【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は病原真菌の検出及び同定に有効なオリゴヌクレオチド及びその組み合わせに関する。更に詳しくは該オリゴヌクレオチドを用いて病原真菌を検出及び同定する方法、ならびにその為のキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】高度医療の普及に伴い易感染患者は増加の一途をたどり、カンジダ症、アスペルギルス症を初めとする深部（全身性）真菌症は、易感染患者が高率に罹患する重要な感染症として医療上の問題となっている。今日治療のための様々な抗菌剤が開発されているにもかかわらず、深部真菌症の診断は極めて困難であり、有効な診断法が未だに確立されていないのが現状である。現在までに市販されている深部真菌症の診断方法としては、各属或いは各種の病原真菌抗原またはこれに対する抗体を免疫学的に検出する方法、病原真菌の菌体成分または代謝産物を生化学的に検出する方法等があるが、いずれの方法においても病理学的に真菌感染が認められない患者（健常人を含む）に対しても有意に高値を示す擬陽性の問題があり、また感度においても臨床的な要請に十分に答えられる現状ではないうえに、結果が出るまでにかなりの時間を要する。
【０００３】
近年、PCR法によって特定の病原真菌のみの遺伝子を迅速かつ特異的に検出する方法が報告されているが、深部真菌症起因菌が多様化している現状を考慮すると、特定の菌種のみを検出する従来のPCR法では検出できる菌種が限られているうえに、検体に対して考えられる起因菌の種類の数だけ同時に別個の検査が必要であり、必ずしも臨床的要請に十分対応できる診断法とは言えず、より広い範囲の病原真菌感染症全体を迅速かつ特異的に診断できる方法の確立が求められていた。また、病原真菌感染症においては、感染した病原真菌の菌種によって治療に使用する抗菌剤を選択する必要があり、そのため病原真菌の菌種を同定することは治療方針上重要であり、同じく迅速かつ特異的に診断できる方法の確立が求められていた。
【０００４】
本発明者の一人である山口英世(帝京大学)が出願した登録番号2110122「病原真菌遺伝子増幅プライマー」の特許では、18S リボゾームRNA（以下、18S rRNA）遺伝子の配列の中から、特に広範囲の病原真菌に共通に保存され、ヒトや細菌には共通性の少ない領域から設計した2種類のプライマーを用いてPCR法にて検出する方法が提示された。同じく、登録番号 2110121「病原糸状真菌遺伝子増幅プライマー」、特開平8-89254「真菌の検出および真菌の菌種同定用オリゴヌクレオチド」、特開平11-142409「病原性微生物の検出方法」ではPCRによる特定菌種の同定法が提示された。しかし、一部の属や種においてプライマー配列の異なりが原因と思われる感度不足や非特異増幅が認められ、更なる感度向上及び特異性向上が求められた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】各種病原真菌の特徴はその遺伝子により規定されているが、各々の病原真菌に共通した特徴的な遺伝子領域に対応するオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて1st PCR法を実施し、各種病原真菌に共通した特徴的遺伝子（第一の目的部分の遺伝子）を検出する事ができれば、そのような菌の存在を確定することができる。また、同反応液を試料とし、更に第一の目的部分の遺伝子の内部配列よりなる菌種特異的オリゴヌクレオチドの組み合わせをプライマーとして用いてnested PCR法を実施することにより、第一の目的病原真菌からさらに対象を絞り込んだ１種以上の病原真菌に特徴的な遺伝子（第二の目的部分の遺伝子）を検出でき、感度よく特定菌種の同定が可能である。
【０００６】
本発明の目的は、上記特許にて試料中の病原真菌を簡便、迅速かつ高感度、特異的に検出及び同定するための方法及びそれに用いるオリゴヌクレオチド、ならびに同キットを改良し、一部の属においてプライマー配列の異なりが原因と思われる感度不足や非特異増幅を解消するための方法及びそれに用いるオリゴヌクレオチド、ならびに同キットを提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題解決のため真菌及びその他の生物の18S rRNA遺伝子に関し種々の検討を重ね、一部の属においてプライマー配列が原因と思われる感度不足及び非特異反応を解消する検出・同定方法を確立し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の各項の病原真菌遺伝子の検出方法等を提供する。
項１. 広範囲の病原真菌の18S rRNA遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドの組み合わせをプライマーとして用いてPCR法により第一の目的部分の遺伝子を増幅後、更に第一の目的部分の遺伝子の内部配列よりなる菌種特異的オリゴヌクレオチドの組み合わせをプライマーとして用いてnested PCR法により第二の目的部分の遺伝子を増幅させ、検出することを特徴とする病原真菌の検出方法。
項２.第一の目的部分の遺伝子を増幅後、さらに反応液を適度に希釈して、更に第二の目的部分の遺伝子を増幅させ、検出する、 項１に記載の病原真菌の検出方法。
項３. 項１に記載した方法で病原真菌の検出を行うことにより、病原真菌の菌種の同定を行う方法。
項４. 項１に記載した広範囲の病原真菌の18S rRNA遺伝子の第一の目的部分の遺伝子を増幅するための、各々の病原真菌に共通した特徴的な遺伝子領域に特異的に対応するオリゴヌクレオチド。
項５. 項４に記載のオリゴヌクレオチドが、配列番号１〜４で示される核酸配列の一部或いは全部からなる該オリゴヌクレオチド。
項６. 項５記載のオリゴヌクレオチドを、配列番号１、２、３或いは１、４の組み合わせで使用することを特徴とする 項１記載の第一の目的部分の遺伝子を増幅する方法。
項７. 項１記載の第二の目的部分の遺伝子を増幅するための、カンジダ属に特徴的な遺伝子領域に特異的に対応するオリゴヌクレオチド。
項８. 項７に記載のオリゴヌクレオチドが、配列番号５及び６で示される核酸配列の一部或いは全部からなる該オリゴヌクレオチド。
項９. 項１記載の第二の目的部分の遺伝子を増幅するための、アスペルギルス属に特徴的な遺伝子領域に特異的に対応するオリゴヌクレオチド。
項１０. 項９に記載のオリゴヌクレオチドが、配列番号７及び８で示される核酸配列の一部或いは全部からなる該オリゴヌクレオチド。
項１１. 項１記載の第二の目的部分の遺伝子を増幅するための、クリプトコッカス属に特徴的な遺伝子領域に特異的に対応するオリゴヌクレオチド。
項１２. 項１１に記載のオリゴヌクレオチドが、配列番号９及び１０で示される核酸配列の一部或いは全部からなる該オリゴヌクレオチド。
項１３. 項１記載の第二の目的部分の遺伝子を増幅するための、カンジダ属、アスペルギルス属およびクリプトコッカス属の病原真菌に共通で特徴的な遺伝子領域に特異的に対応するオリゴヌクレオチド。
項１４. 項１３に記載のオリゴヌクレオチドが、配列番号１１及び１２で示される核酸配列の一部或いは全部からなる該オリゴヌクレオチド。
項１５. 項７〜１４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを、配列番号５及び６、配列番号７及び８、配列番号９及び１０、或いは配列番号１１及び１２から選ばれる少なくとも１つの組み合わせで使用することを特徴とする 項１記載の第二の目的部分の遺伝子を増幅する方法。
項１６. 病原真菌遺伝子を検出するために用いられる配列番号１〜１２に記載のオリゴヌクレオチド配列の一部或いは全部、或いはそれらの相補配列の一部或いは全部からなる該オリゴヌクレオチドの組合せ。
項１７. 病原真菌遺伝子を検出するために用いられる配列番号１〜１２に記載のオリゴヌクレオチド配列の一部或いは全部、或いはそれらの相補配列の一部或いは全部からなる該オリゴヌクレオチドの組合せを含有し、 項１〜３に記載の方法で病原真菌の検出及び同定を行うためのキット。
【０００９】
本発明を概説すれば、カンジダ属、ハンセヌラ属、サッカロマイセス属、トリコスポロン属、クリプトコッカス属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ブラストマイセス属、コクシジオイデス属及びニュウモシスチス属等を含む広範囲の病原真菌、特に好適にはカンジダ属、クリプトコッカス属、アスペルギルス属を含む病原真菌の検出方法に関し、配列番号１〜４に記載のオリゴヌクレオチド配列の一部或いは全部からなる該オリゴヌクレオチドの適した組み合わせをプライマーとして用いて、該真菌の18S rRNA遺伝子をPCR法により、より高感度に検出することを特徴とする。更に、該反応液を滅菌蒸留水で1〜10,000倍、好ましくは10〜1,000倍、より好ましくは増幅が確認できなかった反応液は10倍、確認できた反応液は1,000倍希釈後、配列番号５〜１２に記載のオリゴヌクレオチド配列の一部或いは全部からなるカンジダ属、アスペルギルス属、クリプトコッカス属及び病原真菌共通のオリゴヌクレオチドの各組み合わせをプライマーとして用い、nested PCR法により菌種を同定することを特徴とする。更に、病原真菌の検出・同定用キットに関し、上記方法にて該病原真菌の検出・同定を行うためのキットであって、該病原真菌の18S rRNA遺伝子をPCR法により、より増幅させるための上記オリゴヌクレオチドの組み合わせ及び増幅されたDNAを検出し、更にnested PCR法により菌種特異的に増幅させるための上記オリゴヌクレオチドの組み合わせ及び増幅されたDNAを検出し、同定することを特徴とする。
【００１０】
18S rRNA遺伝子中の、病原真菌に共通する特徴的なオリゴヌクレオチドの配列は、以下の手順で決定することができる。
（１）遺伝子配列データバンク（GenBank）に登録されている遺伝子配列のうち、各種病原真菌、ヒト及び大腸菌の18S rRNA遺伝子（DNA）を各々の塩基配列間で比較し、表１に示す各種病原真菌に共通であって、ヒト（登録番号M10098）及び大腸菌（登録番号M24996）には共通しない配列領域を限定する。
表１
アスペルギルス・フミガタス M５５６２６
ペニシリウム・ノタツム M５５６２８
カンジダ・アルビカンス M６０３０２
カンジダ・ギリエルモンディイ M６０３０４
カンジダ・ケフィル M６０３０３
カンジダ・クルゼイ M６０３０５
カンジダ・ルシタニエ M６０３０６
カンジダ・パラプシローシス M６０３０７
カンジダ・ヴィスワナティイ M６０３０９
カンジダ・グラブラータ M６０３１１
ハンセヌラ・ポリモルファ M６０３１０
サッカロマイセス・セレビシエ Ｖ０１３３５
クリプトコッカス・ネオフォルマンス M５５６２５
ブラストマイセス・デルマチチジス M５５６２４
コクシジオイデス・イミチス M５５６２７
ニュウモシスチス・カリニイ Ｘ１２７０８
【００１１】
（２）上記の病原真菌に特異的な配列領域から、表１に示した全ての病原真菌の18S rRNA遺伝子のみを特異的に増幅することのできるオリゴヌクレオチドの組み合わせ（配列番号１、２及び３或いは１及び４）を決定する。オリゴヌクレオチドはDNA合成機により合成でき、カラムやＨＰＬＣ等にて精製できる。
【００１２】
次に、増幅した遺伝子中の、各種病原真菌に特異的なオリゴヌクレオチドの配列は、以下の手順で決定することができる。
【００１３】
（１）表１に示す各種病原真菌の配列より、PCR法で増幅された18S rRNA遺伝子（DNA）の一部において、更に内部にカンジダ属、アスペルギルス属及びクリプトコッカス属に各々特異的な配列領域と病原真菌に共通な配列領域をカンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス及びクリプトコッカス・ネオフォルマンスの配列を用いて限定する。
【００１４】
（２）上記の病原真菌に特異的な配列領域から、表１に示したカンジダ属、アスペルギルス属及びクリプトコッカス属の各種18S rRNA遺伝子のみを特異的に増幅することのできるオリゴヌクレオチドの組み合わせ及び病原真菌に共通な配列領域を増幅することのできるオリゴヌクレオチドの組み合わせを決定する。オリゴヌクレオチドはDNA合成機により合成でき、カラムやＨＰＬＣ等にて精製できる。
【００１５】
検出する病原真菌DNAは、血液等の病原真菌感染試料より調製する事ができる。PCR法及びnested PCR法については、タック・ポリメラーゼ（Taq polymerase）を含む遺伝子増幅キット及び自動遺伝子増幅装置が市販されており、これと本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用い、病原真菌DNAの増幅反応が可能である。PCR法では、酵素として、例えば、耐熱性タック・ポリメラーゼを用い、DNAの変性（約９５℃）の工程、オリゴヌクレオチドDNAのアニーリング（約５９℃）の工程及びDNA合成（約７２℃）の工程よりなるサイクルを任意の回数繰り返すことで、目的遺伝子のみを指数的に増幅させることができる。例えばサイクルを２５回繰り返せば、目的DNAは約１０万倍に増幅される。微量試料より高感度にDNAを検出するには、現在このPCR法が最も有効な方法である。増幅後の目的DNAの検出は、例えばアガロースゲル電気泳動やポリアクリルアミドゲル電気泳動等で行うことができる。
【００１６】
同定方法としては、nested PCRにおいて上記検出法により病原真菌共通のオリゴヌクレオチドの組み合わせで増幅が確認でき、且つ、カンジダ属、アスペルギルス属、クリプトコッカス属のオリゴヌクレオチドの各組み合わせでいずれか一つの属のみ増幅が確認された場合に、同定可能となる。例えば、病原真菌共通とカンジダ属のオリゴヌクレオチドの組み合わせで増幅が認められ、アスペルギルス属とクリプトコッカス属のオリゴヌクレオチドの組み合わせでは増幅が認められなかった場合、この検体はカンジダ属であると判断できる。また、カンジダ属、アスペルギルス属、クリプトコッカス属のオリゴヌクレオチドの各組み合わせの内、少なくとも二つ以上で増幅が確認できた場合は、非特異増幅或いは複合感染が考えられるため、更に検体を希釈後再度nested PCRを実施するか、他の検査方法を実施することが望ましい。
【００１７】
本発明の目的遺伝子検出方法により第一の目的部分の遺伝子を増幅するにおいては、配列番号１のオリゴヌクレオチドはフォワードプライマー、配列番号２および３のオリゴヌクレオチドはそれぞれリバースプライマーとして用いられる。従来の配列番号１のフォワードプライマーと配列番号２のリバースプライマーの組合せでは、広範囲の病原真菌、とくにクリプトコッカス属を含む広範囲の18S rRNA遺伝子を検出するには十分ではなかったが、配列番号３のリバースプライマーを併用すると、クリプトコッカス属に対するプライマーの特異結合性が増大することの理由によりクリプトコッカス属に対しても十分な感度が得られる。
本発明の目的遺伝子検出方法により第一の目的部分の遺伝子を増幅するにおいては、配列番号１のフォワードプライマーと配列番号４のリバースプライマーの組合せを用いてもよい。これにより、より少ないプライマー数で同等の結果が得られる。
【００１８】
本発明の病原真菌の検出方法で第一の目的部分の遺伝子を増幅するにおいては、クリプトコッカス属に対するプライマーの特異結合性が増大することの理由により、配列番号１、２及び３に記載のオリゴヌクレオチド配列の一部或いは全部を４：４〜１：４〜１の割合で３種類同時に用いることが好ましい。
【００１９】
本発明の病原真菌の検出方法で第一の目的部分の遺伝子を増幅するにおいては、クリプトコッカス属に対するプライマーの特異結合性が増大することの理由により、配列番号１及び４に記載のオリゴヌクレオチド配列の一部或いは全部を１：２〜１の割合で２種類同時に用いることが好ましい。
【００２０】
本発明の目的遺伝子検出方法により第二の目的部分の遺伝子を増幅するにおいては、配列番号５及び６、配列番号７及び８、配列番号９及び１０、或いは配列番号１１及び１２から選ばれる少なくとも１つの組み合わせで使用することができる。配列番号５及び６はフォワードプライマーとリバースプライマーとして好ましく用いることが出来る組合せであり、カンジダ属の遺伝子領域に特異的に対応するオリゴヌクレオチドである。配列番号７及び８はフォワードプライマーとリバースプライマーとして好ましく用いることが出来る組合せであり、アスペルギルス属の遺伝子領域に特異的に対応するオリゴヌクレオチドである。配列番号９及び１０はフォワードプライマーとリバースプライマーとして好ましく用いることが出来る組合せであり、クリプトコッカス属の遺伝子領域に特異的に対応するオリゴヌクレオチドである。配列番号１１及び１２はフォワードプライマーとリバースプライマーとして好ましく用いることが出来る組合せであり、カンジダ属、アスペルギルス属およびクリプトコッカス属のすべての遺伝子領域に特異的に対応するオリゴヌクレオチドである。
【００２１】
本発明でプライマーとして用いる、配列番号１〜１２のいずれかのオリゴヌクレオチドは、その目的を十分満たすのであれば、その一部分を用いても良い。
【００２２】
本願発明の病原真菌遺伝子検出用キットは、請求項１或いは３に記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせからなる該オリゴヌクレオチドを含有することを特徴とする。
【００２３】
このように病原真菌の18S rRNA遺伝子に特有な塩基配列から設計したオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いたPCR法及びnested PCR法によって、一部の属におけるプライマー配列の異なりが原因と思われる感度不足を解消し、より多くの病原真菌を高感度に検出及び同定することができるとともに病原真菌遺伝子検出・同定用キットを作製することが可能である。
【００２４】
なお、キットに用いる試薬は溶液状、凍結乾燥物或いはプレート等に固定化された状態でもよい。以上、本発明によって病原真菌の早期発見及び菌種の同定が可能となり、早期治療に結びつく。
【００２５】
【実施例】以下、本発明を実施例をもって詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって制限されるものではない。
実施例１
主用病原真菌カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス及びクリプトコッカス・ネオフォルマンスの18S rRNA遺伝子のPCR法による検出及び同定
（１）オリゴヌクレオチド（DNA）の合成及び精製
配列表の配列番号１〜３及び５〜１２に示したオリゴヌクレオチド（DNA）の合成及び精製は、日本バイオサービスに依頼した。
（２）カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス及びクリプトコッカス・ネオフォルマンスのゲノムDNAの調製
カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス及びクリプトコッカス・ネオフォルマンスの培養及びゲノムDNAの調製は、槇村らの方法 [ 真菌症遺伝子診断 編集／槇村浩一 発行／メジカルセンス ] により行い、100、10及び1pg/5μLに調製した。
（３）カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス及びクリプトコッカス・ネオフォルマンスの18S rRNA遺伝子に特異的な領域のPCR法による増幅
実施例１の（２）で調製したカンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス及びクリプトコッカス・ネオフォルマンスのDNAを各々5μLずつ0.2ｍL用PCRチューブに取り、3μLの10×増幅用緩衝液（100mM Tris-HCl（pH8.3）、500mMKCl）、3μLの2mM dNTPs（dATP、dGTP、dTTP、dCTP）、1.8μLの25mM MgCl2、0.6μLの15pmol/μL オリゴヌクレオチド１、0.3μLの15pmol/μL オリゴヌクレオチド２、0.3μLの15pmol/μL オリゴヌクレオチド３及び0.3μLの5U/μL タックポリメラーゼ（東洋紡製）を加え、更に滅菌水を加えて30μLの溶液にした。対象として、上記組成中オリゴヌクレオチド２を0.6μL、オリゴヌクレオチド３は混合しない溶液も調製した（登録番号2110122の組成）。反応条件は95℃・5分間の変性後、95℃・30秒の変性→59℃・30秒のアニーリング→72℃・1分の合成反応を34サイクル行い、72℃・7分間伸長反応を行った。以上の反応を自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（Perkin-Elmer社 PCR System 9700）により実施した。
（４）カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス及びクリプトコッカス・ネオフォルマンスの18S rRNA遺伝子に特異的な領域のPCR法による増幅後の検出
10μLの反応液を2%アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線による蛍光で増幅されたDNAを確認した。その結果、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス及びクリプトコッカス・ネオフォルマンスともに1pg/5μL添加まで687bp付近に単一の増幅が確認できたが、２種類のオリゴヌクレオチド（登録番号2110122の組成）を用いた反応液ではカンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタスでは1pg/5μL添加まで増幅が確認できたが、クリプトコッカス・ネオフォルマンスでは100pg/5μL添加しか増幅が確認できなかった。
（５）カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス及びクリプトコッカス・ネオフォルマンスのnested PCR法による増幅
実施例１の（４）で増幅が確認された３種類のオリゴヌクレオチドを用いた反応液（1pg/5μL）を、滅菌蒸留水で1,000倍希釈後、各々1μLずつ0.2ｍL用PCRチューブに取り、3μLの10×増幅用緩衝液（100mM Tris-HCl（pH8.3）、500mM KCl）、3μLの2mM dNTPs（dATP、dGTP、dTTP、dCTP）、1.8μLの25mM MgCl2、0.6μLずつの15pmol/μL 各組み合わせオリゴヌクレオチド2種及び0.3μLの5U/μL タックポリメラーゼ（東洋紡製）を加え、更に滅菌蒸留水を加えて30μLの溶液にした。反応条件は95℃・5分間の変性後、95℃・30秒の変性→60℃・30秒のアニーリング→72℃・30秒の合成反応を25サイクル行い、72℃・7分間伸長反応を行った。以上の反応を自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（Perkin-Elmer社 PCR System 9700）により実施した。
（６）カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス及びクリプトコッカス・ネオフォルマンスのnested PCR法による増幅後の検出及び同定
10μLの反応液を2%アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、紫外線による蛍光で増幅されたDNAを確認した。その結果、カンジダ・アルビカンスにおいては病原真菌共通オリゴヌクレオチドで199bp付近とカンジダ属オリゴヌクレオチドで437bp付近に、アスペルギルス・フミガタスにおいては病原真菌共通オリゴヌクレオチドで199bp付近とアスペルギルス属オリゴヌクレオチドで385bp付近に、クリプトコッカス・ネオフォルマンスにおいては病原真菌共通オリゴヌクレオチドで199bp付近とクリプトコッカス属オリゴヌクレオチドで254bp付近に各々単一の増幅が確認でき、その他のオリゴヌクレオチドの組み合わせでは増幅が確認できなかった。
このことは、本発明によりクリプトコッカス・ネオフォルマンスにおいて更なる感度向上ができたこと及びカンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス及びクリプトコッカス・ネオフォルマンスにおいて同定が可能であることを示していると考える。
【００２６】
【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明により、病原真菌の18S rRNA遺伝子の一部を検出することによる試料中の病原真菌の更なる高感度な検出法及び検出キット、並びに菌種特異的遺伝子の同定法が提供される。
【００２７】
【配列表】
[0001]
FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to oligonucleotides and combinations thereof useful for the detection and identification of pathogenic fungi. More specifically, the present invention relates to a method for detecting and identifying a pathogenic fungus using the oligonucleotide, and a kit therefor.
[0002]
2. Description of the Related Art With the spread of advanced medical treatment, the number of susceptible patients continues to increase, and deep (systemic) mycosis such as candidiasis and aspergillosis is an important susceptibility of highly susceptible patients. It is a medical problem as an infectious disease. Despite the development of various antibacterial agents for treatment today, the diagnosis of deep mycosis is extremely difficult, and an effective diagnostic method has not yet been established. The diagnostic methods for deep mycosis commercially available to date include methods for immunologically detecting each genus or various pathogenic fungal antigens or antibodies thereto, and biochemical analysis of bacterial components or metabolites of pathogenic fungi. However, there is a problem of false positive showing a significantly high value even for patients without pathologically fungal infection (including healthy people) in any method, and also in sensitivity It is not enough to respond to clinical demands, and it takes a considerable amount of time to get results.
[0003]
In recent years, a method has been reported to rapidly and specifically detect the genes of only specific pathogenic fungi by PCR, but in view of the diversification of deep fungal disease-causing bacteria, only specific bacterial species are detected. In addition to the limited number of bacterial species that can be detected by conventional PCR, a separate test is required at the same time as the number of possible causative organisms in a sample, and a diagnostic method that can always adequately respond to clinical requirements However, it has been required to establish a method for rapidly and specifically diagnosing a wider range of pathogenic fungal infections. In addition, in the case of pathogenic fungal infections, it is necessary to select the antimicrobial agent to be used for treatment depending on the species of the infected pathogenic fungus. It has been required to establish a method that can specifically diagnose the disease.
[0004]
One of the inventor, Hideyo Yamaguchi (Teikyo University), applied for a patent for registration number 2110122 "primer for amplifying pathogenic fungal gene". A method was proposed in which two types of primers, which are commonly stored in fungi and designed from regions that are less common to humans and bacteria, were used for PCR detection. Similarly, the registration number 2110121 `` pathogenic filamentous fungal gene amplification primer '', JP-A-8-89254 `` Oligonucleotides for detection of fungi and identification of fungal species '', JP-A-11-142409 `` Method for detecting pathogenic microorganisms '' by PCR A method for identifying a specific strain has been proposed. However, in some genera and species, lack of sensitivity and non-specific amplification, which are considered to be caused by differences in primer sequences, were observed, and further improvements in sensitivity and specificity were required.
[0005]
Although the characteristics of various pathogenic fungi are defined by their genes, the first PCR method is performed using a combination of oligonucleotides corresponding to characteristic gene regions common to each pathogenic fungus. If the method can be carried out and a characteristic gene (gene of the first target portion) common to various pathogenic fungi can be detected, the presence of such a bacterium can be determined. In addition, using the same reaction solution as a sample, and further performing a nested PCR method using a combination of species-specific oligonucleotides comprising the internal sequence of the gene of the first target portion as a primer, the first target pathogenic fungus can be obtained. Thus, a gene (second target gene) characteristic of one or more pathogenic fungi, which has been further narrowed down, can be detected, and specific bacterial species can be identified with high sensitivity.
[0006]
An object of the present invention is to improve a method for detecting and identifying pathogenic fungi in a sample simply, quickly and highly sensitively and specifically and to use the oligonucleotides used in the above patents, and to improve the kit, and The present invention provides a method for resolving insufficient sensitivity and non-specific amplification, which may be caused by a difference in primer sequence, an oligonucleotide used therefor, and the kit.
[0007]
Means for Solving the Problems The present inventors have conducted various studies on the 18S rRNA gene of fungi and other organisms in order to solve the above-mentioned problems, and found that in some genera, the lack of sensitivity which may be caused by the primer sequence is considered. In addition, the present inventors have established a detection / identification method for eliminating non-specific reactions and completed the present invention.
[0008]
That is, the present invention provides a method for detecting a pathogenic fungal gene described in each of the following items.
Item 1. After amplifying the gene of the first target portion by PCR using a combination of oligonucleotides specific to the 18S rRNA gene of a wide range of pathogenic fungi as primers, and further analyzing the internal sequence of the gene of the first target portion A method for detecting a pathogenic fungus, comprising amplifying and detecting a gene of a second target portion by nested PCR using a combination of species-specific oligonucleotides as primers.
Item 2. The method for detecting a pathogenic fungus according to Item 1, wherein after amplifying the gene of the first target portion, the reaction solution is further diluted appropriately to further amplify and detect the gene of the second target portion.
Item 3. A method for identifying a species of a pathogenic fungus by detecting the pathogenic fungus by the method described in Item 1.
Item 4. An oligonucleotide specifically corresponding to a characteristic gene region common to each pathogenic fungus for amplifying the gene of the first target portion of the 18S rRNA gene of a wide range of pathogenic fungi according to Item 1. .
Item 5. The oligonucleotide according to Item 4, wherein the oligonucleotide comprises part or all of the nucleic acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 4.
Item 6. The method for amplifying a gene of the first target portion according to Item 1, wherein the oligonucleotide according to Item 5 is used in combination of SEQ ID NO: 1, 2, 3, or 1, 4.
Item 7. An oligonucleotide specifically corresponding to a gene region characteristic of Candida, for amplifying the gene of the second target portion according to Item 1.
Item 8. The oligonucleotide according to Item 7, comprising a part or all of the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NOS: 5 and 6.
Item 9. An oligonucleotide specifically corresponding to a gene region characteristic of Aspergillus, for amplifying the gene of the second target portion according to Item 1.
Item 10. The oligonucleotide according to Item 9, comprising a part or all of the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NOS: 7 and 8.
Item 11. An oligonucleotide specifically corresponding to a gene region characteristic of Cryptococcus for amplifying the gene of the second target portion according to Item 1.
Item 12. The oligonucleotide according to Item 11, wherein the oligonucleotide comprises part or all of the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NOS: 9 and 10.
Item 13. An oligonucleotide for amplifying the gene of the second target portion according to Item 1, which specifically corresponds to a gene region common and characteristic to pathogenic fungi of the genera Candida, Aspergillus and Cryptococcus.
Item 14. The oligonucleotide according to Item 13, wherein the oligonucleotide comprises part or all of the nucleic acid sequences represented by SEQ ID NOS: 11 and 12.
Item 15. The oligonucleotide according to any one of Items 7-14 is used in at least one combination selected from SEQ ID NOS: 5 and 6, SEQ ID NOS: 7 and 8, SEQ ID NOS: 9 and 10, or SEQ ID NOs: 11 and 12. Item 2. The method for amplifying a gene of the second target portion according to Item 1.
Item 16. A combination of oligonucleotides consisting of part or all of the oligonucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 12, or part or all of their complementary sequences, used for detecting a pathogenic fungal gene.
Item 17. It contains a part or all of the oligonucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 12 used for detecting a pathogenic fungal gene or a combination of these oligonucleotides consisting of a part or all of their complementary sequences. A kit for detecting and identifying a pathogenic fungus by the method according to any one of Items 1 to 3.
[0009]
According to an overview of the present invention, a wide range of pathogenic fungi including Candida, Hansenula, Saccharomyces, Trichosporon, Cryptococcus, Aspergillus, Penicillium, Blastmyces, Coccidioides and Pneumocystis, are particularly preferred. The present invention relates to a method for detecting pathogenic fungi including Candida, Cryptococcus, and Aspergillus, using a suitable combination of the oligonucleotides consisting of part or all of the oligonucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 4 as a primer, Characterized in that the 18S rRNA gene is detected with higher sensitivity by the PCR method. Further, the reaction solution is diluted 1 to 10,000 times with sterile distilled water, preferably 10 to 1,000 times, more preferably the reaction solution for which amplification was not confirmed is 10 times, and the reaction solution which can be confirmed is diluted 1,000 times, and then the SEQ ID NO. Using Candida genus, Aspergillus genus, Cryptococcus genus and each pathogen-common fungal oligonucleotide combination consisting of part or all of the oligonucleotide sequences described in 5 to 12 as primers, identifying the bacterial species by nested PCR. Features. Furthermore, a kit for detecting and identifying a pathogenic fungus, which is a kit for detecting and identifying the pathogenic fungus by the above method, wherein the 18S rRNA gene of the pathogenic fungus is further amplified by a PCR method. The method is characterized by detecting a combination of oligonucleotides and amplified DNA, and further detecting and identifying the combination of oligonucleotides and amplified DNA for amplifying bacterial species-specifically by nested PCR.
[0010]
The sequence of the characteristic oligonucleotide common to the pathogenic fungi in the 18S rRNA gene can be determined by the following procedure.
(1) Among the gene sequences registered in the gene sequence data bank (GenBank), the 18S rRNA genes (DNA) of various pathogenic fungi, humans and Escherichia coli were compared between their respective nucleotide sequences, and the pathogens shown in Table 1 were compared. It defines a sequence region that is common to fungi and not common to humans (accession number M10098) and Escherichia coli (accession number M24996).
Table 1
Aspergillus fumigatus M55626
Penicillium notatum M55628
Candida albicans M60302
Candida Gillier Mondii M60304
Candida Kefil M60303
Candida Kurzei M60305
Candida Lucitanier M60306
Candida parapsilosis M60307
Candida Viswanatii M60309
Candida Gravlata M60311
Hansenula Polymorpha M60310
Saccharomyces cerevisiae V01335
Cryptococcus neoformans M55625
Blast Myces dermatichis M55624
Coccidioidos imitis M55627
Pneumocystis carinii X12708
[0011]
(2) Combinations of oligonucleotides capable of specifically amplifying only the 18S rRNA genes of all the pathogenic fungi shown in Table 1 from the above sequence regions specific to the pathogenic fungi (SEQ ID NOs: 1, 2, and 3) Alternatively, 1 and 4) are determined. Oligonucleotides can be synthesized by a DNA synthesizer, and can be purified by a column, HPLC, or the like.
[0012]
Next, the sequences of oligonucleotides specific to various pathogenic fungi in the amplified gene can be determined by the following procedure.
[0013]
(1) From the sequences of the various pathogenic fungi shown in Table 1, a part of the 18S rRNA gene (DNA) amplified by the PCR method further contains sequence regions specific to Candida, Aspergillus and Cryptococcus, respectively. Sequence regions common to the pathogenic fungi are defined using sequences of Candida albicans, Aspergillus fumigatus and Cryptococcus neoformans.
[0014]
(2) Combinations of oligonucleotides capable of specifically amplifying only the various 18S rRNA genes of the genus Candida, Aspergillus and Cryptococcus shown in Table 1 from the above sequence regions specific to the pathogenic fungi, and pathogenic fungi The combination of oligonucleotides that can amplify the sequence region common to the above is determined. Oligonucleotides can be synthesized by a DNA synthesizer, and can be purified by a column, HPLC, or the like.
[0015]
The pathogenic fungal DNA to be detected can be prepared from a pathogenic fungal infection sample such as blood. Regarding the PCR method and the nested PCR method, a gene amplification kit containing a tack polymerase (Taq polymerase) and an automatic gene amplifying apparatus are commercially available. Is possible. In the PCR method, a step of denaturing DNA (about 95 ° C.), a step of annealing oligonucleotide DNA (about 59 ° C.), and a step of synthesizing DNA (about 72 ° C.) using, for example, a thermostable tack polymerase as an enzyme By repeating this cycle an arbitrary number of times, only the target gene can be exponentially amplified. For example, if the cycle is repeated 25 times, the target DNA is amplified about 100,000 times. This PCR method is currently the most effective method for detecting DNA with higher sensitivity than a small amount of sample. Detection of the target DNA after amplification can be performed by, for example, agarose gel electrophoresis or polyacrylamide gel electrophoresis.
[0016]
As an identification method, amplification can be confirmed by a combination of oligonucleotides common to pathogenic fungi by the above detection method in nested PCR, and only one genus is amplified by each combination of oligonucleotides of Candida, Aspergillus, and Cryptococcus. Can be identified when is confirmed. For example, when amplification is observed with a combination of oligonucleotides common to pathogenic fungi and Candida and no amplification is observed with a combination of oligonucleotides of Aspergillus and Cryptococcus, the specimen can be determined to be Candida. In addition, if amplification was confirmed in at least two or more of each combination of oligonucleotides of the genera Candida, Aspergillus, and Cryptococcus, nonspecific amplification or complex infection is considered. It is desirable to perform PCR or perform other testing methods.
[0017]
In amplifying the gene of the first target portion by the target gene detection method of the present invention, the oligonucleotide of SEQ ID NO: 1 is used as a forward primer, and the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 2 and 3 are used as reverse primers. The conventional combination of the forward primer of SEQ ID NO: 1 and the reverse primer of SEQ ID NO: 2 was not sufficient to detect a wide range of pathogenic fungi, particularly a wide range of 18S rRNA genes including Cryptococcus sp. When primers are used in combination, sufficient sensitivity can be obtained also for the genus Cryptococcus because the specific binding of the primer to the genus Cryptococcus increases.
In amplifying the gene of the first target portion by the target gene detection method of the present invention, a combination of the forward primer of SEQ ID NO: 1 and the reverse primer of SEQ ID NO: 4 may be used. This gives equivalent results with fewer primers.
[0018]
In the method of amplifying the gene of the first target portion by the method for detecting a pathogenic fungus of the present invention, the oligonucleotides of SEQ ID NOS: 1, 2 and 3 are used because the specific binding of a primer to Cryptococcus increases. It is preferable to use a part or all of the sequence at a ratio of 4: 4 to 1: 4 to 1 at the same time.
[0019]
In amplifying the gene of the first target portion by the method for detecting a pathogenic fungus of the present invention, the oligonucleotides represented by SEQ ID NOS: 1 and 4 may have a higher specific binding property to a Cryptococcus sp. It is preferable to use two or more of them at a ratio of 1: 2 to 1 or a part thereof.
[0020]
In amplifying the gene of the second target portion by the target gene detection method of the present invention, at least one selected from SEQ ID NOs: 5 and 6, SEQ ID NOs: 7 and 8, SEQ ID NOs: 9 and 10, or SEQ ID NOs: 11 and 12 Can be used in any combination. SEQ ID NOS: 5 and 6 are combinations that can be preferably used as a forward primer and a reverse primer, and are oligonucleotides specifically corresponding to a Candida gene region. SEQ ID NOs: 7 and 8 are combinations that can be preferably used as a forward primer and a reverse primer, and are oligonucleotides specifically corresponding to a gene region of Aspergillus. SEQ ID NOs: 9 and 10 are combinations that can be preferably used as a forward primer and a reverse primer, and are oligonucleotides that specifically correspond to the gene region of the genus Cryptococcus. SEQ ID NOs: 11 and 12 are combinations that can be preferably used as a forward primer and a reverse primer, and are oligonucleotides specifically corresponding to all gene regions of the genera Candida, Aspergillus and Cryptococcus.
[0021]
Any of the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 1 to 12, which are used as primers in the present invention, may use a part of them as long as the purpose is sufficiently satisfied.
[0022]
A kit for detecting a pathogenic fungal gene according to the present invention comprises the oligonucleotide comprising the combination of the oligonucleotides according to claim 1 or 3.
[0023]
In this way, PCR and nested PCR using a combination of oligonucleotides designed from the nucleotide sequence unique to the 18S rRNA gene of the pathogenic fungus eliminates the lack of sensitivity that may be caused by differences in primer sequences in some genera However, it is possible to detect and identify more pathogenic fungi with high sensitivity and to prepare a kit for detecting and identifying pathogenic fungal genes.
[0024]
The reagent used in the kit may be in the form of a solution, a lyophilized product, or a state immobilized on a plate or the like. As described above, the present invention enables early detection of pathogenic fungi and identification of bacterial species, leading to early treatment.
[0025]
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
Example 1
Detection and identification of 18S rRNA gene of main pathogenic fungi Candida albicans, Aspergillus fumigatus and Cryptococcus neoformans by PCR method (1) Synthesis and purification of oligonucleotide (DNA) SEQ ID NOS: 1-3 and 5 in Sequence Listing The synthesis and purification of the oligonucleotides (DNA) shown in Nos. To 12 were requested to Japan Bio Services.
(2) Preparation of genomic DNA of Candida albicans, Aspergillus fumigatus and Cryptococcus neoformans Culturing of Candida albicans, Aspergillus fumigatus and Cryptococcus neoformans and preparation of genomic DNA are performed according to the method of Makimura et al. Genetic Diagnosis Edited by Koichi Makimura / Medical Sense] to prepare 100, 10 and 1 pg / 5 μL.
(3) Amplification by PCR of a region specific to the 18S rRNA gene of Candida albicans, Aspergillus fumigatus and Cryptococcus neoformans by PCR method Candida albicans, Aspergillus fumigatus and Cryptococcus sp. Prepared in Example 1 (2). Take 5 μL each of Neoformans DNA into a 0.2 mL PCR tube, and add 3 μL of 10 × amplification buffer (100 mM Tris-HCl (pH 8.3), 500 mM KCl), 3 μL of 2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), 1.8 μL of 25 mM MgCl 2 , 0.6 μL of 15 pmol / μL oligonucleotide 1, 0.3 μL of 15 pmol / μL oligonucleotide 2 , 0.3 μL of 15 pmol / μL oligonucleotide 3, and 0.3 μL of 5 U / μL tack polymerase (Toyobo Was added, and sterile water was further added to make a solution of 30 μL. As a control, a solution in which 0.6 μL of oligonucleotide 2 and oligonucleotide 3 were not mixed in the above composition was also prepared (composition of registration number 2110122). The reaction conditions are denaturation at 95 ° C for 5 minutes, denaturation at 95 ° C for 30 seconds → annealing at 59 ° C for 30 seconds → synthesis reaction at 72 ° C for 1 minute for 34 cycles, and extension at 72 ° C for 7 minutes. Was. The above reaction was carried out using an automatic gene amplifier Thermal Cycler (Perkin-Elmer PCR System 9700).
(4) Detection of a region specific to the 18S rRNA gene of Candida albicans, Aspergillus fumigatus and Cryptococcus neoformans after amplification by PCR.
10 μL of the reaction solution was electrophoresed on a 2% agarose gel, stained with ethidium bromide, and the DNA amplified by ultraviolet fluorescence was confirmed. As a result, in each of Candida albicans, Aspergillus fumigatus and Cryptococcus neoformans, single amplification was confirmed at around 687 bp until 1 pg / 5 μL was added. In the reaction mixture, amplification was confirmed up to 1 pg / 5 μL in Candida albicans and Aspergillus fumigatus, but only 100 pg / 5 μL in Cryptococcus neoformans.
(5) Amplification of Candida albicans, Aspergillus fumigatus and Cryptococcus neoformans by nested PCR method Reaction solution (1 pg / 5 μL) using three oligonucleotides whose amplification was confirmed in (4) of Example 1 After diluting 1,000 times with sterile distilled water, transfer 1 μL each to a 0.2 mL PCR tube, and prepare 3 μL of 10 × amplification buffer (100 mM Tris-HCl (pH 8.3), 500 mM KCl), 3 μL of 2 mM dNTPs ( dATP, dGTP, dTTP, dCTP), 1.8 μL of 25 mM MgCl 2 , 0.6 μL each of 15 pmol / μL each combination oligonucleotide, and 0.3 μL of 5 U / μL Tac polymerase (manufactured by Toyobo), and sterile distilled water were further added. In addition, a 30 μL solution was prepared. The reaction conditions are: denaturation at 95 ° C for 5 minutes, followed by denaturation at 95 ° C for 30 seconds → annealing at 60 ° C for 30 seconds → synthesis reaction at 72 ° C for 30 seconds for 25 cycles, and extension at 72 ° C for 7 minutes. Was. The above reaction was carried out using an automatic gene amplifier Thermal Cycler (Perkin-Elmer PCR System 9700).
(6) Detection and identification of Candida albicans, Aspergillus fumigatus and Cryptococcus neoformans after amplification by nested PCR
10 μL of the reaction solution was electrophoresed on a 2% agarose gel, stained with ethidium bromide, and the DNA amplified by ultraviolet fluorescence was confirmed. As a result, in Candida albicans, the pathogenic fungal common oligonucleotide is around 199 bp and the Candida genus oligonucleotide is around 437 bp, and in Aspergillus fumigatus, the pathogenic fungal common oligonucleotide is around 199 bp and the Aspergillus oligonucleotide is around 385 bp, the cryptococcus In the case of neoformans, single amplification was confirmed at around 199 bp for the common oligonucleotide of the pathogenic fungus and at around 254 bp for the oligonucleotide belonging to the genus Cryptococcus, and no amplification was confirmed for any other combination of oligonucleotides.
This suggests that the present invention has further improved the sensitivity of Cryptococcus neoformans and that identification is possible in Candida albicans, Aspergillus fumigatus and Cryptococcus neoformans.
[0026]
As described above in detail, according to the present invention, a method and a kit for detecting a pathogenic fungus in a sample by detecting a part of the 18S rRNA gene of the pathogenic fungus with higher sensitivity, Methods for identifying species-specific genes are provided.
[0027]
[Sequence list]
