JP2004254591A - 抗酸菌鑑別方法及び鑑別用プローブ - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明の課題は、非定型抗酸菌に含まれるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＭＡＣ）のうち、従来検出できなかった変異株を検出可能とすることであり、さらには非定型抗酸菌症としてヒトから分離され、検出されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉのグループ分けを可能とする抗酸菌の鑑別方法を提供することである。
【解決手段】非定型抗酸菌に関し、ＭＡＣ又はＭ．ｋａｎｓａｓｉｉに存在する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする塩基配列のうち、特定の位置に生じる変異した塩基と相補的な塩基を含むプローブ機能を有するオリゴヌクレオチドを用いることによる。
【解決手段】非定型抗酸菌に関し、ＭＡＣ又はＭ．ｋａｎｓａｓｉｉに存在する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする塩基配列のうち、特定の位置に生じる変異した塩基と相補的な塩基を含むプローブ機能を有するオリゴヌクレオチドを用いることによる。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、非定型抗酸菌の鑑別方法に関する。具体的には、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ（以下「ＭＡＣ」という。）の変異株の検出、あるいはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ（以下、「Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ」という。）のグループ分けを可能とする鑑別方法に関し、さらには該鑑別方法に使用するプローブ機能を有するオリゴヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
我が国において長年「国民病」と呼ばれてきた結核は、生活環境衛生の改善や化学療法の進展の進展により患者数の激減をみたが、現在も全世界で年間８００万人の患者が発生し、毎年約３００万人が死亡している。また、最近では若年層における集団感染や外国人労働者の激増による流行も懸念されている。
【０００３】
一方、結核菌以外の非定型抗酸菌と一括呼称されている菌による感染症は増加傾向にあり、なかでもＭＡＣ感染症は極めて難治性であり米国ではＡＩＤＳ患者の主要な日和見感染として問題視されている。非定型抗酸菌は、現在のところ培養可能７３菌種・培養不能１菌種（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）が知られている。培養可能７３菌種のうち３８菌種がヒトに対して病原性を持つ。非定型抗酸菌症の病像には特異性が無く、また菌種により化学療法剤の効果が異なるため、早期診断・治療を行う為には菌種同定が必要である。そのために迅速・確実な非定型抗酸菌の菌種同定法が求められている。
【０００４】
一般に肺結核の鑑別は、臨床症状、病理組織学的所見からは極めて困難であるため、菌の検出・同定によってなされなければならない。
従来、結核菌・非定型抗酸菌の同定は培養法で行わなければならなかった。一般的には小川培地で分離培養し、培地上の性状（増殖速度・温度、コロニーの形状や色素産生など）、ナイアシンテスト、硝酸還元試験、耐熱性カタラーゼ試験、ツイーン８０水解試験、光発光試験などの生化学的性状で菌種の同定を行っていた。しかし抗酸菌は増殖が遅く、菌種同定までに約１ヶ月以上を要することが多いのが問題であった。
近年、分子生物学的手法を用いた迅速同定法が開発されてきており、結核菌をはじめとする抗酸菌の検出・同定にも、これらの技術が応用されている。
分離菌株の同定キットとしては、「アキュプローブ（商標名）」（極東製薬）、「ＤＤＨマイコバクテリウム極東（商標名）」が開発されているが、これらは菌の培養が必要なため検査までに２〜３週間が必要である。
【０００５】
一方、核酸増幅法を用いて喀痰等の臨床検体から培養操作を経ることなく結核菌等を検出・同定するキットとしては、「ＤＮＡプローブ『中外』−ＭＴＤ（商標名）」（中外製薬）、「アンプリコア マイコバクテリウム（商標名）」（ロシュ・ダイアグノスティックス社）などが開発されている。これらは、臨床検体から１〜２日で結核菌を検出・同定することができる。
【０００６】
「アンプリコア マイコバクテリウム」キットに含まれるプライマー（配列番号４、５）を使用すると、ヒトに病原性をもつ３８菌種のうち３１菌種の増幅が確認されており、非定型抗酸菌をＰＣＲで増幅するプライマーとして優れている。
ＫＹ１８（Ｆｏｒｗａｒｄ） ５’−ＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＧＡＡＡＧＧ−３’（配列番号４）
ＫＹ７５（Ｒｅｖｅｒｓｅ） ５’−ＧＣＣＣＧＴＡＴＣＧＣＣＣＧＣＡＣＧＣＴＣＡＣＡ−３’（配列番号５）
【０００７】
また、本キットは菌種同定には菌種特異プローブ（配列番号６〜８）を用いたマイクロプレートハイブリダイゼーション法を用いており、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）および非定型抗酸菌のＭ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの３菌種を同定することができる（非特許文献１）。
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ検出用プローブ：
５’−ＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＧＣＴＴＴＡＧＣＧＧＴ−３’（配列番号６）
Ｍ．ａｖｉｕｍ検出用プローブ：
５’−ＣＡＡＧＡＣＧＣＡＴＧＴＣＴＴＣＴＧＧＴＧ−３’（配列番号７）
Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ検出用プローブ：
５’−ＴＴＡＧＧＣＧＣＡＴＧＴＣＴＴＴＡＧＧＴ−３（配列番号８）
【０００８】
しかし、生化学的性状試験でＭＡＣと判定されている菌株でも、菌種特異プローブ領域に遺伝子変異を起こし、プローブとのハイブリダイゼーションが行われず検出することができないＭＡＣが存在する。
一方、非定型抗酸菌症としてヒトから分離されるＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ の存在も無視することはできない。「アンプリコア マイコバクテリウム」では検出することができない菌種であるため、迅速な同定法が求められている。
【０００９】
【非特許文献１】
アンプリコア（登録商標）マイコバクテリウム（ロッシュ・ダイアグノスティクス株式会社）添付文書（２００１年６月改訂）。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、非定型抗酸菌に含まれるＭＡＣのうち、従来検出できなかった変異株を検出可能とすることであり、さらには非定型抗酸菌症としてヒトから分離され、検出されたＭ．ｋａｎｓａｓｉｉのグループ分けを可能とする抗酸菌の鑑別方法を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、非定型抗酸菌に関し、ＭＡＣ又はＭ．ｋａｎｓａｓｉｉに存在する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする塩基配列のうち、特定の位置に変異が生じることに着目し、該変異位置の塩基と相補的な塩基を含むプローブ機能を有するオリゴヌクレオチドを用いることにより、上記課題を解決しうることを見出し、鋭意研究を重ねた結果本発明を完成した。
【００１２】
すなわち本発明は、
１．抗酸菌が保有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする塩基配列の変異を検出することを特徴する抗酸菌鑑別方法、
２．上記抗酸菌が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ又はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉである前項１に記載の抗酸菌鑑別方法、
３．１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列が配列番号１〜３のいずれかに表される塩基配列である前項１又は２に記載の抗酸菌鑑別方法、
４．塩基配列の変異を次の１）〜３）のいずれかに示す位置から検出する前項３に記載の抗酸菌鑑別方法；
１）配列番号１（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）で表される塩基配列の塩基の変異位置が１５４〜１７４位の間のいずれかである。
２）配列番号２（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）で表される塩基配列の塩基の変異位置が１３２〜１５２位の間のいずれかである。
３）配列番号３（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）で表される塩基配列の塩基の変異位置が４３０位を含む、
５．塩基配列の変異を次の１）〜３）のいずれかに示す位置から検出する前項３又は４に記載の抗酸菌鑑別方法；
１）配列番号１で表される塩基配列の塩基の変異位置が塩基位置１５４位、１５５位及び１６９位で示される塩基のうち、いずれか少なくとも１以上の塩基の変異を検出する。
２）配列番号２で表される塩基配列の塩基の変異位置が塩基位置１３３位、１３６位及び１４８位で示される塩基のうち、いずれか少なくとも１以上の塩基の変異を検出する。
３）配列番号３で表される塩基配列の塩基の変異位置が塩基位置４３０位で示される塩基の変異を検出する、
６．プローブ機能を有し、前項１〜５のいずれか１に記載する抗酸菌鑑別方法に使用する抗酸菌鑑別用オリゴヌクレオチド、
７．生化学的性状試験により抗酸菌に属すると判定された菌株について、該菌が保有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部にハイブリッド形成しうるオリゴヌクレオチドであって、以下の１）〜４）に表される配列からなるオリゴヌクレオチドの群より選択され、プローブ機能を有するオリゴヌクレオチド；
１）１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の変異位置に相補的な塩基を含んでなるオリゴヌクレオチド。
２）１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列が配列番号１〜３のいずれかに表され、該塩基配列の変異の位置に相補的な塩基を含んでなるオリゴヌクレオチド。
３）上記２）の変異位置が請求項４で示される位置に存在する場合に、該変異の位置に相補的な塩基を含んでなるオリゴヌクレオチド。
４）上記２）の塩基配列が請求項５で示される位置に存在する場合に、該変異の位置に相補的な塩基を含んでなるオリゴヌクレオチド。
５）上記１）〜４）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドの塩基数が、５〜５０のいずれかであるオリゴヌクレオチド。
６）配列番号９〜１２のいずれかで表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
７）上記１）〜６）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
８）上記１）〜７）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
９）上記１）〜８）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、
８．前項６又は７に記載のオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１のオリゴヌクレオチドを固相に固定化し、該オリゴヌクレオチドと被検物質をハイブリダイズさせることにより行う抗酸菌鑑別方法、
９．前項１〜５又は８に記載の鑑別方法を使用することによるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘの変異株の検出方法、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉのグルーピング方法又はこれらの菌株の系統樹解析方法、
１０．前項１〜５、８又は９に記載の鑑別方法に使用する試薬及び／又は試薬キット、
１１．前項６又は７に記載のオリゴヌクレオチドから選択されるいずれかのオリゴヌクレオチドを含む試薬及び／又は試薬キット、からなる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の抗酸菌鑑別方法は、非定型抗酸菌に適用することができる。具体的には、市販の測定キット（非特許文献１）で検出可能であった結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）および非定型抗酸菌のＭ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅを除くＭＡＣ変異株の検出をすることができ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉについては他の測定キットでＭ．ｋａｎｓａｓｉｉと判定された菌株を２つにグループ分けすることができる。さらに、本発明の抗酸菌鑑別方法を使用することにより、これらの菌株の系統解析を容易かつ迅速に行うことができる。
【００１４】
本発明において、抗酸菌に属する各菌種の標準株が有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする塩基配列は、Ｍ．ａｖｉｕｍについてはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．ＡＪ５３６０３７（配列番号１）、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅについては同Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｘ５２９２７（配列番号２）、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉについては同Ａｃｃ． Ｎｏ．ＡＦ４８０６０１（配列番号３）に示される配列を意味する。
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを鑑別同定しうるプローブは、配列番号６に表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができる（非特許文献１）。また、Ｍ．ａｖｉｕｍを鑑別同定しうるプローブは配列番号７に、及びＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅを鑑別同定しうるプローブは配列番号８に表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができる（非特許文献１）。
【００１５】
本発明の鑑別方法により、喀痰等の臨床試料からＭＡＣの変異株を検出することができる。この方法によると、生化学的性状試験により抗酸菌に属すると判定された菌株であっても、従来同定が不可能であったＭＡＣの変異株を検出することができる。また、他の公知の方法により判別されたＭ．ｋａｎｓａｓｉｉについて、これらの菌株が保有する変異の箇所を検出することで、ＭＡＣ変異株の検出およびＭ．ｋａｎｓａｓｉｉのグループ分けをすることが可能となる。
【００１６】
さらに、これら変異株の塩基配列を特許出願中（特願２００１−３３３７０４）に示した通り、抗酸菌各種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子について属間、種間、個体間等に存在し得る塩基配列の相違を考慮して、特定された領域に相当する領域で作製したデータベースと共に臨床株の塩基配列を解析することにより、変異株の検出およびグループ分けが可能となる。具体的には、抗酸菌が保有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のうち約５００塩基対の部分をＰＣＲ等の増幅手段により増幅し、その塩基配列を解読して遺伝子系統解析を行い、系統樹を作成する。系統樹は、好ましくは２−パラメーター法を用いたＮ−Ｊ法にて作成し、作成された系統樹はブースストラップ法を用いて評価することができる。
【００１７】
（鑑別方法）
本発明の抗酸菌の鑑別方法とは、抗酸菌が保有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする塩基配列の変異、好適には該１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のうち、約５００塩基対の部分に存在する変異を検出することによるものである。具体的には、配列番号１〜３のいずれかに記載の塩基配列から変異を検出することによる。
【００１８】
たとえば、ＭＡＣでは少なくとも１２以上の変異株の存在が確認された。これらの変異株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする塩基配列は、Ｍ．ａｖｉｕｍ標準株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする塩基配列（配列番号１）又はＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ標準株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする塩基配列（配列番号２）に表される配列とは複数箇所において相違が認められた。本発明の鑑別方法は、これらの変異を検出することにより行うことができる。該変異の検出は、変異された塩基を含む配列を検出することにより行うことができ、より具体的には、該配列とハイブリダイズするプローブを使用することにより行うことができる。
【００１９】
より確実に変異株を鑑別するには、配列番号１に記載の配列のうち、塩基位置が１５４〜１７４位に存在する変異を含む配列を検出することにより行うことができる。配列番号１に記載された配列と変異株の配列は、１５４位、１５５位及び１６９位のいずれかの塩基が少なくとも１以上変異している傾向が認められる。同様に、配列番号２に記載の配列のうち、塩基位置が１３２〜１５２位に存在する変異を含む配列を検出することによっても行うことができる。配列番号２に記載された配列と変異株の配列は、１３３位、１３６位及び１４８位のいずれかの塩基が少なくとも１以上変異している傾向が認められる。
【００２０】
一方、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ標準株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする塩基配列（配列番号３）の配列について４３０番目にあたる塩基ＣがＧに変異している株が存在するということが確認された。この１塩基の違いを見極めることでＭ．ｋａｎｓａｓｉｉを２つのグループに分けることが可能であると考えられた。本発明の鑑別は、この変異を検出する方法により行うことができる。
【００２１】
該変異の検出は、ＭＡＣ変異株の検出と同様に変異された塩基を含む配列を検出すること、例えば該変異された塩基を含む配列とハイブリダイズしうるプローブを用いて行うことができる。
本発明の鑑別は、目的とする菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域のＤＮＡとプローブとハイブリダイゼーションさせる前に該対象ＤＮＡを増幅させておくことが好ましい。
遺伝子領域の増幅方法は、公知の方法、例えばポリメラーゼ・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０：１３５０−１３５４，１９８５）やＮＡＳＢＡ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ 法、Ｎａｔｕｒｅ， ３５０，９１−９２，１９９１）及びＬＡＭＰ法（特開２００１−２４２１６９号公報）等により行うことができ、好適には、非特許文献１に記載する方法により行うことができる。
【００２２】
（プローブの作成）
プローブ機能を有するオリゴヌクレオチドは、自体公知の方法により製造することができ、例えば化学的に合成することができる。あるいは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し、上記のような塩基配列で構成されるように改変し、あるいは連結することも可能である。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置（アプライドバイオシステムズ社製 Ｅｘｐｅｄｉｔｅ Ｍｏｄｅｌ ８９０９ ＤＮＡ合成機）等を用いて合成することができる。
本発明のプローブ機能を有するオリゴヌクレオチドの塩基数は、５〜５０であり、好ましくは８〜３０であり、より好ましくは１５〜２５である。
【００２３】
また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異させたオリゴヌクレオチドの合成法も、自体公知の製法を使用することができる。例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはＰＣＲ法を単独または適宜組み合わせて、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年；［ラボマニュアル遺伝子工学］、村松正實編、丸善株式会社、１９８８年；［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］、Ｅｈｒｌｉｃｈ， ＨＥ．編、ストックトンプレス、１９８９年等に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２１９：６６６）を利用することができる。
【００２４】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は一般に知られたものを選択することができる。その一例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．６、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ中で一次洗浄し、次いで、約６５℃において０．１×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳで二次洗浄といった条件があげられる。
【００２５】
（ハイブリダイゼーション）
ハイブリダイゼーションは、ドットブロットハイブリダイゼーション、マイクロプレートハイブリダイゼーション、ＤＮＡチップ等の公知の方法あるいは今後開発される方法を適用して行うことができる。
例えば、該対象ＤＮＡの５’末端をビオチン等で標識し、マイクロウェルに固相化された各菌株に特異的なプローブ機能を有するオリゴヌクレオチドと、該該対象ＤＮＡとをハイブリダイズさせて該該対象ＤＮＡを固相に固定化し、ビオチンを発色させることにより、プローブ特異的な菌種を検出することができる。
【００２６】
本発明は、抗酸菌鑑別方法、プローブ機能を有するオリゴヌクレオチドの他、該オリゴヌクレオチドを含む試薬及び／又は試薬キットにも及ぶものである。
【００２７】
【実施例】
本発明の理解を深めるために、以下に実施例を示して本発明を説明するが、本件特許発明はこれら実施例の内容に何ら限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１）結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの検出
【００２９】
抗酸菌遺伝子の増幅
（ア）検体からのＤＮＡ抽出
「アンプリコア マイコバクテリウム」（ロシュ・ダイアグノスティックス社）の添付文書（非特許文献１）に従って行った。
１）喀痰等の体液は、等量のＮＡＬＣ溶解液（０．０５Ｍ Ｎａ３ｃｉｔｒａｔｅ，２％ＮａＯＨ）を加え撹拌し、室温にて可溶化する。
２）ＰＢＳを適当量加え、３，０００ｇ以上で２０分以上遠心、上清を除去する。
３）沈渣にＰＢＳ１ｍｌを加える。
４）検体洗浄液＊１５００μｌに上記前処理済み検体１００μｌを加える。
５）１３，０００ｇで１０分間遠心し、上清を除去する。
６）沈渣に溶菌試薬＊１１００μｌを加えて良く撹拌し、６０℃で４５分間インキュベートする。
７）中和試薬＊１１００μｌを加えてＤＮＡ抽出液とする。
８）菌株の場合は、コロニーを適当量のＰＢＳに懸濁し、前処理済み検体として、上述４）の操作から実施する。
＊１：アンプリコアマイコバクテリウム用検体前処理用試薬セットＩＩ
【００３０】
（イ）ＤＮＡの増幅
非特許文献１に従って行った。増幅は配列番号４及び５に記載するプライマーを用いた。
【００３１】
上記キットに含まれるアンプリミックス５０μｌにＤＮＡ抽出液５０μｌを加え、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９６００（ＰＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ製）を用いて、５０℃、１０分保温後、９８℃２０秒で変性、６２℃２０秒でアニーリング、７２℃４５秒で伸長を２サイクル実施後、９４℃２０秒で変性、６２℃２０秒でアニーリング、７２℃４５秒で伸長を４１サイクル行い、抗酸菌１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域を増幅した。
【００３２】
（ウ）増幅産物の検出
非特許文献１に従って行った。検出用に、配列番号６〜８に記載の塩基配列を有するプローブを用いた。
１）ＰＣＲ増幅産物１００μｌに変性試薬１００μｌを加え、室温で１０分間インキュベートする。
２）Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓマイクロプレートウェル、Ｍ．ａｖｉｕｍマイクロプレートウェル、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅマイクロプレートウェルの各ウェルにマイコバクテリウムハイブリダイゼーション緩衝液１００μｌを加える。
３）変性試薬を加えたＰＣＲ増幅産物を２５μｌ加える。
４）３７℃で９０分間インキュベートする。
５）洗浄液３５０−４５０μｌで４回、各ウェルを洗浄する。
６）各ウェルにアビジン−ＨＲＰコンジュゲート１００μｌを加え、３７℃で１５分間インキュベートする。
７）洗浄液３５０−４５０μｌで４回、各ウェルを洗浄する。
８）各ウェルに基質試薬１００μｌを加え、室温、暗所で１０分間インキュベートする。
９）各ウェルに停止試薬１００μｌを加え、波長４５０ｎｍでの吸光度を測定する。
【００３３】
（エ）「アンプリコア マイコバクテリウム」キットによる判定
１）吸光度が０．３５以上の場合を陽性とする。
２）吸光度が０．３５未満の場合を陰性とする。
【００３４】
（実施例２）増幅された抗酸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の同定方法
実施例１に記載の方法によるＰＣＲ増幅産物は、変性試薬を加えた状態で２００μｌである。そのうちプレートハイブリダイゼーションには、１００μｌ使用する。残りの１００μｌをプローブとのハイブリダイゼーションに使用する。
【００３５】
（ア）ＰＣＲ増幅産物の確認
上記増幅産物を、実施例１に記載の方法で検査したときに陰性と判定された菌種について、特異プローブを用いて検出を試みた。
１）変性試薬を加えたＰＣＲ増幅産物１０μｌに１Ｎ−ＨＣｌを２〜５μｌ加え、室温にて１０〜２０分間インキュベートし、中和した。
２）中和したＰＣＲ増幅産物を３％アガロースゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射し目的とする約５８０ｂｐのバンドを検出する。
【００３６】
（イ）特異プローブによる検出
１）ＭＡＣの変異株の検出用プローブの構築
変異株ＭＡＣの検出のために、配列番号６〜８に記載の検出用プローブ領域（Ｍ．ａｖｉｕｍ ＤＳＭ ４４１５６検出用プローブｎｔ１５４−１７４、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ ＡＴＣＣ １５９８５検出用プローブｎｔ１３３−１５２）に認められた塩基配列に基づき、１５〜２５ｍｅｒ程度の長さでプローブを設計した。
ＭＡＣＸ１（５’−ＴＴＡＧＡＣＧＣＡＴＧＴＣＴＴＴＴＧＧＴ−３’）（配列番号９）
ＭＡＣＸ２（５’−ＴＡＡＧＡＣＧＣＡＴＧＴＣＴＴＴＴＧＧＴ−３’）（配列番号１０）
【００３７】
２）Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ のグループ分けにはＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ＡＴＣＣ １２４７８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域（配列番号３）の４３０番目の塩基がＧであるかＣであるか見分けることが可能なように１５〜２５ｍｅｒ程度の長さでプローブを設計した。
ＫＡＮ１（５’−ＧＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＣＴＣＧＧＡＴＴＧ−３’）（配列番号１１）
ＫＡＮ２（５’−ＧＴＣＣＧＧＧＴＴＧＴＣＴＣＧＧＡＴＴＧ−３’）（配列番号１２）
上記プローブを使用して、実施例１で得たＰＣＲ増幅産物とハイブリダイゼーションを行い該当する菌種を検出した。
【００３８】
（実施例３） 臨床分離株を用いた結果
（ア）生化学的性状試験でＭＡＣと判定され、非特許文献１に記載の方法でＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの３菌種の結果が陰性となった臨床分離株１０株について、配列番号９及び１０に記載のプローブを使用して本発明の鑑別方法により同定した。
その結果、次の１）及び２）の結果が得られた。
１）９株はＭＡＣＸ１プローブと特異的にハイブリダイズし、ＭＡＣ変異株として同定することが可能であった。
２）１株はＭＡＣＸ２プローブと特異的にハイブリダイズし、ＭＡＣ変異株として同定することが可能であった。
【００３９】
（イ）生化学的性状試験でＭ．ｋａｎｓａｓｉｉと判定された臨床分離株４株について、配列番号１１及び１２に記載のプローブを使用して本発明の鑑別方法によりＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ のグループ分けを実施した。
その結果、次の１）及び２）の結果が得られた。
１）１株はＫＡＮ１プローブと特異的にハイブリダイズし、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ ＡＴＣＣ １２４７８株と同一のグループであると確認した。
２）３株はＫＡＮ２プローブと特異的にハイブリダイズし、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ ＡＴＣＣ １２４７８株とは異なるグループであると確認した。
【００４０】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の鑑別方法により、生化学的性状試験ではＭＡＣと判定されたものの、非特許文献１に記載の方法で検出することができなかったＭＡＣの同定が可能となった。これにより、非定型抗酸菌症の大半を占めるＭＡＣの検出がより正確で確実に行うことが期待できる。また、同様に本発明の鑑別方法によりＭ．ｋａｎｓａｓｉｉを２グループに分類することができ、臨床的に新しい知見が得られる可能性が期待できる。さらに、本発明の鑑別方法により、非定型抗酸菌の系統樹解析を行うことも可能となる。
【００４１】
【配列表】
【発明が属する技術分野】
本発明は、非定型抗酸菌の鑑別方法に関する。具体的には、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ（以下「ＭＡＣ」という。）の変異株の検出、あるいはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ（以下、「Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ」という。）のグループ分けを可能とする鑑別方法に関し、さらには該鑑別方法に使用するプローブ機能を有するオリゴヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
我が国において長年「国民病」と呼ばれてきた結核は、生活環境衛生の改善や化学療法の進展の進展により患者数の激減をみたが、現在も全世界で年間８００万人の患者が発生し、毎年約３００万人が死亡している。また、最近では若年層における集団感染や外国人労働者の激増による流行も懸念されている。
【０００３】
一方、結核菌以外の非定型抗酸菌と一括呼称されている菌による感染症は増加傾向にあり、なかでもＭＡＣ感染症は極めて難治性であり米国ではＡＩＤＳ患者の主要な日和見感染として問題視されている。非定型抗酸菌は、現在のところ培養可能７３菌種・培養不能１菌種（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）が知られている。培養可能７３菌種のうち３８菌種がヒトに対して病原性を持つ。非定型抗酸菌症の病像には特異性が無く、また菌種により化学療法剤の効果が異なるため、早期診断・治療を行う為には菌種同定が必要である。そのために迅速・確実な非定型抗酸菌の菌種同定法が求められている。
【０００４】
一般に肺結核の鑑別は、臨床症状、病理組織学的所見からは極めて困難であるため、菌の検出・同定によってなされなければならない。
従来、結核菌・非定型抗酸菌の同定は培養法で行わなければならなかった。一般的には小川培地で分離培養し、培地上の性状（増殖速度・温度、コロニーの形状や色素産生など）、ナイアシンテスト、硝酸還元試験、耐熱性カタラーゼ試験、ツイーン８０水解試験、光発光試験などの生化学的性状で菌種の同定を行っていた。しかし抗酸菌は増殖が遅く、菌種同定までに約１ヶ月以上を要することが多いのが問題であった。
近年、分子生物学的手法を用いた迅速同定法が開発されてきており、結核菌をはじめとする抗酸菌の検出・同定にも、これらの技術が応用されている。
分離菌株の同定キットとしては、「アキュプローブ（商標名）」（極東製薬）、「ＤＤＨマイコバクテリウム極東（商標名）」が開発されているが、これらは菌の培養が必要なため検査までに２〜３週間が必要である。
【０００５】
一方、核酸増幅法を用いて喀痰等の臨床検体から培養操作を経ることなく結核菌等を検出・同定するキットとしては、「ＤＮＡプローブ『中外』−ＭＴＤ（商標名）」（中外製薬）、「アンプリコア マイコバクテリウム（商標名）」（ロシュ・ダイアグノスティックス社）などが開発されている。これらは、臨床検体から１〜２日で結核菌を検出・同定することができる。
【０００６】
「アンプリコア マイコバクテリウム」キットに含まれるプライマー（配列番号４、５）を使用すると、ヒトに病原性をもつ３８菌種のうち３１菌種の増幅が確認されており、非定型抗酸菌をＰＣＲで増幅するプライマーとして優れている。
ＫＹ１８（Ｆｏｒｗａｒｄ） ５’−ＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＧＡＡＡＧＧ−３’（配列番号４）
ＫＹ７５（Ｒｅｖｅｒｓｅ） ５’−ＧＣＣＣＧＴＡＴＣＧＣＣＣＧＣＡＣＧＣＴＣＡＣＡ−３’（配列番号５）
【０００７】
また、本キットは菌種同定には菌種特異プローブ（配列番号６〜８）を用いたマイクロプレートハイブリダイゼーション法を用いており、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）および非定型抗酸菌のＭ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの３菌種を同定することができる（非特許文献１）。
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ検出用プローブ：
５’−ＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＧＣＴＴＴＡＧＣＧＧＴ−３’（配列番号６）
Ｍ．ａｖｉｕｍ検出用プローブ：
５’−ＣＡＡＧＡＣＧＣＡＴＧＴＣＴＴＣＴＧＧＴＧ−３’（配列番号７）
Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ検出用プローブ：
５’−ＴＴＡＧＧＣＧＣＡＴＧＴＣＴＴＴＡＧＧＴ−３（配列番号８）
【０００８】
しかし、生化学的性状試験でＭＡＣと判定されている菌株でも、菌種特異プローブ領域に遺伝子変異を起こし、プローブとのハイブリダイゼーションが行われず検出することができないＭＡＣが存在する。
一方、非定型抗酸菌症としてヒトから分離されるＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ の存在も無視することはできない。「アンプリコア マイコバクテリウム」では検出することができない菌種であるため、迅速な同定法が求められている。
【０００９】
【非特許文献１】
アンプリコア（登録商標）マイコバクテリウム（ロッシュ・ダイアグノスティクス株式会社）添付文書（２００１年６月改訂）。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、非定型抗酸菌に含まれるＭＡＣのうち、従来検出できなかった変異株を検出可能とすることであり、さらには非定型抗酸菌症としてヒトから分離され、検出されたＭ．ｋａｎｓａｓｉｉのグループ分けを可能とする抗酸菌の鑑別方法を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、非定型抗酸菌に関し、ＭＡＣ又はＭ．ｋａｎｓａｓｉｉに存在する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする塩基配列のうち、特定の位置に変異が生じることに着目し、該変異位置の塩基と相補的な塩基を含むプローブ機能を有するオリゴヌクレオチドを用いることにより、上記課題を解決しうることを見出し、鋭意研究を重ねた結果本発明を完成した。
【００１２】
すなわち本発明は、
１．抗酸菌が保有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする塩基配列の変異を検出することを特徴する抗酸菌鑑別方法、
２．上記抗酸菌が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ又はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉである前項１に記載の抗酸菌鑑別方法、
３．１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列が配列番号１〜３のいずれかに表される塩基配列である前項１又は２に記載の抗酸菌鑑別方法、
４．塩基配列の変異を次の１）〜３）のいずれかに示す位置から検出する前項３に記載の抗酸菌鑑別方法；
１）配列番号１（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）で表される塩基配列の塩基の変異位置が１５４〜１７４位の間のいずれかである。
２）配列番号２（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）で表される塩基配列の塩基の変異位置が１３２〜１５２位の間のいずれかである。
３）配列番号３（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）で表される塩基配列の塩基の変異位置が４３０位を含む、
５．塩基配列の変異を次の１）〜３）のいずれかに示す位置から検出する前項３又は４に記載の抗酸菌鑑別方法；
１）配列番号１で表される塩基配列の塩基の変異位置が塩基位置１５４位、１５５位及び１６９位で示される塩基のうち、いずれか少なくとも１以上の塩基の変異を検出する。
２）配列番号２で表される塩基配列の塩基の変異位置が塩基位置１３３位、１３６位及び１４８位で示される塩基のうち、いずれか少なくとも１以上の塩基の変異を検出する。
３）配列番号３で表される塩基配列の塩基の変異位置が塩基位置４３０位で示される塩基の変異を検出する、
６．プローブ機能を有し、前項１〜５のいずれか１に記載する抗酸菌鑑別方法に使用する抗酸菌鑑別用オリゴヌクレオチド、
７．生化学的性状試験により抗酸菌に属すると判定された菌株について、該菌が保有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部にハイブリッド形成しうるオリゴヌクレオチドであって、以下の１）〜４）に表される配列からなるオリゴヌクレオチドの群より選択され、プローブ機能を有するオリゴヌクレオチド；
１）１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の変異位置に相補的な塩基を含んでなるオリゴヌクレオチド。
２）１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列が配列番号１〜３のいずれかに表され、該塩基配列の変異の位置に相補的な塩基を含んでなるオリゴヌクレオチド。
３）上記２）の変異位置が請求項４で示される位置に存在する場合に、該変異の位置に相補的な塩基を含んでなるオリゴヌクレオチド。
４）上記２）の塩基配列が請求項５で示される位置に存在する場合に、該変異の位置に相補的な塩基を含んでなるオリゴヌクレオチド。
５）上記１）〜４）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドの塩基数が、５〜５０のいずれかであるオリゴヌクレオチド。
６）配列番号９〜１２のいずれかで表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
７）上記１）〜６）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
８）上記１）〜７）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
９）上記１）〜８）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、
８．前項６又は７に記載のオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１のオリゴヌクレオチドを固相に固定化し、該オリゴヌクレオチドと被検物質をハイブリダイズさせることにより行う抗酸菌鑑別方法、
９．前項１〜５又は８に記載の鑑別方法を使用することによるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘの変異株の検出方法、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉのグルーピング方法又はこれらの菌株の系統樹解析方法、
１０．前項１〜５、８又は９に記載の鑑別方法に使用する試薬及び／又は試薬キット、
１１．前項６又は７に記載のオリゴヌクレオチドから選択されるいずれかのオリゴヌクレオチドを含む試薬及び／又は試薬キット、からなる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の抗酸菌鑑別方法は、非定型抗酸菌に適用することができる。具体的には、市販の測定キット（非特許文献１）で検出可能であった結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）および非定型抗酸菌のＭ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅを除くＭＡＣ変異株の検出をすることができ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉについては他の測定キットでＭ．ｋａｎｓａｓｉｉと判定された菌株を２つにグループ分けすることができる。さらに、本発明の抗酸菌鑑別方法を使用することにより、これらの菌株の系統解析を容易かつ迅速に行うことができる。
【００１４】
本発明において、抗酸菌に属する各菌種の標準株が有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする塩基配列は、Ｍ．ａｖｉｕｍについてはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．ＡＪ５３６０３７（配列番号１）、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅについては同Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｘ５２９２７（配列番号２）、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉについては同Ａｃｃ． Ｎｏ．ＡＦ４８０６０１（配列番号３）に示される配列を意味する。
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを鑑別同定しうるプローブは、配列番号６に表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができる（非特許文献１）。また、Ｍ．ａｖｉｕｍを鑑別同定しうるプローブは配列番号７に、及びＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅを鑑別同定しうるプローブは配列番号８に表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができる（非特許文献１）。
【００１５】
本発明の鑑別方法により、喀痰等の臨床試料からＭＡＣの変異株を検出することができる。この方法によると、生化学的性状試験により抗酸菌に属すると判定された菌株であっても、従来同定が不可能であったＭＡＣの変異株を検出することができる。また、他の公知の方法により判別されたＭ．ｋａｎｓａｓｉｉについて、これらの菌株が保有する変異の箇所を検出することで、ＭＡＣ変異株の検出およびＭ．ｋａｎｓａｓｉｉのグループ分けをすることが可能となる。
【００１６】
さらに、これら変異株の塩基配列を特許出願中（特願２００１−３３３７０４）に示した通り、抗酸菌各種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子について属間、種間、個体間等に存在し得る塩基配列の相違を考慮して、特定された領域に相当する領域で作製したデータベースと共に臨床株の塩基配列を解析することにより、変異株の検出およびグループ分けが可能となる。具体的には、抗酸菌が保有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のうち約５００塩基対の部分をＰＣＲ等の増幅手段により増幅し、その塩基配列を解読して遺伝子系統解析を行い、系統樹を作成する。系統樹は、好ましくは２−パラメーター法を用いたＮ−Ｊ法にて作成し、作成された系統樹はブースストラップ法を用いて評価することができる。
【００１７】
（鑑別方法）
本発明の抗酸菌の鑑別方法とは、抗酸菌が保有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする塩基配列の変異、好適には該１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のうち、約５００塩基対の部分に存在する変異を検出することによるものである。具体的には、配列番号１〜３のいずれかに記載の塩基配列から変異を検出することによる。
【００１８】
たとえば、ＭＡＣでは少なくとも１２以上の変異株の存在が確認された。これらの変異株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする塩基配列は、Ｍ．ａｖｉｕｍ標準株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする塩基配列（配列番号１）又はＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ標準株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする塩基配列（配列番号２）に表される配列とは複数箇所において相違が認められた。本発明の鑑別方法は、これらの変異を検出することにより行うことができる。該変異の検出は、変異された塩基を含む配列を検出することにより行うことができ、より具体的には、該配列とハイブリダイズするプローブを使用することにより行うことができる。
【００１９】
より確実に変異株を鑑別するには、配列番号１に記載の配列のうち、塩基位置が１５４〜１７４位に存在する変異を含む配列を検出することにより行うことができる。配列番号１に記載された配列と変異株の配列は、１５４位、１５５位及び１６９位のいずれかの塩基が少なくとも１以上変異している傾向が認められる。同様に、配列番号２に記載の配列のうち、塩基位置が１３２〜１５２位に存在する変異を含む配列を検出することによっても行うことができる。配列番号２に記載された配列と変異株の配列は、１３３位、１３６位及び１４８位のいずれかの塩基が少なくとも１以上変異している傾向が認められる。
【００２０】
一方、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ標準株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする塩基配列（配列番号３）の配列について４３０番目にあたる塩基ＣがＧに変異している株が存在するということが確認された。この１塩基の違いを見極めることでＭ．ｋａｎｓａｓｉｉを２つのグループに分けることが可能であると考えられた。本発明の鑑別は、この変異を検出する方法により行うことができる。
【００２１】
該変異の検出は、ＭＡＣ変異株の検出と同様に変異された塩基を含む配列を検出すること、例えば該変異された塩基を含む配列とハイブリダイズしうるプローブを用いて行うことができる。
本発明の鑑別は、目的とする菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域のＤＮＡとプローブとハイブリダイゼーションさせる前に該対象ＤＮＡを増幅させておくことが好ましい。
遺伝子領域の増幅方法は、公知の方法、例えばポリメラーゼ・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０：１３５０−１３５４，１９８５）やＮＡＳＢＡ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ 法、Ｎａｔｕｒｅ， ３５０，９１−９２，１９９１）及びＬＡＭＰ法（特開２００１−２４２１６９号公報）等により行うことができ、好適には、非特許文献１に記載する方法により行うことができる。
【００２２】
（プローブの作成）
プローブ機能を有するオリゴヌクレオチドは、自体公知の方法により製造することができ、例えば化学的に合成することができる。あるいは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し、上記のような塩基配列で構成されるように改変し、あるいは連結することも可能である。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置（アプライドバイオシステムズ社製 Ｅｘｐｅｄｉｔｅ Ｍｏｄｅｌ ８９０９ ＤＮＡ合成機）等を用いて合成することができる。
本発明のプローブ機能を有するオリゴヌクレオチドの塩基数は、５〜５０であり、好ましくは８〜３０であり、より好ましくは１５〜２５である。
【００２３】
また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異させたオリゴヌクレオチドの合成法も、自体公知の製法を使用することができる。例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはＰＣＲ法を単独または適宜組み合わせて、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年；［ラボマニュアル遺伝子工学］、村松正實編、丸善株式会社、１９８８年；［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］、Ｅｈｒｌｉｃｈ， ＨＥ．編、ストックトンプレス、１９８９年等に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２１９：６６６）を利用することができる。
【００２４】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は一般に知られたものを選択することができる。その一例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．６、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ中で一次洗浄し、次いで、約６５℃において０．１×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳで二次洗浄といった条件があげられる。
【００２５】
（ハイブリダイゼーション）
ハイブリダイゼーションは、ドットブロットハイブリダイゼーション、マイクロプレートハイブリダイゼーション、ＤＮＡチップ等の公知の方法あるいは今後開発される方法を適用して行うことができる。
例えば、該対象ＤＮＡの５’末端をビオチン等で標識し、マイクロウェルに固相化された各菌株に特異的なプローブ機能を有するオリゴヌクレオチドと、該該対象ＤＮＡとをハイブリダイズさせて該該対象ＤＮＡを固相に固定化し、ビオチンを発色させることにより、プローブ特異的な菌種を検出することができる。
【００２６】
本発明は、抗酸菌鑑別方法、プローブ機能を有するオリゴヌクレオチドの他、該オリゴヌクレオチドを含む試薬及び／又は試薬キットにも及ぶものである。
【００２７】
【実施例】
本発明の理解を深めるために、以下に実施例を示して本発明を説明するが、本件特許発明はこれら実施例の内容に何ら限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１）結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの検出
【００２９】
抗酸菌遺伝子の増幅
（ア）検体からのＤＮＡ抽出
「アンプリコア マイコバクテリウム」（ロシュ・ダイアグノスティックス社）の添付文書（非特許文献１）に従って行った。
１）喀痰等の体液は、等量のＮＡＬＣ溶解液（０．０５Ｍ Ｎａ３ｃｉｔｒａｔｅ，２％ＮａＯＨ）を加え撹拌し、室温にて可溶化する。
２）ＰＢＳを適当量加え、３，０００ｇ以上で２０分以上遠心、上清を除去する。
３）沈渣にＰＢＳ１ｍｌを加える。
４）検体洗浄液＊１５００μｌに上記前処理済み検体１００μｌを加える。
５）１３，０００ｇで１０分間遠心し、上清を除去する。
６）沈渣に溶菌試薬＊１１００μｌを加えて良く撹拌し、６０℃で４５分間インキュベートする。
７）中和試薬＊１１００μｌを加えてＤＮＡ抽出液とする。
８）菌株の場合は、コロニーを適当量のＰＢＳに懸濁し、前処理済み検体として、上述４）の操作から実施する。
＊１：アンプリコアマイコバクテリウム用検体前処理用試薬セットＩＩ
【００３０】
（イ）ＤＮＡの増幅
非特許文献１に従って行った。増幅は配列番号４及び５に記載するプライマーを用いた。
【００３１】
上記キットに含まれるアンプリミックス５０μｌにＤＮＡ抽出液５０μｌを加え、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９６００（ＰＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ製）を用いて、５０℃、１０分保温後、９８℃２０秒で変性、６２℃２０秒でアニーリング、７２℃４５秒で伸長を２サイクル実施後、９４℃２０秒で変性、６２℃２０秒でアニーリング、７２℃４５秒で伸長を４１サイクル行い、抗酸菌１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域を増幅した。
【００３２】
（ウ）増幅産物の検出
非特許文献１に従って行った。検出用に、配列番号６〜８に記載の塩基配列を有するプローブを用いた。
１）ＰＣＲ増幅産物１００μｌに変性試薬１００μｌを加え、室温で１０分間インキュベートする。
２）Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓマイクロプレートウェル、Ｍ．ａｖｉｕｍマイクロプレートウェル、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅマイクロプレートウェルの各ウェルにマイコバクテリウムハイブリダイゼーション緩衝液１００μｌを加える。
３）変性試薬を加えたＰＣＲ増幅産物を２５μｌ加える。
４）３７℃で９０分間インキュベートする。
５）洗浄液３５０−４５０μｌで４回、各ウェルを洗浄する。
６）各ウェルにアビジン−ＨＲＰコンジュゲート１００μｌを加え、３７℃で１５分間インキュベートする。
７）洗浄液３５０−４５０μｌで４回、各ウェルを洗浄する。
８）各ウェルに基質試薬１００μｌを加え、室温、暗所で１０分間インキュベートする。
９）各ウェルに停止試薬１００μｌを加え、波長４５０ｎｍでの吸光度を測定する。
【００３３】
（エ）「アンプリコア マイコバクテリウム」キットによる判定
１）吸光度が０．３５以上の場合を陽性とする。
２）吸光度が０．３５未満の場合を陰性とする。
【００３４】
（実施例２）増幅された抗酸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の同定方法
実施例１に記載の方法によるＰＣＲ増幅産物は、変性試薬を加えた状態で２００μｌである。そのうちプレートハイブリダイゼーションには、１００μｌ使用する。残りの１００μｌをプローブとのハイブリダイゼーションに使用する。
【００３５】
（ア）ＰＣＲ増幅産物の確認
上記増幅産物を、実施例１に記載の方法で検査したときに陰性と判定された菌種について、特異プローブを用いて検出を試みた。
１）変性試薬を加えたＰＣＲ増幅産物１０μｌに１Ｎ−ＨＣｌを２〜５μｌ加え、室温にて１０〜２０分間インキュベートし、中和した。
２）中和したＰＣＲ増幅産物を３％アガロースゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射し目的とする約５８０ｂｐのバンドを検出する。
【００３６】
（イ）特異プローブによる検出
１）ＭＡＣの変異株の検出用プローブの構築
変異株ＭＡＣの検出のために、配列番号６〜８に記載の検出用プローブ領域（Ｍ．ａｖｉｕｍ ＤＳＭ ４４１５６検出用プローブｎｔ１５４−１７４、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ ＡＴＣＣ １５９８５検出用プローブｎｔ１３３−１５２）に認められた塩基配列に基づき、１５〜２５ｍｅｒ程度の長さでプローブを設計した。
ＭＡＣＸ１（５’−ＴＴＡＧＡＣＧＣＡＴＧＴＣＴＴＴＴＧＧＴ−３’）（配列番号９）
ＭＡＣＸ２（５’−ＴＡＡＧＡＣＧＣＡＴＧＴＣＴＴＴＴＧＧＴ−３’）（配列番号１０）
【００３７】
２）Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ のグループ分けにはＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ＡＴＣＣ １２４７８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域（配列番号３）の４３０番目の塩基がＧであるかＣであるか見分けることが可能なように１５〜２５ｍｅｒ程度の長さでプローブを設計した。
ＫＡＮ１（５’−ＧＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＣＴＣＧＧＡＴＴＧ−３’）（配列番号１１）
ＫＡＮ２（５’−ＧＴＣＣＧＧＧＴＴＧＴＣＴＣＧＧＡＴＴＧ−３’）（配列番号１２）
上記プローブを使用して、実施例１で得たＰＣＲ増幅産物とハイブリダイゼーションを行い該当する菌種を検出した。
【００３８】
（実施例３） 臨床分離株を用いた結果
（ア）生化学的性状試験でＭＡＣと判定され、非特許文献１に記載の方法でＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの３菌種の結果が陰性となった臨床分離株１０株について、配列番号９及び１０に記載のプローブを使用して本発明の鑑別方法により同定した。
その結果、次の１）及び２）の結果が得られた。
１）９株はＭＡＣＸ１プローブと特異的にハイブリダイズし、ＭＡＣ変異株として同定することが可能であった。
２）１株はＭＡＣＸ２プローブと特異的にハイブリダイズし、ＭＡＣ変異株として同定することが可能であった。
【００３９】
（イ）生化学的性状試験でＭ．ｋａｎｓａｓｉｉと判定された臨床分離株４株について、配列番号１１及び１２に記載のプローブを使用して本発明の鑑別方法によりＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ のグループ分けを実施した。
その結果、次の１）及び２）の結果が得られた。
１）１株はＫＡＮ１プローブと特異的にハイブリダイズし、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ ＡＴＣＣ １２４７８株と同一のグループであると確認した。
２）３株はＫＡＮ２プローブと特異的にハイブリダイズし、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ ＡＴＣＣ １２４７８株とは異なるグループであると確認した。
【００４０】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の鑑別方法により、生化学的性状試験ではＭＡＣと判定されたものの、非特許文献１に記載の方法で検出することができなかったＭＡＣの同定が可能となった。これにより、非定型抗酸菌症の大半を占めるＭＡＣの検出がより正確で確実に行うことが期待できる。また、同様に本発明の鑑別方法によりＭ．ｋａｎｓａｓｉｉを２グループに分類することができ、臨床的に新しい知見が得られる可能性が期待できる。さらに、本発明の鑑別方法により、非定型抗酸菌の系統樹解析を行うことも可能となる。
【００４１】
【配列表】
Claims (11)
- 抗酸菌が保有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする塩基配列の変異を検出することを特徴とする抗酸菌鑑別方法。
- 上記抗酸菌が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ又はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉである請求項１に記載の抗酸菌鑑別方法。
- １６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列が配列番号１〜３のいずれかに表される塩基配列である請求項１又は２に記載の抗酸菌鑑別方法。
- 塩基配列の変異を次の１）〜３）のいずれかに示す位置から検出する請求項３に記載の抗酸菌鑑別方法；
１）配列番号１（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）で表される塩基配列の塩基の変異位置が１５４〜１７４位の間のいずれかである。
２）配列番号２（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）で表される塩基配列の塩基の変異位置が１３２〜１５２位の間のいずれかである。
３）配列番号３（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）で表される塩基配列の塩基の変異位置が４３０位を含む。 - 塩基配列の変異を次の１）〜３）のいずれかに示す位置から検出する請求項３又は４に記載の抗酸菌鑑別方法；
１）配列番号１で表される塩基配列の塩基の変異位置が塩基位置１５４位、１５５位及び１６９位で示される塩基のうち、いずれか少なくとも１以上の塩基の変異を検出する。
２）配列番号２で表される塩基配列の塩基の変異位置が塩基位置１３３位、１３６位及び１４８位で示される塩基のうち、いずれか少なくとも１以上の塩基の変異を検出する。
３）配列番号３で表される塩基配列の塩基の変異位置が塩基位置４３０位で示される塩基の変異を検出する。 - プローブ機能を有し、請求項１〜５のいずれか１に記載する抗酸菌鑑別方法に使用する抗酸菌鑑別用オリゴヌクレオチド。
- 生化学的性状試験により抗酸菌に属すると判定された菌株について、該菌が保有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部にハイブリッド形成しうるオリゴヌクレオチドであって、以下の１）〜４）に表される配列からなるオリゴヌクレオチドの群より選択され、プローブ機能を有するオリゴヌクレオチド；
１）１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の変異位置に相補的な塩基を含んでなるオリゴヌクレオチド。
２）１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列が配列番号１〜３のいずれかに表され、該塩基配列の変異の位置に相補的な塩基を含んでなるオリゴヌクレオチド。
３）上記２）の変異位置が請求項４で示される位置に存在する場合に、該変異の位置に相補的な塩基を含んでなるオリゴヌクレオチド。
４）上記２）の塩基配列が請求項５で示される位置に存在する場合に、該変異の位置に相補的な塩基を含んでなるオリゴヌクレオチド。
５）上記１）〜４）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドの塩基数が、５〜５０のいずれかであるオリゴヌクレオチド。
６）配列番号９〜１２のいずれかで表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
７）上記１）〜６）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
８）上記１）〜７）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
９）上記１）〜８）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。 - 請求項６又は７に記載のオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１のオリゴヌクレオチドを固相に固定化し、該オリゴヌクレオチドと被検物質をハイブリダイズさせることにより行う抗酸菌鑑別方法。
- 請求項１〜５又は８に記載の鑑別方法を使用することによるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘの変異株の検出方法、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉのグルーピング方法又はこれらの菌株の系統解析方法。
- 請求項１〜５、８又は９に記載の鑑別方法に使用する試薬及び／又は試薬キット。
- 請求項６又は７に記載のオリゴヌクレオチドから選択されるいずれかのオリゴヌクレオチドを含む試薬及び／又は試薬キット。
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