JP2004248501A - 癌悪性度の評価方法 - Google Patents
癌悪性度の評価方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004248501A JP2004248501A JP2000109982A JP2000109982A JP2004248501A JP 2004248501 A JP2004248501 A JP 2004248501A JP 2000109982 A JP2000109982 A JP 2000109982A JP 2000109982 A JP2000109982 A JP 2000109982A JP 2004248501 A JP2004248501 A JP 2004248501A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- accession number
- genebank
- precursor
- genebank accession
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 247
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 245
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 title claims abstract description 126
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 title claims description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 336
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 230
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims abstract description 129
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims abstract description 128
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims abstract description 128
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 87
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 75
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 45
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 37
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 22
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 19
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 60
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 48
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 41
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 37
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 37
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 35
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 35
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 26
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 23
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 claims description 20
- 102100028437 Versican core protein Human genes 0.000 claims description 20
- 108090000855 Matrilysin Proteins 0.000 claims description 18
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 claims description 15
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 claims description 14
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 claims description 14
- 101710200894 Versican core protein Proteins 0.000 claims description 14
- 108010077077 Osteonectin Proteins 0.000 claims description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 12
- 102100036170 C-X-C motif chemokine 9 Human genes 0.000 claims description 11
- 102100030417 Matrilysin Human genes 0.000 claims description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 11
- 101710151806 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 claims description 10
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 claims description 10
- 102100021663 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Human genes 0.000 claims description 10
- 101710178010 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Proteins 0.000 claims description 10
- 108090000654 Bone morphogenetic protein 1 Proteins 0.000 claims description 10
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims description 10
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims description 10
- 108010069502 Collagen Type III Proteins 0.000 claims description 10
- 102000001187 Collagen Type III Human genes 0.000 claims description 10
- 108010043741 Collagen Type VI Proteins 0.000 claims description 10
- 102000002734 Collagen Type VI Human genes 0.000 claims description 10
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims description 10
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 10
- 102100031000 Hepatoma-derived growth factor Human genes 0.000 claims description 10
- 101001027925 Homo sapiens Metastasis-associated protein MTA1 Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004372 Insulin-like growth factor binding protein 2 Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000964 Insulin-like growth factor binding protein 2 Proteins 0.000 claims description 10
- 108010041357 Integrin alpha3 Proteins 0.000 claims description 10
- 102000000510 Integrin alpha3 Human genes 0.000 claims description 10
- 101150014058 MMP1 gene Proteins 0.000 claims description 10
- 108010016113 Matrix Metalloproteinase 1 Proteins 0.000 claims description 10
- 102000000380 Matrix Metalloproteinase 1 Human genes 0.000 claims description 10
- 108010016165 Matrix Metalloproteinase 2 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100037517 Metastasis-associated protein MTA1 Human genes 0.000 claims description 10
- 102100029529 Thrombospondin-2 Human genes 0.000 claims description 10
- 108700004333 collagenase 1 Proteins 0.000 claims description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 10
- 108010052188 hepatoma-derived growth factor Proteins 0.000 claims description 10
- 230000003902 lesion Effects 0.000 claims description 10
- 102000009099 rhoA GTP Binding Protein Human genes 0.000 claims description 10
- 108010087917 rhoA GTP Binding Protein Proteins 0.000 claims description 10
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 claims description 10
- 108010060887 thrombospondin 2 Proteins 0.000 claims description 10
- 101710187168 Alpha-2-macroglobulin Proteins 0.000 claims description 9
- 101710136034 Alpha-2-macroglobulin homolog Proteins 0.000 claims description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 9
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 8
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 8
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 7
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004318 Matrilysin Human genes 0.000 claims description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 7
- 101000947172 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 9 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100026547 Platelet-derived growth factor receptor beta Human genes 0.000 claims description 6
- 101710164680 Platelet-derived growth factor receptor beta Proteins 0.000 claims description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 6
- 102000028416 insulin-like growth factor binding Human genes 0.000 claims description 6
- 108091022911 insulin-like growth factor binding Proteins 0.000 claims description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 6
- 101710085500 C-X-C motif chemokine 9 Proteins 0.000 claims description 5
- 101710096389 Collagen alpha chain Proteins 0.000 claims description 5
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 claims description 5
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 claims description 5
- 101000894525 Homo sapiens Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 Proteins 0.000 claims description 5
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000014842 Multidrug resistance proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108050005144 Multidrug resistance proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 claims description 5
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 claims description 5
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 claims description 5
- 102100021398 Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 Human genes 0.000 claims description 5
- 108010042352 Urokinase Plasminogen Activator Receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004504 Urokinase Plasminogen Activator Receptors Human genes 0.000 claims description 5
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 claims description 5
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 claims description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 5
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 claims description 4
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 claims description 4
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 claims description 4
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 2
- 102000009890 Osteonectin Human genes 0.000 claims 12
- 102000004152 Bone morphogenetic protein 1 Human genes 0.000 claims 9
- 102000018967 Platelet-Derived Growth Factor beta Receptor Human genes 0.000 claims 8
- 108010051742 Platelet-Derived Growth Factor beta Receptor Proteins 0.000 claims 8
- 108010027297 Versicans Proteins 0.000 claims 6
- 102000047200 Collagen Type XVIII Human genes 0.000 claims 4
- 108010001463 Collagen Type XVIII Proteins 0.000 claims 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 abstract description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 59
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 51
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 26
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 21
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 12
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 11
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 9
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 9
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 9
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 8
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 7
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 6
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 5
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 5
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 5
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 5
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 5
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 5
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 4
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 4
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 4
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 4
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 102100024458 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A Human genes 0.000 description 3
- 101100532034 Drosophila melanogaster RTase gene Proteins 0.000 description 3
- 208000007433 Lymphatic Metastasis Diseases 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000029578 entry into host Effects 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 201000011591 microinvasive gastric cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 241000713826 Avian leukosis virus Species 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- -1 Cy5 Chemical compound 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 2
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 2
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102100037599 SPARC Human genes 0.000 description 2
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 108010056708 bcr-abl Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 2
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005861 gene abnormality Effects 0.000 description 2
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003426 interchromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000000683 nonmetastatic effect Effects 0.000 description 2
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 108700042657 p16 Genes Proteins 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000009790 vascular invasion Effects 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 101150040390 105 gene Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000714230 Avian leukemia virus Species 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 101150049556 Bcr gene Proteins 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 102100028728 Bone morphogenetic protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000030746 Collagen Type X Human genes 0.000 description 1
- 108010022510 Collagen Type X Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010068682 Cyclophilins Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000013446 GTP Phosphohydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108091006109 GTPases Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000014429 Insulin-like growth factor Human genes 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 101150115920 MTS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010027457 Metastases to liver Diseases 0.000 description 1
- 206010051676 Metastases to peritoneum Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000032818 Microsatellite Instability Diseases 0.000 description 1
- 101710167839 Morphogenetic protein Proteins 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 235000012012 Paullinia yoco Nutrition 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000008022 Proto-Oncogene Proteins c-met Human genes 0.000 description 1
- 108010089836 Proto-Oncogene Proteins c-met Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 102000042463 Rho family Human genes 0.000 description 1
- 108091078243 Rho family Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101710100111 SPARC Proteins 0.000 description 1
- 208000003252 Signet Ring Cell Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000006087 Silane Coupling Agent Substances 0.000 description 1
- 101150114468 TUB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100031358 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108700025690 abl Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008711 chromosomal rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 108700020302 erbB-2 Genes Proteins 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 208000013210 hematogenous Diseases 0.000 description 1
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 1
- 238000007417 hierarchical cluster analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 210000003963 intermediate filament Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000029691 metastatic malignant neoplasm in the lymph nodes Diseases 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 230000033607 mismatch repair Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 201000010879 mucinous adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000004019 papillary adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010882 preoperative diagnosis Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 230000028617 response to DNA damage stimulus Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 201000008123 signet ring cell adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000030938 small GTPase Human genes 0.000 description 1
- 108060007624 small GTPase Proteins 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 210000004876 tela submucosa Anatomy 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010451 viral insertion Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】簡便かつ迅速に、高い信頼度で癌の悪性度を評価しうる、癌、特に胃癌の悪性度の評価方法、それに用いるアレイ及びキットを提供すること。
【解決手段】下記ステップ：（１）被検試料において、胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子の発現量を測定するステップ、及び（２）（１）で得られた各遺伝子の発現量に基づき、胃癌の悪性度を評価するステップを行なうことを特徴とする胃癌の悪性度の評価方法；前記８種以上の遺伝子に対応する核酸又はその断片が各支持体上の定められた領域に固定化された胃癌悪性度評価用アレイ；該８種以上の遺伝子から発現されるｍＲＮＡ又はその断片の検出用プライマー及び／又はプローブを含有した胃癌悪性度評価用キット；並びに該８種以上の遺伝子にコードされたポリペプチド又はその断片の抗体又はその断片を含有した胃癌悪性度評価用キット。
【選択図】 なし
【解決手段】下記ステップ：（１）被検試料において、胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子の発現量を測定するステップ、及び（２）（１）で得られた各遺伝子の発現量に基づき、胃癌の悪性度を評価するステップを行なうことを特徴とする胃癌の悪性度の評価方法；前記８種以上の遺伝子に対応する核酸又はその断片が各支持体上の定められた領域に固定化された胃癌悪性度評価用アレイ；該８種以上の遺伝子から発現されるｍＲＮＡ又はその断片の検出用プライマー及び／又はプローブを含有した胃癌悪性度評価用キット；並びに該８種以上の遺伝子にコードされたポリペプチド又はその断片の抗体又はその断片を含有した胃癌悪性度評価用キット。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、簡便かつ迅速に、高い信頼度で癌の悪性度を評価しうる、癌、特に胃癌の悪性度の評価方法、それに用いるアレイ及びキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌は、１９８１年以降日本における死因の１位を占め、中でも胃癌は、最も頻度の高い癌である。近年、正常細胞が癌になるまでの多段階発癌機構が存在することが明らかにされている〔フィーロンＥ．Ｒ．（Ｆｅａｒｏｎ，Ｅ．Ｒ．）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、第６１巻、第７５９−７６７頁（１９９０）、スギムラＴ．（Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ｔ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） 、第２５８巻、第６０３−６０７頁（１９９２）〕。具体的には、正常細胞の癌化には、ＤＮＡ修復遺伝子、癌抑制遺伝子及び癌遺伝子を含む複数の遺伝子異常の蓄積が必要とされている。一般に、遺伝子の不安定性と癌抑制遺伝子の不活化とは癌の発生に関与すると考えられている。また、癌遺伝子の活性化及び／又は増殖因子の過剰発現は、癌の進展及び悪性化に関与すると考えられている。さらに、細胞外マトリックス分子の分解酵素をコードする遺伝子や細胞の運動能又は接着性を調節するタンパク質をコードする遺伝子は、転移、浸潤に関与すると考えられている。
【０００３】
遺伝子の不安定性には、ＤＮＡミスマッチ修復系の異常に関連した遺伝子の不安定性と染色体レベルの不安定性とがある。前者の例として、ゲノム中に存在する単純繰り返し配列の鎖長が同一個体の癌部と非癌部とで異なること（マイクロサテライト不安定性）〔シボドーＳ．Ｎ．（Ｔｈｉｂｏｄｅａｕ， Ｓ． Ｎ．） ら、サイエンス、第２６０巻、第８１６−８１９頁（１９９３）〕が挙げられ、後者の例として、染色体間の再配列が挙げられる。前記染色体間の再配列は、正常細胞では認められないタンパク質を発現させ、一方、正常細胞において発現しているタンパク質であっても、その発現量に影響を与える場合がある。実際、ヒトの慢性骨髄性白血病において、染色体間の再配列により、ｂｃｒ 遺伝子とｃ−ａｂｌ 遺伝子の融合が起こり、正常細胞では存在しないｂｃｒ−ａｂｌ 融合遺伝子より転写されたハイブリッドｍＲＮＡの発現が確認されている。更に、ｂｃｒ−ａｂｌ 融合遺伝子を動物に導入すると白血病を発症することが確認されている〔ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ， Ｊ．Ｄ．）ら著、組み換えＤＮＡの分子生物学 第２版；丸善株式会社、第３０９頁（１９９２）〕。
【０００４】
癌抑制遺伝子の不活化としては、例えば、ｐ５３遺伝子の不活化が挙げられる。不活化の原因としては、遺伝子内の欠失かコード領域の特定の部分に起こる点突然変異によると考えられている〔ニグロＪ．Ｍ．（Ｎｉｇｒｏ， Ｊ．Ｍ．）ら、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ） 、第３４２巻、第７０５−７０８頁（１９８９）、マルキンＤ（Ｍａｌｋｉｎ，Ｄ．）ら、サイエンス、第２５０巻、第１２３３−１２３８頁（１９９０）〕。また、ｐ５３遺伝子の欠失及び点突然変異は、多くの種類の癌で観察されている。例えば、胃癌においては、前記ｐ５３遺伝子の欠失及び点突然変異は、早期癌の６割以上の症例に認められる〔ヨコザキＨ．（Ｙｏｋｏ ｚａｋｉ，Ｈ．）ら、ジャーナルオブ キャンサー リサーチ アンド クリニカルオンコロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ） 、第１１９巻、第６７−７０頁（１９９２）〕。
【０００５】
一方、ｐ１６／ＭＴＳ１遺伝子は、ホモ欠失により不活化する遺伝子として知られている。具体的には、グリオーマ、膵癌、ぼうこう癌等で高頻度のホモ欠失が観察されている〔ケアンズＰ．（Ｃａｉｒｎｓ，Ｐ．）ら、ネーチャー ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第１１巻、第２１０−２１２頁（１９９５）〕。ｐ１６ タンパク質は、細胞周期を調節している。前記ｐ１６ の発現異常は、細胞の癌化に関与することが示唆されている〔オカモトＡ．（Ｏｋａｍｏｔｏ，Ａ．） ら、プロシーディングズ オブザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）、第９１巻、第１１０４５−１１０４９頁（１９９４）〕。
【０００６】
癌遺伝子の活性化としては、例えば、癌遺伝子近傍における、ウィルスの挿入突然変異や、染色体間の再配列が原因として挙げられる。例えば、トリ白血病ウィルス ａｖｉａｎ ｌｅｕｋｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ （ＡＬＶ） によって起こる、ニワトリのリンパ腫において、ウィルスによる挿入突然変異が確認されている。この場合、ＡＬＶ のＤＮＡ が遺伝子の一種である ｃ−ｍｙｃの近傍に挿入され、ウィルスの強いエンハンサーとプロモーターにより、正常な ｃ−ｍｙｃが過剰発現したり、正常な遺伝子とは一部異なった新しい配列が発現されることが確認された。また、ある種のヒトＢ細胞の腫瘍では、染色体間の再配列により、癌遺伝子の一つである ｃ−ｍｙｃが免疫グロブリンの強い転写シグナルのもとに置かれ、その発現量が増加することが確認されている。この場合、癌細胞における ｃ−ｍｙｃ発現産物は、正常細胞に発現している該産物と差は認められず、癌化は、ｃ−ｍｙｃ 発現量の増加に起因していると考えられている〔ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ， Ｊ．Ｄ．）ら著、組み換えＤＮＡの分子生物学 第２版；丸善株式会社、第３０５−３０８頁（１９９２）〕。
【０００７】
増殖因子の過剰発現としては、例えば、肝細胞増殖因子レセプターをコードする Ｃ−Ｍｅｔの過剰発現が挙げられる。この Ｃ−Ｍｅｔの発現異常は、胃癌の発生初期から正常粘膜には認められない６．０キロ塩基長の長さを有するｍＲＮＡの発現が見られたり〔クニヤスＨ．（Ｋｕｎｉｙａｓｕ，Ｈ．）ら、インターナショナル ジャーナルオブ キャンサー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）、第５５巻、第７２−７５頁（１９９３）〕、転移癌において遺伝子増幅が高頻度で見られ、遺伝子増幅と癌の悪性度に相関性が確認されている〔クニヤスＨ．ら、バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、第１８９巻、第２２７−２３２頁（１９９２）〕。
【０００８】
遺伝子異常と癌の悪性度に相関が確認されている例として、上記ｃ−Ｍｅｔ のほか、乳癌、卵巣癌、胃癌、子宮癌等における、癌遺伝子Ｃ−ｅｒｂＢ２ 遺伝子の増幅及び／又はその過剰発現〔ライトＣ．（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｃ．）ら、キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第４９巻、第２０８７−２０９０頁（１９８９）、サファリＢ．（Ｓａｆｆａｒｉ，Ｂ．） ら、キャンサー リサーチ、第５５巻、第５６９３−５６９８頁（１９９５）〕、胃癌の１組織型である低分化腺癌における、癌遺伝子Ｋ−ｓａｍ 遺伝子の増幅及び／又はその過剰発現〔タハラＥ．（Ｔａｈａｒａ， Ｅ．） ら著、ガストリックキャンサー，東京（Ｇａｓｔｒｉｃ Ｃａｎｃｅｒ， Ｔｏｋｙｏ）、スプリンガー社（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、１９９３年発行、第２０９−２１７頁〕等がそれぞれ確認されている。
【０００９】
癌細胞が組織を浸潤して転移するには、細胞外マトリックスの分解が必要であり、分解酵素として代表的なマトリックス メタロプロテナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーに属する種々の酵素が正常細胞に比べ過剰生産されている〔ゴールドバーグＧＩ．（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ＧＩ．） ら、キャンサートリートメントリサーチ（Ｃａｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｒｅｓｅａｃｈ） 、第５３巻、第７０１−７０８頁（１９９１）〕。胃癌においては、比較的特異的に癌細胞が発現するマトリリシン（ＭＭＰ−７）のｍＲＮＡを、６割以上の症例で過剰発現していたと報告されている〔セノタＡ．ら、クリニカル＆エクスペリメンタル メタスタシス（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、第１６巻、第３１３−３２１頁（１９９８）〕。
【００１０】
悪性腫瘍においては、腫瘍血管が新生されなければ大きくなることはできず、血管新生を誘導することにより加速度的に増殖可能となる。腫瘍血管新生は、さまざまな調節因子、血管新生促進因子及び抑制因子等の発現バランスにより制御されているが、もっとも重要な因子として血管内皮細胞増殖因子ＶＥＧＦが上げられる。種々の固形腫瘍でＶＥＧＦの発現と血管新生の亢進に正の相関が認められており〔シブヤＭら、アドバンスドキャンサーリサーチ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第６７巻、第２８１頁（１９９５）〕、また胃癌、食道癌、大腸癌等においてＶＥＧＦ高発現腫瘍の予後が不良であることが報告されている〔トイＭら，モレキュラー・メディシン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）第３５巻、第１２０６−１２１５頁（１９９８）〕。
【００１１】
これまで、病理診断のみでしか不可能であった癌の分類が、ＤＮＡマイクロアレイを用い多数の遺伝子発現を同時に測定することで可能となった初めての報告が最近なされた。すなわち、ゴラブＴ．Ｒ．らは、ＤＮＡマイクロアレイ上に固定された人の６８１７遺伝子につきスクリーニングを行い、主に５０遺伝子の発現量の変化により急性白血病の分類（ＡＬＬ又はＡＭＬ）が可能であることを示した〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ ）第２８６巻、第５３１−５３７ページ（１９９９）〕。
【００１２】
このように個々の遺伝子のレベルでは癌の発生、進展に関与する遺伝子、及び該遺伝子異常に関する情報は増えてきている。しかしながら、発癌機構は、多段階であり、複数の変異の蓄積が必要とされるため、単一の遺伝子や、少数の遺伝子のランダムな組み合わせによる判定では、いまだに実用性に十分な、癌の確定診断や予後の判定にはいたっていないのが現状である。
【００１３】
事実、現在においても癌の診断や進行度、分化度の判定はすべて病理診断により行われている。しかしながら、病理学的にはほぼ同様の進行度、分化度を示す癌であっても予後の良い症例が有る一方、早期に再発、転移する悪性度の高い症例が存在する。また一部の症例では、抗がん剤や放射線照射に感受性を示すものの、他方では抵抗性を示す症例が多数存在する。したがって、現時点ではこれらを治療前や手術後早期に予測することは不可能であるのが現状である。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
癌の診断や進行度、分化度等を予測できれば、不必要な治療を避けることが可能となり、患者の負担を最小限に押さえ、かつ個々の患者に適した治療方針を立てることに大きく貢献できる。また医療費の抑制にもつながると考えられる。
【００１５】
したがって、本発明の第１の目的は、患者数の多い胃癌の悪性度の判定の指標となりうる遺伝子、特に、細胞の癌化、進展に伴い発現状態が変化する多数の遺伝子を明らかにし、簡便かつ迅速に、高い信頼度で癌の悪性度を評価しうる、該遺伝子の発現パターンの解析に基づく癌の悪性度の評価方法、又は癌の検出方法を提供することにある。本発明の第２の目的は、上記の癌の悪性度の評価、又は癌細胞の検出に使用される、アレイ又はキットを提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために胃癌患者の癌組織及び対照正常組織における、多数の遺伝子の細胞内発現量を個別に比較するだけでなく、遺伝子発現のパターン解析により胃癌の悪性化に関与する多数の遺伝子を見出した。これらの遺伝子の組み合わせによる遺伝子発現のパターン解析をする上での適切な手法を考案し、癌の悪性度の評価が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕 下記ステップ：
（１）被検試料において、胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子の発現量を測定するステップ、及び
（２）（１）で得られた各遺伝子の発現量に基づき、胃癌の悪性度を評価するステップ
を行なうことを特徴とする胃癌の悪性度の評価方法、
〔２〕 胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子に対応する核酸又はその断片がそれぞれ支持体上の定められた領域に固定化されてなる、胃癌の悪性度を評価するためのアレイ、
〔３〕 胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子から発現されるｍＲＮＡ又はその断片を検出するためのプライマー及び／又はプローブを含有してなる、胃癌の悪性度を評価するためのキット、並びに
〔４〕 胃癌の悪性度に応じて発現量の変化する８種以上の遺伝子にコードされたポリペプチド又はその断片に対する抗体又はその断片を含有してなる、胃癌の悪性度を評価するためのキット、
に関する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本明細書において、「癌の悪性度」とは、第一次因子として浸潤の程度、転移の有無により決定され、結果として手術等処置後の５年生存率を左右する要因を指す。
【００１９】
具体的には、癌が粘膜、粘膜下層にとどまり、転移のない癌は悪性度の低い癌と判断され、５年生存率が高い（９０％以上）と予測される。一方、粘膜下層から筋層、漿膜下層、漿膜面へと深く浸潤し、リンパ行性、血行性、浸潤性、又は播種性に癌が転移した場合、悪性度は高いと判断され、５年生存率は低い。なかでも腹膜へ播種性転移、肝転移、遠隔リンパ節への転移が認められ、又はさらに癌の浸潤が他の臓器におよぶ場合は予後が非常に悪く、５年生存率は低い（２０％以下）。また、第二次因子として抗がん剤や放射線への感受性の有無が上げられ、該抗がん剤や放射線への感受性のある場合は悪性度が低く、抵抗性の場合を悪性度が高いと判断する。
【００２０】
１．本発明の胃癌の悪性度の評価方法
本発明の胃癌の悪性度の評価方法は、下記ステップ：
（１）被検試料において、胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子の発現量を測定するステップ、及び
（２）（１）で得られた各遺伝子の発現量に基づき、胃癌の悪性度を評価するステップ
を行なうことを１つの特徴とする。本発明の評価方法によれば、後述の胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子の発現量を測定するため、簡便で、かつ迅速に高い信頼度で癌、特に胃癌の悪性度を評価することができるという優れた効果を発揮する。
【００２１】
前記被検試料としては、血液；尿；糞便；外科的手法により摘出した組織等の生体由来の試料が挙げられる。本発明の胃癌の悪性度の評価方法においては、術前診断の観点から、生検鉗子で採取された病変組織が望ましい。また、本明細書においては、前記被検試料の供給源となる個体を「検体」と示す場合がある。
【００２２】
本発明の評価方法に用いられる「胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する遺伝子」は、癌化、癌の悪性度の評価の指標となりうる遺伝子であり、細胞の癌化に伴ってその発現量が変化する遺伝子、言い換えれば、その発現が有意に誘導又は抑制される遺伝子をいう。
【００２３】
このような遺伝子は、例えば、ゲノム中の遺伝子のコピー数や染色体の再配列のパターンの解析のほか、正常細胞と癌化した細胞における遺伝子産物の発現量を比較し、両細胞間で差異のあるものを特定することにより検出することができる。遺伝子産物としては、例えば、遺伝子より転写されるｍＲＮＡや翻訳産物であるタンパク質が挙げられる。本発明に使用される遺伝子の検出においては、遺伝子操作技術の進歩に伴い、その解析に様々な手法が開発されているｍＲＮＡを指標とするのが効率的である。
【００２４】
ｍＲＮＡを指標にした遺伝子発現の変化を確認する手法としては、ノーザンハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法等が挙げられ、これらの方法を適宜選択して本発明に使用される遺伝子を見出すことができる。さらに、数百、数千といった多数の遺伝子の発現の変化を同時に検出する方法としては、ＤＮＡアレイを使用した方法（ＤＮＡチップハイブリダイゼーション解析、ＤＮＡマクロアレイハイブリダイゼーション解析等）が知られている。
【００２５】
「胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する遺伝子」は、ヒト由来の遺伝子に対応する核酸又はその断片が固定化されたＤＮＡアレイを使用することにより得られる。例えば、癌に対して何らかの関連が示唆された遺伝子の断片を固定化したＤＮＡマイクロアレイが市販されており（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ ＣＨＩＰ 、宝酒造社製）、これを使用して本発明に使用される遺伝子を見出すことができる。前記「胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する遺伝子」は、例えば以下のような遺伝子選別方法により得ることができる。
【００２６】
遺伝子選別方法：
例えば、癌患者より採取された癌病変部組織からｍＲＮＡを調製し、該ｍＲＮＡを鋳型とした逆転写反応を行なう。この際、例えば適切な標識を付したプライマーや標識ヌクレオチドを使用することにより、標識されたｃＤＮＡを得ることができる。標識方法としては特に限定されないが、放射性同位体を含む化合物、蛍光物質、ビオチンのようなリガンドを使用した標識等が挙げられる。
【００２７】
次に、上記の標識ｃＤＮＡと、適当な遺伝子に対応する核酸又はその断片を固定化されたＤＮＡアレイとの間でハイブリダイゼーションを実施する。ハイブリダイゼーションは公知の方法で実施すればよく、その条件は使用するＤＮＡアレイや標識ｃＤＮＡに適したものを適宜選択すればよい。例えばモレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）、第２版、第９．５２−９．５５頁（１９８９）に記載の条件で行なうことができる。
【００２８】
また、前記と同様のハイブリダイゼーション条件下に対照試料（健常人由来試料、非病変部位由来の試料等）由来の核酸と前記ＤＮＡアレイとのハイブリダイゼーションを行なう。これらのヒト由来の試料は、採取から遺伝子発現量の測定までに時間がかかり、ＲＮＡ分解酵素の作用によりｍＲＮＡが分解を受ける可能性がある。被検試料と対照試料との遺伝子発現の差を測定するためには、比較的発現変動の少ない標準的な遺伝子を用いて両者のｍＲＮＡ量を補正する必要がある。さらに、以下に述べる２種類の蛍光を用いて１枚のＤＮＡアレイ上で競合ハイブリダイゼーションを行なう場合には、２種の蛍光物質間の強度差を補正する必要もある。このような補正の目的に使用される核酸としては、非病変部位由来の核酸；ハウスキーピング遺伝子〔例えば、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）遺伝子、シクロフィリン遺伝子、β−アクチン遺伝子、α−チューブリン遺伝子、ホスフォリパーゼＡ２遺伝子等〕に対応する核酸等が挙げられ、また、非特異的なハイブリダイゼーションでないことを確認するための陰性対照としては、プラスミドｐＵＣ１８が挙げられる。
【００２９】
ついで、癌病変部由来の試料とのハイブリダイゼーション及び対照試料とのハイブリダイゼーションのそれぞれ結果を比較することにより、両者で発現量の異なる遺伝子を検出することができる。具体的には、上記の方法で標識された核酸試料とハイブリダイゼーションを行なったアレイについて、使用された標識方法に応じて適切なシグナルの検出を行ない、アレイ上の各遺伝子の癌病変部由来試料、対照試料中の発現量を比較することができる。好ましくは、複数の標識、例えば２種類の蛍光を検出することができる多波長検出蛍光アナライザーを用いれば、癌病変部由来の試料における遺伝子発現量と対照試料での遺伝子発現量との差を同じＤＮＡアレイ上で競合ハイブリダイゼーションにて比較することができる。例えば、癌病変部由来の試料についてはＣｙ５−ｄＵＴＰで蛍光標識を行ない、対照の核酸試料についてはＣｙ３−ｄＵＴＰで蛍光標識する。両者を等量混合してＤＮＡアレイとハイブリダイゼーションを行なうことで両者の遺伝子発現量の差を、シグナルの色及び蛍光強度の違いとして検出することができる。
【００３０】
こうして得られたシグナルの強度に有意な差のある遺伝子は、細胞の癌化に伴って発現量が変化する遺伝子であり、癌化、癌の悪性化の指標として使用可能な遺伝子である。本発明に用いられる「胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する遺伝子」は、発現量の差の大きな遺伝子ほど指標として望ましい。
【００３１】
前記した遺伝子選別方法における目的遺伝子の選別基準は、下記基準：
（Ｉ）被検試料または対照試料における発現強度が、陰性対照遺伝子の発現強度の２倍以上であること、
（ＩＩ）癌の悪性度との相関性が高いこと
が挙げられる。なお、具体的選別法を実施例１に記載する。
【００３２】
前記のようにして得られる遺伝子としては、細胞の癌化に伴ってその発現が変化する遺伝子であればよく、例えば、（１）オンコジーン及び腫瘍抑制（ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ ＆ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ ）に関与する遺伝子群、（２）核内レセプター又は核内レセプター転写共役に関与する遺伝子群、（３）キナーゼ型伝達に関与する遺伝子群、（４）レセプター型キナーゼに関与する遺伝子群、（５）中間フィラメントマーカー（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｍａｒｋｅｒｓ ）に関与する遺伝子、（６）細胞周期、成長調節（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ＆ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）に関与する遺伝子群、（７）アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ）に関与する遺伝子群、（８）ＤＮＡ損傷反応、修復、再構成（ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ， ｒｅｐａｉｒ ＆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ）に関与する遺伝子群、（９）レセプター（ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ）に関与する遺伝子群、（１０）細胞死及び分化調節（ｃｅｌｌ ｆａｔｅ ＆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）に関与する遺伝子群、（１１）細胞接着、運動性及び浸潤（ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ， ｍｏｔｉｌｉｔｙ ＆ ｉｎｖａｓｉｏｎ）に関与する遺伝子群、（１２）血管新生促進（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ）に関与する遺伝子群、（１３）細胞浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ）に関与する遺伝子群、（１４）細胞間相互作用（ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）に関与する遺伝子群、（１５）Ｒｈｏ ファミリーＧＴＰａｓｅ及びその調節因子（Ｒｈｏ ｆａｍｉｌｙ ｓｍａｌｌ ＧＴＰａｓｅｓ ＆ ｔｈｅｉｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）に関与する遺伝子群、（１６）成長因子及びサイトカイン（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ＆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）に関与する遺伝子群、（１７）エネルギー代謝に関与する遺伝子群等が挙げられる。
【００３３】
より具体的には、表１及び２に列挙される１０５種の遺伝子の発現量を測定し、癌の悪性度の評価を行なうことができる。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】
本発明の胃癌の悪性度の評価方法においては、正確な評価を得る観点から、上記遺伝子のうち、本発明において発現量を測定される遺伝子は、８種以上であり、好ましくは２０種以上であり、より好ましくは３０種以上であり、さらに好ましくは４０種以上であり、特に好ましくは５０種以上であることが望ましく、評価方法における操作の容易性、特に後述のＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ により遺伝子発現のパターン解析を行なう場合の操作の容易性の観点から、１００種以下であることが望ましい。
【００３７】
「胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する遺伝子」の具体例としては、好ましくは、アポトーシスインヒビター サーバイビン〔ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｕｒｖｉｖｉｎ（ジーンバンク登録番号：Ｕ７５２８５）〕、Ｉ型コラーゲン〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉ （ジーンバンク登録番号：Ｊ０３４６４）〕、ＩＩＩ 型コラーゲン プロ−α−１鎖〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｐｒｏ−ａｌｐｈａ−１ （ジーンバンク登録番号：Ｘ１４４２０）〕、フィブロネクチン前駆体（ＦＮ）〔ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ＦＮ）（ジーンバンク登録番号：Ｘ０２７６１）〕、ＭＭＰ−１；コラゲナーゼ−１〔ＭＭＰ−１； ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−１（ジーンバンク登録番号：Ｘ５４９２５）〕、ＭＭＰ−７；マトリリシン〔ＭＭＰ−７； ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ （ジーンバンク登録番号：Ｘ０７８１９）〕、Ｕ−プラスミノーゲン活性化因子〔ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ＥＣ ３．４．２１．７３）； Ｕ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ （ＵＰＡ）（ジーンバンク登録番号：Ｘ０２４１９） 〕、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体〔ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ； ＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ｆｒｏｍ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （Ｕ−ＰＡＲ）；ｍｏｎｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ＭＯ３； ＣＤ８７ ａｎｔｉｇｅｎ （ジーンバンク登録番号：Ｕ０９９３７）〕、アルファ−２−マクログロブリン前駆体〔ａｌｐｈａ−２−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ａｌｐｈａ−２−Ｍ） （ジーンバンク登録番号：Ｍ１１３１３）〕、大動脈タイプ平滑筋α−アクチン遺伝子、エキソン９〔ａｏｒｔｉｃ−ｔｙｐｅ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｌｐｈａ−ａｃｔｉｎ ｇｅｎｅ， ｅｘｏｎ ９（ジーンバンク登録番号：Ｍ３３２１６）〕、β型血小板由来増殖因子受容体前駆体〔ｂｅｔａ ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｕｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ＰＤＧＦＲ−ｂｅｔａ）； ＣＤ１４０Ｂ ａｎｔｉｇｅｎ（ジーンバンク登録番号：Ｊ０３２７８）〕、ＢＩＧＨ３ （ジーンバンク登録番号：Ｍ７７３４９）、骨形成タンパク質１〔ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ １ （ＢＭｐ１） （ジーンバンク登録番号：Ｕ５０３３０）〕、ＶＩ型コラーゲンα−３鎖〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＶＩ ａｌｐｈａ−３（ジーンバンク登録番号：Ｘ５２０２２）〕、ＸＶＩＩＩ 型コラーゲンα鎖〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＸＶＩＩＩ ａｌｐｈａ （ジーンバンク登録番号：Ｌ２２５４８）〕、サイトカインｈｕｍｉｇ〔ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｈｕｍｉｇ； ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｎｏｋｉｎｅ （ＭＩＧ） （ジーンバンク登録番号：Ｘ７２７５５）〕、成長ホルモン依存性インスリン様増殖因子結合タンパク質〔ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ジーンバンク登録番号：Ｍ３５８７８）〕、肝癌由来増殖因子〔ｈｅｐａｔｏｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＨＤＧＦ） （ジーンバンク登録番号：Ｄ１６４３１）〕、インスリン様増殖因子結合タンパク質２〔ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ （ＩＧＦＢｐ２） （ジーンバンク登録番号：Ｘ１６３０２）〕、インテグリンα−３鎖〔ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ−３ ｃｈａｉｎ（ジーンバンク登録番号：Ｍ５９９１１）〕、白血球インターフェロン誘導性ペプチド〔ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ（ジーンバンク登録番号：Ｘ５７３５１）〕、転移関連ＭＴＡ１〔ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＭＴＡ１（ジーンバンク登録番号：Ｕ３５１１３）〕、ＭＭＰ−２；ゼラチナーゼＡ〔ＭＭＰ−２； ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ Ａ （ジーンバンク登録番号：Ｚ４８４８２）〕、ノッチ２ ノッチ ホモログ３〔Ｎｏｔｃｈ２ Ｎｏｔｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇ ３（ジーンバンク登録番号：Ｕ９７６６９）〕、プロト−オンコジーンｒｈｏＡ多剤耐性タンパク質〔ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｒｈｏＡ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ； ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ｒｈｏＡ）（ジーンバンク登録番号：Ｌ２５０８０）〕、ｓｐａｒｃ前駆体（オステオネクチン）〔ｓｐａｒｃ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅ； ｏｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎ） （ＯＮ）； ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＭ−４０ （ジーンバンク登録番号：Ｊ０３０４０）〕、トロンボスポンジン２前駆体〔ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ２ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ（ジーンバンク登録番号：Ｌ１２３５０）〕、及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質２〔ｖｅｒｓｉｃａｎ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ； ｌａｒｇｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ； ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２； ｇｌｉａｌ ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＧＨＡＰ） （ジーンバンク登録番号：Ｊ０２８１４）〕
のそれぞれの遺伝子からなる群より選択された少なくとも８種、より好ましくは、少なくとも２０種の遺伝子が挙げられる。なお、少なくとも８種の遺伝子、少なくとも２０種の遺伝子の具体例としては、特に限定されないが、それぞれ後述の実施例３の表５に記載の遺伝子、実施例２の表４に記載の遺伝子が挙げられる。
【００３８】
前記遺伝子は、癌又は癌細胞を検出するための指標としても有用である。したがって、本発明の胃癌の悪性度の評価方法により、癌、特に胃癌における癌細胞の検出をも可能にする。かかる癌又は癌細胞の検出方法も本発明の範囲に包含される。
【００３９】
癌又は癌細胞の検出方法においては、選択された遺伝子の多くは癌化によりその発現が変動し、さらに悪性化により変動パターンが異なるため、同一の手法により癌又は癌細胞の検出とその癌の悪性化判定とを同時に行なうことができる。
【００４０】
本発明の胃癌の悪性度の評価方法においては、遺伝子の発現量は、該遺伝子より転写されるｍＲＮＡ量又は該遺伝子にコードされたポリペプチド量から測定することができる。
【００４１】
前記ｍＲＮＡ量の測定には、公知の種々の方法、例えば、ノーザン・ハイブリダイゼーション法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション法、ＤＮＡアレイを使用する方法等に代表されるハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法に代表される核酸増幅法等が使用できる。十分なｍＲＮＡの検出感度を得る観点から、ハイブリダイゼーション法又は核酸増幅法が好ましく、より具体的には、発現量を測定しようとする遺伝子に対応する核酸又はその断片が支持体上のそれぞれ定められた領域に固定化されたアレイ（例えば、ＤＮＡアレイ）を使用するハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法が好適である。多数の遺伝子の発現を同時に測定する観点から、ＤＮＡアレイを使用するハイブリダイゼーション法が特に好適である。
【００４２】
本明細書において「ＤＮＡアレイ」とは、遺伝子又は遺伝子由来のＤＮＡ断片が支持体上の定められた領域に固定されているものを指し、例えばＤＮＡチップと呼称されているものを包含する。また、遺伝子又は遺伝子由来のＤＮＡ断片が支持体上に高密度に固定されているものはＤＮＡマイクロアレイとも呼ばれる。
【００４３】
ＤＮＡアレイの支持体は、ハイブリダイゼーションに使用可能なものであれば特に限定はなく、通常スライドグラス、シリコンチップ、ニトロセルロースやナイロンの膜等が使用される。また、支持体上に固定される遺伝子又はその断片としては、特に限定するものではないが、例えばゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリー、これらを鋳型としたＰＣＲ等によって増幅されたＤＮＡが挙げられる。
【００４４】
このようなＤＮＡアレイを使用することにより、核酸試料中に含まれる多種類の核酸分子の量を同時に測定することができる。また、少量の核酸試料でも測定できるという利点がある。例えば、試料中のｍＲＮＡを標識するか、もしくはｍＲＮＡを鋳型として標識されたｃＤＮＡを調製し、これとＤＮＡアレイの間でハイブリダイゼーションを実施することにより、試料中で発現されているｍＲＮＡを同時に検出し、さらにその発現量を測定することができる。
【００４５】
標識に用いられる標識物質としては、放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質、発光団を有する物質等の物質を用いることができる。例えば、蛍光物質としては、Ｃｙ２、ＦｌｕｏｒＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン等が挙げられる。また、同時に検出できる点から、２種類以上の蛍光物質を用いて、被検試料、対照として用いる試料をそれぞれ異なった蛍光物質で標識することが望ましい。ここで試料の標識は、試料中のｍＲＮＡ、該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡもしくは該ｃＤＮＡより転写あるいは増幅された核酸を標識することによって実施される。
【００４６】
標識の検出法は、用いられる標識物質の種類により、適宜選択することができる。例えば、前記Ｃｙ３及びＣｙ５を標識物質として用いる場合、Ｃｙ３は５３２ｎｍ、Ｃｙ５は６３５ｎｍの波長でスキャンすることにより検出することができる。なお、標識の強度を遺伝子の発現量の指標とする。
【００４７】
核酸増幅法、特にＲＴ−ＰＣＲ法によりｍＲＮＡ量を測定する場合、例えば、競合ＰＣＲ法、ＴａｑＭａｎ法〔例えば、リンダ・ジー・リー等（Ｌｉｎｄａ Ｇ．Ｌｅｅ）、ヌクレイック アシッズ リサーチ、第２１巻、第３７６１−３７６６頁（１９９３）等を参照のこと〕等により、ｍＲＮＡ量を測定できる。
【００４８】
前記遺伝子にコードされたポリペプチド量は、該ポリペプチド又はその断片に対する抗体を用いて測定することができる。具体的には、例えば、標識抗体を用い、慣用のＥＬＩＳＡ法等により行なうことができる。
【００４９】
本発明の評価方法においては、ステップ（２）において、被検試料における遺伝子発現量と対照試料における遺伝子発現量とを比較することにより遺伝子の発現量を解析し、それにより胃癌の悪性度を評価することができる。ここで、対照試料とは、健常人由来試料又は非病変部位由来の試料をいう。
【００５０】
遺伝子の発現の解析は、パターン解析により行なうことができる。かかるパターン解析は、被検試料における各遺伝子の発現強度シグナル、又は対照試料に対する被検試料における各遺伝子の相対発現比率を用いたクラスタリング解析により行なうことができる。
【００５１】
すなわち、得られた各遺伝子の発現強度を用いコンピューターによるクラスタリング解析を行なう。解析に用いられるデータとしては、被検試料における各遺伝子の発現強度シグナル、又は対照試料に対する被検試料における各遺伝子の相対発現比率が挙げられる。
【００５２】
なお、ステップ（２）において、さらにステップ（１）で得られた各遺伝子の発現量の測定値の補正処理を行なうことができる。
【００５３】
前記相対発現比率とは、〔被検試料における遺伝子発現量／対照試料における遺伝子発現量〕により示される値をいう。クラスタリングの手法としては、特に限定されないが、Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ 、Ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ 等が挙げられる。
【００５４】
以下にバイオテクノロジー分野で比較的よく用いられるＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇについて説明する。
【００５５】
Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕａｔｅｒｉｎｇ とは、個々のサンプルにつき測定されたデータを多次元座標に配置した場合、データ間の距離が最も近いサンプルから順に見つけ、最終的には似たサンプルが隣り合うように並べるもので、結果を樹形図で表現できるのが特色である。サンプル間の距離の測定法には種々あり、ユークリッド距離、マハラノビスの汎距離等がよく用いられる。また、樹形図を作成する過程で、個々のサンプルをまとめた組の相互の距離の定義の仕方も種々あり、特に限定されないが、主に最短距離法、最長距離法、群平均法、重心法、ウォード法が挙げられる。
【００５６】
被検試料、例えば、癌組織における各遺伝子の発現強度シグナルを用いる場合は、各遺伝子のスポットシグナルからバックグラウンドシグナルを差し引いた値（本値を発現強度シグナルとする）をコンピューターに入力するが、この際のシグナル強度の分布はアレイ毎に異なるので補正（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ） を行なう方が好ましい。このｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ の方法には、Ｚ−ｓｃｏｒｅ 、Ｍｅａｎ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ、Ｍｅａｎ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ 、Ｍｅｄｉａｎ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ 等があり、適宜選択する。クラスタリングの対象となる遺伝子は、前記表１及び２に記載の遺伝子から選択され、数が多いほうがより精度の高い分類が可能である。具体的には、８種以上の限定された遺伝子の組み合わせでも、限られた悪性度因子を判定可能である。
【００５７】
ついで、ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ 後の発現強度シグナルについて、Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ 解析を行なうことにより、検体、例えば、胃癌検体のクラスタリング並びに遺伝子のクラスタリングが行なわれる。その結果、樹形図上での検体間分類、すなわち遺伝子発現の強弱パターンが似通った検体間相互には、病理診断における癌の浸潤程度、リンパ節転移、腹膜転移、肝転移等の悪性度の面での共通性があり、かつ悪性度の高い転移検体と浸潤程度の低い早期癌検体はもっとも離れた距離に配置された。この方法を用いることにより、手術前、バイオプシーにより少量の癌組織を採取するだけで、未知の検体の悪性度が判定可能となる。すなわち、癌組織よりｍＲＮＡを精製し、たとえば一色蛍光ラベリングしたプローブを用いハイブリダイゼーションを行ない、個々の遺伝子の発現強度シグナルを求める。この発現強度シグナルと既に悪性度の判明した標準となる胃癌検体の発現強度シグナルと共にクラスタリング解析を行なうことにより、未知の検体がどの悪性度レベルの標準検体に近いかが判定される。また従来の手術後の病理診断では、癌の浸潤が粘膜から筋層に広がっていた場合、予後の比較的良い癌なのか、将来、再発及び／又は転移する可能性がある悪性の癌なのかの分岐点に位置するため予後の判定不能であったが、本発明のクラスタリング解析を行なうことにより悪性度未知の検体が、悪性度の低い初期の癌か、あるいは転移した悪性度の高い癌検体のいずれに距離的に近いか判明し、予後が予想可能となる。
【００５８】
一方、被検試料（例えば、胃癌組織）の対照試料（例えば、対照正常組織）に対する各遺伝子の相対発現比率、すなわち、〔被検試料における遺伝子発現量／対照試料における遺伝子発現量〕（具体的には、〔癌組織における遺伝子発現量／対照正常組織における遺伝子発現量〕）を用いた場合においても、胃癌検体のクラスタリングは、癌組織の発現強度シグナルを用いた場合とほぼ同様の結果が得られる。相対発現比率を用いた場合は、遺伝子発現における個体差を排除した遺伝子発現プロファイルを見ることができる利点がある。遺伝子のクラスタリングは癌化及び悪性化による発現変動が似通った遺伝子ごとに分類されており、その発現変動と病理診断上の悪性度因子との相関性解析を行なうことにより悪性化に関与する遺伝子を特定することが可能である。これにより、表１及び２に示す１０５個の遺伝子と悪性度との関連性、すなわち癌の浸潤程度を示す深達度レベルとの相関性が見出された。
【００５９】
さらに、上記法より見出された悪性度に相関する遺伝子の分類を応用し、より簡易的な悪性度診断が可能なことを見出した。すなわち、コンピュータによる複雑なクラスタリング解析を行なうことなく、発現変動する遺伝子の数や発現変動の割合を指標として、遺伝子の発現変動レベルを評価することにより、癌、特に胃癌の悪性度の評価が可能であることを見出した。
【００６０】
ここで、「遺伝子の発現変動レベル」は、▲１▼〔対照試料に比較して被検試料において発現量の上昇した遺伝子の相対発現比率若しくは該相対発現比率の対数の絶対値の総和により示された値〕、又は▲２▼〔対照試料に比較して被検試料において発現量の上昇した遺伝子を１ポイントとし、被検試料中の各遺伝子のポイントの総和により示された値〕により評価することができる。具体的には、例えば、対照試料に比較して、被検試料において発現量の上昇した遺伝子の相対発現比率が２以上のときを１ポイントとし、被検試料中の各遺伝子のポイントの総和により示された値により、遺伝子の発現変動レベルを評価することができる。
【００６１】
本明細書において「遺伝子の発現変動」とは、２倍以上の変動、すなわち、相対発現比率（〔被検試料における遺伝子発現量／対照試料における遺伝子発現量〕）が２以上若しくは１／２以下の場合をいう。ここで、前記相対発現比率が２以上の場合が発現上昇した遺伝子であり、１／２以下の場合が発現低下した遺伝子であることの指標である。前記▲２▼では、悪性度の各因子と大きく相関する遺伝子群から選択された８個以上からなるグループの発現変動遺伝子の個数を、すでに悪性度、予後がわかっている標準となる癌組織の発現変動遺伝子数と比較することにより評価可能である。
【００６２】
前記▲１▼の値においては、〔被検試料における遺伝子発現量／対照試料における遺伝子発現量〕の値を対数で示し、その絶対値を用いることで発現の増加率と減少率を対等に評価することができる。その際の対数値は自然対数ｌｏｇ２、絶対対数ｌｏｇ１０ のいずれで表されてもよい。
【００６３】
発現変動する遺伝子の数や発現変動の割合を指標に悪性度を評価する際には、同一チップ上に搭載した陰性対照遺伝子の強度シグナル（バックグラウンド値）を基準に判定すると信頼性の高い評価をすることが可能である。すなわち、被検試料における発現強度シグナル又は対照試料における発現強度シグナルの両者がバックグラウンド値の２倍より小さい場合は変動の信頼性は低いが、いずれかが２倍以上で４倍より小さい場合は信頼度が高く、またいずれかが４倍以上の場合はさらに信頼度が高い。これらの信頼度を悪性度判定に加味すると評価の信頼性があがる。すなわち癌の発現強度シグナル又は対照正常組織の発現強度シグナルのいずれかが陰性対照遺伝子の強度シグナルの２倍以上の場合の発現変動する遺伝子の数や発現変動の割合の和で評価することがより望ましい。
【００６４】
本発明においては、遺伝子発現量の解析は、胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子の発現量と、被検試料におけるハウスキーピング遺伝子の発現量との比較により行なうことができる。
【００６５】
２．本発明のアレイ
癌化、癌の悪性化を評価するために用いられる、胃癌の悪性度を評価するための本発明のアレイは、胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子に対応する核酸（例えば、ＤＮＡ等）又はその断片がそれぞれ支持体上の定められた領域に固定化されたアレイである。本発明のアレイにおいては、前記１．の項に挙げられた、胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子に対応する核酸又はその断片が固定されているため、癌、特に胃癌の悪性度を簡便な操作により評価することができるという優れた性質を有する。
【００６６】
ここで、「それぞれ定められた位置に固定化される」とは、おのおのの遺伝子に対応する核酸又はその断片の固定化されている位置が支持体上においてあらかじめ決定されていることを意味する。すなわち、このようなアレイを使用した場合には、検出されたシグナルの位置からこのシグナルがどの遺伝子の核酸又はその断片に由来するのかを知ることができる。
【００６７】
本発明のアレイに用いる支持体は、ハイブリダイゼーションに使用可能なものであれば特に限定はなく、通常スライドグラス、シリコンチップ、ニトロセルロースやナイロンの膜等が使用される。更に好ましくは、非多孔性で、表面が滑らかな構造を有する材質であればよく、特に限定はないが、例えばスライドガラス等のガラスが好適に使用できる。支持体の表面は、共有結合又は非共有結合により一本鎖ＤＮＡを固定化できるものであればいずれでもよく、支持体の表面に親水性又は疎水性の官能基を有しているものが好適に使用でき、特に限定はないが、例えば、水酸基、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、カルボキシル基、アシル基等を有しているものが好適に使用できる。これらの官能基は、支持体自体の表面特性として存在していてもよいが、表面処理によって導入してもよい。このような表面処理物としては、例えば、ガラスをアミノアルキルシラン等の市販のシランカップリング剤で処理したものや、ポリリジンやポリエチレンイミン等のポリ陽イオンで処理したもの等が挙げられる。また、これらの処理を施したスライドガラスの一部は市販されている。
【００６８】
本発明のアレイにおいては、核酸又はその断片は、一本鎖、二本鎖のどちらが固定されていてもよい。例えば、該核酸子又はその断片が、変性された二本の鎖として支持体に整列固定化されたＤＮＡアレイや、固定化されたＤＮＡの少なくとも一部が一本鎖ＤＮＡであるＤＮＡアレイでもよい。また、本発明のアレイは、二本鎖ＤＮＡを変性下において、同一支持体に整列させてスポットしたＤＮＡアレイでもよい。
【００６９】
さらに、本発明のアレイにおいては、固定化される遺伝子の核酸あるいはその断片の支持体上における密度について特に限定はないが、例えば、高密度のアレイでもよく、１００ドット／ｃｍ２ 以上の密度で核酸、特にＤＮＡが固定化されたアレイが好適に使用できる。
【００７０】
支持体上に固定化される核酸又はその断片には特に限定はなく、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドのいずれであってもよい。また、その製法にも特に限定はなく、化学的に合成したもの、天然の核酸から単離、精製したもの、酵素的に合成したもの、さらにはこれらを組み合わせて使用することができる。
【００７１】
支持体上に固定される核酸又はその断片としては、特に限定するものではないが、例えば、鎖長が５０塩基長以上の二本鎖ポリヌクレオチド又はその誘導体であって、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ）法等により、酵素的に増幅して調製されるものを、ＤＮＡの固定化支持体への固定化時に変性し、一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体としたものが好適に使用できる。該誘導体としては、支持体表面への固定化を可能にするような修飾を付されたものであれば良く、特に限定するものではないが、例えばＤＮＡの５’末端にアミノ基やチオール基等の官能基が導入されたＤＮＡが挙げられる。
【００７２】
例えば、ゲノムＤＮＡライブラリーあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型としたＰＣＲ等によって増幅されたＤＮＡを使用することができる。上記の遺伝子に対応する核酸又はその断片を公知の方法、例えばアミノ基を導入した支持体上に固定することにより該アレイを作製することができる。また、上記固定化の操作をＤＮＡアレイ作製装置、例えばＧＭＳ社製のＤＮＡチップ作製装置を使用して行なうことにより、遺伝子に対応する核酸が整列、固定化された本発明のアレイを作製することができる。
【００７３】
アレイに核酸の断片を固定する場合、該断片の鎖長は、特に限定されるものではなく、例えば、約１００塩基長〜約１キロ塩基長であることが望ましく、また、該鎖長より短いあるいは長いものであっても被検試料由来の核酸とハイブリダイゼーションにおいて特異的にハイブリダイズするものであればよい。
【００７４】
本発明のアレイに用いられる遺伝子は、胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する遺伝子であればよく、特に限定されるものではないが、前記１．の項で挙げられた遺伝子、例えば、癌遺伝子、癌抑制遺伝子、増殖因子、転移・浸潤因子、血管新生因子もしくはエネルギー代謝に関与するタンパクをコードする遺伝子等が挙げられる。さらに、例えば、機能は未知であるが種々の悪性度の異なる胃癌患者の癌組織及び対照正常組織より抽出された全ＲＮＡ中よりディファレンシアルディスプレイ（ＤＤ）法により胃癌の悪性化に伴い発現の減少、又は増加する遺伝子を見出してこれらを固定化してもよい。さらに、前記１．の項に記載の遺伝子選別方法で判明した胃癌の悪性化の過程で発現変動する遺伝子は全て入手可能であり、かかる遺伝子に対応する核酸を全て固定化した胃癌の悪性度評価用ＤＮＡアレイを作製することができる。
【００７５】
具体的には、前記１．の項に記載の「胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する遺伝子」の具体例に挙げられた遺伝子からなる群より選択された少なくとも８種、好ましくは少なくとも２０種の遺伝子が挙げられる。
【００７６】
本発明のアレイは、癌、特に胃癌における癌細胞を検出するためにも使用することができる。
【００７７】
３．本発明の胃癌の悪性度を評価するためのキット
本発明の胃癌の悪性度を評価するためのキットとしては、検出対象物により、▲１▼胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子から発現されるｍＲＮＡ又はその断片を検出するためのプライマー及び／又はプローブを含有したキット、並びに▲２▼胃癌の悪性度に応じて発現量の変化する８種以上の遺伝子にコードされたポリペプチド又はその断片に対する抗体又はその断片を含有したキットが挙げられる。
【００７８】
本発明のキットは、▲１▼胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子から発現されるｍＲＮＡ又はその断片を検出するためのプライマー及び／又はプローブ、あるいは▲２▼胃癌の悪性度に応じて発現量の変化する８種以上の遺伝子にコードされたポリペプチド又はその断片に対する抗体又はその断片を含有しているため、前記胃癌の悪性度の評価方法に用いることができ、より簡便、かつ迅速な操作を可能にする。また、本発明のキットは、癌、特に胃癌における癌細胞を検出するためにも使用することができる。
【００７９】
前記▲１▼のキットは、胃癌の悪性度に応じて発現量の変化する８種以上の遺伝子から発現されるｍＲＮＡ又はその断片を核酸増幅法、具体的には、ＲＴ−ＰＣＲ法によって検出するためのプライマー及び／又はプローブを含有する。
【００８０】
前記プライマー及び／又はプローブは、胃癌の悪性度に応じて発現量の変化する８種以上の遺伝子に、又は該遺伝子に相補的な塩基配列を有する核酸にストリンジェントな条件下にハイブリダイズするものであればよい。
【００８１】
上記「ストリンジェントな条件」とは、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液中、〔前記プライマー及び／又はプローブのＴｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件等をいう。
【００８２】
また、上記のプライマーの塩基配列は、通常の核酸増幅法、特にＲＴ−ＰＣＲにおけるの反応条件下に、前記遺伝子に対応する核酸を特異的に増幅しうる配列であればよい。
【００８３】
一方、プローブの塩基配列も、前記遺伝子に対応する核酸に前記ストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸の配列であればよい。
【００８４】
なお、プローブ又はプライマーのＴｍは、例えば、下記式：
Ｔｍ＝８１．５−１６．６ （ｌｏｇ１０［Ｎａ＋ ］）＋０．４１ （％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
（式中、Ｎはプローブ又はプライマーの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはプローブ又はプライマー中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）
により求められる。
【００８５】
また、プローブ又はプライマーの鎖長が１８塩基より短い場合、Ｔｍは、例えば、Ａ＋Ｔ（アデニン＋チミン）残基の含有量と２℃との積と、Ｇ＋Ｃ残基の含有量と４℃との積との和〔（Ａ＋Ｔ） ×２＋（Ｇ＋Ｃ） ×４ 〕により推定することができる。
【００８６】
前記プローブの鎖長は、特に限定はないが、非特異的なハイブリダイゼーションを防止する観点から、１５塩基以上であり、好ましくは１８塩基以上であることが望ましい。
【００８７】
また、プライマーの鎖長は、特に限定はないが、例えば、１５〜４０塩基長であり、好ましくは１７〜３０塩基長であることが望ましい。
【００８８】
前記「胃癌の悪性度に応じて発現量の変化する８種以上の遺伝子」としては、好ましくは、前記１．の項に記載の「胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する遺伝子」の具体例に挙げられた遺伝子からなる群より選択された少なくとも８種、より好ましくは少なくとも２０種の遺伝子が挙げられる。
【００８９】
前記▲２▼のキットにおいて、ポリペプチドは、前記胃癌の悪性度に応じて発現量の変化する８種以上の遺伝子によりコードされたポリペプチドが挙げられる。具体的には、前記１．の項に記載の「胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する遺伝子」の具体例に挙げられた遺伝子にコードされたポリペプチドからなる群より選択された少なくとも８種、より好ましくは少なくとも２０種のポリペプチドが挙げられる。
【００９０】
抗体は、前記ポリペプチドに特異的に結合する能力を有するものであれば、特に限定はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のどちらでもよい。さらに、公知技術により修飾された抗体や抗体の誘導体、例えばヒト化抗体、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体等を使用することもできる。前記抗体は、例えば、１９９２年、ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｅｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ）発行、ジョン・Ｅ・コリガン（Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ ）編集、カレント・プロトコルズ・イン・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ）に記載の方法により、前記ポリペプチドの全部又は一部を用いてウサギやラット、マウス等を免疫することにより、容易に作製され得る。こうして得られた抗体を精製後、ペプチダーゼ等により処理することにより、抗体の断片が得られる。また、遺伝子工学的に抗体を作製することもできる。さらに、本発明の抗体又はその断片は、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法等による検出を容易にするために、各種修飾をしてもよい。
【００９１】
上記の抗体又はその断片には、ポリペプチドのある部分断片に特異的に結合しうるものも含まれる。
【００９２】
本発明のキットは、検出用試薬等を適宜含有してもよい。
【００９３】
また、本発明は、前記評価方法等により、得られた結果を解析手段（例えば、コンピューターによる画像処理方法等）により解析し、その結果を、例えば、紙等の記録媒体；コンピューター読み取り可能な記録媒体等に記録又は表示して提供する診断方法をも提供することができる。かかる診断方法も本発明に含まれる。
【００９４】
【実施例】
以下に実施例をもってさらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
【００９５】
実施例１
（１）ＤＮＡアレイの作成
ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）法により見いだされた、国際公開公報第９８／３７１８７号公報に記載の癌関連遺伝子のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドクローンに挿入されているＤＮＡ断片を鋳型とし、当該ファージミドのマルチクローニングサイトの両端に設定されたプライマーを使用したＰＣＲ法により目的のｃＤＮＡ断片を増幅、回収した。さらに、ハウスキーピング遺伝子としてグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）、シクロフィリン遺伝子を、陰性対照としてプラスミドｐＵＣ１８をそれぞれ同様に調製した。
【００９６】
これらのＤＮＡをエタノール沈殿法により回収して１００ｍＭ 炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で１μＭとなるように溶解し、ＤＮＡチップ作製装置（ＧＭＳ社製）を用いてアミノ基導入スライドガラス（シグマ社製）にスポットし、ＵＶ照射により固定した。スライドを０．２％ＳＤＳ、次いで蒸留水で洗浄乾燥してＤＮＡアレイとした。
【００９７】
（２）蛍光標識ｃＤＮＡの調製
表３に示す、癌の浸潤程度、転移の有無、又は進行度の異なる１０人の胃癌患者より、癌摘出手術時に摘出された組織から胃癌組織と対照正常胃組織とを取りわけた。ついで、ＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）法により、各組織から個々に全ＲＮＡを抽出した。これらの全ＲＮＡのそれぞれからＯｌｉｇｏｔｅｘ−ＭＡＧ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、ｍＲＮＡを精製した。
【００９８】
【表３】
【００９９】
なお、表３中の各項目は以下のような所見を示す：
進行度：
進行度Ｉは、癌の浸潤程度が浅く、転移の認められない早期の癌である。
進行度ＩＩは、癌が浸潤、近接リンパ節に転移した状態をいう。
進行度ＩＩＩは、遠隔リンパ節に広がった状態をいう。
進行度ＩＶは、さらに進行し、より遠隔リンパ節に広がるとともに腹膜転移、肝転移した状態をいう。
【０１００】
分化度：
一般型として、乳頭腺癌（ｐａｐ） 、高分化腺癌（ｔｕｂ １） 、中分化腺癌（ｔｕｂ ２） 、低分化腺癌（ｐｏｒ） 、印環細胞癌（ｓｉｇ） 、粘液癌（ｍｕｃ） に分類される
【０１０１】
深達度：
癌浸潤の及んだ最も深い胃壁の層で表し、粘膜（ｍ） 、粘膜下層（ｓｍ）、筋層（ｍｐ）、しょう膜化組織（ｓｓ）、しょう膜を破り腹膜に露出（ｓｅ）で表現される。
【０１０２】
リンパ節転移（組織学的に検索されたリンパ節群の転移程度を表わす）：
全く転移を認めない（Ｎ０）
第１群リンパ節のみに転移を認める（Ｎ１）
第２群リンパ節に転移を認めるが、第３群、第４群には転移を認めない（Ｎ２）
第３群リンパ節に転移を認めるが、第４群には転移を認めない（Ｎ３）
第４群リンパ節に転移を認める（Ｎ４）
【０１０３】
リンパ管侵襲：
侵襲が認められない（０）
侵襲が軽度に認められる（１）
侵襲が中程度に認められる（２）
侵襲が高度に認められる（３）
【０１０４】
静脈侵襲：
侵襲が認められない（０）
侵襲が軽度に認められる（１）
侵襲が中程度に認められる（２）
侵襲が高度に認められる（３）
【０１０５】
腹膜転移：
全く播種を認めない（０）
近接腹膜に播種を認める（１）
遠隔腹膜に少数の転移（２）
遠隔腹膜に多数の転移（３）
【０１０６】
肝転移：
全く肝転移を認めない（０）
一葉にのみ肝転移を認める（１）
両葉に少数散在性の転移（２）
両葉に多数散在性の転移（３）
【０１０７】
浸潤増殖様式：
癌層が膨張性の発育を示し周囲と一線を画する （α）
病巣が浸潤性の増殖を示し周囲組織との境が不明瞭 （γ）
その中間にあるもの （β）
【０１０８】
上記のｍＲＮＡを鋳型とし、対照正常胃癌組織群にはＣｙ３−ｄＵＴＰ（アマシャム−ファルマシア社製）、胃癌組織群にはＣｙ５−ｄＵＴＰ（アマシャム社製−ファルマシア社製）をそれぞれ使用した逆転写反応を行い、蛍光標識ｃＤＮＡを調製した。
【０１０９】
反応液組成を以下に示す。
反応液Ａ：ｍＲＮＡ約１μｇ、３００ｐｍｏｌのオリゴｄＴプライマー（宝酒造社製）及び最終的に１１．９μｌになるようジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ、ナカライテスク社製）処理水を添加；
反応液Ｂ：５×ＡＭＶ ＲＴａｓｅ用緩衝液（ライフサイエンス社製）４μｌ、０．１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及び０．０６５ｍＭのｄＴＴＰ、６０ＵのＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、０．０３５ｍＭのＣｙ３又はＣｙ５標識ｄＵＴＰ（アマシャムファルマシア社製）を混合し、最終容量６．５μｌの溶液を得た。
【０１１０】
反応液Ａを７０℃で５分間保持した後、氷浴上で冷却した。その後、前記反応液Ａに反応液Ｂ（６．５μｌ）とＡＭＶ ＲＴａｓｅ（ライフサイエンス社製）３０Ｕとを加え、ＲＴ反応液を得た。このＲＴ反応液を５５℃で３０分間保持した後、温度を４２℃とした。前記ＲＴ反応液に、さらに３０ＵのＡＭＶ ＲＴａｓｅを追加して液量を２０μｌに調整した後、得られた混合液を再度４２℃で６０分間保持した。得られた反応液に５００ｍＭのＥＤＴＡ溶液 ２．５μｌと１Ｍの水酸化ナトリウム ５μｌとを加え、３７℃で１０分間保持し、鋳型ＲＮＡを分解させた。反応液を室温まで冷却した後、１Ｍのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）を１２．５μｌ添加した。この溶液をＣｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いてゲルろ過した。これにより、Ｃｙ３標識ｃＤＮＡ溶液（約３５μｌ）及びＣｙ５標識ｃＤＮＡ（約３５μｌ）を得た。
【０１１１】
こうして得られたＣｙ３標識ｃＤＮＡ、Ｃｙ５標識ｃＤＮＡを同一患者ごとに対になるように混合してエタノール沈殿濃縮し、ハイブリダイゼーションバッファー（６×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ／５×デンハート液／０．１ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）８μｌに溶解して、蛍光標識ｃＤＮＡを調製した。
【０１１２】
（３）標識ｃＤＮＡとＤＮＡアレイとのハイブリダイゼーション
上記（１）で作成したＤＮＡアレイ、ならびに市販のＤＮＡアレイ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｉｐ 、宝酒造社製）にプレハイブリダイゼーションバッファー（６×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ／５×デンハート液／１ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）を滴下し、カバーグラスをかけて周囲をフィルムで密閉した。これを室温で２時間保持した後、カバーグラスを除いて、２×ＳＳＣで洗浄、次いで０．２×ＳＳＣで洗浄し、風乾した。
【０１１３】
（２）で調製した蛍光標識ｃＤＮＡを熱変性（９４℃、３分）後、その８μｌをプレハイブリダイズされたＤＮＡアレイに滴下し、カバーグラスをかけて周囲をフィルムで密閉した。得られたアレイを６５℃で１６時間保持した後、カバーグラスを除いて、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中で５５℃、３０分洗浄を２回、次いで６５℃、５分洗浄を１回、さらに０．０５×ＳＳＣ中で室温、１０分洗浄し、風乾した。得られたアレイをマイクロアレイスキャナー（ＧＭＳ社製）にかけて各スポットの蛍光シグナルを測定した。測定されたシグナルを発現データ解析ソフトウェアＩｍａｇｅｎｅ（バイオディスカバリー社製）で解析し、癌組織、対照正常組織における各遺伝子の発現量を調べた。
【０１１４】
使用したＤＮＡアレイに固定化された個々の遺伝子の、癌組織と対照正常組織における相対発現比率（［癌組織の発現強度シグナル／対照正常組織の発現強度シグナル］）、すなわち〔被検試料における遺伝子発現量／対照試料における遺伝子発現量〕は、１０人の胃癌患者によりそれぞれ複雑に異なっていた。しかし一部の遺伝子は、癌の浸潤程度、転移の有無又は進行度に依存した、発現パターンを示した。これらの遺伝子の中から以下のステップを経て、胃癌の悪性度に関連する遺伝子を見い出した。
【０１１５】
まず使用したＤＮＡアレイ上の遺伝子全ての癌組織と対照正常組織とにおける〔相対発現比率の自然対数変換値〕について、クラスタリングソフトＧｅｎｅＳｉｇｈｔ （ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ 社製） を使用したＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ を実施した。各サンプル間の距離の測定法にはユークリッド距離を、距離の定義には重心法を用いた。なお、この解析により得られる樹形図において、縦軸は、検体の分類を示し、大きく、〔初期胃癌検体〕、〔癌が固有筋層又はしょう膜下組織まで浸潤しているが転移はしていない胃癌検体〕及び〔転移検体〕の３つのグループに分類されることが示される。また、樹形図の横軸は遺伝子の分類を示しており、これらは、〔すべての胃癌患者癌組織で発現強度比の低い遺伝子群〕、〔すべての胃癌患者癌組織で発現強度比の高い遺伝子群〕及び〔胃癌患者ごとに発現パターンの異なる遺伝子群〕の３分類に分類されることがわかる。
【０１１６】
胃癌の悪性度に関連する遺伝子は、前記３分類のうち、〔胃癌患者ごとに発現パターンの異なる遺伝子群〕に属すると考えられたため、本グループの遺伝子をまず候補として選択した。これら候補遺伝子から、癌の発現強度シグナル及び対照正常組織の発現強度シグナルがバックグラウンド値の２倍より小さい遺伝子は、発現が低く変動の評価信頼性が低いため除去した。胃癌患者ごとに発現パターンの異なる候補遺伝子群は、およそ３から１０遺伝子を１グループとしてサブクラスタリングしているため、次に、選択遺伝子からサブクラスター遺伝子のグループごとに除いていき、残りの遺伝子を用い同様にクラスタリングしていった。その結果、検体間の分類と悪性度との相関性が失われるサブクラスタリンググループを見出した。このような遺伝子はその発現が胃癌の悪性度に密接に関連していると考えられる。
【０１１７】
上記ステップを経て選択された１０５の遺伝子名とそのアクセッション番号は、前出の表１及び２に示されたものと同様である。
【０１１８】
これら１０５遺伝子を用いたＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ により得られた樹形図を図１及び２に示す。図１は、胃癌患者の分類を示す。また、図２は、各胃癌患者における各遺伝子の発現パターンの樹形図を示す。図１に示すように、癌の深達度が低くリンパ管侵襲の見られない初期胃癌患者（ＭＫ３８及びＭＫ１６８ ）と、侵襲の見られる中程度から高度の進行胃癌検体とに大きく分かれることがわかる。また、後者は、癌が深く浸潤しリンパ節に転移している検体群（ＭＫ１５３ 、ＭＫ４４及びＭＫ１４３ ）とＭＫ１４４ 、ＭＫ８０及びＭＫ９６のサブクラスターを含むことがわかる。これらのうちＭＫ９６は、癌の深達が比較的低く、転移が見られなかったが、手術切片を顕微鏡観察したところ、リンパ管に癌が軽度に侵襲していた。現在、手術後４年１０カ月経過するが生存中である。ＭＫ８０も手術時転移は見られなったが癌が深く浸潤し、摘出された手術切片の顕微鏡観察でリンパ管に癌が高度に侵襲していた。その後、癌が再発し、死亡している。ＭＫ１４４ は、リンパ節にも腹膜にも転移している悪性度の高い癌患者であった。
【０１１９】
ＤＮＡアレイ上の遺伝子の癌組織における発現強度を指標とした、Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ も実施した。癌組織における発現強度のｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ にはＺ−ｓｃｏｒｅ 法を、サンプル間の距離の測定法にはシィティーブロック距離を、距離の定義には重心法を用いた。得られた樹形図を図３及び４に示す。縦軸の患者検体の分類（図３）は発現比率を用いた場合とわずかに異なるものの、１０人の胃癌患者は、やはり癌の深達度が低くリンパ管侵襲の見られない初期胃癌患者とリンパ管侵襲及び／又は転位の見られる中程度から高度の進行胃癌検体の２グループに大きく分かれた。さらに後者は転移の見られないＭＫ８０及びＭＫ９６のサブクラスターを含み、転移検体がこのサブクラスターに複雑に絡んでいた（図４）。
【０１２０】
癌組織の発現強度を用いた場合と、癌組織との対照正常組織の相対発現比率を用いた場合のＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ が似通っておりかつ胃癌の悪性度と相関していることから、これら１０５遺伝子の癌組織における発現変化は個体差による変化ではなく、胃癌の悪性化に関連していると判断された。
【０１２１】
実施例２
（１）ＤＮＡアレイの作製
実施例１で選択された１０５種類の遺伝子について、実施例１記載の方法により、約１００ヌクレオチド長〜約１キロヌクレオチド長）のｃＤＮＡ断片を調製し、該ＤＮＡ断片をスポットしたＤＮＡアレイを作製した。
【０１２２】
（２）標識ｃＤＮＡとＤＮＡアレイとのハイブリダイゼーション
実施例２で調製した蛍光標識ｃＤＮＡを使用し、上記（１）で作成したＤＮＡアレイとのハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーションの条件は実施例１と同様の条件とした。
【０１２３】
ハイブリダイゼーションの結果に基づき、得られた１０５遺伝子についての蛍光シグナルのうち、表４に示す２０種の遺伝子を選択し、該２０種の遺伝子について、実施例１と同様にＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ を実施した。
【０１２４】
【表４】
【０１２５】
なお、癌組織の対照正常組織に対する各遺伝子の〔相対発現比率の自然対数変換値〕を用い、ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ 無し、サンプル間の距離の測定はユークリッド距離、距離の定義は重心法により解析した。得られた樹形図を図５及び６に示す。その結果、１０人の胃癌患者は非転移群と転移群の２グループに分かれることがわかる（図５）。また、非転移群は、初期胃癌患者（ＭＫ３８とＭＫ１６８ ）と、リンパ管侵襲の見られるＭＫ８０及びＭＫ９６とにサブクラスタリングされることがわかる。転移群のサブクラスターを構成する検体はいずれも広範囲のリンパ節に転移が認められた高進行癌の検体であることがわかる。このように、表４に示す２０個の遺伝子の組み合わせで、悪性度と密接に関連したクラスタリングが可能であることが示される。本実験よりこれら２０種の遺伝子の胃癌の悪性度への関与が再確認された。
【０１２６】
実施例３
（１）標識ｃＤＮＡとＤＮＡアレイとのハイブリダイゼーション
手術時の臨床病理データでは予後の予想のつきにくい悪性度レベルは、転移が認められないが、癌が胃の筋層に達した深達度ｍｐの胃癌である。臨床病理的にこのレベルに分類される胃癌患者ＭＫ１１５ の胃癌組織及び対照正常胃組織から、実施例１記載の方法でｍＲＮＡを精製し、さらに蛍光標識ｃＤＮＡを調製した。この蛍光標識ｃＤＮＡと、実施例１で調製した蛍光標識ｃＤＮＡとを使用して実施例２（１）で作成されたＤＮＡマイクロアレイとのハイブリダイゼーションを実施した。なお、ハイブリダイゼーションの条件は、実施例１と同様の条件とした。
【０１２７】
前記胃癌患者ＭＫ１１５ の臨床病理データは、次の通りである：
進行度Ｉ、分化度ｍｏｄ 、深達度ｍｐ、リンパ節転移０ 、リンパ節侵襲０ 、静脈侵襲０ 、腹膜転移０ 、肝転移０ 、浸潤増殖様式α。
【０１２８】
ハイブリダイゼーションの結果、得られた１０５遺伝子についての蛍光シグナルのうち、表５に示す遺伝子８種を選択し、癌組織の対照正常組織に対する相対発現比率を求めた。癌組織における発現が対照正常組織の２倍以上上昇している遺伝子、すなわち相対発現比率が２以上の遺伝子の相対発現比率の総和又は相対発現比率が２以上の遺伝子数にて悪性度を判定した。
【０１２９】
標準癌検体として実施例１及び２で用いられた癌検体１０検体と上記検体を比較した。表５に結果を示す。
【０１３０】
【表５】
【０１３１】
胃癌患者ＭＫ１１５ はリンパ管侵襲、血管侵襲も全く見られない進行度Ｉｂにもかかわらず選択された８遺伝子の相対発現比率の総和と相対発現比率が２以上の遺伝子数はともに大きく進行癌と同レベルであった。同様に、相対発現比率が２以上である遺伝子の相対発現比率の総和も進行癌と同レベルであった。そこで、この患者の予後を調べてみると３年９ヶ月後にガンが再発し死亡していた。通常、リンパ管侵襲、血管侵襲も見られない進行度Ｉの患者がこのような早期に再発することはまれであり、３年後の癌の再発が既に手術時の遺伝子の発現変化で予想できることは意義深い。
【０１３２】
ここで選択した８遺伝子は、転移や悪性度との相関が示唆されている遺伝子が多いにもかかわらず、転移、非転移という観点で見ても該遺伝子の発現は、検体ごとに異なり均一ではない。例えば、マトリリシン（ＭＭＰ−７）は、胃癌の悪性との関連性が高いとの報告〔セノタＡ．ら、クリニカル＆エクスペリメンタルメタスタシス（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、第１６巻、第３１３−３２１頁（１９９８）〕があるが、今回測定した１１人の患者のうち４人で過剰発現していたに過ぎない。しかも、悪性度の高い転移検体でも半数で発現増加が見られるのみである。この結果より明らかなように、単一の遺伝子のみでは精度の高い悪性度判定は不可能であり、悪性度と関連する遺伝子の複数の組み合わせによって、予後の判定が可能になる。
【０１３３】
このように本発明は、従来の病理診断では予測不可能であった癌の悪性度や予後の診断に有効であることが明らかとなった。
【０１３４】
【発明の効果】
本発明の胃癌の悪性度の評価方法、胃癌の悪性度を評価するためのアレイ及び胃癌の悪性度を評価するためのキットにより、胃癌の悪性化に関与する多数の遺伝子の発現変化を迅速、かつ高感度に系統的に測定でき、これらの遺伝子発現変動のパターン解析により胃癌の悪性度の判定、又は胃癌の検出をすることができるとい優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、１０５遺伝子の〔相対発現比率の自然対数変換値〕を用いたＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ により得られた胃癌患者の分類の樹形図を示す。
【図２】図２は、１０５遺伝子の〔相対発現比率の自然対数変換値〕を用いたＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ により得られた各胃癌患者における各遺伝子の発現パターンの樹形図を示す。
【図３】図３は、１０５遺伝子の発現強度を用いたＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ により得られた胃癌患者の分類の樹形図を示す。
【図４】図４は、１０５遺伝子の発現強度を用いたＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ により得られた各胃癌患者における各遺伝子の発現パターンの樹形図を示す。
【図５】図５は、２０遺伝子の〔相対発現比率の自然対数変換値〕を用いたＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ により得られた胃癌患者の分類の樹形図を示す。
【図６】図６は、２０遺伝子の〔相対発現比率の自然対数変換値〕を用いたＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ により得られた各胃癌患者における各遺伝子の発現パターンの樹形図を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、簡便かつ迅速に、高い信頼度で癌の悪性度を評価しうる、癌、特に胃癌の悪性度の評価方法、それに用いるアレイ及びキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌は、１９８１年以降日本における死因の１位を占め、中でも胃癌は、最も頻度の高い癌である。近年、正常細胞が癌になるまでの多段階発癌機構が存在することが明らかにされている〔フィーロンＥ．Ｒ．（Ｆｅａｒｏｎ，Ｅ．Ｒ．）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、第６１巻、第７５９−７６７頁（１９９０）、スギムラＴ．（Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ｔ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） 、第２５８巻、第６０３−６０７頁（１９９２）〕。具体的には、正常細胞の癌化には、ＤＮＡ修復遺伝子、癌抑制遺伝子及び癌遺伝子を含む複数の遺伝子異常の蓄積が必要とされている。一般に、遺伝子の不安定性と癌抑制遺伝子の不活化とは癌の発生に関与すると考えられている。また、癌遺伝子の活性化及び／又は増殖因子の過剰発現は、癌の進展及び悪性化に関与すると考えられている。さらに、細胞外マトリックス分子の分解酵素をコードする遺伝子や細胞の運動能又は接着性を調節するタンパク質をコードする遺伝子は、転移、浸潤に関与すると考えられている。
【０００３】
遺伝子の不安定性には、ＤＮＡミスマッチ修復系の異常に関連した遺伝子の不安定性と染色体レベルの不安定性とがある。前者の例として、ゲノム中に存在する単純繰り返し配列の鎖長が同一個体の癌部と非癌部とで異なること（マイクロサテライト不安定性）〔シボドーＳ．Ｎ．（Ｔｈｉｂｏｄｅａｕ， Ｓ． Ｎ．） ら、サイエンス、第２６０巻、第８１６−８１９頁（１９９３）〕が挙げられ、後者の例として、染色体間の再配列が挙げられる。前記染色体間の再配列は、正常細胞では認められないタンパク質を発現させ、一方、正常細胞において発現しているタンパク質であっても、その発現量に影響を与える場合がある。実際、ヒトの慢性骨髄性白血病において、染色体間の再配列により、ｂｃｒ 遺伝子とｃ−ａｂｌ 遺伝子の融合が起こり、正常細胞では存在しないｂｃｒ−ａｂｌ 融合遺伝子より転写されたハイブリッドｍＲＮＡの発現が確認されている。更に、ｂｃｒ−ａｂｌ 融合遺伝子を動物に導入すると白血病を発症することが確認されている〔ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ， Ｊ．Ｄ．）ら著、組み換えＤＮＡの分子生物学 第２版；丸善株式会社、第３０９頁（１９９２）〕。
【０００４】
癌抑制遺伝子の不活化としては、例えば、ｐ５３遺伝子の不活化が挙げられる。不活化の原因としては、遺伝子内の欠失かコード領域の特定の部分に起こる点突然変異によると考えられている〔ニグロＪ．Ｍ．（Ｎｉｇｒｏ， Ｊ．Ｍ．）ら、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ） 、第３４２巻、第７０５−７０８頁（１９８９）、マルキンＤ（Ｍａｌｋｉｎ，Ｄ．）ら、サイエンス、第２５０巻、第１２３３−１２３８頁（１９９０）〕。また、ｐ５３遺伝子の欠失及び点突然変異は、多くの種類の癌で観察されている。例えば、胃癌においては、前記ｐ５３遺伝子の欠失及び点突然変異は、早期癌の６割以上の症例に認められる〔ヨコザキＨ．（Ｙｏｋｏ ｚａｋｉ，Ｈ．）ら、ジャーナルオブ キャンサー リサーチ アンド クリニカルオンコロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ） 、第１１９巻、第６７−７０頁（１９９２）〕。
【０００５】
一方、ｐ１６／ＭＴＳ１遺伝子は、ホモ欠失により不活化する遺伝子として知られている。具体的には、グリオーマ、膵癌、ぼうこう癌等で高頻度のホモ欠失が観察されている〔ケアンズＰ．（Ｃａｉｒｎｓ，Ｐ．）ら、ネーチャー ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第１１巻、第２１０−２１２頁（１９９５）〕。ｐ１６ タンパク質は、細胞周期を調節している。前記ｐ１６ の発現異常は、細胞の癌化に関与することが示唆されている〔オカモトＡ．（Ｏｋａｍｏｔｏ，Ａ．） ら、プロシーディングズ オブザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）、第９１巻、第１１０４５−１１０４９頁（１９９４）〕。
【０００６】
癌遺伝子の活性化としては、例えば、癌遺伝子近傍における、ウィルスの挿入突然変異や、染色体間の再配列が原因として挙げられる。例えば、トリ白血病ウィルス ａｖｉａｎ ｌｅｕｋｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ （ＡＬＶ） によって起こる、ニワトリのリンパ腫において、ウィルスによる挿入突然変異が確認されている。この場合、ＡＬＶ のＤＮＡ が遺伝子の一種である ｃ−ｍｙｃの近傍に挿入され、ウィルスの強いエンハンサーとプロモーターにより、正常な ｃ−ｍｙｃが過剰発現したり、正常な遺伝子とは一部異なった新しい配列が発現されることが確認された。また、ある種のヒトＢ細胞の腫瘍では、染色体間の再配列により、癌遺伝子の一つである ｃ−ｍｙｃが免疫グロブリンの強い転写シグナルのもとに置かれ、その発現量が増加することが確認されている。この場合、癌細胞における ｃ−ｍｙｃ発現産物は、正常細胞に発現している該産物と差は認められず、癌化は、ｃ−ｍｙｃ 発現量の増加に起因していると考えられている〔ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ， Ｊ．Ｄ．）ら著、組み換えＤＮＡの分子生物学 第２版；丸善株式会社、第３０５−３０８頁（１９９２）〕。
【０００７】
増殖因子の過剰発現としては、例えば、肝細胞増殖因子レセプターをコードする Ｃ−Ｍｅｔの過剰発現が挙げられる。この Ｃ−Ｍｅｔの発現異常は、胃癌の発生初期から正常粘膜には認められない６．０キロ塩基長の長さを有するｍＲＮＡの発現が見られたり〔クニヤスＨ．（Ｋｕｎｉｙａｓｕ，Ｈ．）ら、インターナショナル ジャーナルオブ キャンサー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）、第５５巻、第７２−７５頁（１９９３）〕、転移癌において遺伝子増幅が高頻度で見られ、遺伝子増幅と癌の悪性度に相関性が確認されている〔クニヤスＨ．ら、バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、第１８９巻、第２２７−２３２頁（１９９２）〕。
【０００８】
遺伝子異常と癌の悪性度に相関が確認されている例として、上記ｃ−Ｍｅｔ のほか、乳癌、卵巣癌、胃癌、子宮癌等における、癌遺伝子Ｃ−ｅｒｂＢ２ 遺伝子の増幅及び／又はその過剰発現〔ライトＣ．（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｃ．）ら、キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第４９巻、第２０８７−２０９０頁（１９８９）、サファリＢ．（Ｓａｆｆａｒｉ，Ｂ．） ら、キャンサー リサーチ、第５５巻、第５６９３−５６９８頁（１９９５）〕、胃癌の１組織型である低分化腺癌における、癌遺伝子Ｋ−ｓａｍ 遺伝子の増幅及び／又はその過剰発現〔タハラＥ．（Ｔａｈａｒａ， Ｅ．） ら著、ガストリックキャンサー，東京（Ｇａｓｔｒｉｃ Ｃａｎｃｅｒ， Ｔｏｋｙｏ）、スプリンガー社（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、１９９３年発行、第２０９−２１７頁〕等がそれぞれ確認されている。
【０００９】
癌細胞が組織を浸潤して転移するには、細胞外マトリックスの分解が必要であり、分解酵素として代表的なマトリックス メタロプロテナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーに属する種々の酵素が正常細胞に比べ過剰生産されている〔ゴールドバーグＧＩ．（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ＧＩ．） ら、キャンサートリートメントリサーチ（Ｃａｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｒｅｓｅａｃｈ） 、第５３巻、第７０１−７０８頁（１９９１）〕。胃癌においては、比較的特異的に癌細胞が発現するマトリリシン（ＭＭＰ−７）のｍＲＮＡを、６割以上の症例で過剰発現していたと報告されている〔セノタＡ．ら、クリニカル＆エクスペリメンタル メタスタシス（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、第１６巻、第３１３−３２１頁（１９９８）〕。
【００１０】
悪性腫瘍においては、腫瘍血管が新生されなければ大きくなることはできず、血管新生を誘導することにより加速度的に増殖可能となる。腫瘍血管新生は、さまざまな調節因子、血管新生促進因子及び抑制因子等の発現バランスにより制御されているが、もっとも重要な因子として血管内皮細胞増殖因子ＶＥＧＦが上げられる。種々の固形腫瘍でＶＥＧＦの発現と血管新生の亢進に正の相関が認められており〔シブヤＭら、アドバンスドキャンサーリサーチ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第６７巻、第２８１頁（１９９５）〕、また胃癌、食道癌、大腸癌等においてＶＥＧＦ高発現腫瘍の予後が不良であることが報告されている〔トイＭら，モレキュラー・メディシン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）第３５巻、第１２０６−１２１５頁（１９９８）〕。
【００１１】
これまで、病理診断のみでしか不可能であった癌の分類が、ＤＮＡマイクロアレイを用い多数の遺伝子発現を同時に測定することで可能となった初めての報告が最近なされた。すなわち、ゴラブＴ．Ｒ．らは、ＤＮＡマイクロアレイ上に固定された人の６８１７遺伝子につきスクリーニングを行い、主に５０遺伝子の発現量の変化により急性白血病の分類（ＡＬＬ又はＡＭＬ）が可能であることを示した〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ ）第２８６巻、第５３１−５３７ページ（１９９９）〕。
【００１２】
このように個々の遺伝子のレベルでは癌の発生、進展に関与する遺伝子、及び該遺伝子異常に関する情報は増えてきている。しかしながら、発癌機構は、多段階であり、複数の変異の蓄積が必要とされるため、単一の遺伝子や、少数の遺伝子のランダムな組み合わせによる判定では、いまだに実用性に十分な、癌の確定診断や予後の判定にはいたっていないのが現状である。
【００１３】
事実、現在においても癌の診断や進行度、分化度の判定はすべて病理診断により行われている。しかしながら、病理学的にはほぼ同様の進行度、分化度を示す癌であっても予後の良い症例が有る一方、早期に再発、転移する悪性度の高い症例が存在する。また一部の症例では、抗がん剤や放射線照射に感受性を示すものの、他方では抵抗性を示す症例が多数存在する。したがって、現時点ではこれらを治療前や手術後早期に予測することは不可能であるのが現状である。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
癌の診断や進行度、分化度等を予測できれば、不必要な治療を避けることが可能となり、患者の負担を最小限に押さえ、かつ個々の患者に適した治療方針を立てることに大きく貢献できる。また医療費の抑制にもつながると考えられる。
【００１５】
したがって、本発明の第１の目的は、患者数の多い胃癌の悪性度の判定の指標となりうる遺伝子、特に、細胞の癌化、進展に伴い発現状態が変化する多数の遺伝子を明らかにし、簡便かつ迅速に、高い信頼度で癌の悪性度を評価しうる、該遺伝子の発現パターンの解析に基づく癌の悪性度の評価方法、又は癌の検出方法を提供することにある。本発明の第２の目的は、上記の癌の悪性度の評価、又は癌細胞の検出に使用される、アレイ又はキットを提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために胃癌患者の癌組織及び対照正常組織における、多数の遺伝子の細胞内発現量を個別に比較するだけでなく、遺伝子発現のパターン解析により胃癌の悪性化に関与する多数の遺伝子を見出した。これらの遺伝子の組み合わせによる遺伝子発現のパターン解析をする上での適切な手法を考案し、癌の悪性度の評価が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕 下記ステップ：
（１）被検試料において、胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子の発現量を測定するステップ、及び
（２）（１）で得られた各遺伝子の発現量に基づき、胃癌の悪性度を評価するステップ
を行なうことを特徴とする胃癌の悪性度の評価方法、
〔２〕 胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子に対応する核酸又はその断片がそれぞれ支持体上の定められた領域に固定化されてなる、胃癌の悪性度を評価するためのアレイ、
〔３〕 胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子から発現されるｍＲＮＡ又はその断片を検出するためのプライマー及び／又はプローブを含有してなる、胃癌の悪性度を評価するためのキット、並びに
〔４〕 胃癌の悪性度に応じて発現量の変化する８種以上の遺伝子にコードされたポリペプチド又はその断片に対する抗体又はその断片を含有してなる、胃癌の悪性度を評価するためのキット、
に関する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本明細書において、「癌の悪性度」とは、第一次因子として浸潤の程度、転移の有無により決定され、結果として手術等処置後の５年生存率を左右する要因を指す。
【００１９】
具体的には、癌が粘膜、粘膜下層にとどまり、転移のない癌は悪性度の低い癌と判断され、５年生存率が高い（９０％以上）と予測される。一方、粘膜下層から筋層、漿膜下層、漿膜面へと深く浸潤し、リンパ行性、血行性、浸潤性、又は播種性に癌が転移した場合、悪性度は高いと判断され、５年生存率は低い。なかでも腹膜へ播種性転移、肝転移、遠隔リンパ節への転移が認められ、又はさらに癌の浸潤が他の臓器におよぶ場合は予後が非常に悪く、５年生存率は低い（２０％以下）。また、第二次因子として抗がん剤や放射線への感受性の有無が上げられ、該抗がん剤や放射線への感受性のある場合は悪性度が低く、抵抗性の場合を悪性度が高いと判断する。
【００２０】
１．本発明の胃癌の悪性度の評価方法
本発明の胃癌の悪性度の評価方法は、下記ステップ：
（１）被検試料において、胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子の発現量を測定するステップ、及び
（２）（１）で得られた各遺伝子の発現量に基づき、胃癌の悪性度を評価するステップ
を行なうことを１つの特徴とする。本発明の評価方法によれば、後述の胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子の発現量を測定するため、簡便で、かつ迅速に高い信頼度で癌、特に胃癌の悪性度を評価することができるという優れた効果を発揮する。
【００２１】
前記被検試料としては、血液；尿；糞便；外科的手法により摘出した組織等の生体由来の試料が挙げられる。本発明の胃癌の悪性度の評価方法においては、術前診断の観点から、生検鉗子で採取された病変組織が望ましい。また、本明細書においては、前記被検試料の供給源となる個体を「検体」と示す場合がある。
【００２２】
本発明の評価方法に用いられる「胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する遺伝子」は、癌化、癌の悪性度の評価の指標となりうる遺伝子であり、細胞の癌化に伴ってその発現量が変化する遺伝子、言い換えれば、その発現が有意に誘導又は抑制される遺伝子をいう。
【００２３】
このような遺伝子は、例えば、ゲノム中の遺伝子のコピー数や染色体の再配列のパターンの解析のほか、正常細胞と癌化した細胞における遺伝子産物の発現量を比較し、両細胞間で差異のあるものを特定することにより検出することができる。遺伝子産物としては、例えば、遺伝子より転写されるｍＲＮＡや翻訳産物であるタンパク質が挙げられる。本発明に使用される遺伝子の検出においては、遺伝子操作技術の進歩に伴い、その解析に様々な手法が開発されているｍＲＮＡを指標とするのが効率的である。
【００２４】
ｍＲＮＡを指標にした遺伝子発現の変化を確認する手法としては、ノーザンハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法等が挙げられ、これらの方法を適宜選択して本発明に使用される遺伝子を見出すことができる。さらに、数百、数千といった多数の遺伝子の発現の変化を同時に検出する方法としては、ＤＮＡアレイを使用した方法（ＤＮＡチップハイブリダイゼーション解析、ＤＮＡマクロアレイハイブリダイゼーション解析等）が知られている。
【００２５】
「胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する遺伝子」は、ヒト由来の遺伝子に対応する核酸又はその断片が固定化されたＤＮＡアレイを使用することにより得られる。例えば、癌に対して何らかの関連が示唆された遺伝子の断片を固定化したＤＮＡマイクロアレイが市販されており（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ ＣＨＩＰ 、宝酒造社製）、これを使用して本発明に使用される遺伝子を見出すことができる。前記「胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する遺伝子」は、例えば以下のような遺伝子選別方法により得ることができる。
【００２６】
遺伝子選別方法：
例えば、癌患者より採取された癌病変部組織からｍＲＮＡを調製し、該ｍＲＮＡを鋳型とした逆転写反応を行なう。この際、例えば適切な標識を付したプライマーや標識ヌクレオチドを使用することにより、標識されたｃＤＮＡを得ることができる。標識方法としては特に限定されないが、放射性同位体を含む化合物、蛍光物質、ビオチンのようなリガンドを使用した標識等が挙げられる。
【００２７】
次に、上記の標識ｃＤＮＡと、適当な遺伝子に対応する核酸又はその断片を固定化されたＤＮＡアレイとの間でハイブリダイゼーションを実施する。ハイブリダイゼーションは公知の方法で実施すればよく、その条件は使用するＤＮＡアレイや標識ｃＤＮＡに適したものを適宜選択すればよい。例えばモレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）、第２版、第９．５２−９．５５頁（１９８９）に記載の条件で行なうことができる。
【００２８】
また、前記と同様のハイブリダイゼーション条件下に対照試料（健常人由来試料、非病変部位由来の試料等）由来の核酸と前記ＤＮＡアレイとのハイブリダイゼーションを行なう。これらのヒト由来の試料は、採取から遺伝子発現量の測定までに時間がかかり、ＲＮＡ分解酵素の作用によりｍＲＮＡが分解を受ける可能性がある。被検試料と対照試料との遺伝子発現の差を測定するためには、比較的発現変動の少ない標準的な遺伝子を用いて両者のｍＲＮＡ量を補正する必要がある。さらに、以下に述べる２種類の蛍光を用いて１枚のＤＮＡアレイ上で競合ハイブリダイゼーションを行なう場合には、２種の蛍光物質間の強度差を補正する必要もある。このような補正の目的に使用される核酸としては、非病変部位由来の核酸；ハウスキーピング遺伝子〔例えば、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）遺伝子、シクロフィリン遺伝子、β−アクチン遺伝子、α−チューブリン遺伝子、ホスフォリパーゼＡ２遺伝子等〕に対応する核酸等が挙げられ、また、非特異的なハイブリダイゼーションでないことを確認するための陰性対照としては、プラスミドｐＵＣ１８が挙げられる。
【００２９】
ついで、癌病変部由来の試料とのハイブリダイゼーション及び対照試料とのハイブリダイゼーションのそれぞれ結果を比較することにより、両者で発現量の異なる遺伝子を検出することができる。具体的には、上記の方法で標識された核酸試料とハイブリダイゼーションを行なったアレイについて、使用された標識方法に応じて適切なシグナルの検出を行ない、アレイ上の各遺伝子の癌病変部由来試料、対照試料中の発現量を比較することができる。好ましくは、複数の標識、例えば２種類の蛍光を検出することができる多波長検出蛍光アナライザーを用いれば、癌病変部由来の試料における遺伝子発現量と対照試料での遺伝子発現量との差を同じＤＮＡアレイ上で競合ハイブリダイゼーションにて比較することができる。例えば、癌病変部由来の試料についてはＣｙ５−ｄＵＴＰで蛍光標識を行ない、対照の核酸試料についてはＣｙ３−ｄＵＴＰで蛍光標識する。両者を等量混合してＤＮＡアレイとハイブリダイゼーションを行なうことで両者の遺伝子発現量の差を、シグナルの色及び蛍光強度の違いとして検出することができる。
【００３０】
こうして得られたシグナルの強度に有意な差のある遺伝子は、細胞の癌化に伴って発現量が変化する遺伝子であり、癌化、癌の悪性化の指標として使用可能な遺伝子である。本発明に用いられる「胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する遺伝子」は、発現量の差の大きな遺伝子ほど指標として望ましい。
【００３１】
前記した遺伝子選別方法における目的遺伝子の選別基準は、下記基準：
（Ｉ）被検試料または対照試料における発現強度が、陰性対照遺伝子の発現強度の２倍以上であること、
（ＩＩ）癌の悪性度との相関性が高いこと
が挙げられる。なお、具体的選別法を実施例１に記載する。
【００３２】
前記のようにして得られる遺伝子としては、細胞の癌化に伴ってその発現が変化する遺伝子であればよく、例えば、（１）オンコジーン及び腫瘍抑制（ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ ＆ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ ）に関与する遺伝子群、（２）核内レセプター又は核内レセプター転写共役に関与する遺伝子群、（３）キナーゼ型伝達に関与する遺伝子群、（４）レセプター型キナーゼに関与する遺伝子群、（５）中間フィラメントマーカー（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｍａｒｋｅｒｓ ）に関与する遺伝子、（６）細胞周期、成長調節（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ＆ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）に関与する遺伝子群、（７）アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ）に関与する遺伝子群、（８）ＤＮＡ損傷反応、修復、再構成（ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ， ｒｅｐａｉｒ ＆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ）に関与する遺伝子群、（９）レセプター（ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ）に関与する遺伝子群、（１０）細胞死及び分化調節（ｃｅｌｌ ｆａｔｅ ＆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）に関与する遺伝子群、（１１）細胞接着、運動性及び浸潤（ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ， ｍｏｔｉｌｉｔｙ ＆ ｉｎｖａｓｉｏｎ）に関与する遺伝子群、（１２）血管新生促進（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ）に関与する遺伝子群、（１３）細胞浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ）に関与する遺伝子群、（１４）細胞間相互作用（ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）に関与する遺伝子群、（１５）Ｒｈｏ ファミリーＧＴＰａｓｅ及びその調節因子（Ｒｈｏ ｆａｍｉｌｙ ｓｍａｌｌ ＧＴＰａｓｅｓ ＆ ｔｈｅｉｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）に関与する遺伝子群、（１６）成長因子及びサイトカイン（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ＆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）に関与する遺伝子群、（１７）エネルギー代謝に関与する遺伝子群等が挙げられる。
【００３３】
より具体的には、表１及び２に列挙される１０５種の遺伝子の発現量を測定し、癌の悪性度の評価を行なうことができる。
【００３４】
【表１】
【表２】
本発明の胃癌の悪性度の評価方法においては、正確な評価を得る観点から、上記遺伝子のうち、本発明において発現量を測定される遺伝子は、８種以上であり、好ましくは２０種以上であり、より好ましくは３０種以上であり、さらに好ましくは４０種以上であり、特に好ましくは５０種以上であることが望ましく、評価方法における操作の容易性、特に後述のＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ により遺伝子発現のパターン解析を行なう場合の操作の容易性の観点から、１００種以下であることが望ましい。
【００３７】
「胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する遺伝子」の具体例としては、好ましくは、アポトーシスインヒビター サーバイビン〔ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｕｒｖｉｖｉｎ（ジーンバンク登録番号：Ｕ７５２８５）〕、Ｉ型コラーゲン〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉ （ジーンバンク登録番号：Ｊ０３４６４）〕、ＩＩＩ 型コラーゲン プロ−α−１鎖〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｐｒｏ−ａｌｐｈａ−１ （ジーンバンク登録番号：Ｘ１４４２０）〕、フィブロネクチン前駆体（ＦＮ）〔ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ＦＮ）（ジーンバンク登録番号：Ｘ０２７６１）〕、ＭＭＰ−１；コラゲナーゼ−１〔ＭＭＰ−１； ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−１（ジーンバンク登録番号：Ｘ５４９２５）〕、ＭＭＰ−７；マトリリシン〔ＭＭＰ−７； ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ （ジーンバンク登録番号：Ｘ０７８１９）〕、Ｕ−プラスミノーゲン活性化因子〔ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ＥＣ ３．４．２１．７３）； Ｕ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ （ＵＰＡ）（ジーンバンク登録番号：Ｘ０２４１９） 〕、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体〔ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ； ＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ｆｒｏｍ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （Ｕ−ＰＡＲ）；ｍｏｎｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ＭＯ３； ＣＤ８７ ａｎｔｉｇｅｎ （ジーンバンク登録番号：Ｕ０９９３７）〕、アルファ−２−マクログロブリン前駆体〔ａｌｐｈａ−２−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ａｌｐｈａ−２−Ｍ） （ジーンバンク登録番号：Ｍ１１３１３）〕、大動脈タイプ平滑筋α−アクチン遺伝子、エキソン９〔ａｏｒｔｉｃ−ｔｙｐｅ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｌｐｈａ−ａｃｔｉｎ ｇｅｎｅ， ｅｘｏｎ ９（ジーンバンク登録番号：Ｍ３３２１６）〕、β型血小板由来増殖因子受容体前駆体〔ｂｅｔａ ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｕｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ＰＤＧＦＲ−ｂｅｔａ）； ＣＤ１４０Ｂ ａｎｔｉｇｅｎ（ジーンバンク登録番号：Ｊ０３２７８）〕、ＢＩＧＨ３ （ジーンバンク登録番号：Ｍ７７３４９）、骨形成タンパク質１〔ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ １ （ＢＭｐ１） （ジーンバンク登録番号：Ｕ５０３３０）〕、ＶＩ型コラーゲンα−３鎖〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＶＩ ａｌｐｈａ−３（ジーンバンク登録番号：Ｘ５２０２２）〕、ＸＶＩＩＩ 型コラーゲンα鎖〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＸＶＩＩＩ ａｌｐｈａ （ジーンバンク登録番号：Ｌ２２５４８）〕、サイトカインｈｕｍｉｇ〔ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｈｕｍｉｇ； ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｎｏｋｉｎｅ （ＭＩＧ） （ジーンバンク登録番号：Ｘ７２７５５）〕、成長ホルモン依存性インスリン様増殖因子結合タンパク質〔ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ジーンバンク登録番号：Ｍ３５８７８）〕、肝癌由来増殖因子〔ｈｅｐａｔｏｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＨＤＧＦ） （ジーンバンク登録番号：Ｄ１６４３１）〕、インスリン様増殖因子結合タンパク質２〔ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ （ＩＧＦＢｐ２） （ジーンバンク登録番号：Ｘ１６３０２）〕、インテグリンα−３鎖〔ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ−３ ｃｈａｉｎ（ジーンバンク登録番号：Ｍ５９９１１）〕、白血球インターフェロン誘導性ペプチド〔ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ（ジーンバンク登録番号：Ｘ５７３５１）〕、転移関連ＭＴＡ１〔ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＭＴＡ１（ジーンバンク登録番号：Ｕ３５１１３）〕、ＭＭＰ−２；ゼラチナーゼＡ〔ＭＭＰ−２； ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ Ａ （ジーンバンク登録番号：Ｚ４８４８２）〕、ノッチ２ ノッチ ホモログ３〔Ｎｏｔｃｈ２ Ｎｏｔｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇ ３（ジーンバンク登録番号：Ｕ９７６６９）〕、プロト−オンコジーンｒｈｏＡ多剤耐性タンパク質〔ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｒｈｏＡ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ； ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ｒｈｏＡ）（ジーンバンク登録番号：Ｌ２５０８０）〕、ｓｐａｒｃ前駆体（オステオネクチン）〔ｓｐａｒｃ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅ； ｏｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎ） （ＯＮ）； ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＭ−４０ （ジーンバンク登録番号：Ｊ０３０４０）〕、トロンボスポンジン２前駆体〔ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ２ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ（ジーンバンク登録番号：Ｌ１２３５０）〕、及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質２〔ｖｅｒｓｉｃａｎ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ； ｌａｒｇｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ； ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２； ｇｌｉａｌ ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＧＨＡＰ） （ジーンバンク登録番号：Ｊ０２８１４）〕
のそれぞれの遺伝子からなる群より選択された少なくとも８種、より好ましくは、少なくとも２０種の遺伝子が挙げられる。なお、少なくとも８種の遺伝子、少なくとも２０種の遺伝子の具体例としては、特に限定されないが、それぞれ後述の実施例３の表５に記載の遺伝子、実施例２の表４に記載の遺伝子が挙げられる。
【００３８】
前記遺伝子は、癌又は癌細胞を検出するための指標としても有用である。したがって、本発明の胃癌の悪性度の評価方法により、癌、特に胃癌における癌細胞の検出をも可能にする。かかる癌又は癌細胞の検出方法も本発明の範囲に包含される。
【００３９】
癌又は癌細胞の検出方法においては、選択された遺伝子の多くは癌化によりその発現が変動し、さらに悪性化により変動パターンが異なるため、同一の手法により癌又は癌細胞の検出とその癌の悪性化判定とを同時に行なうことができる。
【００４０】
本発明の胃癌の悪性度の評価方法においては、遺伝子の発現量は、該遺伝子より転写されるｍＲＮＡ量又は該遺伝子にコードされたポリペプチド量から測定することができる。
【００４１】
前記ｍＲＮＡ量の測定には、公知の種々の方法、例えば、ノーザン・ハイブリダイゼーション法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション法、ＤＮＡアレイを使用する方法等に代表されるハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法に代表される核酸増幅法等が使用できる。十分なｍＲＮＡの検出感度を得る観点から、ハイブリダイゼーション法又は核酸増幅法が好ましく、より具体的には、発現量を測定しようとする遺伝子に対応する核酸又はその断片が支持体上のそれぞれ定められた領域に固定化されたアレイ（例えば、ＤＮＡアレイ）を使用するハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法が好適である。多数の遺伝子の発現を同時に測定する観点から、ＤＮＡアレイを使用するハイブリダイゼーション法が特に好適である。
【００４２】
本明細書において「ＤＮＡアレイ」とは、遺伝子又は遺伝子由来のＤＮＡ断片が支持体上の定められた領域に固定されているものを指し、例えばＤＮＡチップと呼称されているものを包含する。また、遺伝子又は遺伝子由来のＤＮＡ断片が支持体上に高密度に固定されているものはＤＮＡマイクロアレイとも呼ばれる。
【００４３】
ＤＮＡアレイの支持体は、ハイブリダイゼーションに使用可能なものであれば特に限定はなく、通常スライドグラス、シリコンチップ、ニトロセルロースやナイロンの膜等が使用される。また、支持体上に固定される遺伝子又はその断片としては、特に限定するものではないが、例えばゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリー、これらを鋳型としたＰＣＲ等によって増幅されたＤＮＡが挙げられる。
【００４４】
このようなＤＮＡアレイを使用することにより、核酸試料中に含まれる多種類の核酸分子の量を同時に測定することができる。また、少量の核酸試料でも測定できるという利点がある。例えば、試料中のｍＲＮＡを標識するか、もしくはｍＲＮＡを鋳型として標識されたｃＤＮＡを調製し、これとＤＮＡアレイの間でハイブリダイゼーションを実施することにより、試料中で発現されているｍＲＮＡを同時に検出し、さらにその発現量を測定することができる。
【００４５】
標識に用いられる標識物質としては、放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質、発光団を有する物質等の物質を用いることができる。例えば、蛍光物質としては、Ｃｙ２、ＦｌｕｏｒＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン等が挙げられる。また、同時に検出できる点から、２種類以上の蛍光物質を用いて、被検試料、対照として用いる試料をそれぞれ異なった蛍光物質で標識することが望ましい。ここで試料の標識は、試料中のｍＲＮＡ、該ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡもしくは該ｃＤＮＡより転写あるいは増幅された核酸を標識することによって実施される。
【００４６】
標識の検出法は、用いられる標識物質の種類により、適宜選択することができる。例えば、前記Ｃｙ３及びＣｙ５を標識物質として用いる場合、Ｃｙ３は５３２ｎｍ、Ｃｙ５は６３５ｎｍの波長でスキャンすることにより検出することができる。なお、標識の強度を遺伝子の発現量の指標とする。
【００４７】
核酸増幅法、特にＲＴ−ＰＣＲ法によりｍＲＮＡ量を測定する場合、例えば、競合ＰＣＲ法、ＴａｑＭａｎ法〔例えば、リンダ・ジー・リー等（Ｌｉｎｄａ Ｇ．Ｌｅｅ）、ヌクレイック アシッズ リサーチ、第２１巻、第３７６１−３７６６頁（１９９３）等を参照のこと〕等により、ｍＲＮＡ量を測定できる。
【００４８】
前記遺伝子にコードされたポリペプチド量は、該ポリペプチド又はその断片に対する抗体を用いて測定することができる。具体的には、例えば、標識抗体を用い、慣用のＥＬＩＳＡ法等により行なうことができる。
【００４９】
本発明の評価方法においては、ステップ（２）において、被検試料における遺伝子発現量と対照試料における遺伝子発現量とを比較することにより遺伝子の発現量を解析し、それにより胃癌の悪性度を評価することができる。ここで、対照試料とは、健常人由来試料又は非病変部位由来の試料をいう。
【００５０】
遺伝子の発現の解析は、パターン解析により行なうことができる。かかるパターン解析は、被検試料における各遺伝子の発現強度シグナル、又は対照試料に対する被検試料における各遺伝子の相対発現比率を用いたクラスタリング解析により行なうことができる。
【００５１】
すなわち、得られた各遺伝子の発現強度を用いコンピューターによるクラスタリング解析を行なう。解析に用いられるデータとしては、被検試料における各遺伝子の発現強度シグナル、又は対照試料に対する被検試料における各遺伝子の相対発現比率が挙げられる。
【００５２】
なお、ステップ（２）において、さらにステップ（１）で得られた各遺伝子の発現量の測定値の補正処理を行なうことができる。
【００５３】
前記相対発現比率とは、〔被検試料における遺伝子発現量／対照試料における遺伝子発現量〕により示される値をいう。クラスタリングの手法としては、特に限定されないが、Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ 、Ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ 等が挙げられる。
【００５４】
以下にバイオテクノロジー分野で比較的よく用いられるＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇについて説明する。
【００５５】
Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕａｔｅｒｉｎｇ とは、個々のサンプルにつき測定されたデータを多次元座標に配置した場合、データ間の距離が最も近いサンプルから順に見つけ、最終的には似たサンプルが隣り合うように並べるもので、結果を樹形図で表現できるのが特色である。サンプル間の距離の測定法には種々あり、ユークリッド距離、マハラノビスの汎距離等がよく用いられる。また、樹形図を作成する過程で、個々のサンプルをまとめた組の相互の距離の定義の仕方も種々あり、特に限定されないが、主に最短距離法、最長距離法、群平均法、重心法、ウォード法が挙げられる。
【００５６】
被検試料、例えば、癌組織における各遺伝子の発現強度シグナルを用いる場合は、各遺伝子のスポットシグナルからバックグラウンドシグナルを差し引いた値（本値を発現強度シグナルとする）をコンピューターに入力するが、この際のシグナル強度の分布はアレイ毎に異なるので補正（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ） を行なう方が好ましい。このｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ の方法には、Ｚ−ｓｃｏｒｅ 、Ｍｅａｎ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ、Ｍｅａｎ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ 、Ｍｅｄｉａｎ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ 等があり、適宜選択する。クラスタリングの対象となる遺伝子は、前記表１及び２に記載の遺伝子から選択され、数が多いほうがより精度の高い分類が可能である。具体的には、８種以上の限定された遺伝子の組み合わせでも、限られた悪性度因子を判定可能である。
【００５７】
ついで、ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ 後の発現強度シグナルについて、Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ 解析を行なうことにより、検体、例えば、胃癌検体のクラスタリング並びに遺伝子のクラスタリングが行なわれる。その結果、樹形図上での検体間分類、すなわち遺伝子発現の強弱パターンが似通った検体間相互には、病理診断における癌の浸潤程度、リンパ節転移、腹膜転移、肝転移等の悪性度の面での共通性があり、かつ悪性度の高い転移検体と浸潤程度の低い早期癌検体はもっとも離れた距離に配置された。この方法を用いることにより、手術前、バイオプシーにより少量の癌組織を採取するだけで、未知の検体の悪性度が判定可能となる。すなわち、癌組織よりｍＲＮＡを精製し、たとえば一色蛍光ラベリングしたプローブを用いハイブリダイゼーションを行ない、個々の遺伝子の発現強度シグナルを求める。この発現強度シグナルと既に悪性度の判明した標準となる胃癌検体の発現強度シグナルと共にクラスタリング解析を行なうことにより、未知の検体がどの悪性度レベルの標準検体に近いかが判定される。また従来の手術後の病理診断では、癌の浸潤が粘膜から筋層に広がっていた場合、予後の比較的良い癌なのか、将来、再発及び／又は転移する可能性がある悪性の癌なのかの分岐点に位置するため予後の判定不能であったが、本発明のクラスタリング解析を行なうことにより悪性度未知の検体が、悪性度の低い初期の癌か、あるいは転移した悪性度の高い癌検体のいずれに距離的に近いか判明し、予後が予想可能となる。
【００５８】
一方、被検試料（例えば、胃癌組織）の対照試料（例えば、対照正常組織）に対する各遺伝子の相対発現比率、すなわち、〔被検試料における遺伝子発現量／対照試料における遺伝子発現量〕（具体的には、〔癌組織における遺伝子発現量／対照正常組織における遺伝子発現量〕）を用いた場合においても、胃癌検体のクラスタリングは、癌組織の発現強度シグナルを用いた場合とほぼ同様の結果が得られる。相対発現比率を用いた場合は、遺伝子発現における個体差を排除した遺伝子発現プロファイルを見ることができる利点がある。遺伝子のクラスタリングは癌化及び悪性化による発現変動が似通った遺伝子ごとに分類されており、その発現変動と病理診断上の悪性度因子との相関性解析を行なうことにより悪性化に関与する遺伝子を特定することが可能である。これにより、表１及び２に示す１０５個の遺伝子と悪性度との関連性、すなわち癌の浸潤程度を示す深達度レベルとの相関性が見出された。
【００５９】
さらに、上記法より見出された悪性度に相関する遺伝子の分類を応用し、より簡易的な悪性度診断が可能なことを見出した。すなわち、コンピュータによる複雑なクラスタリング解析を行なうことなく、発現変動する遺伝子の数や発現変動の割合を指標として、遺伝子の発現変動レベルを評価することにより、癌、特に胃癌の悪性度の評価が可能であることを見出した。
【００６０】
ここで、「遺伝子の発現変動レベル」は、▲１▼〔対照試料に比較して被検試料において発現量の上昇した遺伝子の相対発現比率若しくは該相対発現比率の対数の絶対値の総和により示された値〕、又は▲２▼〔対照試料に比較して被検試料において発現量の上昇した遺伝子を１ポイントとし、被検試料中の各遺伝子のポイントの総和により示された値〕により評価することができる。具体的には、例えば、対照試料に比較して、被検試料において発現量の上昇した遺伝子の相対発現比率が２以上のときを１ポイントとし、被検試料中の各遺伝子のポイントの総和により示された値により、遺伝子の発現変動レベルを評価することができる。
【００６１】
本明細書において「遺伝子の発現変動」とは、２倍以上の変動、すなわち、相対発現比率（〔被検試料における遺伝子発現量／対照試料における遺伝子発現量〕）が２以上若しくは１／２以下の場合をいう。ここで、前記相対発現比率が２以上の場合が発現上昇した遺伝子であり、１／２以下の場合が発現低下した遺伝子であることの指標である。前記▲２▼では、悪性度の各因子と大きく相関する遺伝子群から選択された８個以上からなるグループの発現変動遺伝子の個数を、すでに悪性度、予後がわかっている標準となる癌組織の発現変動遺伝子数と比較することにより評価可能である。
【００６２】
前記▲１▼の値においては、〔被検試料における遺伝子発現量／対照試料における遺伝子発現量〕の値を対数で示し、その絶対値を用いることで発現の増加率と減少率を対等に評価することができる。その際の対数値は自然対数ｌｏｇ２、絶対対数ｌｏｇ１０ のいずれで表されてもよい。
【００６３】
発現変動する遺伝子の数や発現変動の割合を指標に悪性度を評価する際には、同一チップ上に搭載した陰性対照遺伝子の強度シグナル（バックグラウンド値）を基準に判定すると信頼性の高い評価をすることが可能である。すなわち、被検試料における発現強度シグナル又は対照試料における発現強度シグナルの両者がバックグラウンド値の２倍より小さい場合は変動の信頼性は低いが、いずれかが２倍以上で４倍より小さい場合は信頼度が高く、またいずれかが４倍以上の場合はさらに信頼度が高い。これらの信頼度を悪性度判定に加味すると評価の信頼性があがる。すなわち癌の発現強度シグナル又は対照正常組織の発現強度シグナルのいずれかが陰性対照遺伝子の強度シグナルの２倍以上の場合の発現変動する遺伝子の数や発現変動の割合の和で評価することがより望ましい。
【００６４】
本発明においては、遺伝子発現量の解析は、胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子の発現量と、被検試料におけるハウスキーピング遺伝子の発現量との比較により行なうことができる。
【００６５】
２．本発明のアレイ
癌化、癌の悪性化を評価するために用いられる、胃癌の悪性度を評価するための本発明のアレイは、胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子に対応する核酸（例えば、ＤＮＡ等）又はその断片がそれぞれ支持体上の定められた領域に固定化されたアレイである。本発明のアレイにおいては、前記１．の項に挙げられた、胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子に対応する核酸又はその断片が固定されているため、癌、特に胃癌の悪性度を簡便な操作により評価することができるという優れた性質を有する。
【００６６】
ここで、「それぞれ定められた位置に固定化される」とは、おのおのの遺伝子に対応する核酸又はその断片の固定化されている位置が支持体上においてあらかじめ決定されていることを意味する。すなわち、このようなアレイを使用した場合には、検出されたシグナルの位置からこのシグナルがどの遺伝子の核酸又はその断片に由来するのかを知ることができる。
【００６７】
本発明のアレイに用いる支持体は、ハイブリダイゼーションに使用可能なものであれば特に限定はなく、通常スライドグラス、シリコンチップ、ニトロセルロースやナイロンの膜等が使用される。更に好ましくは、非多孔性で、表面が滑らかな構造を有する材質であればよく、特に限定はないが、例えばスライドガラス等のガラスが好適に使用できる。支持体の表面は、共有結合又は非共有結合により一本鎖ＤＮＡを固定化できるものであればいずれでもよく、支持体の表面に親水性又は疎水性の官能基を有しているものが好適に使用でき、特に限定はないが、例えば、水酸基、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、カルボキシル基、アシル基等を有しているものが好適に使用できる。これらの官能基は、支持体自体の表面特性として存在していてもよいが、表面処理によって導入してもよい。このような表面処理物としては、例えば、ガラスをアミノアルキルシラン等の市販のシランカップリング剤で処理したものや、ポリリジンやポリエチレンイミン等のポリ陽イオンで処理したもの等が挙げられる。また、これらの処理を施したスライドガラスの一部は市販されている。
【００６８】
本発明のアレイにおいては、核酸又はその断片は、一本鎖、二本鎖のどちらが固定されていてもよい。例えば、該核酸子又はその断片が、変性された二本の鎖として支持体に整列固定化されたＤＮＡアレイや、固定化されたＤＮＡの少なくとも一部が一本鎖ＤＮＡであるＤＮＡアレイでもよい。また、本発明のアレイは、二本鎖ＤＮＡを変性下において、同一支持体に整列させてスポットしたＤＮＡアレイでもよい。
【００６９】
さらに、本発明のアレイにおいては、固定化される遺伝子の核酸あるいはその断片の支持体上における密度について特に限定はないが、例えば、高密度のアレイでもよく、１００ドット／ｃｍ２ 以上の密度で核酸、特にＤＮＡが固定化されたアレイが好適に使用できる。
【００７０】
支持体上に固定化される核酸又はその断片には特に限定はなく、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドのいずれであってもよい。また、その製法にも特に限定はなく、化学的に合成したもの、天然の核酸から単離、精製したもの、酵素的に合成したもの、さらにはこれらを組み合わせて使用することができる。
【００７１】
支持体上に固定される核酸又はその断片としては、特に限定するものではないが、例えば、鎖長が５０塩基長以上の二本鎖ポリヌクレオチド又はその誘導体であって、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ）法等により、酵素的に増幅して調製されるものを、ＤＮＡの固定化支持体への固定化時に変性し、一本鎖ＤＮＡ又はその誘導体としたものが好適に使用できる。該誘導体としては、支持体表面への固定化を可能にするような修飾を付されたものであれば良く、特に限定するものではないが、例えばＤＮＡの５’末端にアミノ基やチオール基等の官能基が導入されたＤＮＡが挙げられる。
【００７２】
例えば、ゲノムＤＮＡライブラリーあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型としたＰＣＲ等によって増幅されたＤＮＡを使用することができる。上記の遺伝子に対応する核酸又はその断片を公知の方法、例えばアミノ基を導入した支持体上に固定することにより該アレイを作製することができる。また、上記固定化の操作をＤＮＡアレイ作製装置、例えばＧＭＳ社製のＤＮＡチップ作製装置を使用して行なうことにより、遺伝子に対応する核酸が整列、固定化された本発明のアレイを作製することができる。
【００７３】
アレイに核酸の断片を固定する場合、該断片の鎖長は、特に限定されるものではなく、例えば、約１００塩基長〜約１キロ塩基長であることが望ましく、また、該鎖長より短いあるいは長いものであっても被検試料由来の核酸とハイブリダイゼーションにおいて特異的にハイブリダイズするものであればよい。
【００７４】
本発明のアレイに用いられる遺伝子は、胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する遺伝子であればよく、特に限定されるものではないが、前記１．の項で挙げられた遺伝子、例えば、癌遺伝子、癌抑制遺伝子、増殖因子、転移・浸潤因子、血管新生因子もしくはエネルギー代謝に関与するタンパクをコードする遺伝子等が挙げられる。さらに、例えば、機能は未知であるが種々の悪性度の異なる胃癌患者の癌組織及び対照正常組織より抽出された全ＲＮＡ中よりディファレンシアルディスプレイ（ＤＤ）法により胃癌の悪性化に伴い発現の減少、又は増加する遺伝子を見出してこれらを固定化してもよい。さらに、前記１．の項に記載の遺伝子選別方法で判明した胃癌の悪性化の過程で発現変動する遺伝子は全て入手可能であり、かかる遺伝子に対応する核酸を全て固定化した胃癌の悪性度評価用ＤＮＡアレイを作製することができる。
【００７５】
具体的には、前記１．の項に記載の「胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する遺伝子」の具体例に挙げられた遺伝子からなる群より選択された少なくとも８種、好ましくは少なくとも２０種の遺伝子が挙げられる。
【００７６】
本発明のアレイは、癌、特に胃癌における癌細胞を検出するためにも使用することができる。
【００７７】
３．本発明の胃癌の悪性度を評価するためのキット
本発明の胃癌の悪性度を評価するためのキットとしては、検出対象物により、▲１▼胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子から発現されるｍＲＮＡ又はその断片を検出するためのプライマー及び／又はプローブを含有したキット、並びに▲２▼胃癌の悪性度に応じて発現量の変化する８種以上の遺伝子にコードされたポリペプチド又はその断片に対する抗体又はその断片を含有したキットが挙げられる。
【００７８】
本発明のキットは、▲１▼胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子から発現されるｍＲＮＡ又はその断片を検出するためのプライマー及び／又はプローブ、あるいは▲２▼胃癌の悪性度に応じて発現量の変化する８種以上の遺伝子にコードされたポリペプチド又はその断片に対する抗体又はその断片を含有しているため、前記胃癌の悪性度の評価方法に用いることができ、より簡便、かつ迅速な操作を可能にする。また、本発明のキットは、癌、特に胃癌における癌細胞を検出するためにも使用することができる。
【００７９】
前記▲１▼のキットは、胃癌の悪性度に応じて発現量の変化する８種以上の遺伝子から発現されるｍＲＮＡ又はその断片を核酸増幅法、具体的には、ＲＴ−ＰＣＲ法によって検出するためのプライマー及び／又はプローブを含有する。
【００８０】
前記プライマー及び／又はプローブは、胃癌の悪性度に応じて発現量の変化する８種以上の遺伝子に、又は該遺伝子に相補的な塩基配列を有する核酸にストリンジェントな条件下にハイブリダイズするものであればよい。
【００８１】
上記「ストリンジェントな条件」とは、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液中、〔前記プライマー及び／又はプローブのＴｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件等をいう。
【００８２】
また、上記のプライマーの塩基配列は、通常の核酸増幅法、特にＲＴ−ＰＣＲにおけるの反応条件下に、前記遺伝子に対応する核酸を特異的に増幅しうる配列であればよい。
【００８３】
一方、プローブの塩基配列も、前記遺伝子に対応する核酸に前記ストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸の配列であればよい。
【００８４】
なお、プローブ又はプライマーのＴｍは、例えば、下記式：
Ｔｍ＝８１．５−１６．６ （ｌｏｇ１０［Ｎａ＋ ］）＋０．４１ （％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
（式中、Ｎはプローブ又はプライマーの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはプローブ又はプライマー中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）
により求められる。
【００８５】
また、プローブ又はプライマーの鎖長が１８塩基より短い場合、Ｔｍは、例えば、Ａ＋Ｔ（アデニン＋チミン）残基の含有量と２℃との積と、Ｇ＋Ｃ残基の含有量と４℃との積との和〔（Ａ＋Ｔ） ×２＋（Ｇ＋Ｃ） ×４ 〕により推定することができる。
【００８６】
前記プローブの鎖長は、特に限定はないが、非特異的なハイブリダイゼーションを防止する観点から、１５塩基以上であり、好ましくは１８塩基以上であることが望ましい。
【００８７】
また、プライマーの鎖長は、特に限定はないが、例えば、１５〜４０塩基長であり、好ましくは１７〜３０塩基長であることが望ましい。
【００８８】
前記「胃癌の悪性度に応じて発現量の変化する８種以上の遺伝子」としては、好ましくは、前記１．の項に記載の「胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する遺伝子」の具体例に挙げられた遺伝子からなる群より選択された少なくとも８種、より好ましくは少なくとも２０種の遺伝子が挙げられる。
【００８９】
前記▲２▼のキットにおいて、ポリペプチドは、前記胃癌の悪性度に応じて発現量の変化する８種以上の遺伝子によりコードされたポリペプチドが挙げられる。具体的には、前記１．の項に記載の「胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する遺伝子」の具体例に挙げられた遺伝子にコードされたポリペプチドからなる群より選択された少なくとも８種、より好ましくは少なくとも２０種のポリペプチドが挙げられる。
【００９０】
抗体は、前記ポリペプチドに特異的に結合する能力を有するものであれば、特に限定はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のどちらでもよい。さらに、公知技術により修飾された抗体や抗体の誘導体、例えばヒト化抗体、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体等を使用することもできる。前記抗体は、例えば、１９９２年、ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｅｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ）発行、ジョン・Ｅ・コリガン（Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ ）編集、カレント・プロトコルズ・イン・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ）に記載の方法により、前記ポリペプチドの全部又は一部を用いてウサギやラット、マウス等を免疫することにより、容易に作製され得る。こうして得られた抗体を精製後、ペプチダーゼ等により処理することにより、抗体の断片が得られる。また、遺伝子工学的に抗体を作製することもできる。さらに、本発明の抗体又はその断片は、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法等による検出を容易にするために、各種修飾をしてもよい。
【００９１】
上記の抗体又はその断片には、ポリペプチドのある部分断片に特異的に結合しうるものも含まれる。
【００９２】
本発明のキットは、検出用試薬等を適宜含有してもよい。
【００９３】
また、本発明は、前記評価方法等により、得られた結果を解析手段（例えば、コンピューターによる画像処理方法等）により解析し、その結果を、例えば、紙等の記録媒体；コンピューター読み取り可能な記録媒体等に記録又は表示して提供する診断方法をも提供することができる。かかる診断方法も本発明に含まれる。
【００９４】
【実施例】
以下に実施例をもってさらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
【００９５】
実施例１
（１）ＤＮＡアレイの作成
ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）法により見いだされた、国際公開公報第９８／３７１８７号公報に記載の癌関連遺伝子のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドクローンに挿入されているＤＮＡ断片を鋳型とし、当該ファージミドのマルチクローニングサイトの両端に設定されたプライマーを使用したＰＣＲ法により目的のｃＤＮＡ断片を増幅、回収した。さらに、ハウスキーピング遺伝子としてグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）、シクロフィリン遺伝子を、陰性対照としてプラスミドｐＵＣ１８をそれぞれ同様に調製した。
【００９６】
これらのＤＮＡをエタノール沈殿法により回収して１００ｍＭ 炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で１μＭとなるように溶解し、ＤＮＡチップ作製装置（ＧＭＳ社製）を用いてアミノ基導入スライドガラス（シグマ社製）にスポットし、ＵＶ照射により固定した。スライドを０．２％ＳＤＳ、次いで蒸留水で洗浄乾燥してＤＮＡアレイとした。
【００９７】
（２）蛍光標識ｃＤＮＡの調製
表３に示す、癌の浸潤程度、転移の有無、又は進行度の異なる１０人の胃癌患者より、癌摘出手術時に摘出された組織から胃癌組織と対照正常胃組織とを取りわけた。ついで、ＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）法により、各組織から個々に全ＲＮＡを抽出した。これらの全ＲＮＡのそれぞれからＯｌｉｇｏｔｅｘ−ＭＡＧ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、ｍＲＮＡを精製した。
【００９８】
【表３】
なお、表３中の各項目は以下のような所見を示す：
進行度：
進行度Ｉは、癌の浸潤程度が浅く、転移の認められない早期の癌である。
進行度ＩＩは、癌が浸潤、近接リンパ節に転移した状態をいう。
進行度ＩＩＩは、遠隔リンパ節に広がった状態をいう。
進行度ＩＶは、さらに進行し、より遠隔リンパ節に広がるとともに腹膜転移、肝転移した状態をいう。
【０１００】
分化度：
一般型として、乳頭腺癌（ｐａｐ） 、高分化腺癌（ｔｕｂ １） 、中分化腺癌（ｔｕｂ ２） 、低分化腺癌（ｐｏｒ） 、印環細胞癌（ｓｉｇ） 、粘液癌（ｍｕｃ） に分類される
【０１０１】
深達度：
癌浸潤の及んだ最も深い胃壁の層で表し、粘膜（ｍ） 、粘膜下層（ｓｍ）、筋層（ｍｐ）、しょう膜化組織（ｓｓ）、しょう膜を破り腹膜に露出（ｓｅ）で表現される。
【０１０２】
リンパ節転移（組織学的に検索されたリンパ節群の転移程度を表わす）：
全く転移を認めない（Ｎ０）
第１群リンパ節のみに転移を認める（Ｎ１）
第２群リンパ節に転移を認めるが、第３群、第４群には転移を認めない（Ｎ２）
第３群リンパ節に転移を認めるが、第４群には転移を認めない（Ｎ３）
第４群リンパ節に転移を認める（Ｎ４）
【０１０３】
リンパ管侵襲：
侵襲が認められない（０）
侵襲が軽度に認められる（１）
侵襲が中程度に認められる（２）
侵襲が高度に認められる（３）
【０１０４】
静脈侵襲：
侵襲が認められない（０）
侵襲が軽度に認められる（１）
侵襲が中程度に認められる（２）
侵襲が高度に認められる（３）
【０１０５】
腹膜転移：
全く播種を認めない（０）
近接腹膜に播種を認める（１）
遠隔腹膜に少数の転移（２）
遠隔腹膜に多数の転移（３）
【０１０６】
肝転移：
全く肝転移を認めない（０）
一葉にのみ肝転移を認める（１）
両葉に少数散在性の転移（２）
両葉に多数散在性の転移（３）
【０１０７】
浸潤増殖様式：
癌層が膨張性の発育を示し周囲と一線を画する （α）
病巣が浸潤性の増殖を示し周囲組織との境が不明瞭 （γ）
その中間にあるもの （β）
【０１０８】
上記のｍＲＮＡを鋳型とし、対照正常胃癌組織群にはＣｙ３−ｄＵＴＰ（アマシャム−ファルマシア社製）、胃癌組織群にはＣｙ５−ｄＵＴＰ（アマシャム社製−ファルマシア社製）をそれぞれ使用した逆転写反応を行い、蛍光標識ｃＤＮＡを調製した。
【０１０９】
反応液組成を以下に示す。
反応液Ａ：ｍＲＮＡ約１μｇ、３００ｐｍｏｌのオリゴｄＴプライマー（宝酒造社製）及び最終的に１１．９μｌになるようジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ、ナカライテスク社製）処理水を添加；
反応液Ｂ：５×ＡＭＶ ＲＴａｓｅ用緩衝液（ライフサイエンス社製）４μｌ、０．１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及び０．０６５ｍＭのｄＴＴＰ、６０ＵのＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、０．０３５ｍＭのＣｙ３又はＣｙ５標識ｄＵＴＰ（アマシャムファルマシア社製）を混合し、最終容量６．５μｌの溶液を得た。
【０１１０】
反応液Ａを７０℃で５分間保持した後、氷浴上で冷却した。その後、前記反応液Ａに反応液Ｂ（６．５μｌ）とＡＭＶ ＲＴａｓｅ（ライフサイエンス社製）３０Ｕとを加え、ＲＴ反応液を得た。このＲＴ反応液を５５℃で３０分間保持した後、温度を４２℃とした。前記ＲＴ反応液に、さらに３０ＵのＡＭＶ ＲＴａｓｅを追加して液量を２０μｌに調整した後、得られた混合液を再度４２℃で６０分間保持した。得られた反応液に５００ｍＭのＥＤＴＡ溶液 ２．５μｌと１Ｍの水酸化ナトリウム ５μｌとを加え、３７℃で１０分間保持し、鋳型ＲＮＡを分解させた。反応液を室温まで冷却した後、１Ｍのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）を１２．５μｌ添加した。この溶液をＣｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いてゲルろ過した。これにより、Ｃｙ３標識ｃＤＮＡ溶液（約３５μｌ）及びＣｙ５標識ｃＤＮＡ（約３５μｌ）を得た。
【０１１１】
こうして得られたＣｙ３標識ｃＤＮＡ、Ｃｙ５標識ｃＤＮＡを同一患者ごとに対になるように混合してエタノール沈殿濃縮し、ハイブリダイゼーションバッファー（６×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ／５×デンハート液／０．１ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）８μｌに溶解して、蛍光標識ｃＤＮＡを調製した。
【０１１２】
（３）標識ｃＤＮＡとＤＮＡアレイとのハイブリダイゼーション
上記（１）で作成したＤＮＡアレイ、ならびに市販のＤＮＡアレイ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｉｐ 、宝酒造社製）にプレハイブリダイゼーションバッファー（６×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ／５×デンハート液／１ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）を滴下し、カバーグラスをかけて周囲をフィルムで密閉した。これを室温で２時間保持した後、カバーグラスを除いて、２×ＳＳＣで洗浄、次いで０．２×ＳＳＣで洗浄し、風乾した。
【０１１３】
（２）で調製した蛍光標識ｃＤＮＡを熱変性（９４℃、３分）後、その８μｌをプレハイブリダイズされたＤＮＡアレイに滴下し、カバーグラスをかけて周囲をフィルムで密閉した。得られたアレイを６５℃で１６時間保持した後、カバーグラスを除いて、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中で５５℃、３０分洗浄を２回、次いで６５℃、５分洗浄を１回、さらに０．０５×ＳＳＣ中で室温、１０分洗浄し、風乾した。得られたアレイをマイクロアレイスキャナー（ＧＭＳ社製）にかけて各スポットの蛍光シグナルを測定した。測定されたシグナルを発現データ解析ソフトウェアＩｍａｇｅｎｅ（バイオディスカバリー社製）で解析し、癌組織、対照正常組織における各遺伝子の発現量を調べた。
【０１１４】
使用したＤＮＡアレイに固定化された個々の遺伝子の、癌組織と対照正常組織における相対発現比率（［癌組織の発現強度シグナル／対照正常組織の発現強度シグナル］）、すなわち〔被検試料における遺伝子発現量／対照試料における遺伝子発現量〕は、１０人の胃癌患者によりそれぞれ複雑に異なっていた。しかし一部の遺伝子は、癌の浸潤程度、転移の有無又は進行度に依存した、発現パターンを示した。これらの遺伝子の中から以下のステップを経て、胃癌の悪性度に関連する遺伝子を見い出した。
【０１１５】
まず使用したＤＮＡアレイ上の遺伝子全ての癌組織と対照正常組織とにおける〔相対発現比率の自然対数変換値〕について、クラスタリングソフトＧｅｎｅＳｉｇｈｔ （ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ 社製） を使用したＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ を実施した。各サンプル間の距離の測定法にはユークリッド距離を、距離の定義には重心法を用いた。なお、この解析により得られる樹形図において、縦軸は、検体の分類を示し、大きく、〔初期胃癌検体〕、〔癌が固有筋層又はしょう膜下組織まで浸潤しているが転移はしていない胃癌検体〕及び〔転移検体〕の３つのグループに分類されることが示される。また、樹形図の横軸は遺伝子の分類を示しており、これらは、〔すべての胃癌患者癌組織で発現強度比の低い遺伝子群〕、〔すべての胃癌患者癌組織で発現強度比の高い遺伝子群〕及び〔胃癌患者ごとに発現パターンの異なる遺伝子群〕の３分類に分類されることがわかる。
【０１１６】
胃癌の悪性度に関連する遺伝子は、前記３分類のうち、〔胃癌患者ごとに発現パターンの異なる遺伝子群〕に属すると考えられたため、本グループの遺伝子をまず候補として選択した。これら候補遺伝子から、癌の発現強度シグナル及び対照正常組織の発現強度シグナルがバックグラウンド値の２倍より小さい遺伝子は、発現が低く変動の評価信頼性が低いため除去した。胃癌患者ごとに発現パターンの異なる候補遺伝子群は、およそ３から１０遺伝子を１グループとしてサブクラスタリングしているため、次に、選択遺伝子からサブクラスター遺伝子のグループごとに除いていき、残りの遺伝子を用い同様にクラスタリングしていった。その結果、検体間の分類と悪性度との相関性が失われるサブクラスタリンググループを見出した。このような遺伝子はその発現が胃癌の悪性度に密接に関連していると考えられる。
【０１１７】
上記ステップを経て選択された１０５の遺伝子名とそのアクセッション番号は、前出の表１及び２に示されたものと同様である。
【０１１８】
これら１０５遺伝子を用いたＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ により得られた樹形図を図１及び２に示す。図１は、胃癌患者の分類を示す。また、図２は、各胃癌患者における各遺伝子の発現パターンの樹形図を示す。図１に示すように、癌の深達度が低くリンパ管侵襲の見られない初期胃癌患者（ＭＫ３８及びＭＫ１６８ ）と、侵襲の見られる中程度から高度の進行胃癌検体とに大きく分かれることがわかる。また、後者は、癌が深く浸潤しリンパ節に転移している検体群（ＭＫ１５３ 、ＭＫ４４及びＭＫ１４３ ）とＭＫ１４４ 、ＭＫ８０及びＭＫ９６のサブクラスターを含むことがわかる。これらのうちＭＫ９６は、癌の深達が比較的低く、転移が見られなかったが、手術切片を顕微鏡観察したところ、リンパ管に癌が軽度に侵襲していた。現在、手術後４年１０カ月経過するが生存中である。ＭＫ８０も手術時転移は見られなったが癌が深く浸潤し、摘出された手術切片の顕微鏡観察でリンパ管に癌が高度に侵襲していた。その後、癌が再発し、死亡している。ＭＫ１４４ は、リンパ節にも腹膜にも転移している悪性度の高い癌患者であった。
【０１１９】
ＤＮＡアレイ上の遺伝子の癌組織における発現強度を指標とした、Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ も実施した。癌組織における発現強度のｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ にはＺ−ｓｃｏｒｅ 法を、サンプル間の距離の測定法にはシィティーブロック距離を、距離の定義には重心法を用いた。得られた樹形図を図３及び４に示す。縦軸の患者検体の分類（図３）は発現比率を用いた場合とわずかに異なるものの、１０人の胃癌患者は、やはり癌の深達度が低くリンパ管侵襲の見られない初期胃癌患者とリンパ管侵襲及び／又は転位の見られる中程度から高度の進行胃癌検体の２グループに大きく分かれた。さらに後者は転移の見られないＭＫ８０及びＭＫ９６のサブクラスターを含み、転移検体がこのサブクラスターに複雑に絡んでいた（図４）。
【０１２０】
癌組織の発現強度を用いた場合と、癌組織との対照正常組織の相対発現比率を用いた場合のＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ が似通っておりかつ胃癌の悪性度と相関していることから、これら１０５遺伝子の癌組織における発現変化は個体差による変化ではなく、胃癌の悪性化に関連していると判断された。
【０１２１】
実施例２
（１）ＤＮＡアレイの作製
実施例１で選択された１０５種類の遺伝子について、実施例１記載の方法により、約１００ヌクレオチド長〜約１キロヌクレオチド長）のｃＤＮＡ断片を調製し、該ＤＮＡ断片をスポットしたＤＮＡアレイを作製した。
【０１２２】
（２）標識ｃＤＮＡとＤＮＡアレイとのハイブリダイゼーション
実施例２で調製した蛍光標識ｃＤＮＡを使用し、上記（１）で作成したＤＮＡアレイとのハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーションの条件は実施例１と同様の条件とした。
【０１２３】
ハイブリダイゼーションの結果に基づき、得られた１０５遺伝子についての蛍光シグナルのうち、表４に示す２０種の遺伝子を選択し、該２０種の遺伝子について、実施例１と同様にＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ を実施した。
【０１２４】
【表４】
なお、癌組織の対照正常組織に対する各遺伝子の〔相対発現比率の自然対数変換値〕を用い、ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ 無し、サンプル間の距離の測定はユークリッド距離、距離の定義は重心法により解析した。得られた樹形図を図５及び６に示す。その結果、１０人の胃癌患者は非転移群と転移群の２グループに分かれることがわかる（図５）。また、非転移群は、初期胃癌患者（ＭＫ３８とＭＫ１６８ ）と、リンパ管侵襲の見られるＭＫ８０及びＭＫ９６とにサブクラスタリングされることがわかる。転移群のサブクラスターを構成する検体はいずれも広範囲のリンパ節に転移が認められた高進行癌の検体であることがわかる。このように、表４に示す２０個の遺伝子の組み合わせで、悪性度と密接に関連したクラスタリングが可能であることが示される。本実験よりこれら２０種の遺伝子の胃癌の悪性度への関与が再確認された。
【０１２６】
実施例３
（１）標識ｃＤＮＡとＤＮＡアレイとのハイブリダイゼーション
手術時の臨床病理データでは予後の予想のつきにくい悪性度レベルは、転移が認められないが、癌が胃の筋層に達した深達度ｍｐの胃癌である。臨床病理的にこのレベルに分類される胃癌患者ＭＫ１１５ の胃癌組織及び対照正常胃組織から、実施例１記載の方法でｍＲＮＡを精製し、さらに蛍光標識ｃＤＮＡを調製した。この蛍光標識ｃＤＮＡと、実施例１で調製した蛍光標識ｃＤＮＡとを使用して実施例２（１）で作成されたＤＮＡマイクロアレイとのハイブリダイゼーションを実施した。なお、ハイブリダイゼーションの条件は、実施例１と同様の条件とした。
【０１２７】
前記胃癌患者ＭＫ１１５ の臨床病理データは、次の通りである：
進行度Ｉ、分化度ｍｏｄ 、深達度ｍｐ、リンパ節転移０ 、リンパ節侵襲０ 、静脈侵襲０ 、腹膜転移０ 、肝転移０ 、浸潤増殖様式α。
【０１２８】
ハイブリダイゼーションの結果、得られた１０５遺伝子についての蛍光シグナルのうち、表５に示す遺伝子８種を選択し、癌組織の対照正常組織に対する相対発現比率を求めた。癌組織における発現が対照正常組織の２倍以上上昇している遺伝子、すなわち相対発現比率が２以上の遺伝子の相対発現比率の総和又は相対発現比率が２以上の遺伝子数にて悪性度を判定した。
【０１２９】
標準癌検体として実施例１及び２で用いられた癌検体１０検体と上記検体を比較した。表５に結果を示す。
【０１３０】
【表５】
胃癌患者ＭＫ１１５ はリンパ管侵襲、血管侵襲も全く見られない進行度Ｉｂにもかかわらず選択された８遺伝子の相対発現比率の総和と相対発現比率が２以上の遺伝子数はともに大きく進行癌と同レベルであった。同様に、相対発現比率が２以上である遺伝子の相対発現比率の総和も進行癌と同レベルであった。そこで、この患者の予後を調べてみると３年９ヶ月後にガンが再発し死亡していた。通常、リンパ管侵襲、血管侵襲も見られない進行度Ｉの患者がこのような早期に再発することはまれであり、３年後の癌の再発が既に手術時の遺伝子の発現変化で予想できることは意義深い。
【０１３２】
ここで選択した８遺伝子は、転移や悪性度との相関が示唆されている遺伝子が多いにもかかわらず、転移、非転移という観点で見ても該遺伝子の発現は、検体ごとに異なり均一ではない。例えば、マトリリシン（ＭＭＰ−７）は、胃癌の悪性との関連性が高いとの報告〔セノタＡ．ら、クリニカル＆エクスペリメンタルメタスタシス（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、第１６巻、第３１３−３２１頁（１９９８）〕があるが、今回測定した１１人の患者のうち４人で過剰発現していたに過ぎない。しかも、悪性度の高い転移検体でも半数で発現増加が見られるのみである。この結果より明らかなように、単一の遺伝子のみでは精度の高い悪性度判定は不可能であり、悪性度と関連する遺伝子の複数の組み合わせによって、予後の判定が可能になる。
【０１３３】
このように本発明は、従来の病理診断では予測不可能であった癌の悪性度や予後の診断に有効であることが明らかとなった。
【０１３４】
【発明の効果】
本発明の胃癌の悪性度の評価方法、胃癌の悪性度を評価するためのアレイ及び胃癌の悪性度を評価するためのキットにより、胃癌の悪性化に関与する多数の遺伝子の発現変化を迅速、かつ高感度に系統的に測定でき、これらの遺伝子発現変動のパターン解析により胃癌の悪性度の判定、又は胃癌の検出をすることができるとい優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、１０５遺伝子の〔相対発現比率の自然対数変換値〕を用いたＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ により得られた胃癌患者の分類の樹形図を示す。
【図２】図２は、１０５遺伝子の〔相対発現比率の自然対数変換値〕を用いたＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ により得られた各胃癌患者における各遺伝子の発現パターンの樹形図を示す。
【図３】図３は、１０５遺伝子の発現強度を用いたＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ により得られた胃癌患者の分類の樹形図を示す。
【図４】図４は、１０５遺伝子の発現強度を用いたＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ により得られた各胃癌患者における各遺伝子の発現パターンの樹形図を示す。
【図５】図５は、２０遺伝子の〔相対発現比率の自然対数変換値〕を用いたＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ により得られた胃癌患者の分類の樹形図を示す。
【図６】図６は、２０遺伝子の〔相対発現比率の自然対数変換値〕を用いたＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ により得られた各胃癌患者における各遺伝子の発現パターンの樹形図を示す。
Claims (29)
- 下記ステップ：
（１）被検試料において、胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子の発現量を測定するステップ、及び
（２）（１）で得られた各遺伝子の発現量に基づき、胃癌の悪性度を評価するステップ
を行なうことを特徴とする、胃癌の悪性度の評価方法。 - アポトーシスインヒビター サーバイビン〔ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｕｒｖｉｖｉｎ（ジーンバンク登録番号：Ｕ７５２８５）〕遺伝子、
Ｉ型コラーゲン〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉ （ジーンバンク登録番号：Ｊ０３４６４）〕遺伝子、
ＩＩＩ 型コラーゲン プロ−α−１鎖〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｐｒｏ−ａｌｐｈａ−１ （ジーンバンク登録番号：Ｘ１４４２０）〕遺伝子、
フィブロネクチン前駆体（ＦＮ）〔ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ＦＮ）（ジーンバンク登録番号：Ｘ０２７６１）〕遺伝子、
ＭＭＰ−１；コラゲナーゼ−１〔ＭＭＰ−１； ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−１（ジーンバンク登録番号：Ｘ５４９２５）〕遺伝子、
ＭＭＰ−７；マトリリシン〔ＭＭＰ−７； ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ （ジーンバンク登録番号：Ｘ０７８１９）〕遺伝子、
Ｕ−プラスミノーゲン活性化因子〔ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ＥＣ ３．４．２１．７３）； Ｕ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ （ＵＰＡ）（ジーンバンク登録番号：Ｘ０２４１９） 〕遺伝子、
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体〔ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ； ＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ｆｒｏｍ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （Ｕ−ＰＡＲ）；ｍｏｎｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ＭＯ３； ＣＤ８７ ａｎｔｉｇｅｎ （ジーンバンク登録番号：Ｕ０９９３７）〕遺伝子、
アルファ−２−マクログロブリン前駆体〔ａｌｐｈａ−２−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ａｌｐｈａ−２−Ｍ） （ジーンバンク登録番号：Ｍ１１３１３）〕遺伝子、
大動脈タイプ平滑筋α−アクチン遺伝子、エキソン９〔ａｏｒｔｉｃ−ｔｙｐｅ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｌｐｈａ−ａｃｔｉｎ ｇｅｎｅ， ｅｘｏｎ ９（ジーンバンク登録番号：Ｍ３３２１６）〕、
β型血小板由来増殖因子受容体前駆体〔ｂｅｔａ ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｕｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ＰＤＧＦＲ−ｂｅｔａ）； ＣＤ１４０Ｂ ａｎｔｉｇｅｎ（ジーンバンク登録番号：Ｊ０３２７８）〕遺伝子、
ＢＩＧＨ３ （ジーンバンク登録番号：Ｍ７７３４９）遺伝子、
骨形成タンパク質１〔ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ １ （ＢＭｐ１） （ジーンバンク登録番号：Ｕ５０３３０）〕遺伝子、
ＶＩ型コラーゲンα−３鎖〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＶＩ ａｌｐｈａ−３（ジーンバンク登録番号：Ｘ５２０２２）〕遺伝子、
ＸＶＩＩＩ 型コラーゲンα鎖〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＸＶＩＩＩ ａｌｐｈａ （ジーンバンク登録番号：Ｌ２２５４８）〕遺伝子、
サイトカインｈｕｍｉｇ〔ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｈｕｍｉｇ； ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｎｏｋｉｎｅ （ＭＩＧ） （ジーンバンク登録番号：Ｘ７２７５５）〕遺伝子、
成長ホルモン依存性インスリン様増殖因子結合タンパク質〔ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ジーンバンク登録番号：Ｍ３５８７８）〕遺伝子、
肝癌由来増殖因子〔ｈｅｐａｔｏｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＨＤＧＦ） （ジーンバンク登録番号：Ｄ１６４３１）〕遺伝子、
インスリン様増殖因子結合タンパク質２〔ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ （ＩＧＦＢｐ２） （ジーンバンク登録番号：Ｘ１６３０２）〕遺伝子、
インテグリンα−３鎖〔ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ−３ ｃｈａｉｎ（ジーンバンク登録番号：Ｍ５９９１１）〕遺伝子、
白血球インターフェロン誘導性ペプチド〔ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ（ジーンバンク登録番号：Ｘ５７３５１）〕遺伝子、
転移関連ＭＴＡ１〔ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＭＴＡ１（ジーンバンク登録番号：Ｕ３５１１３）〕遺伝子、
ＭＭＰ−２；ゼラチナーゼＡ〔ＭＭＰ−２； ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ Ａ （ジーンバンク登録番号：Ｚ４８４８２）〕遺伝子、
ノッチ２ ノッチ ホモログ３〔Ｎｏｔｃｈ２ Ｎｏｔｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇ ３（ジーンバンク登録番号：Ｕ９７６６９）〕遺伝子、
プロト−オンコジーンｒｈｏＡ多剤耐性タンパク質〔ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｒｈｏＡ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ； ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ｒｈｏＡ）（ジーンバンク登録番号：Ｌ２５０８０）〕遺伝子、
ｓｐａｒｃ前駆体（オステオネクチン）〔ｓｐａｒｃ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅ； ｏｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎ） （ＯＮ）； ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＭ−４０ （ジーンバンク登録番号：Ｊ０３０４０）〕遺伝子、
トロンボスポンジン２前駆体〔ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ２ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ（ジーンバンク登録番号：Ｌ１２３５０）〕遺伝子、及び
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質２〔ｖｅｒｓｉｃａｎ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ； ｌａｒｇｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ； ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２； ｇｌｉａｌ ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＧＨＡＰ） （ジーンバンク登録番号：Ｊ０２８１４）〕遺伝子
からなる群より選択された少なくとも８種の遺伝子の発現量を測定する、請求項１記載の評価方法。 - 少なくとも２０種の遺伝子の発現量を測定する、請求項２記載の評価方法。
- 遺伝子の発現量が、該遺伝子より転写されるｍＲＮＡ量又は該遺伝子にコードされたポリペプチド量から測定される、請求項１〜３いずれかに記載の評価方法。
- ｍＲＮＡ量が、ハイブリダイゼーション法又は核酸増幅法により測定される、請求項４記載の方法。
- ハイブリダイゼーション法において、発現量を測定しようとする遺伝子に対応する核酸又はその断片が支持体上のそれぞれ定められた領域に固定化されたアレイを使用する、請求項５記載の評価方法。
- 核酸増幅法が、ＲＴ−ＰＣＲ法である、請求項５記載の評価方法。
- 該遺伝子にコードされたポリペプチド量が、該ポリペプチド又はその断片に対する抗体を用いて測定される、請求項４記載の評価方法。
- ステップ（２）において、被検試料における遺伝子発現量と対照試料における遺伝子発現量とを比較することにより遺伝子の発現量を解析し、それにより胃癌の悪性度を評価する、請求項１〜８いずれかに記載の評価方法。
- 対照試料が、健常人由来試料又は非病変部位由来の試料である、請求項９記載の評価方法。
- 遺伝子の発現量の解析が、パターン解析により行なわれる、請求項９又は１０記載の評価方法。
- 遺伝子発現のパターン解析が、被検試料における各遺伝子の発現強度シグナル又は対照試料に対する被検試料における各遺伝子の相対発現比率を用いたクラスタリング解析により行なわれる、請求項１１記載の評価方法。
- 相対発現比率が、〔被検試料における遺伝子発現量／対照試料における遺伝子発現量〕により示される値である、請求項１２記載の評価方法。
- 対照試料に比較して、被検試料において発現量の上昇した遺伝子の相対発現比率の対数の絶対値により示された値により、遺伝子の発現変動レベルを評価する、請求項１２又は１３記載の評価方法。
- 対照試料に比較して、被検試料において発現量の上昇した遺伝子の相対発現比率が２以上のときを１ポイントとし、被検試料中の各遺伝子のポイントの総和により示された値により、遺伝子の発現変動レベルを評価する、請求項１２又は１３記載の評価方法。
- 遺伝子の発現量の解析が、胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子の発現量と、被検試料におけるハウスキーピング遺伝子の発現量との比較により行なわれる、請求項１〜７いずれかに記載の評価方法。
- ステップ（２）において、さらにステップ（１）で得られた各遺伝子の発現量の測定値の補正処理を行なう、請求項１〜１６いずれかに記載の評価方法。
- 胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子に対応する核酸又はその断片がそれぞれ支持体上の定められた領域に固定化されてなる、胃癌の悪性度を評価するためのアレイ。
- 支持体がスライドグラスである、請求項１８記載のアレイ。
- アポトーシスインヒビター サーバイビン〔ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｕｒｖｉｖｉｎ（ジーンバンク登録番号：Ｕ７５２８５）〕遺伝子、Ｉ型コラーゲン〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉ （ジーンバンク登録番号：Ｊ０３４６４）〕、
ＩＩＩ 型コラーゲン プロ−α−１鎖〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｐｒｏ−ａｌｐｈａ−１ （ジーンバンク登録番号：Ｘ１４４２０）〕遺伝子、
フィブロネクチン前駆体（ＦＮ）〔ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ＦＮ）（ジーンバンク登録番号：Ｘ０２７６１）〕遺伝子、
ＭＭＰ−１；コラゲナーゼ−１〔ＭＭＰ−１； ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−１（ジーンバンク登録番号：Ｘ５４９２５）〕遺伝子、
ＭＭＰ−７；マトリリシン〔ＭＭＰ−７； ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ （ジーンバンク登録番号：Ｘ０７８１９）〕遺伝子、
Ｕ−プラスミノーゲン活性化因子〔ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ＥＣ ３．４．２１４７３）； Ｕ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ （ＵＰＡ）（ジーンバンク登録番号：Ｘ０２４１９） 〕遺伝子、
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体〔ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ； ＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ｆｒｏｍ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （Ｕ−ＰＡＲ）；ｍｏｎｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ＭＯ３； ＣＤ８７ ａｎｔｉｇｅｎ （ジーンバンク登録番号：Ｕ０９９３７）〕遺伝子、
アルファ−２−マクログロブリン前駆体〔ａｌｐｈａ−２−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ａｌｐｈａ−２−Ｍ） （ジーンバンク登録番号：Ｍ１１３１３）〕遺伝子、
大動脈タイプ平滑筋α−アクチン遺伝子、エキソン９〔ａｏｒｔｉｃ−ｔｙｐｅ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｌｐｈａ−ａｃｔｉｎ ｇｅｎｅ， ｅｘｏｎ ９（ジーンバンク登録番号：Ｍ３３２１６）〕、
β型血小板由来増殖因子受容体前駆体〔ｂｅｔａ ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｕｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ＰＤＧＦＲ−ｂｅｔａ）； ＣＤ１４０Ｂ ａｎｔｉｇｅｎ（ジーンバンク登録番号：Ｊ０３２７８）〕遺伝子、
ＢＩＧＨ３ （ジーンバンク登録番号：Ｍ７７３４９）遺伝子、
骨形成タンパク質１〔ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ １ （ＢＭｐ１） （ジーンバンク登録番号：Ｕ５０３３０）〕遺伝子、
ＶＩ型コラーゲンα−３鎖〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＶＩ ａｌｐｈａ−３（ジーンバンク登録番号：Ｘ５２０２２）〕遺伝子、
ＸＶＩＩＩ 型コラーゲンα鎖〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＸＶＩＩＩ ａｌｐｈａ （ジーンバンク登録番号：Ｌ２２５４８）〕遺伝子、
サイトカインｈｕｍｉｇ〔ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｈｕｍｉｇ； ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｎｏｋｉｎｅ （ＭＩＧ） （ジーンバンク登録番号：Ｘ７２７５５）〕、
成長ホルモン依存性インスリン様増殖因子結合タンパク質〔ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ジーンバンク登録番号：Ｍ３５８７８）〕遺伝子、
肝癌由来増殖因子〔ｈｅｐａｔｏｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＨＤＧＦ） （ジーンバンク登録番号：Ｄ１６４３１）〕遺伝子、
インスリン様増殖因子結合タンパク質２〔ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ （ＩＧＦＢｐ２） （ジーンバンク登録番号：Ｘ１６３０２）〕遺伝子、
インテグリンα−３鎖〔ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ−３ ｃｈａｉｎ（ジーンバンク登録番号：Ｍ５９９１１）〕遺伝子、
白血球インターフェロン誘導性ペプチド〔ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ（ジーンバンク登録番号：Ｘ５７３５１）〕遺伝子、
転移関連ＭＴＡ１〔ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＭＴＡ１（ジーンバンク登録番号：Ｕ３５１１３）〕遺伝子、
ＭＭＰ−２；ゼラチナーゼＡ〔ＭＭＰ−２； ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ Ａ （ジーンバンク登録番号：Ｚ４８４８２）〕遺伝子、
ノッチ２ ノッチ ホモログ３〔Ｎｏｔｃｈ２ Ｎｏｔｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇ ３（ジーンバンク登録番号：Ｕ９７６６９）〕遺伝子、
プロト−オンコジーンｒｈｏＡ多剤耐性タンパク質〔ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｒｈｏＡ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ； ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ｒｈｏＡ）（ジーンバンク登録番号：Ｌ２５０８０）〕遺伝子、
ｓｐａｒｃ前駆体（オステオネクチン）〔ｓｐａｒｃ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅ； ｏｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎ） （ＯＮ）； ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＭ−４０ （ジーンバンク登録番号：Ｊ０３０４０）〕遺伝子、
トロンボスポンジン２前駆体〔ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ２ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ（ジーンバンク登録番号：Ｌ１２３５０）〕遺伝子、及び
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質２〔ｖｅｒｓｉｃａｎ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ； ｌａｒｇｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ； ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２； ｇｌｉａｌ ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＧＨＡＰ） （ジーンバンク登録番号：Ｊ０２８１４）〕遺伝子
からなる群より選択された少なくとも８種の遺伝子に対応する核酸が固定されてなる、請求項１８又は１９記載のアレイ。 - 少なくとも２０種の遺伝子が固定されてなる、請求項２０記載のアレイ。
- 胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する８種以上の遺伝子から発現されるｍＲＮＡ又はその断片を検出するためのプライマー及び／又はプローブを含有してなる、胃癌の悪性度を評価するためのキット。
- プライマー及び／又はプローブが、核酸増幅法により検出するためのものである、請求項２２記載のキット。
- 該核酸増幅法がＲＴ−ＰＣＲ法である、請求項２３記載のキット。
- 胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する遺伝子が、
アポトーシスインヒビター サーバイビン〔ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｕｒｖｉｖｉｎ（ジーンバンク登録番号：Ｕ７５２８５）〕、
Ｉ型コラーゲン〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉ （ジーンバンク登録番号：Ｊ０３４６４）〕、
ＩＩＩ 型コラーゲン プロ−α−１鎖〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｐｒｏ−ａｌｐｈａ−１ （ジーンバンク登録番号：Ｘ１４４２０）〕、
フィブロネクチン前駆体（ＦＮ）〔ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ＦＮ）（ジーンバンク登録番号：Ｘ０２７６１）〕、
ＭＭＰ−１；コラゲナーゼ−１〔ＭＭＰ−１； ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−１（ジーンバンク登録番号：Ｘ５４９２５）〕、
ＭＭＰ−７；マトリリシン〔ＭＭＰ−７； ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ （ジーンバンク登録番号：Ｘ０７８１９）〕、
Ｕ−プラスミノーゲン活性化因子〔ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ＥＣ ３．４．２１４７３）； Ｕ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ （ＵＰＡ）（ジーンバンク登録番号：Ｘ０２４１９） 〕、
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体〔ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ； ＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ｆｒｏｍ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （Ｕ−ＰＡＲ）；ｍｏｎｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ＭＯ３； ＣＤ８７ ａｎｔｉｇｅｎ （ジーンバンク登録番号：Ｕ０９９３７）〕遺伝子、
アルファ−２−マクログロブリン前駆体〔ａｌｐｈａ−２−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ａｌｐｈａ−２−Ｍ） （ジーンバンク登録番号：Ｍ１１３１３）〕遺伝子、
大動脈タイプ平滑筋α−アクチン遺伝子、エキソン９〔ａｏｒｔｉｃ−ｔｙｐｅ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｌｐｈａ−ａｃｔｉｎ ｇｅｎｅ， ｅｘｏｎ ９（ジーンバンク登録番号：Ｍ３３２１６）〕、
β型血小板由来増殖因子受容体前駆体〔ｂｅｔａ ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｕｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ＰＤＧＦＲ−ｂｅｔａ）； ＣＤ１４０Ｂ ａｎｔｉｇｅｎ（ジーンバンク登録番号：Ｊ０３２７８）〕遺伝子、
ＢＩＧＨ３ （ジーンバンク登録番号：Ｍ７７３４９）遺伝子、
骨形成タンパク質１〔ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ １ （ＢＭｐ１） （ジーンバンク登録番号：Ｕ５０３３０）〕遺伝子、
ＶＩ型コラーゲンα−３鎖〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＶＩ ａｌｐｈａ−３（ジーンバンク登録番号：Ｘ５２０２２）〕遺伝子、
ＸＶＩＩＩ 型コラーゲンα鎖〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＸＶＩＩＩ ａｌｐｈａ （ジーンバンク登録番号：Ｌ２２５４８）〕遺伝子、
サイトカインｈｕｍｉｇ〔ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｈｕｍｉｇ； ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｎｏｋｉｎｅ （ＭＩＧ） （ジーンバンク登録番号：Ｘ７２７５５）〕遺伝子、
成長ホルモン依存性インスリン様増殖因子結合タンパク質〔ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ジーンバンク登録番号：Ｍ３５８７８）〕遺伝子、
肝癌由来増殖因子〔ｈｅｐａｔｏｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＨＤＧＦ） （ジーンバンク登録番号：Ｄ１６４３１）〕遺伝子、
インスリン様増殖因子結合タンパク質２〔ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ （ＩＧＦＢｐ２） （ジーンバンク登録番号：Ｘ１６３０２）〕遺伝子、
インテグリンα−３鎖〔ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ−３ ｃｈａｉｎ（ジーンバンク登録番号：Ｍ５９９１１）〕遺伝子、
白血球インターフェロン誘導性ペプチド〔ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ（ジーンバンク登録番号：Ｘ５７３５１）〕遺伝子、
転移関連ＭＴＡ１〔ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＭＴＡ１（ジーンバンク登録番号：Ｕ３５１１３）〕遺伝子、
ＭＭＰ−２；ゼラチナーゼＡ〔ＭＭＰ−２； ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ Ａ （ジーンバンク登録番号：Ｚ４８４８２）〕遺伝子、
ノッチ２ ノッチ ホモログ３〔Ｎｏｔｃｈ２ Ｎｏｔｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇ ３（ジーンバンク登録番号：Ｕ９７６６９）〕遺伝子、
プロト−オンコジーンｒｈｏＡ多剤耐性タンパク質〔ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｒｈｏＡ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ； ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ｒｈｏＡ）（ジーンバンク登録番号：Ｌ２５０８０）〕遺伝子、
ｓｐａｒｃ前駆体（オステオネクチン）〔ｓｐａｒｃ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅ； ｏｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎ） （ＯＮ）； ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＭ−４０ （ジーンバンク登録番号：Ｊ０３０４０）〕遺伝子、
トロンボスポンジン２前駆体〔ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ２ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ（ジーンバンク登録番号：Ｌ１２３５０）〕遺伝子、
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質２〔ｖｅｒｓｉｃａｎ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ； ｌａｒｇｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ； ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２； ｇｌｉａｌ ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＧＨＡＰ） （ジーンバンク登録番号：Ｊ０２８１４）〕遺伝子
からなる群より選択された少なくとも８種である、請求項２２〜２４いずれかに記載のキット。 - 胃癌の悪性度に応じて発現量が変化する遺伝子が、少なくとも２０種の遺伝子である、請求項２５記載のキット。
- 胃癌の悪性度に応じて発現量の変化する８種以上の遺伝子にコードされたポリペプチド又はその断片に対する抗体又はその断片を含有してなる、胃癌の悪性度を評価するためのキット。
- ポリペプチドが、
アポトーシスインヒビター サーバイビン〔ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｕｒｖｉｖｉｎ（ジーンバンク登録番号：Ｕ７５２８５）〕、
Ｉ型コラーゲン〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉ （ジーンバンク登録番号：Ｊ０３４６４）〕、
ＩＩＩ 型コラーゲン プロ−α−１鎖〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｐｒｏ−ａｌｐｈａ−１ （ジーンバンク登録番号：Ｘ１４４２０）〕、
フィブロネクチン前駆体（ＦＮ）〔ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ＦＮ）（ジーンバンク登録番号：Ｘ０２７６１）〕、
ＭＭＰ−１；コラゲナーゼ−１〔ＭＭＰ−１； ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−１（ジーンバンク登録番号：Ｘ５４９２５）〕、
ＭＭＰ−７；マトリリシン〔ＭＭＰ−７； ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ （ジーンバンク登録番号：Ｘ０７８１９）〕、
Ｕ−プラスミノーゲン活性化因子〔ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ＥＣ ３．４．２１４７３）； Ｕ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ （ＵＰＡ）（ジーンバンク登録番号：Ｘ０２４１９） 〕、
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体〔ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ； ＧＰＩ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ｆｒｏｍ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （Ｕ−ＰＡＲ）；ｍｏｎｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ＭＯ３； ＣＤ８７ ａｎｔｉｇｅｎ （ジーンバンク登録番号：Ｕ０９９３７）〕、アルファ−２−マクログロブリン前駆体〔ａｌｐｈａ−２−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ａｌｐｈａ−２−Ｍ） （ジーンバンク登録番号：Ｍ１１３１３）〕、
大動脈タイプ平滑筋α−アクチン遺伝子、エキソン９〔ａｏｒｔｉｃ−ｔｙｐｅ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｌｐｈａ−ａｃｔｉｎ ｇｅｎｅ， ｅｘｏｎ ９（ジーンバンク登録番号：Ｍ３３２１６）〕産物、
β型血小板由来増殖因子受容体前駆体〔ｂｅｔａ ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｕｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ＰＤＧＦＲ−ｂｅｔａ）； ＣＤ１４０Ｂ ａｎｔｉｇｅｎ（ジーンバンク登録番号：Ｊ０３２７８）〕、
ＢＩＧＨ３ （ジーンバンク登録番号：Ｍ７７３４９）、
骨形成タンパク質１〔ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ １ （ＢＭｐ１） （ジーンバンク登録番号：Ｕ５０３３０）〕、
ＶＩ型コラーゲンα−３鎖〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＶＩ ａｌｐｈａ−３（ジーンバンク登録番号：Ｘ５２０２２）〕、
ＸＶＩＩＩ 型コラーゲンα鎖〔ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ ＸＶＩＩＩ ａｌｐｈａ （ジーンバンク登録番号：Ｌ２２５４８）〕、
サイトカインｈｕｍｉｇ〔ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｈｕｍｉｇ； ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｎｏｋｉｎｅ （ＭＩＧ） （ジーンバンク登録番号：Ｘ７２７５５）〕、
成長ホルモン依存性インスリン様増殖因子結合タンパク質〔ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ジーンバンク登録番号：Ｍ３５８７８）〕、
肝癌由来増殖因子〔ｈｅｐａｔｏｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＨＤＧＦ） （ジーンバンク登録番号：Ｄ１６４３１）〕、
インスリン様増殖因子結合タンパク質２〔ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ （ＩＧＦＢｐ２） （ジーンバンク登録番号：Ｘ１６３０２）〕、
インテグリンα−３鎖〔ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ−３ ｃｈａｉｎ（ジーンバンク登録番号：Ｍ５９９１１）〕、
白血球インターフェロン誘導性ペプチド〔ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ（ジーンバンク登録番号：Ｘ５７３５１）〕、
転移関連ＭＴＡ１〔ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＭＴＡ１（ジーンバンク登録番号：Ｕ３５１１３）〕、
ＭＭＰ−２；ゼラチナーゼＡ〔ＭＭＰ−２； ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ Ａ （ジーンバンク登録番号：Ｚ４８４８２）〕、
ノッチ２ ノッチ ホモログ３〔Ｎｏｔｃｈ２ Ｎｏｔｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇ ３（ジーンバンク登録番号：Ｕ９７６６９）〕、
プロト−オンコジーンｒｈｏＡ多剤耐性タンパク質〔ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｒｈｏＡ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ； ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ｒｈｏＡ）（ジーンバンク登録番号：Ｌ２５０８０）〕、
ｓｐａｒｃ前駆体（オステオネクチン）〔ｓｐａｒｃ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅ； ｏｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎ） （ＯＮ）； ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＭ−４０ （ジーンバンク登録番号：Ｊ０３０４０）〕、
トロンボスポンジン２前駆体〔ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ２ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ（ジーンバンク登録番号：Ｌ１２３５０）〕、及び
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質２〔ｖｅｒｓｉｃａｎ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ； ｌａｒｇｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ； ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２； ｇｌｉａｌ ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＧＨＡＰ） （ジーンバンク登録番号：Ｊ０２８１４）〕
からなる群より選択された少なくとも８種のポリペプチドである、請求項２７記載のキット。 - ポリペプチドが、少なくとも２０種のポリペプチドである、請求項２８記載のキット。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000109982A JP2004248501A (ja) | 2000-04-11 | 2000-04-11 | 癌悪性度の評価方法 |
| PCT/JP2001/003031 WO2001077385A1 (en) | 2000-04-11 | 2001-04-09 | Method of detecting cancer |
| AU2001246862A AU2001246862A1 (en) | 2000-04-11 | 2001-04-09 | Method of detecting cancer |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000109982A JP2004248501A (ja) | 2000-04-11 | 2000-04-11 | 癌悪性度の評価方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004248501A true JP2004248501A (ja) | 2004-09-09 |
Family
ID=33018678
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000109982A Withdrawn JP2004248501A (ja) | 2000-04-11 | 2000-04-11 | 癌悪性度の評価方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2004248501A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009519460A (ja) * | 2005-12-16 | 2009-05-14 | エレクトロフォレティックス リミテッド | 結腸直腸癌の診断と予後 |
-
2000
- 2000-04-11 JP JP2000109982A patent/JP2004248501A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009519460A (ja) * | 2005-12-16 | 2009-05-14 | エレクトロフォレティックス リミテッド | 結腸直腸癌の診断と予後 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220307090A1 (en) | Method for predicting the response to chemotherapy in a patient suffering from or at risk of developing recurrent breast cancer | |
| JP4568716B2 (ja) | 遺伝子発現を測定するためのイントロンｒｎａの使用 | |
| US20110177971A1 (en) | Method for diagnosing the stage of a thyroid tumor | |
| HUE030164T2 (en) | Method for breast cancer recurrence prediction under endocrine treatment | |
| JP2005500832A (ja) | 乳癌患者の診断および予後 | |
| JP2006518602A5 (ja) | ||
| EP2390370A2 (en) | A method for predicting the response of a tumor in a patient suffering from or at risk of developing recurrent gynecologic cancer towards a chemotherapeutic agent | |
| ES2527062T3 (es) | Supervivencia y recurrencia del cáncer de próstata | |
| CN110468205A (zh) | 用于肿瘤分子亚型分型的方法和试剂盒 | |
| US20090156420A1 (en) | Method for detecting cancer | |
| EP4001431A1 (en) | Distinguishing marker gene set, method and kit each for distinguishing or classifying subtype of breast cancer | |
| WO2010034794A2 (en) | Methods and kits for the diagnosis and the staging of colorectal cancer | |
| WO2005076005A2 (en) | A method for classifying a tumor cell sample based upon differential expression of at least two genes | |
| US20160348183A1 (en) | Method for predicting the response and survival from chemotherapy in patients with breast cancer | |
| JP6638128B2 (ja) | 腎がんの悪性度の検査マーカー及び検査方法 | |
| JP2005270093A (ja) | 乳癌の術後予後予測に関与する遺伝子 | |
| KR20090052670A (ko) | 간세포암 진단용 조성물, 이를 이용한 간세포암 진단 키트및 항암제의 스크리닝 방법 | |
| US10301685B2 (en) | Method for predicting the benefit from inclusion of taxane in a chemotherapy regimen in patients with breast cancer | |
| JP5865241B2 (ja) | 肉腫の予後分子署名およびその使用 | |
| KR101803108B1 (ko) | 방광암의 비뇨기적 검출 방법 | |
| JP2004248501A (ja) | 癌悪性度の評価方法 | |
| JP2004248502A (ja) | 癌悪性度の評価方法 | |
| WO2001077385A1 (en) | Method of detecting cancer | |
| WO2010003772A1 (en) | Method for predicting adverse response to erythropoietin in breast cancer treatment | |
| US20110269636A1 (en) | Materials and methods for identifying patients at heighten risk for developing her2+ related brain tumors |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20040716 |