JP2004503252A - Ｈｉｖ−１リポーターウイルスおよび抗ウイルス性化合物をアッセイするうえでのその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、複製コンピテントなＨＩＶ−１リポーターウイルスを生成する、ＨＩＶ−１プロウイルス構築物に関する。本発明はまた、抗ウイルス性化合物の高処理量スクリーニングにおけるこれらＨＩＶ−１リポーターウイルスの使用にも関する。

Description

【０００１】
（技術分野）
本発明は、リポーター遺伝子、好ましくはレニラ（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼか分泌胎盤アルカリホスファターゼ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ＳＥＡＰ）のいずれかのリポーター遺伝子をコードする、複製コンピテントな（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＨＩＶ−１プロウイルス構築物に関する。本発明はさらに、ＨＩＶ−１の複製を抑制する化合物の高処理量スクリーニングにおけるこれらプロウイルス構築物ビリオンの使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）の細胞培養中での複製は、一般に、ウイルスの逆転写酵素（ＲＴ）活性の産生を定量するか、細胞培養液中の成熟ウイルスカプシドタンパク質（すなわち、ｐ２４）を定量するか、または逆転写酵素によって指令された複製連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によるウイルスＲＮＡコピー数を定量することによって測定される。あるいは、ＨＩＶ−１複製は、ＸＴＴやＭＴＴなどの色素還元（ｄｙｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）法を用いて感染細胞に対するウイルスによって誘発された細胞変性効果（ｃｐｅ）を定量することによって間接的に測定することができる（ワイスロウ（Ｗｅｉｓｌｏｗ）ら、１９８９）。
【０００３】
ＨＩＶ−１ ＲＴアッセイまたはｐ２４アッセイの場合、これら方法の厄介な性質はこれら方法を高処理量の抗ウイルスアッセイに適用するのを排除している。一方、ＸＴＴなどの色素還元法によるＨＩＶ複製の分析は単一工程のプロセスであり、それゆえ高処理量が可能である。しかしながら、色素還元法はしばしば培養液中の大部分の細胞が感染し死滅した後に行われるので、一層有効性の少ないＨＩＶ−１インヒビターの同定の感度の低減という結果となる。さらに、色素還元法は有意の細胞変性効果に依存しているので、シンシチウム非誘導性のＨＩＶ−１株のように培養細胞株中で攻撃的な（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）複製動力学を示さないＨＩＶ株の複製を正確に測定するのに用いることはできない。
【０００４】
（発明の開示）
（発明が解決しようとする技術的課題）
ＨＩＶ−１リポーターウイルスの生成は、ＨＩＶ−１複製の測定の従来法に代わる方法を提供する。リポーター遺伝子としてルシフェラーゼをコードする単サイクル感染性ＨＩＶ−１リポーターウイルスが記載されている（チェン（Ｃｈｅｎ）ら、１９９４）。これらウイルスは、ウイルスの侵入、逆転写、組込み、および遺伝子発現を含むＨＩＶ−１複製サイクルのほぼ最初の半分の簡単かつ迅速な分析を可能にする。しかしながら、感染細胞でのＨＩＶ遺伝子発現の後の工程、たとえばビリオンの成熟に必要なウイルス前駆体ポリペプチドのＨＩＶプロテアーゼ媒体プロセシングなどは、これらウイルスを用いては容易に測定できない。
【０００５】
ＨＩＶの完全な複製サイクルを分析し、細胞集団中のＨＩＶ−１の伝播を追跡するには、複製コンピテントなリポーターウイルスが必要である。ＨＩＶ−１の複製の分析に用いることのできる幾つかの複製コンピテントなＨＩＶ−１リポーターウイルスが作製されている（ターウィリガー（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ）ら、１９８９；マリム（Ｍａｌｉｍ）ら、１９９２；ヘ（Ｈｅ）およびランダウ（Ｌａｎｄａｕ）、１９９５；プラネレ（Ｐｌａｎｅｌｌｅｓ）ら、１９９５；チェン（Ｃｈｅｎ）ら、１９９６；ページ（Ｐａｇｅ）ら、１９９７；ジャミエソン（Ｊａｍｉｅｓｏｎ）およびザック（Ｚａｃｋ）、１９９８）。しかしながら、これらリポーターウイルスがコードするリポーター遺伝子産物は簡単かつ迅速なアッセイによって測定できないため、これらリポーターウイルスは高容量の抗ウイルスアッセイには有用ではない。たとえば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）リポーター遺伝子は厄介な酵素アッセイによって制限された範囲の感度でしか測定することができない。同様に、マーカー遺伝子をコードするリポーターウイルスは、ＨＩＶ感染細胞を同定するために蛍光活性化セルソーティングを必要とする。
【０００６】
（その解決方法）
本発明は、複製コンピテントなＨＩＶ−１リポーターウイルスを生成する、ＨＩＶ−１プロウイルスに関する。これらプロウイルスは、ウイルス複製に必須でない領域がリポーター遺伝子、好ましくはレニラルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼ遺伝子の誘導体または分泌胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）リポーター遺伝子によって置換されたＨＩＶ−１ゲノムをコードしている。レニラルシフェラーゼ遺伝子の誘導体としては、機能的なレニラルシフェラーゼ酵素という結果となる野生型レニラルシフェラーゼ配列中でのアミノ酸またはヌクレオチド置換（すなわち、ｃｙｓ−ａｌａ置換）が挙げられる（リウ（Ｌｉｕ）ら、（１９９９））。リポーター遺伝子の発現は真正の（ｂｏｎａ ｆｉｄｅ）ウイルス複製に依存しており、簡単かつ迅速なアッセイを用いて検出することができる。
【０００７】
本発明の複製コンピテントなＨＩＶ−１プロウイルスは、あらゆるＨＩＶ−１ウイルス株からのいかなる複製コンピテントなＨＩＶ−１プロウイルスクローンを用いても構築することができる。一つの態様において、複製コンピテントなＨＩＶ−１プロウイルスは、ＨＩＶ−１プロウイルスクローンｐＮＬ４−３のｎｅｆ遺伝子をレニラルシフェラーゼリポーター遺伝子で置換することによって構築される。得られたプロウイルスは、ウイルス感染のためのコレセプターとしてＣＸＣＲ４を利用するＴ細胞親和性の（Ｔ−ｔｒｏｐｉｃ）ウイルスを生成する。使用できるリポーター遺伝子の他の例としては、ＳＥＡＰ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子またはグリーン蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【０００８】
他の態様において、複製コンピテントなＨＩＶ−１プロウイルスの構築は、ＨＩＶ−１プロウイルスクローンｐＮＬ４−３のｎｅｆ遺伝子をレニラルシフェラーゼリポーター遺伝子で置換し、さらにｐＮＬ４−３のエンベロープ遺伝子をＨＩＶ−１プロウイルスＪＲＦＬのエンベロープ遺伝子で置換することによって行う。得られたプロウイルスは、ウイルス感染のためのコレセプターとしてＣＣＲ５を利用するマクロファージ親和性の（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｔｒｏｐｉｃ）ウイルスを生成する。
【０００９】
さらに他の態様において、複製コンピテントなＨＩＶ−１プロウイルスは、ＨＩＶ−１プロウイルスクローンｐＮＬ４−３のｎｅｆ遺伝子をＳＥＡＰリポーター遺伝子で置換し、さらにｐＮＬ４−３のエンベロープ遺伝子をＨＩＶ−１プロウイルスクローンＪＲＦＬのエンベロープ遺伝子で置換することによって生成する。得られたプロウイルス（「ＪＲＦＮＳＥＡＰ」と称する）は、ウイルス感染のためのコレセプターとしてＣＣＲ５を利用するマクロファージ親和性のウイルスを生成する。
【００１０】
本発明のＨＩＶ−１プロウイルスを生成するのに用いることのできるエンベロープ遺伝子の他の例としては、ＣＣまたはＣＸＣケモカインレセプターのいずれかに対して親和性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を示すＨＩＶ−１エンベロープまたは真核生物細胞の感染を開始することのできるＨＩＶ−１単離物エンベロープが挙げられるが、これらに限られるものではない。
本発明はまた、ＨＩＶ−１の複製を抑制する化合物の高処理量インビトロスクリーニングにおける本発明のＨＩＶ−１複製コンピテントリポーターウイルスの使用にも関する。
【００１１】
本発明は複製コンピテントなＨＩＶ−１プロウイルスに関する。これらの複製コンピテントなＨＩＶ−１プロウイルスは、ウイルスの複製に必須でないＨＩＶ−１ウイルスゲノムの領域をリポーター遺伝子、好ましくはレニラルシフェラーゼ遺伝子、レニラルシフェラーゼ遺伝子の誘導体または分泌胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）リポーター遺伝子で置換することによって生成される。レニラルシフェラーゼ遺伝子の誘導体としては、機能的なレニラルシフェラーゼ酵素という結果となる野生型レニラルシフェラーゼ配列中のアミノ酸またはヌクレオチド置換（すなわち、ｃｙｓ−ａｌａ置換）が挙げられる（リウ（Ｌｉｕ）ら、（１９９９））。リポーター遺伝子の発現は真正のウイルス複製に依存しており、それゆえウイルス複製の定量法として用いることができる。リポーター遺伝子の発現は、簡単かつ迅速なアッセイを用いて検出することができる。
【００１２】
本発明の複製コンピテントなＨＩＶ−１プロウイルスを構築するため、衰弱しない（ｎｏｎ−ｄｅｂｉｌｉｔａｔｉｎｇ）リポーター遺伝子、たとえばレニラルシフェラーゼリポーター遺伝子を、ＨＩＶ−１ウイルスの複製を妨害しない限りにおいて該ウイルスゲノム中のどこにでも挿入することができる。好ましくは、ウイルスの複製に必須でないＨＩＶ−１ゲノムの領域を置換することによって該ウイルスゲノム中にリポーター遺伝子を挿入する。そのような領域としては、ｎｅｆ遺伝子、ｖｐｒ遺伝子、およびｎｅｆ遺伝子やｖｐｒ遺伝子のフラグメントが挙げられるが、これらに限られるものではない。ｎｅｆおよびｖｐｒ遺伝子のフラグメントは、一般に１〜３００ヌクレオチドの長さである。
【００１３】
本発明の複製コンピテントなＨＩＶ−１プロウイルスは、あらゆるＨＩＶ−１ウイルス株からのいかなる複製コンピテントなＨＩＶ−１プロウイルスクローンを用いても構築することができる。そのようなクローンの例としては、ｐＮＬ４−３（アダチ（Ａｄａｃｈｉ）ら、１９８６）、ｐＹＵ−２（ライ（Ｌａｉ）、１９９１）、ｐ８９．６（コルマン（Ｃｏｌｌｍａｎ）ら、１９９２）およびＨＩＶ−１ Ｌａｉ（ウエイン−ホブソン（Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ）ら、１９８５）が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００１４】
一つの態様において、複製コンピテントなＨＩＶ−１プロウイルスはＨＩＶ−１プロウイルスクローンｐＮＬ４−３のｎｅｆ遺伝子をレニラルシフェラーゼリポーター遺伝子で置換することによって生成される。得られたプロウイルス（「ＮＬ４Ｒｌｕｃ」と称する）は、ウイルス感染のためのコレセプターとしてＣＸＣＲ４を利用するＴ細胞親和性のウイルスを生成する。
【００１５】
他の態様において、複製コンピテントなＨＩＶ−１プロウイルスは、ＨＩＶ−１プロウイルスクローンｐＮＬ４−３のｎｅｆ遺伝子をレニラルシフェラーゼリポーター遺伝子で置換し、さらにｐＮＬ４−３のエンベロープ遺伝子をＨＩＶ−１プロウイルスクローンＪＲＦＬのエンベロープ遺伝子で置換することによって生成される。得られたプロウイルス（「ＪＲＦＮＲｌｕｃ」と称する）は、ウイルス感染のためのコレセプターとしてＣＣＲ５を利用するマクロファージ親和性のウイルスを生成する。
【００１６】
さらに他の態様において、複製コンピテントなＨＩＶ−１プロウイルスは、ＨＩＶ−１プロウイルスクローンｐＮＬ４−３のｎｅｆ遺伝子をＳＥＡＰリポーター遺伝子で置換し、さらにｐＮＬ４−３のエンベロープ遺伝子をＨＩＶ−１プロウイルスクローンＪＲＦＬのエンベロープ遺伝子で置換することによって生成される。得られたプロウイルス（「ＪＲＦＮＳＥＡＰ」と称する）は、ウイルス感染のためのコレセプターとしてＣＣＲ５を利用するマクロファージ親和性のウイルスを生成する。
【００１７】
本発明のＨＩＶ−１ウイルスに感染した細胞中でのレニラルシフェラーゼリポーター遺伝子、レニラルシフェラーゼ遺伝子の誘導体またはＳＥＡＰリポーター遺伝子の発現は細胞培養中での真正のウイルス複製に依存しており、当該技術分野で知られた方法を用いて検出することができる。一つの態様において、レニラルシフェラーゼ活性の測定は、該プロウイルスに感染した細胞にレニラルシフェラーゼ基質であるコエレンテラミン（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｍｉｎｅ）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、マジソン、ウイスコンシン）を加えることによって行う。レニラルシフェラーゼはコエレンテラミンをコエレンテラミド（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｍｉｄｅ）に変換し、同時にＣＯ_２および光を産生するので、レニラルシフェラーゼ活性は光の放射によって検出され、光の放射はシンチレーションカウンターまたはルミノメーターを用いて定量することができる。
【００１８】
他の態様において、ＳＥＡＰ活性の測定は、感染細胞培養からの上澄み液にＳＥＡＰ基質であるＣＳＰＤ（Ｔｒｏｐｉｘ ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ベッドフォード、マサチューセッツ）、ルミネセンスエンハンサー、および内生の非胎盤アルカリホスファターゼ活性を阻害する緩衝液系を加えることによって行う。ＳＥＡＰによる基質の脱リン酸後に準安定なフェノラートアニオン中間体が生成し、該中間体は分解して光を放射する。光の放射はシンチレーションカウンターまたはルミノメーターを用いて測定することができる。
【００１９】
レニラルシフェラーゼ活性またはＳＥＡＰ活性を測定するため、当該技術分野で知られたレニラルシフェラーゼまたはＳＥＡＰの他の基質を使用できることが理解される。
細胞培養中での本発明のＨＩＶ−１ウイルスの複製は簡単かつ迅速なアッセイを用いて容易に測定することができるので、本発明はまたＨＩＶ−１複製を抑制する化合物の高容量スクリーニングにおけるこれらＨＩＶ−１ウイルスの使用にも関する。
【００２０】
一つの態様において、スクリーニング法は、本発明の複製コンピテントなプロウイルスのウイルスストックに感染した細胞に被験化合物を加え、ついで２〜７日、好ましくは６日間のインキュベーション後にレニラルシフェラーゼまたはＳＥＡＰ活性を測定することを含む。他の態様において、ウイルスのストックを感染させるべき細胞とともに被験化合物に加えてもよい。
抗ウイルス性の化合物のスクリーニングに用いるのに適した細胞または細胞株としては、ＭＴ−２細胞、ＭＴ−２＃１８細胞、ＰＭ−１、ＣＥＭ ＳＳおよびジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００２１】
被験化合物で処理した細胞でのレニラルシフェラーゼまたはＳＥＡＰ活性のレベルを感染コントロール細胞のレベルと比較する。コントロール細胞でのレベルと比較して被験化合物で処理した細胞でのレニラルシフェラーゼまたはＳＥＡＰ活性レベルの低減は、該被験化合物がＨＩＶ−１ウイルスの複製を抑制する能力を有していることを示している。好ましくは、抑制は５０〜９０％、さらに好ましくは９０％以上である。
【００２２】
本発明のＨＩＶ−１ウイルスのウイルスストックは当業者によく知られた方法により生成することができる。一つの態様において、ウイルスストックは、本発明のプロウイルスクローンを細胞培養中にトランスフェクションし、ついでトランスフェクションした細胞の上澄み液を回収することによって調製される。トランスフェクションは、リン酸カルシウム、エレクトロポレーションまたはリポソーム媒体トランスフェクションなどの当該技術分野で知られた方法を用いて行うことができる。トランスフェクションに用いる細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ジャーカット細胞およびＣＥＭ細胞が挙げられるが、これらに限られるものではない。
被験化合物で処理した細胞でのレニラルシフェラーゼまたはＳＥＡＰ活性レベルの変化を測定することにより、被験化合物がウイルスの複製を抑制するうえでの有効性並びに有効性の程度を決定することができる。
【００２３】
つぎに本発明を実施例により記載するが、これら実施例は本発明を説明するためのものであって本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例
材料および方法
細胞株および細胞培養条件
ＮＩＨ ＡＩＤＳリサーチ・アンド・レファレンス・リージェント・プログラム（ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）（ベセスダ、メリーランド）から得たＣＤ４＋ヒト悪性Ｔ細胞株であるＭＴ−２細胞株を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するロスウエル・パーク・メモリアル・インスティチュート（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＲＰＭＩ）１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ゲイサーズバーグ、メリーランド）中で増殖させた。この細胞株は本来、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４を発現するが、形質転換してマクロファージ親和性のＨＩＶ−１コレセプターであるヒトＣＣＲ５を発現するようにした。形質転換した細胞株をそのクローン集団の番号によりＭＴ−２＃１８と名付け、その親細胞株ＭＴ−２と同様に０．５ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ゲイサーズバーグ、メリーランド）を加えて培養した。ＭＴ−２＃１８細胞は、Ｔ細胞親和性のウイルスに対してはＣＸＣＲ４コレセプターの使用を介して、またはマクロファージ親和性のウイルスに対してはＣＣＲ５コレセプターの使用を介して、ＨＩＶ−１感染を許容する。
【００２４】
ＨＥＫ２９３−Ｔは、ＳＶ−４０ラージＴ抗原で形質転換したヒト胚性腎細胞株である。ＨＥＫ２９３−Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ゲイサーズバーグ、メリーランド）中で増殖させた。
【００２５】
リポーターウイルスの構築
ＨＩＶ−１プロウイルスクローンｐＮＬ４−３（アダチ（Ａｄａｃｈｉ）ら、１９８６）を用いてプロウイルスを構築した。ＮＬ４Ｒｌｕｃプロウイルスクローン（図１）を構築するため、ｐＮＬ４−３中のエンベロープコード配列の直ぐ３’側に唯一のＸｂａＩエンドヌクレアーゼ制限部位を導入した。導入したＸｂａＩ部位とＮｅｆ中のＢｇｌＩＩエンドヌクレアーゼ制限部位との間の１９１塩基対のセグメントを欠失させ、唯一のＸｈｏＩエンドヌクレアーゼ制限部位で置換した。ついで、導入したＸｂａＩおよびＸｈｏＩ部位を用いて９４７塩基対のレニラルシフェラーゼリポーター遺伝子（ＲＬｕｃ）（マシューズ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）ら、およびローレンツ（Ｌｏｒｅｎｚ）ら）を改変ｐＮＬ４−３中に挿入した。得られた構築物ＮＬ４ＲｌｕｃはｐＮＬ４−３構築物よりも７５６塩基対だけ長かった。
【００２６】
プロウイルスクローンＪＲＦＮＲＬｕｃ（図２）を構築するため、ＮＬ４Ｒｌｕｃのエンベロープコード領域（約３，１００塩基対）をエンベロープコード配列の直ぐ５’側に位置するＥｃｏＲＩ部位および上記唯一のＸｂａＩ部位により除去した。この断片をＨＩＶ−１ ＪＲＦＬのエンベロープコード領域（約３，７００塩基対）（オブライエン（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ）ら、１９９０）で置換した。ＪＲＦＬクローンのエンベロープコード領域は、この領域のＰＣＲ増幅およびＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位での組換えクローニングにより調製した。ＪＲＦＮＦＬｕｃ ｃＤＮＡクローン（図３）の構築は、ＪＲＦＮＲＬｕｃ中のレニラルシフェラーゼ遺伝子（９４７塩基対）をホタルルシフェラーゼ遺伝子（１，７０６塩基対）で置換することにより行った。プロウイルスクローンＪＲＦＮＳＥＡＰの構築は、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩ部位を用いてＪＲＦＮＲＬｕｃ中のレニラルシフェラーゼ遺伝子をＳＥＡＰコード遺伝子（１，５５７塩基対）で置換することにより行った（図４）。
【００２７】
ウイルスストックの調製
ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ゲイサーズバーグ、メリーランド）を用い、製造業社の指示に従ってＨＥＫ２９３細胞をＮＬ４Ｒｌｕｃ、ＪＲＦＮＲＬｕｃ、ＪＲＦＮＦＬｕｃまたはＪＲＦＮＳＥＡＰプロウイルスクローンでトランスフェクションした。各トランスフェクションに約３×１０^７細胞を用いた。トランスフェクションの７２時間後にトランスフェクションした細胞の上澄み液を回収し、低速遠心分離により清澄化し、−７０℃で貯蔵した。感染性のウイルスを解凍し、ＭＴ−２＃１８細胞を用いて力価測定した。
【００２８】
細胞の感染およびｐ２４アッセイ
ＭＴ−２＃１８細胞をペレット化し、０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）にてウイルスストックで３７℃で２時間感染させた。ウイルスを除去し、最終濃度１０，０００細胞／１００μＬで再浮遊する前に細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄した。感染性アッセイおよび薬剤感受性アッセイを９６ウエル組織培養プレートで行い、動力学試験をＴ−２５フラスコで行った。細胞の上澄み液を第０日目、第２日目、第３日目、第５日目または第６日目に回収し、継代したウイルスを第２日目または第３日目に回収した。ゼプトメトリックス・レトロテック（Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ Ｒｅｔｒｏｔｅｋ）製品（Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、バッファロー、ニューヨーク）を用い、製造業社のプロトコールに従ってカプシドタンパク質ｐ２４の活性を分析した。
【００２９】
高処理量スクリーニングアッセイ
ＭＴ−２＃１８細胞の大容量培養液を調製し、１０％ウシ胎仔血清を加えたＲＰＭＩ培地中で０．５×１０^６細胞／ｍｌ未満の濃度で保持した。被験化合物を９６ウエル組織培養処理した透明底ブラックプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、コーニング、ニューヨーク）に２０μｌの脱イオン水および５％ジメチルスルホキシド中で３ｍＭの濃度にてプレーティングした。ＭＴ−２＃１８細胞を低速遠心分離によりペレット化し、新たな培地に再浮遊させた。この新たな培地および細胞にリポーターウイルスを加えて約０．０１のＭＯＩおよび１６０μｌ中に１×１０^４の細胞濃度とした。ついで、２０μｌ／ウエルの２×完全改変イーグル培地を脱イオン水の容量を補正するために加えた。ついで、この混合物１８０μｌを各被験化合物のウエルおよびコントロールのウエルに加える。３７℃で５〜６日間インキュベーション後、１２チャンネルマニホルドを用いてウエルから培地を吸引した。
【００３０】
レニラルシフェラーゼ活性の測定は、プロメガ・デュアル・ルシフェラーゼ・リポーター・キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｋｉｔ）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、マジソン、ウイスコンシン）を用いて行った。マルチドロップ装置（Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、フランクリン、マサチューセッツ）を用い、プレートの各ウエル中の露出した細胞に基質を１０のバッチにて直接加えた。基質添加後、プレートを直ちに密封し、ウォラック・マイクロベータ（Ｗａｌｌａｃ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ）１４５０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｗａｌｌａｃ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、ゲイサーズバーグ、メリーランド）をルミネセンスモードで用いてウエル当たり５秒読み取った。
【００３１】
分泌胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性の測定は、ＣＳＰＤと呼ばれる１，２ジオキセタンアルカリホスファターゼ基質（Ｔｒｏｐｉｘ ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ベッドフォード、マサチューセッツ）を用いて行った。アッセイには、６５℃にて５〜３０分間、好ましくは３０分間のインキュベーション、ついでＬ−ホモアルギニンを加えて５〜２０分間、好ましくは２０分間のインキュベーションを含む２つのインキュベーション工程が含まれる。光の放射はシンチレーションカウンターまたはルミノメーターを用いて測定することができる。
【００３２】
実施例１
レニラルシフェラーゼリポーターウイルスの複製
よく特徴付けられたＣＸＣＲ４親和性のＨＩＶ−１プロウイルスクローンであるｐＮＬ４−３構築物をＨＩＶ−１プロウイルスの構築のためのプロウイルスｃＤＮＡ骨格として用いた。レニラルシフェラーゼ遺伝子をコードする３つのプロウイルスクローン、ＮＬ４Ｒｌｕｃ、ＪＲＦＮＲｌｕｃ、およびＪＲＦＮＦＬｕｃを構築した。ＮＬ４Ｒｌｕｃクローンは、ＨＩＶ−１ゲノム中のｎｅｆ遺伝子をレニラルシフェラーゼリポーター遺伝子で置換することによって構築した。ＮＬ４Ｒｌｕｃの子孫ビリオンは、ＣＸＣＲ−４をウイルス感染のためのコレセプターとして利用する。ＪＲＦＮＲｌｕｃクローンは、ＮＬ４Ｒｌｕｃクローンのエンベロープ領域をＨＩＶ−１株ＪＲＦＬのエンベロープ領域で置換することによって構築した。ＪＲＦＮＦＬｕｃクローンは、ＪＲＦＮＲｌｕｃクローンのレニラルシフェラーゼリポーター遺伝子をホタルルシフェラーゼ遺伝子で置換することによって構築した。ＪＲＦＮＲｌｕｃおよびＪＲＦＮＦＬｕｃの子孫ビリオンは、ＣＣＲ５をウイルス感染のためのコレセプターとして利用する。
【００３３】
これらクローンに由来するウイルスがインビトロで複製する能力を試験した。感染５日後、ＮＬ４Ｒｌｕｃに感染したＭＴ−２＃１８細胞でのレニラルシフェラーゼ活性は非感染細胞で観察されるものと比較して１０００倍以上であった（図５）。同様に、ＪＲＦＮＲＬｕｃに感染したＭＴ−２＃１８細胞でのレニラルシフェラーゼ活性は非感染細胞で観察されるものと比較して８００倍以上であった（図６）。いずれのウイルスに感染した細胞でのレニラルシフェラーゼ活性の動力学もｐ２４（成熟ビリオン中に存在するカプシドタンパク質）の産生と相関関係があった（図５および６）。このことは、検出されたレニラルシフェラーゼ活性がＨＩＶ−１のウイルス複製の結果であることを示唆している。ＮＬ４ＲｌｕｃおよびＪＲＦＮＲｌｕｃウイルスによるｐ２４産生のレベルが野生型ｐＮＬ４−３の子孫ウイルスのレベルと実質的に同等であるとの知見は、レニラルシフェラーゼ遺伝子によるｎｅｆ遺伝子の置換がＨＩＶ−１のウイルス複製に対して有害な作用をもたらさないことを証明している（図１２）。
【００３４】
細胞培養のＮＬ４ＲｌｕｃおよびＪＲＦＮＲＬｕｃ感染の後に生成するＨＩＶ−１ウイルスが細胞培養において新たな感染の繰り返しを開始できるか否かを決定するため、ＭＴ−２＃１８細胞をＮＬ４ＲｌｕｃまたはＪＲＦＮＲＬｕｃ上澄み液に感染させ、ｐ２４活性およびレニラルシフェラーゼ活性を測定した。図７に示すように、Ｔ細胞株を６日間感染させた後に生成されるＮＬ４Ｒｌｕｃウイルスはリポーター遺伝子を新たなＭＴ−２＃１８細胞に形質導入することができた。同様に、Ｔ細胞株を６日間感染させた後に生成されるＪＲＦＮＲＬｕｃビリオンはリポーター遺伝子を新たなＭＴ−２＃１８細胞に形質導入することができた（図８）。これら結果は、ＮＬ４ＲｌｕｃおよびＪＲＦＮＲＬｕｃウイルスが感染細胞培養から伝播して新たな細胞培養において多数の複製の繰り返しを開始できること、それゆえ複製コンピテントであることを証明している。
【００３５】
ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターのアンプレナビル（Ａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）（Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ、リサーチ・トライアングル・パーク、ノースカロライナ）および非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターのエファビレンツ（Ｅｆａｖｉｒｅｎｚ）（Ｄｕｐｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ウイルミントン、デラウエア）を用い、ＮＬ４ＲｌｕｃおよびＪＲＦＮＲＬｕｃウイルスの複製特性を調べた。アンプレナビルおよびエファビレンツはＨＩＶ−１感染の介入のために臨床的に用いられているものである。逆転写酵素インヒビターであるエファビレンツはＨＩＶ−１複製サイクルの初期で作用するのに対し、プロテアーゼインヒビターであるアンプレナビルはＨＩＶ−１複製サイクルの後期で作用する。
【００３６】
表１に示すように、ＮＬ４ＲｌｕｃおよびＪＲＦＮＲＬｕｃによるＭＴ−２＃１８細胞の感染はエファビレンツ並びにアンプレナビルによって抑制された。アンプレナビルはＮＬ４ＲｌｕｃおよびＪＲＦＮＲＬｕｃの複製をそれぞれ１９．４ｎＭおよび６．９ｎＭの５０有効濃度（ＥＣ５０）値で抑制し、エファビレンツはＮＬ４ＲｌｕｃおよびＪＲＦＮＲＬｕｃの複製をそれぞれ０．３６ｎＭおよび０．１２ｎＭのＥＣ５０で抑制した。ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターであるアンプレナビルは複製サイクルの後期にビリオンの成熟に際して作用し、単一サイクルの感染は抑制しない。それゆえ、これら結果はさらに、観察されたレニラルシフェラーゼリポーター遺伝子活性がＮＬ４ＲｌｕｃまたはＪＲＦＮＲＬｕｃの真正の複製の結果であることを証明している。
【００３７】
表１
アンプレナビルおよびエファビレンツによるウイルス複製の抑制

【００３８】
ついで、ＮＬ４ＲｌｕｃおよびＪＲＦＮＲＬｕｃウイルスの複製能をＪＲＦＮＦＬｕｃウイルスの複製能と比較した。ＪＲＦＮＦＬｕｃはＪＲＦＮＲＬｕｃとレニラルシフェラーゼ遺伝子の代わりにホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードしている点で異なる。ＪＲＦＮＦＬｕｃの構築は以前に報告されたのと同様の仕方で行った（チェン（Ｃｈｅｎ）ら、１９９４）。ＪＲＦＮＦＬｕｃによるＴ細胞株の感染は、ＮＬ４ＲｌｕｃおよびＪＲＦＮＲＬｕｃウイルスと全く同様にして行った。
【００３９】
図９に示すように、ＪＲＦＮＦＬｕｃによる細胞の感染は、感染３日後に非感染細胞で観察されるものと比較して２００倍以上のホタルルシフェラーゼ活性の産生という結果となった。しかしながら、この活性レベルはこの時点以後に増大することはなく、ｐ２４活性も６日間の感染期間を通じてバックグラウンドレベルを超えることはなかった。これら結果は、成熟ウイルスコア粒子が生成されなかったことを示している。６日間感染後のＪＲＦＮＦＬｕｃ上澄み液を非感染ＭＴ−２＃１８細胞に継代したところ、接種７日後までホタルルシフェラーゼ活性もｐ２４産生も検出できなかった（データは示していない）。これら結果は、これら上澄み液が新たな複製の繰り返しを開始できるウイルスを含んでいなかったことを示唆している。
【００４０】
最後に、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターであるエファビレンツはＪＲＦＮＦＬｕｃを０．１８ｎＭの５０有効濃度（ＥＣ５０）値で抑制したが、ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターであるアンプレナビルは複製コンピテントなＪＲＦＮＲＬｕｃの１０００倍以上に相当する濃度の１０μＭでも該ウイルスを抑制できなかった（表１）。このウイルスが後期ＨＩＶ−１複製サイクルインヒビターによって抑制することができないとの知見は、このウイルスが複製できないことのさらなる証拠である。以上を総合すると、これらデータは、ＪＲＦＮＦＬｕｃウイルスが感染の単一の繰り返しを行うことができるのみであり、複製コンピテントではないのに対し、ＮＬ４ＲｌｕｃおよびＪＲＦＮＲＬｕｃは感染の多数の繰り返しを行うことができ、真正に複製コンピテントなプロウイルスであることを強く示唆している。
【００４１】
実施例２
ＳＥＡＰリポーターウイルスの複製
ＪＲＦＮＲＬｕｃ中のレニラルシフェラーゼ遺伝子をＳＥＡＰをコードする遺伝子で置換することによりＪＲＦＮＳＥＡＰプロウイルス構築物を生成した。このプロウイルスクローンによって生成したウイルスがインビトロで複製する能力を試験した。感染６日後、ＪＲＦＮＳＥＡＰに感染したＭＴ−２＃１８細胞でのＳＥＡＰ活性は非感染細胞で観察される活性の１５０倍以上であった。このウイルスに感染した細胞でのＳＥＡＰ活性の動力学はｐ２４活性と相関関係があった（図１０）。このことは、検出されたＳＥＡＰ活性がＨＩＶ−１のウイルス複製の結果であることを示唆している。ＪＲＦＮＳＥＡＰウイルスによるｐ２４産生のレベルが野生型ｐＮＬ４−３の子孫ウイルスのレベルと実質的に同等であるとの知見は、ＳＥＡＰ遺伝子によるｎｅｆ遺伝子の置換がＨＩＶ−１のウイルス複製に対して有害な作用をもたらさないことを証明している（図１２）。
【００４２】
ついで、細胞培養の感染後に生成するＪＲＦＮＳＥＡＰウイルスが細胞培養において新たな感染の繰り返しを開始できるか否かを決定するための試験を行った。図１１に示すように、Ｔ細胞株を６日間感染させた後に生成されるＪＲＦＮＳＥＡＰウイルスはリポーター遺伝子を新たなＭＴ−２＃１８細胞に形質導入することができた。これら結果は、ＪＲＦＮＳＥＡＰウイルスが感染細胞培養から伝播して新たな細胞培養において多数の複製の繰り返しを開始できること、それゆえ複製コンピテントであることを証明している。
【００４３】
上記ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターであるアンプレナビルおよび非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターであるエファビレンツを用い、ＪＲＦＮＳＥＡＰウイルスの複製特性を調べた。表１に示すように、ＪＲＦＮＳＥＡＰによるＭＴ−２＃１８細胞の感染はエファビレンツ並びにアンプレナビルによって抑制された。アンプレナビルはＪＲＦＮＳＥＡＰの複製を２１．５ｎＭの５０有効濃度（ＥＣ５０）値で抑制し、エファビレンツはＪＲＦＮＳＥＡＰの複製を０．１０ｎＭのＥＣ５０で抑制した。ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターであるアンプレナビルは複製サイクルの後期にビリオンの成熟に際して作用し、単一サイクルの感染は抑制しない。それゆえ、この知見は、観察されたＳＥＡＰリポーター遺伝子活性が真正のウイルス複製の結果であることをさらに証明している。
【００４４】
参照文献
１．チェン（Ｃｈｅｎ）ら、１９９４， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８： ６５４−６６０
２．ターウィリガー（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ）ら、１９８９， ＰＮＡＳ ８６： ３８５７−３８６１
３．マリム（Ｍａｌｉｍ）ら、１９９２， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６： １１９７−１２０１
４．ヘ（Ｈｅ）およびランダウ（Ｌａｎｄａｕ）、１９９５， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９： ４５８７−４５９２
５．プラネレ（Ｐｌａｎｅｌｌｅｓ）ら、１９９５， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２： ３６９−３７６
６．チェン（Ｃｈｅｎ）ら、１９９６， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０： ６０４４−６０５３
７．ページ（Ｐａｇｅ）ら、１９９７， Ａｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏ． １３： １０７７−１０８１
８．ジャミエソン（Ｊａｍｉｅｓｏｎ）およびザック（Ｚａｃｋ）、１９９８， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ６５２０−６５２６
９．ワイスロウ（Ｗｅｉｓｌｏｗ）ら、１９８９， Ｊ． ｏｆ Ｎａｔ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８１： ５７７−５８６
【００４５】
１０．アダチ（Ａｄａｃｈｉ）ら、１９８６， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５９： ２８４−２９１
１１．オブライエン（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ）ら、１９９０， Ｎａｔｕｒｅ ３４８： ６９−７３
１２．マシューズ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）ら、１９７７， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６： ８５
１３．エディンガー（Ｅｄｉｎｇｅｒ）ら、１９９８， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ７９３４−７９４０
１４．ウエイン−ホブソン（Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ）ら、１９８５， Ｃｅｌｌ ４０： ９−１７
１５．リ（Ｌｉ）ら、１９９１， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５： ３９７３−３９８５
１６．コルマン（Ｃｏｌｌｍａｎ）ら、１９９２， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６： ７５１７−７５２１
１７．ローレンツ（Ｌｏｒｅｎｚ）ら、１９９１， Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ． ＵＳＡ ８８： ４４３８
１８．リウ（Ｌｉｕ）ら、１９９９， Ｇｅｎｅ ２３７： １５３−１５９
【００４６】
本明細書に引用した全ての特許、特許出願、公開文献、参照マニュアル、出典および要約の内容は、本発明が関連する技術分野の技術の状態を一層完全に記載するためにその全体が参照のため引用される。
上記に記載した組成物および方法には本発明の範囲から逸脱しない限り種々の変更を施すことが可能なので、上記記載に含まれ、添付の図面に示され、または請求の範囲で定められる事項は全て例示のものとして解釈されるのであって限定的な意味でないことが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＮＬ４ＲＬｕｃプロウイルス構築物の模式図である。
【図２】ＪＲＦＮＲＬｕｃプロウイルス構築物の模式図である。
【図３】ＪＲＦＮＦＬｕｃプロウイルス構築物の模式図である。
【図４】ＪＲＦＮＳＥＡＰプロウイルス構築物の模式図である。
【図５】ＨＩＶ−１プロウイルスｐＮＬ４ＲＬｕｃによって生成したＨＩＶ−１ウイルスの複製の動力学を示す。第０日目、第２日目および第５日目に測定したレニラルシフェラーゼ活性および成熟ウイルスカプシドタンパク質ｐ２４レベルを示す。
【図６】ＨＩＶ−１プロウイルスＪＲＦＮＲｌｕｃによって生成したＨＩＶ−１ウイルスの複製の動力学を示す。第０日目、第３日目および第６日目に測定したレニラルシフェラーゼ活性および成熟ウイルスカプシドタンパク質ｐ２４レベルを示す。
【図７】ＭＴ−２＃１８細胞のｐＮＬ４Ｒｌｕｃ感染後に生成したＨＩＶ−１ウイルスはＭＴ−２＃１８細胞において新たな感染の繰り返しを開始することができたことを示す。
【図８】ＭＴ−２＃１８細胞のＪＲＦＮＲｌｕｃ感染後に生成したＨＩＶ−１ウイルスはＭＴ−２＃１８細胞において新たな感染の繰り返しを開始することができたことを示す。
【図９】ＨＩＶ−１プロウイルスＪＲＦＮＦＬｕｃによって生成したＨＩＶ−１ウイルスの複製の動力学を示す。
【図１０】ＨＩＶ−１プロウイルスＪＲＦＮＳＥＡＰによって生成したＨＩＶ−１ウイルスの複製の動力学を示す。第０日目、第３日目および第６日目に測定したＳＥＡＰ活性および成熟ウイルスカプシドタンパク質ｐ２４レベルを示す。
【図１１】ＭＴ−２＃１８細胞のＪＲＦＮＳＥＡＰ感染後に生成したＨＩＶ−１ウイルスはＭＴ−２＃１８細胞において新たな感染の繰り返しを開始することができたことを示す。
【図１２】種々のＨＩＶ−１リポーターウイルスおよびｐＮＬ４−３ウイルスのｐ２４活性を示す。

Claims (23)

1. 複製コンピテントなＨＩＶ−１ウイルスをコードするベクターであって、ウイルスの複製に必須でない領域がリポーター遺伝子によって置換されているＨＩＶ−１ゲノムを含むことを特徴とするベクター。
2. 該リポーター遺伝子が、レニラルシフェラーゼリポーター遺伝子、ＳＥＡＰリポーター遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、およびグリーン蛍光タンパク質遺伝子よりなる群から選ばれる、請求項１に記載のベクター。
3. 該リポーター遺伝子がレニラルシフェラーゼリポーター遺伝子およびＳＥＡＰリポーター遺伝子よりなる群から選ばれる、請求項２に記載のベクター。
4. ウイルスの複製に必須でない領域がｎｅｆ遺伝子またはｎｅｆ遺伝子のフラグメントをコードする、請求項１、２または３に記載のベクター。
5. ウイルスの複製に必須でない領域がｖｐｒ遺伝子またはｖｐｒ遺伝子のフラグメントをコードする、請求項１、２または３に記載のベクター。
6. 該ＨＩＶ−１ゲノムがｐＮＬ４−３プロウイルスクローンのゲノムである、請求項１、２または３に記載のベクター。
7. 該ＨＩＶ−１ゲノムがｐＹＵ−２プロウイルスクローンのゲノムである、請求項１、２または３に記載のベクター。
8. 該ＨＩＶ−１ゲノムがｐ８９．６プロウイルスクローンのゲノムである、請求項１、２または３に記載のベクター。
9. 該ＨＩＶ−１ゲノムがＨＩＶ−１ Ｌａｉプロウイルスクローンのゲノムである、請求項１、２または３に記載のベクター。
10. 請求項１、２または３に記載のベクターを含む細胞。
11. ＨＩＶ−１に対する抗ウイルス活性を示す化合物のスクリーニング法であって、
    （ａ）請求項１、２または３に記載のベクターで感染したまたは感染させるべき哺乳動物細胞に被験化合物を加え、ついで
    （ｂ）該被験化合物に暴露した細胞でのリポーター遺伝子の活性をコントロールの細胞での発現レベルと比較する
    ことを含み、その際、リポーター遺伝子の発現レベルの低減が該被験化合物がＨＩＶ−１の複製を抑制したことを示すことを特徴とする方法。
12. 該哺乳動物細胞がＭＴ−２＃１８細胞である、請求項８に記載の方法。
13. 複製コンピテントなＨＩＶ−１ウイルスをコードするベクターであって、ウイルスの複製に必須でない領域が機能的なレニラルシフェラーゼ酵素をコードする核酸配列によって置換されているＨＩＶ−１ゲノムを含むことを特徴とするベクター。
14. 該レニラルシフェラーゼ遺伝子が、機能的なレニラルシフェラーゼ酵素という結果となるアラニンへのシステイン置換を含む、請求項１３に記載のベクター。
15. ウイルスの複製に必須でない領域がｎｅｆ遺伝子またはｎｅｆ遺伝子のフラグメントをコードする、請求項１３に記載のベクター。
16. ウイルスの複製に必須でない領域がｖｐｒ遺伝子またはｖｐｒ遺伝子のフラグメントをコードする、請求項１３に記載のベクター。
17. 該ＨＩＶ−１ゲノムがｐＮＬ４−３プロウイルスクローンのゲノムである、請求項１３に記載のベクター。
18. 該ＨＩＶ−１ゲノムがｐＹＵ−２プロウイルスクローンのゲノムである、請求項１３に記載のベクター。
19. 該ＨＩＶ−１ゲノムがｐ８９．６プロウイルスクローンのゲノムである、請求項１３に記載のベクター。
20. 該ＨＩＶ−１ゲノムがＨＩＶ−１ Ｌａｉプロウイルスクローンのゲノムである、請求項１３に記載のベクター。
21. 請求項１３に記載のベクターを含む細胞。
22. ＨＩＶ−１に対する抗ウイルス活性を示す化合物のスクリーニング法であって、
    （ａ）請求項１３に記載のベクターで感染したまたは感染させるべき哺乳動物細胞に被験化合物を加え、ついで
    （ｂ）該被験化合物に暴露した細胞でのリポーター遺伝子の活性をコントロールの細胞での発現レベルと比較する
    ことを含み、その際、リポーター遺伝子の発現レベルの低減が該被験化合物がＨＩＶ−１の複製を抑制したことを示すことを特徴とする方法。
23. 該哺乳動物細胞がＭＴ−２＃１８細胞である、請求項１３に記載の方法。

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