JP2004344029A - 遺伝子破壊微生物およびそれを用いたピリミジンヌクレオシド化合物の製造方法 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
【課題】煩雑なデアミナーゼ失活処理を施さずに４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物の製造法を提供する。
【解決手段】シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両遺伝子を持つ微生物において、シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ遺伝子を同時に欠損した微生物を用いて４位にアミノ基を有するピリミジンヌクレオシド化合物を製造する。
【効果】本発明によれば煩雑なデアミナーゼ失活処理を施さずに４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体をもつヌクレオシド化合物が効率的に製造できる。さらに、該遺伝子を相同組換えにより破壊した菌株は、野生株と何ら変わらない増殖性を示し、工業的に有利な高濃度培養も容易に実施できる。
【選択図】なし
【解決手段】シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両遺伝子を持つ微生物において、シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ遺伝子を同時に欠損した微生物を用いて４位にアミノ基を有するピリミジンヌクレオシド化合物を製造する。
【効果】本発明によれば煩雑なデアミナーゼ失活処理を施さずに４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体をもつヌクレオシド化合物が効率的に製造できる。さらに、該遺伝子を相同組換えにより破壊した菌株は、野生株と何ら変わらない増殖性を示し、工業的に有利な高濃度培養も容易に実施できる。
【選択図】なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は医薬品等の合成原料として有用なピリミジンヌクレオシド化合物の製造方法に関する。シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両遺伝子を同時に欠損した微生物に、４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を合成する活性を有する酵素を発現させた微生物を用いるピリミジンヌクレオシド化合物の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を製造する方法としては、乳酸菌のヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩを用いる方法が特開２００２−１７３９３号公報で開示されている。該公報では、精製酵素を用いているため菌体反応による生成物の分解等については開示されていない。
【０００３】
大腸菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼを用いる方法が欧州特許公開第１２５４９５９Ａ２号公報で開示されている。該公報によれば、４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物の製造する際に、４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体あるいは対応するヌクレオシド化合物が脱アミノ化されて反応収率が低減する事があり、デアミナーゼを選択的に失活させる処理を施す方法が開示されているが、処理が煩雑であり工業的に必ずしも有利な方法ではない。
【０００４】
上述の方法においては、上記デアミナーゼのみが失活し、４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を合成する活性を有する酵素は失活しない条件を見出さなければならず、大腸菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ以外の酵素を用いる場合には必ずしも利用できる方法とは限らない。
【０００５】
更に、医薬品としてヌクレオシド化合物を製造する場合、その類縁体が製品に混入する事は当該ヌクレオシド化合物を原料として更にヌクレオチド等を製造するに際して大変な問題である。該公報では完全にデアミナーゼ活性は消失できず、わずかな副生物を除くために精製工程が複雑化する問題も含んでいる。
【０００６】
該公報において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属のシチジンデアミナーゼ欠損株を用いることで脱アミノ化を防ぐ方法も開示されている。Ｂａｃｉｌｌｕｓはシチジンデアミナーゼしか持たないために単独の欠損で対応するヌクレオシドを製造できるが、工業的に製造するためには高密度培養が難しかったり、遺伝子操作系が煩雑などの問題を抱えていた。
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−１７３９３号公報
【特許文献２】欧州特許公開第１２５４９５９Ａ２号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
以上のとおり、デアミナーゼを欠損させることが４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を製造するに際して有効であることが示唆されていたが、シトシンデアミナーゼとシチジンデアミナーゼの両遺伝子を同時に欠損させた場合の効果は知られておらず、また、従来知られていた技術から単純には予測することもできない。
また、シトシンデアミナーゼとシチジンデアミナーゼの両遺伝子を同時に欠損させたとしても、必ずしも上記遺伝子産物のみが該酵素活性をもつとは必ずしも明らかになっていなかった。
【０００９】
以上のような状況に鑑み、本発明の目的は、煩雑なデアミナーゼ失活処理を施さずに４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物の製造法を提供する事である。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上述の課題を解決するために鋭意検討した結果、シトシンデアミナーゼとシチジンデアミナーゼの両方の遺伝子を突然変異の誘発や相同組換えにより同時に欠損した微生物に、４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を合成する活性を有する酵素を発現させる事で、煩雑なデアミナーゼの失活処理を施さず対応するヌクレオシド化合物を効率的に製造できることを見出した。
【００１１】
特にシトシンデアミナーゼとシチジンデアミナーゼの両方の遺伝子を相同組換えを用いて破壊し該遺伝子以外の遺伝子を欠損していない微生物を用いれば、従来の技術では不可能であった微量のデアミノ体をも含まない純度の高いヌクレオシド化合物を煩雑な精製工程を採用することなく得ることが出来ることを見出した。
【００１２】
即ち本発明は以下のとおりである。
［１］ シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両遺伝子を本来有する微生物であって、且つ該シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ遺伝子を同時に欠損した微生物。
［２］ 前記微生物が大腸菌である［１］記載の微生物。
［３］ シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両遺伝子を相同組換えにより破壊し、該遺伝子以外の遺伝子を欠損していない［１］または［２］記載の微生物。
［４］ ４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を合成する活性を有する酵素が発現している［１］から［３］の何れか一項に記載の微生物。
［５］ 前記微生物の処理物を用いて４位にアミノ基を有するピリミジンヌクレオシド化合物を製造する方法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明において、シトシンデアミナーゼとは、シトシンの４位のアミノ基を脱離し、ウラシルとアンモニアを生成させる機能を有する酵素である。該酵素はシトシン以外にも５−メチルシトシンも基質となることが知られている。該酵素は、酵母、細菌に存在することが知られている。
【００１４】
本発明において、シトシンデアミナーゼ遺伝子とは、シトシンデアミナーゼをコードする遺伝子であり、例えば大腸菌であれば、遺伝子記号ｃｏｄＡと表記され、塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｓ５６９０３（コード領域は塩基番号１３０−１４１３）で示されている。
【００１５】
本発明において、シチジンデアミナーゼとは、シチジンの４位のアミノ基を脱離し、ウリジンとアンモニアを生成させる機能を有する酵素である。該酵素はシチジン以外にもデオキシシチジン、５−ハロゲン化シチジン、５−または６−アザシチジン、シトシンアラビノシドも基質となることが知られている。該酵素は、広く生物界に分布し、哺乳類、鳥類、魚類などの組織、酵母、細菌に存在する。
【００１６】
本発明において、シチジンデアミナーゼ遺伝子とは、シチジンデアミナーゼをコードする遺伝子であり、例えば大腸菌であれば、遺伝子記号ｃｄｄと表記され、塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｘ６３１４４（コード領域は塩基番号６７−１０５９）で示されている。
【００１７】
本発明において、シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両遺伝子を本来有する微生物とは、遺伝子操作等の人為的な方法で両遺伝子を当該微生物に導入したのではなく、生物種として原初的にその染色体ＤＮＡ等に両遺伝子を有することを意味する。
【００１８】
本発明においてシトシンデアミナーゼとシチジンデアミナーゼの両遺伝子を同時に欠損した微生物とは、上述のシトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両遺伝子を本来有する微生物を更に該シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両遺伝子を同時に何らかの手段により欠損された微生物を指す。本発明の微生物は上記の性質を保持している限りその由来、種類は特に制限されない。
本発明の微生物としては代表的には上記の性質を有し且つ分類学的に大腸菌に分類される微生物が例示できる。
【００１９】
本発明の微生物は、例えば自然界から元々存在していた両遺伝子を何らかの理由で欠いている微生物を単離したり、突然変異の誘発により該遺伝子が発現しない変異株を取得する方法や、トランスポゾンを用いて該遺伝子周辺を脱落させる方法、更には相同組換えによる該遺伝子のみを欠損させる方法が利用できるが両遺伝子を欠損できればその方法は特に制限されない。
【００２０】
突然変異の誘発やトランスポゾンなどにより目的遺伝子以外の遺伝子を欠損させる事で微生物の増殖性が悪くなることがある。また、遺伝子組換えにより特定の酵素を発現させる場合、各種変異を導入された株より野生株の方が高い発現量を示すことが多い。更に、野生株のように増殖性がよいと高密度培養が容易となり、工業的には有利である。そのため相同組換えによる特定の遺伝子のみを欠失させる方法が好適な方法といえる。
【００２１】
本発明において、４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体とは、ピリミジン骨格を有し４位にアミノ基を持つ化合物であり、例えばシトシン、５−アザシトシン、５−メチルシトシン、５−フルオロシトシンなどを例示できる。
【００２２】
本発明において、４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体に対応するヌクレオシド化合物とは、リボースやデオキシリボースなどの糖類と４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体とがＮ−グルコシド結合により結合した化合物であり、例えばシチジン、デオキシシチジン、５―アザシチジン、５−フルオロシチジン、５−メチルシデオキシチジンなどを例示できる。
【００２３】
本発明において、４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を合成する活性とは、リン酸化糖あるいはヌクレオシド類と上述の４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から上述の対応するヌクレオシド化合物を合成するる反応を促進する触媒としての機能を指している。
【００２４】
よって、本発明における４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を合成する活性を有する酵素とは、上述の活性を有する酵素を指す。例えば、リン酸化糖と４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を合成できるヌクレオシドホスホリラーゼやヌクレオシド類と４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を合成できるヌクレオシドリボシルトランスフェラーゼ、ヌクレオシドデオキシリボシルトランスフェラーゼなどを挙げる事ができる。
【００２５】
リン酸化糖と４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を合成できるヌクレオシドホスホリラーゼとは、リン酸化糖と４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を合成する酵素を指しており、この要件を満たす限り動物、植物、微生物の何れの起源であっても構わない。このようなヌクレオシドホスホリラーゼの具体例としては、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に含まれる微生物の従来のプリンヌクレオシドホスホリラーゼとして知られている酵素で前記活性も有するものを好適な例として挙げることができる。具体的な例として、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のプリンヌクレオシドホスホリラーゼのＤＮＡ塩基配列を配列番号：８に、該塩基配列より翻訳されるアミノ酸配列を配列番号：９に例示した。また、近年の遺伝子工学の進歩により塩基配列の一部を失活、挿入、置換によりアミノ酸配列を改変することが容易となった。かかる技術水準に鑑み、該塩基配列の一部を、所望とする酵素活性に影響を及ぼさない範囲内、例えば酵素活性を維持または向上できる範囲内で、改変してアミノ酸配列を改変したものも本発明のシトシンヌクレオシドホスホリラーゼに包含されるものとする。例えば、配列番号：９に示したアミノ酸配列に、目的とする酵素活性に影響を及ぼさない範囲内で２〜３個のアミノ酸の欠失、置換または付加が行われたものや、配列番号：８の塩基配列に目的とする酵素活性に影響を及ぼさず、かつ、その相補配列がストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る範囲内での欠失、置換または付加等の変異を生じさせた塩基配列によってコードされたアミノ酸配列を有するものを用いることができる。
【００２６】
本発明における本発明の微生物を用いて４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を製造する方法は、概略以下のとおりである。
即ち、４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体を基質として、対応するヌクレオシド化合物を合成できる酵素を発現している微生物であって、シトシンデアミナーゼとシチジンデアミナーゼの両遺伝子を本来有する微生物であって且つ該シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ遺伝子を同時に欠損した微生物の菌体、培養液それらの処理物を用い、水性媒体中で適切なｐＨや温度などの反応条件を選んで反応させることにより行われる。この場合、水性媒体とは水或いは水を主成分としてｐＨ緩衝能を有するような溶媒である。
【００２７】
反応の条件は通常はｐＨ４〜１１、好ましくは７〜１０、温度１０〜８０℃、好ましくは３０〜５０℃の範囲で行うことができる。反応の時間は任意であるが１時間から２０時間程度で行うことができる。
その他反応に際しては、基質や触媒として用いる菌体が沈殿しない程度に攪拌できれば十分である。
【００２８】
本発明において、微生物の菌体、培養液それらの処理物とは、微生物の菌体或いは培養液中の菌体を超音波、浸透圧ショック等で破壊して得られたもの、また、菌体及び該破壊物を固定化担体等で固定化したもの、或いは破壊物等から精製された酵素などが含まれる。
【００２９】
反応の際に基質として用いられる４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体の使用量は通常は０．１〜５０（重量）％、好ましくは５〜２０（重量）％の範囲で行うことができる。
【００３０】
基質に対する微生物の菌体、培養液それらの処理物の使用量は、反応が進行すればどのような量でもかまわないが、基質・生成物の分解活性を持たないため相当過剰に添加しても反応収率を低下させることはない。触媒濃度は通常０．１（重量）％〜１０（重量）％程度で行うことができる。
【００３１】
以上のようにして得られた反応液より４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体に対応するヌクレオシド化合物を採取する方法は、水性媒体に対する該誘導体と生成物の溶解度差を利用したり、イオン交換や吸着樹脂を用いる方法で行うことができる。例えば、反応液に活性炭を加え反応液中の菌体などを濾過により除き濾液を濃縮、晶析する事で高純度のヌクレオシドを得ることができる。反応によってデアミノ体の含有量は従来の技術に比して格段に押さえられているので、デアミノ体の除去を目的とした煩雑な精製は不要である。
【００３２】
【実施例】
以下に実施例で本発明を説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら制限されるものではない。
【００３３】
［分析法］
生成したヌクレオシド化合物はすべて高速液体クロマトグラフィーにより定量した。分析条件は以下による。
カラム；Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＭＧ−５ ４．６×２５０ｍｍ（野村化学）
カラム温度；４０℃
ポンプ流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
検出；ＵＶ２５４ｎｍ、
溶離液；５０ｍＭリン酸１カリウム：メタノール＝８：１（Ｖ／Ｖ）
【００３４】
実施例１（シトシンデアミナーゼ欠損株の作製）
エシェリヒア・コリＫ−１２ Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）（ＡＴＣＣはアメリカンタイプカルチャーコレクションの意味）を５０ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で一夜培養した後集菌し、リゾチーム１ｍｇ／ｍｌを含む溶菌液で溶菌した。溶菌液をフェノール処理した後、通常の方法によりエタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させた。生じたＤＮＡの沈殿は、ガラス棒に巻き付けて回収した後、洗浄し、ＰＣＲに用いた。
【００３５】
ＰＣＲ用のプライマーには、エシェリヒア・コリの既知のシトシンパーミアーゼ（以下ｃｏｄＢと表記する）をコードする塩基配列から既知のシトシンデアミナーゼ（以下ｃｏｄＡと表記する）をコードする塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ６３６５６）に基づいて設計した配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（北海道システム・サイエンス株式会社に委託して合成した）を用いた。これらのプライマーの５’末端付近及び３’末端付近には、それぞれＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を有する。
【００３６】
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した前記大腸菌染色体ＤＮＡ ６ｎｇ／μｌ及びプライマー各３μＭを含む０．１ｍｌのＰＣＲ反応液を用いて、変性：９６℃、１分間、アニーリング：５５℃、１分間、伸長反応：７４℃、１分間からなる反応サイクルを、３０サイクルの条件でＰＣＲを行った。
【００３７】
上記ＰＣＲ反応産物及び温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（Ａ ｓｅｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ／−ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｎｅｔ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒｓ ａｎｄ ｉｎ ａｎ ｉｓｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ＧＥＮＥ ２４１（２０００）１８５−１９１）配列番号：３を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αを３０℃にて形質転換した。形質転換株をクロラムフェニコール（Ｃｍ）１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で培養し、Ｃｍ耐性となった形質転換株を得た。得られたコロニーをＣｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。
このプラスミドをＰｓｔＩで消化し、大きなフラグメントを回収してライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換した。形質転換株を、クロラムフェニコール（Ｃｍ）１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で培養し、Ｃｍ耐性となった形質転換株を得た。得られたコロニーをＣｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。設計通りの大きさであったプラスミドを前記Ｗ３１１０株に３０℃で形質転換し、Ｃｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体を寒天プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をＣｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。
さらにもう一度、４２℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンから通常のプラスミド抽出操作を行なってもプラスミドが検出されないことを確認した。
【００３８】
次に上記クローンをＬＢ寒天プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した後に、ＬＢ液体培地（３ｍｌ／試験管）に接種し、４２℃で３〜４時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈し、ＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれをＬＢ寒天プレートとＣｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、ＬＢ寒天プレートにのみ生育するＣｍ感受性のクローンを選んだ。
【００３９】
これらの目的クローンをＣｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍＬで３７℃、２０時間培養し菌体を１００００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により分離した。集菌体を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍＬに懸濁した。
活性測定は１０ｍＭのシトシン、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液１ｍＬに菌体懸濁液０．１ｍＬを加え５０℃で１ｈｒ保温し、１０倍に希釈して液体クロマトグラフィーにて分析した。
得られた１０クローンのうち２クローンがｃｏｄＡ活性を完全に欠いており、ウラシルを検出できなかった。この菌株をＷ３１１０／ｃｏｄＡ欠損株と命名した。
【００４０】
実施例２（シトシンデアミナーゼ・シチジンデアミナーゼ欠損株の作製）
ＰＣＲ用のプライマーには、エシェリヒア・コリの既知のシチジンデアミナーゼ（以下ｃｄｄと表記する）をコードするｃｄｄ遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｘ６３１４４基づいて設計した配列番号：４及び５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（北海道システム・サイエンス株式会社に委託して合成した）を用いた。これらのプライマーの５’末端付近及び３’末端付近には、それぞれＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を有する。
【００４１】
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した前記大腸菌染色体ＤＮＡ ６ｎｇ／μｌ及びプライマー各３μＭを含む０．１ｍｌのＰＣＲ反応液を用いて、変性：９６℃、１分間、アニーリング：５５℃、１分間、伸長反応：７４℃、１分間からなる反応サイクルを、３０サイクルの条件でＰＣＲを行った。
【００４２】
上記反応産物及び実施例１で調製した温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換した。形質転換株を、クロラムフェニコール（Ｃｍ）１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で培養し、Ｃｍ耐性となった形質転換株を得た。得られたコロニーをＣｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。
このプラスミドをＢｇｌＩＩで消化し末端をＢＫＬキット（タカラ酒造（株））により埋めてライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換した。形質転換株を、クロラムフェニコール（Ｃｍ）１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で培養し、Ｃｍ耐性となった形質転換株を得た。得られたコロニーをＣｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。
このプラスミドがＢｇｌＩＩで消化されない事を確認し、このプラスミドをＷ３１１０／ｄｏｃＡ欠損株に３０℃で形質転換し、Ｃｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体を寒天プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をＣｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。
さらにもう一度、４２℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質中に持たないことを確認した。
【００４３】
次に上記クローンをＬＢ寒天プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した後に、ＬＢ液体培地（３ｍｌ／試験管）に接種し、４２℃で３〜４時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈し、ＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれをＬＢ寒天プレートとＣｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、ＬＢ寒天プレートにのみ生育するＣｍ感受性のクローンを選んだ。
【００４４】
これらの目的クローンをＣｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍＬで３７℃、２０時間培養し菌体を１００００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により分離した。集菌体を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍＬに懸濁し、ｃｄｄの活性を測定した。
活性測定は１０ｍＭのシチジン、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液１ｍＬに菌体懸濁液０．１ｍＬを加え５０℃で１ｈｒ保温し、１０倍に希釈して液体クロマトグラフィーにて分析した。
得られた１０クローンのうち８クローンがｃｄｄ活性を完全に欠いておりウリジンを検出できなかった。この菌株をＷ３１１０／ｃｏｄＡ・ｃｄｄ欠損株と命名した。
【００４５】
実施例３（シトシンホスホリラーゼ生産菌の調製）
ＰＣＲ用のプライマーには、エシェリヒア・コリの既知のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（以下ＰＮＰと表記する）をコードするｄｅｏＤ遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＥ０００５０８（コード領域は塩基番号１１５３１−１２２５０）に基づいて設計した配列番号：６及び７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（北海道システム・サイエンス株式会社に委託して合成した）を用いた。これらのプライマーの５’末端付近及び３’末端付近には、それぞれＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を有する。
【００４６】
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した前記大腸菌染色体ＤＮＡ ６ｎｇ／μｌ及びプライマー各３μＭを含む０．１ｍｌのＰＣＲ反応液を用いて、変性：９６℃、１分間、アニーリング：５５℃、１分間、伸長反応：７４℃、１分間からなる反応サイクルを、３０サイクルの条件でＰＣＲを行った。
【００４７】
上記ＰＣＲ反応産物及びプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造（株））を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換した。形質転換株を、アンピシリン（Ａｍ）５０μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。
【００４８】
このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを、ｐＵＣ−ＰＮＰ７３と命名した。ｐＵＣ−ＰＮＰ７３をＷ３１１０／ｃｏｄＡ・ｃｄｄ欠損株に形質転換した。
得られた形質転換体をＡｍ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬで３７℃・１晩振とう培養した。培養液を１３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、得られた菌体を２０ｍＬの１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。懸濁液を再度１３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、得られた菌体を２ｍＬの１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）に懸濁し、−２０℃にて凍結保存した。
【００４９】
実施例４（デオキシシチジンの合成）
２０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２０ｍＭのシトシン（和光純薬製、特級）、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、実施例３で得られた菌体液０．１ｍｌからなる反応液１．０ｍｌを５０℃で２０時間反応させた。反応液を希釈した後分析したところ、１０．７ｍＭのデオキシシチジンが生成していたが、デオキシウリジン、ウラシルは全く検出できなかった。
【００５０】
実施例５（５−フルオロデオキシシチジンの合成）
２０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２０ｍＭの２−フルオロシトシン（ＳＩＧＭＡ）、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、実施例３で得られた菌体液０．１ｍｌからなる反応液１．０ｍｌを５０℃で２０時間反応させた。反応液を希釈した後分析したところ、１０．７ｍＭの２−フルオロデオキシシチジンが生成していたが、２−フルオロデオキシウリジン、２−フルオロウラシルは全く検出できなかった。
【００５１】
【発明の効果】
本発明によれば従来のような煩雑なデアミナーゼ失活処理を施さずに、シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両遺伝子を本来有する微生物であって、且つ該シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ遺伝子を同時に欠損した微生物を用いて４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物が効率的に製造できる。
【００５２】
更に相同組換えによる該遺伝子の破壊株は、完全にシトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両酵素活性を消失している。係る微生物を用いて反応を行うことにより得られるヌクレオシド化合物には微量のデアミノ体も検出されず、本発明の製造方法により製造されるヌクレオシド化合物は、従来の製造法で得られたヌクレオシド化合物が有していた煩雑な精製工程を大幅に簡略化出来るため、医薬品或いは医薬品製造中間体として特に優れている。
【００５３】
さらに、該遺伝子を相同組換えにより破壊した菌株は、野生株と何ら変わらない増殖性を示し、工業的に有利な高濃度培養も容易に実施できる。
【００５４】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は医薬品等の合成原料として有用なピリミジンヌクレオシド化合物の製造方法に関する。シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両遺伝子を同時に欠損した微生物に、４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を合成する活性を有する酵素を発現させた微生物を用いるピリミジンヌクレオシド化合物の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を製造する方法としては、乳酸菌のヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ−ＩＩを用いる方法が特開２００２−１７３９３号公報で開示されている。該公報では、精製酵素を用いているため菌体反応による生成物の分解等については開示されていない。
【０００３】
大腸菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼを用いる方法が欧州特許公開第１２５４９５９Ａ２号公報で開示されている。該公報によれば、４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物の製造する際に、４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体あるいは対応するヌクレオシド化合物が脱アミノ化されて反応収率が低減する事があり、デアミナーゼを選択的に失活させる処理を施す方法が開示されているが、処理が煩雑であり工業的に必ずしも有利な方法ではない。
【０００４】
上述の方法においては、上記デアミナーゼのみが失活し、４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を合成する活性を有する酵素は失活しない条件を見出さなければならず、大腸菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ以外の酵素を用いる場合には必ずしも利用できる方法とは限らない。
【０００５】
更に、医薬品としてヌクレオシド化合物を製造する場合、その類縁体が製品に混入する事は当該ヌクレオシド化合物を原料として更にヌクレオチド等を製造するに際して大変な問題である。該公報では完全にデアミナーゼ活性は消失できず、わずかな副生物を除くために精製工程が複雑化する問題も含んでいる。
【０００６】
該公報において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属のシチジンデアミナーゼ欠損株を用いることで脱アミノ化を防ぐ方法も開示されている。Ｂａｃｉｌｌｕｓはシチジンデアミナーゼしか持たないために単独の欠損で対応するヌクレオシドを製造できるが、工業的に製造するためには高密度培養が難しかったり、遺伝子操作系が煩雑などの問題を抱えていた。
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−１７３９３号公報
【特許文献２】欧州特許公開第１２５４９５９Ａ２号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
以上のとおり、デアミナーゼを欠損させることが４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を製造するに際して有効であることが示唆されていたが、シトシンデアミナーゼとシチジンデアミナーゼの両遺伝子を同時に欠損させた場合の効果は知られておらず、また、従来知られていた技術から単純には予測することもできない。
また、シトシンデアミナーゼとシチジンデアミナーゼの両遺伝子を同時に欠損させたとしても、必ずしも上記遺伝子産物のみが該酵素活性をもつとは必ずしも明らかになっていなかった。
【０００９】
以上のような状況に鑑み、本発明の目的は、煩雑なデアミナーゼ失活処理を施さずに４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物の製造法を提供する事である。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上述の課題を解決するために鋭意検討した結果、シトシンデアミナーゼとシチジンデアミナーゼの両方の遺伝子を突然変異の誘発や相同組換えにより同時に欠損した微生物に、４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を合成する活性を有する酵素を発現させる事で、煩雑なデアミナーゼの失活処理を施さず対応するヌクレオシド化合物を効率的に製造できることを見出した。
【００１１】
特にシトシンデアミナーゼとシチジンデアミナーゼの両方の遺伝子を相同組換えを用いて破壊し該遺伝子以外の遺伝子を欠損していない微生物を用いれば、従来の技術では不可能であった微量のデアミノ体をも含まない純度の高いヌクレオシド化合物を煩雑な精製工程を採用することなく得ることが出来ることを見出した。
【００１２】
即ち本発明は以下のとおりである。
［１］ シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両遺伝子を本来有する微生物であって、且つ該シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ遺伝子を同時に欠損した微生物。
［２］ 前記微生物が大腸菌である［１］記載の微生物。
［３］ シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両遺伝子を相同組換えにより破壊し、該遺伝子以外の遺伝子を欠損していない［１］または［２］記載の微生物。
［４］ ４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を合成する活性を有する酵素が発現している［１］から［３］の何れか一項に記載の微生物。
［５］ 前記微生物の処理物を用いて４位にアミノ基を有するピリミジンヌクレオシド化合物を製造する方法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明において、シトシンデアミナーゼとは、シトシンの４位のアミノ基を脱離し、ウラシルとアンモニアを生成させる機能を有する酵素である。該酵素はシトシン以外にも５−メチルシトシンも基質となることが知られている。該酵素は、酵母、細菌に存在することが知られている。
【００１４】
本発明において、シトシンデアミナーゼ遺伝子とは、シトシンデアミナーゼをコードする遺伝子であり、例えば大腸菌であれば、遺伝子記号ｃｏｄＡと表記され、塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｓ５６９０３（コード領域は塩基番号１３０−１４１３）で示されている。
【００１５】
本発明において、シチジンデアミナーゼとは、シチジンの４位のアミノ基を脱離し、ウリジンとアンモニアを生成させる機能を有する酵素である。該酵素はシチジン以外にもデオキシシチジン、５−ハロゲン化シチジン、５−または６−アザシチジン、シトシンアラビノシドも基質となることが知られている。該酵素は、広く生物界に分布し、哺乳類、鳥類、魚類などの組織、酵母、細菌に存在する。
【００１６】
本発明において、シチジンデアミナーゼ遺伝子とは、シチジンデアミナーゼをコードする遺伝子であり、例えば大腸菌であれば、遺伝子記号ｃｄｄと表記され、塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｘ６３１４４（コード領域は塩基番号６７−１０５９）で示されている。
【００１７】
本発明において、シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両遺伝子を本来有する微生物とは、遺伝子操作等の人為的な方法で両遺伝子を当該微生物に導入したのではなく、生物種として原初的にその染色体ＤＮＡ等に両遺伝子を有することを意味する。
【００１８】
本発明においてシトシンデアミナーゼとシチジンデアミナーゼの両遺伝子を同時に欠損した微生物とは、上述のシトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両遺伝子を本来有する微生物を更に該シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両遺伝子を同時に何らかの手段により欠損された微生物を指す。本発明の微生物は上記の性質を保持している限りその由来、種類は特に制限されない。
本発明の微生物としては代表的には上記の性質を有し且つ分類学的に大腸菌に分類される微生物が例示できる。
【００１９】
本発明の微生物は、例えば自然界から元々存在していた両遺伝子を何らかの理由で欠いている微生物を単離したり、突然変異の誘発により該遺伝子が発現しない変異株を取得する方法や、トランスポゾンを用いて該遺伝子周辺を脱落させる方法、更には相同組換えによる該遺伝子のみを欠損させる方法が利用できるが両遺伝子を欠損できればその方法は特に制限されない。
【００２０】
突然変異の誘発やトランスポゾンなどにより目的遺伝子以外の遺伝子を欠損させる事で微生物の増殖性が悪くなることがある。また、遺伝子組換えにより特定の酵素を発現させる場合、各種変異を導入された株より野生株の方が高い発現量を示すことが多い。更に、野生株のように増殖性がよいと高密度培養が容易となり、工業的には有利である。そのため相同組換えによる特定の遺伝子のみを欠失させる方法が好適な方法といえる。
【００２１】
本発明において、４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体とは、ピリミジン骨格を有し４位にアミノ基を持つ化合物であり、例えばシトシン、５−アザシトシン、５−メチルシトシン、５−フルオロシトシンなどを例示できる。
【００２２】
本発明において、４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体に対応するヌクレオシド化合物とは、リボースやデオキシリボースなどの糖類と４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体とがＮ−グルコシド結合により結合した化合物であり、例えばシチジン、デオキシシチジン、５―アザシチジン、５−フルオロシチジン、５−メチルシデオキシチジンなどを例示できる。
【００２３】
本発明において、４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を合成する活性とは、リン酸化糖あるいはヌクレオシド類と上述の４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から上述の対応するヌクレオシド化合物を合成するる反応を促進する触媒としての機能を指している。
【００２４】
よって、本発明における４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を合成する活性を有する酵素とは、上述の活性を有する酵素を指す。例えば、リン酸化糖と４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を合成できるヌクレオシドホスホリラーゼやヌクレオシド類と４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を合成できるヌクレオシドリボシルトランスフェラーゼ、ヌクレオシドデオキシリボシルトランスフェラーゼなどを挙げる事ができる。
【００２５】
リン酸化糖と４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を合成できるヌクレオシドホスホリラーゼとは、リン酸化糖と４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を合成する酵素を指しており、この要件を満たす限り動物、植物、微生物の何れの起源であっても構わない。このようなヌクレオシドホスホリラーゼの具体例としては、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に含まれる微生物の従来のプリンヌクレオシドホスホリラーゼとして知られている酵素で前記活性も有するものを好適な例として挙げることができる。具体的な例として、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のプリンヌクレオシドホスホリラーゼのＤＮＡ塩基配列を配列番号：８に、該塩基配列より翻訳されるアミノ酸配列を配列番号：９に例示した。また、近年の遺伝子工学の進歩により塩基配列の一部を失活、挿入、置換によりアミノ酸配列を改変することが容易となった。かかる技術水準に鑑み、該塩基配列の一部を、所望とする酵素活性に影響を及ぼさない範囲内、例えば酵素活性を維持または向上できる範囲内で、改変してアミノ酸配列を改変したものも本発明のシトシンヌクレオシドホスホリラーゼに包含されるものとする。例えば、配列番号：９に示したアミノ酸配列に、目的とする酵素活性に影響を及ぼさない範囲内で２〜３個のアミノ酸の欠失、置換または付加が行われたものや、配列番号：８の塩基配列に目的とする酵素活性に影響を及ぼさず、かつ、その相補配列がストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る範囲内での欠失、置換または付加等の変異を生じさせた塩基配列によってコードされたアミノ酸配列を有するものを用いることができる。
【００２６】
本発明における本発明の微生物を用いて４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を製造する方法は、概略以下のとおりである。
即ち、４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体を基質として、対応するヌクレオシド化合物を合成できる酵素を発現している微生物であって、シトシンデアミナーゼとシチジンデアミナーゼの両遺伝子を本来有する微生物であって且つ該シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ遺伝子を同時に欠損した微生物の菌体、培養液それらの処理物を用い、水性媒体中で適切なｐＨや温度などの反応条件を選んで反応させることにより行われる。この場合、水性媒体とは水或いは水を主成分としてｐＨ緩衝能を有するような溶媒である。
【００２７】
反応の条件は通常はｐＨ４〜１１、好ましくは７〜１０、温度１０〜８０℃、好ましくは３０〜５０℃の範囲で行うことができる。反応の時間は任意であるが１時間から２０時間程度で行うことができる。
その他反応に際しては、基質や触媒として用いる菌体が沈殿しない程度に攪拌できれば十分である。
【００２８】
本発明において、微生物の菌体、培養液それらの処理物とは、微生物の菌体或いは培養液中の菌体を超音波、浸透圧ショック等で破壊して得られたもの、また、菌体及び該破壊物を固定化担体等で固定化したもの、或いは破壊物等から精製された酵素などが含まれる。
【００２９】
反応の際に基質として用いられる４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体の使用量は通常は０．１〜５０（重量）％、好ましくは５〜２０（重量）％の範囲で行うことができる。
【００３０】
基質に対する微生物の菌体、培養液それらの処理物の使用量は、反応が進行すればどのような量でもかまわないが、基質・生成物の分解活性を持たないため相当過剰に添加しても反応収率を低下させることはない。触媒濃度は通常０．１（重量）％〜１０（重量）％程度で行うことができる。
【００３１】
以上のようにして得られた反応液より４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体に対応するヌクレオシド化合物を採取する方法は、水性媒体に対する該誘導体と生成物の溶解度差を利用したり、イオン交換や吸着樹脂を用いる方法で行うことができる。例えば、反応液に活性炭を加え反応液中の菌体などを濾過により除き濾液を濃縮、晶析する事で高純度のヌクレオシドを得ることができる。反応によってデアミノ体の含有量は従来の技術に比して格段に押さえられているので、デアミノ体の除去を目的とした煩雑な精製は不要である。
【００３２】
【実施例】
以下に実施例で本発明を説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら制限されるものではない。
【００３３】
［分析法］
生成したヌクレオシド化合物はすべて高速液体クロマトグラフィーにより定量した。分析条件は以下による。
カラム；Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＭＧ−５ ４．６×２５０ｍｍ（野村化学）
カラム温度；４０℃
ポンプ流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
検出；ＵＶ２５４ｎｍ、
溶離液；５０ｍＭリン酸１カリウム：メタノール＝８：１（Ｖ／Ｖ）
【００３４】
実施例１（シトシンデアミナーゼ欠損株の作製）
エシェリヒア・コリＫ−１２ Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）（ＡＴＣＣはアメリカンタイプカルチャーコレクションの意味）を５０ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で一夜培養した後集菌し、リゾチーム１ｍｇ／ｍｌを含む溶菌液で溶菌した。溶菌液をフェノール処理した後、通常の方法によりエタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させた。生じたＤＮＡの沈殿は、ガラス棒に巻き付けて回収した後、洗浄し、ＰＣＲに用いた。
【００３５】
ＰＣＲ用のプライマーには、エシェリヒア・コリの既知のシトシンパーミアーゼ（以下ｃｏｄＢと表記する）をコードする塩基配列から既知のシトシンデアミナーゼ（以下ｃｏｄＡと表記する）をコードする塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ６３６５６）に基づいて設計した配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（北海道システム・サイエンス株式会社に委託して合成した）を用いた。これらのプライマーの５’末端付近及び３’末端付近には、それぞれＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を有する。
【００３６】
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した前記大腸菌染色体ＤＮＡ ６ｎｇ／μｌ及びプライマー各３μＭを含む０．１ｍｌのＰＣＲ反応液を用いて、変性：９６℃、１分間、アニーリング：５５℃、１分間、伸長反応：７４℃、１分間からなる反応サイクルを、３０サイクルの条件でＰＣＲを行った。
【００３７】
上記ＰＣＲ反応産物及び温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（Ａ ｓｅｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ／−ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｎｅｔ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒｓ ａｎｄ ｉｎ ａｎ ｉｓｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ＧＥＮＥ ２４１（２０００）１８５−１９１）配列番号：３を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αを３０℃にて形質転換した。形質転換株をクロラムフェニコール（Ｃｍ）１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で培養し、Ｃｍ耐性となった形質転換株を得た。得られたコロニーをＣｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。
このプラスミドをＰｓｔＩで消化し、大きなフラグメントを回収してライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換した。形質転換株を、クロラムフェニコール（Ｃｍ）１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で培養し、Ｃｍ耐性となった形質転換株を得た。得られたコロニーをＣｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。設計通りの大きさであったプラスミドを前記Ｗ３１１０株に３０℃で形質転換し、Ｃｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体を寒天プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をＣｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。
さらにもう一度、４２℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンから通常のプラスミド抽出操作を行なってもプラスミドが検出されないことを確認した。
【００３８】
次に上記クローンをＬＢ寒天プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した後に、ＬＢ液体培地（３ｍｌ／試験管）に接種し、４２℃で３〜４時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈し、ＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれをＬＢ寒天プレートとＣｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、ＬＢ寒天プレートにのみ生育するＣｍ感受性のクローンを選んだ。
【００３９】
これらの目的クローンをＣｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍＬで３７℃、２０時間培養し菌体を１００００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により分離した。集菌体を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍＬに懸濁した。
活性測定は１０ｍＭのシトシン、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液１ｍＬに菌体懸濁液０．１ｍＬを加え５０℃で１ｈｒ保温し、１０倍に希釈して液体クロマトグラフィーにて分析した。
得られた１０クローンのうち２クローンがｃｏｄＡ活性を完全に欠いており、ウラシルを検出できなかった。この菌株をＷ３１１０／ｃｏｄＡ欠損株と命名した。
【００４０】
実施例２（シトシンデアミナーゼ・シチジンデアミナーゼ欠損株の作製）
ＰＣＲ用のプライマーには、エシェリヒア・コリの既知のシチジンデアミナーゼ（以下ｃｄｄと表記する）をコードするｃｄｄ遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｘ６３１４４基づいて設計した配列番号：４及び５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（北海道システム・サイエンス株式会社に委託して合成した）を用いた。これらのプライマーの５’末端付近及び３’末端付近には、それぞれＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を有する。
【００４１】
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した前記大腸菌染色体ＤＮＡ ６ｎｇ／μｌ及びプライマー各３μＭを含む０．１ｍｌのＰＣＲ反応液を用いて、変性：９６℃、１分間、アニーリング：５５℃、１分間、伸長反応：７４℃、１分間からなる反応サイクルを、３０サイクルの条件でＰＣＲを行った。
【００４２】
上記反応産物及び実施例１で調製した温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換した。形質転換株を、クロラムフェニコール（Ｃｍ）１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で培養し、Ｃｍ耐性となった形質転換株を得た。得られたコロニーをＣｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。
このプラスミドをＢｇｌＩＩで消化し末端をＢＫＬキット（タカラ酒造（株））により埋めてライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換した。形質転換株を、クロラムフェニコール（Ｃｍ）１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で培養し、Ｃｍ耐性となった形質転換株を得た。得られたコロニーをＣｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。
このプラスミドがＢｇｌＩＩで消化されない事を確認し、このプラスミドをＷ３１１０／ｄｏｃＡ欠損株に３０℃で形質転換し、Ｃｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体を寒天プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をＣｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。
さらにもう一度、４２℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質中に持たないことを確認した。
【００４３】
次に上記クローンをＬＢ寒天プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した後に、ＬＢ液体培地（３ｍｌ／試験管）に接種し、４２℃で３〜４時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈し、ＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれをＬＢ寒天プレートとＣｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、ＬＢ寒天プレートにのみ生育するＣｍ感受性のクローンを選んだ。
【００４４】
これらの目的クローンをＣｍ１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍＬで３７℃、２０時間培養し菌体を１００００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により分離した。集菌体を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍＬに懸濁し、ｃｄｄの活性を測定した。
活性測定は１０ｍＭのシチジン、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液１ｍＬに菌体懸濁液０．１ｍＬを加え５０℃で１ｈｒ保温し、１０倍に希釈して液体クロマトグラフィーにて分析した。
得られた１０クローンのうち８クローンがｃｄｄ活性を完全に欠いておりウリジンを検出できなかった。この菌株をＷ３１１０／ｃｏｄＡ・ｃｄｄ欠損株と命名した。
【００４５】
実施例３（シトシンホスホリラーゼ生産菌の調製）
ＰＣＲ用のプライマーには、エシェリヒア・コリの既知のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（以下ＰＮＰと表記する）をコードするｄｅｏＤ遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＥ０００５０８（コード領域は塩基番号１１５３１−１２２５０）に基づいて設計した配列番号：６及び７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（北海道システム・サイエンス株式会社に委託して合成した）を用いた。これらのプライマーの５’末端付近及び３’末端付近には、それぞれＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を有する。
【００４６】
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した前記大腸菌染色体ＤＮＡ ６ｎｇ／μｌ及びプライマー各３μＭを含む０．１ｍｌのＰＣＲ反応液を用いて、変性：９６℃、１分間、アニーリング：５５℃、１分間、伸長反応：７４℃、１分間からなる反応サイクルを、３０サイクルの条件でＰＣＲを行った。
【００４７】
上記ＰＣＲ反応産物及びプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造（株））を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換した。形質転換株を、アンピシリン（Ａｍ）５０μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。
【００４８】
このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを、ｐＵＣ−ＰＮＰ７３と命名した。ｐＵＣ−ＰＮＰ７３をＷ３１１０／ｃｏｄＡ・ｃｄｄ欠損株に形質転換した。
得られた形質転換体をＡｍ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬで３７℃・１晩振とう培養した。培養液を１３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、得られた菌体を２０ｍＬの１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。懸濁液を再度１３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、得られた菌体を２ｍＬの１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）に懸濁し、−２０℃にて凍結保存した。
【００４９】
実施例４（デオキシシチジンの合成）
２０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２０ｍＭのシトシン（和光純薬製、特級）、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、実施例３で得られた菌体液０．１ｍｌからなる反応液１．０ｍｌを５０℃で２０時間反応させた。反応液を希釈した後分析したところ、１０．７ｍＭのデオキシシチジンが生成していたが、デオキシウリジン、ウラシルは全く検出できなかった。
【００５０】
実施例５（５−フルオロデオキシシチジンの合成）
２０ｍＭの２´−デオキシリボース１−リン酸ジ（モノシクロヘキシルアンモニウム）塩（ＳＩＧＭＡ製）、２０ｍＭの２−フルオロシトシン（ＳＩＧＭＡ）、１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、実施例３で得られた菌体液０．１ｍｌからなる反応液１．０ｍｌを５０℃で２０時間反応させた。反応液を希釈した後分析したところ、１０．７ｍＭの２−フルオロデオキシシチジンが生成していたが、２−フルオロデオキシウリジン、２−フルオロウラシルは全く検出できなかった。
【００５１】
【発明の効果】
本発明によれば従来のような煩雑なデアミナーゼ失活処理を施さずに、シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両遺伝子を本来有する微生物であって、且つ該シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ遺伝子を同時に欠損した微生物を用いて４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物が効率的に製造できる。
【００５２】
更に相同組換えによる該遺伝子の破壊株は、完全にシトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両酵素活性を消失している。係る微生物を用いて反応を行うことにより得られるヌクレオシド化合物には微量のデアミノ体も検出されず、本発明の製造方法により製造されるヌクレオシド化合物は、従来の製造法で得られたヌクレオシド化合物が有していた煩雑な精製工程を大幅に簡略化出来るため、医薬品或いは医薬品製造中間体として特に優れている。
【００５３】
さらに、該遺伝子を相同組換えにより破壊した菌株は、野生株と何ら変わらない増殖性を示し、工業的に有利な高濃度培養も容易に実施できる。
【００５４】
【配列表】
Claims (5)
- シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両遺伝子を本来有する微生物であって、且つ該シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼ遺伝子を同時に欠損した微生物。
- 前記微生物が大腸菌である請求項１記載の微生物。
- シトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの両遺伝子を相同組換えにより破壊し、該遺伝子以外の遺伝子を欠損していない請求項１または２記載の微生物。
- ４位にアミノ基を有するピリミジン塩基誘導体から対応するヌクレオシド化合物を合成する活性を有する酵素が発現している請求項１から３の何れか一項に記載の微生物。
- 前記微生物の処理物を用いて４位にアミノ基を有するピリミジンヌクレオシド化合物を製造する方法。
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| JP2003142784A JP2004344029A (ja) | 2003-05-21 | 2003-05-21 | 遺伝子破壊微生物およびそれを用いたピリミジンヌクレオシド化合物の製造方法 |
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|---|---|---|---|---|
| EP2883959A1 (en) | 2013-12-13 | 2015-06-17 | Plasmia Biotech, S.L. | Enzymatic production of cytosinic nucleoside analogues |
-
2003
- 2003-05-21 JP JP2003142784A patent/JP2004344029A/ja active Pending
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| EP2883959A1 (en) | 2013-12-13 | 2015-06-17 | Plasmia Biotech, S.L. | Enzymatic production of cytosinic nucleoside analogues |
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