JP2004201605A - レジオネラ属菌リボソームｌ７／ｌ１２タンパク質をコードするｄｎａ - Google Patents
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Abstract
【課題】Legionella pneumophila由来の新規なリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質、並びにそれをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【解決手段】以下の何れかのタンパク質をコードするポリヌクレオチド。（ａ）Legionella pneumophila由来の特定なアミノ酸配列を有するタンパク質；又は（ｂ）Legionella pneumophila由来の特定なアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質。
【選択図】 なし
【解決手段】以下の何れかのタンパク質をコードするポリヌクレオチド。（ａ）Legionella pneumophila由来の特定なアミノ酸配列を有するタンパク質；又は（ｂ）Legionella pneumophila由来の特定なアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Legionella pneumophila由来の新規なリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質をコードする遺伝子、およびその応用に関する。さらに詳しくは、本発明は、該タンパク質あるいはそのホモログ、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドの取得方法、該ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、該組み換えベクターを含有する形質転換体、該タンパク質の製造方法、該タンパク質に対する抗体に関する。さらに本発明は、Legionella pneumophilaの検出やLegionella pneumophilaが関与する疾患の診断、治療または予防を行う際の本発明のタンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
レジオネラ属菌群は土壌や河川など自然環境に広く分布するブドウ糖非発酵グラム陰性桿菌で、細菌や藻類などの代謝産物を栄養源にしたり、アメーバーなどの原生動物の体内に寄生することにより増殖することが確認されているが、人への感染例は稀であるとされてきた。しかし、近年レジオネラ属菌による院内感染や循環風呂汚染での感染がもとで、レジオネラ症と呼ばれる肺炎等を引き起こすことが報告され、特に高齢者では死亡例も数多く報告されるに至っている。レジオネラ属細菌感染症にはβラクタム剤などの通常の一次選択抗生剤が無効であり、有効な治療がほどこされない場合には容易に重症化しやすいことが知られている。このようにレジオネラ属菌の感染は社会的にも問題視されており、臨床サンプルのみならず環境水を対象とした簡便かつ迅速なレジオネラ属菌の早期検出方法の確立が望まれている。
【０００３】
従来レジオネラ属菌の検出は分離培養法が用いられてきたが、レジオネラ属菌は日常の検査で使用される培地では生育せず、特殊培地が必要であること、さらにレジオネラ属菌は増殖が遅いためこの方法では検査に数日を要するという欠点がある。
【０００４】
そこで近年では、レジオネラ菌に対する抗体を用いた免疫学的な手法による検出が試みられている。米国特許第4,851,333号公報にはレジオネラ・ニューモフィラ由来の蛋白質特異抗原およびその抗体を用いることで、レジオネラ・ニューモフィラの全てのセロタイプと反応しかつ他のレジオネラ属細菌とは反応しない特異的な免疫法検出が可能であることが示されている。国際公開ＷＯ８７／０６４６９号公報にはレジオネラ感染症の診断に利用可能なレジオネラ・ニューモフィラ種特異的あるいはレジオネラ属特異的な新規なモノクローナル抗体が示されている。また、国際公開ＷＯ８７／０５６０９号公報にはレジオネラ症の診断のためのレジオネラ属特異的な検出に利用可能なレジオネラ属細菌に特異的な外膜蛋白質に対するモノクローナル抗体が示されている。ドイツ公開特許番号3537272号公報にはレジオネラ・ニューモフィラ細菌の内特に血清型１の細菌にのみ特異的に反応しその検出、診断に有用な新規なモノクローナル抗体が開示されている。
【０００５】
また、レジオネラ属菌の遺伝子情報を基づいた検出方法についても開発が試みられている。例えば、米国特許第5,935,782号公報にはレジオネラ・ニューモフィラの特異的なDNA検出に利用可能なfrgA（iron-repressed-gene）遺伝子およびそのフラグメントの遺伝子配列が開示されている。ドイツ公開特許番号4419294号公報にはレジオネラ感染症診断に利用可能なレジオネラ・ニューモフィラ細菌に特異的な分子量29kdの外膜蛋白質をコードするDNA配列が開示されている。国際公開ＷＯ９４／２８１７４号公報にはレジオネラ属の23Sあるいは16SのリボゾーマルＲＮＡ、あるいはリボゾーマルＤＮＡとハイブリダイズ可能な遺伝子配列情報が開示されている。さらに、レジオネラ菌の遺伝子配列に基づき、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法、さらにはＬＡＭＰ(Loop-Mediated IsothermalAmplification)法により種々の遺伝子を増幅させることで検出することも試みられている。
【０００６】
しかしながら、レジオネラ・ニューモフィラのリボゾーム蛋白質、特にリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質を抗原とする特異的な抗体あるいはそのＤＮＡ配列の特異性を利用した診断等に関する従来技術はこれまでのところ全く知られていなかった。
【０００７】
【特許文献１】
米国特許第4,851,333号公報
【特許文献２】
国際公開ＷＯ８７／０６４６９号公報
【特許文献３】
国際公開ＷＯ８７／０５６０９号公報
【特許文献４】
ドイツ公開特許番号3537272号公報
【特許文献５】
米国特許第5,935,782号公報
【特許文献６】
ドイツ公開特許番号4419294号公報
【特許文献７】
国際公開ＷＯ９４／２８１７４号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Legionella pneumophila由来の新規なリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質、並びにそれをコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。すなわち本発明は、Legionella pneumophila由来の新規なリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質あるいはそのホモログ、さらには該タンパク質の一部のアミノ酸配列からなる部分ペプチド、これらのタンパク質あるいは部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドの取得方法、該ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、該組み換えベクターを含有する形質転換体、該タンパク質の調製方法、並びに該タンパク質と特異的に反応する抗体に関する。また、本発明は、上記したポリヌクレオチドまたは抗体を用いるLegionella pneumophilaの検出方法およびLegionella pneumophilaが関与する疾患の診断、治療又は予防方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質は、タンパク質合成に必須なリボソームを構成するタンパク質の一種で、全ての微生物に存在している。分子量は約１３キロダルトンで、エシュリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を始め、ヘモフィラスイン・フルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、ストレプトコッカス・ニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｅｕｍｏｎｉａｅ）、ナイセリア・メニンギチヂス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）など多くの微生物でアミノ酸配列やそれをコードする遺伝子の塩基配列が解明されている。各微生物のリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質のアミノ酸配列の相同性は５０％〜６５％程度であり、必ずしも高くなく、特にＮ末端領域の配列の相同性は低く、個々の微生物に特異的な配列を有している。このような特徴に着目して、たとえば、国際公開ＷＯ００／０６６０３号公報「微生物検出用抗体」に記載のごとく、微生物のリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質に対する抗体を作製し、免疫的手法によってその微生物を特異的に検知し同定できることが知られている。
【００１０】
一方、Legionella pneumophilaのゲノム配列は、Columbia Genome CenterのLegionella Genome Project等で解析が進められ、すでにその塩基配列の一部が公開されているが、リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質の遺伝子配列についてはいまだ同定されていない。本発明者らは、種々の細菌で保存されているリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質のＣ末端領域のアミノ酸配列を基に、公開されているLegionella pneumophilaゲノム配列を検索した。その結果、目的とするアミノ酸配列をコードすると推定される塩基配列を有する領域を見出した。しかし、この領域をタンパク質に翻訳すると、Ｎ末端領域のアミノ酸配列は、公知リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質とは全く異なることが判明した。
【００１１】
そこで本発明者らは、Ｃ末端領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を基に種々のＰＣＲプライマーを設計し、Legionella pneumophilaのゲノムＤＮＡの増幅を検討した。その結果、７１４塩基対からなるＤＮＡ断片の増幅に成功し、その塩基配列からリボソーム結合部位と推定される塩基配列領域を介して、１２５アミノ酸残基からなる新規なタンパク質をコードする領域を明らかにできた。このタンパク質は、種々の細菌リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質とＣ末端領域で高度に相同性を有しており、目的のLegionella pneumophilaリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質であることが示された。
【００１２】
さらに本発明者らは、このＤＮＡ断片のリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質コード領域を大腸菌発現用プラスミドに挿入し、大腸菌組み換え体を作製してその発現を検討した。その結果、目的タンパク質を融合タンパクとして発現させることに成功し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は以下に関するものである。
（１） 以下の何れかのタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；又は
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質。
【００１４】
（２） 以下の何れかのポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列又はその相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００１５】
（３） Legionella pneumophila由来のポリヌクレオチドである、（１）または（２）記載のポリヌクレオチド。
（４） （１）から（３）の何れかに記載のポリヌクレオチドの塩基配列のうち連続する１５塩基以上の長さを有する塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド。
（５） （１）から（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを用いる、Legionella pneumophilaの検出方法。
（６） （１）から（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む、Legionella pneumophila検出用試薬キット。
【００１６】
（７） 以下の何れかのタンパク質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質；又は
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質とその全長にわたり９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質であり、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質。
【００１７】
（８） 以下の何れかのアミノ酸配列中の連続する少なくとも５つのアミノ酸を有する部分ペプチド。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するアミノ酸配列；又は
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）記載のアミノ酸配列とその全長にわたり９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列であり、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するアミノ酸配列。
【００１８】
（９） （１）から（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを発現することにより得られるタンパク質もしくは部分ペプチド。
（１０） （１）から（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター。
（１１） （１）から（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは（１０）に記載の組換えベクターを有する形質転換体。
（１２） （ａ）（１１）記載の形質転換体を培養し、（ｂ）発現された組み換えタンパク質もしくはペプチドを回収することを含む、タンパク質もしくは部分ペプチドの製造方法。
【００１９】
（１３） （７）から（９）の何れかに記載のタンパク質もしくは部分ペプチドに対する抗体。
（１４） （１３）記載の抗体を用いるLegionella pneumophilaの検出方法。
（１５） （１４）記載の抗体を含む、Legionella pneumophila検出用試薬キット。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明においてポリヌクレオチドとは、Legionella pneumophilaのリボソームＬ7/Ｌ１２タンパク質に相同性のあるタンパク質あるいは部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドであれば、特に限定されない。また、本発明のタンパク質とは、Legionella pneumophilaのリボソームＬ7/Ｌ１２タンパク質に相同性のあるタンパク質あるいは部分ペプチドであれば、特に限定されない。
【００２１】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質を提供し、これに関連してさらに以下のタンパク質を提供する。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質；
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質とその全長にわたり９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質であり、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質；及び、
（ｄ）上記（ａ）から（ｃ）の何れかのアミノ酸配列中に連続する少なくとも５つのアミノ酸を有する部分ペプチド。
【００２２】
“同一性”とは、当該技術で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、３以上のタンパク質あるいは９以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の適合によって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間の適合によって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味する。“同一性”は、既知の方法により容易に決定できる。同一性を決定する好ましい方法は、試験する配列間で最も長く適合するように設計される。同一性を決定するための方法は、公に利用可能なプログラムにコードされている。相同性決定には、AltschulらによるBLAST (Basic Local AlignmentSearch Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, MyersEW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25:p3389-3402 (1997)）を利用し決定することができる。BLASTのようなソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を用いるのが好ましい。BLAST検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りであるが、これに限定されない。
【００２３】
アミノ酸置換行列とは２０種類のアミノ酸の各々のペアの類縁性を数値化した行列であり、通常BLOSUM62のデフォルトマトリックスが用いられる。このアミノ酸置換行列の理論についてはAltschul S.F., J.Mol.Biol.,219:555-565(1991)に、ＤＮＡ配列の比較への適用についてはStates D.J., Gish W., Altschul S.F.,Methods, 3:66-70(1991)に示されている。その際の最適なギャップコストは経験的に決定されており、BLOSUM62の場合は好ましくは、Existence 11、Extension 1のパラメーターが用いられる。期待値（EXPECT）とは、データベース配列に対してマッチする際の統計的有意性に関する閾値であり、デフォルト値は１０である。
【００２４】
一例として、配列番号２のアミノ酸配列に対して例えば９５％以上の同一性を有するタンパク質は、そのアミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸１００個あたり５個までのアミノ酸の変化を含んでよいことを意味する。言い換えれば、対照アミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質は、対照配列中の全アミノ酸の５％までの数のアミノ酸が欠失または他のアミノ酸と置換していてもよく、あるいは、対照配列中の全アミノ酸配列のうち５％までの数のアミノ酸が対照配列中に挿入されたものであってもよい。対照配列におけるこれらの変化は、対照アミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシ末端位置に存在していてもよく、あるいはそれらの末端間のいずれかの位置に存在していてもよく、あるいは対照配列内で１個またはそれ以上の一連の群をなしていてもよい。
【００２５】
また本発明は、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを提供し、これに関してさらに以下のポリヌクレオチドを提供する。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列又はその相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｄ）上記（ａ）から（ｃ）の何れかに記載のポリヌクレオチドの塩基配列のうち連続する１５塩基以上の長さを有する塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド。
【００２６】
上記ポリヌクレオチド配列に含まれる塩基配列に同一または実質的に同一なポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンまたは上記配列に対応する相同性の高い他の遺伝子のｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離するためのハイブリダイゼーションプローブとして、または核酸増幅反応のためのプライマーとして使用してもよい。代表的には、これらのヌクレオチド配列は、上記配列に７０％同一であり、好ましくは８０％同一であり、より好ましくは９０％同一であり、最も好ましくは９５％同一である。プローブまたはプライマーは、一般的には少なくとも１５ヌクレオチドを含有し、好ましくは３０ヌクレオチドを含有し、５０ヌクレオチドを含有してもよい。特に好ましいプローブは、３０〜５０ヌクレオチドを有する。特に好ましいプライマーは、２０〜２５ヌクレオチドを有する。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態（たとえば、ｃＤＮＡおよびクローニングによって得られるか、あるいは合成的に生成されるゲノムＤＮＡを含む）であってもよく、ＲＮＡ（たとえばｍＲＮＡ）の形態であってもよい。該ポリヌクレオチドは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドであってもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（コード鎖としても知られる）であっても、アンチセンス鎖（非コード鎖としても知られる）であってもよい。
【００２８】
当業者であれば、公知の方法を用いてこのタンパク質中のアミノ酸の置換などを適宜行ない、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と同様に、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質もしくは部分ペプチドを作製することが可能である。一つの方法としては、該タンパク質をコードするＤＮＡに対して、慣用の突然変異誘発法を使用する方法がある。別の方法としてはたとえば部位特異的変異法（たとえば宝酒造株式会社のMutan-Super Express Km キット）が挙げられる。また、タンパク質のアミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このようにアミノ酸の欠失、置換、付加により配列番号２のタンパク質に対してアミノ酸配列が変異した変異体であって、Legionella pneumophilaに対する抗体を調製するに適当な抗原性を有するタンパク質及び該タンパク質をコードするＤＮＡも本発明に含まれる。変異の数は、好ましくは１０以下、より好ましくは５以下、最も好ましくは３以下が好ましい。
【００２９】
アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のグループ内での置換が挙げられる。（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）。
当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術などを用いて配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡまたはその一部を基に、これと類似性の高いＤＮＡを単離して、該ＤＮＡから配列番号１に類似の塩基配列を有するＤＮＡを得ることも容易に行うことができる。このように配列番号１で表される塩基配列のＤＮＡと高い同一性を有するＤＮＡであって、上記配列番号２のアミノ酸配列を含み、Legionella pneumophilaに対する抗体を調製するに適当な抗原性を有するタンパク質あるいは部分ペプチドを得ることは可能である。
【００３０】
本発明のタンパク質あるいは部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡの他、化学合成ＤＮＡも含まれる。このようなＤＮＡは、公知の方法により化学合成することができる。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含まれる。ストリンジェントな条件とは、当業者には十分理解できることであり、たとえば、T.Maniatisらの実験操作書（Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory 1982、1989）などに従えば容易に実施できる。
【００３２】
すなわち、ストリンジェントな条件とは、３０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中（５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性せん断サケ精子ＤＮＡ）で３７℃のインキュベーションを一晩行い、その後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分の洗浄を３回行い、次いで１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で１０分の洗浄を２回行う条件である（低ストリンジエンシー）。より好ましい条件は、４０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃のインキュベーションを一晩行い、その後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分の洗浄を３回行い、次いで０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中、４２℃で１０分の洗浄を２回行う条件である（中ストリンジエンシー）。最も好ましい条件は、５０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃のインキュベーションを一晩行い、その後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分の洗浄を３回行い、次いで０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で１０分の洗浄を２回行う条件である（高ストリンジエンシー）。
【００３３】
本発明のポリヌクレオチドは、前述のタンパク質を、組換えＤＮＡ技術を用いて製造するのに用いることができる。本発明のポリヌクレオチド及びペプチドは、概略以下のようにして得ることができる。
（Ａ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡをクローニングする。
（Ｂ）タンパク質の全コード領域あるいはその一部をコードするＤＮＡを発現用ベクターに組み込んで、組換えベクターを構築する。
（Ｃ）構築した組換えベクターにより、宿主細胞を形質転換する。
（Ｄ）得られた細胞を培養し、該タンパク質、またはその類縁体を発現させ、カラムクロマトグラフィーなどにより精製する。
【００３４】
上記の工程中でＤＮＡ、組換え体宿主としての大腸菌等の取り扱いに必要な一般的な操作は、当業者間で通常行われているものであり、たとえば、上記Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの実験操作書に従えば容易に実施できる。使用する酵素、試薬類も全て市販の製品を用いることができ、特に断らない限り、製品で指定されている使用条件に従えば、完全にそれの目的を達成することができる。以下に上記（Ａ）〜（Ｄ）の工程について更に詳しく説明する。
【００３５】
上記工程（Ａ）における本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本願明細書実施例に記載した方法の他に、本発明のヌクレオチド配列（たとえば配列番号１の一部を有する合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって増幅する方法、あるいは、適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別すること、などが挙げられる。
【００３６】
本発明は、上記のＤＮＡを含有する組換えベクターを提供する。本発明のタンパク質の発現ベクターは、たとえば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。用いる発現ベクターとしては、複製可能であれば、大腸菌をはじめとする原核生物由来、酵母由来、真菌由来、などの微生物由来のベクター、さらには昆虫ウイルス由来、脊椎動物ウイルス由来、いずれのベクターでも良いが、宿主として使用する微生物または細胞に適したものを選択する必要がある。また、発現物に応じて、宿主細胞―発現ベクター系としては、適切な組み合わせが選択される。
【００３７】
微生物を宿主として使用する場合、これら微生物に適したプラスミドベクターが組換え体ＤＮＡの複製可能な発現ベクターとして一般に用いられる。たとえば、大腸菌を形質転換するためのプラスミドベクターとしては、プラスミドｐＢＲ３２２やｐＢＲ３２７などを用いることができる。プラスミドベクターは通常複製起源、プロモーター、及び組換え体ＤＮＡで形質転換した細胞を選別するのに有用な表現型を組換え体ＤＮＡに与えるマーカー遺伝子等を含んでいる。プロモーターの例としては、β−ラクタマーゼプロモータ、ラクトースプロモーター、トリプトファンプロモーター等が挙げられる。マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン耐性遺伝子やテトラサイクリン遺伝子などが挙げられる。適した発現ベクターの例としては、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２７の他に、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等が挙げられる。
【００３８】
酵母で本発明のＤＮＡを発現するためには、複製可能なベクターとして、たとえばＹＥｐ２４を用いることができる。プラスミドＹＥｐ２４はＵＲＡ３遺伝子を含有しており、このＵＲＡ３遺伝子をマーカー遺伝子として利用することができる。酵母細胞用の発現ベクターのプロモーターの例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼなどの遺伝子のプロモーター等が挙げられる。
【００３９】
真菌で本発明のＤＮＡを発現するための発現ベクターに用いられるプロモーター及びターミネーターの例としては、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）、アクチン等の遺伝子プロモーター及びターミネーターが挙げられる。適した発現ベクターの例としては、プラスミドｐＰＧＡＣＹ２、ｐＢＳＦＡＨＹ８３等が挙げられる。
【００４０】
上記工程（Ｃ）において用いる宿主としては、大腸菌をはじめとする原核生物、酵母、真菌等の微生物、及び昆虫や動物等の細胞のいずれでもよいが、用いる発現ベクターに適したものを選択する必要がある。微生物の例としては、エシュリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の菌株、たとえばＥ．ｃｏｌｉＫ１２株２９４（ＡＴＣＣ ３１４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１５３７）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ６００、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ株、あるいはバチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の如きＢａｃｉｌｌｕｓ属の菌株、あるいはサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）またはセラチア・マーゼサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓ）等の大腸菌以外の腸内菌、あるいはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の種々の菌株が挙げられる。
【００４１】
酵母としては、たとえば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。真菌としては、たとえば、アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）（ＡＴＣＣ １１５５０）等が挙げられる。
【００４２】
上記の形質転換された細胞を本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが発現可能な条件下で培養し、本発明のタンパク質を生成、蓄積せしめることによって、本発明のタンパク質を製造することができる。すなわち、本発明は、上記した本発明のポリヌクレオチドを含む形質転換された細胞を、該ポリヌクレオチドによりコードされているタンパク質を発現させる条件下培養し、次いで培養物から該タンパク質を回収することを含む該タンパク質の製造方法を提供する。
【００４３】
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。たとえば、本発明のタンパク質は、硫安またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスフォセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む既知の方法により組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィーが精製に使用される。
【００４４】
本発明のタンパク質あるいは部分ペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として製造することができる。これらも、本発明に含まれる。この融合タンパク質を発現する際に用いられるベクターとしては、該タンパク質をコードするＤＮＡを組み込むことができ、かつ該融合タンパク質を発現することができるベクターであれば、いかなるベクターでも用いることができる。本発明のペプチドに融合できるタンパク質としては、たとえばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジン残基の６個の連続配列（６×Ｈｉｓ）等が挙げられる。本発明のタンパク質を他のタンパク質と融合したタンパク質として発現させた場合には、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、有利である。例えば、ＧＳＴとの融合タンパク質として生産した場合は、グルタチオンをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【００４５】
本発明は、前記の本発明のタンパク質あるいはその部分ペプチドに特異的に結合する抗体ならびにそのような抗体の製造方法に関する。抗体を作成するためのペプチドの長さは特に限定されないがリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質蛋白質に対する抗体の場合、この蛋白質を特徴づけられる長さがあれば良く、好ましくは５アミノ酸以上、特に好ましくは８アミノ酸以上のペプチドを用いればよい。抗体は、本発明のタンパク質を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ならびにこれらの抗体のフラグメント、一本鎖抗体、ヒト化抗体の何れであってもよい。抗体フラグメントは、公知の技術によって作製することができる。たとえば、該抗体フラグメントには、限定されるものではないが、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂフラグメント及びＦｖフラグメントが含まれる。たとえば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、上記した本発明のタンパク質またはその部分ペプチドを抗原またはエピトープ含有フラグメントとして非ヒト動物に投与することにより得られる。本発明のタンパク質に対する抗体は、本発明のタンパク質あるいはその部分ペプチドを抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。たとえば実験医学別冊 新遺伝子工学ハンドブック 改訂第３版に記載の方法が挙げられる。
【００４６】
ポリクローナル抗体の場合であれば、たとえば、ウサギなどの動物に本発明のタンパク質あるいは部分ペプチドを注射することにより該タンパク質あるいはペプチドに対する抗体を産生させ、次いで血液を採取し、これを、たとえば硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、あるいは該タンパク質を固定化したアフィニティーカラム等によって精製することで調製することができる。
【００４７】
モノクローナル抗体の場合は、たとえば、本発明のタンパク質あるいは部分ペプチドをマウスなどの動物に免疫し、同マウスから脾臓を抽出し、これをすりつぶして細胞にし、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、本発明のタンパク質に対する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウス内より腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、たとえば硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、あるいは該タンパク質を固定化したアフィニティーカラム等によって精製することで調製することができる。
【００４８】
本発明における抗体を用いるLegionella pneumophila検出方法とは、例えばポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術であるＥＬＩＳＡ法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もしくは発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともにキャプチャー抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチアッセイなどの既知の免疫測定手法を利用する検出方法に相当する。
【００４９】
また、特に抗体を用いるLegionella pneumophila検出方法として、特表平7-509565号公報に記載されているシリコン、窒化珪素などにより形成された光学薄膜上で抗体反応をおこない光干渉原理等により検出するいわゆるオプティカルイムノアッセイ(OIA,Optical Immunoassay)などが高感度な検出方法として有用である。
【００５０】
また該検出方法において必要となる微生物からの細胞内マーカー抗原の抽出方法としては、トリトンＸ−１００(Triton X-100)、ツイーン−２０(Tween-20)をはじめとする種々の界面活性剤を用いた抽出試薬による処理法、適当なプロテアーゼなどの酵素を用いる酵素処理法、物理的方法による微生物細胞の破砕をはじめ既知の細胞構造の破砕手法が用いられうるが、界面活性剤等の組み合わせにより微生物ごとに試薬による最適な抽出条件を設定することが望ましい。
また、本発明における、抗体を用いるLegionella pneumophila検出用試薬キットとは、当該検出方法を用いた検出用試薬キットに相当する。
【００５１】
更に本発明の配列番号１で示される塩基配列またはその一部を含むポリヌクレオチドは、Legionella pneumophilaの土壌や河川など自然環境における環境水汚染、さらには院内感染や循環風呂汚染を調べるために応用できる。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列を含むポリヌクレオチドをプローブとしたLegionella pneumophilaの検出。
（ｂ）上記塩基配列中に連続する少なくとも１５塩基からなるポリヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法やＬＡＭＰ法等遺伝子増幅によるLegionella pneumophilaの検出。
【００５２】
培養菌体に対しては、本発明のポリヌクレオチドをプローブとして用いれば、上記Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの実験操作書に記載のコロニーハイブリダイゼーション法やサザン法に従えば容易に実施できる。使用する酵素、試薬類も全て市販の製品を用いることができ、特に断らない限り、製品で指定されている使用条件に従えば、完全にそれの目的を達成することができる。
【００５３】
循環水や環境水を被験サンプルとする場合には、菌体を濃縮もしくはトラップして、ＤＮＡを抽出することが必要である。そのための簡便な方法として、ＥＰ０３８９０６３記載のシリカを用いる方法、ＷＯ００／２１９７３号記載のフィルターを用いる方法、特表平１１−５０１５０４号記載の磁性粒子を用いる方法などが挙げられ、これらを適宜組み合わせることも可能である。これらの方法によって抽出されたＤＮＡをテンプレートとして、本発明のＤＮＡの塩基配列に基づくプライマーを用いて遺伝子を増幅することにより、Legionella pneumophilaが検出できる。
以下に、実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明は、これらの例に何ら限定されるものではない。当業者には種々の変更、修飾が可能であり、これも本発明に含まれる。
【００５４】
【実施例】
実施例１
リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質のアミノ酸配列は、すでに数多くの微生物で明らかにされており、公開されている。そこで、Columbia Genome CenterのLegionella Genome Projectのサイトから、これらに類似するアミノ酸配列をコードするゲノム領域の検索を行った。その結果、７４５塩基配列からなるゲノム領域、LP.wg.165.61.07180 bin Contig78（以下、ＬＰ１領域と呼ぶ）に、Ｎ末端よりIEGAPSTVKEGVSKDEAASIKKELEEAGATVEVK で示される３４個のアミノ酸（配列番号３）からなる配列がコードされていることを見出した。このアミノ酸配列は、公知のリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質のＣ末側1/4の領域にホモロジーが高いことから、ＬＰ１領域にはLegionellaのリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質をコードされていると推定された。しかし、ＬＰ１領域の塩基配列にコードされているタンパク質は、前述したＣ末側領域はホモロジーが高いものの、その上流部分は全く違う配列になっていることが判明した。
【００５５】
そこでリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質のコーディング領域を特異的に増幅するため、ＬＰ１領域の塩基配列情報を基に、上流側のセンスプライマーとしてNP86（5'-CCTGGACGTCGACTCTTAAA-3'）（配列番号４）、および下流側のアンチセンスプライマーとしてNP89r（5'-AATGCAGCATGCAATCCCG-3'）（配列番号５） を設計した。ＰＣＲのテンプレートとするLegionella pneumophilaのゲノムＤＮＡは、ＡＴＣＣ（ American Type Culture Collection ）などから購入可能である。具体的にはATCC 33152D （ genomic DNA from Legionella pneumophila subsp. pneumophila ）を用いた。
【００５６】
これらのプライマーセットを用いて、このLegionella pneumophila ゲノム ＤＮＡをテンプレートとしてPCR反応を行った。具体的には、Legionella pneumophila １０ｎｇをに対して、上記プライマー各 50 pmol を加えて、Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）および酵素に添付のバッファーを５μｌ、酵素に添付のdNTP mixture ４μｌを加え、最終容量５０μｌとした。
【００５７】
この混合物を、TaKaRa PCR Thermal Cycler 480を用いて、９５℃ ３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分間の反応を３０サイクル行った。このＰＣＲ産物の一部を１％アガロースゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察した結果、約７００塩基対からなるＤＮＡ断片が増幅された。
【００５８】
このＤＮＡ断片を、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit（Invitrogen）を用いてTOPOベクターに連結し、E.coli DH5αに形質転換した。
得られた１２個の形質転換株を培養し、ウィザードミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の説明書に従って各プラスミドＤＮＡを分離した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化して、該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認した。
【００５９】
これらのプラスミドＤＮＡを、Applied Biosystems社製の蛍光シークエンサーを用いて塩基配列を解読した。その結果、驚くべきことに、本ＤＮＡ断片は、用いたプライマーセットのうちNP89rのみをプライマーとして増幅された、配列番号１で示される塩基配列からなる７１４塩基対であることが判明した。
【００６０】
すなわち、ＬＰ１領域の配列を基に設計されたプライマーセットのうち、実際は上流側プライマーNP86が働かず、その代わり、下流側のプライマーNP89rと非常に似た配列が上流部分に存在したため上流側のプライマーとして働き、ＰＣＲ反応によって増幅されたと推定された。
【００６１】
この７１４塩基からなる配列を解析すると、メチオニンで始まる配列番号２で示される１２４アミノ酸からなるオープンリーディングフレームが組めること、さらにその上流にribosome binding siteと推定される塩基配列AGGAも見出されることから、タンパク質をコードする遺伝子領域であると推定された。またそのアミノ酸配列は、他の微生物のリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質に、非常にホモロジーが高いことから、目的とするLegionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質の遺伝子であると断定された。
【００６２】
実施例２
Legionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質を大腸菌で発現させる目的で、上記ＤＮＡを含有するプラスミドＤＮＡ、Ｌｅｇ１６．Ｌ７／Ｌ１２に対して、リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質コーディング領域のＮ末に制限酵素ＢａｍＨＩサイトを付加したセンスプライマーＮＰ９４(5'-GGGATCCGCTGTATCAAAAAACGAAATATTA-3')（配列番号６）、Ｃ末にＸｈｏＩサイト(CTを付加したアンチセンスプライマーＮＰ９５ｒ（5'-GCTCGAGCGGTATCGGCATTATATCTGT-3'）（配列番号７）を作製し、ＰＣＲ反応にて増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)で精製後、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断した。一方、発現用ベクターとして用いるｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を同じ制限酵素で切断し、両者を１％アガロースゲルで電気泳動後、目的とするＤＮＡ断片をゲルから抽出し、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)によって精製した。これらの断片を、Ligation-High （TOYOBO社製）を用いて１６℃で１時間連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた。
【００６３】
得られた形質転換株１２個を培養して、各プラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ切断により目的ＤＮＡが構築されていることを確認した。さらにこれらのプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定し、目的の塩基配列、すなわちＧＳＴと同じ読み枠でLegionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質のコーディング領域が連結されていることを確認し、うち１つをｐＧＥＸ−Ｌｅｇ１６．Ｌ７／Ｌ１２とした。
【００６４】
本プラスミドＤＮＡを含有する大腸菌ＤＨ５α形質転換株をＬＢ培地に接種し、３７℃で１晩培養した。培養液２００μｌを１０ｍｌのＬＢ培地に移植し、３７℃にて１時間培養した後に終濃度２ｍＭとなるようにイソプロピルβ−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに４時間培養した。培養菌体を遠心分離にて回収し、Fast Protein Red Kit（ＢＩＯ１０１社製）に添付のYeast Breakage Buffer 500μlに懸濁し、ガラスビーズ入りチューブに移して、１０分間ボルテックスミキサーで撹拌して溶菌させた。得られた溶菌液の一部をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、タンパク質をクマシー染色した。その結果、Legionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質が分子量１５キロダルトンのＧＳＴ分子の下流に結合した、分子量４５キロダルトンの目的とする融合タンパク質のバンドが確認された。
【００６５】
実施例３：大量発現
プラスミドＤＮＡｐＧＥＸ−Ｌｅｇ１６．Ｌ７／Ｌ１２を含有する大腸菌ＤＨ５α形質転換株を、２倍濃度のＹＴ培地５０ｍｌ中で３７℃にて１晩培養した。３７℃で１時間温めておいた２倍濃度のＹＴ培地４５０ｍｌに１晩培養した大腸菌培養液５０ｍｌを移植し、３７℃１時間培養後、５００ｍＭのＩＰＴＧを１００μｌ入れ、さらに２５℃にて４時間培養した。該培養液２５０ｍｌずつを５０００ｒｐｍ、２０分遠心し菌体を回収し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２５％ Ｓｕｃｒｏｓｅを含む溶菌バッファー２５ｍｌずつに懸濁した。これに１０％ ＮＰ−４０を １．２５ｍｌ、１Ｍ ＭｇＣｌ2を１２５μｌ加えて、菌体を超音波破砕し、１２０００ｒｐｍ、１５分間遠心後、上澄みを回収した。
【００６６】
次にＰＢＳでコンディショニングしたグルタチオンセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）カラムに前記の上澄み液を吸着させた。次にＰＢＳでカラムを３ベットボリューム分洗浄した。その後１０ｍＭのグルタチオンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶出し、分画したフラクション中の蛋白質含有量を色素結合法（ブラッドフォード法；ＢｉｏＲａｄ社）で検出し、メインフラクションを取得した。メインフラクションをＰＢＳ３Ｌに対して３回透析を行った。
【００６７】
得られたＧＳＴ融合Legionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質の１ｍｇ／ｍｌ溶液１０ｍｌに５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴを含むＣｌｅａｖａｇｅバッファー１ｍｌを加え、さらに２Ｕ／μｌのＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を１００μｌ添加して４℃で反応させることによりＧＳＴ部分をLegionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質部分から切り離した。
【００６８】
次にＰＢＳでコンディショニングしたグルタチオンセファロースカラムに反応液を通し、通過液を回収し、さらにＰＢＳを１ベッドボリューム流し、これも回収した。取得した精製Legionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質の純度は電気泳動法により確認したところ約９０％であり免疫源として充分な純度を確保できた。
【００６９】
実施例４：抗体の作製
まずマウスの免疫についてはLegionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質１００μｇを２００μｌのＰＢＳに溶解後、フロイントのコンプリートアジュバントを２００μｌ加え混合、エマルジョン化した後２００μｌを腹腔内に注射した。さらに２週間後、４週間後、６週間後に同様のエマルジョン抗原を腹腔内に注射し、さらに１０週間後、１４週間後に２倍濃度の抗原エマルジョン液を腹腔内注射し最終免疫から３日後に脾臓を取り出し、細胞融合に供した。
【００７０】
無菌的に取り出したマウスの脾細胞１０8個に対し骨髄腫細胞２×１０7個をガラスチューブに取り良く混合した後１５００ｒｐｍで５分間遠心し上澄みを棄て、その後細胞をよく混合した。
【００７１】
細胞融合に使用した骨髄腫細胞はＮＳ−１系の細胞株を用い１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、細胞融合の２週間前から０．１３ｍＭのアザグアニン、０．５μｇ／ｍｌのＭＣ−２１０、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養後、さらに１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養したものを用いた。混合した細胞サンプルに３７℃に保温した５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を３０ｍｌ加え１５００ｒｐｍで遠心、上澄み除去後３７℃に保温した５０％ポリエチレングリコールを１ｍｌ加え激しく攪拌しながら２分間処理後、３７℃に保温した１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を加え液を滅菌ピペットで吸引、排出しながら約５分間激しく攪拌混合した。
【００７２】
１０００ｒｐｍで５分間遠心、上澄み除去後さらに３０ｍｌのＨＡＴ培地を加え細胞濃度が５×１０6個／ｍｌになるように調整し攪拌均一化後、９６穴プレート型培養プレートに０．１ｍｌずつ分注し７％ＣＯ2条件下、３７℃で培養し、１日目、１週間目、２週間目にＨＡＴ培地を０．１ｍｌずつ加えた。次に目的の抗体を生産している細胞をスクリーニングするためにＥＬＩＳＡ法による評価を実施した。０．０５％のアジ化ソーダ含むＰＢＳ中に溶解したLegionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質を１０μｇ／ｍｌ濃度に希釈した液を１００μｌずつ９６穴プレートの別々に分注し４℃で１晩吸着させた。上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ中）２００μｌ添加し室温で１時間反応しブロッキングする。上澄み除去後洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０２％、ＰＢＳ）で洗浄し、その上に融合細胞の培養液１００μｌを加え室温で２時間反応後上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄後、５０ｎｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体液を１００μｌ加え室温、１時間反応を実施し、上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した後ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ社）を１００μｌずつ加え室温で２０分反応、発色後１Ｎの硫酸を１００μｌ添加して反応を停止し、４５０ｎｍの吸光を測定した。
【００７３】
この結果Legionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質に反応する陽性ウェルが見いだされLegionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質に対する抗体が含まれていることが判明した。
【００７４】
そこで陽性ウェル中の細胞をそれぞれ回収し２４穴プラスティックプレート中、ＨＡＴ培地で培養した。培養した融合培地を細胞数が約２０個／ｍｌになるようにＨＡＴ培地で希釈し５０μｌを、ＨＡＴ培地に懸濁した６週齢のマウス胸腺細胞１０6個と９６穴培養プレート中で混合後、７％ＣＯ2条件下、３７℃で２週間培養した。培養上澄み中の抗体活性を前述のＥＬＩＳＡ法にて同様に検定し、Legionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質との反応陽性の細胞を回収した。
さらに同様の希釈検定、クローニング操作を繰り返し、ハイブリドーマＬＰＡＭ−１〜４の計４クローンを取得した。
【００７５】
【発明の効果】
本発明により、Legionella pneumophila由来の新規なリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質、該タンパク質に対する抗体、並びに該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。本発明のタンパク質、抗体およびポリヌクレオチドは、Legionella pneumophilaの検出や、Legionella pneumophilaが関与する疾患の診断、治療または予防のために有用である。
【００７６】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Legionella pneumophila由来の新規なリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質をコードする遺伝子、およびその応用に関する。さらに詳しくは、本発明は、該タンパク質あるいはそのホモログ、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドの取得方法、該ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、該組み換えベクターを含有する形質転換体、該タンパク質の製造方法、該タンパク質に対する抗体に関する。さらに本発明は、Legionella pneumophilaの検出やLegionella pneumophilaが関与する疾患の診断、治療または予防を行う際の本発明のタンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
レジオネラ属菌群は土壌や河川など自然環境に広く分布するブドウ糖非発酵グラム陰性桿菌で、細菌や藻類などの代謝産物を栄養源にしたり、アメーバーなどの原生動物の体内に寄生することにより増殖することが確認されているが、人への感染例は稀であるとされてきた。しかし、近年レジオネラ属菌による院内感染や循環風呂汚染での感染がもとで、レジオネラ症と呼ばれる肺炎等を引き起こすことが報告され、特に高齢者では死亡例も数多く報告されるに至っている。レジオネラ属細菌感染症にはβラクタム剤などの通常の一次選択抗生剤が無効であり、有効な治療がほどこされない場合には容易に重症化しやすいことが知られている。このようにレジオネラ属菌の感染は社会的にも問題視されており、臨床サンプルのみならず環境水を対象とした簡便かつ迅速なレジオネラ属菌の早期検出方法の確立が望まれている。
【０００３】
従来レジオネラ属菌の検出は分離培養法が用いられてきたが、レジオネラ属菌は日常の検査で使用される培地では生育せず、特殊培地が必要であること、さらにレジオネラ属菌は増殖が遅いためこの方法では検査に数日を要するという欠点がある。
【０００４】
そこで近年では、レジオネラ菌に対する抗体を用いた免疫学的な手法による検出が試みられている。米国特許第4,851,333号公報にはレジオネラ・ニューモフィラ由来の蛋白質特異抗原およびその抗体を用いることで、レジオネラ・ニューモフィラの全てのセロタイプと反応しかつ他のレジオネラ属細菌とは反応しない特異的な免疫法検出が可能であることが示されている。国際公開ＷＯ８７／０６４６９号公報にはレジオネラ感染症の診断に利用可能なレジオネラ・ニューモフィラ種特異的あるいはレジオネラ属特異的な新規なモノクローナル抗体が示されている。また、国際公開ＷＯ８７／０５６０９号公報にはレジオネラ症の診断のためのレジオネラ属特異的な検出に利用可能なレジオネラ属細菌に特異的な外膜蛋白質に対するモノクローナル抗体が示されている。ドイツ公開特許番号3537272号公報にはレジオネラ・ニューモフィラ細菌の内特に血清型１の細菌にのみ特異的に反応しその検出、診断に有用な新規なモノクローナル抗体が開示されている。
【０００５】
また、レジオネラ属菌の遺伝子情報を基づいた検出方法についても開発が試みられている。例えば、米国特許第5,935,782号公報にはレジオネラ・ニューモフィラの特異的なDNA検出に利用可能なfrgA（iron-repressed-gene）遺伝子およびそのフラグメントの遺伝子配列が開示されている。ドイツ公開特許番号4419294号公報にはレジオネラ感染症診断に利用可能なレジオネラ・ニューモフィラ細菌に特異的な分子量29kdの外膜蛋白質をコードするDNA配列が開示されている。国際公開ＷＯ９４／２８１７４号公報にはレジオネラ属の23Sあるいは16SのリボゾーマルＲＮＡ、あるいはリボゾーマルＤＮＡとハイブリダイズ可能な遺伝子配列情報が開示されている。さらに、レジオネラ菌の遺伝子配列に基づき、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法、さらにはＬＡＭＰ(Loop-Mediated IsothermalAmplification)法により種々の遺伝子を増幅させることで検出することも試みられている。
【０００６】
しかしながら、レジオネラ・ニューモフィラのリボゾーム蛋白質、特にリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質を抗原とする特異的な抗体あるいはそのＤＮＡ配列の特異性を利用した診断等に関する従来技術はこれまでのところ全く知られていなかった。
【０００７】
【特許文献１】
米国特許第4,851,333号公報
【特許文献２】
国際公開ＷＯ８７／０６４６９号公報
【特許文献３】
国際公開ＷＯ８７／０５６０９号公報
【特許文献４】
ドイツ公開特許番号3537272号公報
【特許文献５】
米国特許第5,935,782号公報
【特許文献６】
ドイツ公開特許番号4419294号公報
【特許文献７】
国際公開ＷＯ９４／２８１７４号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Legionella pneumophila由来の新規なリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質、並びにそれをコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。すなわち本発明は、Legionella pneumophila由来の新規なリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質あるいはそのホモログ、さらには該タンパク質の一部のアミノ酸配列からなる部分ペプチド、これらのタンパク質あるいは部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドの取得方法、該ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、該組み換えベクターを含有する形質転換体、該タンパク質の調製方法、並びに該タンパク質と特異的に反応する抗体に関する。また、本発明は、上記したポリヌクレオチドまたは抗体を用いるLegionella pneumophilaの検出方法およびLegionella pneumophilaが関与する疾患の診断、治療又は予防方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質は、タンパク質合成に必須なリボソームを構成するタンパク質の一種で、全ての微生物に存在している。分子量は約１３キロダルトンで、エシュリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を始め、ヘモフィラスイン・フルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、ストレプトコッカス・ニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｅｕｍｏｎｉａｅ）、ナイセリア・メニンギチヂス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）など多くの微生物でアミノ酸配列やそれをコードする遺伝子の塩基配列が解明されている。各微生物のリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質のアミノ酸配列の相同性は５０％〜６５％程度であり、必ずしも高くなく、特にＮ末端領域の配列の相同性は低く、個々の微生物に特異的な配列を有している。このような特徴に着目して、たとえば、国際公開ＷＯ００／０６６０３号公報「微生物検出用抗体」に記載のごとく、微生物のリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質に対する抗体を作製し、免疫的手法によってその微生物を特異的に検知し同定できることが知られている。
【００１０】
一方、Legionella pneumophilaのゲノム配列は、Columbia Genome CenterのLegionella Genome Project等で解析が進められ、すでにその塩基配列の一部が公開されているが、リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質の遺伝子配列についてはいまだ同定されていない。本発明者らは、種々の細菌で保存されているリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質のＣ末端領域のアミノ酸配列を基に、公開されているLegionella pneumophilaゲノム配列を検索した。その結果、目的とするアミノ酸配列をコードすると推定される塩基配列を有する領域を見出した。しかし、この領域をタンパク質に翻訳すると、Ｎ末端領域のアミノ酸配列は、公知リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質とは全く異なることが判明した。
【００１１】
そこで本発明者らは、Ｃ末端領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を基に種々のＰＣＲプライマーを設計し、Legionella pneumophilaのゲノムＤＮＡの増幅を検討した。その結果、７１４塩基対からなるＤＮＡ断片の増幅に成功し、その塩基配列からリボソーム結合部位と推定される塩基配列領域を介して、１２５アミノ酸残基からなる新規なタンパク質をコードする領域を明らかにできた。このタンパク質は、種々の細菌リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質とＣ末端領域で高度に相同性を有しており、目的のLegionella pneumophilaリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質であることが示された。
【００１２】
さらに本発明者らは、このＤＮＡ断片のリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質コード領域を大腸菌発現用プラスミドに挿入し、大腸菌組み換え体を作製してその発現を検討した。その結果、目的タンパク質を融合タンパクとして発現させることに成功し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は以下に関するものである。
（１） 以下の何れかのタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；又は
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質。
【００１４】
（２） 以下の何れかのポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列又はその相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００１５】
（３） Legionella pneumophila由来のポリヌクレオチドである、（１）または（２）記載のポリヌクレオチド。
（４） （１）から（３）の何れかに記載のポリヌクレオチドの塩基配列のうち連続する１５塩基以上の長さを有する塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド。
（５） （１）から（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを用いる、Legionella pneumophilaの検出方法。
（６） （１）から（４）の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む、Legionella pneumophila検出用試薬キット。
【００１６】
（７） 以下の何れかのタンパク質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質；又は
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質とその全長にわたり９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質であり、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質。
【００１７】
（８） 以下の何れかのアミノ酸配列中の連続する少なくとも５つのアミノ酸を有する部分ペプチド。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するアミノ酸配列；又は
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）記載のアミノ酸配列とその全長にわたり９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列であり、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するアミノ酸配列。
【００１８】
（９） （１）から（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを発現することにより得られるタンパク質もしくは部分ペプチド。
（１０） （１）から（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター。
（１１） （１）から（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは（１０）に記載の組換えベクターを有する形質転換体。
（１２） （ａ）（１１）記載の形質転換体を培養し、（ｂ）発現された組み換えタンパク質もしくはペプチドを回収することを含む、タンパク質もしくは部分ペプチドの製造方法。
【００１９】
（１３） （７）から（９）の何れかに記載のタンパク質もしくは部分ペプチドに対する抗体。
（１４） （１３）記載の抗体を用いるLegionella pneumophilaの検出方法。
（１５） （１４）記載の抗体を含む、Legionella pneumophila検出用試薬キット。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明においてポリヌクレオチドとは、Legionella pneumophilaのリボソームＬ7/Ｌ１２タンパク質に相同性のあるタンパク質あるいは部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドであれば、特に限定されない。また、本発明のタンパク質とは、Legionella pneumophilaのリボソームＬ7/Ｌ１２タンパク質に相同性のあるタンパク質あるいは部分ペプチドであれば、特に限定されない。
【００２１】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質を提供し、これに関連してさらに以下のタンパク質を提供する。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質；
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質とその全長にわたり９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質であり、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質；及び、
（ｄ）上記（ａ）から（ｃ）の何れかのアミノ酸配列中に連続する少なくとも５つのアミノ酸を有する部分ペプチド。
【００２２】
“同一性”とは、当該技術で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、３以上のタンパク質あるいは９以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の適合によって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間の適合によって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味する。“同一性”は、既知の方法により容易に決定できる。同一性を決定する好ましい方法は、試験する配列間で最も長く適合するように設計される。同一性を決定するための方法は、公に利用可能なプログラムにコードされている。相同性決定には、AltschulらによるBLAST (Basic Local AlignmentSearch Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, MyersEW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25:p3389-3402 (1997)）を利用し決定することができる。BLASTのようなソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を用いるのが好ましい。BLAST検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りであるが、これに限定されない。
【００２３】
アミノ酸置換行列とは２０種類のアミノ酸の各々のペアの類縁性を数値化した行列であり、通常BLOSUM62のデフォルトマトリックスが用いられる。このアミノ酸置換行列の理論についてはAltschul S.F., J.Mol.Biol.,219:555-565(1991)に、ＤＮＡ配列の比較への適用についてはStates D.J., Gish W., Altschul S.F.,Methods, 3:66-70(1991)に示されている。その際の最適なギャップコストは経験的に決定されており、BLOSUM62の場合は好ましくは、Existence 11、Extension 1のパラメーターが用いられる。期待値（EXPECT）とは、データベース配列に対してマッチする際の統計的有意性に関する閾値であり、デフォルト値は１０である。
【００２４】
一例として、配列番号２のアミノ酸配列に対して例えば９５％以上の同一性を有するタンパク質は、そのアミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸１００個あたり５個までのアミノ酸の変化を含んでよいことを意味する。言い換えれば、対照アミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質は、対照配列中の全アミノ酸の５％までの数のアミノ酸が欠失または他のアミノ酸と置換していてもよく、あるいは、対照配列中の全アミノ酸配列のうち５％までの数のアミノ酸が対照配列中に挿入されたものであってもよい。対照配列におけるこれらの変化は、対照アミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシ末端位置に存在していてもよく、あるいはそれらの末端間のいずれかの位置に存在していてもよく、あるいは対照配列内で１個またはそれ以上の一連の群をなしていてもよい。
【００２５】
また本発明は、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを提供し、これに関してさらに以下のポリヌクレオチドを提供する。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列又はその相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
（ｄ）上記（ａ）から（ｃ）の何れかに記載のポリヌクレオチドの塩基配列のうち連続する１５塩基以上の長さを有する塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド。
【００２６】
上記ポリヌクレオチド配列に含まれる塩基配列に同一または実質的に同一なポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンまたは上記配列に対応する相同性の高い他の遺伝子のｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離するためのハイブリダイゼーションプローブとして、または核酸増幅反応のためのプライマーとして使用してもよい。代表的には、これらのヌクレオチド配列は、上記配列に７０％同一であり、好ましくは８０％同一であり、より好ましくは９０％同一であり、最も好ましくは９５％同一である。プローブまたはプライマーは、一般的には少なくとも１５ヌクレオチドを含有し、好ましくは３０ヌクレオチドを含有し、５０ヌクレオチドを含有してもよい。特に好ましいプローブは、３０〜５０ヌクレオチドを有する。特に好ましいプライマーは、２０〜２５ヌクレオチドを有する。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態（たとえば、ｃＤＮＡおよびクローニングによって得られるか、あるいは合成的に生成されるゲノムＤＮＡを含む）であってもよく、ＲＮＡ（たとえばｍＲＮＡ）の形態であってもよい。該ポリヌクレオチドは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドであってもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（コード鎖としても知られる）であっても、アンチセンス鎖（非コード鎖としても知られる）であってもよい。
【００２８】
当業者であれば、公知の方法を用いてこのタンパク質中のアミノ酸の置換などを適宜行ない、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と同様に、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質もしくは部分ペプチドを作製することが可能である。一つの方法としては、該タンパク質をコードするＤＮＡに対して、慣用の突然変異誘発法を使用する方法がある。別の方法としてはたとえば部位特異的変異法（たとえば宝酒造株式会社のMutan-Super Express Km キット）が挙げられる。また、タンパク質のアミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このようにアミノ酸の欠失、置換、付加により配列番号２のタンパク質に対してアミノ酸配列が変異した変異体であって、Legionella pneumophilaに対する抗体を調製するに適当な抗原性を有するタンパク質及び該タンパク質をコードするＤＮＡも本発明に含まれる。変異の数は、好ましくは１０以下、より好ましくは５以下、最も好ましくは３以下が好ましい。
【００２９】
アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のグループ内での置換が挙げられる。（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）。
当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術などを用いて配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡまたはその一部を基に、これと類似性の高いＤＮＡを単離して、該ＤＮＡから配列番号１に類似の塩基配列を有するＤＮＡを得ることも容易に行うことができる。このように配列番号１で表される塩基配列のＤＮＡと高い同一性を有するＤＮＡであって、上記配列番号２のアミノ酸配列を含み、Legionella pneumophilaに対する抗体を調製するに適当な抗原性を有するタンパク質あるいは部分ペプチドを得ることは可能である。
【００３０】
本発明のタンパク質あるいは部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡの他、化学合成ＤＮＡも含まれる。このようなＤＮＡは、公知の方法により化学合成することができる。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含まれる。ストリンジェントな条件とは、当業者には十分理解できることであり、たとえば、T.Maniatisらの実験操作書（Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory 1982、1989）などに従えば容易に実施できる。
【００３２】
すなわち、ストリンジェントな条件とは、３０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中（５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性せん断サケ精子ＤＮＡ）で３７℃のインキュベーションを一晩行い、その後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分の洗浄を３回行い、次いで１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で１０分の洗浄を２回行う条件である（低ストリンジエンシー）。より好ましい条件は、４０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃のインキュベーションを一晩行い、その後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分の洗浄を３回行い、次いで０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中、４２℃で１０分の洗浄を２回行う条件である（中ストリンジエンシー）。最も好ましい条件は、５０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中で４２℃のインキュベーションを一晩行い、その後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分の洗浄を３回行い、次いで０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で１０分の洗浄を２回行う条件である（高ストリンジエンシー）。
【００３３】
本発明のポリヌクレオチドは、前述のタンパク質を、組換えＤＮＡ技術を用いて製造するのに用いることができる。本発明のポリヌクレオチド及びペプチドは、概略以下のようにして得ることができる。
（Ａ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡをクローニングする。
（Ｂ）タンパク質の全コード領域あるいはその一部をコードするＤＮＡを発現用ベクターに組み込んで、組換えベクターを構築する。
（Ｃ）構築した組換えベクターにより、宿主細胞を形質転換する。
（Ｄ）得られた細胞を培養し、該タンパク質、またはその類縁体を発現させ、カラムクロマトグラフィーなどにより精製する。
【００３４】
上記の工程中でＤＮＡ、組換え体宿主としての大腸菌等の取り扱いに必要な一般的な操作は、当業者間で通常行われているものであり、たとえば、上記Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの実験操作書に従えば容易に実施できる。使用する酵素、試薬類も全て市販の製品を用いることができ、特に断らない限り、製品で指定されている使用条件に従えば、完全にそれの目的を達成することができる。以下に上記（Ａ）〜（Ｄ）の工程について更に詳しく説明する。
【００３５】
上記工程（Ａ）における本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本願明細書実施例に記載した方法の他に、本発明のヌクレオチド配列（たとえば配列番号１の一部を有する合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって増幅する方法、あるいは、適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別すること、などが挙げられる。
【００３６】
本発明は、上記のＤＮＡを含有する組換えベクターを提供する。本発明のタンパク質の発現ベクターは、たとえば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。用いる発現ベクターとしては、複製可能であれば、大腸菌をはじめとする原核生物由来、酵母由来、真菌由来、などの微生物由来のベクター、さらには昆虫ウイルス由来、脊椎動物ウイルス由来、いずれのベクターでも良いが、宿主として使用する微生物または細胞に適したものを選択する必要がある。また、発現物に応じて、宿主細胞―発現ベクター系としては、適切な組み合わせが選択される。
【００３７】
微生物を宿主として使用する場合、これら微生物に適したプラスミドベクターが組換え体ＤＮＡの複製可能な発現ベクターとして一般に用いられる。たとえば、大腸菌を形質転換するためのプラスミドベクターとしては、プラスミドｐＢＲ３２２やｐＢＲ３２７などを用いることができる。プラスミドベクターは通常複製起源、プロモーター、及び組換え体ＤＮＡで形質転換した細胞を選別するのに有用な表現型を組換え体ＤＮＡに与えるマーカー遺伝子等を含んでいる。プロモーターの例としては、β−ラクタマーゼプロモータ、ラクトースプロモーター、トリプトファンプロモーター等が挙げられる。マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン耐性遺伝子やテトラサイクリン遺伝子などが挙げられる。適した発現ベクターの例としては、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２７の他に、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等が挙げられる。
【００３８】
酵母で本発明のＤＮＡを発現するためには、複製可能なベクターとして、たとえばＹＥｐ２４を用いることができる。プラスミドＹＥｐ２４はＵＲＡ３遺伝子を含有しており、このＵＲＡ３遺伝子をマーカー遺伝子として利用することができる。酵母細胞用の発現ベクターのプロモーターの例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼなどの遺伝子のプロモーター等が挙げられる。
【００３９】
真菌で本発明のＤＮＡを発現するための発現ベクターに用いられるプロモーター及びターミネーターの例としては、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）、アクチン等の遺伝子プロモーター及びターミネーターが挙げられる。適した発現ベクターの例としては、プラスミドｐＰＧＡＣＹ２、ｐＢＳＦＡＨＹ８３等が挙げられる。
【００４０】
上記工程（Ｃ）において用いる宿主としては、大腸菌をはじめとする原核生物、酵母、真菌等の微生物、及び昆虫や動物等の細胞のいずれでもよいが、用いる発現ベクターに適したものを選択する必要がある。微生物の例としては、エシュリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の菌株、たとえばＥ．ｃｏｌｉＫ１２株２９４（ＡＴＣＣ ３１４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１５３７）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ６００、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ株、あるいはバチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の如きＢａｃｉｌｌｕｓ属の菌株、あるいはサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）またはセラチア・マーゼサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓ）等の大腸菌以外の腸内菌、あるいはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の種々の菌株が挙げられる。
【００４１】
酵母としては、たとえば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。真菌としては、たとえば、アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）（ＡＴＣＣ １１５５０）等が挙げられる。
【００４２】
上記の形質転換された細胞を本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが発現可能な条件下で培養し、本発明のタンパク質を生成、蓄積せしめることによって、本発明のタンパク質を製造することができる。すなわち、本発明は、上記した本発明のポリヌクレオチドを含む形質転換された細胞を、該ポリヌクレオチドによりコードされているタンパク質を発現させる条件下培養し、次いで培養物から該タンパク質を回収することを含む該タンパク質の製造方法を提供する。
【００４３】
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。たとえば、本発明のタンパク質は、硫安またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスフォセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む既知の方法により組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィーが精製に使用される。
【００４４】
本発明のタンパク質あるいは部分ペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として製造することができる。これらも、本発明に含まれる。この融合タンパク質を発現する際に用いられるベクターとしては、該タンパク質をコードするＤＮＡを組み込むことができ、かつ該融合タンパク質を発現することができるベクターであれば、いかなるベクターでも用いることができる。本発明のペプチドに融合できるタンパク質としては、たとえばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジン残基の６個の連続配列（６×Ｈｉｓ）等が挙げられる。本発明のタンパク質を他のタンパク質と融合したタンパク質として発現させた場合には、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、有利である。例えば、ＧＳＴとの融合タンパク質として生産した場合は、グルタチオンをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【００４５】
本発明は、前記の本発明のタンパク質あるいはその部分ペプチドに特異的に結合する抗体ならびにそのような抗体の製造方法に関する。抗体を作成するためのペプチドの長さは特に限定されないがリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質蛋白質に対する抗体の場合、この蛋白質を特徴づけられる長さがあれば良く、好ましくは５アミノ酸以上、特に好ましくは８アミノ酸以上のペプチドを用いればよい。抗体は、本発明のタンパク質を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ならびにこれらの抗体のフラグメント、一本鎖抗体、ヒト化抗体の何れであってもよい。抗体フラグメントは、公知の技術によって作製することができる。たとえば、該抗体フラグメントには、限定されるものではないが、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂフラグメント及びＦｖフラグメントが含まれる。たとえば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、上記した本発明のタンパク質またはその部分ペプチドを抗原またはエピトープ含有フラグメントとして非ヒト動物に投与することにより得られる。本発明のタンパク質に対する抗体は、本発明のタンパク質あるいはその部分ペプチドを抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。たとえば実験医学別冊 新遺伝子工学ハンドブック 改訂第３版に記載の方法が挙げられる。
【００４６】
ポリクローナル抗体の場合であれば、たとえば、ウサギなどの動物に本発明のタンパク質あるいは部分ペプチドを注射することにより該タンパク質あるいはペプチドに対する抗体を産生させ、次いで血液を採取し、これを、たとえば硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、あるいは該タンパク質を固定化したアフィニティーカラム等によって精製することで調製することができる。
【００４７】
モノクローナル抗体の場合は、たとえば、本発明のタンパク質あるいは部分ペプチドをマウスなどの動物に免疫し、同マウスから脾臓を抽出し、これをすりつぶして細胞にし、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、本発明のタンパク質に対する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウス内より腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、たとえば硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、あるいは該タンパク質を固定化したアフィニティーカラム等によって精製することで調製することができる。
【００４８】
本発明における抗体を用いるLegionella pneumophila検出方法とは、例えばポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術であるＥＬＩＳＡ法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もしくは発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともにキャプチャー抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチアッセイなどの既知の免疫測定手法を利用する検出方法に相当する。
【００４９】
また、特に抗体を用いるLegionella pneumophila検出方法として、特表平7-509565号公報に記載されているシリコン、窒化珪素などにより形成された光学薄膜上で抗体反応をおこない光干渉原理等により検出するいわゆるオプティカルイムノアッセイ(OIA,Optical Immunoassay)などが高感度な検出方法として有用である。
【００５０】
また該検出方法において必要となる微生物からの細胞内マーカー抗原の抽出方法としては、トリトンＸ−１００(Triton X-100)、ツイーン−２０(Tween-20)をはじめとする種々の界面活性剤を用いた抽出試薬による処理法、適当なプロテアーゼなどの酵素を用いる酵素処理法、物理的方法による微生物細胞の破砕をはじめ既知の細胞構造の破砕手法が用いられうるが、界面活性剤等の組み合わせにより微生物ごとに試薬による最適な抽出条件を設定することが望ましい。
また、本発明における、抗体を用いるLegionella pneumophila検出用試薬キットとは、当該検出方法を用いた検出用試薬キットに相当する。
【００５１】
更に本発明の配列番号１で示される塩基配列またはその一部を含むポリヌクレオチドは、Legionella pneumophilaの土壌や河川など自然環境における環境水汚染、さらには院内感染や循環風呂汚染を調べるために応用できる。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列を含むポリヌクレオチドをプローブとしたLegionella pneumophilaの検出。
（ｂ）上記塩基配列中に連続する少なくとも１５塩基からなるポリヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法やＬＡＭＰ法等遺伝子増幅によるLegionella pneumophilaの検出。
【００５２】
培養菌体に対しては、本発明のポリヌクレオチドをプローブとして用いれば、上記Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの実験操作書に記載のコロニーハイブリダイゼーション法やサザン法に従えば容易に実施できる。使用する酵素、試薬類も全て市販の製品を用いることができ、特に断らない限り、製品で指定されている使用条件に従えば、完全にそれの目的を達成することができる。
【００５３】
循環水や環境水を被験サンプルとする場合には、菌体を濃縮もしくはトラップして、ＤＮＡを抽出することが必要である。そのための簡便な方法として、ＥＰ０３８９０６３記載のシリカを用いる方法、ＷＯ００／２１９７３号記載のフィルターを用いる方法、特表平１１−５０１５０４号記載の磁性粒子を用いる方法などが挙げられ、これらを適宜組み合わせることも可能である。これらの方法によって抽出されたＤＮＡをテンプレートとして、本発明のＤＮＡの塩基配列に基づくプライマーを用いて遺伝子を増幅することにより、Legionella pneumophilaが検出できる。
以下に、実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明は、これらの例に何ら限定されるものではない。当業者には種々の変更、修飾が可能であり、これも本発明に含まれる。
【００５４】
【実施例】
実施例１
リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質のアミノ酸配列は、すでに数多くの微生物で明らかにされており、公開されている。そこで、Columbia Genome CenterのLegionella Genome Projectのサイトから、これらに類似するアミノ酸配列をコードするゲノム領域の検索を行った。その結果、７４５塩基配列からなるゲノム領域、LP.wg.165.61.07180 bin Contig78（以下、ＬＰ１領域と呼ぶ）に、Ｎ末端よりIEGAPSTVKEGVSKDEAASIKKELEEAGATVEVK で示される３４個のアミノ酸（配列番号３）からなる配列がコードされていることを見出した。このアミノ酸配列は、公知のリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質のＣ末側1/4の領域にホモロジーが高いことから、ＬＰ１領域にはLegionellaのリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質をコードされていると推定された。しかし、ＬＰ１領域の塩基配列にコードされているタンパク質は、前述したＣ末側領域はホモロジーが高いものの、その上流部分は全く違う配列になっていることが判明した。
【００５５】
そこでリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質のコーディング領域を特異的に増幅するため、ＬＰ１領域の塩基配列情報を基に、上流側のセンスプライマーとしてNP86（5'-CCTGGACGTCGACTCTTAAA-3'）（配列番号４）、および下流側のアンチセンスプライマーとしてNP89r（5'-AATGCAGCATGCAATCCCG-3'）（配列番号５） を設計した。ＰＣＲのテンプレートとするLegionella pneumophilaのゲノムＤＮＡは、ＡＴＣＣ（ American Type Culture Collection ）などから購入可能である。具体的にはATCC 33152D （ genomic DNA from Legionella pneumophila subsp. pneumophila ）を用いた。
【００５６】
これらのプライマーセットを用いて、このLegionella pneumophila ゲノム ＤＮＡをテンプレートとしてPCR反応を行った。具体的には、Legionella pneumophila １０ｎｇをに対して、上記プライマー各 50 pmol を加えて、Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）および酵素に添付のバッファーを５μｌ、酵素に添付のdNTP mixture ４μｌを加え、最終容量５０μｌとした。
【００５７】
この混合物を、TaKaRa PCR Thermal Cycler 480を用いて、９５℃ ３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分間の反応を３０サイクル行った。このＰＣＲ産物の一部を１％アガロースゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察した結果、約７００塩基対からなるＤＮＡ断片が増幅された。
【００５８】
このＤＮＡ断片を、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit（Invitrogen）を用いてTOPOベクターに連結し、E.coli DH5αに形質転換した。
得られた１２個の形質転換株を培養し、ウィザードミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の説明書に従って各プラスミドＤＮＡを分離した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化して、該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認した。
【００５９】
これらのプラスミドＤＮＡを、Applied Biosystems社製の蛍光シークエンサーを用いて塩基配列を解読した。その結果、驚くべきことに、本ＤＮＡ断片は、用いたプライマーセットのうちNP89rのみをプライマーとして増幅された、配列番号１で示される塩基配列からなる７１４塩基対であることが判明した。
【００６０】
すなわち、ＬＰ１領域の配列を基に設計されたプライマーセットのうち、実際は上流側プライマーNP86が働かず、その代わり、下流側のプライマーNP89rと非常に似た配列が上流部分に存在したため上流側のプライマーとして働き、ＰＣＲ反応によって増幅されたと推定された。
【００６１】
この７１４塩基からなる配列を解析すると、メチオニンで始まる配列番号２で示される１２４アミノ酸からなるオープンリーディングフレームが組めること、さらにその上流にribosome binding siteと推定される塩基配列AGGAも見出されることから、タンパク質をコードする遺伝子領域であると推定された。またそのアミノ酸配列は、他の微生物のリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質に、非常にホモロジーが高いことから、目的とするLegionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質の遺伝子であると断定された。
【００６２】
実施例２
Legionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質を大腸菌で発現させる目的で、上記ＤＮＡを含有するプラスミドＤＮＡ、Ｌｅｇ１６．Ｌ７／Ｌ１２に対して、リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質コーディング領域のＮ末に制限酵素ＢａｍＨＩサイトを付加したセンスプライマーＮＰ９４(5'-GGGATCCGCTGTATCAAAAAACGAAATATTA-3')（配列番号６）、Ｃ末にＸｈｏＩサイト(CTを付加したアンチセンスプライマーＮＰ９５ｒ（5'-GCTCGAGCGGTATCGGCATTATATCTGT-3'）（配列番号７）を作製し、ＰＣＲ反応にて増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)で精製後、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断した。一方、発現用ベクターとして用いるｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を同じ制限酵素で切断し、両者を１％アガロースゲルで電気泳動後、目的とするＤＮＡ断片をゲルから抽出し、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)によって精製した。これらの断片を、Ligation-High （TOYOBO社製）を用いて１６℃で１時間連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた。
【００６３】
得られた形質転換株１２個を培養して、各プラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ切断により目的ＤＮＡが構築されていることを確認した。さらにこれらのプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定し、目的の塩基配列、すなわちＧＳＴと同じ読み枠でLegionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質のコーディング領域が連結されていることを確認し、うち１つをｐＧＥＸ−Ｌｅｇ１６．Ｌ７／Ｌ１２とした。
【００６４】
本プラスミドＤＮＡを含有する大腸菌ＤＨ５α形質転換株をＬＢ培地に接種し、３７℃で１晩培養した。培養液２００μｌを１０ｍｌのＬＢ培地に移植し、３７℃にて１時間培養した後に終濃度２ｍＭとなるようにイソプロピルβ−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに４時間培養した。培養菌体を遠心分離にて回収し、Fast Protein Red Kit（ＢＩＯ１０１社製）に添付のYeast Breakage Buffer 500μlに懸濁し、ガラスビーズ入りチューブに移して、１０分間ボルテックスミキサーで撹拌して溶菌させた。得られた溶菌液の一部をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、タンパク質をクマシー染色した。その結果、Legionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質が分子量１５キロダルトンのＧＳＴ分子の下流に結合した、分子量４５キロダルトンの目的とする融合タンパク質のバンドが確認された。
【００６５】
実施例３：大量発現
プラスミドＤＮＡｐＧＥＸ−Ｌｅｇ１６．Ｌ７／Ｌ１２を含有する大腸菌ＤＨ５α形質転換株を、２倍濃度のＹＴ培地５０ｍｌ中で３７℃にて１晩培養した。３７℃で１時間温めておいた２倍濃度のＹＴ培地４５０ｍｌに１晩培養した大腸菌培養液５０ｍｌを移植し、３７℃１時間培養後、５００ｍＭのＩＰＴＧを１００μｌ入れ、さらに２５℃にて４時間培養した。該培養液２５０ｍｌずつを５０００ｒｐｍ、２０分遠心し菌体を回収し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２５％ Ｓｕｃｒｏｓｅを含む溶菌バッファー２５ｍｌずつに懸濁した。これに１０％ ＮＰ−４０を １．２５ｍｌ、１Ｍ ＭｇＣｌ2を１２５μｌ加えて、菌体を超音波破砕し、１２０００ｒｐｍ、１５分間遠心後、上澄みを回収した。
【００６６】
次にＰＢＳでコンディショニングしたグルタチオンセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）カラムに前記の上澄み液を吸着させた。次にＰＢＳでカラムを３ベットボリューム分洗浄した。その後１０ｍＭのグルタチオンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶出し、分画したフラクション中の蛋白質含有量を色素結合法（ブラッドフォード法；ＢｉｏＲａｄ社）で検出し、メインフラクションを取得した。メインフラクションをＰＢＳ３Ｌに対して３回透析を行った。
【００６７】
得られたＧＳＴ融合Legionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質の１ｍｇ／ｍｌ溶液１０ｍｌに５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴを含むＣｌｅａｖａｇｅバッファー１ｍｌを加え、さらに２Ｕ／μｌのＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を１００μｌ添加して４℃で反応させることによりＧＳＴ部分をLegionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質部分から切り離した。
【００６８】
次にＰＢＳでコンディショニングしたグルタチオンセファロースカラムに反応液を通し、通過液を回収し、さらにＰＢＳを１ベッドボリューム流し、これも回収した。取得した精製Legionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質の純度は電気泳動法により確認したところ約９０％であり免疫源として充分な純度を確保できた。
【００６９】
実施例４：抗体の作製
まずマウスの免疫についてはLegionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質１００μｇを２００μｌのＰＢＳに溶解後、フロイントのコンプリートアジュバントを２００μｌ加え混合、エマルジョン化した後２００μｌを腹腔内に注射した。さらに２週間後、４週間後、６週間後に同様のエマルジョン抗原を腹腔内に注射し、さらに１０週間後、１４週間後に２倍濃度の抗原エマルジョン液を腹腔内注射し最終免疫から３日後に脾臓を取り出し、細胞融合に供した。
【００７０】
無菌的に取り出したマウスの脾細胞１０8個に対し骨髄腫細胞２×１０7個をガラスチューブに取り良く混合した後１５００ｒｐｍで５分間遠心し上澄みを棄て、その後細胞をよく混合した。
【００７１】
細胞融合に使用した骨髄腫細胞はＮＳ−１系の細胞株を用い１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、細胞融合の２週間前から０．１３ｍＭのアザグアニン、０．５μｇ／ｍｌのＭＣ−２１０、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養後、さらに１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養したものを用いた。混合した細胞サンプルに３７℃に保温した５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を３０ｍｌ加え１５００ｒｐｍで遠心、上澄み除去後３７℃に保温した５０％ポリエチレングリコールを１ｍｌ加え激しく攪拌しながら２分間処理後、３７℃に保温した１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を加え液を滅菌ピペットで吸引、排出しながら約５分間激しく攪拌混合した。
【００７２】
１０００ｒｐｍで５分間遠心、上澄み除去後さらに３０ｍｌのＨＡＴ培地を加え細胞濃度が５×１０6個／ｍｌになるように調整し攪拌均一化後、９６穴プレート型培養プレートに０．１ｍｌずつ分注し７％ＣＯ2条件下、３７℃で培養し、１日目、１週間目、２週間目にＨＡＴ培地を０．１ｍｌずつ加えた。次に目的の抗体を生産している細胞をスクリーニングするためにＥＬＩＳＡ法による評価を実施した。０．０５％のアジ化ソーダ含むＰＢＳ中に溶解したLegionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質を１０μｇ／ｍｌ濃度に希釈した液を１００μｌずつ９６穴プレートの別々に分注し４℃で１晩吸着させた。上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ中）２００μｌ添加し室温で１時間反応しブロッキングする。上澄み除去後洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０２％、ＰＢＳ）で洗浄し、その上に融合細胞の培養液１００μｌを加え室温で２時間反応後上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄後、５０ｎｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体液を１００μｌ加え室温、１時間反応を実施し、上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した後ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ社）を１００μｌずつ加え室温で２０分反応、発色後１Ｎの硫酸を１００μｌ添加して反応を停止し、４５０ｎｍの吸光を測定した。
【００７３】
この結果Legionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質に反応する陽性ウェルが見いだされLegionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質に対する抗体が含まれていることが判明した。
【００７４】
そこで陽性ウェル中の細胞をそれぞれ回収し２４穴プラスティックプレート中、ＨＡＴ培地で培養した。培養した融合培地を細胞数が約２０個／ｍｌになるようにＨＡＴ培地で希釈し５０μｌを、ＨＡＴ培地に懸濁した６週齢のマウス胸腺細胞１０6個と９６穴培養プレート中で混合後、７％ＣＯ2条件下、３７℃で２週間培養した。培養上澄み中の抗体活性を前述のＥＬＩＳＡ法にて同様に検定し、Legionella リボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質との反応陽性の細胞を回収した。
さらに同様の希釈検定、クローニング操作を繰り返し、ハイブリドーマＬＰＡＭ−１〜４の計４クローンを取得した。
【００７５】
【発明の効果】
本発明により、Legionella pneumophila由来の新規なリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質、該タンパク質に対する抗体、並びに該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。本発明のタンパク質、抗体およびポリヌクレオチドは、Legionella pneumophilaの検出や、Legionella pneumophilaが関与する疾患の診断、治療または予防のために有用である。
【００７６】
【配列表】
Claims (15)
- 以下の何れかのタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；又は
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質。 - 以下の何れかのポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列又はその相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - Legionella pneumophila由来のポリヌクレオチドである、請求項１または２記載のポリヌクレオチド。
- 請求項１から３の何れかに記載のポリヌクレオチドの塩基配列のうち連続する１５塩基以上の長さを有する塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド。
- 請求項１から４の何れかに記載のポリヌクレオチドを用いる、Legionella pneumophilaの検出方法。
- 請求項１から４の何れかに記載のポリヌクレオチドを含む、Legionella pneumophila検出用試薬キット。
- 以下の何れかのタンパク質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質；又は
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質とその全長にわたり９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質であり、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するタンパク質。 - 以下の何れかのアミノ酸配列中の連続する少なくとも５つのアミノ酸を有する部分ペプチド。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するアミノ酸配列；又は
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）記載のアミノ酸配列とその全長にわたり９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列であり、Legionella pneumophilaに特異的な抗原性を有するアミノ酸配列。 - 請求項１から４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを発現することにより得られるタンパク質もしくは部分ペプチド。
- 請求項１から４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター。
- 請求項１から４のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０に記載の組換えベクターを有する形質転換体。
- （ａ）請求項１１記載の形質転換体を培養し、（ｂ）発現された組み換えタンパク質もしくはペプチドを回収することを含む、タンパク質もしくは部分ペプチドの製造方法。
- 請求項７から９の何れかに記載のタンパク質もしくは部分ペプチドに対する抗体。
- 請求項１３記載の抗体を用いるLegionella pneumophilaの検出方法。
- 請求項１４記載の抗体を含む、Legionella pneumophila検出用試薬キット。
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