット遺伝子を保持するメンブレンフィルターは、メンブレン１ｃｍ^２あたり１ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＣ、０．５％ ＢＳＡ、０．１ｍｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ、０．１％ ＳＤＳ）を使用して、３７℃、１時間、プレハイブリダイゼーションを行った。初めに（２）で得られた全ＲＮＡもしくは精製ＲＮＡのいずれか１０μｌに上記（１）で調製した標識ポリｄＵプローブ溶液 １０μｌを添加し、最終容量が２００μｌになるようにハイブリダイゼーション緩衝液を加え、７０℃、１０分間加熱後、上記メンブレンフィルターと６〜１０時間、３０℃でハイブリダイズした。メンブレンフィルターは、室温で１５分間、洗浄緩衝液Ｉ（１×ＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳ）に入れて穏やかに振とうし、次に１０分間、洗浄緩衝液ＩＩ（０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）に入れて振とうし、洗浄した。洗浄後、メンブレンフィルターは、蛍光イメージアナライザーＦＭＢＩＯ ＩＩ（宝酒造社製）で検出した。一方、ＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーションは添付の取り扱い説明書の指示通りにおこなった。すなわち、プレハイブリダイゼーションは、１４μｌのプレハイブリダイゼーション液（６×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．１μｇ／μｌ サケ精子ＤＮＡ）を用いて１時間、６５℃で行った。ポリｄＵプローブとのハイブリダイゼーションについては、上記（２）で得られた６００ｎｇのｍＲＮＡに１μｌのポリｄＵを加え、容量を１４μｌとした。該溶液を７０℃、１０分間加熱した。また、同量のｍＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡプローブの調製を行った。前述の反応液をマイクロアレイに添加し、次いでアレイを６５℃、１８〜２０時間インキュベートし、さらに３０℃、３時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、該マイクロアレイを６０℃、１５分間、２×ＳＳＣ溶液で、さらに６０℃、１５分間、洗浄液（２×ＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳ）で洗浄し、最後に室温で２回、２×ＳＳＣで洗浄した。マイクロアレイ上のシグナルは、アレイスキャナー４１８（アフィメトリックス社製）を用いて検出した。
【００３１】
メンブレンフィルターにおける本発明の標識ポリヌクレオチドプローブの一例として、Ａｌｅｘａ−ｄＵＴＰで標識された標識ポリヌクレオチドプローブのハイブリ特異性について図１−Ａに示す。図１−Ｂは、各ポリヌクレオチドのスポットした位置を示す。図１−Ａに示したように該標識ポリヌクレオチドプローブは、ポリリボアデニンヌクレオチド（ｐｏｌｙＡ）に特異的にハイブリダイズし、他のヌクレオチドにはハイブリダイズしないことが確認できた。
【００３２】
さらに、ポリリボアデニンヌクレオチドを１ｎｇ（３ｆｍｏｌ）〜１０００ｎｇ（３ｐｍｏｌ）の濃度範囲でスポットしたメンブレンを用いて検出感度を検討した。その結果を図２に示す。図２に示したように３ｆｍｏｌ（１ｎｇ）を１２ｍｍ^２に固定化した場合においても明瞭な蛍光シグナルが得られることが確認できた。
【００３３】
また、１μｇのＧＡＰＤＨ ＤＮＡ断片及びｐＵＣ１８ プラスミドＤＮＡを同一メンブレン上にスポットしたフィルターを用いて、ＨｅＬａ細胞由来の１０〜４０μｇの全ＲＮＡに（１）で調製された標識ポリｄＵプローブ溶液 １０μｌをアニーリングさせたものをハイブリダイズさせた。その結果を図３に示す。図３に示したようにｐＵＣ１８ＤＮＡではなく、ＧＡＰＤＨ ＤＮＡをスポットしたもののみシグナルが検出された。
【００３４】
次に、（４）で調製したＤＮＡ断片をスポットしたメンブレンを使用し、ＨｅＬａ細胞とＷＩ１３８細胞由来の２０μｇの全ＲＮＡと（１）で調製したポリｄＵプローブ溶液 １０μｌをアニーリングしたものをハイブリダイズした。その結果を図４に示す。図４―１は、ＨｅＬａ細胞由来、図４―２はＷＩ１３８由来の試料を用いた結果を示す。図４―３は、スポットした各遺伝子の位置を示す。図４―１及び図４―２より、発現する遺伝子に応じてシグナルが検出されることが確認できた。さらに、従来法のノーザンブロットの結果と比較したところ同じ発現パターンで検出されることが確認できた。
【００３５】
ＤＮＡマイクロアレイ及びＷＩ３８細胞由来のｍＲＮＡを用いて検討した。その結果を図５に示す。図５Ａに示したようにＷＩ３８細胞由来のｍＲＮＡに本発明の標識ポリヌクレオチドプローブがアニーリングしたものは、哺乳類細胞由来の特異的なターゲットにハイブリダイズすることが示された。一方、シアノバクテリア遺伝子のものは全く検出しなかった。この事から、本発明の標識ポリヌクレオチドプローブは、ＤＮＡマイクロアレイにおいても使用できることを確認した。また同じチップを、同じｍＲＮＡ調製品から従来の方法で調製されたｃＤＮＡプローブによって検討した結果を図５Ｂに示す。図５のＡ及びＢの比較から本発明の検出方法が、従来法と基本的に同様の結果を示すことが確認できた。
【００３６】
【発明の効果】
本発明により、ハイブリダイゼーションにおいて有用な標識核酸プローブ、該プローブの調製方法及び該プローブを用いた標的核酸の高感度検出方法が提供される。
【００３７】

【００３８】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の標識ポリヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションにおける特異性を示す図である。
【図２】図２は、本発明の標識ポリヌクレオチドプローブの検出感度を示す図である。
【図３】図３は、本発明の標識ポリヌクレオチドプローブを用いた発現遺伝子の検出を示す図である。
【図４】図４は、本発明の標識ポリヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションにおける特異性を示す図である。
【図５】図５は、ＤＮＡチップにおける本発明の標識ポリヌクレオチドプローブを用いた検出を示す図である。

Claims (25)

1. ポリアデニンヌクレオチド部分にハイブリダイズすることを特徴とする標識ポリヌクレオチドプローブ。
2. 鎖長が５０ヌクレオチド以上であることを特徴とする請求項１記載の標識ポリヌクレオチドプローブ。
3. デオキシウラシルヌクレオチド及び／又はデオキシチミンヌクレオチドからなるポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の標識ポリヌクレオチドプローブ
4. 標識デオキシウラシルヌクレオチド及び／又は標識デオキシチミンヌクレオチドを含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の標識ポリヌクレオチドプローブ。
5. 標識ヌクレオチドが、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、リガンドあるいはレセプターで標識されたヌクレオチドのいずれかから選択されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の標識ポリヌクレオチドプローブ。
6. 標識がフルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン，Ａｌｅｘａ、テキサスレッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のいずれかから選択される標識ヌクレオチドであることを特徴とする請求項５記載の標識ポリヌクレオチドプローブ。
7. ｍＲＮＡのポリＡ部分にハイブリダイズすることを特徴とする標識ポリヌクレオチドプローブの調製方法。
8. ポリリボアデニンヌクレオチドあるいはポリデオキシアデニンヌクレオチドを鋳型とし、オリゴｄＴをプライマーとしたヌクレオチド伸長反応により調製することを特徴とする請求項７記載の標識ポリヌクレオチドプローブの調製方法。
9. ヌクレオチド伸長反応がポリリボアデニンヌクレオチドを鋳型とした逆転写反応であることを特徴とする請求項８記載の標識ポリヌクレオチドプローブの調製方法。
10. 鋳型となるポリリボアデニンヌクレオチドあるいはポリデオキシアデニンヌクレオチドの鎖長が５０ヌクレオチド以上であることを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載の標識ポリヌクレオチドプローブの調製方法。
11. ヌクレオチド伸長反応が、デオキシヌクレオチド重合反応であることを特徴とする請求項８記載の標識ポリヌクレオチドプローブの調製方法。
12. 鎖長が５０ヌクレオチド以上であることを特徴とする請求項７〜１１のいずれかに記載の標識ポリヌクレオチドプローブの調製方法。
13. ヌクレオチド伸長反応が少なくとも標識デオキシウラシルヌクレオチド及び／又は標識デオキシチミンヌクレオチドを用いて行われることを特徴とする請求項７〜１２のいずれかに記載の標識ポリヌクレオチドプローブの調製方法。
14. ヌクレオチド伸長反応液中のデオキシウラシルヌクレオチドとデオキシチミンヌクレオチドの含有モル比が１：１〜１：３であることを特徴とする請求項１３記載の標識ポリヌクレオチドプローブの調製方法。
15. 標識ヌクレオチドが、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、リガンドあるいはレセプターで標識されたヌクレオチドのいずれかから選択されることを特徴とする請求項７〜１４のいずれかに記載の標識ポリヌクレオチドプローブの調製方法。
16. 標識がフルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン，Ａｌｅｘａ、テキサスレッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のいずれかから選択される標識ヌクレオチドであることを特徴とする請求項１５記載の標識ポリヌクレオチドプローブの調製方法。
17. ポリアデニンヌクレオチド部分に標識ポリヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせることを特徴とする標的核酸の検出方法。
18. ポリアデニンヌクレオチド部分が、ｍＲＮＡのポリＡテールであることを特徴とする請求項１７に記載の標的核酸の検出方法。
19. 標識ポリヌクレオチドプローブが少なくとも標識デオキシウラシルヌクレオチド及び／又は標識デオキシチミンヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１７又は請求項１８のいずれかに記載の標的核酸の検出方法。
20. 標識ヌクレオチドが、放射性同位元素、化学発光物質、蛍光物質、リガンドあるいはレセプターで標識されたヌクレオチドのいずれかから選択されることを特徴とする請求項１７〜１９のいずれかに記載の標的核酸の検出方法。
21. 標識がフルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン，Ａｌｅｘａ、テキサスレッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のいずれかから選択される標識ヌクレオチドであることを特徴とする請求項２０記載の標的核酸の検出方法。
22. ポリアデニンヌクレオチド部分にハイブリダイズすることを特徴とする少なくとも２種類の異なる標識を有する標識ポリヌクレオチドプローブを用い、異なる２種類の試料中の多種類の遺伝子の発現を比較することを特徴とする発現遺伝子の解析方法。
23. 標識がフルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン，Ａｌｅｘａ、テキサスレッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のいずれかから選択される標識ヌクレオチドであることを特徴とする請求項２２記載の発現遺伝子の解析方法。
24. ポリアデニンヌクレオチド部分にハイブリダイズすることを特徴とする標識ポリヌクレオチドプローブとｃＤＮＡ標識ポリヌクレオチドプローブを組み合わせることを特徴とする発現遺伝子の解析方法。
25. 標識がフルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン，Ａｌｅｘａ、テキサスレッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のいずれかから選択される標識ヌクレオチドであることを特徴とする請求項２４記載の発現遺伝子の解析方法。

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