JP2004166576A - 遺伝子が置換または欠損した微生物の製造法 - Google Patents
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Abstract
【課題】染色体ＤＮＡ上に、１０ｋｂ以上の置換または欠損領域を１以上有する微生物の製造法を提供する。
【解決手段】本発明によれば、薬剤耐性遺伝子を有する直鎖ＤＮＡであり、かつ置換または欠損の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に位置するＤＮＡとそれぞれ相同性を有するＤＮＡを、その両端に有する直鎖ＤＮＡ用いて微生物を形質転換することを特徴とする、染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂ以上の領域が置換または欠損した微生物の製造法を提供することができる。
【選択図】 なし
【解決手段】本発明によれば、薬剤耐性遺伝子を有する直鎖ＤＮＡであり、かつ置換または欠損の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に位置するＤＮＡとそれぞれ相同性を有するＤＮＡを、その両端に有する直鎖ＤＮＡ用いて微生物を形質転換することを特徴とする、染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂ以上の領域が置換または欠損した微生物の製造法を提供することができる。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂ以上の領域が置換または欠損した微生物の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＰＣＲ技術の発展に従い、目的とする塩基配列を有する直鎖ＤＮＡを効率よく作製することが可能となった。枯草菌等の一部の微生物では、上記ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片等を用いて染色体ＤＮＡ上の任意の遺伝子が欠損または置換した形質転換体の作製が行われている。
【０００３】
一方、大腸菌野生株は、直鎖ＤＮＡによる形質転換頻度は低く、ｒｅｃＢＣおよびｓｂｃＢＣ等のヌクレアーゼ活性が低下した変異株でのみ低い頻度で直鎖ＤＮＡによる染色体ＤＮＡ上の遺伝子置換等が可能であった（非特許文献１参照）。
λファージ由来の組換えタンパク質群（Ｒｅｄ組換え系）を大腸菌内で発現させると、直鎖ＤＮＡを用いた染色体上の形質転換効率が１０倍以上上昇することが報告されている（非特許文献２）。また、ＰＣＲにより作製した直鎖ＤＮＡとλＲｅｄ組換え系を組み合わせた、大腸菌の染色体ＤＮＡ上の任意の遺伝子を置換または欠損させる方法も報告されている（非特許文献３および４参照）。
【０００４】
上記λＲｅｄ組換え系を用いて単一の遺伝子破壊を行う際に、形質転換株の選択に使用するマーカー遺伝子である薬剤耐性遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残らないようにする方法も非特許文献３および４に記載されている。しかしながら、上記λＲｅｄ組換え系を用いた染色体ＤＮＡ上の異なる位置に存在する２以上の遺伝子が置換または欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの作製法、１０ｋｂｐ以上の長いＤＮＡ領域が置換または欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉの作製法は知られていなかった。
【０００５】
大腸菌染色体ＤＮＡ上の長い領域に欠損を多重に導入する方法として、制限酵素ＳｃｅＩを用いる方法が報告されている（非特許文献５参照）。しかしながらこの方法は、多段階の工程からなる複雑な方法であり、また効率が低い方法である。また、同様に長い領域に欠損を導入する方法としては、Ｃｒｅ組換え酵素を利用する方法が知られていた（非特許文献６参照）が、この方法では最終的にＣｒｅの認識配列であるｌｏｘＰ配列が染色体上に残存するため、多重に欠損を導入する方法としては好ましい方法ではない。非特許文献６には、認識配列が異なる二つの組換え酵素ＣｒｅとＦＬＰを利用して、４つまでの欠失を同時に一菌株に導入することが記載されているが、この方法も染色体ＤＮＡに欠損を導入するたびに、染色体ＤＮＡ上にＣｒｅ認識配列であるｌｏｘＰ配列やＦＬＰ認識配列であるＦＲＴ配列が蓄積する方法であり、多重に欠損を導入する方法としては好ましい方法ではない。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（ジャーナル オブ バクテリオロジー）， １５９， ７８３−７８６ （１９８４）
【０００７】
【非特許文献２】
Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（ジャーナル オブ バクテリオロジー）， １８０， ２０６３−２０７１ （１９９８）
【０００８】
【非特許文献３】
Ｇｅｎｅ（ジーン）， ２４６， ３２１−３２０ （２０００）
【０００９】
【非特許文献４】
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（プロシーディング オブ ナショナル アカデミーサイエンス）， ９７， ６６４０−６６４５ （２０００）
【００１０】
【非特許文献５】
Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ゲノム リサーチ）， １２， ６４０−６４７ （２００２）
【００１１】
【非特許文献６】
Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ネイチャー バイオテクノロジー）， ２０， １０１８−１０２３ （２００２）
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂｐ以上の領域が置換または欠損した微生物の製造法を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は下記（１）〜（８）に関する。
（１） 薬剤耐性遺伝子を有する直鎖ＤＮＡであり、かつ置換または欠損を導入したい染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に位置するＤＮＡとそれぞれ相同性を有するＤＮＡを、その両端に有する直鎖ＤＮＡを用いて微生物を形質転換することを特徴とする、染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂ以上の領域が置換または欠損した微生物の製造法。
【００１４】
（２） 上記（１）の製造法で得られた染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂ以上の領域が置換または欠損した微生物に、上記（１）で用いた置換または欠損を導入したい染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に位置するＤＮＡとそれぞれ相同性を有するＤＮＡをその両端に有する直鎖ＤＮＡを導入することにより、染色体ＤＮＡ上に挿入された薬剤耐性遺伝子を削除することを特徴とする、染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂ以上の領域が置換または欠損した微生物の製造法。
【００１５】
（３） 以下の［１］〜［３］の工程、
［１］薬剤耐性遺伝子、ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を有する直鎖ＤＮＡであり、かつ置換または欠損の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に位置するＤＮＡとそれぞれ相同性を有するＤＮＡをその両端に有する直鎖ＤＮＡ用いて微生物を形質転換する工程
［２］上記［１］で用いた置換または欠損の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に位置するＤＮＡとそれぞれ相同性を有するＤＮＡをその両端に有する直鎖ＤＮＡを該形質転換体に導入する工程
［３］染色体ＤＮＡ上から、［１］で用いた薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が削除された形質転換体を選択する工程
を含む、染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂ以上の領域が置換または欠損した微生物の製造法。
【００１６】
（４） 上記（３）の［１］〜［３］の工程を繰り返すことを特徴とする染色体ＤＮＡ上の異なる位置に存在する２以上の１０ｋｂｐ以上の領域が置換または欠損した微生物の製造法。
（５） 置換または欠損の導入導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に位置するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡが、各々５００ｂｐ〜５ｋｂｐの長さを有するＤＮＡである上記（１）〜（４）の製造法。
【００１７】
（６） 微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物である上記（１）〜（５）の製造法。
（７） 薬剤耐性遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子である上記（１）〜（６）の製造法。
【００１８】
（８） ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物由来のｓａｃＢ遺伝子またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物由来のｒｐｓＬ遺伝子である上記（３）〜（７）の製造法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本願発明の製造法に用いられる宿主微生物としては、直鎖ＤＮＡをその細胞内に取り込み、染色体ＤＮＡと導入した直鎖ＤＮＡとの間で相同組換えが起こる微生物であれば、いずれの微生物であってもよいが、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物、より好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、さらに好ましくはλファージ由来の組換えタンパク質群（Ｒｅｄ組換え系）を発現しているＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉをあげることができる。
【００２０】
λＲｅｄ組換え系を発現しているＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉとしては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＫＭ２２株〔Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １８０， ２０６３（１９９８）〕およびＫＭ２２株が保有するλＲｅｄ組換え系に関与する遺伝子で形質転換または形質導入されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉなどをあげることができ、具体的にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ｒｅｄ株をあげることができる。
【００２１】
本発明の製造法に用いられるＤＮＡとしては、
（１）薬剤耐性遺伝子を有する直鎖ＤＮＡであり、かつ置換または欠損の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡをその両端に有する直鎖ＤＮＡ、
（２）置換または欠損の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡをその両端に有する直鎖ＤＮＡ、
（３）薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を有する直鎖ＤＮＡであり、かつ置換または欠損の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡをその両端に有する直鎖ＤＮＡ
をあげることができる。
【００２２】
薬剤耐性遺伝子としては、宿主微生物が感受性を示す薬剤に対し、薬剤耐性を付与する薬剤耐性遺伝子であれば、いずれの薬剤耐性遺伝子も使用することができる。宿主微生物にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを用いた場合は、薬剤耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子等をあげることができる。
【００２３】
ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子とは、宿主微生物で該遺伝子を発現させたとき、一定培養条件下においては、該微生物に致死的である遺伝子のことをいい、該遺伝子としては例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物由来のｓａｃＢ遺伝子〔Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ５９， １３６１−１３６６（１９９３）〕 、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物由来のｒｐｓＬ遺伝子〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ７２， ９９−１０４（２００１）〕等をあげることができる。
【００２４】
本発明の製造法で用いられる直鎖ＤＮＡの両末端に存在する、染色体ＤＮＡ上の置換または欠損の導入対象となる領域の両端の外側に位置するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡは、直鎖ＤＮＡにおいて、染色体ＤＮＡ上の方向と同じ方向に配置され、その長さは５００ｂｐ〜５ｋｂｐ程度が好ましく、５００ｂｐ〜２ｋｂｐ程度がより好ましく、１ｋｂｐ程度がさらに好ましい。
【００２５】
相同性を有するとは、上記直鎖ＤＮＡが、染色体ＤＮＡ上の目的とする領域において、相同組換えが起こる程度の相同性を有することであり、具体的な相同性としては、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは１００％の相同性をあげることができる。
上記塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， ５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８３， ６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５， ４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ． ｇｏｖ．）。
【００２６】
上記直鎖ＤＮＡ断片は、ＰＣＲにより作製することができる。また上記直鎖ＤＮＡを含むＤＮＡをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖ＤＮＡを得ることもできる。
本発明の製造法において用いられる、微生物の染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂｐ以上の領域を置換または欠損させる方法としては、以下の方法１〜３があげられる。
方法１：上記（１）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する方法。
方法２：上記方法１により取得された形質転換株に、上記（２）の直鎖ＤＮＡを導入し、該方法により染色体ＤＮＡ上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物の染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂｐ以上の領域を置換または欠損させる方法。
方法３
［１］上記（３）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
［２］染色体ＤＮＡ上の置換または欠損の対象となる領域の両端の外側に位置するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、染色体ＤＮＡ上における方向と同一の方向で連結したＤＮＡを合成し、上記［１］で得られた形質転換株に導入する、
［３］ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、上記［２］の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体ＤＮＡ上から削除された株として選択する方法。
【００２７】
上記方法で用いられる、直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入する方法としては、該微生物へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ６９， ２１１０ （１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １６， ６１２７ （１９８８）〕等をあげることができる。
【００２８】
方法２または方法３［２］で用いられる直鎖ＤＮＡにおいて、該ＤＮＡの中央部付近に、染色体ＤＮＡ上に挿入したい任意の遺伝子を組み込こんだ直鎖ＤＮＡを用いることにより、薬剤耐性遺伝子等を削除するのと同時に、任意の遺伝子を染色体ＤＮＡ上に挿入することができる。
上記方法２および３では、最終的に得られる形質転換株の染色体ＤＮＡ上には薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子を残さない方法であるため、該方法を用いる本発明の製造法では、同一の薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、方法１および２、または方法３［１］〜［３］の操作を繰り返すことにより、容易に染色体ＤＮＡ上の位置の異なる２以上の領域に１０ｋｂｐ以上の欠損を有する微生物を製造することができる。
【００２９】
【実施例】
実施例１：λＲｅｄ組換え系を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの作製
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＭ２２株［Δ（ｒｅｃＣ ｐｔｒｒｅｃＢ ｒｅｃＤ）：：Ｐｌａｃ−ｒｅｄ ｋａｎ］（米国マサチューセッツ医科大学のＫｅｎｅｎ Ｃ． Ｍｕｒｐｈｙ博士より入手可能）よりＰ１ファージを以下の方法により調製した。
【００３０】
２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む１０ｍｌのＬＢ培地〔１０ｇ／ｌ バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、１０ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、１ｍｌ／ｌ １ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム〕を用いて３０℃にて１６時間培養したＫＭ２２株の培養液 ０．５ｍｌと、１．４ｍｌの新しいＬＢ培地および１００μｌの０．１ｍｍｏｌ／ｌ 塩化カルシウム溶液とを混合した。３０℃にて５〜６時間振とう培養した後、４００μｌの培養液を滅菌チューブに移した。該チューブに２μｌのＰ１ファージストック（東京大学分子細胞生物学研究所より入手可能）を添加し、３７℃にて１０分間保温した。次に５０℃に保温した３ｍｌのソフトアガー溶液（１０ｇ／ｌ バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｍｍｏｌ／ｌ 塩化カルシウム、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム、３ｇ／ｌ 寒天）を添加し、よく攪拌した後に、Ｃａ−ＬＢ寒天培地プレート（１０ｇ／ｌ バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｍｍｏｌ／ｌ 塩化カルシウム、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム、１５ｇ／ｌ 寒天、プレートの直径は１５ｃｍ）上にまいた。該プレートを３７℃で７時間培養した後、スプレッダーでソフトアガー部分を細かく砕いて回収した。回収したソフトアガーを１５００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離した。得られた上清１．５ｍｌに対し１００μｌのクロロホルムを添加し、４℃にて一晩保存した後、１５０００ｇにて２分間遠心分離し、その上清をファージストックとして４℃で保存した。
【００３１】
次に上記で取得したファージを用いてＷ３１１０株を形質転換した。５ｍｌのＣａ−ＬＢ液体培地を用いて３０℃、４時間培養したＷ３１１０株培養液から２００μｌ分取し、ファージストックを１μｌ添加した。３７℃で１０分間保温した後、５ｍｌのＬＢ液体培地と２００μｌの１ｍｏｌ／ｌ クエン酸ナトリウム溶液を添加し、攪拌した。１５００ｇ、２５℃にて１０分間遠心分離した後、上清を捨て、得られた細胞に１ｍｌのＬＢ液体培地と１０μｌの１ｍｏｌ／ｌ クエン酸ナトリウム溶液を加え３０℃にて２時間保温した。該溶液１００μｌを２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム３寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に塗布し、３０℃で一晩培養した。翌日出現したコロニー２４個をそれぞれ、２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム３寒天培地に塗布し、カナマイシン耐性株を選抜することにより、Δ（ｒｅｃＣｐｔｒ ｒｅｃＢ ｒｅｃＤ）：：Ｐｌａｃ−ｒｅｄ ｋａｎ）領域が形質導入されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ Ｗ３１１０ｒｅｄ株を取得した。
【００３２】
実施例２：染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂｐ以上の領域を欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの製造
実施例１で取得したλＲｅｄ遺伝子群を導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ｒｅｄ株〔Ｗ３１１０、Δ（ｒｅｃＣ ｐｔｒ ｒｅｃＢｒｅｃＤ）：：Ｐｌａｃ−ｒｅｄ ｋａｎ〕を宿主微生物に用い、以下の方法により、Ｗ３１１０ｒｅｄ株の染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂｐ以上の領域が欠損した形質転換株を作製した。
【００３３】
Ｗ３１１０ｒｅｄ株を、１ｍｍｏｌ／ｌのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−Ｔｈｉｏ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加した１００ｍｌのＬＢ液体培地〔１０ｇ／ｌ バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、１０ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム〕を用いて、３０℃で培養した。ＯＤ６６０ｎｍが０．１に達した時点で培養を終了した。なお、以下の操作は低温および氷冷した溶液を用いて行った。次に遠心分離により集菌した菌体を５０ｍｌの２０％グリセロール溶液に懸濁し、同様の遠心分離により集菌する操作を３回以上繰り返すことで菌体を洗浄した後、培養液の５０μｌの１０％グリセロール溶液に懸濁した。該溶液をエレクトロポレーション用のコンピテントセル溶液として使用した。
【００３４】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株の染色体ＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． Ｕ０００９６）において、４４８７７０９〜４５３３５９９ｂｐまでの領域約４６ｋｂｐを欠失させるための直鎖ＤＮＡを以下の方法で作製した。
配列番号１で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ１ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ ｌｉ染色体ＤＮＡ上の４４８６７０９〜４４８６７３４ｂｐに相当する塩基配列を有するＤＮＡ）、配列番号２で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ２ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４４８７７０８〜４４８７６８５ｂｐに相当する塩基配列に２５ｍｅｒのリンカー配列を付加したＤＮＡ）、配列番号３で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ３ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４５３４５９９〜４５３４５７５ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号４で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ４ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４５３３６００〜４５３３６２０ｂｐに相当する塩基配列に２５ｍｅｒのリンカー配列を付加したＤＮＡ）を合成した。
【００３５】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡを鋳型に用い、上記プライマーＤＮＡ１と２、またはプライマーＤＮＡ３と４の組合せをプライマーセットとしてそれぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製した染色体ＤＮＡ１００ｎｇまたは爪楊枝の先で拾った少量の菌体を用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００３６】
上記ＰＣＲにて、欠損対象領域の両端に位置する染色体ＤＮＡ配列とそれぞれ相同な１ｋｂの領域（アーム）を取得した。以下、プライマーＤＮＡ１と２をプライマーセットに用いて増幅されたＤＮＡを上流アーム、プライマーＤＮＡ３と４をプライマーセットに用いて増幅されたＤＮＡを下流アームと呼ぶ。
次に、配列番号５で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ５、および配列番号６で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ６を合成した。該ＤＮＡをプライマーセットとして用い、ｐＨＳＧ３９９プラスミドＤＮＡ（宝酒造社より購入可能）を鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは上記と同様の条件で行った。鋳型ＤＮＡとしては精製したプラスミドＤＮＡ４０ｎｇを用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００３７】
上記ＰＣＲにて、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ遺伝子）を含むＤＮＡ断片を取得した。
次に、上記で取得した上流アーム、下流アーム、およびｃａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片を混合したＤＮＡを鋳型として、プライマーＤＮＡ１と３をプライマーセットに用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製した上流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製した下流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製したｃａｔ遺伝子断片１．５μｌを用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００３８】
上記ＰＣＲにて、ｃａｔ遺伝子の一端に上流アーム、他の一端に下流アームが付加したＤＮＡ断片を作製した。該ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）により分離し、該ＤＮＡ断片をゲルから切り出して、ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
【００３９】
精製したＤＮＡ断片０．１μｇを、上記で作製したコンピテントセル溶液５０μｌに添加し、０．１ｃｍのキュベット（ＢｉｏＲａｄ社製）中で、１．８ＫＶ、２５μＦにてエレクトロポレーションを行った。１ｍｌのＳＯＣ液体培地（２０ｇ／ｌバクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、０．２ｍｌ／ｌの５ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム、２０ｍｌ／ｌ １ｍｏｌ／ｌ グルコース、１０ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 水酸化マグネシウム、１０ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 硫酸マグネシウム）を用いて３７℃で２時間培養した後、遠心分離により集菌した全量を、１５μｇ／ｍｌ クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート（ＬＢ液体培地に寒天を１．５％含むもの。以下、ＬＢｃｍ寒天培地プレートと略す）上に塗布し、３７℃で一晩培養することにより、クロラムフェニコール耐性株を取得した。
【００４０】
取得したクロラムフェニコール耐性株の染色体ＤＮＡ上に目的とする欠損（４４８７７０９〜４５３３５９９ｂｐの領域がｃａｔ遺伝子で置き換わっている）が導入されていることを確認することを目的に以下の実験を行った。
上記で用いたアーム配列末端からさらに染色体ＤＮＡ上において上流または下流にそれぞれ１ｋｂ離れた領域に相当するプライマーＤＮＡである、配列番号７で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ７ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４４８５７０９〜４４８５７２９ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）および配列番号８で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ８ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４５３５５９９〜４５３５５７５ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）を合成した。プライマーＤＮＡ７および８をプライマーセットとして用い、クロラムフェニコール耐性株のコロニーを直接鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては爪楊枝の先で拾った少量の菌体をＰＣＲ反応液に懸濁して鋳型とした。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００４１】
その結果、約４．６ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られた。プライマーＤＮＡ７および８をプライマーセットに用い、目的とする欠損が導入されたクロラムフェニコール耐性株の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲによって取得される増幅ＤＮＡ断片は、ｃａｔ遺伝子（０．６ｋｂ）の両端にそれぞれ約２ｋｂのＤＮＡが付加されたＤＮＡ断片（約４．６ｋｂ）であることから、目的とする形質転換株が得られたことを確認し、該形質転換株をΔｅ＿ｃａｔ株（欠失領域４４８７７０９〜４５３３５９９ｂｐ）と命名した。
【００４２】
上記Δｅ＿ｃａｔ株の製造法と同様の方法により、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の２６２８９２〜２９７０１６ｂｐの領域が欠損した株（Δｆ＿ｃａｔ）、５６４０１７〜５８４８７９ｂｐの領域が欠損した株（Δｃ＿ｃａｔ）、１１９６０８９〜１２２３１３１ｂｐの領域が欠損した株（Δｇ＿ｃａｔ）、１４１７３４５〜１４３２２８２ｂｐの領域が欠損した株（Δｈ＿ｃａｔ）、１５０６８３７〜１５１７１２５ｂｐの領域が欠損した株（Δｂ＿ｃａｔ）、１８０５４０３〜１８１１７３３ｂｐの領域が欠損した株（Δａ＿ｃａｔ）、２３１８０６２〜２３３２４２３ｂｐの領域が欠損した株（Δｋ＿ｃａｔ）、２７５４１５９〜２７８８００４ｂｐの領域が欠損した株（Δｄ＿ｃａｔ）、３１０８６０６〜３１３２８３９ｂｐの領域が欠損した株（Δｌ＿ｃａｔ）、３４５１１４４〜３４６７４９１ｂｐの領域が欠損した株（Δｍ＿ｃａｔ）、４５６９９３４〜４５８６３３４ｂｐの領域が欠損した株（Δｏ＿ｃａｔ）、２５６２０６〜３６３９９２ｂｐの領域が欠損した株（ΔＣＧＳＣ１＿ｃａｔ）を取得することができた。
【００４３】
実施例３ ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いた染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂｐ以上の領域を欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの製造
実施例１で取得したλＲｅｄ遺伝子群を導入した株Ｗ３１１０ｒｅｄ株〔Ｗ３１１０、Δ（ｒｅｃＣ ｐｔｒ ｒｅｃＢ ｒｅｃＤ）：：Ｐｌａｃ−ｒｅｄ ｋａｎ〕を宿主微生物に用い、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子としてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ遺伝子（ｓａｃＢ遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＢＧ１０３８８）を有する直鎖ＤＮＡを用いて、以下の方法によりＷ３１１０ｒｅｄ株の染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂｐ以上の領域が欠損した形質転換株を作製した。
【００４４】
Ｗ３１１０ｒｅｄ株のコンピテントセルは実施例２と同様の方法により作製した。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＫ−１２株の染色体配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． Ｕ０００９６）で４４８７７０９〜４５３３５９９ｂｐまでの領域約４６ｋｂｐを欠失させるための直鎖ＤＮＡを以下の方法で作製した。
【００４５】
配列番号９で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ９ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４４８５７０９〜４４８５７２９ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号１０で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ１０ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４４８７７０８〜４４８７６８５ｂｐに相当する塩基配列に２５ｍｅｒのリンカー配列を付加した塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号１１で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ１１ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４５３５５９９〜４５３５５７５ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号１２で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ１２ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４５３３６００〜４５３３６２０ｂｐに相当する塩基配列に２２ｍｅｒのリンカー配列を付加した塩基配列からなるＤＮＡ）を合成した。
【００４６】
Ｗ３１１０ｒｅｄ株のゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマーＤＮＡ９と１０、またはプライマーＤＮＡ１１と１２をプライマーセットとしてそれぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製染色体ＤＮＡ１００ｎｇまたは爪楊枝の先で拾った少量の菌体を用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００４７】
上記ＰＣＲにて、欠失対象領域の両端に位置する染色体ＤＮＡ配列とそれぞれ相同な２ｋｂの領域（アーム）を取得した。以下、プライマーＤＮＡ９と１０をプライマーセットとして増幅されたＤＮＡ断片を上流アーム、プライマーＤＮＡ１１と１２をプライマーセットとして増幅されたＤＮＡ断片を下流アームと呼ぶ。
【００４８】
ｓａｃＢ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． Ｘ０２７３０）を、コーディング領域の上流４００ｂｐ、下流２００ｂｐまでの領域としてＰＣＲ法にて取得した。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしてはＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌ ｉｓ １６８株（ＡＴＣＣ等の各種機関より入手可能）精製染色体ＤＮＡ１００ｎｇを用いた。プライマーＤＮＡには、配列番号４５で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ４５と配列番号４６で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ４６を各々２０ｐｍｏｌ反応液に添加した。
【００４９】
上記ＰＣＲにて取得した断片を、ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、最終的に各々５０μｌのＤＮＡ溶液を得た。
またｐＨＳＧ３９９プラスミド由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）断片を実施例２で取得したときと同様のＰＣＲ法にて増幅し、精製ＤＮＡを取得した。ただしプライマーセットとして配列番号４７で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ４７と配列番号４８で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ４８を用いた。
【００５０】
上記ＰＣＲで取得したｓａｃＢ断片とｃａｔ断片を鋳型として、プライマーＤＮＡ４５とプライマーＤＮＡ４８をプライマーセットとしてＰＣＲを行い、二つの遺伝子の向きが同一方向に連結したＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で３分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製したｓａｃＢ断片１μｌとｃａｔ断片１μｌを用いた。各プライマーは各々２０ｐｍｏｌ反応液に添加した。
【００５１】
上記ＰＣＲにて取得した断片を、電気泳動後ゲルから切り出し、ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、最終的に各々５０μｌのＤＮＡ溶液を得た。
該ＤＮＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔにて、プラスミドｐＣＲ２．１中ににクローニングすることで、プラスミドｐＣＲ２．１＿ｓａｃＢ＿２００＿ｃａｔを作製した（クローニングの方法はキットに付属の指示書に従った）。ｐＣＲ２．１＿ｓａｃＢ＿２００＿ｃａｔ のｓａｃＢ遺伝子とｃａｔ遺伝子を連結させた部分の構造を図１に示した。
【００５２】
次に配列番号１３で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ１３、配列番号１４で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ１４をプライマーセットとして用い、ｐＣＲ２．１＿ｓａｃＢ＿２００＿ｃａｔプラスミドを鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製プラスミドＤＮＡ４０ｎｇを用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００５３】
上記ＰＣＲにて、ｓａｃＢ遺伝子、ｃａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｓａｃＢ ＋ ｃａｔ断片）を取得した。該ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）により分離し、該ＤＮＡ断片をゲルから切り出して、ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、最終的に５０μｌのＤＮＡ溶液を得た。
【００５４】
次に、上流アーム、下流アーム断片およびｓａｃＢ ＋ ｃａｔ断片の３つのＤＮＡ断片を混合したものを鋳型として、配列番号１５で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４４８６７０９〜４４８６７３４ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号１６で表される塩基配列からなるプライマー１６ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４５３４５９９〜４５３４５７５ｂｐに相当塩基配列からなるＤＮＡ）をプライマーセットに用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製上流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製下流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製ｓａｃＢ ＋ ｃａｔ遺伝子断片１．５μｌを用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００５５】
上記ＰＣＲにて、ｓａｃＢ遺伝子とｃａｔ遺伝子が結合したＤＮＡの両端に、欠失対象領域の両端および上流アーム、下流アームが付加したＤＮＡ断片を増幅ＤＮＡ断片として取得した。該ＤＮＡ断片は上記と同様の方法によりアガロースゲル電気泳動法により分離し、該ＤＮＡ断片を含む部分をゲルから切り出し、精製した。
【００５６】
精製したＤＮＡ断片を、コンビテントセル溶液に添加し、実施例２と同様の方法でエレクトロポレーションによりＷ３１１０ｒｅｄ株に導入し、ＬＢｃｍプレート上で形質転換株を選択した。選択された形質転換株のコロニーをＳｕＬＢ寒天培地〔１０ｇ／ｌ バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、１０％ シュークロース、２０ｍｇ／ｌ カナマイシン、１５ｍｇ／ｌ クロラムフェニコール、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム）プレートにレプリカし、シュークロース感受性を示す株を選択した。
【００５７】
選択された株の染色体ＤＮＡ上において欠損対象領域である４４８７７０９〜４５３３５９９ｂｐがｓａｃＢ遺伝子とｃａｔ遺伝子との結合ＤＮＡと置換していることを確認するため、以下の実験を行った。
形質転換に用いた直鎖ＤＮＡのアーム配列末端からさらに上流および下流にそれぞれ１ｋｂ離れた領域に相同な塩基配列を有する配列番号９で表される塩基配列からなるプライマー９および配列番号１１で表される塩基配列からなるプライマー１１をプライマーセットに用いて、選択された株のコロニーを直接鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては爪楊枝の先で拾った少量の菌体をＰＣＲ反応液に懸濁して鋳型とした。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００５８】
その結果、約６．７ｋｂの増幅断片が得られた。プライマーＤＮＡ９および１１をプライマーセットに用い、目的とする欠損が導入されたクロラムフェニコール耐性、シュークロース感受性株の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲによって取得される増幅ＤＮＡ断片は、ｓａｃＢ 遺伝子とｃａｔ遺伝子の結合体（２．７ｋｂ）の両端にそれぞれ約２ｋｂのＤＮＡが付加されたＤＮＡ断片（約６．６ｋｂ）であることから、目的とする形質転換株が得られたことを確認し、該形質転換株をΔＥ＿ｓｕｃ株（欠損領域４４８７７０９〜４５３３５９９ｂｐ）と命名した。
【００５９】
ΔＥ＿ｓｕｃ株の製造法と同様の方法により、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の２６２８９２〜２９７０１６ｂｐの領域が欠損した株（ΔＡ＿ｓｕｃ株）、５６４０１７〜５８４８７９ｂｐの領域が欠損した株（ΔＣ＿ｓｕｃ）、１１９６０８９〜１２２３１３１ｂｐの領域が欠損した株（ΔＤ＿ｓｕｃ）、１４１７３４５〜１４３２２８２ｂｐの領域が欠損した株（ΔＦ＿ｓｕｃ）、１５０６８３７〜１５１７１２５の領域が欠損した株（ΔＧ＿ｓｕｃ）、１８０５４０３〜１８１１７３３ｂｐの領域が欠損した株（ΔＨ＿ｓｕｃ）、２３１８０６２〜２３３２４２３ｂｐの領域が欠損した株（ΔＫ＿ｓｕｃ）、２７５４１５９〜２７８８００４ｂｐの領域が欠損した株（ΔＬ＿ｓｕｃ）、３１０８６０６〜３１３２８３９ｂｐ（ΔＭ＿ｓｕｃ）、３４５１１４４〜３４６７４９１ｂｐの領域が欠損した株（ΔＣＧＳＣ＿ｓｕｃ）を取得することができる。
【００６０】
実施例４ ストレプトマイシン耐性でλＲｅｄ系を有する株の作製
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ｒｐｓＬ株（東京都立大学加藤潤一教授より入手可能）を親株として、λＲｅｄ組換え系を導入した。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＭ２２株［Δ（ｒｅｃＣ ｐｔｒｒｅｃＢ ｒｅｃＤ）：：Ｐｌａｃ −ｒｅｄ ｋａｎ］（米国マサチューセッツ医科大学のＫｅｎｅｎ Ｃ． Ｍｕｒｐｈｙ博士より入手可能）よりＰ１ファージを以下の方法により調製した。
【００６１】
２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む１０ｍｌのＬＢ培地〔１０ｇ／ｌ バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、１０ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム〕を用いて３０℃にて１６時間培養したＫＭ２２株の培養液 ０．５ｍｌと、１．４ｍｌの新しいＬＢ培地および１００μｌの０．１ｍｍｏｌ／ｌ 塩化カルシウム溶液とを混合した。３０℃にて５〜６時間振とう培養した後、４００μｌの培養液を滅菌チューブに移した。該チューブに２μｌのＰ１ファージストック（東京大学分子細胞生物学研究所より入手可能）を添加し、３７℃にて１０分間保温した。次に５０℃に保温した３ｍｌのソフトアガー溶液（１０ｇ／ｌ バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｍｍｏｌ／ｌ 塩化カルシウム、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム、３ｇ／ｌ 寒天）を添加し、よく攪拌した後に、Ｃａ−ＬＢ寒天培地プレート（１０ｇ／ｌ バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｍｍｏｌ／ｌ 塩化カルシウム、１ｍｌ／ｌ １ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム、１５ｇ／ｌ 寒天、プレートの直径は１５ｃｍ）上にまいた。該プレートを３７℃で７時間培養した後、スプレッダーでソフトアガー部分を細かく砕いて回収した。回収したソフトアガーを１５００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離した。得られた上清１．５ｍｌに対し１００μｌのクロロホルムを添加し、４℃にて一晩保存した後、１５０００ｇにて２分間遠心分離し、その上清をファージストックとして４℃で保存した。
【００６２】
次に上記で取得したファージを用いてＭＧ１６５５ｒｐｓＬ株を形質転換した。５ｍｌのＣａ−ＬＢ液体培地を用いて３０℃、４時間培養したＷ３１１０株培養液から２００μｌ分取し、ファージストックを１μｌ添加した。３７℃で１０分間保温した後、５ｍｌのＬＢ液体培地と２００μｌの１ｍｏｌ／ｌ クエン酸ナトリウム溶液を添加し、攪拌した。１５００ｇ、２５℃にて１０分間遠心分離した後、上清を捨て、得られた細胞に１ｍｌのＬＢ液体培地と１０μｌの１ｍｏｌ／ｌ クエン酸ナトリウム溶液を加え３０℃にて２時間保温した。該溶液１００μｌを２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム３寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に塗布し、３０℃で一晩培養した。翌日出現したコロニー２４個をそれぞれ、２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム３寒天培地に塗布し、カナマイシン耐性株を選抜することにより、Δ（ｒｅｃＣｐｔｒ ｒｅｃＢ ｒｅｃＤ）：：Ｐｌａｃ −ｒｅｄ ｋａｎ）領域が形質導入されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ｒｓｈ株〔ＭＧ１６５５、ｒｐｓＬ、Δ（ｒｅｃＣ ｐｔｒ ｒｅｃＢｒｅｃＤ）：：Ｐｌａｃ −ｒｅｄ ｋａｎを取得した。
【００６３】
実施例５ ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を二つ用いた染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂｐ以上の領域を欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの製造
実施例４で取得したλＲｅｄ遺伝子群を導入したＭＧ１６５５ｒｓｈ株を宿主微生物に用い、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子としてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のストレプトマイシン感受性リボソーマルタンパク遺伝子（ｒｐｓＬ、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． Ｊ０１６８８）を有する直鎖ＤＮＡを用いて、以下の方法によりＭＧ１６５５ｒｓｈ株の染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂ以上の領域が欠損した形質転換株を作製した。
【００６４】
染色体上の形質転換が可能なコンピテントセルは実施例２と同様の方法により作製した。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＫ−１２株の染色体配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｕ０００９６）で４９８３０６〜５５２３８７ｂｐまでの領域約５４ｋｂｐを欠損させるための直鎖ＤＮＡ断片を、以下のようにして作製した。
【００６５】
配列番号１７で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ１７（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４９６８０４〜４９６８２８ｂｐに相当する塩基配列を有するＤＮＡ）、配列番号１８で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ１８（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４９８３０５〜４９８２８０ｂｐに相当する塩基配列に２７ｍｅｒのリンカー配列を付加した塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号１９で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ１９ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の５５３８８８〜５５３８６３ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号２０で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ２０（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の５５２３８８〜５５２４１２ｂｐに相当する塩基配列に２９ｍｅｒのリンカー配列を付加したＤＮＡ）を合成した。ＭＧ１６５５ｒｓｈ株の染色体ＤＮＡを鋳型して、プライマーＤＮＡ１７と１８、またはプライマーＤＮＡ１９と２０をプライマーセットとしてそれぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製した染色体ＤＮＡ１００ｎｇまたは爪楊枝の先で拾った少量の菌体を用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００６６】
上記ＰＣＲにて、欠損対象領域の両端に位置する染色体ＤＮＡ配列とそれぞれ相同な１．５ｋｂの領域（アーム）を取得した。以下、プライマーＤＮＡ１７と１８をプライマーセットとして増幅されたＤＮＡ断片を上流アーム、プライマーＤＮＡ１９と２０をプライマーセットとして増幅されたＤＮＡ断片を下流アームと呼ぶ。
【００６７】
次にｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子およびｃａｔ遺伝子を含む断片を、以下の方法により取得した。東京都立大学理学部加藤潤一教授より入手することができるｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子、ｃａｔ遺伝子の順に配列されたＤＮＡ断片を有するｍｉｎｉＦ＿ＳａｃＩ＿１＿１０プラスミドを鋳型として、配列番号２１で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ２１および配列番号２２で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ２２をプライマーセットとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製プラスミドＤＮＡ４０ｎｇを用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００６８】
上記ＰＣＲにて、ｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子およびｃａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、マーカーユニット断片という）を増幅ＤＮＡ断片として取得した。該増幅ＤＮＡ断片の構造を図２に示した。
次に、上記で取得した上流アーム、下流アームと、マーカーユニット断片を混合したものを鋳型として、配列番号２３で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ２３（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４９７３２８〜４９７３５２ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号２４で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ２４ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の５５３３８８〜５５３３６４ｂｐに相当する塩基配列を有するＤＮＡ）をプライマーセットとして用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製上流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製下流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製マーカーユニット断片１．５μｌを用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００６９】
上記ＰＣＲにて、マーカーユニット断片の両端にそれぞれ１．５ｋｂの上流アームおよび下流アームが付加した増幅ＤＮＡ断片を取得した。該増幅ＤＮＡ断片を上記と同様の方法によりアガロースゲル電気泳動法により分離し、目的とするＤＮＡ断片をゲルから切り出し、精製した。
精製したＤＮＡ断片を、先に作製したＭＧ１６５５ｒｓｈ株のコンピテントセル溶液に添加し、実施例２と同様の方法でエレクトロポレーションによりＤＮＡ断片をＭＧ１６５５ｒｓｈ株に導入し、ＬＢｃｍプレート上で形質転換株を選択した。取得した形質転換株のコロニーをＳｕＬＢ寒天培地ならびにＳｔＬＢ寒天培地（１０ｇ／ｌ バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、１０ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、５０ｍｇ／ｌ ストレプトマイシン、２０ｍｇ／ｌ カナマイシン、１５ｍｇ／ｌ クロラムフェニコール、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム）プレートにそれぞれレプリカし、シュークロースおよびストレプトマイシン感受性を示す株を選択した。
【００７０】
選択された株の染色体ＤＮＡ上において欠損対象領域である４９８３０６〜５５２３８７ｂｐがマーカーユニット断片と置換していることを確認するため、以下の実験を行った。
配列番号１７で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ１７と配列番号１９で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ１９をプライマーセットに用い、選択された形質転換株のコロニーを直接鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては爪楊枝の先で拾った少量の菌体をＰＣＲ反応液に懸濁して鋳型とした。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００７１】
その結果、約８．０ｋｂの増幅断片が得られた。プライマーＤＮＡ１７および１８をプライマーセットに用い、目的とする欠損が導入されたクロラムフェニコール耐性、シュークロース感受性、ストレプトマイシン感受性株の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲによって取得される増幅ＤＮＡ断片は、ｓａｃＢ 遺伝子、ｃａｔ遺伝子、およびｒｐｓＬ遺伝子を含むマーカーユニット（５．０ｋｂ）の両端にそれぞれ約１．５ｋｂのＤＮＡが付加されたＤＮＡ断片（約８．０ｋｂ）であることから、目的とする形質転換株が得られたことを確認し、該形質転換株をΔ２８−１＿ｓｓ株（欠失領域４９８３０６〜５５２３８７ｂｐ）と命名した。
【００７２】
Δ２８−１＿ｓｓ株の製造法と同様の方法により、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の２１９４４４４〜２２４０９６２ｂｐの領域が欠損した株（Δ１６−２＿ｓｓ）、４２７３３３７〜４３５９０００ｂｐの領域が欠損した株（Δ４−１＿ｓｓ）、１０４２１７８〜１１２０４６７ｂｐの領域が欠損した株（Δ１７−１＿ｓｓ）、５６４２７７〜６４３３７１ｂｐの領域が欠損した株（Δ１２−１＿ｓｓ）、５６４２７７〜６０８４５４ｂｐの領域が欠損した株（Δ１２−Ｃ＿ｓｓ）、５６４２７７〜６０１０４９ｂｐの領域が欠損した株（Δ１２−Ｄ＿ｓｓ）、４２７３２６５〜４３５０４５０ｂｐの領域が欠損した株（Δ０４−Ｂ＿ｓｓ）、４２７３２６５〜４３２７８１３ｂｐの領域が欠損した株（Δ０４−Ｄ＿ｓｓ）、３２１４４２０〜３２６７６６９ｂｐの領域が欠損した株（Δ５−１＿ｓｓ）、３７２３２１９〜３７６９３７１ｂｐの領域が欠損した株（Δ２−２＿ｓｓ）、２８２１９１１〜２８６４５５１ｂｐの領域が欠損した株（Δ２１−１＿ｓｓ）、２３６８４４〜３８７９２４ｂｐの領域が欠損した株（Δ９−１＿ｓｓ）、２３４６５５２〜２４２０６６７ｂｐの領域が欠損した株（Δ１３−１＿ｓｓ）、２４４７１６６〜２５１７２３４ｂｐの領域が欠損した株（Δ１１−１＿ｓｓ）、２９６４１７０〜３０３１６５３ｂｐの領域が欠損した株（Δ８−１＿ｓｓ）、３６１６６１９〜３７１５９４２ｂｐの領域が欠損した株（Δ２−１＿ｓｓ）、１１９５７２０〜１２５７００１ｂｐの領域が欠損した株（Δ１８−１＿ｓｓ）、１３８４６９１〜１５８８７５１ｂｐの領域が欠損した株（Δ２０−１＿ｓｓ）、２０４２７５６〜２０８３０６５ｂｐの領域が欠損した株（Δ１６−１−１＿ｓｓ）、２０８３０６３〜２１９２１７７ｂｐの領域が欠損した株（Δ１６−１−２＿ｓｓ）、２２８４３９１〜２３３４７７０ｂｐの領域が欠損した株（Δ１４−１＿ｓｓ）、２５５５３４９〜２６１６０４６ｂｐの領域が欠損した株（Δ１０−１＿ｓｓ）、２７５１５８９〜２８１２２３５ｂｐの領域が欠損した株（Δ２２＿ｓｓ）、２８２１９１１〜２８６４５５０ｂｐの領域が欠損した株（Δ２１＿ｓｓ）、３０９２０２１〜３１６０７０３ｂｐの領域が欠損した株（Δ７−１＿ｓｓ）、４４８６０４０〜４５９７７７５ｂｐの領域が欠損した株（Δ１−１＿ｓｓ）を製造することができた。
【００７３】
実施例６ 薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が削除された染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂｐ以上の領域を欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの製造
実施例３で取得されたΔＥ＿ｓｕｃ株からｃａｔ遺伝子およびｓｕｃＢ遺伝子が削除されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを、以下の方法により製造した。
【００７４】
配列番号２５で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ２５ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４５３３６２０〜４５３３６００ｂｐと４４８７７０８〜４４８７６８５に相当する塩基配列を結合した塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号２６で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ２６ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４４８７６８５〜４４８７７０ ｂｐと４５３３６００〜４５３３６２０に相当する塩基配列を結合した塩基配列からなるＤＮＡ）を合成した。
【００７５】
次に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株の染色体ＤＮＡを鋳型に、プライマーＤＮＡ９とプライマーＤＮＡ２５、またはプライマーＤＮＡ１１とプライマーＤＮＡ２６のプライマーセットを用いてそれぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製染色体ＤＮＡ１００ｎｇまたは爪楊枝の先で拾った少量の菌体を用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００７６】
上記ＰＣＲにて、欠損対象領域の両端に位置する染色体ＤＮＡ配列とそれぞれ相同な配列を有する１ｋｂのＤＮＡ断片（アーム）を取得した。以下、プライマーＤＮＡ９と２５をプライマーセットとして増幅されたＤＮＡ断片を上流アーム、プライマーＤＮＡ１１と２６をプライマーセットとして増幅されたＤＮＡ断片を下流アームと呼ぶ。得られたＤＮＡ断片は、それぞれＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、次にそれらを混合したものを鋳型として、プライマーＤＮＡ１５と１６プライマーセットとして用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製上流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製下流アームＤＮＡ溶液１μｌを用いた。
【００７７】
上記ＰＣＲにて、上記アーム同士が結合した２ｋｂの断片を増幅ＤＮＡ断片として取得し、ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。
実施例２と同様の方法で、ΔＥ＿ｓｕｃ株を培養してコンピテントセル溶液を作製し、精製したＤＮＡ断片を添加し、エレクトロポレーションにより該ＤＮＡ断片をΔＥ＿ｓｕｃ株に導入した。選択培地には、ＳｕＬＢ寒天培地を用いた。選択された形質転換株のコロニーをＬＢｃｍ寒天プレートにレプリカし、クロラムフェニコール感受性を示す株を選択した。
【００７８】
プライマーＤＮＡ１５および１６をプライマーセットに用い、選択されたシュークロース耐性、クロラムフェニコール感受性コロニーを直接鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては爪楊枝の先で拾った少量の菌体をＰＣＲ反応液に懸濁して鋳型とした。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００７９】
その結果、約４．０ｋｂの増幅断片が得られた。プライマーＤＮＡ１５および１６をプライマーセットに用い、目的とする置換が導入され、ｓｕｃＢ遺伝子およびｃａｔ遺伝子が削除されたシュークロース耐性、クロラムフェニコール感受性株の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲによって取得される増幅ＤＮＡ断片は、アームの両外側の１ｋｂと両アーム領域の１ｋｂが増幅されることから約４ｋｂのバンドが増幅するので、上記方法によりマーカー遺伝子が残らない染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂ以上の領域が欠損した染色体ＤＮＡ部分欠失株（ΔＥ株）が製造できたことが確認された。
【００８０】
ΔＥ株の製造法と同様の方法により、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの染色体ＤＮＡ上の２６２８９２〜２９７０１６ｂｐの領域が欠損した株（ΔＡ株）、５６４０１７〜５８４８７９ｂｐの領域が欠損した株（ΔＣ株）、１１９６０８９〜１２２３１３１ｂｐの領域が欠損した株（ΔＤ株）、１４１７３４５〜１４３２２８２ｂｐの領域が欠損した株（ΔＦ株）、１５０６８３７〜１５１７１２５ｂｐの領域が欠損した株（ΔＧ株）、２３１８０６２〜２３３２４２３ｂｐの領域が欠損した株（ΔＫ株）、２７５４１５９〜２７８８００４ｂｐの領域が欠損した株（ΔＬ株）、３１０８６０６〜３１３２８３９ｂｐの領域が欠損した株（ΔＭ株）、３４５１１４４〜３４６７４９１ｂｐの領域が欠損した株（ΔＣＧＳＣ）を製造することができた。
【００８１】
次に、実施例５で作製したΔ２８＿ｓｓ株からｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子およびｃａｔ遺伝子を削除した株を、以下の方法により製造した。
配列番号２７で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ２７（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の５５２４１２〜５５２３８８ｂｐと４９８３０６〜４９８２８０ｂｐに相当する塩基配列を結合した塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号２８で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ２８ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４９８２８０〜４９８３０４ｂｐと５５２３８８〜５５２４１２ｂｐに相当する塩基配列を結合した塩基配列からなるＤＮＡ）を合成した。
【００８２】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉゲノムを鋳型に、プライマーＤＮＡ１７とプライマーＤＮＡ２７、またはプライマーＤＮＡ１９とプライマーＤＮＡ２８のプライマーセットを用いてそれぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製染色体ＤＮＡ１００ｎｇまたは爪楊枝の先で拾った少量の菌体を用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００８３】
上記ＰＣＲにて、欠損対象領域の両端に位置する染色体ＤＮＡの塩基配列とそれぞれ相同な配列を有する１ｋｂの増幅ＤＮＡ断片（アーム）を取得した。以下、プライマーＤＮＡ１７と２７をプライマーセットとして増幅されたＤＮＡ断片を上流アーム、プライマーＤＮＡ１９と２８をプライマーセットとして増幅されたＤＮＡ断片を下流アームと呼ぶ。該ＤＮＡ断片はそれぞれＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）で精製し、それらを混合したものを鋳型として、プライマーＤＮＡ２３と２４を用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製上流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製下流アームＤＮＡ溶液１μｌを用いた。
【００８４】
上記ＰＣＲにて、上記アーム同士が結合した２ｋｂの断片を取得し、ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて精製した。
実施例２と同様の方法で、Δ２８＿ｓｓ株を培養してコンピテントセル溶液を作製し、精製したＤＮＡ断片を添加し、エレクトロポレーションにより該ＤＮＡ断片をΔ２８＿ｓｓ株に導入した。選択培地には、ＳｕＳｔＬＢ寒天培地 （１０ｇ／ｌ バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、１０％ シュークロース、２０ｍｇ／ｌ カナマイシン、５０ｍｇ／ｌ ストレプトマイシン、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム）を用いた。選択された形質転換株のコロニーをＬＢｃｍ寒天培地プレート上にレプリカし、クロラムフェニコール感受性を示す株を選択した。
【００８５】
プライマーＤＮＡ１７および１９をプライマーセットとして用い、選択されたシュークロース耐性、ストレプトマイシン耐性、クロラムフェニコール感受性コロニーを直接鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては爪楊枝の先で拾った少量の菌体をＰＣＲ反応液に懸濁して鋳型とした。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００８６】
その結果、約３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が取得された。プライマーＤＮＡ１７および１９をプライマーセットに用いた、目的とする置換が導入され、ｓｕｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子およびｃａｔ遺伝子が削除されたシュークロース耐性、ストレプトマイシン耐性、クロラムフェニコール感受性株の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲによって取得される増幅ＤＮＡ断片は、アームの両外側の０．５ｋｂと両アーム領域の１ｋｂが増幅されることから約３ｋｂのバンドが増幅するので、上記方法によりマーカー遺伝子が残らない染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂ以上の領域が欠損した染色体ＤＮＡ部分欠損株（Δ２８株）が製造できたことが確認された。
【００８７】
Δ２８株の製造法と同様の方法により、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの染色体ＤＮＡ上の２１９４４４４〜２２４０９６２ｂｐの領域が欠損した株（Δ１６−２）、４２７３３３７〜４３５９０００ｂｐの領域が欠損した株（Δ４−１）、１０４２１７８〜１１２０４６７ｂｐの領域が欠損した株（Δ１７−１）、５６４２７７〜６４３３７１ｂｐの領域が欠損した株（Δ１２−１）、３２１４４２０〜３２６７６６９ｂｐの領域が欠損した株（Δ５−１）、３７２３２１９〜３７６９３７１ｂｐの領域が欠損した株（Δ２−２）、２３６８４４〜３８７９２４ｂｐの領域が欠損した株（Δ９−１）、２３４６５５２〜２４２０６６７ｂｐの領域が欠損した株（Δ１３−１）、２４４７１６６〜２５１７２３４ｂｐの領域が欠損した株（Δ１１−１）、２９６４１７０〜３０３１６５３ｂｐの領域が欠損した株（Δ８−１）、３６１６６１９〜３７１５９４２ｂｐの領域が欠損した株（Δ２−１）、２０８３０６３〜２１９２１７７ｂｐの領域が欠損した株（Δ１６−１−２）、２２８４３９１〜２３３４７７０ｂｐの領域が欠損した株（Δ１４−１）、２５５５３４９〜２６１６０４６ｂｐの領域が欠損した株（Δ１０−１）、２７５１５８９〜２８１２２３５ｂｐの領域が欠損した株（Δ２２）、２８２１９１１〜２８６４５５０ｂｐの領域が欠損した株（Δ２１）、４４８６０４０〜４５９７７７５ｂｐの領域が欠損した株（Δ１−１）を製造することができた。
【００８８】
実施例７ 多重欠損体の製造法１（λｒｅｄを利用した段階的な欠損導入）
染色体ＤＮＡの多重欠損株を、実施例３または実施例５で記載したネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を利用した染色体ＤＮＡの置換または欠損株の製造法と、実施例６に記載した薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が削除された染色体ＤＮＡの部分欠損株の製造法を交互に行うことにより製造した。
【００８９】
ＭＧ１６５５ｒｓｈ株のコンピテントセルは実施例２と同様の方法により作製した。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＫ−１２株の染色体ＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｕ０００９６）で５６４２７７〜６４３３７１ｂｐまでの領域約７９ｋｂｐを欠損させるための直鎖ＤＮＡ断片を以下のように作製した。
【００９０】
配列番号２９で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ２９ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の５６２７８８ 〜 ５６２８１２ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号３０で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ３０ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の５６４２７６〜５６４２５２ｂｐに相当する塩基配列に２７ｍｅｒのリンカー配列を付加した塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号３１で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ３１ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の６４４８６８〜６４４８４４ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号３２で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ３２ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の６４３３７２〜６４３３９６ｂｐに相当する塩基配列に２９ｍｅｒのリンカー配列を付加した塩基配列からなるＤＮＡ）を合成した。
【００９１】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＫ−１２株の染色体ＤＮＡを鋳型に、プライマーＤＮＡ２９と３０、またはプライマーＤＮＡ３１と３２のプライマーセットを用いてそれぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製染色体ＤＮＡ１００ｎｇまたは爪楊枝の先で拾った少量の菌体を用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００９２】
上記ＰＣＲにて、欠損対象領域の両端に位置する染色体ＤＮＡ配列とそれぞれ相同な塩基配列を有する１ｋｂのＤＮＡ断片（アーム）を取得した。以下、プライマーＤＮＡ２９と３０のプライマーセットで増幅したＤＮＡ断片を上流アーム、プライマーＤＮＡ３１と３２のプライマーセットで増幅したＤＮＡ断片を下流アームと呼ぶ。
【００９３】
次にプライマーＤＮＡ２１およびプライマーＤＮＡ２２を用い、ｍｉｎｉＦプラスミドｍｉｎｉＦ＿ＳａｃＩ＿１＿１０を鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製プラスミドＤＮＡ４０ｎｇを用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００９４】
上記ＰＣＲにて、実施例４と同様にｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子、ｃａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片（マーカーユニット断片）を取得した。
次に、上記で取得した上流アーム、下流アーム断片、およびマーカーユニット断片の３つのＤＮＡ断片を混合したものを鋳型として、配列番号３３で表される塩基配列からなるＤＮＡ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の５６３２７６〜５６３３１０ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号３４で表される塩基配列からなるＤＮＡプライマー３４ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の６４４３６６〜６４４３４２ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）をプライマーセットとして用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製上流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製下流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製マーカーユニット断片１．５μｌを用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００９５】
上記ＰＣＲにて、マーカーユニットの両端にそれぞれ上流アーム（１ｋｂ）および下流アーム（１ｋｂ）が付加した増幅ＤＮＡ断片を取得した。該ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法により分離し、目的の断片をゲルから切り出して、精製した。
実施例２と同様の方法により、精製したＤＮＡ断片を、ＭＧ１６５５ｒｓｈ株のコンピテントセル溶液に添加し、エレクトロポレーションによりＭＧ１６５５ｒｓｈ株に導入し、選択培地に、ＬＢｃｍ寒天培地を用いて形質転換株を選択した。選択された形質転換株のコロニーをＬＢｃｍ寒天培地プレート上にレプリカし、クロラムフェニコール耐性を示す株を選択した。選択されたコロニーをＳｕＬＢ寒天培地ならびにＳｔＬＢ寒天培地プレートにそれぞれレプリカし、シュークロースおよびストレプトマイシン感受性を示す株を選択した。
【００９６】
プライマーＤＮＡ２９と３１をプライマーセットに用い、選択されたクロラムフェニコール耐性、シュークロース感受性、ストレプトマイシン感受性コロニーを直接鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては爪楊枝の先で拾った少量の菌体をＰＣＲ反応液に懸濁して鋳型とした。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００９７】
その結果、約８ｋｂｐの増幅断片が得られた。プライマーＤＮＡ２９および３１をプライマーセットに用いた、目的とする置換が導入され、ｓｕｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子およびｃａｔ遺伝子が挿入されたシュークロース感受性、ストレプトマイシン感受性、クロラムフェニコール耐性株の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲによって取得される増幅ＤＮＡ断片は、アームの両外側の０．５ｋｂ、両アーム領域の１ｋｂおよびｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子、ｃａｔ遺伝子ユニットの５ｋｂが増幅されることから、約８ｋｂのバンドが増幅するので、上記方法により目的の染色体ＤＮＡ部分欠損株（Δ１２−１＿ｓｓ株）が取得できたことを確認した。
【００９８】
配列番号３５で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ３５ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の６４３３９６〜６４３３７０と５６４２７６〜５６４２５２に相当する塩基配列を結合した塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号３６で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ３６ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の５６４２５２〜５６４２７６と６４３３７０〜６４３３９６に相当する塩基配列を結合した塩基配列からなるＤＮＡ）を合成した。
【００９９】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株の染色体ＤＮＡを鋳型に、プライマーＤＮＡ２９と３５、またはプライマーＤＮＡ３０と３６のプライマーセットを用いて、それぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製した染色体ＤＮＡ１００ｎｇまたは爪楊枝の先で拾った少量の菌体を用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【０１００】
上記ＰＣＲにて、欠損対象領域の両端に位置する染色体ＤＮＡ配列とそれぞれ相同な塩基配列を有する１ｋｂのＤＮＡ断片（アーム）を取得した。以下、プライマーＤＮＡ２９と３５をプライマーセットとして増幅されたＤＮＡ断片を上流アーム、プライマーＤＮＡ３０と３６をプライマーセットとして増幅されたＤＮＡ断片を下流アームと呼ぶ。取得したＤＮＡ断片をそれぞれＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン）で精製し、それらを混合したものを鋳型として、プライマーＤＮＡ３３と３４をプライマーセットとして用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製上流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製下流アームＤＮＡ溶液１μｌを用いた。
【０１０１】
上記ＰＣＲにて、２つのアーム同士が結合した２ｋｂの断片を取得し、ＱＩＡ ｑｕｉｃｋＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて精製した。
実施例２と同様の方法により、精製したＤＮＡ断片を、Δ１２−１＿ｓｓ株のコンピテントセル溶液に添加し、エレクトロポレーションによりΔ１２−１＿ｓｓ株に導入し、選択培地にＳｕＳｔＬＢ寒天培地を用いて形質転換株を選択した。
【０１０２】
選択した形質転換株のコロニーをＬＢｃｍ寒天培地プレート上にレプリカし、クロラムフェニコール感受性を示す株を選択した。
プライマーＤＮＡ２９と３１をプライマーセットに用い、取得したシュークロース耐性、ストレプトマイシン耐性、クロラムフェニコール感受性コロニーを直接鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては爪楊枝の先で拾った少量の菌体をＰＣＲ反応液に懸濁して鋳型とした。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【０１０３】
その結果、約３ｋｂｐの増幅断片が得られた。プライマーＤＮＡ２９および３１をプライマーセットに用いた、目的とする置換が導入され、ｓｕｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子およびｃａｔ遺伝子が削除されたシュークロース耐性、ストレプトマイシン耐性、クロラムフェニコール感受性株の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲによって取得される増幅ＤＮＡ断片は、アームの両外側の０．５ｋｂ、両アーム領域の１ｋｂが増幅されることから、約３ｋｂのバンドが増幅するので、上記方法により目的のマーカー遺伝子が削除された染色体部分欠損株（Δ１２−１株）が取得できたことを確認した。
【０１０４】
次に、Δ１２−１株の染色体ＤＮＡ配列で３２１４４２０〜３２６７６６９ｂｐ（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ． Ｕ０００９６での位置）までの領域約５３ｋｂｐを欠失させるための直鎖ＤＮＡ断片を以下のように作製した。
配列番号３７で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ３７ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体上の３２１２９２０〜３２１２９４４ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号３８で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ３８ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の３２１４４１９〜３２１４３９５ ｂｐに相当する塩基配列に２７ｍｅｒのリンカー配列を付加した塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号３９で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ３９ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の３２６９１６９〜３２６９１４５ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ） 、配列番号４０で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ４０ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の３２６７６７０〜３２６７６９４ｂｐに相当する塩基配列に２９ｍｅｒのリンカー配列を付加した塩基配列からなるＤＮＡ）を合成した。
【０１０５】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株の染色体ＤＮＡを鋳型に、プライマーＤＮＡ３７と３８、またはプライマーＤＮＡ３９と４０のプライマーセットを用いて、それぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製した染色体ＤＮＡ１００ｎｇまたは爪楊枝の先で拾った少量の菌体を用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【０１０６】
上記ＰＣＲにて、欠損対象領域の両端に位置する染色体ＤＮＡ配列とそれぞれ相同な塩基配列を有する１ｋｂのＤＮＡ断片（アーム）を取得した。以下、プライマーＤＮＡ３７と３８のプライマーセットで増幅したＤＮＡ断片を上流アーム、プライマーＤＮＡ３９と４０のプライマーセットで増幅したＤＮＡ断片を下流アームと呼ぶ。
【０１０７】
次にプライマーＤＮＡ２１と２２をプライマーセットに用い、ｍｉｎｉＦプラスミドｍｉｎｉＦ＿ＳａｃＩ＿１＿１０を鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製プラスミドＤＮＡ４０ｎｇを用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【０１０８】
上記ＰＣＲにて、実施例５と同様にｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子、ｃａｔ遺伝子を含む断片（マーカーユニット断片）を取得した。
次に、上記で取得した上流アーム、下流アーム、マーカーユニット断片を混合したものを鋳型として、配列番号４１で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ４１ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の３２１３４２０〜３２１３４４４ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号４２で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ４２ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の３２６８６４５〜３２６８６２１ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）をプライマーセットに用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製上流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製下流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製マーカーユニット断片１．５μｌを用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【０１０９】
上記ＰＣＲにて、マーカーユニットの両端にそれぞれ上流アーム（１ｋｂ）および下流アーム（１ｋｂ）が付加した増幅ＤＮＡ断片を取得した。該断片をアガロースゲル電気泳動法により分離し、目的とする断片をゲルから切り出して、精製した。
精製したＤＮＡ断片を、Δ１２−１株のコンピテントセル溶液に添加し、実施例２と同様の方法でエレクトロポレーションによりΔ１２−１株に導入し、選択培地にＬＢｃｍ寒天培地を用いて形質転換体を選択した。選択した形質転換株のコロニーをＳｕＬＢ寒天培地ならびにＳｔＬＢ寒天培地プレート上にレプリカし、シュークロースおよびストレプトマイシン感受性を示す株を選択した。
【０１１０】
プライマーＤＮＡ３７と３９をプライマーセットとして用い、取得したクロラムフェニコール耐性、シュークロース感受性、ストレプトマイシン感受性コロニーを直接鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては爪楊枝の先で拾った少量の菌体をＰＣＲ反応液に懸濁して鋳型とした。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【０１１１】
その結果、約８ｋｂの増幅断片が得られた。プライマーＤＮＡ３７および３９をプライマーセットに用いた、目的とする置換が導入され、ｓｕｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子およびｃａｔ遺伝子が挿入されたシュークロース感受性、ストレプトマイシン感受性、クロラムフェニコール耐性株の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲによって取得される増幅ＤＮＡ断片は、アームの両外側の０．５ｋｂ、両アーム領域の１ｋｂおよびｓｕｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子およびｃａｔ遺伝子からなるマーカーユニットの５ｋｂが増幅されることから、約８ｋｂのバンドが増幅するので、上記方法により目的のマーカー遺伝子が挿入された染色体部分欠損株（Δ１２−１Δ５−１＿ｓｓ株）が取得できたことを確認した。
【０１１２】
次に、配列番号４３で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ４３ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の３２６７６９４〜３２６７６７０ｂｐおよび ３２１４４１９〜３２１４３９５ｂｐに相当する塩基配列を結合した塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号４４で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ４４ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の３２１４３９５〜 ３２１４４１９ｂｐおよび３２６７６７０〜３２６７６９４ｂｐに相当する塩基配列を結合した塩基配列からなるＤＮＡ）を合成した。
【０１１３】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株の染色体ＤＮＡを鋳型に、プライマーＤＮＡ３７と４３、またはプライマーＤＮＡ３９と４４のプライマーセットを用いてそれぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製した染色体ＤＮＡ１００ｎｇまたは爪楊枝の先で拾った少量の菌体を用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【０１１４】
上記ＰＣＲにて、欠損対象領域の両端に位置する染色体ＤＮＡ配列とそれぞれ相同な塩基配列を有する１ｋｂのＤＮＡ断片（アーム）を取得した。取得したＤＮＡ断片は、それぞれＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン）で精製し、それらを混合したものを鋳型として、プライマーＤＮＡ４１と４２を用いたＰＣＲを行い、アーム断片同士を結合した２ｋｂのＤＮＡ断片を取得し、ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて精製した。
【０１１５】
精製したＤＮＡ断片を、Δ１２−１Δ５−１＿ｓｓ株のコンピテントセル溶液に添加し、実施例２と同様の方法でエレクトロポレーションによりΔ１２−１Δ５−１＿ｓｓ株に導入し、選択培地にＳｕＳｔＬＢ寒天培地を用いて形質転換株を選択した。選択した形質転換株のコロニーをＬＢｃｍ寒天培地プレート上にレプリカし、クロラムフェニコール感受性を示す株を選択した。
【０１１６】
プライマーＤＮＡ３７と３９をプライマーセットとして用い、選択したシュークロース耐性、ストレプトマイシン耐性、クロラムフェニコール感受性コロニーを直接鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては爪楊枝の先で拾った少量の菌体をＰＣＲ反応液に懸濁して鋳型とした。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【０１１７】
その結果、約３ｋｂｐの増幅断片が得られた。プライマーＤＮＡ３７および３９をプライマーセットに用いた、目的とする置換が導入され、ｓｕｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子およびｃａｔ遺伝子が削除されたシュークロース耐性、ストレプトマイシン耐性、クロラムフェニコール感受性株の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲによって取得される増幅ＤＮＡ断片は、アームの両外側の０．５ｋｂ、両アーム領域の１ｋｂが増幅されることから、約３ｋｂのバンドが増幅するので、上記方法により目的のマーカー遺伝子が削除された染色体部分欠損株（Δ１２−１Δ５−１株）が取得できたことを確認した。
【０１１８】
上記したように、実施例６に記載した、マーカー遺伝子を削除した染色体ＤＮＡへの欠損の導入を、順次別の染色体部位に対して行うことにより、複数の欠損を一つの菌株に多重に導入することが可能となった。
【０１１９】
実施例８ 多重欠損株の製造法２（Ｐ１ファージを利用した段階的な欠損導入）上記で取得した各染色体部分欠損株より、実施例１記載の方法に従いＰ１ファージを調製し、宿主株として選択した株の染色体ＤＮＡ上に、以下の方法により多重に欠損を導入した。
【０１２０】
実施例５で取得したΔ２−１＿ｓｓ株よりＰ１ファージを以下の方法により取得した。
Δ２−１＿ｓｓ株を１５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含む１０ｍｌのＬＢ液体培地を用いて、３０℃にて１６時間培養し、該培養液から０．５ｍｌ分取し、１．４ｍｌの新しいＬＢ培地および１００μｌの０．１ｍｏｌ／ｌの塩化カルシウム溶液と混合した。３０℃にて５から６時間振とう培養した後、４００μｌを滅菌チューブに移し、２μｌのＰ１ファージストック（東京大学分子細胞生物学研究所より入手可能）を添加し、３７℃にて１０分間保温した。該チューブに５０℃に保温した３ｍｌのソフトアガー溶液を添加し、よく攪拌した後、Ｃａ−ＬＢ寒天培地プレート上にまいた。該プレートを３７℃で７時間培養した後、スプレッダーでソフトアガー部分を細かく砕いて回収し、１５００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離した。得られた上清１．５ｍｌに対し１００μｌのクロロホルムを添加し、４℃にて一晩保存した後、１５０００ｇにて２分間遠心分離し、得られた上清をファージストックとして４℃で保存した。
【０１２１】
上記で取得したファージを用いてＭＧ１６５５ｒｐｓＬ株に以下の方法により形質導入した。ＭＧ１６５５ｒｐｓＬ株を５ｍｌのＣａ−ＬＢ液体培地を用いて、３０℃で４時間培養した培養液を２００μｌ分取し、上記で取得したファージストックを１μｌ添加した。３７℃で１０分間保温した後、５ｍｌのＬＢ培地と２００μｌの１ｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウム溶液を添加し、攪拌した。１５００ｇ、２５℃にて１０分間遠心分離した後、上清を捨て、得られた沈殿した細胞に１ｍｌのＬＢ培地と１０μｌの１ｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウム溶液を加え３０℃にて２時間保温した。該溶液１００μｌを１５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むアンチバイオティックメディウム３寒天培地に塗布し、３０℃で一晩培養した。得られたコロニー２４個をそれぞれ、１５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むアンチバイオティックメディウム３寒天培地、１５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールと１０％シュークロースを添加した塩化ナトリウムを含まないＬＢ寒天培地、および１５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールと５０ｍｇ／ｌのストレプトマイシンを添加した塩化ナトリウムを含まないＬＢ寒天培地に塗布し、クロラムフェニコール耐性でかつシュークロース感受性かつストレプトマイシン感受性の株を選択することにより、Δ２−１＿ｓｓ領域が形質導入されたＭＧ１６５５ｒｐｓＬΔ２−１＿ｓｓ株を取得した。
【０１２２】
次に実施例６で得られたΔ２−１株よりファージストックを上記と同様の方法にて調製した。該ファージストックを用いて上記と同様の方法にてＭＧ１６５５ｒｐｓＬΔ２−１＿ｓｓ株に形質導入し、シュークロース耐性、ストレプトマイシン耐性、かつクロラムフェニコール感受性の株を選択することにより、Δ２−１＿ｓｓ領域中のマーカー遺伝子挿入領域が、Δ２−１株由来のマーカー遺伝子削除領域に置換されたＭＧ１６５５ｒｐｓＬΔ２−１株を取得した。
【０１２３】
次に実施例５で得られたΔ４−１＿ｓｓ株よりファージストックを上記と同様の方法にて調製した。該ファージストックを用いて上記と同様の方法にてＭＧ１６５５ｒｐｓＬΔ２−１に形質導入し、クロラムフェニコール耐性、シュークロース感受性かつストレプトマイシン感受性の株を選択することにより、Δ４−１＿ｓｓ領域が形質導入されたＭＧ１６５５ｒｐｓＬΔ２−１Δ４−１＿ｓｓ株を取得した。
【０１２４】
次に実施例６で得られたΔ４−１株よりファージストックを上記と同様の方法にて調製した。該ファージストックを用いてＭＧ１６５５ｒｐｓＬΔ２−１Δ４−１＿ｓｓ株に形質導入し、シュークロース耐性、ストレプトマイシン耐性かつクロラムフェニコール感受性の株を選択することにより、Δ４−１＿ｓｓ領域中のマーカー遺伝子領域がΔ４−１株由来のマーカー遺伝子削除領域に置換されたＭＧ１６５５ｒｐｓＬΔ２−１Δ４−１株を得た。
【０１２５】
上記の方法を用いることにより、マーカー遺伝子挿入型欠損株由来のＰ１ファージとマーカー遺伝子領域削除型欠損株由来のＰ１ファージとを交互に用いて形質導入を繰り返すことにより、複数のマーカー遺伝子削除型欠損を一つの菌株の染色体ＤＮＡ上に多重に導入することができる。
【０１２６】
【発明の効果】
本発明によれば、染色体ＤＮＡ上に、１０ｋｂ以上の欠損を有する微生物を容易に製造することができ、さらに該製造法に、染色体ＤＮＡ上に薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を削除する工程を付加することにより、１０ｋｂ以上の欠損を染色体ＤＮＡ上に多重に有する微生物を製造することができる。
【０１２７】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【０１２８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はプラスミドｐＣＲ２．１＿ｓａｃＢ＿２００＿ｃａｔ 中のｓａｃＢ遺伝子とｃａｔ遺伝子の連部分の構造を示す図である。
【図２】図２はｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子およびｃａｔ遺伝子を連結したマーカーユニット断片の構造を示す図である。
【符号の説明】
ｓａｃＢ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のレバンシュークラーゼ遺伝子
ｃａｔ：プラスミドｐＨＳＧ３９９由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子
ｒｐｓＬ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のストレプトマイシン感受性リボソーマルタンパク質遺伝子
【発明の属する技術分野】
本発明は、染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂ以上の領域が置換または欠損した微生物の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＰＣＲ技術の発展に従い、目的とする塩基配列を有する直鎖ＤＮＡを効率よく作製することが可能となった。枯草菌等の一部の微生物では、上記ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片等を用いて染色体ＤＮＡ上の任意の遺伝子が欠損または置換した形質転換体の作製が行われている。
【０００３】
一方、大腸菌野生株は、直鎖ＤＮＡによる形質転換頻度は低く、ｒｅｃＢＣおよびｓｂｃＢＣ等のヌクレアーゼ活性が低下した変異株でのみ低い頻度で直鎖ＤＮＡによる染色体ＤＮＡ上の遺伝子置換等が可能であった（非特許文献１参照）。
λファージ由来の組換えタンパク質群（Ｒｅｄ組換え系）を大腸菌内で発現させると、直鎖ＤＮＡを用いた染色体上の形質転換効率が１０倍以上上昇することが報告されている（非特許文献２）。また、ＰＣＲにより作製した直鎖ＤＮＡとλＲｅｄ組換え系を組み合わせた、大腸菌の染色体ＤＮＡ上の任意の遺伝子を置換または欠損させる方法も報告されている（非特許文献３および４参照）。
【０００４】
上記λＲｅｄ組換え系を用いて単一の遺伝子破壊を行う際に、形質転換株の選択に使用するマーカー遺伝子である薬剤耐性遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残らないようにする方法も非特許文献３および４に記載されている。しかしながら、上記λＲｅｄ組換え系を用いた染色体ＤＮＡ上の異なる位置に存在する２以上の遺伝子が置換または欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの作製法、１０ｋｂｐ以上の長いＤＮＡ領域が置換または欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉの作製法は知られていなかった。
【０００５】
大腸菌染色体ＤＮＡ上の長い領域に欠損を多重に導入する方法として、制限酵素ＳｃｅＩを用いる方法が報告されている（非特許文献５参照）。しかしながらこの方法は、多段階の工程からなる複雑な方法であり、また効率が低い方法である。また、同様に長い領域に欠損を導入する方法としては、Ｃｒｅ組換え酵素を利用する方法が知られていた（非特許文献６参照）が、この方法では最終的にＣｒｅの認識配列であるｌｏｘＰ配列が染色体上に残存するため、多重に欠損を導入する方法としては好ましい方法ではない。非特許文献６には、認識配列が異なる二つの組換え酵素ＣｒｅとＦＬＰを利用して、４つまでの欠失を同時に一菌株に導入することが記載されているが、この方法も染色体ＤＮＡに欠損を導入するたびに、染色体ＤＮＡ上にＣｒｅ認識配列であるｌｏｘＰ配列やＦＬＰ認識配列であるＦＲＴ配列が蓄積する方法であり、多重に欠損を導入する方法としては好ましい方法ではない。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（ジャーナル オブ バクテリオロジー）， １５９， ７８３−７８６ （１９８４）
【０００７】
【非特許文献２】
Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（ジャーナル オブ バクテリオロジー）， １８０， ２０６３−２０７１ （１９９８）
【０００８】
【非特許文献３】
Ｇｅｎｅ（ジーン）， ２４６， ３２１−３２０ （２０００）
【０００９】
【非特許文献４】
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（プロシーディング オブ ナショナル アカデミーサイエンス）， ９７， ６６４０−６６４５ （２０００）
【００１０】
【非特許文献５】
Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ゲノム リサーチ）， １２， ６４０−６４７ （２００２）
【００１１】
【非特許文献６】
Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ネイチャー バイオテクノロジー）， ２０， １０１８−１０２３ （２００２）
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂｐ以上の領域が置換または欠損した微生物の製造法を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は下記（１）〜（８）に関する。
（１） 薬剤耐性遺伝子を有する直鎖ＤＮＡであり、かつ置換または欠損を導入したい染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に位置するＤＮＡとそれぞれ相同性を有するＤＮＡを、その両端に有する直鎖ＤＮＡを用いて微生物を形質転換することを特徴とする、染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂ以上の領域が置換または欠損した微生物の製造法。
【００１４】
（２） 上記（１）の製造法で得られた染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂ以上の領域が置換または欠損した微生物に、上記（１）で用いた置換または欠損を導入したい染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に位置するＤＮＡとそれぞれ相同性を有するＤＮＡをその両端に有する直鎖ＤＮＡを導入することにより、染色体ＤＮＡ上に挿入された薬剤耐性遺伝子を削除することを特徴とする、染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂ以上の領域が置換または欠損した微生物の製造法。
【００１５】
（３） 以下の［１］〜［３］の工程、
［１］薬剤耐性遺伝子、ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を有する直鎖ＤＮＡであり、かつ置換または欠損の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に位置するＤＮＡとそれぞれ相同性を有するＤＮＡをその両端に有する直鎖ＤＮＡ用いて微生物を形質転換する工程
［２］上記［１］で用いた置換または欠損の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に位置するＤＮＡとそれぞれ相同性を有するＤＮＡをその両端に有する直鎖ＤＮＡを該形質転換体に導入する工程
［３］染色体ＤＮＡ上から、［１］で用いた薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が削除された形質転換体を選択する工程
を含む、染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂ以上の領域が置換または欠損した微生物の製造法。
【００１６】
（４） 上記（３）の［１］〜［３］の工程を繰り返すことを特徴とする染色体ＤＮＡ上の異なる位置に存在する２以上の１０ｋｂｐ以上の領域が置換または欠損した微生物の製造法。
（５） 置換または欠損の導入導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に位置するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡが、各々５００ｂｐ〜５ｋｂｐの長さを有するＤＮＡである上記（１）〜（４）の製造法。
【００１７】
（６） 微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物である上記（１）〜（５）の製造法。
（７） 薬剤耐性遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子である上記（１）〜（６）の製造法。
【００１８】
（８） ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物由来のｓａｃＢ遺伝子またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物由来のｒｐｓＬ遺伝子である上記（３）〜（７）の製造法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本願発明の製造法に用いられる宿主微生物としては、直鎖ＤＮＡをその細胞内に取り込み、染色体ＤＮＡと導入した直鎖ＤＮＡとの間で相同組換えが起こる微生物であれば、いずれの微生物であってもよいが、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物、より好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、さらに好ましくはλファージ由来の組換えタンパク質群（Ｒｅｄ組換え系）を発現しているＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉをあげることができる。
【００２０】
λＲｅｄ組換え系を発現しているＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉとしては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＫＭ２２株〔Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １８０， ２０６３（１９９８）〕およびＫＭ２２株が保有するλＲｅｄ組換え系に関与する遺伝子で形質転換または形質導入されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉなどをあげることができ、具体的にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ｒｅｄ株をあげることができる。
【００２１】
本発明の製造法に用いられるＤＮＡとしては、
（１）薬剤耐性遺伝子を有する直鎖ＤＮＡであり、かつ置換または欠損の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡをその両端に有する直鎖ＤＮＡ、
（２）置換または欠損の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡをその両端に有する直鎖ＤＮＡ、
（３）薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を有する直鎖ＤＮＡであり、かつ置換または欠損の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両外側に存在するＤＮＡをその両端に有する直鎖ＤＮＡ
をあげることができる。
【００２２】
薬剤耐性遺伝子としては、宿主微生物が感受性を示す薬剤に対し、薬剤耐性を付与する薬剤耐性遺伝子であれば、いずれの薬剤耐性遺伝子も使用することができる。宿主微生物にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを用いた場合は、薬剤耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子等をあげることができる。
【００２３】
ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子とは、宿主微生物で該遺伝子を発現させたとき、一定培養条件下においては、該微生物に致死的である遺伝子のことをいい、該遺伝子としては例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物由来のｓａｃＢ遺伝子〔Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ５９， １３６１−１３６６（１９９３）〕 、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物由来のｒｐｓＬ遺伝子〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ７２， ９９−１０４（２００１）〕等をあげることができる。
【００２４】
本発明の製造法で用いられる直鎖ＤＮＡの両末端に存在する、染色体ＤＮＡ上の置換または欠損の導入対象となる領域の両端の外側に位置するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡは、直鎖ＤＮＡにおいて、染色体ＤＮＡ上の方向と同じ方向に配置され、その長さは５００ｂｐ〜５ｋｂｐ程度が好ましく、５００ｂｐ〜２ｋｂｐ程度がより好ましく、１ｋｂｐ程度がさらに好ましい。
【００２５】
相同性を有するとは、上記直鎖ＤＮＡが、染色体ＤＮＡ上の目的とする領域において、相同組換えが起こる程度の相同性を有することであり、具体的な相同性としては、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは１００％の相同性をあげることができる。
上記塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， ５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８３， ６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５， ４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ． ｇｏｖ．）。
【００２６】
上記直鎖ＤＮＡ断片は、ＰＣＲにより作製することができる。また上記直鎖ＤＮＡを含むＤＮＡをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖ＤＮＡを得ることもできる。
本発明の製造法において用いられる、微生物の染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂｐ以上の領域を置換または欠損させる方法としては、以下の方法１〜３があげられる。
方法１：上記（１）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する方法。
方法２：上記方法１により取得された形質転換株に、上記（２）の直鎖ＤＮＡを導入し、該方法により染色体ＤＮＡ上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物の染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂｐ以上の領域を置換または欠損させる方法。
方法３
［１］上記（３）の直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖ＤＮＡが染色体ＤＮＡ上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
［２］染色体ＤＮＡ上の置換または欠損の対象となる領域の両端の外側に位置するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡを、染色体ＤＮＡ上における方向と同一の方向で連結したＤＮＡを合成し、上記［１］で得られた形質転換株に導入する、
［３］ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、上記［２］の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体ＤＮＡ上から削除された株として選択する方法。
【００２７】
上記方法で用いられる、直鎖ＤＮＡを宿主微生物に導入する方法としては、該微生物へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ６９， ２１１０ （１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １６， ６１２７ （１９８８）〕等をあげることができる。
【００２８】
方法２または方法３［２］で用いられる直鎖ＤＮＡにおいて、該ＤＮＡの中央部付近に、染色体ＤＮＡ上に挿入したい任意の遺伝子を組み込こんだ直鎖ＤＮＡを用いることにより、薬剤耐性遺伝子等を削除するのと同時に、任意の遺伝子を染色体ＤＮＡ上に挿入することができる。
上記方法２および３では、最終的に得られる形質転換株の染色体ＤＮＡ上には薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子を残さない方法であるため、該方法を用いる本発明の製造法では、同一の薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、方法１および２、または方法３［１］〜［３］の操作を繰り返すことにより、容易に染色体ＤＮＡ上の位置の異なる２以上の領域に１０ｋｂｐ以上の欠損を有する微生物を製造することができる。
【００２９】
【実施例】
実施例１：λＲｅｄ組換え系を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの作製
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＭ２２株［Δ（ｒｅｃＣ ｐｔｒｒｅｃＢ ｒｅｃＤ）：：Ｐｌａｃ−ｒｅｄ ｋａｎ］（米国マサチューセッツ医科大学のＫｅｎｅｎ Ｃ． Ｍｕｒｐｈｙ博士より入手可能）よりＰ１ファージを以下の方法により調製した。
【００３０】
２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む１０ｍｌのＬＢ培地〔１０ｇ／ｌ バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、１０ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、１ｍｌ／ｌ １ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム〕を用いて３０℃にて１６時間培養したＫＭ２２株の培養液 ０．５ｍｌと、１．４ｍｌの新しいＬＢ培地および１００μｌの０．１ｍｍｏｌ／ｌ 塩化カルシウム溶液とを混合した。３０℃にて５〜６時間振とう培養した後、４００μｌの培養液を滅菌チューブに移した。該チューブに２μｌのＰ１ファージストック（東京大学分子細胞生物学研究所より入手可能）を添加し、３７℃にて１０分間保温した。次に５０℃に保温した３ｍｌのソフトアガー溶液（１０ｇ／ｌ バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｍｍｏｌ／ｌ 塩化カルシウム、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム、３ｇ／ｌ 寒天）を添加し、よく攪拌した後に、Ｃａ−ＬＢ寒天培地プレート（１０ｇ／ｌ バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｍｍｏｌ／ｌ 塩化カルシウム、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム、１５ｇ／ｌ 寒天、プレートの直径は１５ｃｍ）上にまいた。該プレートを３７℃で７時間培養した後、スプレッダーでソフトアガー部分を細かく砕いて回収した。回収したソフトアガーを１５００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離した。得られた上清１．５ｍｌに対し１００μｌのクロロホルムを添加し、４℃にて一晩保存した後、１５０００ｇにて２分間遠心分離し、その上清をファージストックとして４℃で保存した。
【００３１】
次に上記で取得したファージを用いてＷ３１１０株を形質転換した。５ｍｌのＣａ−ＬＢ液体培地を用いて３０℃、４時間培養したＷ３１１０株培養液から２００μｌ分取し、ファージストックを１μｌ添加した。３７℃で１０分間保温した後、５ｍｌのＬＢ液体培地と２００μｌの１ｍｏｌ／ｌ クエン酸ナトリウム溶液を添加し、攪拌した。１５００ｇ、２５℃にて１０分間遠心分離した後、上清を捨て、得られた細胞に１ｍｌのＬＢ液体培地と１０μｌの１ｍｏｌ／ｌ クエン酸ナトリウム溶液を加え３０℃にて２時間保温した。該溶液１００μｌを２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム３寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に塗布し、３０℃で一晩培養した。翌日出現したコロニー２４個をそれぞれ、２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム３寒天培地に塗布し、カナマイシン耐性株を選抜することにより、Δ（ｒｅｃＣｐｔｒ ｒｅｃＢ ｒｅｃＤ）：：Ｐｌａｃ−ｒｅｄ ｋａｎ）領域が形質導入されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ Ｗ３１１０ｒｅｄ株を取得した。
【００３２】
実施例２：染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂｐ以上の領域を欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの製造
実施例１で取得したλＲｅｄ遺伝子群を導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ｒｅｄ株〔Ｗ３１１０、Δ（ｒｅｃＣ ｐｔｒ ｒｅｃＢｒｅｃＤ）：：Ｐｌａｃ−ｒｅｄ ｋａｎ〕を宿主微生物に用い、以下の方法により、Ｗ３１１０ｒｅｄ株の染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂｐ以上の領域が欠損した形質転換株を作製した。
【００３３】
Ｗ３１１０ｒｅｄ株を、１ｍｍｏｌ／ｌのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−Ｔｈｉｏ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加した１００ｍｌのＬＢ液体培地〔１０ｇ／ｌ バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、１０ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム〕を用いて、３０℃で培養した。ＯＤ６６０ｎｍが０．１に達した時点で培養を終了した。なお、以下の操作は低温および氷冷した溶液を用いて行った。次に遠心分離により集菌した菌体を５０ｍｌの２０％グリセロール溶液に懸濁し、同様の遠心分離により集菌する操作を３回以上繰り返すことで菌体を洗浄した後、培養液の５０μｌの１０％グリセロール溶液に懸濁した。該溶液をエレクトロポレーション用のコンピテントセル溶液として使用した。
【００３４】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株の染色体ＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． Ｕ０００９６）において、４４８７７０９〜４５３３５９９ｂｐまでの領域約４６ｋｂｐを欠失させるための直鎖ＤＮＡを以下の方法で作製した。
配列番号１で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ１ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ ｌｉ染色体ＤＮＡ上の４４８６７０９〜４４８６７３４ｂｐに相当する塩基配列を有するＤＮＡ）、配列番号２で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ２ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４４８７７０８〜４４８７６８５ｂｐに相当する塩基配列に２５ｍｅｒのリンカー配列を付加したＤＮＡ）、配列番号３で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ３ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４５３４５９９〜４５３４５７５ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号４で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ４ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４５３３６００〜４５３３６２０ｂｐに相当する塩基配列に２５ｍｅｒのリンカー配列を付加したＤＮＡ）を合成した。
【００３５】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡを鋳型に用い、上記プライマーＤＮＡ１と２、またはプライマーＤＮＡ３と４の組合せをプライマーセットとしてそれぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製した染色体ＤＮＡ１００ｎｇまたは爪楊枝の先で拾った少量の菌体を用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００３６】
上記ＰＣＲにて、欠損対象領域の両端に位置する染色体ＤＮＡ配列とそれぞれ相同な１ｋｂの領域（アーム）を取得した。以下、プライマーＤＮＡ１と２をプライマーセットに用いて増幅されたＤＮＡを上流アーム、プライマーＤＮＡ３と４をプライマーセットに用いて増幅されたＤＮＡを下流アームと呼ぶ。
次に、配列番号５で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ５、および配列番号６で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ６を合成した。該ＤＮＡをプライマーセットとして用い、ｐＨＳＧ３９９プラスミドＤＮＡ（宝酒造社より購入可能）を鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは上記と同様の条件で行った。鋳型ＤＮＡとしては精製したプラスミドＤＮＡ４０ｎｇを用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００３７】
上記ＰＣＲにて、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ遺伝子）を含むＤＮＡ断片を取得した。
次に、上記で取得した上流アーム、下流アーム、およびｃａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片を混合したＤＮＡを鋳型として、プライマーＤＮＡ１と３をプライマーセットに用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製した上流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製した下流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製したｃａｔ遺伝子断片１．５μｌを用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００３８】
上記ＰＣＲにて、ｃａｔ遺伝子の一端に上流アーム、他の一端に下流アームが付加したＤＮＡ断片を作製した。該ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）により分離し、該ＤＮＡ断片をゲルから切り出して、ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
【００３９】
精製したＤＮＡ断片０．１μｇを、上記で作製したコンピテントセル溶液５０μｌに添加し、０．１ｃｍのキュベット（ＢｉｏＲａｄ社製）中で、１．８ＫＶ、２５μＦにてエレクトロポレーションを行った。１ｍｌのＳＯＣ液体培地（２０ｇ／ｌバクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、０．２ｍｌ／ｌの５ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム、２０ｍｌ／ｌ １ｍｏｌ／ｌ グルコース、１０ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 水酸化マグネシウム、１０ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 硫酸マグネシウム）を用いて３７℃で２時間培養した後、遠心分離により集菌した全量を、１５μｇ／ｍｌ クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート（ＬＢ液体培地に寒天を１．５％含むもの。以下、ＬＢｃｍ寒天培地プレートと略す）上に塗布し、３７℃で一晩培養することにより、クロラムフェニコール耐性株を取得した。
【００４０】
取得したクロラムフェニコール耐性株の染色体ＤＮＡ上に目的とする欠損（４４８７７０９〜４５３３５９９ｂｐの領域がｃａｔ遺伝子で置き換わっている）が導入されていることを確認することを目的に以下の実験を行った。
上記で用いたアーム配列末端からさらに染色体ＤＮＡ上において上流または下流にそれぞれ１ｋｂ離れた領域に相当するプライマーＤＮＡである、配列番号７で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ７ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４４８５７０９〜４４８５７２９ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）および配列番号８で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ８ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４５３５５９９〜４５３５５７５ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）を合成した。プライマーＤＮＡ７および８をプライマーセットとして用い、クロラムフェニコール耐性株のコロニーを直接鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては爪楊枝の先で拾った少量の菌体をＰＣＲ反応液に懸濁して鋳型とした。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００４１】
その結果、約４．６ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られた。プライマーＤＮＡ７および８をプライマーセットに用い、目的とする欠損が導入されたクロラムフェニコール耐性株の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲによって取得される増幅ＤＮＡ断片は、ｃａｔ遺伝子（０．６ｋｂ）の両端にそれぞれ約２ｋｂのＤＮＡが付加されたＤＮＡ断片（約４．６ｋｂ）であることから、目的とする形質転換株が得られたことを確認し、該形質転換株をΔｅ＿ｃａｔ株（欠失領域４４８７７０９〜４５３３５９９ｂｐ）と命名した。
【００４２】
上記Δｅ＿ｃａｔ株の製造法と同様の方法により、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の２６２８９２〜２９７０１６ｂｐの領域が欠損した株（Δｆ＿ｃａｔ）、５６４０１７〜５８４８７９ｂｐの領域が欠損した株（Δｃ＿ｃａｔ）、１１９６０８９〜１２２３１３１ｂｐの領域が欠損した株（Δｇ＿ｃａｔ）、１４１７３４５〜１４３２２８２ｂｐの領域が欠損した株（Δｈ＿ｃａｔ）、１５０６８３７〜１５１７１２５ｂｐの領域が欠損した株（Δｂ＿ｃａｔ）、１８０５４０３〜１８１１７３３ｂｐの領域が欠損した株（Δａ＿ｃａｔ）、２３１８０６２〜２３３２４２３ｂｐの領域が欠損した株（Δｋ＿ｃａｔ）、２７５４１５９〜２７８８００４ｂｐの領域が欠損した株（Δｄ＿ｃａｔ）、３１０８６０６〜３１３２８３９ｂｐの領域が欠損した株（Δｌ＿ｃａｔ）、３４５１１４４〜３４６７４９１ｂｐの領域が欠損した株（Δｍ＿ｃａｔ）、４５６９９３４〜４５８６３３４ｂｐの領域が欠損した株（Δｏ＿ｃａｔ）、２５６２０６〜３６３９９２ｂｐの領域が欠損した株（ΔＣＧＳＣ１＿ｃａｔ）を取得することができた。
【００４３】
実施例３ ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いた染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂｐ以上の領域を欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの製造
実施例１で取得したλＲｅｄ遺伝子群を導入した株Ｗ３１１０ｒｅｄ株〔Ｗ３１１０、Δ（ｒｅｃＣ ｐｔｒ ｒｅｃＢ ｒｅｃＤ）：：Ｐｌａｃ−ｒｅｄ ｋａｎ〕を宿主微生物に用い、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子としてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ遺伝子（ｓａｃＢ遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＢＧ１０３８８）を有する直鎖ＤＮＡを用いて、以下の方法によりＷ３１１０ｒｅｄ株の染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂｐ以上の領域が欠損した形質転換株を作製した。
【００４４】
Ｗ３１１０ｒｅｄ株のコンピテントセルは実施例２と同様の方法により作製した。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＫ−１２株の染色体配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． Ｕ０００９６）で４４８７７０９〜４５３３５９９ｂｐまでの領域約４６ｋｂｐを欠失させるための直鎖ＤＮＡを以下の方法で作製した。
【００４５】
配列番号９で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ９ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４４８５７０９〜４４８５７２９ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号１０で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ１０ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４４８７７０８〜４４８７６８５ｂｐに相当する塩基配列に２５ｍｅｒのリンカー配列を付加した塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号１１で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ１１ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４５３５５９９〜４５３５５７５ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号１２で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ１２ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４５３３６００〜４５３３６２０ｂｐに相当する塩基配列に２２ｍｅｒのリンカー配列を付加した塩基配列からなるＤＮＡ）を合成した。
【００４６】
Ｗ３１１０ｒｅｄ株のゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマーＤＮＡ９と１０、またはプライマーＤＮＡ１１と１２をプライマーセットとしてそれぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製染色体ＤＮＡ１００ｎｇまたは爪楊枝の先で拾った少量の菌体を用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００４７】
上記ＰＣＲにて、欠失対象領域の両端に位置する染色体ＤＮＡ配列とそれぞれ相同な２ｋｂの領域（アーム）を取得した。以下、プライマーＤＮＡ９と１０をプライマーセットとして増幅されたＤＮＡ断片を上流アーム、プライマーＤＮＡ１１と１２をプライマーセットとして増幅されたＤＮＡ断片を下流アームと呼ぶ。
【００４８】
ｓａｃＢ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． Ｘ０２７３０）を、コーディング領域の上流４００ｂｐ、下流２００ｂｐまでの領域としてＰＣＲ法にて取得した。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしてはＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌ ｉｓ １６８株（ＡＴＣＣ等の各種機関より入手可能）精製染色体ＤＮＡ１００ｎｇを用いた。プライマーＤＮＡには、配列番号４５で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ４５と配列番号４６で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ４６を各々２０ｐｍｏｌ反応液に添加した。
【００４９】
上記ＰＣＲにて取得した断片を、ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、最終的に各々５０μｌのＤＮＡ溶液を得た。
またｐＨＳＧ３９９プラスミド由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）断片を実施例２で取得したときと同様のＰＣＲ法にて増幅し、精製ＤＮＡを取得した。ただしプライマーセットとして配列番号４７で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ４７と配列番号４８で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ４８を用いた。
【００５０】
上記ＰＣＲで取得したｓａｃＢ断片とｃａｔ断片を鋳型として、プライマーＤＮＡ４５とプライマーＤＮＡ４８をプライマーセットとしてＰＣＲを行い、二つの遺伝子の向きが同一方向に連結したＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で３分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製したｓａｃＢ断片１μｌとｃａｔ断片１μｌを用いた。各プライマーは各々２０ｐｍｏｌ反応液に添加した。
【００５１】
上記ＰＣＲにて取得した断片を、電気泳動後ゲルから切り出し、ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、最終的に各々５０μｌのＤＮＡ溶液を得た。
該ＤＮＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔにて、プラスミドｐＣＲ２．１中ににクローニングすることで、プラスミドｐＣＲ２．１＿ｓａｃＢ＿２００＿ｃａｔを作製した（クローニングの方法はキットに付属の指示書に従った）。ｐＣＲ２．１＿ｓａｃＢ＿２００＿ｃａｔ のｓａｃＢ遺伝子とｃａｔ遺伝子を連結させた部分の構造を図１に示した。
【００５２】
次に配列番号１３で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ１３、配列番号１４で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ１４をプライマーセットとして用い、ｐＣＲ２．１＿ｓａｃＢ＿２００＿ｃａｔプラスミドを鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製プラスミドＤＮＡ４０ｎｇを用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００５３】
上記ＰＣＲにて、ｓａｃＢ遺伝子、ｃａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｓａｃＢ ＋ ｃａｔ断片）を取得した。該ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）により分離し、該ＤＮＡ断片をゲルから切り出して、ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、最終的に５０μｌのＤＮＡ溶液を得た。
【００５４】
次に、上流アーム、下流アーム断片およびｓａｃＢ ＋ ｃａｔ断片の３つのＤＮＡ断片を混合したものを鋳型として、配列番号１５で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４４８６７０９〜４４８６７３４ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号１６で表される塩基配列からなるプライマー１６ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４５３４５９９〜４５３４５７５ｂｐに相当塩基配列からなるＤＮＡ）をプライマーセットに用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製上流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製下流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製ｓａｃＢ ＋ ｃａｔ遺伝子断片１．５μｌを用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００５５】
上記ＰＣＲにて、ｓａｃＢ遺伝子とｃａｔ遺伝子が結合したＤＮＡの両端に、欠失対象領域の両端および上流アーム、下流アームが付加したＤＮＡ断片を増幅ＤＮＡ断片として取得した。該ＤＮＡ断片は上記と同様の方法によりアガロースゲル電気泳動法により分離し、該ＤＮＡ断片を含む部分をゲルから切り出し、精製した。
【００５６】
精製したＤＮＡ断片を、コンビテントセル溶液に添加し、実施例２と同様の方法でエレクトロポレーションによりＷ３１１０ｒｅｄ株に導入し、ＬＢｃｍプレート上で形質転換株を選択した。選択された形質転換株のコロニーをＳｕＬＢ寒天培地〔１０ｇ／ｌ バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、１０％ シュークロース、２０ｍｇ／ｌ カナマイシン、１５ｍｇ／ｌ クロラムフェニコール、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム）プレートにレプリカし、シュークロース感受性を示す株を選択した。
【００５７】
選択された株の染色体ＤＮＡ上において欠損対象領域である４４８７７０９〜４５３３５９９ｂｐがｓａｃＢ遺伝子とｃａｔ遺伝子との結合ＤＮＡと置換していることを確認するため、以下の実験を行った。
形質転換に用いた直鎖ＤＮＡのアーム配列末端からさらに上流および下流にそれぞれ１ｋｂ離れた領域に相同な塩基配列を有する配列番号９で表される塩基配列からなるプライマー９および配列番号１１で表される塩基配列からなるプライマー１１をプライマーセットに用いて、選択された株のコロニーを直接鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては爪楊枝の先で拾った少量の菌体をＰＣＲ反応液に懸濁して鋳型とした。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００５８】
その結果、約６．７ｋｂの増幅断片が得られた。プライマーＤＮＡ９および１１をプライマーセットに用い、目的とする欠損が導入されたクロラムフェニコール耐性、シュークロース感受性株の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲによって取得される増幅ＤＮＡ断片は、ｓａｃＢ 遺伝子とｃａｔ遺伝子の結合体（２．７ｋｂ）の両端にそれぞれ約２ｋｂのＤＮＡが付加されたＤＮＡ断片（約６．６ｋｂ）であることから、目的とする形質転換株が得られたことを確認し、該形質転換株をΔＥ＿ｓｕｃ株（欠損領域４４８７７０９〜４５３３５９９ｂｐ）と命名した。
【００５９】
ΔＥ＿ｓｕｃ株の製造法と同様の方法により、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の２６２８９２〜２９７０１６ｂｐの領域が欠損した株（ΔＡ＿ｓｕｃ株）、５６４０１７〜５８４８７９ｂｐの領域が欠損した株（ΔＣ＿ｓｕｃ）、１１９６０８９〜１２２３１３１ｂｐの領域が欠損した株（ΔＤ＿ｓｕｃ）、１４１７３４５〜１４３２２８２ｂｐの領域が欠損した株（ΔＦ＿ｓｕｃ）、１５０６８３７〜１５１７１２５の領域が欠損した株（ΔＧ＿ｓｕｃ）、１８０５４０３〜１８１１７３３ｂｐの領域が欠損した株（ΔＨ＿ｓｕｃ）、２３１８０６２〜２３３２４２３ｂｐの領域が欠損した株（ΔＫ＿ｓｕｃ）、２７５４１５９〜２７８８００４ｂｐの領域が欠損した株（ΔＬ＿ｓｕｃ）、３１０８６０６〜３１３２８３９ｂｐ（ΔＭ＿ｓｕｃ）、３４５１１４４〜３４６７４９１ｂｐの領域が欠損した株（ΔＣＧＳＣ＿ｓｕｃ）を取得することができる。
【００６０】
実施例４ ストレプトマイシン耐性でλＲｅｄ系を有する株の作製
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ｒｐｓＬ株（東京都立大学加藤潤一教授より入手可能）を親株として、λＲｅｄ組換え系を導入した。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＭ２２株［Δ（ｒｅｃＣ ｐｔｒｒｅｃＢ ｒｅｃＤ）：：Ｐｌａｃ −ｒｅｄ ｋａｎ］（米国マサチューセッツ医科大学のＫｅｎｅｎ Ｃ． Ｍｕｒｐｈｙ博士より入手可能）よりＰ１ファージを以下の方法により調製した。
【００６１】
２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む１０ｍｌのＬＢ培地〔１０ｇ／ｌ バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、１０ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム〕を用いて３０℃にて１６時間培養したＫＭ２２株の培養液 ０．５ｍｌと、１．４ｍｌの新しいＬＢ培地および１００μｌの０．１ｍｍｏｌ／ｌ 塩化カルシウム溶液とを混合した。３０℃にて５〜６時間振とう培養した後、４００μｌの培養液を滅菌チューブに移した。該チューブに２μｌのＰ１ファージストック（東京大学分子細胞生物学研究所より入手可能）を添加し、３７℃にて１０分間保温した。次に５０℃に保温した３ｍｌのソフトアガー溶液（１０ｇ／ｌ バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｍｍｏｌ／ｌ 塩化カルシウム、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム、３ｇ／ｌ 寒天）を添加し、よく攪拌した後に、Ｃａ−ＬＢ寒天培地プレート（１０ｇ／ｌ バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｍｍｏｌ／ｌ 塩化カルシウム、１ｍｌ／ｌ １ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム、１５ｇ／ｌ 寒天、プレートの直径は１５ｃｍ）上にまいた。該プレートを３７℃で７時間培養した後、スプレッダーでソフトアガー部分を細かく砕いて回収した。回収したソフトアガーを１５００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離した。得られた上清１．５ｍｌに対し１００μｌのクロロホルムを添加し、４℃にて一晩保存した後、１５０００ｇにて２分間遠心分離し、その上清をファージストックとして４℃で保存した。
【００６２】
次に上記で取得したファージを用いてＭＧ１６５５ｒｐｓＬ株を形質転換した。５ｍｌのＣａ−ＬＢ液体培地を用いて３０℃、４時間培養したＷ３１１０株培養液から２００μｌ分取し、ファージストックを１μｌ添加した。３７℃で１０分間保温した後、５ｍｌのＬＢ液体培地と２００μｌの１ｍｏｌ／ｌ クエン酸ナトリウム溶液を添加し、攪拌した。１５００ｇ、２５℃にて１０分間遠心分離した後、上清を捨て、得られた細胞に１ｍｌのＬＢ液体培地と１０μｌの１ｍｏｌ／ｌ クエン酸ナトリウム溶液を加え３０℃にて２時間保温した。該溶液１００μｌを２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム３寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に塗布し、３０℃で一晩培養した。翌日出現したコロニー２４個をそれぞれ、２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム３寒天培地に塗布し、カナマイシン耐性株を選抜することにより、Δ（ｒｅｃＣｐｔｒ ｒｅｃＢ ｒｅｃＤ）：：Ｐｌａｃ −ｒｅｄ ｋａｎ）領域が形質導入されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ｒｓｈ株〔ＭＧ１６５５、ｒｐｓＬ、Δ（ｒｅｃＣ ｐｔｒ ｒｅｃＢｒｅｃＤ）：：Ｐｌａｃ −ｒｅｄ ｋａｎを取得した。
【００６３】
実施例５ ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を二つ用いた染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂｐ以上の領域を欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの製造
実施例４で取得したλＲｅｄ遺伝子群を導入したＭＧ１６５５ｒｓｈ株を宿主微生物に用い、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子としてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のストレプトマイシン感受性リボソーマルタンパク遺伝子（ｒｐｓＬ、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． Ｊ０１６８８）を有する直鎖ＤＮＡを用いて、以下の方法によりＭＧ１６５５ｒｓｈ株の染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂ以上の領域が欠損した形質転換株を作製した。
【００６４】
染色体上の形質転換が可能なコンピテントセルは実施例２と同様の方法により作製した。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＫ−１２株の染色体配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｕ０００９６）で４９８３０６〜５５２３８７ｂｐまでの領域約５４ｋｂｐを欠損させるための直鎖ＤＮＡ断片を、以下のようにして作製した。
【００６５】
配列番号１７で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ１７（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４９６８０４〜４９６８２８ｂｐに相当する塩基配列を有するＤＮＡ）、配列番号１８で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ１８（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４９８３０５〜４９８２８０ｂｐに相当する塩基配列に２７ｍｅｒのリンカー配列を付加した塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号１９で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ１９ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の５５３８８８〜５５３８６３ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号２０で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ２０（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の５５２３８８〜５５２４１２ｂｐに相当する塩基配列に２９ｍｅｒのリンカー配列を付加したＤＮＡ）を合成した。ＭＧ１６５５ｒｓｈ株の染色体ＤＮＡを鋳型して、プライマーＤＮＡ１７と１８、またはプライマーＤＮＡ１９と２０をプライマーセットとしてそれぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製した染色体ＤＮＡ１００ｎｇまたは爪楊枝の先で拾った少量の菌体を用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００６６】
上記ＰＣＲにて、欠損対象領域の両端に位置する染色体ＤＮＡ配列とそれぞれ相同な１．５ｋｂの領域（アーム）を取得した。以下、プライマーＤＮＡ１７と１８をプライマーセットとして増幅されたＤＮＡ断片を上流アーム、プライマーＤＮＡ１９と２０をプライマーセットとして増幅されたＤＮＡ断片を下流アームと呼ぶ。
【００６７】
次にｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子およびｃａｔ遺伝子を含む断片を、以下の方法により取得した。東京都立大学理学部加藤潤一教授より入手することができるｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子、ｃａｔ遺伝子の順に配列されたＤＮＡ断片を有するｍｉｎｉＦ＿ＳａｃＩ＿１＿１０プラスミドを鋳型として、配列番号２１で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ２１および配列番号２２で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ２２をプライマーセットとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製プラスミドＤＮＡ４０ｎｇを用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００６８】
上記ＰＣＲにて、ｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子およびｃａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、マーカーユニット断片という）を増幅ＤＮＡ断片として取得した。該増幅ＤＮＡ断片の構造を図２に示した。
次に、上記で取得した上流アーム、下流アームと、マーカーユニット断片を混合したものを鋳型として、配列番号２３で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ２３（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４９７３２８〜４９７３５２ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号２４で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ２４ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の５５３３８８〜５５３３６４ｂｐに相当する塩基配列を有するＤＮＡ）をプライマーセットとして用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製上流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製下流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製マーカーユニット断片１．５μｌを用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００６９】
上記ＰＣＲにて、マーカーユニット断片の両端にそれぞれ１．５ｋｂの上流アームおよび下流アームが付加した増幅ＤＮＡ断片を取得した。該増幅ＤＮＡ断片を上記と同様の方法によりアガロースゲル電気泳動法により分離し、目的とするＤＮＡ断片をゲルから切り出し、精製した。
精製したＤＮＡ断片を、先に作製したＭＧ１６５５ｒｓｈ株のコンピテントセル溶液に添加し、実施例２と同様の方法でエレクトロポレーションによりＤＮＡ断片をＭＧ１６５５ｒｓｈ株に導入し、ＬＢｃｍプレート上で形質転換株を選択した。取得した形質転換株のコロニーをＳｕＬＢ寒天培地ならびにＳｔＬＢ寒天培地（１０ｇ／ｌ バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、１０ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、５０ｍｇ／ｌ ストレプトマイシン、２０ｍｇ／ｌ カナマイシン、１５ｍｇ／ｌ クロラムフェニコール、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム）プレートにそれぞれレプリカし、シュークロースおよびストレプトマイシン感受性を示す株を選択した。
【００７０】
選択された株の染色体ＤＮＡ上において欠損対象領域である４９８３０６〜５５２３８７ｂｐがマーカーユニット断片と置換していることを確認するため、以下の実験を行った。
配列番号１７で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ１７と配列番号１９で表される塩基配列を有するプライマーＤＮＡ１９をプライマーセットに用い、選択された形質転換株のコロニーを直接鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては爪楊枝の先で拾った少量の菌体をＰＣＲ反応液に懸濁して鋳型とした。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００７１】
その結果、約８．０ｋｂの増幅断片が得られた。プライマーＤＮＡ１７および１８をプライマーセットに用い、目的とする欠損が導入されたクロラムフェニコール耐性、シュークロース感受性、ストレプトマイシン感受性株の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲによって取得される増幅ＤＮＡ断片は、ｓａｃＢ 遺伝子、ｃａｔ遺伝子、およびｒｐｓＬ遺伝子を含むマーカーユニット（５．０ｋｂ）の両端にそれぞれ約１．５ｋｂのＤＮＡが付加されたＤＮＡ断片（約８．０ｋｂ）であることから、目的とする形質転換株が得られたことを確認し、該形質転換株をΔ２８−１＿ｓｓ株（欠失領域４９８３０６〜５５２３８７ｂｐ）と命名した。
【００７２】
Δ２８−１＿ｓｓ株の製造法と同様の方法により、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の２１９４４４４〜２２４０９６２ｂｐの領域が欠損した株（Δ１６−２＿ｓｓ）、４２７３３３７〜４３５９０００ｂｐの領域が欠損した株（Δ４−１＿ｓｓ）、１０４２１７８〜１１２０４６７ｂｐの領域が欠損した株（Δ１７−１＿ｓｓ）、５６４２７７〜６４３３７１ｂｐの領域が欠損した株（Δ１２−１＿ｓｓ）、５６４２７７〜６０８４５４ｂｐの領域が欠損した株（Δ１２−Ｃ＿ｓｓ）、５６４２７７〜６０１０４９ｂｐの領域が欠損した株（Δ１２−Ｄ＿ｓｓ）、４２７３２６５〜４３５０４５０ｂｐの領域が欠損した株（Δ０４−Ｂ＿ｓｓ）、４２７３２６５〜４３２７８１３ｂｐの領域が欠損した株（Δ０４−Ｄ＿ｓｓ）、３２１４４２０〜３２６７６６９ｂｐの領域が欠損した株（Δ５−１＿ｓｓ）、３７２３２１９〜３７６９３７１ｂｐの領域が欠損した株（Δ２−２＿ｓｓ）、２８２１９１１〜２８６４５５１ｂｐの領域が欠損した株（Δ２１−１＿ｓｓ）、２３６８４４〜３８７９２４ｂｐの領域が欠損した株（Δ９−１＿ｓｓ）、２３４６５５２〜２４２０６６７ｂｐの領域が欠損した株（Δ１３−１＿ｓｓ）、２４４７１６６〜２５１７２３４ｂｐの領域が欠損した株（Δ１１−１＿ｓｓ）、２９６４１７０〜３０３１６５３ｂｐの領域が欠損した株（Δ８−１＿ｓｓ）、３６１６６１９〜３７１５９４２ｂｐの領域が欠損した株（Δ２−１＿ｓｓ）、１１９５７２０〜１２５７００１ｂｐの領域が欠損した株（Δ１８−１＿ｓｓ）、１３８４６９１〜１５８８７５１ｂｐの領域が欠損した株（Δ２０−１＿ｓｓ）、２０４２７５６〜２０８３０６５ｂｐの領域が欠損した株（Δ１６−１−１＿ｓｓ）、２０８３０６３〜２１９２１７７ｂｐの領域が欠損した株（Δ１６−１−２＿ｓｓ）、２２８４３９１〜２３３４７７０ｂｐの領域が欠損した株（Δ１４−１＿ｓｓ）、２５５５３４９〜２６１６０４６ｂｐの領域が欠損した株（Δ１０−１＿ｓｓ）、２７５１５８９〜２８１２２３５ｂｐの領域が欠損した株（Δ２２＿ｓｓ）、２８２１９１１〜２８６４５５０ｂｐの領域が欠損した株（Δ２１＿ｓｓ）、３０９２０２１〜３１６０７０３ｂｐの領域が欠損した株（Δ７−１＿ｓｓ）、４４８６０４０〜４５９７７７５ｂｐの領域が欠損した株（Δ１−１＿ｓｓ）を製造することができた。
【００７３】
実施例６ 薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が削除された染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂｐ以上の領域を欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの製造
実施例３で取得されたΔＥ＿ｓｕｃ株からｃａｔ遺伝子およびｓｕｃＢ遺伝子が削除されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを、以下の方法により製造した。
【００７４】
配列番号２５で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ２５ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４５３３６２０〜４５３３６００ｂｐと４４８７７０８〜４４８７６８５に相当する塩基配列を結合した塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号２６で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ２６ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４４８７６８５〜４４８７７０ ｂｐと４５３３６００〜４５３３６２０に相当する塩基配列を結合した塩基配列からなるＤＮＡ）を合成した。
【００７５】
次に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株の染色体ＤＮＡを鋳型に、プライマーＤＮＡ９とプライマーＤＮＡ２５、またはプライマーＤＮＡ１１とプライマーＤＮＡ２６のプライマーセットを用いてそれぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製染色体ＤＮＡ１００ｎｇまたは爪楊枝の先で拾った少量の菌体を用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００７６】
上記ＰＣＲにて、欠損対象領域の両端に位置する染色体ＤＮＡ配列とそれぞれ相同な配列を有する１ｋｂのＤＮＡ断片（アーム）を取得した。以下、プライマーＤＮＡ９と２５をプライマーセットとして増幅されたＤＮＡ断片を上流アーム、プライマーＤＮＡ１１と２６をプライマーセットとして増幅されたＤＮＡ断片を下流アームと呼ぶ。得られたＤＮＡ断片は、それぞれＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、次にそれらを混合したものを鋳型として、プライマーＤＮＡ１５と１６プライマーセットとして用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製上流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製下流アームＤＮＡ溶液１μｌを用いた。
【００７７】
上記ＰＣＲにて、上記アーム同士が結合した２ｋｂの断片を増幅ＤＮＡ断片として取得し、ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。
実施例２と同様の方法で、ΔＥ＿ｓｕｃ株を培養してコンピテントセル溶液を作製し、精製したＤＮＡ断片を添加し、エレクトロポレーションにより該ＤＮＡ断片をΔＥ＿ｓｕｃ株に導入した。選択培地には、ＳｕＬＢ寒天培地を用いた。選択された形質転換株のコロニーをＬＢｃｍ寒天プレートにレプリカし、クロラムフェニコール感受性を示す株を選択した。
【００７８】
プライマーＤＮＡ１５および１６をプライマーセットに用い、選択されたシュークロース耐性、クロラムフェニコール感受性コロニーを直接鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては爪楊枝の先で拾った少量の菌体をＰＣＲ反応液に懸濁して鋳型とした。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００７９】
その結果、約４．０ｋｂの増幅断片が得られた。プライマーＤＮＡ１５および１６をプライマーセットに用い、目的とする置換が導入され、ｓｕｃＢ遺伝子およびｃａｔ遺伝子が削除されたシュークロース耐性、クロラムフェニコール感受性株の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲによって取得される増幅ＤＮＡ断片は、アームの両外側の１ｋｂと両アーム領域の１ｋｂが増幅されることから約４ｋｂのバンドが増幅するので、上記方法によりマーカー遺伝子が残らない染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂ以上の領域が欠損した染色体ＤＮＡ部分欠失株（ΔＥ株）が製造できたことが確認された。
【００８０】
ΔＥ株の製造法と同様の方法により、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの染色体ＤＮＡ上の２６２８９２〜２９７０１６ｂｐの領域が欠損した株（ΔＡ株）、５６４０１７〜５８４８７９ｂｐの領域が欠損した株（ΔＣ株）、１１９６０８９〜１２２３１３１ｂｐの領域が欠損した株（ΔＤ株）、１４１７３４５〜１４３２２８２ｂｐの領域が欠損した株（ΔＦ株）、１５０６８３７〜１５１７１２５ｂｐの領域が欠損した株（ΔＧ株）、２３１８０６２〜２３３２４２３ｂｐの領域が欠損した株（ΔＫ株）、２７５４１５９〜２７８８００４ｂｐの領域が欠損した株（ΔＬ株）、３１０８６０６〜３１３２８３９ｂｐの領域が欠損した株（ΔＭ株）、３４５１１４４〜３４６７４９１ｂｐの領域が欠損した株（ΔＣＧＳＣ）を製造することができた。
【００８１】
次に、実施例５で作製したΔ２８＿ｓｓ株からｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子およびｃａｔ遺伝子を削除した株を、以下の方法により製造した。
配列番号２７で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ２７（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の５５２４１２〜５５２３８８ｂｐと４９８３０６〜４９８２８０ｂｐに相当する塩基配列を結合した塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号２８で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ２８ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の４９８２８０〜４９８３０４ｂｐと５５２３８８〜５５２４１２ｂｐに相当する塩基配列を結合した塩基配列からなるＤＮＡ）を合成した。
【００８２】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉゲノムを鋳型に、プライマーＤＮＡ１７とプライマーＤＮＡ２７、またはプライマーＤＮＡ１９とプライマーＤＮＡ２８のプライマーセットを用いてそれぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製染色体ＤＮＡ１００ｎｇまたは爪楊枝の先で拾った少量の菌体を用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００８３】
上記ＰＣＲにて、欠損対象領域の両端に位置する染色体ＤＮＡの塩基配列とそれぞれ相同な配列を有する１ｋｂの増幅ＤＮＡ断片（アーム）を取得した。以下、プライマーＤＮＡ１７と２７をプライマーセットとして増幅されたＤＮＡ断片を上流アーム、プライマーＤＮＡ１９と２８をプライマーセットとして増幅されたＤＮＡ断片を下流アームと呼ぶ。該ＤＮＡ断片はそれぞれＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）で精製し、それらを混合したものを鋳型として、プライマーＤＮＡ２３と２４を用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製上流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製下流アームＤＮＡ溶液１μｌを用いた。
【００８４】
上記ＰＣＲにて、上記アーム同士が結合した２ｋｂの断片を取得し、ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて精製した。
実施例２と同様の方法で、Δ２８＿ｓｓ株を培養してコンピテントセル溶液を作製し、精製したＤＮＡ断片を添加し、エレクトロポレーションにより該ＤＮＡ断片をΔ２８＿ｓｓ株に導入した。選択培地には、ＳｕＳｔＬＢ寒天培地 （１０ｇ／ｌ バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、１０％ シュークロース、２０ｍｇ／ｌ カナマイシン、５０ｍｇ／ｌ ストレプトマイシン、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム）を用いた。選択された形質転換株のコロニーをＬＢｃｍ寒天培地プレート上にレプリカし、クロラムフェニコール感受性を示す株を選択した。
【００８５】
プライマーＤＮＡ１７および１９をプライマーセットとして用い、選択されたシュークロース耐性、ストレプトマイシン耐性、クロラムフェニコール感受性コロニーを直接鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては爪楊枝の先で拾った少量の菌体をＰＣＲ反応液に懸濁して鋳型とした。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００８６】
その結果、約３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が取得された。プライマーＤＮＡ１７および１９をプライマーセットに用いた、目的とする置換が導入され、ｓｕｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子およびｃａｔ遺伝子が削除されたシュークロース耐性、ストレプトマイシン耐性、クロラムフェニコール感受性株の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲによって取得される増幅ＤＮＡ断片は、アームの両外側の０．５ｋｂと両アーム領域の１ｋｂが増幅されることから約３ｋｂのバンドが増幅するので、上記方法によりマーカー遺伝子が残らない染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂ以上の領域が欠損した染色体ＤＮＡ部分欠損株（Δ２８株）が製造できたことが確認された。
【００８７】
Δ２８株の製造法と同様の方法により、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの染色体ＤＮＡ上の２１９４４４４〜２２４０９６２ｂｐの領域が欠損した株（Δ１６−２）、４２７３３３７〜４３５９０００ｂｐの領域が欠損した株（Δ４−１）、１０４２１７８〜１１２０４６７ｂｐの領域が欠損した株（Δ１７−１）、５６４２７７〜６４３３７１ｂｐの領域が欠損した株（Δ１２−１）、３２１４４２０〜３２６７６６９ｂｐの領域が欠損した株（Δ５−１）、３７２３２１９〜３７６９３７１ｂｐの領域が欠損した株（Δ２−２）、２３６８４４〜３８７９２４ｂｐの領域が欠損した株（Δ９−１）、２３４６５５２〜２４２０６６７ｂｐの領域が欠損した株（Δ１３−１）、２４４７１６６〜２５１７２３４ｂｐの領域が欠損した株（Δ１１−１）、２９６４１７０〜３０３１６５３ｂｐの領域が欠損した株（Δ８−１）、３６１６６１９〜３７１５９４２ｂｐの領域が欠損した株（Δ２−１）、２０８３０６３〜２１９２１７７ｂｐの領域が欠損した株（Δ１６−１−２）、２２８４３９１〜２３３４７７０ｂｐの領域が欠損した株（Δ１４−１）、２５５５３４９〜２６１６０４６ｂｐの領域が欠損した株（Δ１０−１）、２７５１５８９〜２８１２２３５ｂｐの領域が欠損した株（Δ２２）、２８２１９１１〜２８６４５５０ｂｐの領域が欠損した株（Δ２１）、４４８６０４０〜４５９７７７５ｂｐの領域が欠損した株（Δ１−１）を製造することができた。
【００８８】
実施例７ 多重欠損体の製造法１（λｒｅｄを利用した段階的な欠損導入）
染色体ＤＮＡの多重欠損株を、実施例３または実施例５で記載したネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を利用した染色体ＤＮＡの置換または欠損株の製造法と、実施例６に記載した薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が削除された染色体ＤＮＡの部分欠損株の製造法を交互に行うことにより製造した。
【００８９】
ＭＧ１６５５ｒｓｈ株のコンピテントセルは実施例２と同様の方法により作製した。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＫ−１２株の染色体ＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｕ０００９６）で５６４２７７〜６４３３７１ｂｐまでの領域約７９ｋｂｐを欠損させるための直鎖ＤＮＡ断片を以下のように作製した。
【００９０】
配列番号２９で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ２９ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の５６２７８８ 〜 ５６２８１２ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号３０で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ３０ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の５６４２７６〜５６４２５２ｂｐに相当する塩基配列に２７ｍｅｒのリンカー配列を付加した塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号３１で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ３１ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の６４４８６８〜６４４８４４ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号３２で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ３２ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の６４３３７２〜６４３３９６ｂｐに相当する塩基配列に２９ｍｅｒのリンカー配列を付加した塩基配列からなるＤＮＡ）を合成した。
【００９１】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＫ−１２株の染色体ＤＮＡを鋳型に、プライマーＤＮＡ２９と３０、またはプライマーＤＮＡ３１と３２のプライマーセットを用いてそれぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製染色体ＤＮＡ１００ｎｇまたは爪楊枝の先で拾った少量の菌体を用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００９２】
上記ＰＣＲにて、欠損対象領域の両端に位置する染色体ＤＮＡ配列とそれぞれ相同な塩基配列を有する１ｋｂのＤＮＡ断片（アーム）を取得した。以下、プライマーＤＮＡ２９と３０のプライマーセットで増幅したＤＮＡ断片を上流アーム、プライマーＤＮＡ３１と３２のプライマーセットで増幅したＤＮＡ断片を下流アームと呼ぶ。
【００９３】
次にプライマーＤＮＡ２１およびプライマーＤＮＡ２２を用い、ｍｉｎｉＦプラスミドｍｉｎｉＦ＿ＳａｃＩ＿１＿１０を鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製プラスミドＤＮＡ４０ｎｇを用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００９４】
上記ＰＣＲにて、実施例４と同様にｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子、ｃａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片（マーカーユニット断片）を取得した。
次に、上記で取得した上流アーム、下流アーム断片、およびマーカーユニット断片の３つのＤＮＡ断片を混合したものを鋳型として、配列番号３３で表される塩基配列からなるＤＮＡ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の５６３２７６〜５６３３１０ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号３４で表される塩基配列からなるＤＮＡプライマー３４ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の６４４３６６〜６４４３４２ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）をプライマーセットとして用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製上流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製下流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製マーカーユニット断片１．５μｌを用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００９５】
上記ＰＣＲにて、マーカーユニットの両端にそれぞれ上流アーム（１ｋｂ）および下流アーム（１ｋｂ）が付加した増幅ＤＮＡ断片を取得した。該ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法により分離し、目的の断片をゲルから切り出して、精製した。
実施例２と同様の方法により、精製したＤＮＡ断片を、ＭＧ１６５５ｒｓｈ株のコンピテントセル溶液に添加し、エレクトロポレーションによりＭＧ１６５５ｒｓｈ株に導入し、選択培地に、ＬＢｃｍ寒天培地を用いて形質転換株を選択した。選択された形質転換株のコロニーをＬＢｃｍ寒天培地プレート上にレプリカし、クロラムフェニコール耐性を示す株を選択した。選択されたコロニーをＳｕＬＢ寒天培地ならびにＳｔＬＢ寒天培地プレートにそれぞれレプリカし、シュークロースおよびストレプトマイシン感受性を示す株を選択した。
【００９６】
プライマーＤＮＡ２９と３１をプライマーセットに用い、選択されたクロラムフェニコール耐性、シュークロース感受性、ストレプトマイシン感受性コロニーを直接鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては爪楊枝の先で拾った少量の菌体をＰＣＲ反応液に懸濁して鋳型とした。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【００９７】
その結果、約８ｋｂｐの増幅断片が得られた。プライマーＤＮＡ２９および３１をプライマーセットに用いた、目的とする置換が導入され、ｓｕｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子およびｃａｔ遺伝子が挿入されたシュークロース感受性、ストレプトマイシン感受性、クロラムフェニコール耐性株の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲによって取得される増幅ＤＮＡ断片は、アームの両外側の０．５ｋｂ、両アーム領域の１ｋｂおよびｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子、ｃａｔ遺伝子ユニットの５ｋｂが増幅されることから、約８ｋｂのバンドが増幅するので、上記方法により目的の染色体ＤＮＡ部分欠損株（Δ１２−１＿ｓｓ株）が取得できたことを確認した。
【００９８】
配列番号３５で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ３５ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の６４３３９６〜６４３３７０と５６４２７６〜５６４２５２に相当する塩基配列を結合した塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号３６で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ３６ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の５６４２５２〜５６４２７６と６４３３７０〜６４３３９６に相当する塩基配列を結合した塩基配列からなるＤＮＡ）を合成した。
【００９９】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株の染色体ＤＮＡを鋳型に、プライマーＤＮＡ２９と３５、またはプライマーＤＮＡ３０と３６のプライマーセットを用いて、それぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製した染色体ＤＮＡ１００ｎｇまたは爪楊枝の先で拾った少量の菌体を用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【０１００】
上記ＰＣＲにて、欠損対象領域の両端に位置する染色体ＤＮＡ配列とそれぞれ相同な塩基配列を有する１ｋｂのＤＮＡ断片（アーム）を取得した。以下、プライマーＤＮＡ２９と３５をプライマーセットとして増幅されたＤＮＡ断片を上流アーム、プライマーＤＮＡ３０と３６をプライマーセットとして増幅されたＤＮＡ断片を下流アームと呼ぶ。取得したＤＮＡ断片をそれぞれＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン）で精製し、それらを混合したものを鋳型として、プライマーＤＮＡ３３と３４をプライマーセットとして用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製上流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製下流アームＤＮＡ溶液１μｌを用いた。
【０１０１】
上記ＰＣＲにて、２つのアーム同士が結合した２ｋｂの断片を取得し、ＱＩＡ ｑｕｉｃｋＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて精製した。
実施例２と同様の方法により、精製したＤＮＡ断片を、Δ１２−１＿ｓｓ株のコンピテントセル溶液に添加し、エレクトロポレーションによりΔ１２−１＿ｓｓ株に導入し、選択培地にＳｕＳｔＬＢ寒天培地を用いて形質転換株を選択した。
【０１０２】
選択した形質転換株のコロニーをＬＢｃｍ寒天培地プレート上にレプリカし、クロラムフェニコール感受性を示す株を選択した。
プライマーＤＮＡ２９と３１をプライマーセットに用い、取得したシュークロース耐性、ストレプトマイシン耐性、クロラムフェニコール感受性コロニーを直接鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては爪楊枝の先で拾った少量の菌体をＰＣＲ反応液に懸濁して鋳型とした。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【０１０３】
その結果、約３ｋｂｐの増幅断片が得られた。プライマーＤＮＡ２９および３１をプライマーセットに用いた、目的とする置換が導入され、ｓｕｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子およびｃａｔ遺伝子が削除されたシュークロース耐性、ストレプトマイシン耐性、クロラムフェニコール感受性株の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲによって取得される増幅ＤＮＡ断片は、アームの両外側の０．５ｋｂ、両アーム領域の１ｋｂが増幅されることから、約３ｋｂのバンドが増幅するので、上記方法により目的のマーカー遺伝子が削除された染色体部分欠損株（Δ１２−１株）が取得できたことを確認した。
【０１０４】
次に、Δ１２−１株の染色体ＤＮＡ配列で３２１４４２０〜３２６７６６９ｂｐ（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ． Ｕ０００９６での位置）までの領域約５３ｋｂｐを欠失させるための直鎖ＤＮＡ断片を以下のように作製した。
配列番号３７で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ３７ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体上の３２１２９２０〜３２１２９４４ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号３８で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ３８ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の３２１４４１９〜３２１４３９５ ｂｐに相当する塩基配列に２７ｍｅｒのリンカー配列を付加した塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号３９で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ３９ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の３２６９１６９〜３２６９１４５ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ） 、配列番号４０で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ４０ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の３２６７６７０〜３２６７６９４ｂｐに相当する塩基配列に２９ｍｅｒのリンカー配列を付加した塩基配列からなるＤＮＡ）を合成した。
【０１０５】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株の染色体ＤＮＡを鋳型に、プライマーＤＮＡ３７と３８、またはプライマーＤＮＡ３９と４０のプライマーセットを用いて、それぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製した染色体ＤＮＡ１００ｎｇまたは爪楊枝の先で拾った少量の菌体を用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【０１０６】
上記ＰＣＲにて、欠損対象領域の両端に位置する染色体ＤＮＡ配列とそれぞれ相同な塩基配列を有する１ｋｂのＤＮＡ断片（アーム）を取得した。以下、プライマーＤＮＡ３７と３８のプライマーセットで増幅したＤＮＡ断片を上流アーム、プライマーＤＮＡ３９と４０のプライマーセットで増幅したＤＮＡ断片を下流アームと呼ぶ。
【０１０７】
次にプライマーＤＮＡ２１と２２をプライマーセットに用い、ｍｉｎｉＦプラスミドｍｉｎｉＦ＿ＳａｃＩ＿１＿１０を鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製プラスミドＤＮＡ４０ｎｇを用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【０１０８】
上記ＰＣＲにて、実施例５と同様にｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子、ｃａｔ遺伝子を含む断片（マーカーユニット断片）を取得した。
次に、上記で取得した上流アーム、下流アーム、マーカーユニット断片を混合したものを鋳型として、配列番号４１で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ４１ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の３２１３４２０〜３２１３４４４ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号４２で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ４２ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の３２６８６４５〜３２６８６２１ｂｐに相当する塩基配列からなるＤＮＡ）をプライマーセットに用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製上流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製下流アームＤＮＡ溶液１μｌ、精製マーカーユニット断片１．５μｌを用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【０１０９】
上記ＰＣＲにて、マーカーユニットの両端にそれぞれ上流アーム（１ｋｂ）および下流アーム（１ｋｂ）が付加した増幅ＤＮＡ断片を取得した。該断片をアガロースゲル電気泳動法により分離し、目的とする断片をゲルから切り出して、精製した。
精製したＤＮＡ断片を、Δ１２−１株のコンピテントセル溶液に添加し、実施例２と同様の方法でエレクトロポレーションによりΔ１２−１株に導入し、選択培地にＬＢｃｍ寒天培地を用いて形質転換体を選択した。選択した形質転換株のコロニーをＳｕＬＢ寒天培地ならびにＳｔＬＢ寒天培地プレート上にレプリカし、シュークロースおよびストレプトマイシン感受性を示す株を選択した。
【０１１０】
プライマーＤＮＡ３７と３９をプライマーセットとして用い、取得したクロラムフェニコール耐性、シュークロース感受性、ストレプトマイシン感受性コロニーを直接鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては爪楊枝の先で拾った少量の菌体をＰＣＲ反応液に懸濁して鋳型とした。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【０１１１】
その結果、約８ｋｂの増幅断片が得られた。プライマーＤＮＡ３７および３９をプライマーセットに用いた、目的とする置換が導入され、ｓｕｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子およびｃａｔ遺伝子が挿入されたシュークロース感受性、ストレプトマイシン感受性、クロラムフェニコール耐性株の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲによって取得される増幅ＤＮＡ断片は、アームの両外側の０．５ｋｂ、両アーム領域の１ｋｂおよびｓｕｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子およびｃａｔ遺伝子からなるマーカーユニットの５ｋｂが増幅されることから、約８ｋｂのバンドが増幅するので、上記方法により目的のマーカー遺伝子が挿入された染色体部分欠損株（Δ１２−１Δ５−１＿ｓｓ株）が取得できたことを確認した。
【０１１２】
次に、配列番号４３で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ４３ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の３２６７６９４〜３２６７６７０ｂｐおよび ３２１４４１９〜３２１４３９５ｂｐに相当する塩基配列を結合した塩基配列からなるＤＮＡ）、配列番号４４で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ４４ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ上の３２１４３９５〜 ３２１４４１９ｂｐおよび３２６７６７０〜３２６７６９４ｂｐに相当する塩基配列を結合した塩基配列からなるＤＮＡ）を合成した。
【０１１３】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株の染色体ＤＮＡを鋳型に、プライマーＤＮＡ３７と４３、またはプライマーＤＮＡ３９と４４のプライマーセットを用いてそれぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１．５分間のサイクルを３０回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては精製した染色体ＤＮＡ１００ｎｇまたは爪楊枝の先で拾った少量の菌体を用いた。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【０１１４】
上記ＰＣＲにて、欠損対象領域の両端に位置する染色体ＤＮＡ配列とそれぞれ相同な塩基配列を有する１ｋｂのＤＮＡ断片（アーム）を取得した。取得したＤＮＡ断片は、それぞれＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン）で精製し、それらを混合したものを鋳型として、プライマーＤＮＡ４１と４２を用いたＰＣＲを行い、アーム断片同士を結合した２ｋｂのＤＮＡ断片を取得し、ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて精製した。
【０１１５】
精製したＤＮＡ断片を、Δ１２−１Δ５−１＿ｓｓ株のコンピテントセル溶液に添加し、実施例２と同様の方法でエレクトロポレーションによりΔ１２−１Δ５−１＿ｓｓ株に導入し、選択培地にＳｕＳｔＬＢ寒天培地を用いて形質転換株を選択した。選択した形質転換株のコロニーをＬＢｃｍ寒天培地プレート上にレプリカし、クロラムフェニコール感受性を示す株を選択した。
【０１１６】
プライマーＤＮＡ３７と３９をプライマーセットとして用い、選択したシュークロース耐性、ストレプトマイシン耐性、クロラムフェニコール感受性コロニーを直接鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の指示書に従い、添付の反応成分を用い反応液を作製した。反応液量は２５μｌで、９４℃で３分間保温した後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で７分間のサイクルを３５回行い、７２℃で１０分間保温する反応条件でＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡとしては爪楊枝の先で拾った少量の菌体をＰＣＲ反応液に懸濁して鋳型とした。プライマーは各々２０ｐｍｏｌを反応液に添加した。
【０１１７】
その結果、約３ｋｂｐの増幅断片が得られた。プライマーＤＮＡ３７および３９をプライマーセットに用いた、目的とする置換が導入され、ｓｕｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子およびｃａｔ遺伝子が削除されたシュークロース耐性、ストレプトマイシン耐性、クロラムフェニコール感受性株の染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲによって取得される増幅ＤＮＡ断片は、アームの両外側の０．５ｋｂ、両アーム領域の１ｋｂが増幅されることから、約３ｋｂのバンドが増幅するので、上記方法により目的のマーカー遺伝子が削除された染色体部分欠損株（Δ１２−１Δ５−１株）が取得できたことを確認した。
【０１１８】
上記したように、実施例６に記載した、マーカー遺伝子を削除した染色体ＤＮＡへの欠損の導入を、順次別の染色体部位に対して行うことにより、複数の欠損を一つの菌株に多重に導入することが可能となった。
【０１１９】
実施例８ 多重欠損株の製造法２（Ｐ１ファージを利用した段階的な欠損導入）上記で取得した各染色体部分欠損株より、実施例１記載の方法に従いＰ１ファージを調製し、宿主株として選択した株の染色体ＤＮＡ上に、以下の方法により多重に欠損を導入した。
【０１２０】
実施例５で取得したΔ２−１＿ｓｓ株よりＰ１ファージを以下の方法により取得した。
Δ２−１＿ｓｓ株を１５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含む１０ｍｌのＬＢ液体培地を用いて、３０℃にて１６時間培養し、該培養液から０．５ｍｌ分取し、１．４ｍｌの新しいＬＢ培地および１００μｌの０．１ｍｏｌ／ｌの塩化カルシウム溶液と混合した。３０℃にて５から６時間振とう培養した後、４００μｌを滅菌チューブに移し、２μｌのＰ１ファージストック（東京大学分子細胞生物学研究所より入手可能）を添加し、３７℃にて１０分間保温した。該チューブに５０℃に保温した３ｍｌのソフトアガー溶液を添加し、よく攪拌した後、Ｃａ−ＬＢ寒天培地プレート上にまいた。該プレートを３７℃で７時間培養した後、スプレッダーでソフトアガー部分を細かく砕いて回収し、１５００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離した。得られた上清１．５ｍｌに対し１００μｌのクロロホルムを添加し、４℃にて一晩保存した後、１５０００ｇにて２分間遠心分離し、得られた上清をファージストックとして４℃で保存した。
【０１２１】
上記で取得したファージを用いてＭＧ１６５５ｒｐｓＬ株に以下の方法により形質導入した。ＭＧ１６５５ｒｐｓＬ株を５ｍｌのＣａ−ＬＢ液体培地を用いて、３０℃で４時間培養した培養液を２００μｌ分取し、上記で取得したファージストックを１μｌ添加した。３７℃で１０分間保温した後、５ｍｌのＬＢ培地と２００μｌの１ｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウム溶液を添加し、攪拌した。１５００ｇ、２５℃にて１０分間遠心分離した後、上清を捨て、得られた沈殿した細胞に１ｍｌのＬＢ培地と１０μｌの１ｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウム溶液を加え３０℃にて２時間保温した。該溶液１００μｌを１５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むアンチバイオティックメディウム３寒天培地に塗布し、３０℃で一晩培養した。得られたコロニー２４個をそれぞれ、１５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むアンチバイオティックメディウム３寒天培地、１５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールと１０％シュークロースを添加した塩化ナトリウムを含まないＬＢ寒天培地、および１５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールと５０ｍｇ／ｌのストレプトマイシンを添加した塩化ナトリウムを含まないＬＢ寒天培地に塗布し、クロラムフェニコール耐性でかつシュークロース感受性かつストレプトマイシン感受性の株を選択することにより、Δ２−１＿ｓｓ領域が形質導入されたＭＧ１６５５ｒｐｓＬΔ２−１＿ｓｓ株を取得した。
【０１２２】
次に実施例６で得られたΔ２−１株よりファージストックを上記と同様の方法にて調製した。該ファージストックを用いて上記と同様の方法にてＭＧ１６５５ｒｐｓＬΔ２−１＿ｓｓ株に形質導入し、シュークロース耐性、ストレプトマイシン耐性、かつクロラムフェニコール感受性の株を選択することにより、Δ２−１＿ｓｓ領域中のマーカー遺伝子挿入領域が、Δ２−１株由来のマーカー遺伝子削除領域に置換されたＭＧ１６５５ｒｐｓＬΔ２−１株を取得した。
【０１２３】
次に実施例５で得られたΔ４−１＿ｓｓ株よりファージストックを上記と同様の方法にて調製した。該ファージストックを用いて上記と同様の方法にてＭＧ１６５５ｒｐｓＬΔ２−１に形質導入し、クロラムフェニコール耐性、シュークロース感受性かつストレプトマイシン感受性の株を選択することにより、Δ４−１＿ｓｓ領域が形質導入されたＭＧ１６５５ｒｐｓＬΔ２−１Δ４−１＿ｓｓ株を取得した。
【０１２４】
次に実施例６で得られたΔ４−１株よりファージストックを上記と同様の方法にて調製した。該ファージストックを用いてＭＧ１６５５ｒｐｓＬΔ２−１Δ４−１＿ｓｓ株に形質導入し、シュークロース耐性、ストレプトマイシン耐性かつクロラムフェニコール感受性の株を選択することにより、Δ４−１＿ｓｓ領域中のマーカー遺伝子領域がΔ４−１株由来のマーカー遺伝子削除領域に置換されたＭＧ１６５５ｒｐｓＬΔ２−１Δ４−１株を得た。
【０１２５】
上記の方法を用いることにより、マーカー遺伝子挿入型欠損株由来のＰ１ファージとマーカー遺伝子領域削除型欠損株由来のＰ１ファージとを交互に用いて形質導入を繰り返すことにより、複数のマーカー遺伝子削除型欠損を一つの菌株の染色体ＤＮＡ上に多重に導入することができる。
【０１２６】
【発明の効果】
本発明によれば、染色体ＤＮＡ上に、１０ｋｂ以上の欠損を有する微生物を容易に製造することができ、さらに該製造法に、染色体ＤＮＡ上に薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を削除する工程を付加することにより、１０ｋｂ以上の欠損を染色体ＤＮＡ上に多重に有する微生物を製造することができる。
【０１２７】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【０１２８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はプラスミドｐＣＲ２．１＿ｓａｃＢ＿２００＿ｃａｔ 中のｓａｃＢ遺伝子とｃａｔ遺伝子の連部分の構造を示す図である。
【図２】図２はｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子およびｃａｔ遺伝子を連結したマーカーユニット断片の構造を示す図である。
【符号の説明】
ｓａｃＢ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のレバンシュークラーゼ遺伝子
ｃａｔ：プラスミドｐＨＳＧ３９９由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子
ｒｐｓＬ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のストレプトマイシン感受性リボソーマルタンパク質遺伝子
Claims (8)
- 薬剤耐性遺伝子を有する直鎖ＤＮＡであり、かつ置換または欠損の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に位置するＤＮＡとそれぞれ相同性を有するＤＮＡを、その両端に有する直鎖ＤＮＡを用いて微生物を形質転換することを特徴とする、染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂ以上の領域が置換または欠損した微生物の製造法。
- 請求項１記載の製造法で得られた染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂ以上の領域が置換または欠損した微生物に、請求項１で用いられる置換または欠損の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に位置するＤＮＡとそれぞれ相同性を有するＤＮＡをその両端に有する直鎖ＤＮＡを導入することにより、染色体ＤＮＡ上に挿入された薬剤耐性遺伝子を削除することを特徴とする、染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂ以上の領域が置換または欠損した微生物の製造法。
- 以下の［１］〜［３］の工程、
［１］薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を有する直鎖ＤＮＡであり、かつ置換または欠損を導入したい染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に位置するＤＮＡとそれぞれ相同性を有するＤＮＡをその両端に有する直鎖ＤＮＡ用いて微生物を形質転換する工程
［２］上記［１］で用いた置換または欠損を導入したい染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に位置するＤＮＡとそれぞれ相同性を有するＤＮＡをその両端に有する直鎖ＤＮＡを該形質転換体に導入する工程
［３］染色体ＤＮＡ上から、［１］で用いた薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が削除された形質転換体を選択する工程
を含む、染色体ＤＮＡ上の１０ｋｂ以上の領域が置換または欠損した微生物の製造法。 - 請求項３の［１］〜［３］の工程を繰り返すことを特徴とする染色体ＤＮＡ上の異なる位置に存在する２以上の１０ｋｂｐ以上の領域が置換または欠損した微生物の製造法。
- 置換または欠損の導入対象である染色体ＤＮＡ上の領域の両端の外側に位置するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡが、各々５００ｂｐ〜５ｋｂｐの長さを有するＤＮＡである請求項１〜４記載の製造法。
- 微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物である請求項１〜５記載の製造法。
- 薬剤耐性遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子である請求項１〜６記載の製造法。
- ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物由来のｓａｃＢ遺伝子またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物由来のｒｐｓＬ遺伝子である請求項３〜７記載の製造法。
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| JP (1) | JP2004166576A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009116566A1 (ja) | 2008-03-18 | 2009-09-24 | 協和発酵キリン株式会社 | 工業的に有用な微生物 |
-
2002
- 2002-11-19 JP JP2002335475A patent/JP2004166576A/ja active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009116566A1 (ja) | 2008-03-18 | 2009-09-24 | 協和発酵キリン株式会社 | 工業的に有用な微生物 |
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