JP2004505603A - 植物における細胞壁多糖構造の再構築方法 - Google Patents

Abstract

細胞壁複合多糖類−修飾酵素、例えばエンド−ラムノガラクツロナンヒドロラーゼ、エンド−ラムノガラクツロナンリアーゼ、エンド−ガラクタナーゼ、エンド−アラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、β−ガラクトシダーゼのようなガラクトシダーゼ、キシロシダーゼ及びエキソ−ガラクツロシダーゼの生産を改変するヌクレオチド配列で植物細胞を形質転換することからなる、野生型状態に対して、ペクチン及びヘミセルロースを含む細胞壁複合多糖類構造が修飾されており、修飾が、全体的なグリコシド結合パターン又は単糖プロフィルであるトランスジェニック植物及びその部分の製造方法。修飾は、インビボ又は収穫後に行うことができ、後者の場合、修飾酵素は、例えばゴルジ、小胞体又は液胞に酵素を標的化することによって、その基質から生育中に植物で分離されるか、あるいは、植物では不活性な形態である。収穫後に、酵素をその基質と接触させるか、又は活性化させて、細胞壁多糖類の望ましい修飾を収穫後に得る。トランスジェニック植物物質は、改善された機能を有し、食品及び飼料の製造ならびに医薬もしくは医療上活性な物質として有用である。

Description

【０００１】
発明の分野
この発明は、多糖−修飾酵素をインビボで発現させることによる、高等植物における細胞壁の多糖構造の再構築方法に関する。
【０００２】
技術的背景、従来技術及び本発明の顕著な特徴
高等植物の細胞壁は、セルロース、大部分がヘミセルロースポリマーの構造を有する内部連結荷、ペクチンマトリクスポリマー及び球状ならびに非球状のタンパク質からなる。球状タンパク質という潜在的な例外のほかは、全てのポリマー群は、細胞壁で構造上の役割を果たしている。細胞壁が成熟するにつれて、鎖間及び鎖内双方の架橋結合が形成され、ついにはリグニンが細胞壁に堆積して、細胞壁をかなり安定化し、この結果、その成分への分離、消化及び処理が困難なものとなっている。
【０００３】
この発明は、細胞壁の複合多糖類構造に関してインビボでのコントロールを獲得することに関する。細胞壁ポリマーのうち、半結晶性のセルロースミクロフィブリル単体は、表皮細胞壁に見られる非糖分子、つまりタンパク質、リグニンならびにスベリン及びワックスから構築される種々の種類のポリマーのように、この群から除かれる。ヘミセルロース及びペクチンは広義では細胞壁の複合多糖類群を規定するが、特定の種又は組織で特に豊富であるか又は重要である場合により狭い分類を示す名称によって称される場合がある。少数の例を示せば、カラマツ木のアラビノガラクタン及び穀物種のβ−グルカンである。この発明の関係で、細胞壁複合多糖類群から除かれるのは、構造上の成分ではないが、他の目的、一般には種子の発芽中に再移動される炭水化物の貯蔵に資する多糖類群である。グアー中にあるようなガラクトマンナン、及びタマリンド中にあるようなキシログルカンが２つの例である。
【０００４】
ヘミセルロースポリマーは、一方で、イネ科の草本、カヤツリグサ及びそれらに密接に関連する群に属する植物、及び他方で維管束植物群の種類と数度を異にしている。Ｃａｒｐｉｔａ とＧｉｂｅａｕｔ （１９９３）は、タイプ−Ｉ 細胞壁として非草本型細胞壁、及びタイプ−ＩＩ細胞壁として草本型細胞壁を挙げている。タイプ−Ｉの一次細胞壁は、セルロース、ヘミセルロース及びペクチンがほぼ等量であることによって特徴付けられる。未分化細胞で優勢なヘミセルロースポリマーは、キシログルカン（上記の種子貯蔵キシログルカンと混同すべきではない）である。
キシログルカンは、タイプ−ＩＩ細胞壁では少数のヘミセルロース多糖類であり（〜５％）、ペクチンもタイプ−Ｉ細胞壁に比較して多くはない。ヘミセルロースポリマー、つまりキシラン、アラビノキシラン及びグルカンの広範囲な群は、タイプ−ＩＩ細胞壁のヘミセルロースポリマーの残りを構成する。これらのヘミセルロースポリマーは、タイプ−ＩＩ細胞壁の多糖構造の再建に用いる場合、本発明に特に関連する目的物である。タイプ−Ｉ細胞壁については、本発明は、マトリクスポリマー、つまりペクチン用に特に開発されている。
【０００５】
ペクチンは、２つの基本部分、つまりガラクツロン酸残基からなる本質的に非分枝のポリマー（ホモガラクツロナン、平滑領域としても公知）、及び、長い中性側鎖で置換され得る、ラムノシル及びガラクツロノシル残基が交互になっているポリマー（ラムノガラクツロナンＩ、「毛（ｈａｉｒ）」を有し、毛状（ｈａｉｒｙ）領域としても公知）からなる。ペクチン多糖類は、双子葉植物細胞壁の３０〜５０％を構成する（Ｃａｒｐｉｔａ 及びＧｉｂｅａｕｔ １９９３）。植物細胞壁のペクチンマトリクスは、ホモガラクツロナン（ＨＧＡ）、ラムノガラクツロナンＩ （ＲＧ−Ｉ） 及びラムノガラクツロナンＩＩ （ＲＧ−ＩＩ） ポリマーの複合混合物である（Ｖｏｒａｇｅｎら、１９９５）。ＨＧＡは、特異にメチル−エステル化及び／又はアセチル化され得る１，４ 結合α−Ｄ−ガラクツロン酸 （ＧａｌＡ）残基の非分枝鎖である。比較的エステル化されていないＨＧＡの長さ （接合領域）は他のＨＧＡ分子の類似領域とＣａ^２＋ 架橋結合し、ゲルを形成し得るポリマー及び高次構造を形成できるが、高度にエステル化されたＨＧＡはカルシウム促進ゲル化の可能性を低減させる。他の機序によるゲル化は、しばしばメチルエステル含量の高さに依存している。ＲＧ−Ｉは１，２−α−Ｌ−ラムノース（Ｒｈａ）と １，４−α−Ｄ−ＧａｌＡ 残基が交互になった分枝ヘテロポリマーで（Ｌａｕら、１９８５）、ＲＧ−Ｉ骨格のラムノース（Ｒｈａ）残基に優性に結合している１，４−β−Ｄ−ガラクトース（Ｇａｌ）及び／又は １，５−α−Ｌ−アラビノース（Ａｒａ）残基の中性側鎖を有している。それらは、単一の単位 （β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１（４））又はアラビノガラクタンＩ及びアラビナンのようなポリマーであってもよい。アラビノガラクタンの別のタイプである、アラビノガラクタンＩＩは、主にタンパク質（アラビノガラクタンタンパク質）と結合している。毛の分枝パターンは、種依存性である。ＲＧ−Ｉの側鎖は、フェルラ酸のようなヒドロキシシナミン酸残基を介したエステル結合によって他のペクチン分子に架橋結合していてもよい（Ｆｒｙ １９８６）。ホモガラクツロナン（ＨＧ）とラムノガラクツロナンＩ （ＲＧ−Ｉ）は共有結合していることが、一般に認められている。しかし、平滑領域及び毛状領域の正確な配列ストレッチは、決定されるべき状態のままである。高度に保存されたＲＧ−ＩＩ分子は、ジエステルホウ酸架橋結合で二量体化しうる、既知の糖と結合が最も多様な側鎖で装飾されたホモガラクツロナン骨格を有している（Ｏ’Ｎｅｉｌｌら、１９９６）。
【０００６】
細胞壁の孔度を決定するほかに、シグナル分子（オリゴサッカリン）源としての（Ｃｏｔｅ 及びＨａｈｎ １９９４）、細胞付着の制御、細胞膨張（ＭｃＣａｎｎ 及びＲｏｂｅｒｔｓ １９９４）、細胞壁の機械特性（Ｃｈａｎｌｉａｕｄ 及びＧｉｄｌｅｙ １９９７）及び細胞の分化ならびに器官形成における関与（Ｓａｔｏｈ １９９８）を含むさらなる役割がペクチンポリマーに提案されている。
食品での適用に対するペクチンの適性は、その分子量、中性糖含量、毛状領域に対する平滑領域の割合、メチル及びアセチルエステル化の程度、ならびにホモガラクツロナン骨格に沿ったこれらのエステル基の分布を含む多くのパラメータによって監督下に置かれている（Ｄａａｓら、１９９８， Ｂｒａｃｃｉｎｉら、１９９９）。例えば、Ｃａ^２＋とのホモガラクツロナンの架橋は、毛がごく少量しか存在しない場合に促進され、その結果、安定性を増したゲルが形成される。
【０００７】
多くの豊富な源、例えばポテトの塊茎及びビート糖に由来するペクチンの一次構造は、例えばリンゴ又は柑橘系のペクチンと比較すると、食品への適用に対し品質が劣っている。特に、ポテトペクチンの毛状領域の割合は極めて高く、メチルエステル化の程度が極めて低い（Ｒｙｄｅｎら、１９９０）。後者は、収穫後に作用するペクチンメチルエステラーゼによって引起こされている可能性がある。内因性酵素活性に伴う別の問題は阻止できないので、ポテトのペクチン構造の調整は、十分なゲル化特性を生じさせ、高品質なペクチンと競合させる必要がある。
ヒトの細胞及び組織に生理的に作用する幾つかのペクチン製剤は植物から抽出されており、ヒト由来の高分子複合体との生化学的作用が立証されている （Ｐａｕｌｓｅｎ ２０００）。例えば、毛状領域由来の化合物はインビトロで補体系と相互作用することが示され、この結果、これらの化合物が免疫系に作用する（免疫調節）可能性があることが推論されている（Ｓａｍｕｅｌｓｅｎら、１９９８，１９９９， Ｙａｍａｄａ 及び Ｋｉｙｏｈａｒａ １９９９）。しかし、多くの医薬上の要求は、活性製剤があまり特徴付けられていないために疑問視されている。したがって、ペクチン構造に関するコントロールの欠如は、これらの生化学的／生理学的活性に対する正確な構造−活性関係の決定を排除している。
【０００８】
ペクチンの製造において、又は現在の新たな適用に合うように多糖類の特性を変える手段として、ペクチン及び他の植物細胞壁多糖類を酵素で処理する概念は、最近２０年にわたってかなりの注目を集めるものとなっている。これらの酵素には、特にグルカナーゼ、キシログルカナーゼ、セルラーゼ、フコシダーゼ、キシラナーゼ、エンド−ポリガラクツロナーゼ（エンド−ＰＧつまりＥＰＧ）、ペクチンエステラーゼ、アセチル基で装飾された多糖類の種々の群に特異的なアセチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、エキソ−ポリガラクツロナーゼ及びペクテートリアーゼが含まれる。また、ラムノガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナンリアーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナーゼ及び相当するフラノシダーゼの新たな群が注目を集めている。α−及びβ−特異的酵素のいずれも、興味深い。一例としてガラクトシダーゼを用いると、幾つかのイソ形態のα−ガラクトシダーゼがガラクトマンナンを移動させることができ、特定のβ−特異的な変異体がペクチンガラクタンを解重合させることができる。同様の見解は、上記酵素で修飾した実質的に全ての多糖群に関連している。また、現存の目的に役立っているか、又は藻類もしくは微生物の多糖類の修飾のために人によって選択された多くの酵素は、異なる組成及び由来の多糖類間にモチーフを共有するために、高等植物細胞壁多糖類の点で興味深いものと考えられる。
【０００９】
上記の点から、問題の多糖類、例えばペクチンが細胞壁の非常に複雑な成分で、個々の多糖類の微細な構造がまずまず理解されていることは明らかである。ポリマーの複雑さを考慮すれば、その分解に多くの酵素が関わっていることは驚くに値せず、それは翻って、大きな「ツールボックス」がこれらのポリマーの再建に利用可能であることを意味している。
しかし、植物細胞壁多糖類の修飾に現在利用可能な概念は、主として収穫後の方法に基づいている。これは収穫後の方法を用いてペクチンを修飾する事例で、その方法では、ペクチンを由来植物から最初に抽出し、その後にのみ、所定の適用に対して所望の特徴をもつ修飾ペクチンが得られるようにペクチンを修飾に付す。
【００１０】
これに対し、現在利用可能でないか、又は技術的及び／又は経済的理由から実行できない種々の可能性の範囲を広げるので、例えばペクチンに関しては、ペクチン構造、例えば毛状領域の構造を修飾することによって、インビボで細胞壁多糖類を修飾できる利点がある。したがって、本発明のひとつの主たる目的は、生植物におけるペクチン構造を含む複合多糖構造に関しコントロールを獲得し、それによって、親植物に比較して新たな細胞壁多糖類構造を有する再構築された細胞壁多糖類を含む植物物質を得ることである。ここで用いられるように、用語「新たな多糖類構造」及び「新たなペクチン構造」は、新たな配置を有する、及び／又はポリマーの単糖構築ブロックの割合が変化した、ポリマーを意味する。後述するように結合パターンを決定する際には、（例えば熟成中にみられるような）分子量のシフトダウンに起因する新たな末端基の定量的に些細な量を無視し、大きさのみが変えられたポリマーを新たな構造物としてはここではみなさない。単糖プロフィル及び結合パターン双方の決定では、非糖置換基での装飾も無視し、例えばメチルエステル化の増加によってのみ異なる多糖類を新たな構造物とみなさない。したがって、この発明は、現在の技術に対し、上記の新規な細胞壁複合多糖類構造のインビボでの生成を提供する。
【００１１】
以下（及び以下の実施例）で、インビボで植物細胞壁複合多糖類構造を修飾する可能性を、一例としてポテトを用いるペクチン構造に関して例示する。この発明は、ペクチン又はポテトにいかなる方法でも限定されないが、この発明は、大きな範囲の細胞壁多糖類を修飾するのに有用であり、多くの穀物種及び塊茎に加えて多くの植物器官に関連している。しかし、ポテトはそれ自体（ボイルして、焼いて等）として、又は加工（フレンチフライ、チップ、ピューレ）した後に消費されるのみならず、多くの産業上の適用に使用できる高品質の澱粉を生産するので、多くの国で重要な穀物である。ポテトの塊茎から澱粉を抽出後、主として動物飼料で適用される実質量の（線維及びタンパク質のような）副産物が残る。しかし、これらの副産物は、より高い価値のある製品を生じる可能性のある成分を含んでいる。ポテトの線維画分は、細胞内容物のパッケージング物質、つまり植物細胞壁をともに形成する種々の多糖類の集まりである。これらのうち、ペクチンは、多くの食品での適用において既知のゲル化剤であるので、おそらくもっとも興味深いポリマーである（Ｖｉｓｓｅｒ 及びＶｏｒａｇｅｎ １９９６， Ｄａａｓら、１９９８）。
【００１２】
この発明によれば、例えばエステル基でのホモガラクツロナンの装飾よりむしろ、ペクチンの毛状領域に特に焦点があてられている。毛状領域の量は、ウロン酸に対する中性糖の割合を決定づける。この割合が高い場合には、ペクチンの水結合能も高い。これは、幾つかの食品での適用ならびに非食品での適用に望ましい可能性がある。この割合が低ければ、ペクチンの構造は、食品産業に通常好ましい柑橘系ペクチンの構造に近づく。したがって、ウロン酸に対する中性糖の割合を低下させることは、例えばポテトの澱粉及びビート糖の生産に由来する髄質副産物の物価維持安定策に重要である。
したがって、この発明の別の重要な目的は、遺伝修飾によって生育しているペクチンの毛状領域の割合を低下させることである。ポテトペクチンのゲル化特性の改善に加えて、これは、澱粉の抽出処理を容易にし、その結果澱粉の収率を高くするはずである。
【００１３】
別の目的は、粘度の低い食品（例えばドリンク型ヨーグルト及び類似乳製品）にそれらを用いるため、ペクチンの毛状領域を調整し、回復させることである。「自己プロセシング」塊茎（又は一般に自己プロセシング植物物質）として表されるこの発明の詳細な具体例は、この要求に応える別の技術を提供している。「自己プロセシング」は、植物組織が、収穫後の崩壊によって、細胞内に貯蔵された酵素を放出する性質を意味する。放出された酵素は、細胞壁物質の修飾、一般には容易な回復のために当該多糖類又はオリゴ糖類の切除を触媒する。この技術は、調整されたペクチンポリマー及びこれらから誘導されるオリゴマーの医療用途にも適用できる。
【００１４】
分解酵素を利用するペクチンポリマー構造の収穫後修飾とは対照的に、インビボの修飾は、生合成酵素をエンコードする遺伝子又はシンセターゼ複合体の成分をも利用することができる。シンセターゼ又は装飾（ｄｅｃｏｒａｔｉｖｅ）酵素の活性をアップ−又はダウン−レギュレーションすることは、設計の選択肢を広げるものと認められる。少数の装飾トランスフェラーゼが同定されており、この点で価値のあることが分かっている （Ｐｅｒｒｉｎら、１９９９， Ｅｄｗａｒｄｓら、１９９９， ＷＯ ９９／６０１０３）。このような酵素は、この発明によるペクチン修飾の候補である。
ヌクレオチド糖の相互変換に関与する酵素は幾つかが知られており、特徴付けられた変異体に基づけば（以下参照）、これらの酵素をエンコードする遺伝子は、ペクチン及び他の細胞壁多糖類の生合成に関する間接的な操作に有用であると考えられる。しかし、インビボでペクチンを修飾する好ましい手段は、現在、収穫後のペクチン修飾に有用であることが既に立証されている多糖類−修飾酵素をエンコードする遺伝子である。
【００１５】
修飾細胞壁表現型を示す幾つかのシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）変異体が、単離されている。これらの幾つかは、ヌクレオチド糖プールのレベルで影響を受けている。既存の細胞壁突然変異体のうち唯一のｍｕｒ ８は、ラムノースを欠いているので、特異的なペクチン突然変異体であると思われ（Ｒｅｉｔｅｒら、１９９７）、ｍｕｒ １ （フコース欠損）及びｍｕｒ ４ （アラビノース還元） （Ｍａｙｅｒ １９９８）は、他の細胞壁多糖類のうちでペクチンに影響を及ぼしていると思われる。しかし、このような突然変異体は、シロイヌナズナでは管理できるが、細胞壁多糖類の修飾が関わる穀物植物では管理できない、ランダムな方法で生じる。
ＷＯ ９１／０８２９９号は、果実熟成のコントロールを目的にアンチセンス技術を用いる植物細胞での遺伝子産物の生産阻害方法を開示している。目的遺伝子には、ペクチンエステラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ及びキシラナーゼが含まれる。したがって、この開示は、ここで提供される、新たな細胞壁複合多糖類のインビボでの製造に関連していない。
【００１６】
ＷＯ ９９／０７８５７号は、ペクテートリアーゼ活性が変化している植物及びトランスジェニック植物ならびにその部分及びその子孫由来の、ペクテートリアーゼをエンコードする核酸を開示している。植物でのペクテートリアーゼ活性の増加がペクチンに変化をもたらすことは明らかであるが、この変化は、ペクチンポリマーの分子量変化が生じ得る意味で唯一である。しかし、これは、ここに記載するような新たなペクチン構造をもたらすものではない。
ＷＯ ９３／１３２１２号は、例えばペクチンエステラーゼ活性を低下させるトマトの形質転換用のペクチンエステラーゼイソ−酵素をエンコードするＤＮＡを開示している。
【００１７】
Ｓｏｒｅｎｓｅｎら（１９９９）によって示された”Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｃｔｉｎ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｎｇａｌ ｅｎｄｏ−ｂｅｔａ−１，４−ｇａｌａｃ−ｔａｎｓｅ ｉｎ ｐｏｔａｔｏ” と題されたポスターは、ＲＧ−Ｉのラムノース残基に結合した線状ガラクタンの量を低下させることによって、ポテトペクチンの毛状領域を修飾することが望ましく、またアスペルギルス・アキュリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）由来の真菌性エンド−ガラクタナーゼによって、これらのガラクタンを分解できることが期待されることを示唆している。このポスターは、顆粒結合型澱粉合成酵素（ＧＢＳＳ）のプロモーター又はパタチンのプロモーターの制御下、葉及び塊茎でガラクタナーゼ遺伝子を発現するトランスジェニック植物が生産されるが、細胞壁多糖類におけるガラクタナーゼ発現の潜在的な作用は、理論的にも実験によっても目的とされていなかったことを報告している。
つまり、従来技術は、植物細胞壁で熟成過程をコントロールできること、またこれらの操作は、ポリマーの分子量分布及びメチルエステル化のような置換での装飾を変えることができることを示唆している。熟成についてのこのコントロールの獲得が可能であることは、熟成が進行速度に関してすでに制御されている植物の自然の過程であるから、驚くに値しない。しかし、この明細書で、このような変化は、新たな細胞壁多糖類構造によって伴われるので、無視される。
【００１８】
何人かの研究者は、細胞壁の性質における遺伝子発現についてむしろ不特定の下流での作用を提案しているが、特定技術は開発されていない。植物が、積極的に、注意深く制御された方法で、生育中にその細胞壁を代謝することを考慮すれば、細胞壁の代謝の自然な進行の単なる加速又は減速以上の細胞壁の再構築を植物が許容できることは、極めて驚くべきことである。しかし、ポリマーのエステル化と分子量変化が優勢である一方、ポリマー組成は大部分同じままの従来技術で立証されるように、熟成の遅延に伴う細胞壁の代謝の速度変化と、標的とされる細胞壁複合多糖類を調整し、例えばメチル化分析によって測定される単糖プロフィル及び／又は全体的な結合パターンにおいて高度に予測可能な変化を生じる新たな技術を提供するこの発明の達成とは、明らかに区別する必要がある。
したがって、この発明は、植物細胞壁複合多糖類について標的とされる、特異的な再構築又は修飾のための新たな技術に関する。一般に、この技術の利点は、４つの広いカテゴリーに分けられる。
【００１９】
１．　穀物植物の作物特性の改良
修飾植物の構造。
細胞壁の代謝経過での選択的な干渉は、細胞の分化、形態及び生育に影響を及ぼす。自己剪定（Ｓｅｌｆ−ｐｒｕｎｉｎｇ）植物は、例えば細胞の運命及び生育の経過の決定に重要な細胞壁成分を修飾して設計してもよい。
稔性。
細胞の分離が種子の散布（ＷＯ ９７／１３８６５ ）、花粉の散布及び花柱中央のラメラに沿った花粉管の成長のように重要な生育過程である場合、生育過程は、細胞壁の修飾によって変化し得る。
病原体の侵入。
病原性の真菌及び細菌は、宿主細胞壁の構造に合う一連の多糖類分解酵素の組織的な展開によって植物組織に侵入する。この技術は、侵入を遅らすように細胞壁を変える手段を提供する。シグナル分子、いわゆるオリゴサッカリンは病原体の侵入中に細胞壁から放出されるので、新たな細胞壁構造は細胞壁からのオリゴサッカリンの放出について種々のパターンを生じ、この結果、病原の進路を変更する。症状の進行の低下が達成されるであろう。
【００２０】
２． 植物生産物の改良
食物繊維。
細胞壁の修飾を用いて、食品中の食物繊維の数度を増し、不溶性食物繊維と、頻繁に多くの健康上の要求が伴われる可溶性食物繊維との割合を変えてもよい。
テクスチャー。
細胞壁は、野菜及び果実のテクスチャーの原因で、貯蔵に伴うテクスチャー変化において役割を果たしている。したがって、テクスチャー及び貯蔵寿命の双方が、本発明を用いる修飾の対象である。貯蔵寿命に関わるが、ここに提示される技術は、従来技術に記載されるようなトランスジェニック修飾による熟成のコントロール（加速又は遅延）を補完している。
材料特性。
木及び線維の構造特性は、全体的な植物解剖学、線維細胞結合構造、二次細胞壁形成、木化及び構成している多糖類ポリマーに依っている。後者から生ずる植物物質特性は、この発明によって可能となった標的とされる細胞壁の設計によって改善することができる。インプラント及び幾つかの医療器具のコーティング用の医療用物質、ハイドロコロイドに関連する特性には、水結合能が含まれる。水結合能は、例えば本発明によって可能となったようなペクチン構造の修飾によってコントロールすることができる（以下の４．「調整ペクチン」参照）。
【００２１】
副産物に対する付加価値。
紙又は繊維の製造、醸造、澱粉又は糖の製造に由来する髄質が、特定産業の用途基準を満たさない植物複合多糖類の多い由来源である場合、この発明を問題の穀物植物の設計に用い、それを価値の高い多糖類源にすることによって、髄質の物価を維持安定させることができる。その一例は、以下に例示するようなペクチン画分での物価維持安定策を目的とすることである。
機能的飼料の細胞壁組成は主として消化性、及びそれにより家畜及び家禽での窒素の使用効率を決定づけている。特に、非反芻動物、例えば若い子豚及び家禽では、細胞壁多糖類の消化性は、効率的な飼料利用の点で制限因子である。ここに示される新たな技術を適用することにより、消化性に優れた飼料品がもたらされ、この結果、動物の成長速度を改善することができる。反芻動物では、多糖類及び細胞壁成分の消化性の増加は、反芻動物でのタンパク質分解に影響を及ぼす。というのは、反芻動物の微生物は、タンパク質の代わりに放出されたサッカリンを利用し、こうしてタンパク質を第一胃であまり分解せず、アンモニアをあまり生ぜず、こうして増加した多糖類及び細胞壁成分の消化性が第一胃での分解からタンパク質を助け、それにより多くのタンパク質成分が腸内で溶解されるためである。こうして改善された細胞壁成分及び多糖類の消化性は、タンパク質の利用を増し、第一胃の分解タンパク質からのアンモニア又は窒素の排出を低下する。
【００２２】
３． プロセシング特徴の改善
飲料濾過特性。
植物物質の液化は、例えば収率を増し、フィルターの凝固を妨げるための食品産業酵素を用いて、ジュース及びワインの製造に適用される。この発明は、これらの実践を補完したり、又はこれに替わって、そのような処理のあいだ問題を引起こす多糖類画分を減少／除去する点で有用である。
麦芽製造特性。
麦芽製造中、澱粉は分解するが、穀果の分化した細胞壁のβ−グルカンのみが可溶化され、ビールの透明性に問題を生じる可能性がある。この問題に対する大部分の生物科学的な技術方法はβ−グルカンを完全に消化できる酵母を設計で製造することに向けられているが、この発明を利用すると、細胞壁のβ−グルカン成分のプロセシング特性を改善し、一般に麦芽製造中のプロセシングを改良して、さらに最終製品を改良することができる。
【００２３】
ベーキング特性。
ドウの流動学的特性は、細胞壁多糖類に作用するキシラナーゼ及びグルカナーゼの活性が多い技術的な酵素を用いてしばしば変えられる。細胞壁多糖類がこの発明を用いて望ましいようにすでに修飾されている原料物質は、技術的酵素を付加する実践を補完するか、又はこれに替わることができる。さらに、多糖類及び細胞壁成分の他の修飾は、ドウの特性を改善し、ベーキング特性を改良する。
繊維の軟化。
例えば亜麻の繊維は、産業上の酵素処理を用いて、又は軟化（ｒｅｔｔｉｎｇ）として既知の伝統的な「発酵」処理によって単離される。繊維自体、又は繊維が埋め込まれている組織が、この発明によって可能となったような細胞壁特性に関して修飾されている繊維植物を用いて、取って替わるか、又は補完してもよい。さらに、織物として用いられる他の植物繊維（綿、麻など）の（プロセシングを含む）改良も、この発明の技術を用いて行うことができる。
【００２４】
４． 単離された多糖類
食品成分及び添加剤としての調整ペクチン。
計画的なペクチンは、例えば上記のような品質の劣っているペクチンを通常含む植物物質から、この発明を用いて得ることができる。一般に、このような技術の利点には、低粘度のペクチンの生理活性の維持、エステル分布の均一性、低粘度の高分子量ペクチンの製造、排水からの酸の除去及び分子量の損失がない少量のエステルペクチンの製造が含まれる。他の利点には、簡単なプロセシング、高収率、高強度、安価な原材料の利用、緩やかな処理条件、回収の容易性、低コスト、プロセシングに関する低い環境衝撃及び高品質が含まれる。さらに、この技術は、例えば嗜好に合わない外観の形成に関わる望ましくない多糖類及び細胞壁成分を除き、低品質成分の「材料」の品質を改善できるので、（例えば従来の抽出手法の大部分をなくして製造される）非精製品も利用する。
【００２５】
医療材料及び医薬品としての調整ペクチン。
ペクチンを含む細胞壁多糖類から得られる生物活性な多糖類及びオリゴ糖は、多くが外来植物の幾つかの植物種で検出される。この発明は、細胞壁多糖ポリマー構造に関する有意なコントロールを提供し、例えば穀物植物の多糖類及びオリゴ糖類をデザインし、その結果、生物活性にすることができる。例えば、１以上の特定の穀物植物について最適化されている、製糖所、澱粉の製造所、醸造所などの周知のプロセシング工程を用いるプロセシングで、効率が高く、コストが低いことは、利点に含まれる。
【００２６】
発明の要約
最初の観点において、この発明は、野生型状態に対して、細胞壁複合多糖類構造が修飾されており、その修飾が全体的なグリコシド結合パターン及び単糖プロフィルの少なくとも１つである、トランスジェニック植物物質の製造方法に関する。その方法は、（ｉ）核酸構築物の植物細胞への導入後に、少なくとも１つの目的の細胞壁多糖類−修飾酵素の生産を改変するヌクレオチド配列からなる核酸構築物を準備し、（ｉｉ） 核酸構築物で植物細胞を形質転換し、かつ（ｉｉｉ） その形質転換した植物細胞から、少なくとも１つの細胞壁多糖類−修飾酵素の生産が変化している植物細胞培養物、植物組織又はトランスジェニック植物を得て、野生型植物に対して、標的とされる基質細胞壁多糖類が修飾され、少なくとも１つの単糖の割合が少なくとも１０％変化しているか、又は少なくとも１つのグリコシド結合の割合が少なくとも１０％変化している単糖プロフィルを有するトランスジェニック植物細胞、植物組織又は植物を得る工程からなる。
【００２７】
ひとつの具体例において、構築物の植物細胞への導入後に、少なくとも１つの目的の細胞壁多糖類−修飾酵素の生産を改変するヌクレオチド配列は、そのような酵素、コード化配列がコード化配列の発現を管理するプロモーター（例えば植物組織のような植物由来のプロモーター又はある貯蔵器官に特異的なプロモーターを含む器官特異的プロモーター）に操作可能に連結されている具体例を含む、標的とされる細胞壁多糖類を修飾し得る、真菌又は微生物由来の細胞壁多糖類−修飾酵素をコードする配列である。この明細書において、興味深いプロモーターは、顆粒結合型澱粉合成酵素（ＧＢＳＳ）プロモーター及びＢ３３プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、ポテトの塊茎で細胞壁多糖類−修飾酵素の発現を管理できるプロモーターである。
【００２８】
さらなる具体例において、その生産が改変される、少なくとも１つの目的の細胞壁多糖類−修飾酵素は、内因性酵素、つまり、核酸構築物の植物細胞への導入後に、少なくとも１つの目的の細胞壁多糖類−修飾酵素の生産を改変するヌクレオチド配列が、標的とされる細胞壁多糖類を修飾し得る酵素をコードする内因性配列の発現を調節する配列である具体例を含む、形質転換植物細胞で天然に生産される酵素である。そのような具体例の一例として、標的とされる細胞壁多糖類を修飾し得る酵素をコードする内因性配列の発現を調節する配列は、リプレッサーの発現を低下させるか、又は内因性の目的の細胞壁多糖類−修飾酵素の阻害剤の生産を低下させるアンチセンス配列をコードする配列である。別の例において、標的とされる細胞壁多糖類を修飾し得る酵素をコードする内因性配列の発現を調節する配列は、組換え事象後に、内因性の目的の細胞壁−修飾酵素に操作可能に連結し、細胞壁−修飾酵素のコード配列の発現を管理できる新たな又は修飾プロモーターの挿入を生じる配列である。
【００２９】
上記方法の別の具体例で、構築物の植物細胞への導入後に、少なくとも１つの目的の細胞壁多糖類−修飾酵素の生産を改変するヌクレオチド配列は、組換え事象後に、標的とされる細胞壁多糖類を修飾し得る酵素をコードする内因性配列の発現を、そのような酵素が通常は存在しない植物細胞での位置に標的化させる配列である。
上記方法の有用な具体例では、核酸構築物は、植物細胞への導入後に、細胞ゲノムに組み込まれないウイルスベクターである。
上記方法の詳細な具体例では、細胞壁多糖類−修飾酵素によって修飾される標的とされる細胞壁複合多糖類は、ペクチン又はヘミセルロース多糖類である。適当なペクチン又はヘミセルロース修飾酵素には、エンド−ラムノガラクツロナンヒドロラーゼ、エンド−ラムノガラクツロナンリアーゼ、エンド−ガラクタナーゼ、エンド−アラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、ガラクトシダーゼ、例えばβ−ガラクトシダーゼ、キシロシダーゼ及びエキソ−ガラクツロナーゼ及びその類似体（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）又はイソ型が含まれる。
【００３０】
上記方法のさらに別の具体例では、構築物の植物細胞への導入後に、少なくとも１つの目的の細胞壁多糖類−修飾酵素の生産を改変するヌクレオチド配列は、宿主植物の内因性遺伝子と十分に異なり、同時抑制（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）を生じない。
上記方法のさらに別の具体例では、補助酵素には、一例としてメチルエステラーゼ、アセチルエステラーゼ又はアラビノフラノシダーゼ、ガラクトシダーゼ、キシロシダーゼもしくはフコシダーゼのようなポリマーからひとつの単糖を除くグリコシダーゼが含まれるが、これは目的の細胞壁多糖類−修飾酵素とともに同時発現され、その同時発現によって多糖類−修飾酵素のその基質への接触を促進する。
【００３１】
さらなる観点では、この発明は、少なくとも１つの細胞壁複合多糖類の植物細胞における生合成を修飾し、野生型状態に対して、細胞壁複合多糖類構造が修飾されており、修飾が全体的なグリコシド結合パターン及び単糖プロフィルの少なくとも１つである、トランスジェニック植物物質を得る方法に関する。この方法は、以下の工程からなる： （ｉ） 植物細胞での発現により、少なくとも１つの細胞壁多糖類−修飾酵素を、通常は存在しない植物細胞の区画に標的化させるか、又は植物細胞で天然に生産され、細胞壁多糖類の生合成に影響を及ぼすポリペプチドの発現を変えるヌクレオチド配列からなる核酸構築物を準備し、（ｉｉ） 植物細胞を核酸構築物で形質転換し、かつ（ｉｉｉ） 形質転換植物細胞から、少なくとも１つの細胞壁多糖類−修飾酵素が野生型植物に対して異なる区画に生じる植物細胞培養物、植物組織又はトランスジェニック植物を得る。
【００３２】
上記方法には、得られたトランスジェニック植物細胞、植物組織又は植物において、標的とされる基質の細胞壁多糖類が野生型植物に対し、少なくとも１つの単糖の割合が少なくとも１０％変化しているか、又は少なくとも１つのグリコシド結合の割合が少なくとも１０％変化している単糖プロフィルを有するように修飾されている具体例が含まれる。
【００３３】
上記方法のさらなる具体例において、少なくとも１つの細胞壁多糖類−修飾酵素は、ゴルジスタックと融合しているか、又はそれから分離している膜小胞を含むゴルジ装置に標的化されている。これには、植物細胞での発現により、少なくとも１つの細胞壁多糖類−修飾酵素がゴルジ装置に標的化されるヌクレオチド配列が、少なくとも１つの細胞壁多糖類−修飾酵素からなるキメラ遺伝子産物をコードする配列及びゴルジにキメラ遺伝子産物を標的化しうる配列である具体例が含まれる。このような標的化遺伝子は、例えばそのフラグメントを含むタイプＩＩ膜アンカーゴルジタンパク質、例えばシアリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ又はガラクトシルトランスフェラーゼ、又は可溶性ゴルジ標的化タンパク質、例えばアカエンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ） 可逆的グリコシル化性（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔａｂｌｅ）ポリペプチド（ＲＧＰ１） 又はそのフラグメントである。
【００３４】
細胞壁多糖類の生合成を修飾するための上記方法の別の具体例では、植物細胞での発現により、少なくとも１つの細胞壁多糖類−修飾酵素を、通常は存在しない植物細胞の区画に標的化させるヌクレオチド配列は、導入される植物細胞ゲノムのプロモーターに操作可能に連結される。
【００３５】
別の観点では、この発明は、少なくとも１つの細胞壁複合多糖類、例えばペクチン又はヘミセルロース多糖類が植物物質自体に存在する酵素により収穫後に酵素的に処理される部分からなるトランスジェニック植物、つまり「自己プロセシング」植物を得る方法に関する。その方法は、以下からなる：（ｉ） 核酸構築物の植物細胞への導入後に、植物細胞の非アポプラスト又は非ゴルジ区画で細胞壁多糖類−修飾酵素を発現させるか、又はインビボの条件では不活性であるが、植物細胞由来の植物物質の収穫後に活性化することのできる形態で、細胞壁多糖類−修飾酵素を発現させるヌクレオチド配列からなる核酸構築物を準備し、（ｉｉ） その核酸構築物で植物細胞を形質転換し、かつ（ｉｉｉ） 少なくとも１つの細胞壁複合多糖類を、非アポプラスト又は非ゴルジ区画で発現される細胞壁多糖類−修飾酵素と接触させることにより、又はインビボで不活性な形態で発現される酵素が活性化される条件に収穫した植物物質を付すことにより、適当な収穫後の条件下で、少なくとも１つの細胞壁複合多糖類を収穫後に酵素的に処理できるトランスジェニック植物物質を、前記の形質転換植物細胞から得る。
【００３６】
ひとつの詳細な具体例で、核酸構築物の植物細胞への導入後に、細胞壁−多糖類修飾酵素を非アポプラスト又は非ゴルジ区画で発現させるヌクレオチド配列は、植物の生育中に、細胞壁多糖類−修飾酵素を、液胞、小胞体、細胞質及びプラスチドからなる群から選択される細胞区画に標的化させる配列である。これには、非アポプラスト又は非ゴルジ区画で発現される細胞壁多糖類−修飾酵素が、植物細胞に導入される核酸構築物に含まれる配列によって、又は核酸構築物が導入される細胞ゲノムに存在する内因性配列によってエンコードされる例が含まれる。
収穫後に自己プロセシング植物を得るための上記方法に有用な具体例では、細胞壁多糖類−修飾酵素は、エンド−ポリガラクツロナーゼ、エンド−ペクチンリアーゼ、ペクテートリアーゼ、ラムノガラクツロナンヒドロラーゼ、ラムノガラクツロナンリアーゼ、エンド−グルカナーゼ、エンド−キシラナーゼ、及びそのイソ型又は類似体からなる群から選択される。有用な具体例では、このような酵素の発現は、植物プロモーターによって管理される。
【００３７】
収穫後に処理される細胞壁多糖類がペクチンである上記方法の具体例において、ペクチンのプロセシングは、ラムノガラクツロナンとホモガラクツロナン領域間の領域である。
収穫後に「自己プロセシング」植物を得る方法において、ひとつの有用な具体例は、植物物質自体に存在する酵素によって収穫後に酵素的に処理される細胞壁多糖類を含む、少なくとも１つの細胞壁複合多糖類構造をインビボで修飾し得る酵素を発現させる核酸配列で、植物細胞をさらに形質転換する例である。このような核酸配列は、例えば、細胞壁多糖類−修飾酵素をコードする配列又は細胞壁多糖類−修飾酵素をコードする内因性配列の発現に影響を及ぼす生成物をコードする配列である。有用な具体例では、細胞壁多糖類−修飾酵素は、アポプラストに標的化される。
【００３８】
少なくとも１つの細胞壁複合多糖類構造をインビボで修飾し得る有用な酵素には、エンド−ラムノガラクツロナンヒドロラーゼ、エンド−ラムノガラクツロナンリアーゼ、エンド−ガラクタナーゼ、エンド−アラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、ガラクトシダーゼ、例えばβ−ガラクトシダーゼ、キシロシダーゼ及びエキソ−ガラクツロナーゼ及びその類似体又はイソ型が含まれる。
【００３９】
さらに別の観点では、この発明は、野生型状態に対して、構造及び組成が修飾されている、植物細胞壁多糖類物質を得る方法に関する。この方法は、（ｉ） 収穫後に「自己プロセシング」植物を得る上記方法を用いて、トランスジェニック植物、例えばポテトの植物を準備し、（ｉｉ） その植物を培養して、収穫し、少なくとも１つの細胞壁複合多糖類、例えばペクチンを、植物物質自体に存在する酵素によって収穫後に酵素的に処理できる部分を、植物から単離し、（ｉｉｉ） その部分を、非アポプラスト又は非ゴルジ区画で発現される細胞壁多糖類−修飾酵素をその細胞壁多糖類基質と接触させる条件、又はインビボ条件下で不活性な形態で発現される細胞壁多糖類−修飾酵素が活性化されて修飾細胞壁多糖類を生じる条件に付し、かつ（ｉｖ） 修飾細胞壁多糖類物質を単離する工程からなる。
この方法の有用な具体例で、得られる物質中の修飾細胞壁多糖類は、少なくとも１つの単糖の割合が少なくとも１０％変化しているか、又は少なくとも１つのグリコシド結合の割合が少なくとも１０％変化している単糖プロフィルを有するように修飾される。
【００４０】
さらなる観点で、この発明は、野生型の状態に対して、構造及び組成が修飾されており、上記方法によって得られる植物細胞壁多糖類物質を提供する。
また、対応する野生型細胞壁多糖類を含む物質に対して、少なくとも１つの機能特性が変化している、例えば薬理活性、水結合能、加工性、ゲル化性、粘稠特性及び消化性が変化しているようなトランスジェニック植物物質を含む、野生型の状態に対して、細胞壁複合多糖類構造が修飾されているトランスジェニック植物物質、及びかかるトランスジェニック植物又はその子孫又は一部から得られる植物細胞壁多糖類−含有物質を得るためのこの発明の第一の観点による方法によって得られるトランスジェニック植物、又はその植物の子孫又はその一部が提供される。
【００４１】
さらに別の観点で、この発明は、上記のトランスジェニック植物又はその植物の子孫もしくはその一部あるいは植物細胞壁多糖類−含有物質を、食品、食品添加物、飼料製品、医薬品又は医療品及び化粧品ならびに、医薬組成物、インプラント物質、医療器具及び外科粘着剤を例として含む、上記の植物細胞壁多糖類−含有物質からなる医薬品又は医療品の製造で用いることに関する。
また、対応する野生型細胞壁多糖類を含む物質に対して、少なくとも１つの機能特性が変化している、例えば薬理活性、水結合能、加工性、ゲル化性、粘稠特性及び消化性が変化しているようなトランスジェニック植物物質を含む、少なくとも１つの細胞壁複合多糖類の植物細胞での生合成を修飾するための上記方法によって得られるトランスジェニック植物又は植物のその子孫又はその一部及びかかるトランスジェニック植物又はその子孫又は部分から得られる植物細胞壁多糖類−含有物質が提供される。
【００４２】
さらに別の観点で、この発明は、上記トランスジェニック植物又はその植物の子孫もしくはその一部あるいは植物細胞壁多糖類−含有物質を、食品、食品添加物、飼料製品、医薬品又は医療品及び化粧品ならびに、医薬組成物、インプラント物質、医療器具及び外科粘着剤を例として含む、上記の植物細胞壁多糖類−含有物質からなる医薬品又は医療品の製造で用いることに関する。
【００４３】
さらに別の観点で、野生型状態の対応する細胞壁多糖類に対して、修飾構造及び／又は修飾組成を有する、植物細胞壁複合多糖類からなる物質の製造方法が提供される。その方法は、（ｉ） この発明の第一の観点による方法、又は少なくとも１つの細胞壁複合多糖類の植物細胞での生合成を修飾するための上記方法を用いて、培養可能なトランスジェニック植物、例えばポテト植物、又は培養可能なその子孫を準備し、（ｉｉ） 適当な植物培養条件下で、そのトランスジェニック植物又はその子孫を培養し、修飾構造及び／又は修飾組成を有する少なくとも１つの細胞壁複合多糖類からなる植物物質を得て、かつ（ｉｉｉ） 修飾細胞壁多糖類からなる物質を培養した植物から単離する工程からなる。この方法の有用な具体例では、培養植物から単離される物質は、野生型植物に対して、少なくとも１つの単糖の割合が少なくとも１０％変化しているか、又は少なくとも１つのグリコシド結合の割合が少なくとも１０％変化している単糖プロフィルを有するように修飾される細胞壁多糖類からなる。
【００４４】
発明の詳細な開示
以下の記載及び添付の請求の範囲をとおして、発明を定義するためにいくつかの一般的かつ具体的な用語及び表現を用いる。以下にこのような用語及び表現を定義し、説明する。
用語「新たな多糖類構造」及び「新たなペクチン構造」は、新たなグリコシド結合の配置を有する、及び／又はポリマーの単糖構築ブロックの割合が変化した、つまり単糖プロフィルが変化したポリマーを意味する。結合パターンを測定する際、（例えば熟成中に認められるような）分子量のシフトダウンから生じる新たな末端基の定量的にごくわずかな量を無視し、大きさのみが変えられたポリマーを新たな構造物とみなさない。単糖プロフィル及び結合パターン測定の双方について、非糖置換での装飾をも無視し、例えばメチルエステル化の増加によってのみ異なる多糖類を新たな構造物とみなさない。
【００４５】
多糖類又は多糖類混合物の単糖プロフィルは、ウロン酸についての個別の比色（ｃｏｌｏｕｒｉｍｅｔｒｉｃ）測定を用いるか、又は用いないで、例えば多糖類水解物のアジトールアセテート誘導体のガス−クロマトグラフィーによって、又はＨＰＡＥＣによって、測定される。結合分析は、ガスクロマトグラフィー用の加水分解及び誘導化に先立って全ての遊離のヒドロキシル基を完全にメチル化することにより、多糖類又はオリゴ糖類の非糖装飾を除いて通常行われる。単糖プロフィル及び結合パターンの測定の双方について、不完全な澱粉の除去が結果を歪曲する可能性があるので、実験者がこのランダムでない変化の原因を評価する必要がある。単糖プロフィルは量的成分と質的成分を持つ性質であるが、結合パターンは主として質的特性である。特に、定性特性は生物学的変化を受けやすい。この発明は、細胞壁複合多糖類にここで記載されるような新たな構造物を導入でき、これらは、野生型の対照と比較して認識される（以下参照）。形質転換体は、ある単糖において単糖プロフィルが少なくとも１５モル％、少なくとも２０モル％又は少なくとも２５モル％を含む少なくとも１０モル％異なるか、又は野生型植物に対して結合パターン分析が少なくとも１残基において、少なくとも１５モル％、少なくとも２０モル％又は少なくとも２５モル％を含む少なくとも１０モル％異なるならば、野生型状態とは異なるものと認識される。単糖プロフィル及び結合パターン双方の同時変更は、必要でないが、生じてもよい。幾つかの考えられる修飾は配列のみを留意して、新規な結合でのみ明確にされているが、他は、単糖プロフィルが１個のみ変化している純粋な組成修飾である。
【００４６】
用語「トランスジェニック」又は「形質転換」植物は、遺伝的な形質転換処理により、通常は植物に存在しないＤＮＡ−メチル化パターンを含む核酸配列、又は通常は植物に存在する配列に付加される核酸配列、又は通常植物に存在するが、天然の配列と比較して変化しているＤＮＡ配列が含まれている植物を意味する。この明細書で、変化には、そのＤＮＡメチル化パターンの変更又はゲノム中の配置の変更も含まれる。
用語「野生型」は、安定的に形質転換されておらず、外来遺伝物質を過渡的に発現するように操作されてもいない植物を意味する。野生型植物は、生物学的変化を測定し、この結果比較により、真に新たな表現型を示す操作された植物の同定を可能にするために用いられる。野生型の対照植物は、この発明の状況で適当な対照として役立たせるために、研究中の修飾植物と同じ栽培品種で、本質的に同一条件で成長させるべきである。対照分析の器官及び組織は、同様の生育段階にある実験植物及び対照植物からサンプリングされる。
【００４７】
用語「核酸」は、植物における遺伝物質の維持又は遺伝及び／又はＤＮＡ−メチル化パターンを変え得るＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ （ロック型核酸）、ＰＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ−ハイブリッドを含む核酸物質を意味する。また、天然に存在しないヌクレオシドからなる核酸も含まれる。
用語「核酸構築物」は、植物細胞を形質転換して、トランスジェニック植物の子孫を得るために用いられる遺伝配列を意味する。核酸構築物は、植物での発現のために、少なくとも５’ 及び３’ 制御配列に操作可能に連結されている所望の遺伝子産物のコード領域からなる。このような構築物はキメラ、つまり異なる由来からの配列混合物であってもよく、又はキメラでなくともよい。コード領域の方向付けは、問題の遺伝子産物の意図される機能に応じて、センス又はアンチセンスの方向のいずれであってもよい。
【００４８】
同種組換えによる形質転換は、高等植物で可能であることが最近明らかにされている（Ｋｅｍｐｉｎら、１９９７）。上記定義にしたがってトランスジェニック植物を得る方法を変更し、網羅するのにこれを期待することは道理に合っている。したがって、「核酸構築物」の定義は、これらの新たな技術を包含するものとして理解されるべきである。同種組換えを用いてこの発明を実施するための特に技術的な手法には、プロモーター配列の置換又はリプレッサーのノックアウトによる内因性細胞壁多糖類−修飾酵素の補充が含まれるが、これに限定されない。これは、一般に植物に許容されるか、あるいは少なくとも問題の遺伝子が１以上のイソ型で存在する場合に許容される。同じ理論的解釈にしたがえば、内因性遺伝子産物の細胞下標的化は、そのシグナル配列の置換によって変更できる。最後に、異種遺伝子全体又はそのコード領域は、内因性遺伝子の置換によって植物のゲノムに導入することができる。
【００４９】
また、例えば外来遺伝物質を植物に保有させ、この結果、感染細胞での遺伝子発現を修飾するために植物ウイルスを使用することは実行可能であり、実際に、安定的に形質転換した植物の生産なしでの植物の遺伝的修飾について魅力的な経路となっている。成熟植物を収穫後まもなく感染させることができ、所望の表現型が現れるやいなや、修飾組織を回収した。形質転換細胞の直接的な利用をここで言及する場合、示唆されるのは、これらの過渡的な修飾細胞である。
用語「アンチセンス」は、センス鎖の配列に相補的で、構造遺伝子によってエンコードされるポリペプチドに翻訳できないＤＮＡ鎖の配列を意味する。この発明の目的のため、アンチセンスは逆方向の配列の全て又は一部とともにプロモーターに操作可能に連結される核酸構築物を意味し、ＲＮＡ分子への転写後、センス及びアンチセンス配列間にハイブリダイゼーションを生じ、それにより問題のポリペプチドのレベルを低下させる。ここで用いられる用語「センス」は、ｍＲＮＡ分子コピーに転写され、次いで構造遺伝子でエンコードされるポリペプチドに翻訳される構造遺伝子のＤＮＡ鎖の配列を意味する。
【００５０】
用語「操作可能に連結」は、コード配列の発現に必要な制御配列が、コード配列の発現に影響を及ぼすように、コード配列に対して適当な位置で核酸分子に位置していることを意味する。あるいは、コード配列は、コード配列で形質転換される細胞のゲノム中の制御配列に操作可能に連結することができる。ここで用いられる用語「プロモーター」は、ＤＮＡのＲＮＡ分子への転写を生じるか、又はその必要があるＤＮＡ配列を意味する。プロモーターは、組織特異的又は器官特異的なプロモーター、特定の生育段階で活性なプロモーターであってもよく、あるいは、誘導性プロモーター、例えば後述する誘導性プロモーター又は当該分野で公知の別の誘導性プロモーターの１つ、又はカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターのような構成プロモーター又は当該分野で公知の別の構成プロモーターであってもよい。
【００５１】
用語「ベクター」は、細胞で複製可能（又は例えばＰＣＲ法によってインビトロで増幅可能）な核酸分子を意味し、これに別の核酸配列を操作可能に連結して、結合した核酸配列を複製させることができる。一般に用いられるベクターは後述するものであり、細菌プラスミド及びバクテリオファージが含まれる。
【００５２】
上記の核酸構築物は、従来の組換え核酸技術を用いて植物細胞に導入することができる。一般に、そのような技術は、挿入されたタンパク質コード配列の転写及び翻訳に必要な部位及び形質転換した細胞又は植物の選択を容易にするための１以上のマーカー配列を含む発現ベクターに核酸を挿入することを伴う。いったん核酸構築物を発現ベクターにクローンすると、当業者に公知の従来の形質転換方法を用いてそれを植物細胞に導入することができる。これらには、一般にＰｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍａｎｕａｌ （Ｌｉｎｄｓｅｙ， １９９２， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｓ．， Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ）に記載されるような、アグロリウムベクター、例えばエイ．ツメファシエンス及びエイ．リゾゲネス（Ａ． ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）の使用、プロトプラストのＰＥＧ処理、遺伝子銃を用いる（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）ＤＮＡデリバリー、核酸構築物で被覆した金粒子での照射（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、プロトプラストのエレクトロポレーション又は直接的な核酸の取り込みが含まれるが、これに限定されない。所定の場合における形質転換の適当な方法が形質転換される植物に依存していることは、当業者には明らかである。ここで用いられるように、用語「形質転換」は、核酸の形質転換細胞ゲノムへのその後の導入が生じるか否かに関わらず、植物細胞に核酸を導入する事象を意味する。
【００５３】
用語「植物細胞」は植物から得られる細胞を包含し、カルス及び培養懸濁物、ならびに植物種子、花粉又は植物胚のような未分化組織を含むことを意味する。形質転換に適当な植物組織には、葉組織、根茎組織、分裂組織、プロトプラスト、胚軸、子葉、胚盤、茎端、根茎、未成熟胚、カルス、体細胞、胚発生構造物、花粉及び葯が含まれる。
用語「標的化」は、インビボの細胞壁多糖類の再建又は修飾の方法に関連する場合に、この発明を、本来天然にランダムな突然変異手法と区別し、また発明を多糖類前駆体プールが改変されるトランスジェニック手法と区別することを意味する。後者の方法は、影響を受けている構築ブロックを用いて全ポリマーの単糖プロフィルを同時に変えることができるが、この発明は、特定の細胞壁ポリマーが具体的に修飾され得るという点を目的とする。さらに、用語「標的化」は、標的化多糖類の組成への副作用、例えば細胞壁のフィブリルセルロース又はリグニンの量の低下が、ランダムな修飾としてみなされることを意味する。主要成分が低下した後の細胞壁の残留物は、しばしば他の細胞壁の構築ブロックでの単純な補充をもたらすであろう。
【００５４】
用語「細胞壁複合多糖類」は、この発明が係わる維管束植物に由来する一群のポリマーを意味する。細胞内の複合多糖類、澱粉及びフルクタンは、含まれない。種子の二次細胞壁に堆積されるマンナン、ガラクトマンナン及び貯蔵キシログルカンによって例示される分化した種子貯蔵多糖類も含まれない。セルロースの単純で結晶性のフィブリルは、この明細書では「複合」とはみなされない。例えば、後述するヘミセルロース及びペクチンの広範囲な群が定義により含まれる。
用語「ヘミセルロース」又は「ヘミセルロース多糖類」は、（貯蔵キシログルカンに相対する）構造的なキシログルカン、キシラン、アラビノキシラン及び種々の非セルロース性β−グルカンを意味する。
用語「ペクチン」又は「ペクチン多糖類」は、上記した、ペクチンとして一般に知られる一群の多糖類、つまりホモガラクツロナン、キシロガラクツロナン、ラムノガラクツロナン及びアラビノガラクタンポリマーの混合物形態の植物細胞壁に認められる多糖類物質を意味する。
【００５５】
用語「平滑領域」は、一般にＯ−アセチル及びＯ−メチル基でのエステル化の程度が色々なガラクツロン酸単位を含む、ホモガラクツロナンからなるペクチンの一次的に直線状の非分枝領域を意味する。平滑領域は、さらにキシロガラクツロナン及びラムノガラクツロナンＩＩのストレッチを含んでいてもよい。
用語「毛状領域」は、骨格がＧａｌＡとＲｈａからなり、その種々の側鎖が主要成分としてアラビノース及びガラクトースを含むラムノガラクツロナンＩからなるペクチンの分枝鎖領域を意味する。
【００５６】
用語「多糖類−修飾酵素」は、細胞壁複合多糖類構造又はその一部を修飾し得る酵素を意味する。多糖類構造は、上記のように新たな構造物を示す場合に新規とみなされる。できるだけ多くの非糖装飾を、新たな多糖類の定義で無視し、これらの分子の移動の原因となる酵素は多糖類修飾酵素とみなさない（以下の「補助酵素」の定義参照）。多糖類骨格の生合成に係わるグリコシルトランスフェラーゼは、多糖類−修飾酵素とはみなされない。合成酵素の発現の操作は、実際、多糖類構造に主たる変化を生じ得るが、この発明に比較すれば、これは、修飾に依らない技術を、新たな多糖類を得るための基本的に異なる方法としてみなす。さらに、多糖類のひとつの糖残基の装飾で役割を有する遺伝子を同定することは、この発明に関連している（以下の「装飾酵素」の定義参照）。多糖類修飾酵素は、一般に多糖類の変性又は代謝回転に関与する酵素のカテゴリーに属する。これらの酵素の非限定的な例には、エンド−ラムノガラクツロナンヒドロラーゼ、エンド−ラムノガラクツロナンリアーゼ、エンド−ポリガラクツロナーゼ、エンド−ペクテートリアーゼ、エンド−ペクチンリアーゼ、エンド−ガラクタナーゼ、エンド−アラビナナーゼ、エンド−キシログルカナーゼ、エンド−グルカナーゼ、キシラナーゼ、アラビノキシラナーゼ、キシロガラクツロナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フコシダーゼ、エキソ−ガラクツロナーゼ及びキシロシダーゼが含まれる。興味深い特定の多糖類−修飾酵素の具体的な取得には、アスペルギルス・アキュリータスのエンド−ガラクタナーゼ（ＡＣ−番号 Ｌ３４５９９） 又はそのイソ型もしくは類似体、例えばアスペルギルス・ツビジェンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ） 由来の類似体ＡＪ０１２３１６ ； ラムノガラクツロナンリアーゼ（ＡＣ−番号Ｌ３５５００） 又はそのイソ型もしくは類似体； 及びアスペルギルス・アキュリータスのエンド−１，５−α−アラビナナーゼ（ＷＯ ９４／２０６１１のＳＥＱ ＩＤ ＃ １） 又はそのイソ型もしくは類似体、例えばアスペルギルス・ニガー由来の類似体Ｌ２３４３０が含まれる。
【００５７】
用語「装飾酵素」は、ペクチン骨格又は側鎖に、ひとつの単糖側鎖又は非糖置換基、一般にフェロイル、アセチル又はメチルエステルを付加する、トランスフェラーゼのような酵素を意味する。したがって、装飾酵素は、トランスフェラーゼでもあり、ペクチン骨格（ホモガラクツロナンと交互になったラムノガラクツロナン骨格）ならびに長い側鎖（ガラクタン及びアラビナンがかなり豊富）のポリマー化を受ける合成酵素複合体とは別に設定される。
【００５８】
用語「補助酵素」は、上記の装飾酵素の定義から理解されるように、ペクチンの装飾を除く酵素を意味する。装飾は、しばしばペクチンを多糖類−修飾酵素に接触不能にし、このためにマッチングする補助酵素との後者の同時発現が可能になり、一次酵素とそのペクチン基質間の相互作用を最適化する。補助酵素の例には、エステラーゼ、例えばホモガラクツロナン又はラムノガラクツロナンに特異的なメチルエステラーゼ又はアセチルエステラーゼ、ならびにポリマー、例えばアラビノフラノシダーゼ、ガラクトシダーゼ、キシロシダーゼ又はフコシダーゼからひとつの単糖を除くグリコシダーゼが含まれる。
【００５９】
「分子農業」は、野菜、果実又はその画分（例えばジュース又は穀粉）の製造に対する、特定分子の製造用の製造手段として植物を用いる実施を意味する。十分に明らかにされている分子を回収するための植物の製造物の一般的な例は、植物油、糖及び澱粉である。トランスジェニック技術は、植物で農作できる分子の範囲を劇的に広げており、用語は特にこれらの広い展望に関してここで用いられる。
用語「類似体」は、異なる生物由来の２つの（酵素をエンコードする）遺伝子間の以下の関係を示すために用いられる： 遺伝子は、配列類似性が進化上の関連性（但し、限界の）を示し、その遺伝子産物が同じ反応を触媒し、２つの生物において本質的に類似するか又は重複する生理学的目的に資する場合に、類似体とみなされる。
【００６０】
用語「イソ型」は、同じ生物由来の２つの遺伝子間の以下の関係を示すために用いられる： 遺伝子は、配列類似性が進化上の関連性を示し、エンコードされる酵素が同様の反応を触媒する場合に、同じ遺伝子産物のイソ型をエンコードする。イソ型は、生物において異なる生理学的機能に資するものであってもよく、又はそうでないものであってもよい。
用語「組織特異的」及び「器官特異的」は、同化性の誘導性プロモーターも含まれるようにプロモーターに関して用いられる。同化性の誘導性プロモーターは、その同化、例えばショ糖の誘導によってのみ、埋没器官（ｓｉｎｋ ｏｒｇａｎ）での発現をしばしば管理する。全ての実際的な目的に対しては、これらは、この明細書で特異的な貯蔵器官と考えられる。
【００６１】
細胞壁複合多糖類は、細胞壁、つまりプロトプラストの外側に堆積するが、生合成の主要工程はゴルジ装置で生じる。したがって、多糖類−修飾酵素は、これらの位置のいずれかで基質と接触し、基質によって作用して、ゴルジからアポプラストに移動する。
ある観点において、この発明は、一般に適当な細胞下の局在性を確保するのに必要な修飾に全く構わずに、植物遺伝子の異所性発現、又は微生物遺伝子の異種発現に関する。植物遺伝子によってエンコードされるアポプラスト酵素のシグナル配列は、キメラ構築物で遺伝子産物が通常蓄積しない器官への発現を管理するのに用いられる場合でも、植物種にわたって一般に機能している。植物細胞で発現される場合には、分泌される真菌酵素でさえアポプラストを通る。当業者は、アポプラストへの分泌が天然の遺伝子を用いては機能しない遺伝子を設計するために利用可能な技術、つまり一般には機能が知られている植物又は真菌配列で非機能性シグナル配列を置換することによる技術又は置換しないで前記配列を有する遺伝子を得る技術に習熟しているであろう。
【００６２】
当業者は、ゴルジにおける導入遺伝子産物を確実に位置付ける植物のシグナル配列を用いて、適当な配列を用いて導入遺伝子を設計し、合成部位のペクチンを含む細胞壁多糖類の修飾を完了することができると考えられる。以下の実施例８はこの発明の具体例を記載しており、その実施例では、ラットの遺伝子の一部を用いてゴルジが確実に標的化されている系統発生的に大きな隔たりにわたって、シグナル配列がしばしば正確に作動するという事実が利用されている。
この発明の別の観点は、多糖類の所望の再構築を触媒する酵素基質への接触を容易にするために、特定種のペクチンの装飾を除く酵素をエンコードする遺伝子を同時発現することに関する。この発明の具体例は、補助酵素を用いて言及している。後述する実施例９は、関与する設計及び形質転換を例示している。
【００６３】
一般に（酵素が適当な活性のために補助酵素を要しない限り）一対の酵素の同時発現に関する別の観点は、自己プロセシング植物物質（例えばポテトの場合には自己プロセシング塊茎）に関する。この具体例は、標的とされる細胞壁多糖類、例えばペクチンの予備選択部分又はフラグメントの酵素的な切除を伴うが、その一部又はフラグメントは再構築に付されていても、付されていなくてもよい（後者の場合、技術は同時発現を伴わなくともよい）。収穫後の予備選択部分又はフラグメントの切除は、基質から個別に植物細胞で貯蔵される酵素、つまり生育植物中の細胞壁多糖類構造の変化を全く触媒しない酵素によって行うことができる。切除を行う酵素が局在する可能性のある位置についての非限定的な例には、液胞、小胞体、細胞質及びプラスチドが含まれる。その位置は、植物における安定性及び問題の遺伝子産物の植物に対する潜在的な毒性に基づいて選択される。しかし、環境温度で実質的に不活性であるか、又は植物のアポプラストにみられるｐＨ範囲（ｐＨ ３〜７．５）で実質的に不活性な酵素を利用することによって、基質との（結合とは別の）相互作用を回避でき、所望の場合に酵素を適当な条件変化によって活性化できるならば、酵素はアポプラストに直接貯蔵されてもよい。活性化処理には、熱、塩の添加、有機化合物の添加、物理的処理（ｐＨ変化）、プロテアーゼの添加（例えば修飾酵素の阻害部分を切出すプロテアーゼ）、タンパク質の添加（例えば修飾酵素の別の本質的なサブユニット）が含まれる（しかし、これに限定されない）。
【００６４】
要約すれば、標的とされる多糖類は望ましい場合にはインビボで再構築される。植物は、切除を触媒する酵素の要件に必要な条件下に、浸潤した植物物質の培養工程を導入することによって収穫後に処理され、この結果、貯蔵された酵素がその基質によって作用することができる。放出されたフラグメントは、次いで精製に適した状態で回収される。この技術は、２つの点で技術的な酵素を用いるよりも優れている：技術的な酵素は、副活性が存在するため、生成物を分解せずに多糖類の所望の部分又はフラグメントを切除することによってのみ作用するのに十分なほど純粋ではない。多くの植物器官、ポテトの塊茎のような貯蔵器官は、内因性の多糖類−修飾酵素について極めて低いバックグラウンドを生じる。さらに、切除を行う酵素は、植物組織の有効な均質化に依存しているので、外部から添加される技術的な酵素に比較して、その基質に非常によく接近するが、酵素がその基質又は基質と密接に結合している区画とともにすでに存在している場合には、そのようなことがない。
【００６５】
以下の実施例３及び１０は、小胞体における細胞壁多糖類−修飾酵素の保持及びそのような酵素の液胞への標的化を例示している。以下の実施例１２は、ガラクタナーゼ修飾毛状領域を放出するポテトの塊茎を含む自己プロセシング植物物質を設計するための詳細なストラテジの例を示しており、この例は、細胞質における遺伝子産物の蓄積をも立証している。
これまでに示されている技術の適用には、調整したオリゴ糖と多糖類の分子農業が含まれる。なんらかの領域でこの技術を用いることにより、他の産業からの副産物の物価が維持安定され得る。ビート糖の製造から生ずる髄質及び澱粉の製造から生ずる髄質は、天然の状態では価値が低いが、その価値をこの発明によって改善できるペクチンを含む、細胞壁多糖類の多い副産物の非限定的な例である。
【００６６】
医療上の適用には、創傷ドレッシング、移植又はインプラント用物質、生物適合性外科接着剤、免疫調節化合物及び血液凝固調節剤などの医薬化合物ならびに医療物質の提供が含まれる。ここに示される技術の使用は、最終製品の分子農業に限定されないが、発見段階ですでに重要である。ペクチンのような調整多糖類を生産する植物は、医療適用上の構造活性の余地をカバーする、つまり研究中の適用に対する機能特性を保持すると同時に構造上の変化を表すポリマー及びオリゴマーのライブラリーの系統的な作成に用いることができる。当該分野では、そのようなライブラリーの評価からのデータに対する、化学計測（ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃ）多変量分析、ＱＳＡＲ （定量構造活性関係）及びＱＳＰＲ （定量構造特性関係）の適用方法自体が知られている。
【００６７】
この発明の目的のため、被子植物の単子葉及び双子葉植物の双方を含む維管束植物に属する植物の再構築、つまり細胞壁複合多糖類の酵素修飾が考えられる。例えばペクチンの調整に関して、双子葉植物及び非−コメリノイド（ｃｏｍｍｅｌｉｎｏｉｄ）の単子葉植物が特に重要である。逆に、ヘミセルロースポリマーの再構築は、後者のカテゴリーの幾つかの種、特に飼草及び穀類では極めて関連性がある。この発明によって修飾され得る、市場で重要な植物のさらに非限定的な例には、大豆、タバコ、パセリ、ニンジン、カリフラワー、キャベツ、ブロッコリー、ポテト、サツマイモ、インゲン豆、エンドウ、チコリ、レタス、ビート、蕪、ラディッシュ、ホウレンソウ、タマネギ、ニンニク、コショウ、セロリ、柳、ポプラ、カボチャ、ぺポカボチャ、ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、メロン、プラム、チェリー、桃、ネクタリン、アプリコット、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボガド、パパイヤ、マンゴー、バナナ、柑橘種、シロイヌナズナ、ウキクサ及びトマトが含まれる。非維管束植物には、藻及び海藻が重要である。
【００６８】
詳細な具体例では、この発明は、例えば平滑領域から毛状領域を切断するか、及び／又は毛状領域の個々の側鎖を除くか短くすることによって、ペクチンの毛状領域を修飾する酵素を用いることに関している。この理由のため、そのような酵素を発現し、ペクチンが毛状領域にインビボで修飾されているトランスジェニック植物を生ずるヌクレオチド配列は、重要である。「自己プロセシング植物物質」として表されるこの発明の詳細な具体例では、ポリマーの一部を可溶性にするか、又は細胞壁のマトリクスからポリマーを放出する酵素は重要である。ここでの焦点は、問題の多糖類のポリマー構造を切断する酵素にある。
【００６９】
当業者が気づいているように、問題の細胞壁多糖類は、植物細胞壁の定量的かつ機能的に重要な成分である。このため、その性質により、可能な修飾の程度について限界を設定する必要があると考えられる。したがって、この発明に関連して行われる修飾が、生存できない植物を生じるような、あまり強烈なものであるべきではないことは明らかである。雄性の不稔性及び既述の他の望ましい特性に対する手段として、成長を損なう細胞壁の変化から生じる何らかの生育変化を利用し、局所的に細胞を切除してもよい。他方、上記のように、発明者らは、細胞壁多糖類の単糖プロフィル及び全体的な結合パターンについて有意な修飾が可能であるが、依然として生存可能な植物が維持されることを驚くべきことに見出した。これらの意外な知見に基づけば、この技術を用いることにより、広範囲な種々の修飾細胞壁多糖類を、植物の生存性を犠牲にせずに得ることができると考えられる。
【００７０】
細胞壁複合多糖類の修飾方法
この発明によれば、細胞壁複合多糖類は、幾つかの異なる方法で問題の植物物質の生育中に又は収穫後に修飾することができる。これらは、手短に言えば以下に要約される：
（ｉ） 細胞壁複合多糖類の生合成、例えば移動及び重合化工程に直接関わる植物遺伝子の調節による、プールサイズ（ｐｏｏｌ ｓｉｚｅ）の操作及び基質分子の輸送による、又は翻訳及び分泌経路への参加後に、その生合成位置でペクチン又はヘミセルロースの炭水化物を代謝回転させる、ゴルジ装置に保持される多糖類−修飾酵素の発現によってポリマー生合成へ緩衝することによる、生合成の操作。
【００７１】
（ｉｉ） アポプラストの空間、その結果、細胞壁への直接的な翻訳後輸送を確保し、細胞壁へのその並置後又は填充生長後に問題の酵素基質と直接的に相互作用するシグナルを備えた適当な多糖類−修飾酵素の発現による堆積後修飾。
（ｉｉｉ） 生育中に生産され、その後、生植物ではなく、収穫後条件下でのみ活性な酵素の選択を間接的に介して、適当な細胞小器官又は区画で翻訳後蓄積する１以上の多糖類−修飾酵素の収穫後放出。
【００７２】
細胞壁多糖類 − 修飾酵素の器官 ／ 組織特異的発現
この発明の多糖類−修飾酵素の発現、及びこの結果、所定植物のある部分のみに対する修飾細胞壁多糖類の製造を目的とするストラテジは、いっそう大きな範囲のインビボでの細胞壁多糖類修飾を可能にするものと考えられる。例えば、ポテトでは、塊茎のみで多糖類−修飾酵素を発現させ、他の植物部分は天然の多糖類構造を維持しているのが有利であると考えられる。
このようにして標的とされるこの発明による多糖類−修飾酵素の発現は、組織特異的調節配列を用いて適宜行うことができる。多くのそのような組織特異的配列は、当該分野で知られている。
【００７３】
ＵＳ ５，７２３，７５７号は、例えば所望のＤＮＡ配列の「埋没組織」特異的発現を確実に行う植物遺伝子の５’ 転写制御因子の使用を開示している。このような転写制御領域は、「埋没器官」、つまり根茎、種子、果実又は塊茎のような植物の光合成不活性部分に特に生じさせるために、所望のＤＮＡ配列を発現させる。その結果、当該遺伝子産物が、ある組織で発現又は阻害される。制御領域は、クラスＩパタチン遺伝子に属するパタチンタンパク質をコードする遺伝子から特に得られる。
ＵＳ ５，４３６，３９３号は、ポテトのパタチン遺伝子、特にパタチン遺伝子のＢ３３プロモーター配列に由来するポテト塊茎特異的制御領域からなる発現カセットのＤＮＡ配列を開示している。発現カセットを用いてポテト細胞を形質転換することにより、Ｂ３３プロモーター配列に融合した異種由来のＤＮＡ配列が塊茎特異的な方法で発現されるトランスジェニックポテト植物を生産することができる。
【００７４】
塊茎への発現を管理する他の公知のプロモーターには、ポテト由来の推定上のメタロカルボキシペプチダーゼ阻害剤（受入れ番号Ｕ３０３８８）、ポテトリポキシゲナーゼ（受入れ番号Ｘ９５５１３） 及びカテプシンＤ阻害剤（受入れ番号Ｘ７４９８５）が含まれる。当業者は、所望の特異性を有する他のプロモーター領域を切出し、所望の多糖類−修飾酵素でキメラ遺伝子構築物を調製することができる。少なくとも幾つかの塊茎特異的プロモーターはその器官特異性をショ糖誘導に負っているので、これらのプロモーターが、ショ糖を蓄積している他種の器官、例えばビートの根茎でしばしば操作性であることは驚くに当たらない（タバコの葉におけるＧＢＳＳプロモーターの活性をここで実施例１０に例示する）。逆に、ショ糖誘導性プロモーターが他種から同定でき、由来する種に特異的な唯一の貯蔵器官であるだけでなく、ポテトに塊茎特異性を付与することが見出されたことは、当業者に意外なことではない。例えばポテトの塊茎で高度な発現を確実に行うプロモーターには、ＧＢＳＳ及びＢ３３プロモーターが含まれる。
【００７５】
植物細胞壁多糖類の生合成の修飾
ペクチン又はヘミセルロース多糖類の再構築の機会は、異なる合成レベルで作用する酵素を用いて入手できる： （ｉ） ヌクレオチド糖のプールの維持、（ｉｉ） 特定骨格のポリマー化、及び（ｉｉｉ） 種々の置換基（グリコシル残基、メチル及びアセチル基）でのこれらの骨格の装飾。
生合成への干渉は、この発明によれば、生合成を干渉するゴルジ装置に多糖類−修飾酵素を標的化して行うことができる。酵素は設計して、膜に固定され、この結果ゴルジに保持されるか、あるいは最終的にはアポプラストに細胞壁多糖類と共に分泌されるような可溶性酵素としてゴルジに標的化させることができる。ゴルジ膜に固定化される酵素が、自身が膜に結合している生合成複合体と上手く相互作用しているというのは、意外な知見であった。したがって、膜固定及び可溶性変化はいずれも興味深く、前者はきわめて特異的であることが予想される。また、この具体例は、幾つかの分泌される多糖類ヒドロラーゼの植物に対する潜在的な毒性に起因する問題に可能性のある解決策を提供している。
【００７６】
何通りかの証拠が、エリシター酵素による植物細胞壁の酵素分解を介して放出されるオリゴガラクツロニドが植物細胞で特異的応答を誘発できるとの知見を支持している（Ｍｏｌｏｓｈｏｋら、１９９２）。したがって、植物細胞のインビボでの修飾に対し潜在的な候補である、この発明による１以上の酵素は、オリゴガラクツロニドについて認められる知見に似た応答を開始できる炭水化物オリゴマーを放出するものと考えられる。
【００７７】
タバコのＮ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＩ由来のＮ−末端７７アミノ酸は、ニコチアナ・ベンタミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）細胞のゴルジ装置でレポータータンパク質を保持するのに十分であることが分かっている。Ｅｓｓｌら（１９９９） とＤｈｕｇｇａら（１９９７）が、多糖類合成で役割が暗示されているポリペプチドをクローンしたところ、これらのポリペプチドは、内在性タンパク質（アカエンドウマメ可逆グリコシル化性ポリペプチド（ＲＧＰ１） Ｕ３１５６５）を伴わないゴルジである。シロイヌナズナからは、アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＡＪ２４３１９８及びキシロシルトランスフェラーゼＡＪ２７２１２１が同定されている。シロイヌナズナのゲノムを完全にシーケンシングすることにより、当業者は、さらなるゴルジ標的化遺伝子産物についてゲノムを研究する方法を知るであろう。さらに可溶性で完全な植物のゴルジタンパク質が特徴付けられるので、ゴルジの標的化について多糖類−修飾酵素を設計するために配列を利用できる。現在、ほとんど関連していない種間で少なくとも幾つかのゴルジ標的化配列が機能的である事実を利用してもよい。この発明の詳細な具体例で、ラット遺伝子由来の配列は、この実施例８で立証されるようにそのまま用いることができる。
【００７８】
細胞壁多糖類の堆積後修飾
以下の実施例５は、ペクチンの毛状領域によって例示されるように細胞壁多糖類について予め選択した部分又はフラグメントの単糖プロフィルについて標的とされた変化に対し真菌のガラクタナーゼを用いることを例示している。ガラクタン側鎖は、側鎖がもはや酵素の基質ではない程度まで短くされる。植物は、ウロン酸の相対的含量及び絶対含量を増し、アセチル化の程度を増すことによって補償する。
この場合、ガラクタンは、短い単糖側鎖での装飾（もっとも一般的には、アラビノシル装飾）を少し含むか、又は全く含まず、補助酵素の同時発現が不要であった。必要な場合には、この発明の詳細な具体例は、プロセシング中に同時に作用する補助酵素に加えて、当該再構築酵素が付いた二重構築物（ｄｏｕｂｌｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を利用している（以下の実施例４及び９参照）。
【００７９】
この実施例２及び７は、ラムノガラクツロナンリアーゼ、つまりペクチン毛状領域骨格に軽い傷を負わせる酵素の発現を例示し、この酵素がアセチル及びメチルエステルでの装飾に関わらず、ペクチンポリマーを切断できることを立証している。これが該当しない場合、補助酵素、一般的なラムノガラクツロナン又はホモガラクツロナンアセチルエステラーゼ又はメチルエステラーゼは、骨格に軽い傷を負わせる一次再構築酵素とともに同時発現される。
【００８０】
収穫後修飾及び自己プロセシング植物物質
自己プロセシング植物物質、例えば塊茎は、収穫後に所望の画分を除きながらインビボで基質との相互作用を妨げるように、既に説明したような植物組織に１以上の酵素を貯蔵することによってデザインされる。この発現は、生育中に目的の細胞壁多糖類の再構築を触媒する別の酵素の発現で調整することができる。上記のように、植物の生育中のプロセシング酵素の隔離は、例えば液胞、小胞体、細胞質及び／又はプラスチドであってもよく、あるいは化学的な隔離によるものであってもよい。内部に貯蔵される酵素は、例えばＫＤＥＬ保持シグナルを用いて小胞体に、又はパタチンもしくはスポラミンから得られるシグナル配列を用いて液胞に標的化されてもよい。
【００８１】
収穫後に、処理、一般に均質化又は浸潤形態の物理的処理に付すことによって、内部に貯蔵された酵素を細胞壁多糖類と接触させ、細胞壁物質の収穫後修飾を触媒する。収穫後修飾の重要で興味深い具体例は、インビボで修飾されるポリマーの髄質物質からの放出である。一例として調整ペクチン毛状領域を用いると、これらは、ペクチンの平滑領域を切断する酵素の作用によって放出される。以下の実施例１２は、細胞質、液胞に対する植物又は真菌のエンド−ポリガラクツロナーゼの標的化、及び小胞体（ＥＲ）での保持を例示している。細胞内部分は、酵素の各部位での安定性と達した蓄積ならびに異なる位置に蓄積された場合の酵素の植物に対する毒性の可能性に基づいて選択される。自己プロセシングのための植物物質の浸潤及び培養条件は、内部貯蔵酵素の性質、植物組織中の干渉性内因性酵素の存在及び回収されるポリマー又はオリゴマーの安定性の可能性によって選択される。酵素が補助酵素を要し、したがって三次又はより高等なベクター構築物が得られ、この結果、この発明の具体例を拡張できることは、前記の記載から理解される。
【００８２】
細胞壁多糖類メッシュからペクチン多糖類を放出できる所望の特性を有する酵素は、特に、多糖類骨格を切断する（補助酵素によって任意に助けられる）酵素からなる。ペクチン及びペクテートヒドロラーゼ及びリアーゼ、ラムノガラクツロナンヒドロラーゼ及びリアーゼは、この性質を有する既知の酵素のカテゴリーである。キシロガラクツロナンに対する酵素活性は同様に有用であり、多糖類骨格の分化した構造上の特徴に新たな活性を例示するものとしてみなされるべきである。ペクチン側鎖を除くことのできる酵素は、この明細書で再構築酵素として最初に考察される。しかし、側鎖の除去が特定のオリゴ糖を可溶化する例が十分あり得ることも明らかである。
酵素の内部貯蔵を可能にする技術がそれ自身のために酵素の分子農業に有用であることは、明らかである。また、技術が機能性飼料の製造に有用なことは明らかである。「機能性飼料」は、１以上の細胞内に蓄積された多糖類−修飾酵素が植物物質自体ならびに混合されている他の飼料成分の消化性を増す家畜及び家禽用の食物を意味する。実施例１０は、タバコの葉のＥＲにおけるアラビナナーゼの蓄積を立証している。
【００８３】
修飾ペクチン又はそのフラグメントの食品産業上の適用
ペクチンは、重要な食品の添加物及び成分であり、植物物質のテクスチャーを決定付ける重要な要因であることが知られている。その構造、特に分子が多量に分枝している領域（毛状領域）での構造の修飾は、ポリマーの物理特性及び細胞壁物質の性質を変える。この技術により、ホモガラクツロナンに対する中性糖の側鎖の割合を操作することができる。この割合と相関し、食品産業において主たる注目を集めているペクチン相の機能特性はゲル化、ゲル安定性及び水結合効率であり、後者は毛状領域の割合が高いポリマーに偏っており、最初の２つはホモガラクツロナン含量が高いポリマーに偏っている。
【００８４】
ポテトペクチンは、中性糖含量が高く、ゲル化を妨げるアセチル基が存在するために、食品産業には全く用途が見出せていない。歴史的観点から、高品質のレモン及びライムのペクチンの使用は、通常、一方ではゼリー、ジャムなど（高メチル−エステルペクチン）、他方、低糖製品（ペクチンカルシウムのような低メチル−エステルペクチン）の用途に向けられている。しかし、最近１０年のあいだ、適用分野は広げられ、今や乳化剤及び安定化剤、ならびにフライに先立つ製品のコーティングとしての使用が含まれている。ペクチンから得られる分子の新たな適用には、飲食可能な食物繊維としての使用が含まれる。したがって、ペクチンがむしろ高い粘性を生じるという問題がある。しかし、ペクチンのホモガラクツロナン部分を分解する時に、ラムノガラクツロナン部分（修飾毛状領域−ＭＨＲ）がかなり低い粘度で同じ繊維作用を維持していることが示されている（ＥＰ ０８６８８５４−Ａ２）。同様のＭＨＲは、ポテトースによって生産される調整ペクチンからこの発明にしたがって得ることができる。ここで、キーワードは低コスト及び大量の原材料であり、いずれもポテトの髄質原材料の特徴である。理想的には、澱粉のプロセシング中に活性化されるＰＧ−活性を導入し、ポテトのジュースに直接修飾毛状領域を生じるポテト、つまり、自己プロセシング塊茎が関連しているポテトを生産することができる。これは、澱粉のプロセシングを簡単にし、低コストで修飾毛状領域を生じる。澱粉プロセシングの容易化は、促進された抽出性、又は「あまりまとまっていない」塊茎細胞、つまり直接的な細胞壁の薄化が細胞壁の意図的な調整又はペクチン再構築の副作用として生じる細胞に起因している。当然、澱粉の貯蔵器官のみに関連する澱粉の抽出とは別に、幾つかの（豊富な）源に由来する低品質のペクチンに関連した問題やここに示される技術によって成される解決は、いずれもポテトに特異的ではない。その技術は、他の穀物植物、例えばビート糖にも関連している。
【００８５】
より専門化した食品上の適用には、ポリマー溶液の水結合能及び粘度ならびに「食感（ｍｏｕｔｈ ｆｅｅｌ）」に関するコントロールが必要である。天然の又は調整されたラムノガラクツロナンは、ミルクシェーク、ドリンク型ヨーグルトなどの粘性の低い製品としての使用が見出される。
さらに、ペクチンの設計は、ジュース、サイダー及びワインの産業に有用で、このためにぶどう、りんご及び他の果実に関連している。ジュースと果膠は、ハイドロコロイド及び懸濁されたオリゴ糖ならびに多糖類を除き、ジュースを清澄にし、後の加工段階で濁ったり、沈殿物が生じるのを妨げるためにしばしば濾過される。濾過は、可溶性を増したり、あるいは逆に沈澱性を増すために、ペクチンを調整することによって容易化することができる。この発明は、可溶性で懸濁されるペクチンポリマーに依存しているジュース及び果膠の特性に対するコントロールを獲得するための新たな機会を提供している。
【００８６】
最後に、ペクチンは細胞壁孔度を媒介するので（Ｂａｒｏｎ−Ｅｐｅｌら、１９８８）、調整ペクチンは、カルシウムの固定化及び缶詰化に関連する同様の処理に影響を及ぼす可能性がある。 したがって、この発明は、例えばここに記載するように修飾ペクチンで植物物質を用いることによって、例えば缶詰化、カルシウム固定、ろ過等に関する一般的な植物物質の食品産業上の加工性を改善する方法を提供する。
【００８７】
修飾植物細胞壁多糖類の医療上の適用
種々の産業上の適用のためにペクチン多糖類を修飾するための上記した種々の可能性に加えて、修飾ペクチン物質を含む修飾細胞壁多糖類は、医薬及び医療分野での種々の用途に有用であることも考えられる。例えば、この発明は、インビボで細胞壁多糖類の構造を修飾して、例えば免疫調節に関する特異的な性質を有するように修飾された多糖類を生産することができる。さらに、この発明にしたがって開発され、生産される修飾細胞壁多糖類が、原因がどのようなものでも、物理的ダメージ、化学剤及び細菌、真菌、ウイルスならびに他の微生物などの生物剤に起因する炎症を含む、あらゆるタイプの炎症反応用抗炎症化合物としての一般的な使用に適当であることも考えられる。
【００８８】
調整された細胞壁複合多糖類の使用は、２つの基本領域、医薬及び医療用物質の適用に分かれる。慢性的な治癒しない創傷、乾癬（疾患に対する自己免疫成分を有する）によって引起こされる創傷、壊疽を伴う創傷用の創傷ドレッシングの製造及び人工肛門形成製品に現在用いられている材料は、ほとんど完全に、（一般に多くのペクチン及びヘミセルロースポリマーと共有している）その物理特性のために選択されるアルギン酸塩及び修飾セルロースに依存している。種々の形態の慢性的な創傷の治療を目的とした創傷ドレッシングには、物理化学特性が重要である。これらには、ゲル化能及びゲル強度、水結合能、帯電密度及び親水性が含まれる。これらの特性は、植物多糖類の食品産業上の用途に関連して十分に研究されている。修飾細胞壁多糖類は、ドレッシングが創傷によって生じる水を除くか、又は細胞免疫系が表面に接触するように乾燥壊疽に水を与える水緩衝系として作用し得る。しかし、ペクチンの生物活性は、ペクチンに独特である。望ましい生物活性には、細胞成長因子のレザバーとして作用し、このために慢性的な創傷での細胞成長を刺激するペクチンの可能性が含まれる。
【００８９】
別の興味深い展望は、移植片として使用される培養皮膚細胞から再成長皮膚用の足場としてペクチン膜を使用することである。
自己免疫過程を阻害するか、又は自己免疫過程の作用を妨げるか、もしくは治療するための薬剤としての使用は、広範囲な疾患に適用可能であると考えられる。ある種の潰瘍は自己免疫的な態様を伴うと考えられており、これらの場合にも、ラムノガラクツロナンと思われるペクチン構造は活性であることが分かっている（Ｓａｋｕｒａｉら、１９９８）。さらに、そのような自己免疫関連症状の非限定的な例には、自己免疫肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性溶血性貧血、グレイブズ疾患、重症筋無力症、Ｉ型真性糖尿病、炎症性ミオパシー、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、自己免疫副腎炎、クローン疾患、潰瘍性腸炎、糸球体腎炎、進行性全身性硬化（強皮症）、シェーグレン疾患、エリトマトーデス、原発性脈管炎、慢性関節リウマチ、若年性関節炎、混合連結組織疾患、乾癬、天疱瘡、類天疱瘡、皮膚ヘルペスなどが含まれる。
【００９０】
また、幾つかのタイプの癌と闘うための修飾ペクチン及び他の多糖類の使用が考えられる。例えば、修飾された柑橘系のペクチン（ＭＣＰ）がメラノーマ（皮膚癌）及び前立腺癌を含む種々のタイプの癌に対抗できることが示唆されているのは明らかである。この作用は、転移の初期段階にＭＣＰによって生じる細胞増殖抑制性又は「抗粘着性」の作用を伴うと考えられる（Ｒａｌｐｈ Ｗ． Ｍｏｓｓ， ｈｔｔｐ：／／ｒａｌｐｈｍｏｓｓ． ｃｏｍ／ｍｃｐ．ｈｔｍｌ）。修飾ペクチン多糖類を同定し、生産するための、ここに概説する方法を用いることによって、抗癌剤としての使用に適した修飾ペクチンを含む新たな修飾細胞壁多糖類物質を得て、例えば分子農業技術によって市場で生産することができると考えられる。
【００９１】
医療分野での適用は、医薬物質及び医療物質の製造に限定されず、以前の発見段階にも、例えば細胞壁のオリゴ糖及び多糖類のライブラリーの作成用ツールとして、またそのようなオリゴ糖及び多糖類の所望の医薬活性の構造上の要件を決定するツールとして関連している。例えばペクチンポリマーは、交互に他の小さな繰り返し構造からなる反復単位として合成される。ここに記載される再構築技術はペクチンポリマーがあまり十分に特徴付けられていないという事実を変えはしないが、分子間の相違がかなり正確に知られている分子群を生産することができる。例えば、実施例５に記載されるエンド−ガラクタナーゼを発現する塊茎由来のラムノガラクツロナンは、ガラクタン毛の長さ、アセチル化の程度及びウロン酸含量によって相当する野生型ポリマーと異なる。それ故、これらの特徴が認められる生物活性に必須であるかどうかを正確に決定付けることができる。
【００９２】
一例としてペクチンを用いる場合、参加物（ｅｎｔｒｙ）間の相違が知られているライブラリーを（たとえ正確な構造が知られていなくても）、以下の工程を用いて作成することができる：
１）　調整ペクチンを、十分に確立された方法で修飾された多糖類を生じる、ある範囲の各トランスジェニック植物から回収し、
２）　工程１の試料を分けて、インビトロで酵素を用いて収穫後に処理し、
３）　工程２の試料を分けて、化学処理、ケン化及び例えば部分的な加水分解、及びインビトロでの誘導化によって修飾する。パーメチル化、アセチル化、エポキシ化及びアミド化は、後者の非限定的な例である。誘導化のタイプ及び方法は、食品成分産業、織物産業及び有機合成ならびに炭水化物の分光学からそれ自体公知である。
【００９３】
工程２ 及び３は、望ましい場合には、化学修飾が、酵素反応に対して分子の幾つかの部分を保護するか又は曝す目的に役立つように、逆の順序で行ってもよい。
ライブラリーの参加物は、次いで当該分野でそれ自体公知のスクリーニング方法を用いて医薬活性のスクリーニングに付される。特定化合物の構造−機能関係は明らかなので、これは、収穫後（工程２）に用いられる酵素処理の幾つかを（植物による補償が可能な）植物に移転し、それにより、ペクチンのインビボでのプロセシングによって植物でできるだけ調整される原料物質について分子農業用形質転換植物を得るか否かを決定するのに有用な情報を与える。
この発明を、以下の非限定的な実施例及び図面によってさらに例示する。
【００９４】
図１は、アスペルギルス・アキュリータスのエンド−ガラクタナーゼを発現する２つのトランスジェニックのポテト植物Ｔ_１１．１ 及びＴ_１３．１を野生型と識別するための予備的な主成分分析（ＰＣＡ）の使用を例示する。それは、第三及び第五主成分（ＰＣ）スコアを用いて、Ｔ_１３．１ と野生型との比較を示している。
図２は、野生型ポテト塊茎（ＷＴ）及びトランスジェニックポテト植物Ｔ_１１．１ ならびにＴ_１３．１の細胞壁から、それぞれ真菌性ＥＰＧとＰＭＥの組合わせ処理によって特別に抽出されるラムノガラクツロナンＩ（ＲＧＩ）のサイズ排除クロマトグラフィー分析（屈折率によって検出）（不定単位）を示す。このＥＰＧ／ＰＭＥ処理は、野生型と比較して形質転換塊茎の細胞壁からほぼ２倍のウロン酸（ＵＡ）を放出した。野生型細胞壁からＥＰＧ／ＰＭＥによって抽出されるＲＧＩは、ＵＡ含量及び屈折率検出によって示されるように２つの主画分：画分（分子量＞５００ ｋＤａ） 及び画分 Ｃ （分子量 ０．２〜８ ｋＤａ）を含んだ。Ｔ_１１．１ 及びＴ_１３．１のＥＰＧ／ＰＭＥ抽出物は、画分Ａをあまり含まず、実質的には画分Ｃが多く、さらに野生型抽出物には存在しない〜１２０ ｋＤａのフラグメント （画分Ｂ）を含む、野生型とは異なるプロフィルを有する。＊は、ペクチン物質が全くない試料の緩衝塩が存在することに起因する、大きなピークを示す。
【００９５】
図３は、モノクローナル抗体ＬＭ５でゴールドラベル（ｇｏｌｄ ｌａｂｅｌｌｅｄ）し、銀で増強し、反射共焦走査顕微鏡（Ａ， Ｂ）で及び透過型電子顕微鏡（Ｃ， Ｄ）で可視化した、野生型（Ａ， Ｃ）及びエンド−ガラクタナーゼ−発現（Ｔ_１３．１） （Ｂ， Ｄ） ポテト塊茎の切片を示す。野生型柔組織細胞壁は強く標識されている（Ａの白色、Ｃの黒色粒子）が、Ｔ_１３．１の塊茎では、ラベル密度は非常に減少し、原形質膜に近い（Ｄの矢印）幾つかの細胞の角（Ｂの矢じり）にのみ局在している。＊は、澱粉顆粒によっていったんは占有された空間を示す。ＭＬは、これらの角で満ちた拡張したミドルラメラを示す。スケールバー：Ａ及びＢ １００ ｍｍ、Ｃ 及びＤ ２ ｍｍ。
【００９６】
実施例
材料と方法
試薬及び酵素
一般的な分子生物学的方法に用いられる酵素は全て、特に断らない限りＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ （Ｄｅｎｍａｒｋ）から購入した。細胞壁の特徴付け用の薬品及び試薬は、Ｓｉｇｍａから購入した。ブタの膵臓α−アミラーゼはＭｅｒｃｋ （Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、バシラス・アシドプルリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ）のポルラナーゼ（ｐｏｌｌｕｌａｎａｓｅ）とアスペルギルス・ニガーのエンド−ポリガラクツロナーゼは、Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ （Ｂｒａｙ， Ｉｒｅｌａｎｄ）から購入し、アスペルギルス・アキュリータスの精製組換えペクチンメチルエステラーゼ（ＰＭＥ）は、Ｄｒ． Ｋｉｒｋ Ｓｃｈｎｏｒｒ （Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ， Ｂａｇｓｖａｒｄ， Ｄｅｎｍａｒｋ）からの寄贈物であった。
【００９７】
植物の形質転換
ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ） （Ｌ．） ｃｖ． Ｘａｎｔｈｉ． のリーフディスクの形質転換は、本質的にＨｏｒｓｃｈら（１９８５）によって記載されるようにして行った。形質転換体及び野生型植物双方のインビトロの植物由来の節間を温室に移し、成熟植物を得た。葉を回収し、分析に用いた。ポテトｃｖ Ｐｏｓｍｏ 及び Ｋａｒｎｉｃｏを、アグロリウム・ツメファシエンス媒介性形質転換に用いた（Ｖｉｓｓｅｒ， １９９１）。トランスジェニック及び対照のクローンの苗条をインビトロで温室に移し、成熟植物を得た。
【００９８】
ＤＮＡ 分析
ＤＮＡは、Ｒｏｇｅｒｓ 及びＢｅｎｄｌｉｃｈ （１９８８）によって記載されるようなＣＴＡＢプロトコルにしたがって、液体Ｎ_２中ですり潰した葉から抽出した。トランスジェニッククローン中の導入遺伝子の存在を決定付けるために、単離したゲノムＤＮＡを、 ｃＤＮＡ内で２度切断するＥｃｏＲＩと、ｃＤＮＡ内で１度切断するＫｐｎＩで消化した。消化したＤＮＡを電気泳動で分離し、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）によって記載されるようなアルカリ条件下でＨｙｂｏｎｄ Ｎ 膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にブロットした。膜は、Ｓａｌｅｈｕｚｚａｍａｎら （１９９２）に記載されるように、ラムノガラクツロナン−リアーゼ／ｐＹＥＳ２の^３２Ｐ−ＡＴＰ ラベル１ ｋｂ ＫｐｎＩ−ＸｂａＩ ｃＤＮＡフラグメントでハイブリダイズさせた。
【００９９】
ＲＮＡ 分析
ＲＮＡは、Ｋｕｉｐｅｒｓら（１９９４）によって記載されるように各トランスジェニック系の１塊茎から抽出した。組織（５ ｇ）を液体Ｎ_２ですりつぶし、５ ｍｌの抽出緩衝液（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ９．０， １０ ｍＭ ＥＤＴＡ， ２ ％ ＳＤＳ） 及び５ ｍｌのフェノールと混合した。混合物を遠心分離し（２，０００ｇで１０分）、上清を５ ｍｌのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、混合物を再度遠心分離した。核酸を５ ｍｌのイソプロパノールで沈澱させ、遠心分離した（２０００ｇで１０分）。ペレットを１１２５μｌのＨ_２Ｏに溶解した。ＲＮＡを、一晩０℃で３７５μｌの８ Ｍ ＬｉＣｌを用いて沈澱させ、遠心分離した（１３，０００ｇで１０分）。ＲＮＡペレットを０．４ ｍｌのＨ_２Ｏ に溶解し、４０μｌの３ Ｍ ＮａＡｃ 及び１ ｍｌのエタノールを用いて沈澱させた。遠心分離後に、ペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、Ｈ_２Ｏに再懸濁させた。ＲＮＡゲルブロッティングとハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）によって記載されるように、試料当たり４０μｇの塊茎ＲＮＡを用いて行った。膜は、以下の^３２Ｐ−ＡＴＰラベルｃＤＮＡプローブ：　ラムノガラクツロナン−リアーゼ／ｐＹＥＳ２の１ ｋｂ ＫｐｎＩ−ＸｂａＩフラグメント及びポテト２８Ｓ リボソームＲＮＡ遺伝子の２．３ ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントを用いてハイブリダイズさせた（Ｌａｎｄｓｍａｎｎ 及びＵｈｒｉｇ， １９８５）。
【０１００】
葉及び塊茎の抽出物の調製
新たに回収した葉を、液体Ｎ_２を用いて凍結し、すりこ木とモーターを用い、組織１ｇ （新鮮な重量）当たり３ ｍｌの抽出緩衝液Ａ （完全なＴＭを含む２５ ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ ５．０， Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で粉砕した。試料を氷上で１０分インキュベートし、不溶性物質を１０分の遠心分離（１８，０００ ｘ ｇ_ｍａｘ）によって沈澱させ、上清を回収し、２０℃で貯蔵した。新たに回収した塊茎を小さな立方体に切断し、液体Ｎ_２に凍結し、電気グラインダーで微粉末に細粉した。粉末を上記のような抽出緩衝液Ａで抽出した。
【０１０１】
ガラクタナーゼ活性アッセイ
酵素活性は、５０ ｍＭ クエン酸ナトリウムｐＨ ４．５中の上部０．５％及び下部１％のアガロース層でプレートアッセイを用いて測定した。上部層は、１ ｍｇ／ｍｌ濃度の基質、アズリン−結合ポテトガラクタン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｂｒａｙ， Ｉｒｅｌａｎｄ）の懸濁液を含んだ。組織上清のアリコート（２０μｌ）を上部層のみにあいたウェルに加えた。プレートを、２４時間室温でインキュベートした。
可溶性の定量ガラクタナーゼアッセイ。
野生型及び形質転換体（Ｔ_１１．１及び Ｔ_{１ ３．１}）の塊茎抽出物を、４０℃で基質として０．１ Ｍ ＮａＯＡｃ ｐＨ ４．０ 中０．１％濃度のポテトガラクタン（ＭｅｇａｚｙｍｅのＰ−ＧＡＬＰＯＴ）とともにｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジンアッセイ（Ｌｅｖｅｒ １９７２）を用いて、エンド−ガラクタナーゼ活性についてアッセイした。
【０１０２】
アラビナナーゼ活性アッセイ
酵素活性は、５０ ｍＭ クエン酸ナトリウムｐＨ ５．５中の上部０．５％ 及び下部１％ のアガロース層でプレートアッセイを用いて測定した。上部層は、基質の懸濁液、１ ｍｇ／ｍｌ 濃度のアズリン−結合糖−ビートアラビナン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｂｒａｙ， Ｉｒｅｌａｎｄ）を含んだ。組織上清のアリコート（２０μｌ）を、上部層のみにあけたウェルに加えた。プレートを２４時間室温でインキュベートした。
【０１０３】
アスペルギルス ＲＧ− リアーゼ活性
凍結したポテト組織を、液体窒素を加えてモーターですりつぶした。約１ｇのすりつぶしたポテトの組織を、０．４ Ｍ ＮａＣｌを含む０．２５ Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５； ４℃）２ｍｌ中で、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ ＴＰ １８−１０ （１４，０００ ｒｐｍ， Ｉｋａ Ｗｅｒｋ， Ｓｔａｕｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて均質化した。４℃で（周期的に振盪させて）抽出してから１時間後、懸濁液を遠心分離した（１０分， ２，０００ ｇ）。上清を、酵素抽出物として用いた。
次に、上清５μｌを、０．１ Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ５．０中０．２５ ％ ｗ／ｖのケン化されたリンゴＭＨＲ の溶液２４５μｌに加えた。ボルテックスミキサーで４０℃で１５分インキュベーション後、１００℃で５分加熱して酵素を失活させた。ケン化されたリンゴのＭＨＲの分解を、ＨＰＳＥＣ （ＢｉｏＧｅｌ ＴＳＫ ４０ＸＬ、３０ＸＬ及び２０ＸＬ カラムのシリーズ）を用いて測定した。
【０１０４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 及びウェスタンブロット
塊茎の抽出物を、標準的な方法にしたがってＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析に付した。ブロットを、精製したアスペルギルス・アキュリータスのガラクタナーゼ（Ｊｅｎｓ−Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｎａｖａｒｒｏ Ｐｏｕｌｓｅｎ， Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｔｕｄｉｅｓ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎからの寄贈物）に対して生じるウサギ抗体でプローブした。
【０１０５】
フーリエ変換赤外線顕微分光光度計
インビトロの植物からの２０個の葉の表皮、及び２０個の個々に新たに回収した野生型ならびにトランスジェニック（１１．１， １１．２ 及び１３．１）の塊茎のビブラトーム切片（６０μｍ）を、フッ化バリウム領域にのせ、空気乾燥させた。フッ化バリウム領域は、液体窒素−冷却水銀カドミウムテルル化物検出器を備えたＢｉｏ−Ｒａｄ ＦＴＳ１７５ｃ ＦＴＩＲ 分光計のＵＭＡ５００顕微鏡補助段階で支持された。皮質及び延髄（ｐｅｒｉｍｅｄｕｌｌａｒｙ）領域の１００μｍ^２領域を選択し、スペクトルを観察した。６４個のインターフェログラムを８ ｃｍ^−１の解像の透過モードで回収し、同時に加え、各試料のシグナル−ノイズ比を改善した。スペクトルは、ベースライン修正し、面積を標準化した。領域１８００〜８００ ｃｍ^−１の面積標準化スペクトルの予備主成分分析（ＰＣＡ）を、ＷＩＮ−ＤＩＳＣＲＩＭソフトウエア（Ｅ．Ｋ． Ｋｅｍｓｌｅｙ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｎｏｒｗｉｃｈ， ＵＫ）を用いて行った。
【０１０６】
トランスジェニックポテト塊茎におけるペクチンの分析
ポテト植物におけるペクチンの微細構造を決定するには、ポテトの塊茎から細胞壁物質（ＣＷＭ）を単離することがまず必要である。ポテトの塊茎から皮を剥がし、さいの目に切り、液体窒素で凍結させた。その後、組織１００ ｇを、Ｂｒａｕｎ マルチミックスＭＲ ８６０キッチンチョッパー（２ ｘ ３０ 秒、３５０ワット）を用いて粉末に切り刻んだ。ポテト粉末を、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ Ｔ２５ （２４，０００ ＲＰＭ）を用いて、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００ （２ ｍｇ／ｍｌ）を含む３００ｍｌの混合−カチオン緩衝液（１０ ｍＭ ＮａＯＡＣ， ３ ｍＭ ＫＣｌ， ２ ｍＭ ＭｇＣｌ_２ 及び１ ｍＭ ＣａＣｌ_２）で４℃で７ｘ６０秒で均質化した。また、ブレンド中の泡立ちを最小限にするために、オクタノールを数滴加えた。冷却した混合−カチオン緩衝液を用いて２５０及び３６μｍの篩いで洗浄し、界面活性剤を除いた。この方法は４℃で行った。洗浄した残渣を篩いから除き、冷却した５０％アセトン中に攪拌した。試料を濾過し、大きなビーカーに計量した。試料の５倍重量の飽和フェノール溶液を加えた。攪拌から３０分後、吸引して飽和フェノールを除き、残渣をグレード３の焼結ガラスろうと上で混合−カチオン緩衝液で洗浄した。
【０１０７】
残渣を、液体窒素中で小さなペレットに凍結し、コーヒーグラインダーで２ ｘ １５秒、凍結粉砕した。融解直後に、試料を混合−カチオン緩衝液を用いてペーストに混合した。このペーストを、沸騰している大量の混合−カチオン緩衝液に迅速に攪拌し、３０秒沸騰させた。３０秒の沸騰直後に、混合物を冷却した混合−カチオン緩衝液（１０容量）に移し、すぐに冷却させる。
澱粉の除去は、０．０１％ ｗ／ｖ ＮａＮ_３を有する混合−カチオン緩衝液中約１，５００単位のα−アミラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）及び４００単位のプルラナーゼ（ｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ） （Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を用いて行った。試料は、３７℃で一晩軌道振盪器で攪拌した。澱粉が依然として残っていれば、酵素処理を繰り返した。澱粉の存在は、光学顕微鏡下１％ ＫＩ／０．５％ Ｉ_２を用いて検出された。澱粉の除去がＫＩ染色によって評価されるように完全である場合には、細胞壁を３６μｍの篩いで洗浄し、グルコースと塩を除いた。残渣を、細胞壁物質として凍結乾燥した。
【０１０８】
得られたＣＷＭは、Ｈｕｉｓｍａｎら（１９９９）によって記載されるように種々の溶媒での抽出により分画した。１ｇのＣＷＭ当たり、７０ ｍｌの ０．０５ Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ５．２を２回用いて６０分室温で抽出し、４０ ｍｌの０．０５ Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ５．２ を３回用いて４５分７０℃で抽出し、０．０５ Ｍ ＥＤＴＡ と０．０５ Ｍ シュウ酸アンモニウムを含む３５ ｍｌの０．０５ Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ５．２を３回用いて４５分７０℃で抽出し、最後に４０ ｍｌの０．０５ Ｍ 水酸化ナトリウムを３回用いて４５分２℃で抽出した。各抽出工程後、懸濁液をグレード３の焼結ガラスろうとで濾過した。
これは、５つの異なる画分、冷緩衝液可溶性固体（ＣＢＳＳ）、熱緩衝液可溶性固体（ＨＢＳＳ）、キレート化剤可溶性固体（ＣｈＳＳ）、アルカリ可溶性固体（ＡＳＳ）及びヘミセルロースリッチな残渣（Ｒｄｓ）を生じた。それぞれ、異なる割合の細胞壁ポリマーを含んだ。次の分析前に、全画分を凍結乾燥した。
【０１０９】
ＣＷＭと画分を、異なる技術を用いて特徴づけた： 中性糖の組成は、試料を１ Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４ 加水分解（１００℃で３ ｈ）に付して測定した。次に、放出された中性糖を、アルジトールアセテートに転化し、２００℃で操作され、２７０℃に設定したフレームイオン化検出器を備えたＣａｒｌｏ Ｅｒｂａ Ｆｒａｃｔｏｖａｐ ２３００ ガスクロマトグラフィー（Ｍｉｌａｎ， Ｉｔａｌｙ）中の、３％ ＯＶ２７５ （Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ， Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で被覆したＣｈｒｏｍ ＷＡＷ ８０−１００ メッシュを充填した２−ｍｍ ｉ．ｄ． ガラスカラムで分離した。イノシトールを、内部標準として用いた。
アセチル及びメチルのエステル化の程度は、Ｖｏｒａｇｅｎら（１９８６）によって記載される方法を用いてＨＰＬＣにより評価した。
【０１１０】
ペクチナーゼ、例えばポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、エンド−アラビナーゼ、エンド−ガラクタナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ペクテートリアーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼを、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＢｉｏＧｅｌ ＴＳＫ ４０ＸＬ、３０ＸＬ及び２０ＸＬ カラムのシリーズ）及びＤｉｏｎｅｘ ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ−１００カラム（２５０ ｘ ４ ｍｍ， ２０℃）を備えたＤｉｏｎｅｘ （Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ， ＵＳＡ） Ｂｉｏ−ＬＣ ＧＰＭ−ＩＩ クォータナリー（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ）勾配モジュールを用いる高速アニオン交換クロマトグラフィーと組み合わせて用い、ペクチン画分の構造をさらに解明した。しかし、可溶性の問題は、これらの実験を妨げた。
野生型ポテトペクチンの構造解析から得られる結果は、トランスジェニックポテトペクチンとの比較に用いられる。酵素の特徴づけ中に生じた可溶性の問題は、凍結乾燥の代わりに溶液中で画分を維持することによって解消できると考えられる。さらに、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用い、純粋かつ十分に特徴付けられた酵素により放出されるフラグメントを研究することによって、別の情報を得ることができる。
【０１１１】
ペクチン多糖類の単離
Ｏ’Ｎｅｉｌｌら（１９９０）の方法にしたがって、澱粉を除いた細胞壁物質（１０ ｍｇ）を、アジ化ナトリウム０．０５％を含む２ ｍｌの５０ ｍＭ 蟻酸アンモニウムｐＨ ４．５中に懸濁した。ＥＰＧ （１ ｕ、１分当たりに還元ガラクツロネート１μｍｏｌを放出する１単位）と ＰＭＥ （１ ｕ、１分当たりにメタノール１μｍｏｌを放出する１単位）を加え、懸濁液を１６時間４０℃でインキュベートした。次いで、懸濁液を２層ナイロン（３０μｍ孔度）で濾過し、１０ｍＭホウ化水素ナトリウムを含む１ｍｌの氷冷５０ｍＭ炭酸ナトリウムに懸濁した残りの細胞壁物質からＥＰＧ／ＰＭＥ抽出物を分離した。この懸濁液を１時間４℃でインキュベートし、次いで室温で４時間インキュベートした。不溶性物質を、２層のナイロンで濾過して除いた。ろ液のｐＨをｐＨ ５に調整し、ＥＰＧ （１ ｕ）を加え、混合物を４時間４０℃でインキュベートし、可溶化したペクチン物質を部分的に脱重合した。この消化された可溶性の細胞壁物質を炭酸抽出物と命名した。
【０１１２】
ＥＰＧ／ＰＭＥ 及び炭酸抽出物双方を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２カラム（１ ｘ ３０ ｃｍ， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィーに付した。抽出物をカラムにかける前に、カラムを５０ ｍＭ蟻酸アンモニウムｐＨ ５．０で平衡化し、流速０．４ ｍｌ／分で同じ緩衝液を用いてアイソクラティックに溶出した。溶出物を、屈折率検出器（モデル１３１， Ｇｉｌｓｏｎ， Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ， ＷＩ）を用いてモニターし、回収した画分（０．８ ｍｌ）のウロン酸含量を、ｍ−ヒドロキシビフェノールアッセイ（Ｂｌｕｍｅｎｋｒａｎｔｚ ＆ Ａｓｂｏｅ−Ｈａｎｓｅｎ １９７３）を用いて決定した。画分をプールし、凍結乾燥し、その単糖組成を決定付けた。溶出成分の分子質量は、デキストラン標準（Ｆｌｕｋａ， Ｂｕｃｈｓ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及びガラクツロン酸のものに対する保持時間を比較して評価した。
【０１１３】
単糖組成分析
シーマン（Ｓｅａｍａｎ）加水分解（Ｓｅｌｖｅｎｄｒａｎら、１９７９）を用いて、単糖組成解析用の粗又は不溶性の細胞壁残渣を加水分解したが、可溶化した細胞壁画分は、２ Ｍ水性ＴＦＡを１時間１２１℃で用いると単糖に加水分解した。シーマン加水分解は、後述するように行った。細胞壁の残渣（２〜４ ｍｇ）を、ねじ蓋を付けたホウ珪酸塩試験管中の１００μｌの超純水に加え、３００μｌの濃Ｈ_２ＳＯ_４を加え、時折り攪拌しながら懸濁液を室温で３時間置いた。次に、懸濁液を６．６ ｍｌの超純水で希釈し、２時間１００℃で加熱した。冷却後、溶液を飽和水酸化バリウムで中和した。得られたＢａＳＯ_４の沈殿物を、５分遠心分離（１０００ ｘ ｇ_ｍａｘ）で除き、残りの上清を回転蒸留器で濃縮し、その単糖組成を決定した。
【０１１４】
単糖混合物（５〜１５μｇ）をＣａｒｂｏ−Ｐａｃ ＰＡ１０ カラム（Ｄｉｏｎｅｘ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）にかけ、アイソクラティックに１．５ ｍｌ／分の流速で水を用いて溶出した。水酸化ナトリウム（３００ ｍＭ）を、０．５ ｍｌ／分の流速で連続的にカラム溶離物に加え、パルス電流測定検出器（Ｄｉｏｎｅｘ）を用いて溶離物をモニターした。溶出する単糖を、糖標準（フコース、ラムノース、アラビノース、キシロース、グルコース及びマンノース）の保持時間に比較して同定し、そのそれぞれのピーク面積の統合及び各単糖について得られる標準曲線に比較して、定量した。各単糖混合物のウロン酸含量を、ｍ−ヒドロキシビフェノールアッセイ（Ｂｌｕｍｅｎｋｒａｎｔｚ 及びＡｓｂｏｅ−Ｈａｎ−ｓｅｎ １９７３）により測定した。
【０１１５】
エステル化度の測定
アセチル及びメチルのエステル化の程度は、Ｖｏｒａｇｅｎら（１９８６）によって記載される方法を用いてＨＰＬＣにより評価した。
ポテト塊茎のイムノゴールドラベル （Ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）
形質転換体及び野生型の塊茎細胞壁は、本質的にＢｕｓｈ 及びＭｃＣａｎｎ （１９９９）に記載されるようにして特徴づけた。手短に言えば、野生型及び形質転換体１３．１由来のグルタルアルデヒド−固定塊茎について低温樹脂を埋め込んだ切片を、ｍＡｂ ＬＭ５ （１，４−β−ガラクタンを認識（Ｊｏｎｅｓら、１９９７））でイムノゴールドラベルし、以前にＭｃＣａｎｎ ら（１９９２）が記載しているように、銀で増強し、反射レーザー走査共焦顕微鏡及び電子顕微鏡により分析した。
【０１１６】
実施例 １
植物の形質転換用の ＤＮＡ 構築物の一般的なセット
ＤＮＡ 構築物 ｐＰＧＢ１２１ｓ−ｎｅｗ
ベクターｐＰＧＢ１２１ｓ（Ｒ． Ｖｉｓｓｅｒからの寄贈物）からの顆粒結合型澱粉合成酵素のプロモーター領域を、プライマー５’ＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＡＡＣＧ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び５’ＧＧＴＴＴＧＴＣＧＡＣＧＡＡＡＴＣＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＧＧＡＧＧ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を用いてポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）によって増幅し、ＰＣＲ生成物の５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位及び３’末端にＳａｌＩ部位を導入した。 さらに、ＰＣＲ法により、ＧＢＳＳの ５’非翻訳領域の偽翻訳開始コドンを欠失させた。次いで、生成物をアガロースゲル電気泳動で精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ切断ｐＧＵＳＮｏｓ（Ｌ． Ｓａｎｄｅｒからの寄贈物）に連結し、ｐＧＢＳＳ−ＧＵＳＮｏｓを得た。次いで、ＧＢＳＳプロモーターフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩを用いてｐＧＢＳＳ−ＧＵＳＮｏｓから切除し、精製して、続いてＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ消化ｐＢＩ１２１ （Ｄａｔｌａら、１９９２）にクローンし、ベクターｐＰＧＢ１２１−ｎｅｗを得た。このベクターをＳｍａＩ及びＳａｃＩで消化し、ＧＵＳコード領域を除去した。 次いで、ＳａｃＩ突出部をクレノウフラグメントで平滑化し、その結果、連結して閉じたベクターによってｐＰＧＢ１２１ｓ−ｎｅｗを得た。
【０１１７】
ＤＮＡ 構築物 ｐＰＧＢ１２１ｓ−Ｂ
ＳａｌＩとＢａｍＨＩを用いて完全になるようにベクターｐＰＧＢ１２１ｓ−ｎｅｗを消化し、アガロースゲル電気泳動法で精製した。５’ ＴＣＧＡＣＣＧＧＴＡＣＣＴＡＧＧＣＣＣＧＧ ’３ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３）及び５’ ＧＡＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＡＧＧＴＡＣＣＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の配列を有する２つの合成オリゴヌクレオチドをアニーリングして得られるポリリンカーを、ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ切断ベクターにクローンした。この工程により、ＡｇｅＩ、ＫｐｎＩ、ＡｖｒＩＩ、ＳｍａＩ及びＸｍａＩに対しユニークな部位を持つＭＣＳを有するベクターｐＰＧＢ１２１ｓ−Ｂが得られた。
【０１１８】
ＤＮＡ 構築物 ｐＧＥｄ
ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いでヌクレオチドの存在下７２℃で７分間Ｔａｑと反応させて突出部を埋め込み、ｐＰＧＢ１２１ｓ−ｎｅｗのＨｉｎｄＩＩＩ部位を欠失させた。得られた生成物をアガロースゲル電気泳動で精製し、連結反応で閉じ、ｐＰＧＢ１２１ｓ−ｎｅｗ−ＤＨｉｎｄＩＩＩを得た。配列５’ＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＴＣＴＡＧＡＧＣＣＴＣＧＡＧＧ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）及び５’ ＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＧＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＣＴＴＧ３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を有する２つの合成オリゴヌクレオチドをアニーリングして得られる新規のポリリンカーを、元のマルチクローニング部位（ＭＣＳ）の残余部分にクローンし、プラスミドｐＧＥＤを得た。 新規のＭＣＳはＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ及びＸｈｏＩに対する制限部位を導入した。
【０１１９】
ＤＮＡ 構築物 ｐＡＤＡＰ
ｐＧＥＤをＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で精製した。５’ＴＣＧ ＡＣＣ ＧＧＴ ＡＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＣＧ ＧＧＣ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＣＴ ＡＧＧ ＣＣＣ ＧＧ’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７） 及び５’ ＧＡＴ ＣＣＣ ＧＧＧ ＣＣＴ ＡＧＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＧＣＣ ＣＧＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＧ’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を有する２つの合成オリゴヌクレオチドをアニーリングして得られる新規のポリリンカーを、ｐＧＥＤの元のＭＣＳの残余部分にクローンし、プラスミドｐＡＤＡＰを得た。新規のＭＣＳは、ＡｇａＩ、ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＡｖｒＩＩ及びＳｍａＩに対する制限部位を導入した。
【０１２０】
ＤＮＡ 構築物 ｐＰＧＢ１２１ｓ−Ｂ−Ｂ３３
ベクターｐＢＩＮＢ３３（Ｌ． Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒからの寄贈物）をＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で精製した。次いで、オリゴヌクレオチド５’ ＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）及び５’ ＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＧ ３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）をアニーリングして得られるＨｉｎｄＩＩ部位をエンコードするリンカーを、 ＥｃｏＲＩ切断ｐＢＩＮＢ３３ベクターにクローンした。この工程により、ベクターｐＢＩＮＢ３３−ＥＨＥが得られた。パタチンＢ３３プロモーターを持つフラグメントを単離するために、ｐＢＩＮＢ３３−ＥＨＥベクターをＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩで消化した。得られたフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ消化ｐＰＧＢ１２１ｓ−Ｂにクローンし、プラスミドｐＰＧＢ１２１ｓ−Ｂ−Ｂ３３を得た。
【０１２１】
実施例 ２
アポプラストに対し標的化される多糖類 − 修飾酵素を有する植物の形質転換のための特異的な ＤＮＡ 構築物
ＤＮＡ 構築物 ｐＧＥＤ−ＧＡＬ
アスペルギルス・アキュリータスのガラクタナーゼをエンコードする１，３ ｋｂのｃＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化してベクターｐＣ１Ｇ１ （Ｓ． Ｋａｕｐｐｉｎｅｎからの寛大な寄贈物）から切除し、精製し、ｐＧＥＤ ＭＣＳの相当部位にクローンして、ＧＢＳＳプロモーター、エンド−ガラクタナーゼ、ノパリン合成酵素ターミネーターの発現カセットをつくった。このＤＮＡ構築物を、ｐＧＥＤ−ＧＡＬと示す。
【０１２２】
ｐＧＥＤ−ＡＲＡ の構築
アスペルギルス・アキュリータスのアラビナナーゼをエンコードする１，２ ｋｂのｃＤＮＡを、 ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化してベクターｐＣ１Ａ４ （Ｓ． Ｋａｕｐｐｉｎｅｎからの寛大な寄贈物）から切除し、精製し、ｐＧＥＤ ＭＣＳの相当部位にクローンし、プラスミドｐＧＥＤ−ＡＲＡを得た。
ＤＮＡ 構築物 ｐＡＤＡＰ−ＡＲＡ
アスペルギルス・アキュリータスのアラビナナーゼをエンコードする１．２ ｋｂのフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩで消化してｐＧＥＤ−ＡＲＡから単離し、予め切断したｐＡＤＡＰにクローンした。この工程により、ベクターｐＡＤＡＰ−ＡＲＡが得られた。
ＤＮＡ 構築物 ｐＡＤＡＰ−ＧＡＬ
アスペルギルス・アキュリータスのガラクタナーゼをエンコードする１．３ ｋｂのフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩで消化してｐＧＥＤ−ＧＡＬから単離し、予め切断したｐＡＤＡＰにクローンした。この工程により、ＤＮＡ構築物ｐＡＤＡＰ−ＧＡＬが得られた。
【０１２３】
ＤＮＡ 構築物 ｐＰＧＢ１２１ｓ−Ｂ−Ｂ３３−ＡＲＡ
アスペルギルス・アキュリータスのアラビナナーゼをエンコードする１．２ ｋｂのフラグメントを、ＫｐｎＩ及びＳｍａＩで消化してｐＡＤＡＰ−ＡＲＡから単離した。次いで、フラグメントを予め切断したｐＰＧＢ１２１ｓ−Ｂ−Ｂ３３にクローンした。この工程により、ＤＮＡ構築物ｐＰＧＢ１２１ｓ−Ｂ−Ｂ３３−ＡＲＡが得られた。
ＤＮＡ 構築物 ｐＰＧＢ１２１ｓ−Ｂ−Ｂ３３−ＧＡＬ
アスペルギルス・アキュリータスのガラクタナーゼをエンコードする１．３ ｋｂのフラグメントを、ＫｐｎＩ及びＳｍａＩで消化してｐＡＤＡＰ−ＧＡＬから単離した。次いで、フラグメントを予め切断したｐＰＧＢ１２１ｓ−Ｂ−Ｂ３３にクローンし、パタチンＢ３３プロモーター、エンド−ガラクタナーゼ、ノパリン合成酵素ターミネーターの発現カセットをつくった。 この工程により、ＤＮＡ構築物ｐＰＧＢ１２１ｓ−Ｂ−Ｂ３３−ＧＡＬが得られた。
【０１２４】
ＤＮＡ 構築物 ｐＰＧＢ１２１ｓ−ｎｅｗ−ＲＨＧＢ
植物の形質転換ベクターｐＰＧＢ１２１ｓ−ｎｅｗを制限酵素ＳａｌＩで消化し、クレノウ酵素で平滑末端化し、２つの酵素を熱失活させた後、制限酵素ＸｂａＩでさらに消化した。アスペルギルス・アキュリータスのラムノガラクツロナンリアーゼをエンコードするｃＤＮＡクローンを含有するベクターｐＹＥＳ２／ＲＨＧＢを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、クレノウ酵素で平滑末端化し、２つの酵素を熱失活させた後、制限酵素ＸｂａＩでさらに消化した。処理されたベクター及びｃＤＮＡ挿入断片を、アガロースゲル電気泳動後に精製し、連結して、ＤＮＡ構築物ｐＰＧＢ１２１ｓ−ｎｅｗ−ＲＨＧＢをつくった。
【０１２５】
実施例 ３
細胞内区画に遺伝子産物を標的化させるための構築物のデザイン ＤＮＡ 構築物 ｐＡＤＡＰ ／ＡＲＡ−ＫＤＥＬ
アラビナナーゼをエンコードするｃＤＮＡを、鋳型としてベクターｐＧＥＤ／ＡＲＡを用いて、プライマーＡＣＡＧＣＴＣＡＡＣＡＡＧＴＧＧＴＡＡＣ （ＧＢＳＳｐｒｏプライマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）及び
【化１】

（ＡＲＡ−ＫＤＥＬプライマー２、ＫＤＥＬ ＥＲ保持シグナルをエンコードするヌクレオチドはイタリック体で示し、設計した停止コドンは太字で示す、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）で増幅した。次いで、得られた生成物を、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により記載されるようにしてベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローンした。この工程により、異なる配向でＡＲＡ−ＫＤＥＬ生成物を有するベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ／ＡＲＡ−ＫＤＥＬ１及び２ の混合物を得た。
【０１２６】
ＰＣＲ中に生じたエラーにより、後に発現に問題が生じる可能性を最小限にするために、ＡＲＡ−ＫＤＥＬコード領域の大部分を、酵母発現ベクターｐＣ１Ａ４に含有される本来のＡＲＡ ｃＤＮＡから生じるコード領域と交換した。ベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ／ＡＲＡ− ＫＤＥＬ１及び２をＳａｌＩ及びＸｂａＩで切断し、その結果生じたフラグメントをエンコードするＫＤＥＬをＳａｌＩ／ＸｂａＩ切断ｐＣ１Ａ４にクローンした。この結果、ベクターｐＹＥＳ２．０／ＡＲＡ−ＫＤＥＬが得られた。次いで、ＡＲＡ−ＫＤＥＬフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩでｐＹＥＳ２．０／ＡＲＡ−ＫＤＥＬから切除し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ消化ｐＡＤＡＰにクローンした。これによりベクターｐＡＤＡＰ／ＡＲＡ−ＫＤＥＬを得た。
【０１２７】
ＤＮＡ 構築物 ｐＰＧＢ１２１ｓ−Ｂ−Ｂ３３−ＡＲＡ−ＫＤＥＬ
ＡＲＡ−ＫＤＥＬ融合体をＫｐｎＩ及びＳｍａＩでｐＡＤＡＰ／ＡＲＡ−ＫＤＥＬから切除し、フラグメントをアガロースゲル電気泳動で精製した。得られたフラグメントをＫｐｎＩ／ＳｍａＩ消化ｐＰＧＢ１２１ｓ−Ｂ−Ｂ３３にクローンした。この工程により、ベクターｐＰＧＢ１２１ｓ−Ｂ−Ｂ３３／ ＡＲＡ−ＫＤＥＬが得られた。
ＤＮＡ 構築物 ｐＰＧＢ１２１ｓ−Ｂ−Ｂ３３−ＡＲＡ−ＫＤＥＬ
ＡＲＡ−ＫＤＥＬ融合体をＫｐｎＩ及びＳｍａＩを用いてｐＡＤＡＰ／ＡＲＡ−ＫＤＥＬから切除し、フラグメントをアガロースゲル電気泳動で精製した。得られたフラグメントをＫｐｎＩ／ＳｍａＩ消化ｐＰＧＢ１２１ｓ−Ｂ−Ｂ３３にクローンした。この工程により、ベクターｐＰＧＢ１２１ｓ−Ｂ−Ｂ３３／ＡＲＡ−ＫＤＥＬが得られた。
【０１２８】
ＤＮＡ 構築物 ｐＡＤＡＰ／ＳＴ−ＡＲＡ
グリコシルトランスフェラーゼα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）は、ゴルジ装置に局在するＩＩ型膜タンパク質である。このタンパク質の最初の４４アミノ酸が、融合マーカータンパク質、リゾチームのゴルジ保持を管理することは以前に明らかにされている（Ｍｕｎｒｏ １９９１）。その上、ＧＦＰのゴルジ標的化は、ＳＴの５２ Ｎ−末端アミノ酸を融合することで行われている（Ｂｏｅｖｉｎｋら、１９９８）。
【０１２９】
この目的のために、ＳＴの５２ Ｎ−末端アミノ酸と成熟形態のエンド−アラビナナーゼとの融合体を有する構築物は、以下のように生産される。
関連するＳＴ領域は、プライマー（ＳＴ ＳＯＥ ＦＷＤ、下線はＳＴ 特異的配列） ５’ ＧＡＣＧＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＴＴＣＡＴＡＣＣＡＡＣＴＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）及び（ＳＴ ＳＯＥ ＲＥＶ、下線はＳＴ特異的配列） ５’ＧＧＡＧＣＣＧＧＧＧＴＴＧＧＣＧＴＡ−ＧＧＣＣＡＣＴＴＴＣＴＣＣＴＧＧＣＴＣ ３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）を用いてＰＣＲによって増幅した。 鋳型として用いたプラスミドｐＳＴ−ＭＹＣは、Ｓｏｒｅｎ Ｍｏｇｅｌｓｖａｎｇからの寄贈物であった。次いで、アラビナナーゼの成熟部分を、プライマー （ＡＲＡ ＳＯＥ ＦＷＤ、アラビナナーゼの特定配列は太字で示す）
【化２】

及び（ＡＲＡ ＳＯＥ ＲＥＶ， アラビナナーゼ特異的配列は太字）
【化３】

用いて増幅した。２つの生成物をアガロースゲル電気泳動で精製し、次いで、配列重複伸長ＰＣＲ （ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ）で融合し（Ｈｉｇｕｃｈｉ １９８８）、ＳＴの５２ Ｎ−末端アミノ酸をアラビナナーゼの成熟部分（３０２アミノ酸）に融合させた。融合生成物をアガロースゲル電気泳動で精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ消化ｐＡＤＡＰにクローンした。得られたプラスミドはｐＡＤＡＰ／ＳＴ−ＡＲＡと名付けた。
【０１３０】
実施例 ４
２ つの遺伝子を持つ構築物のデザイン
ＤＮＡ 構築物 ｐＧＥＤ／ｄｏｕｂｌｅ／１ 及び ｐＧＥＤ／ｄｏｕｂｌｅ／２
ベクターｐＰＧＢ１２１ｓ−Ｂを ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断した。得られたＧＢＳＳ−Ｔｎｏｓ発現カセットを持つフラグメントの末端をＴａｑでふさぎ、得られた生成物を製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により記載されるようにベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローンした。この工程により、ベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ／ＧＢＳＳ−ｎｏｓｔｅｒｍ１及びｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ／ＧＢＳＳ− ｎｏｓｔｅｒｍ ２を得た。各ベクターをＥｃｏＲＩで消化し、得られたフラグメントをアガロースゲル電気泳動で精製した。フラグメントを、ＥｃｏＲＩで消化し、製造業者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により記載されるようにアルカリシュリンプホスファターゼで脱リン酸化したベクターｐＧＥＤにクローンした。この工程により、２つのＧＢＳＳプロモーターに続いてＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ （ＭＣＳ１）ならびにＳａｌＩ、ＡｇｅＩ、ＫｐｎＩ、ＡｖｒＩＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ及びＢａｍＨＩ部位（ＭＣＳ２）を有するマルチクローニング部位を持つベクターｐＧＥＤ／ｄｏｕｂｌｅ／１及びｐＧＥＤ／ｄｏｕｂｌｅ／２を得た。
【０１３１】
再構築及び補助酵素をエンコードする遺伝子を持つ ＤＮＡ 構築物 ｐＰＧＢ１２１ｓ−ｎｅ ｗ−ＲＨＧＢ−ＲＨＡ１：
ベクターｐＢＩ２２１ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化し、フェノール／クロロホルムで抽出して、アルコールで沈殿させた。リン酸化オリゴヌクレオチドＰ−ＡＡＴＴＡＡＧＣＴＴ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）を自己アニーリングさせ、ＥｃｏＲＩ制限ｐＢＩ２２１ベクターに連結し、ベクターｐＢＩ２２１−２ＨｉｎｄＩＩＩをつくった。
ベクターｐＢＩ２２１−２ＨｉｎｄＩＩＩを制限酵素ＳａｃＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼで平滑末端化し、２つの酵素を熱失活させた後、さらに制限酵素ＢａｍＨＩで消化した。処理されたベクター （ｐＢＩ２２１−２ＨｉｎｄＩＩＩ^＊Ｂ^＊Ｓｂ） を、アガロースゲル電気泳動後に精製した。
【０１３２】
アスペルギルス・アキュリータスのラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼをエンコードするｃＤＮＡクローンを含有するベクターｐＧＥＭ−７Ｚ／ＲＨＡ１を制限酵素ＸｂａＩで消化し、クレノウ酵素で平滑末端化し、２つの酵素を熱失活させて、さらに制限酵素ＢａｍＨＩで消化した。処理されたｃＤＮＡ挿入断片をアガロースゲル電気泳動後に精製し、ゲル精製したベクター部ｐＢＩ２２１−２ＨｉｎｄＩＩＩ^＊Ｂ^＊Ｓｂに連結し、ベクターｐＢＩ２２１−２ＨｉｎｄＩＩＩ−ＲＨＡ１をつくった。ベクターｐＢＩ２２１−２ＨｉｎｄＩＩＩ−ＲＨＡ１を制限酵素 ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、３５Ｓプロモーター−ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ノパリン合成酵素ターミネーターを含む発現カセットを、ゲル電気泳動後に精製した。
【０１３３】
ＤＮＡ構築物ｐＰＧＢ１２１ｓ−ｎｅｗ−ＲＨＧＢを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、脱リン酸化し、ゲル電気泳動後に精製して、３５Ｓプロモーター 、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ノパリン合成酵素ターミネーターの発現カセットを含む精製された ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントと連結し、ＤＮＡ構築物 ｐＰＧＢ１２１ｓ−ｎｅｗ−ＲＨＧＢ−ＲＨＡ１をつくった。
【０１３４】
ＤＮＡ 構築物 ｐＧＥＤ／ａｐｏＧａｌ／ｅｍｐｔｙ／１ 及び ｐＧＥＤ／ａｐｏＧａｌ／ｅ ｍｐｔｙ／２
構築物ｐＧＥＤ／ＧＡＬをＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで消化し、得られたフラグメントをエンコードする ＧＡＬをアガロースゲル電気泳動で単離した。ベクターｐＧＥＤ／ｄｏｕｂｌｅ／１及びｐＧＥＤ／ｄｏｕｂｌｅ／２をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで切断し、アガロースゲル電気泳動で精製し、次いで、フラグメントをエンコードするＧＡＬをクローニングした。これらの工程により、それぞれｐＧＥＤ／ａｐｏＧＡＬ／ｅｍｐｔｙ／１及びｐＧＥＤ／ａｐｏＧＡＬ／ｅｍｐｔｙ／２と命名される２つのベクターを得た。したがって、２つのベクターは、最初のＧＢＳＳ／ＮｏｓターミネーターカセットのＧＢＳＳプロモーター及びＮｏｓ ターミネーター間のアポロプラストの標的とされるガラクタナーゼを備えた。
【０１３５】
「自己プロセシング」二重 ＤＮＡ 構築物のデザイン
アスペルギルス・アキュリータスのエンド−ガラクタナーゼをエンコードする１．３ ｋｂのｃＤＮＡフラグメントを、予め構築したベクターの１つから単離し、ｐＧＥＤ／ｄｏｕｂｌｅ／１又は２に存在する２つのＧＢＳＳ／Ｎｏｓターミネーターカセットの１つのＧＢＳＳプロモーターとＮｏｓターミネーター間にクローし、アポプラスト発現カセットＧＢＳＳプロモーターエンド−ガラクタナーゼ−Ｎｏｓターミネーターをつくった。これらのベクターをｐＧＥＤ／ａｐｏＧＡＬ／１及び ２と名付け、全ての二重ＤＮＡ構築物のデザインに出発ベクターとして用いた。第２ ＧＢＳＳプロモーター−Ｎｏｓターミネーターカセットは、細胞質、小胞体（ＥＲ）又は植物の液胞に細胞壁修飾酵素を運ぶためにデザインした発現カセットの構築に用いた。酵素は、収穫後の作用により、髄質細胞壁から当該生成物を放出する酵素が優先される。下記の実施例１２では、非制限的な例であるが、エンド−ガラクタナーゼを再構築酵素として用い、エンド−ＰＧを切除酵素として用いる自己プロセシングを立証している。エンド−ＰＧを導入し、それを種々の細胞下の位置に標的化させるベクター構築物は、概説されるように製造される：
【０１３６】
細胞質の標的化。
細胞質の標的化には、中性ｐＨの環境で安定性の高い植物、細菌又は菌類由来のエンド−ＰＧが好ましい。細胞質への標的化は、エンド−ＰＧシグナルペプチドをエンコードするエンド−ＰＧ ｃＤＮＡから配列を除去し、それにより小胞体にわたるその輸送を破壊して行われる。成熟タンパク質のＮ−末端がタンパク質配列から公知でない場合は、シグナルペプチドの切断部位は、この目的のために最適化したコンピュータプログラムを用いて経験的に決定される。次いで、成熟エンド−ＰＧタンパク質をエンコードするｃＤＮＡを、構築物ｐＧＥＤ／ａｐｏＧａｌ／ｅｍｐｔｙ／１とｐＧＥＤ／ａｐｏＧａｌ／ｅｍｐｔｙ／２における第２ ＧＢＳＳ／ＮｏｓターミネーターカセットのＧＢＳＳプロモーターとＮｏｓターミネーター間にクローンした。
【０１３７】
ＥＲの保持。
ＥＲ保持には、わずかに酸性から中性ｐＨの環境で安定性の高い植物、細菌又は菌類由来のエンド−ＰＧが好ましい。ＥＲへの標的化は、コード領域の最末端でテトラペプチドＫＤＥＬをエンコードする配列を、エンド−ＰＧをエンコードするｃＤＮＡに導入し、そのＣ−末端でＫＤＥＬ伸長を有するタンパク質を発現させて行った。次いで、融合タンパク質をエンコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＧＥＤ／ａｐｏＧａｌ／ｅｍｐｔｙ／１とｐＧＥＤ／ａｐｏＧａｌ／ｅｍｐｔｙ／２における第２ ＧＢＳＳ／ＮｏｓターミネーターカセットのＧＢＳＳ プロモーターとＮｏｓターミネーター間にクローンした。
【０１３８】
液胞の標的化。
液胞の標的化には、酸性の環境で安定性の高い植物、細菌又は菌類由来のエンド−ＰＧが好ましい。液胞への標的化は、例えば、ハイブリッドをＥＲへ確実に移動させるシグナル配列をエンコードするヌクレオチド配列を結合し、次いで、例えばアミノ酸ＮＰＩＲＬ（Ｎ−末端プロペプチド（ＮＴＰＰ）の一例）からなる液胞のシグナル配列を結合して行われる。あるいは、ＮＰＩＲＬの伸長等は問題のタンパク質のＣ−末端に融合させ、ＥＲへ確実に移動させるシグナル配列は、液胞の標的化を支配するタンパク質のＮ−末端部に融合させる（Ｋｏｉｄｅら、１９９７）。
【０１３９】
Ｎ−末端にＮＴＰＰを有するタンパク質の例は、サツマイモのスポラミンである。スポラミンのＮ−末端部は、スポラミンＮ−末端に融合する場合に、液胞では通常見られないタンパク質をこの区画に向かわせることが以前に示されている。したがって、スポラミンのＮ−末端部をエンコードするヌクレオチド配列を、ペクチン骨格を加水分解する（即ち、シグナルペプチドを欠失している）酵素をエンコードするヌクレオチド配列に直接融合させ、それによってペクチナーゼを液胞に標的化させることができる。次いで、融合タンパク質をエンコードするｃＤＮＡを第２ ＧＢＳＳ／ＮｏｓターミネーターカセットのＧＢＳＳプロモーターとＮｏｓターミネーター間にクローンする。このベクターをｐＧＥＤ／ａｐｏＧＡＬｖａｃＰＧ／１と称する。以下の実施例１０及び１１は、シグナル遺伝子構築物を用いて、エンドアラビナナーゼのＥＲ及び液胞それぞれへの標的化を例証している。
【０１４０】
実施例 ５
ポテト中のラムノガラクツロナンのガラクタン側鎖の再構築
塊茎−特異的ＧＢＳＳプロモーターの制御下、菌類（アスペルギルス・アキュリータス）のエンド−ガラクタナーゼ（Ｃｈｒｉｓｔｇａｕら、１９９５）を発現するポテト植物を作成した（実施例２参照）。低い形質転換効率とは別に、得られた植物は、野生型植物と比較して表現型を変えなかった。低い頻度は、プロモーターがインビトロの培養中、活性であること、また、生育のこのごく初期段階に高レベルなエンド−ガラクタナーゼ活性は形質転換細胞に致命的な可能性があることを示している。内因性のエンド−ガラクタナーゼ活性は野生型ポテト植物の塊茎抽出物ではほとんど検出できないが、Ｔ_１１．１及びＴ_１３．１については、活性レベルは、それぞれ１０４及び２１４ μｍｏｌガラクトース当量 ／分／塊茎の新鮮な重量ｇであった（表２）。 Ｔ_１１．１ 及びＴ_１３．１ は、ＦＴＩＲ分光計ではじめに選択されるような細胞壁表現型であるため、分析用に選択した（下記参照）。
【０１４１】
トランスジェニック植物のエンド−ガラクタナーゼ活性は、低塩緩衝液中で定量的に抽出された。これは、酵素が細胞壁にしっかりと結合されていないことを示している。トランスジェニック植物及び野生型植物からの抽出物もウェスタンブロット法で分析した。エンド−ガラクタナーゼ活性を有する抽出物はすべて、単離された組換型エンド−ガラクタナーゼに類似する分子質量３８ ｋＤａのタンパク質を含有した。
【０１４２】
細胞壁の単離及び抽出中に、導入されたエンド−ガラクタナーゼならびに内因性ペクチナーゼによるペクチン物質の酵素分解を避けるために、幾つかの予防措置を講じた。デオキシコレートナトリウム含有緩衝液を用いてタンパク質を変性、可溶化し、次いで植物のペクチナーゼ、特に導入されたエンド−ガラクタナーゼの最適活性に好ましくないｐＨを有する緩衝液中で数回、氷冷抽出して希釈した。細胞壁の調製中、細胞壁抽出緩衝液にエンド−ガラクタナーゼ活性は検出できなかった。フーリエ変換赤外線顕微分光測光法は、形質転換体の初期選択に用いた。予備的主成分分析 （ＰＣＡ） により、Ｔ_１１．１ 及びＴ_１３．１の２つの形質転換体を野生型と明確に区別できた。図１は、第３及び第５主成分（ＰＣ）のスコアを用いて、Ｔ_１３．１と野生型との比較を示している。したがって、これらの形質転換体を、さらなる分析のために選択した。細胞壁物質の収率は、野生型よりも形質転換体で低く、これは残余澱粉含量でも同じであった（表 ２）。細胞壁調製物の単糖組成は、野生型と比較して双方の形質転換体のガラクトース含量において〜３０％の劇的な減少を示した（表３）。幾つかの単糖測定で、標準的な変動は非常に高いことが判明した。しかしながら、不確定性は、形質転換された表現型と関連していないが、調製された細胞壁の残余澱粉とはほとんど常に関連している。ガラクトシル残基は種々の細胞壁多糖類（ヘミセルロース、アラビノガラクタンタンパク質及びＲＧＩ）に存在するが、ＲＧＩのみがβ−１，４−連結ガラクタンを含有することが知られているため、細胞壁物質のその後の分析はこのポリマーに集中させた。
【０１４３】
ＲＧＩは、菌類のＥＰＧとＰＭＥを組み合わせて処理することにより、細胞壁から特別に抽出した。このＥＰＧ／ＰＭＥ 処理により、野生型と比較してほぼ２倍のＵＡが、形質転換塊茎の細胞壁から放出された（表３）。 ＥＰＧ／ＰＭＥ可溶化ペクチンをサイズ排除クロマトグラフィーで分析し、分子の大きさによって消化フラグメントを分離した。野生型細胞壁由来のＥＰＧ／ＰＭＥで抽出したＲＧＩは、ＵＡ含量及び屈折率の検出で示されるように２つの主要画分を含有した（図２）：これらを画分Ａ （分子量＞５００ ｋＤａ）及び画分Ｃ （分子量０．２〜８ ｋＤａ）と称した。 Ｔ_１１．１ 及びＴ_１３．１ 由来のＥＰＧ／ＰＭＥ抽出物は、野生型とは異なるプロフィルを有し（図２）、少量の画分Ａ及び実質的に多い画分Ｃ、さらに野生型抽出物には存在しない〜１２０ ｋＤａのフラグメント（画分Ｂ）を含んだ。＊は、ペクチン物質が全くない試料の緩衝塩が存在することに起因する大きなピークを示す。
【０１４４】
糖分析で測定されるように（表３）、野生型塊茎の画分Ａは、高い割合のＵＡ、ラムノース、アラビノース及びガラクトースを含有して、他の単糖類を実質的に含まない。これは、ＨＧＡ及びＲＧＩポリマーが高分子量であること示している。しかしながら、野生型塊茎の画分Ａは、ガラクトシル残基を６４ ｍｏｌ％含有するのに対し、トランスジェニック塊茎は１５〜２０ ｍｏｌ％しか含有しない。これは、ガラクタン量が主に減少していることを示唆している。トランスジェニック塊茎のアラビノシル含量はわずかに増し、ＵＡ含量は著しく高い。興味深いことに、フコシル残基はトランスジェニックの画分Ａでは検出できなかったが、野生型の画分Ａでは非常に低い％で検出された（フコシル残基はポテトＲＧＩのガラクタン側鎖の置換基である可能性がある）。トランスジェニック塊茎の画分Ａ及びＢの単糖組成は、類似していた（表３）。野生型ならびに形質転換塊茎細胞壁の画分Ｃは、主にＨＧＡフラグメントを含有したが、小分子量のＲＧＩフラグメントもいくらか検出された。トランスジェニック塊茎から得られるＲＧＩフラグメントは、画分Ａ及びＢと同様に、野生型塊茎（３．８ ｍｏｌ％）と比較してガラクトシル含量が低かった（１．４〜１．５ ｍｏｌ％）。 しかしながら、比較的多量のグルコシル残基は、細胞壁の調製中のα−アミラーゼ処理によって放出されるオリゴ糖での細胞壁物質の混入を示している可能性がある。
【０１４５】
ＥＰＧ／ＰＭＥでの細胞壁物質の酵素処理は、細胞壁を完全には脱ペクチン化（ｄｅｐｅｃｔｉｎａｔｅ）しない。したがって、炭酸ナトリウムを４℃で室温で用い、さらなる連続抽出を行った（表３）。 炭酸塩での脱エステル化は、ＥＰＧ／ＰＭＥ抽出とは異なって、全くペクチンを可溶化せず、野生型とトランスジェニック細胞壁調製物の収率は類似していた。炭酸塩の抽出物をサイズ排除クロマトグラフィーにかけたところ、一方がボイド容量（分子量＞５００ ｋＤａ）で、他方はＧａｌＡと等しい保持時間を有し、単糖類又は少量のオリゴ糖の存在を示す２つのＵＡ含有画分が得られた（データ示さず）。後者の画分は、試料中に高濃度の塩が存在しているため、単糖組成を分析できなかった。大きなポリマーを含む抽出物を単糖分析したところ、ＲＧＩを表す、高い割合のアラビノース、ガラクトース、ＵＡ及びラムノースが示された （表３）。 かなりの量のグルコシル残基及びキシロシル残基が、おそらくは炭酸塩抽出で可溶化されたシキログルカンから得られた。トランスジェニック細胞壁の炭酸塩抽出物は、野生型に対し減少したガラクトシル含量も示した（１８〜１９％対５２％）。また、炭酸塩抽出物に存在するＲＧＩのアラビノシル含量は一定であるのに対し、ＵＡ含量のみはＴ_１３．１の細胞壁調製物では高いが、Ｔ_１１．１では高くなかった。
【０１４６】
ペクチンは、酵素抽出及び炭酸塩緩衝液抽出の後に細胞壁内に残っている可能性がある。ＥＰＧ／ＰＭＥ及び炭酸塩での連続処理前後の細胞壁の単糖組成を、ペクチンを溶解した効率を定量するために比較した（表３）。ペクチンの抽出後、細胞壁にラムノースは検出されなかった；ラムノースは中程度の感度でのみ検出されるけれども、これは、非抽出細胞壁に存在するＲＧＩが連続抽出で完全に除かれたことを示唆している。しかしながら、野生型及び形質転換塊茎について抽出された細胞壁は、類似した量のガラクトースをなおも含有した。このガラクトースは多くが、β−１，２−連結ガラクトシル残基を含むことが知られている、シキログルカンのようなＲＧＩ以外の細胞壁成分から生じると思われ、エンド−ガラクタナーゼで加水分解されない。キシログルカンは、濃縮アルカリ又はシキログルカナーゼの処理によってのみ抽出され、したがって、この研究で用いられる手順で処理した細胞壁内に存在するものと予想される。興味深いことに、ＵＡ含量は、形質転換体よりも野生型の残余細胞壁で３倍以上高く、形質転換体からのペクチンの抽出性の増大を示した。
【０１４７】
１，４−β−Ｄ−ガラクタンが、１，４−β−Ｄ−ガラクタンの四量体を認識するエンド−ガラクタナーゼモノクローナル抗体 ＬＭ５で特異的に加水分解されるかどうかを決定するため、野生型及びＴ_１３．１ の成熟塊茎組織をイムノ−ゴールドラベルに用いた （図３）。
【０１４８】
図３は、モノクローナル抗体ＬＭ５でゴールドラベルされ、銀で増強され、反射共焦走査顕微鏡（Ａ、Ｂ）及び透過型電子顕微鏡（Ｃ、Ｄ）により可視化された野生型（Ａ、Ｃ）及びエンド−ガラクタナーゼ発現（Ｔ_１３．１） （Ｂ、Ｄ）型のポテト塊茎の切片を示す。野生型柔組織細胞壁は強く標識されているが（Ａの白色、Ｃの黒色粒子）、Ｔ_{１３． １}塊茎ではラベル密度は非常に減少し、原形質膜に近い（Ｄの矢印）幾つかの細胞の角（Ｂの矢じり）にのみ局在する。 ＊は、澱粉顆粒によって一度は占有された空間を表す。ＭＬは、これらの角で満ちた拡張したミドルラメラを示す。スケールバー： Ａ及びＢ １００ ｍｍ、Ｃ及びＤ ２ ｍｍ。
【０１４９】
ガラクトースの除去によってラムノガラクツロナン（ＲＧ）分子に生じる構造変化を測定するため、Ｔ_１３．１及び野生型の対照から単離したＲＧについて、Ｈａｋｏｍｏｒｉ （１９６４）にしたがって結合パターンを測定した。下記の表１に要約した結果は、内部β−１，４−ガラクトシル残基を有する内部ガラクトシル残基の幾つかのタイプの極めて著しい低下に伴われる末端ガラクトシル残基の予想される増加は、野生型レベルの約１／９に低下し、少ない結合の多くは形質転換体において検出限界を下回るほど低下したことを示している。
【０１５０】
これらの結果から、トランスジェニックの細胞壁から単離される全てのＲＧＩポリマーはガラクトース含量を著しく減少しており、分泌酵素が細胞壁内では活性で、ＲＧＩの多数のガラクタン側鎖を加水分解したことが明らかなことが結論付けられた。局所免疫化により、ガラクタナーゼについての基質の除去はほぼ完了し、抗体ＬＭ５もガラクタナーゼも結合できないほど短い毛状領域のガラクタナーゼが残ることが示された。結合分析はこれらの結果を裏付けており、組成が変化しているのみならず、新たなラムノガラクツロナン構築物が生産されたことを立証している。電子顕微鏡写真は、原形質膜に面する細胞壁側面（細胞壁のうちで最も最近合成された部分）に少量の長いガラクタンが生じることを示しており、これは、新たに合成されたガラクタンの堆積が、たとえガラクタンの除去が優勢な過程であっても、これと競合することを示唆している。これは、植物細胞壁多糖類の単糖プロフィル及び結合パターンに関する再構築の最初の立証である。結果を表１に要約する：
【０１５１】
【表１】

【０１５２】
結論
トランスジェニックの細胞壁から単離される全てのＲＧＩポリマーがガラクトース含量を著しく減少させており、分泌された酵素が細胞壁内では活性で、ＲＧＩの多くのガラクタン側鎖を加水分解したことが示された。局所免疫化により、ガラクタナーゼについての基質の除去がほぼ完了し、抗体ＬＭ５もガラクタナーゼも結合できないほど短い毛状領域のガラクタナーゼのみが残ることが示された。 電子顕微鏡写真は、原形質膜に面する細胞壁側面（細胞壁のうちで最も最近合成された部分）に少量の長いガラクタンを示しており、これは、新たに合成されたガラクタンの堆積が、たとえガラクタンの除去が優勢な過程であっても、これと競合することを示唆している。これは、植物細胞壁多糖類の単糖プロフィル及び結合パターンに関する再構築の最初の立証である。
【０１５３】
【表２】

【０１５４】
【表３】

【０１５５】
実施例 ６
パタチンプロモーターにより駆動されるガラクタナーゼ
ガラクタナーゼがＧＢＳＳ−プロモーターよりむしろパタチンプロモーターで駆動されるように、本質的にｐＰＧＢ１２１ｓ−Ｂ−Ｂ３３−ＧＡＬを用いて実施例５に記載されるようにして、トランスジェニックのポテト植物を得た。遺伝子発現分析から、発現が効果的に塊茎に制限され、ＧＢＳＳ−プロモーターとの比較としての他器官への導入に高濃度のショ糖を要することが示された。塊茎での発現は、ＧＢＳＳ−プロモーターで見られる発現とはあまり相違しなかった。塊茎の細胞壁表現型がガラクタナーゼ遺伝子の発現を駆動するプロモーターに依存していないことを確証するために、ＬＭ５抗体を用いて塊茎を免疫学的特徴付けに付した。
【０１５６】
実施例 ７
アポプラストに標的化したラムノガラクツロナンリアーゼを発現させるために形質転換したポテト
２５０個の外植体を、アグロバクテリウム・ツメファシエンスでの形質転換に用いた（ｐＰＧＢ１２１ｓ−ｎｅｗ−ＲＨＧＢならびに材料と方法の実験手順を参照）。これにより、２１個の個々の形質転換系が作成され、そのうち１８個を本発明の分析に用いた。一般に、トランスジェニック植物は正常で、若干数のみ（１８％）が表現型に変化を生じた。対照と比較して、これらの植物は小さく、また小さな葉を有した。葉は厚みがあり、ざらざらしていて巻き上がっていた。さらに、これらの植物は、他の全トランスジェニック及び対照と比較して色濃かった。表現型が変えられた植物は全て、塊茎を生じる前に枯れた。他の実験（他の遺伝子での形質転換）で同様の表現型が見出され、（倍数化のような）形質転換の手法自体には影響が及ぼされるが、特定の遺伝子や構築物には影響がないことが示唆された。一見、正常な植物は、表現型の変化した塊茎を生じると思われる。
【０１５７】
ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質レベルの初期分析後、当該系を増殖させ、次の分析のための物質を多く得た。（カナマイシン耐性に基づいて）形質転換に成功した全トランスジェニック系をサザンブロット分析に付した。１８個の植物のうち１５個では、ｒｈｇ−リアーゼ遺伝子が検出された。他の全ての植物において、遺伝子は１つ又は２つのコピーのいずれかで存在する。実際に塊茎を生じた植物のみを、導入遺伝子の発現のために分析した。したがって、１１個の異なる系から単離したＲＮＡのみを、ノーザンブロット分析に用いた。プローブとしてリボソームのポテトＤＮＡフラグメントを用いるＲＮＡゲルブロットハイブリダイゼーションにより、各系で等量のＲＮＡが示された。ラムノガラクツロナン−リアーゼプローブを用いた塊茎ＲＮＡのハイブリダイゼーションにより、大部分の植物（１１個のうち９個）について明確な遺伝子転写物が示された。９個のうち４個は高発現因子と称することが可能であるが、他の５個は低い発現レベルを示し、その中でさらに区別化を行った。ハイブリダイゼーションを全く示さなかった２個も、サザンブロット分析でネガティブな結果を生じた。導入遺伝子のコピー数（１又は２）とＲＮＡ発現レベルとに、明確な相関関係は見出せなかった。導入遺伝子の発現を検出できる系の全てを、さらなる分析に使用した。ＲＧ−リアーゼを発現するトランスジェニックポテト植物の酵素的な特徴付けから、９個のＲＧ−リアーゼ形質転換体のうち３個は高いリアーゼ（オリゴマーへの基質の完全分解）活性を示すが、他は中程度の活性（９個のうち１個）、低い活性（２個） 又は非常に低い活性（３個）を有することが示された。 さらに、ｍＲＮＡ含量と酵素活性とに積極的な相関関係が見出された。
【０１５８】
ＲＧＬ形質転換体の塊茎の糖組成は、ラムノガラクツロナンリアーゼについての基質の点で、対照植物の糖組成とむしろ似ていることが分かった。下記の表４は、高及び低発現形質転換体ならびに野生型のポテト塊茎由来全細胞壁の分析データを示している。１．５〜１ ％ のラムノースの減少は、毛状領域含量の低下を示している。
【０１５９】
【表４】

【０１６０】
特に塊茎の表現型が変化したことを考慮すれば、上記の結果は最初は驚くべきものであったかもしれない。結果は以下のように説明することができる。毛状領域は、天然ペクチンのホモガラクツロナン配列を相互連結していると考えられている（Ｓｈｏｌｓ ＆ Ｖｏｒ−ａｇｅｎ １９９６）。ラムノガラクツロナンリアーゼは、これらの相互連結配列を攻撃するが、ラムノガラクツロナンを完全には分解できない。したがって、比較的小さな部分の毛状領域は、エンド−ラムノガラクツロナンリアーゼによって放出されるオリゴ糖として細胞から逃れることができる。ラムノース （ラムノガラクツロナンを表す）は、細胞壁で比較的少数の糖である。ガラクツロン酸は細胞壁中では非常に豊富であるが、ホモガラクツロナンの最大部に存在する。新しい細胞壁の表現型は、実施例５で行われたような細胞壁における特定のエピトープの免疫局在化を用いて記載されるように、実際、組成上の表現型よりむしろ構造上の表現型である。ガラクタン及びアラビナンからなるラムノガラクツロナン側鎖は、その結合のためにラムノース残基に依拠している。双方の糖が極めて著しく減少し、中性糖側鎖でのまばらな置換をもたらす毛状領域の主要な構造変化を示していることは、注目すべきことである。共焦顕微鏡法でアラビナン及びガラクタン抗体を用いる局所免疫化は、組成分析を裏付けている。さらに、これらの試験は、パランチマル（ｐａｒａｎｃｈｙｍａｌ）澱粉を含む細胞は双方のエピトープに対しごく少数の標識しか示さないが、形質転換体の幾つかの皮層細胞は、細胞角補強材中のガラクタン及びアラビナンを標識していることを明らかにしている。
【０１６１】
実施例 ８
ゴルジ装置に対する酵素活性の標的化
ガラクタナーゼについて実施例６に記載したストラテジにしたがって、菌類アラビナナーゼを発現させ、アポプラストに対して標的化し、タバコとポテトの双方について生育可能な植物を得た。タバコ植物は確認できる表現型を全く示さなかったが、ポテト形質転換体の多くは部分的に機能不全の分裂組織を有した。アラビナナーゼを制御するためにＧＢＳＳ−プロモーターを用いたところ、ほとんど全ての葉腋芽が非機能性分裂組織を有した。したがって、植物発生の態様を制御するためのこの発明の有用性をも例示する新たな無枝植物構造物をつくった。
【０１６２】
酵素活性のゴルジ標的化は、（「自己プロセシング植物物質」で酵素を貯蔵するための細胞内部位としてではなく）アポプラストへの分泌の代替手段として認められるべきである。この技術の効果は、ゴルジで生じる多糖類生合成過程を直接干渉することができる。この技術は、植物の生存能を損なわない設計上の選択肢の範囲を広げる。
【０１６３】
ラット由来のグリコシルトランスフェラーゼα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）は、単独で（Ｗｅｅ ら、１９９８）、及びリゾチーム（Ｍｕｎｒｏ、１９９１）又は緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｂｏｅｖｉｎｋら、１９９８）に融合した切形（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）形態で、植物細胞のゴルジ装置へ標的化されることが、以前に示されている。したがって、種々の異種タンパク質の適切なゴルジ保持を促進する能力について、このタンパク質を評価した。ＳＴ は、ＥＲへの輸送中に翻訳後に切断されるシグナル配列、短いアミノ末端細胞質ドメイン、ゴルジを局在化させる非切断疎水性シグナルアンカー及び大きな触媒ルーメンドメインからなるＩＩ型膜タンパク質（即ち、細胞質ゾルにアミノ末端を局在させる）である（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ら、１９８７）。したがって、内部シグナルアンカーは、ＳＴのこの部分にＮ−末端で融合される異種タンパク質を保持するのに十分であるはずである。これは、ＳＴのＮ−末端部の５２アミノ酸と４４アミノ酸それぞれをニワトリのリゾチーム（Ｍｕｎｒｏ １９９１）及びＧＦＰ （Ｂｏｅｖｉｎｋら、１９９８）に融合したＢｏｅｖｉｎｋら（１９９８）及びＭｕｎｒｏ （１９９１）の研究により示された。
【０１６４】
したがって、ラットのシアリルトランスフェラーゼは、タンパク質がゴルジ装置に可溶化形態で見られるのとは対照的に、タンパク質がゴルジ膜にしっかりと結合されていることを期待する一般的な要求を満たしている。可溶性タンパク質はゴルジを通って移動し、周期的に原形質膜に存在し、それによって、細胞屁器と直接接触すると考えられる。
この目的のため、ラットのシアリルトランスフェラーゼを、組換え型ＰＣＲ （Ｈｉｇｕｃｈｉ １９８８）を用いてアスペルギルス・アキュリータスのアラビナナーゼの成熟部に融合し、得られた融合体を発現ベクターｐＡＤＡＰ及びｐＰＧＢ１２１ｓ−Ｂ−Ｂ３３に導入することによって、ＧＢＳＳ及びパタチンそれぞれのプロモーター制御下にあるＳＴ−ＡＲＡ融合体を有する２つの構築物を得た。 構築物を、エレクトロポレーション及びニコチアナ・タバカム（Ｌ．） ｃｖ． Ｘａｎｔｈｉ及びソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ） （Ｌ．） ｃｖ． Ｐｏｓｍｏの形質転換に用いた細菌宿主でアグロバクテリウムに移した。
【０１６５】
分画遠心分離を用いて、酵素の主要部分がミクロソーム画分にあることが裏付けられた。ゴルジに対する局在化は、古典的な細胞小器官分離法（Ｒａｙら、１９６９、Ｇｉｂｅａｕ及びＣａｒｐｉｔａ １９９０）を用いて決定付けた。
ＧＢＳＳプロモーターの制御下でＳＴ−ＡＲＡ融合体を有する植物を分析した。活性酵素の発現は、アラビナナーゼプレートアッセイを用いて塊茎抽出物で立証した。ウェスタンブロットを用いて、活性とミクロソーム画分、その後の細胞小器官の分離との関連性が立証され、大多数のアラビナナーゼがゴルジ小胞と結合しているが、溶解性のアポプラスト画分と細胞質画分にも原形質膜にも、酵素タンパク質は検出されないことが立証された。検出できるが、低いレベルが小胞体で認められた。これは、ゴルジへの輸送中に新たにアラビナナーゼが生産されたことを示している。小胞体画分が少量のゴルジ小胞で交雑混入（ｃｒｏｓｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）されることは、排除できない。最も重要なのは、実験により、アラビナナーゼが可溶性酵素から膜結合酵素に形質転換され、第一標的がゴルジ装置であることが立証されたことである。
これらの塊茎の細胞壁を、実施例５で行ったように、ＥＰＧ／ＰＭＥ抽出毛状領域の単糖組成について分析した。結果を下記の表５に要約する：
【０１６６】
【表５】

【０１６７】
要約すると、ゴルジに対して標的化したアラビナナーゼの発現は、毛状領域結合アラビノースを約５０％減少させた。共焦顕微鏡で観察されたアラビナン特異的抗体での標識パターンにより、組成データが裏付けられた。これは、何らかの方法により、ゴルジでの複合多糖類生合成過程を干渉することを目的とした最初の実施例である。
【０１６８】
実施例 ９
補助酵素を用いる二重構築物
インビトロの研究から、ラムノガラクツロナン−リアーゼの作用は、ラムノガラクツロナン−アセチルエステラーゼと組み合わせて用いると増すことが知られている。したがって、ポテトの塊茎でこれらの酵素双方を発現させるため、二重構築物をつくった（実施例４のｐＰＧＢ１２１ｓ−ｎｅｗ−ＲＨＧＢ−ＲＨＡ１参照）。ポテト植物を形質転換し、２１個の個々のトランスジェニック系を得た。重要な表現型上の変化は認められなかった。しかしながら、これらの２つの酵素を組み合わせることにより、ｒｈｇ−リアーゼのみが存在する形質転換体に匹敵するような大きな影響が期待された。リアーゼは独力で活性であることが分かっているので、性質上類似した表現型が期待される。
【０１６９】
実施例 １０
ＥＲ における多糖類修飾酵素の保持
ここに定義される「自己プロセシング植物物質」に関連しているため、ＥＲでの保持を以下に例示する。本発明の好ましい実施態様において、多糖類骨格を切断する酵素、一般にはヒドロラーゼ又はリアーゼは、ＥＲで保持されている。植物物質を均質化することにより、酵素は細胞壁と接触し、上清画分で回収される成分を可溶性にする。ＥＲ−保持を、アラビナナーゼに関してここに例示する：他の適当な酵素を下記の実施例１２に列挙する。
少なくともアポプラストに分泌される場合、ＷＯ ９４／２０６１１のアラビナナーゼＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、ポテトに毒性であることが分かった（Ｌｉｂｉａｋｏｖａ ら、１９９９）。タバコを本発明で用いて、活性形態の多糖類−修飾酵素のＥＲにおける蓄積を立証した。材料と方法に詳述するように、遺伝子は、アラビナナーゼ−ＫＤＥＬ ｃＤＮＡを有するｐＡＤＡＰベースの構築物で形質転換したタバコｃｖ． ＸａｎｔｈｉのＫＤＥＬタグ標識化エンドアラビナナーゼの変異型であった。
【０１７０】
形質転換した植物の葉の抽出物の酵素蓄積を、プレートアッセイを用いて評価した（材料と方法参照）。形質転換に成功した植物は、全て活性アラビナナーゼを生産した。アッセイは本来半定量的であるが、葉の粗抽出物の活性はたった１５分以内（形質転換体間では多少の変動がある）で検出でき（試料を含むパンチされたウェルの周囲に幅１ｍｍ以上の青いハロー）、酵素活性が極めて著しいことを示した。分画遠心分離により、測定可能な割合の酵素がミクロソーム画分に捕捉されていることが立証され、ＥＲでの保持が示された。その上、タバコの葉のアポプラスト流体を、Ｈｕｓｔｅｄら（１９９５）の方法を用いて単離することができる。アポプラスト流体に測定可能なアラビナナーゼ活性がないという可能性は、酵素がアポプラスト空間に誤って分類された証拠とみなすことができる。
【０１７１】
実施例 １１
酵素の液胞への標的化
ＥＲでの保持に関し、液胞標的化の例を「自己プロセシング植物物質」の項に示す。細胞内区画への標的化を立証するシグナル遺伝子−構築物を、実施例３に示す。液胞の酸性環境で安定であると考えられる酵素は、この細胞小器官に貯蔵されてもよい。手近には、２つの一般的な手段がある：遺伝子産物がそのまま蓄積される遺伝子の５’−配列に当該遺伝子を備える；あるいは、液胞への侵入時に（部分的又は全体として）切断されるＮ−末端伸長を有する当該遺伝子を設計する。液胞のポテトパタチンタンパク質Ｎ−末端部 （１４６ アミノ酸） （Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ ら、１９９１）及びサツマイモのスポラミンタンパク質（１１１アミノ酸） （Ｔｕｒｋら、１９９７）は、この目的に適した候補である。
【０１７２】
サツマイモのスポラミンでは、液胞の標的化情報は、一次構造のＮ−末端部に存在する。ＥＲへタンパク質を確実に輸送するＮ−末端シグナル配列を切断した後、プロフォーム（ｐｒｏ−ｆｏｒｍ）は、プロ−ペプチドが切断される液胞に効率的に標的化される（Ｋｏｉｄｅら、１９９７）。液胞標的化決定因の正確な位置がＮ−末端に存在することは知られているが、その正確な位置は知られていないポテトパタチンとは異なり、スポラミンの液胞標的化シグナルは十分に特徴付けられている。したがって、スポラミンは、植物の液胞に異種タンパク質を標的化するのに用いられる。液胞への移転後に、融合タンパク質のスポラミン部分の大多数を切断することによって、確実性の程度が高い異種タンパク質が得られるであろう。パタチンを用いる類似手段により、永久的なＮ−末端伸長部が得られ、異種タンパク質のミスフォールィング及び活性損失が生じる可能性がある。
【０１７３】
この目的のため、液胞−標的化ポテトパタチンＣＤＲ及びサツマイモのスポラミンコード領域の１１１アミノ酸をクローンし、配列決定した。スポラミン／パタチンのＮ−末端と適当なエンド−ポリガラクツロナーゼとの間に融合体を有する構築物を得ることができる；以下の実施例参照。ウェスタンブロット分析を用いて、（適用可能な）液胞への侵入によるプロセシングを確認することができる。ＥＲ−保持エンド−アラビナナーゼについての記載に相似する形質転換体の評価によって、液胞における活性エンド−ＰＧの蓄積が示されるであろう。
【０１７４】
実施例 １２
ガラクタナーゼ ＋ エンド − ポリガラクツロナーゼを発現する二重構築物からなる自己プロセシング塊茎
アポプラストへの分泌を宿命とするガラクタナーゼならびに内部貯蔵を目的とする真菌又は植物由来のエンド−ＰＧを有する二重構築物を調製することができる（実施例４の「自己プロセシング」ＤＮＡ構築物のデザイン）参照）。ガラクタナーゼは、インビボで調整する望ましいペクチンを触媒する酵素のプレースホルダーとみなすべきである。植物及び真菌のエンド−ポリガラクツロナーゼは、この実施例で「自己プロセシング植物物質」を例示するために用いられる。しかし、植物又は微生物由来のリアーゼがこのような状況で同様に有用であることも十分に留意すべきである。
【０１７５】
菌類のエンド−ポリガラクツロナーゼは、ホモガラクツロナンの装飾 （特にアセチル化）に対する感度、及び触媒にとってのｐＨ最適条件に対するそれらの安定性質（例えば、液胞が酸性環境であることを留意して）について選択される。受入れ番号ＡＦＯ７４２１３、ＷＯ ９４／１４９５２及びＷＯ ９４／１４９５２のアスペルギルス・アキュリータス由来のポリガラクツロナーゼＩ、ＩＩ及びＩＩＩ は興味深い生化学性質の大体の範囲を包含するが、他のポリガラクツロナーゼも使用できる。
高等植物のエンド−ＰＧタンパク質配列の比較によって、異なる２種のエンド−ＰＧが明らかにされた。一方は、シグナルペプチドと成熟タンパク質との間に位置するプロペプチドを有するが、他方はそのようなプロペプチドを有しない。プロ−ペプチドの機能はいまだ確立されていない。
【０１７６】
プロペプチドを有しないタイプの非分泌エンド−ＰＧ（修飾エンド−ＰＧ Ａ、Ｂ及びＣ）を持つ二重構築物の標的化は、ＥＲ（実施例１０）及び液胞（Ｂ及びＣ）（実施例１１）へのエンド−アラビナナーゼの標的化について既に例示されるようにして行うことができる。しかしながら、この場合は、細胞質内での遺伝子産物の蓄積も考慮される（Ａ）。Ｗｅｇｅｎｅｒ ら（１９９６）は、エルウィニア・カルトボーラのペクテートリアーゼが、検出可能な表現型の変化なしにトランスジェニックポテトの葉と塊茎双方の細胞質にどのように蓄積されたかを記載している。発現された熱安定細菌のセルラーゼを、トランスジェニック植物の細胞質に蓄積することも成功している。Ｚｉｅｇｅｌｈｏｆｆｅｒと協力者は、非常に制限された量ではあるが、トランスジェニックのアルファルファ、ポテト及びタバコのサーモモノスポラ・ファスカ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｆｕｓｃａ）から Ｅ２及びＥ３セルラーゼを生産した（Ｚｉｅｇｅｌｈｏｆｆｅｒら、１９９９）。セルラーゼ発現について表現型の作用は認められなかった。
【０１７７】
前述したように、ＫＤＥＬが既に転位したタンパク質をＥＲで保持するのに対し、シグナルペプチドは実際の転位を担っている。したがって、問題の酵素を細胞質で蓄積させるために、シグナルペプチドを植物宿主での発現前に除く必要がある。シグナルペプチドの切断部位がタンパク質の配列決定で決定されない場合には、例えば神経回路網シグナルＰ （Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９７）を用いて、もっとも可能性の高い切断部位を決定することができる。
シグナルペプチドの物理的除去は、問題の酵素の成熟部に特異的なプライマーでＰＣＲを用いることによりＤＮＡレベルで行われる。この手段によっても、細胞質蓄積を宿命とする酵素の成熟部の翻訳を最適にするための開始コドン及び配列が確実に導入される。
プロペプチドのない代表的な植物のエンド−ＰＧは、ダイズのＡＦ１２８２６６： ＰＧ１及びトマトのＵ７０４８０： ＴＡＰＧ２を含むが、これに制限されない。
【０１７８】
細胞質、ＥＲ又は液胞に対し、プロペプチドを有するタイプの非分泌エンド−ＰＧ （修飾エンドＰＧ Ｄ−Ｉ）を標的化することは、各区画ごとに、２種の修飾エンド−ＰＧによって行われるべきである。前記の項に記載される３つの修飾が成熟タンパク質の前にプロペプチド完全体を残す１系列（Ｄ、Ｆ及びＨ）、及びプロペプチドが除かれる３つからなる１系列（Ｅ、Ｇ及びＩ）は、プロペプチドを含むものと、又は含まないものとがある、３つの異なる局在化をカバーする合計６個の異なる構築物（Ｄ−Ｉ）を生じる。プロペプチドを有する植物のエンド−ＰＧの例は、なたねの脂肪種子のＸ９５００： ＲＤＰＧ１及びキーウィフルーツのＰ３５３３６である。実施例６による分析は、ガラクタナーゼ発現に起因する細胞壁の表現型が、実施例５及び６の結果から予測されるとおりであることを確認するのに用いることができる。さらに、機能性エンド−ポリガラクツロナーゼの発現及び蓄積は、ノーザンブロット及びウェスタンブロットの分析ならびにポリガラクツロナーゼ活性のアッセイにより確立される。
【０１７９】
参考文献
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Ｓａｍｕｅｌｓｅｎ， Ａ．Ｂ．， Ｌｕｎｄ， Ｉ．， Ｄｊａｒｏｍｉ， Ｊ．Ｍ．， Ｐａｕｌｓｅｎ， Ｂ．Ｓ．， Ｗｏｌｄ，Ｊ．Ｋ．， Ｋｎｕｔｓｅｎ， Ｓ．Ｈ． （１９９９） Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｏｍｅ ｈｅｔｅｒｏｘｙｌａｎ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｅｅｄｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔａｇｏ ｍａｊｏｒ Ｌ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｎ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ３８：１３５−１４３
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Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ， Ｕ．， Ｂｒａｕｅｒ， Ｍ．， ｖｏｎ Ｓｃｈａｅｗｅｎ， Ａ．， Ｓｔｉｔｔ， Ｍ．， 及びＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒ， Ｌ． （１９９１）． Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｙｅａｓｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｖｅｒｔａｓｅ ｉｎ ｅｉｔｈｅｒ ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｏｌ， ｖａｃｕｏｌｅ ｏｒ ａｐｏｐｌａｓｔ： ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｓｕｃｒｏｓｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｓｉｎｋ／ｓｏｕｒｃｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ． Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒ． １：９５−１０６．
Ｓｏｒｅｎｓｅｎ， Ｓ．Ｏ．， Ｓｋｊｏｔ， Ｍ．， Ｕｌｖｓｋｏｖ， Ｐ．， Ｄａｌｂｏｇｅ， Ｈ．， Ｂｏｒｋｈａｒｄｔ， Ｂ． （１９９９）． Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｃｔｉｎ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｆ ａ ｆｕｎｇａｌ ｅｎｄｏ−ｂ−１，４−ｇａｌａｃｔａｎａｓｅ ｉｎ ｐｏｔａｔｏ． Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｌｕｂ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌｓ， Ａｌｉｃａｎｔｅ Ｓｐａｉｎ． Ａｂｓｔｒａｃｔ ＃ ４９
Ｔｕｒｋ， Ｓ． Ｃ． Ｈ． Ｊ．， Ｒｏｏｓ， Ｋ． ｄ．， Ｓｃｏｔｔｉ， Ｐ． Ａ．， Ｄｕｎ， Ｋ． ｖ．， Ｗｅｉｓｂｅｅｋ， Ｐ．， 及びＳｍｅｅｋｅｎｓ， Ｓ． Ｃ． Ｍ． （１９９７）． Ｔｈｅ ｖａｃｕｏｌａｒ ｓｏｒｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｓｐｏｒａｍｉｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｓ ＧＵＳ， ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ， ｔｏ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｖａｃｕｏｌｅ． Ｎｅｗ ｐｈｙｔｏｌ １３６：２９−３８．
Ｖｉｓｓｅｒ， Ｊ．， Ｖｏｒａｇｅｎ， Ａ．Ｇ．Ｊ． （編集） （１９９６） Ｐｅｃｔｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｃｔｉｎａｓｅｓ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ
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Ｖｏｒａｇｅｎ， Ａ．Ｇ．Ｊ．， Ｐｉｌｎｉｋ， Ｗ．， Ｔｈｉｂａｕｌｔ， Ｊ．−Ｆ．， Ａｘｅｌｏｓ， Ｍ．Ａ．Ｖ． ＆ Ｒｅｎａｒｄ， Ｃ．Ｍ．Ｇ．Ｃ． （１９９５） Ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｅｄ． Ｓｔｅｐｈｅｎ， Ａ．Ｍ． （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．）： ２８７−３３９．
Ｖｏｒａｇｅｎ， Ａ．Ｇ．Ｊ．， Ｓｃｈｏｌｓ， Ｈ．Ａ． 及びＰｉｌｎｉｋ， Ｗ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｃｔｉｎｓ ｂｙ ｈ．ｐ．ｌ．ｃ． Ｆｏｏｄ Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ １ （１）， １９８６， ６５−７０．
Ｗｅｅ， Ｅ．， Ｓｈｅｒｒｉｅｒ， Ｊ． Ｄ．， Ｐｒｉｍｅ， Ｔ．， 及びＤｕｐｒｅｅｅ， Ｐ． （１９９８）． Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｓｉａｌｙｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｔｏ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｇｏｌｇｉ ａｐｐａｒａｔｕｓ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １０：１７５９−１７６８．
Ｗｅｇｅｎｅｒ， Ｃ．， Ｂａｒｔｌｉｎｇ， Ｓ．， Ｏｌｓｅｎ， Ｏ．， Ｗｅｂｅｒ， Ｊ．， Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ， Ｄ． ｖ． （１９９６） Ｐｅｃｔａｔｅ ｌｙａｓｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏｅｓ ｃｏｎｆｅｒｓ ｐｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｆｅｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ． Ｐａｔｈｏｌ． ４９：３５９−３７６．
Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ， Ｊ．， Ｌｅｅ， Ｅ． Ｕ．， ＭｃＥｎｔｅｅ， Ｋ．， Ｌａｉ， Ｐ． Ｈ．， 及びＰａｕｌｓｏｎ， Ｊ． Ｃ． （１９８７）． Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｂ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ ａｌｐｈａ−２，６−ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｃｏｎｖｅｓｒｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｔｏ ｓｏｕｌｕｂｌｅ ｆｏｒｍｓ ｂｙ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ＮＨ２−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｉｇｎａｌ ａｎｃｈｏｒ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：１７７３５−１７７７４３．
Ｙａｍａｄａ， Ｈ． ＆ Ｋｉｙｏｈａｒａ Ｈ． （１９９９） Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｈｅｒｂｓ． Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ａｇｅｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｐｌａｎｔｓ， ｅｄ． Ｗａｇｎｅｒ， Ｈ．， Ｂｉｒｈｈａｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｂａｓｅｌ， ｐｐ １６１−２０２
Ｚｉｅｇｅｌｈｏｆｆｅｒ， Ｔ．， Ｗｉｌｌ， Ｊ．， 及びＡｕｓｔｉｎ−Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， Ｓ． （１９９９）． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｌｆａｌｆａ （Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）． ｐｏｔａｔｏ （Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．） ａｎｄ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．）． Ｍｏｌ． Ｂｒｅｅｄ． ５：３０９−３１８．
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、アスペルギルス・アキュリータスのエンド−ガラクタナーゼを発現する２つのトランスジェニックのポテト植物Ｔ_１１．１ 及びＴ_１３．１を野生型と識別するための予備的な主成分分析（ＰＣＡ）の使用を例示する。それは、第三及び第五主成分（ＰＣ）スコアを用いて、Ｔ_１３．１ と野生型との比較を示している。
【図２】図２は、野生型ポテト塊茎（ＷＴ）及びトランスジェニックポテト植物Ｔ_１１．１ ならびにＴ_１３．１の細胞壁から、それぞれ真菌性ＥＰＧとＰＭＥの組合わせ処理によって特別に抽出されるラムノガラクツロナンＩ（ＲＧＩ）のサイズ排除クロマトグラフィー分析（屈折率によって検出）（不定単位）を示す。このＥＰＧ／ＰＭＥ処理は、野生型と比較して形質転換塊茎の細胞壁からほぼ２倍のウロン酸（ＵＡ）を放出した。野生型細胞壁からＥＰＧ／ＰＭＥによって抽出されるＲＧＩは、ＵＡ含量及び屈折率検出によって示されるように２つの主画分：画分（分子量＞５００ ｋＤａ） 及び画分 Ｃ （分子量 ０．２〜８ ｋＤａ）を含んだ。Ｔ_１１．１ 及びＴ_１３．１のＥＰＧ／ＰＭＥ抽出物は、画分Ａをあまり含まず、実質的には画分Ｃが多く、さらに野生型抽出物には存在しない〜１２０ ｋＤａのフラグメント （画分Ｂ）を含む、野生型とは異なるプロフィルを有する。＊は、ペクチン物質が全くない試料の緩衝塩が存在することに起因する、大きなピークを示す。
【図３】図３は、モノクローナル抗体ＬＭ５でゴールドラベル（ｇｏｌｄ ｌａｂｅｌｌｅｄ）し、銀で増強し、反射共焦走査顕微鏡（Ａ， Ｂ）で及び透過型電子顕微鏡（Ｃ， Ｄ）で可視化した、野生型（Ａ， Ｃ）及びエンド−ガラクタナーゼ−発現（Ｔ_１３．１） （Ｂ， Ｄ） ポテト塊茎の切片を示す。野生型柔組織細胞壁は強く標識されている（Ａの白色、Ｃの黒色粒子）が、Ｔ_１３．１の塊茎では、ラベル密度は非常に減少し、原形質膜に近い（Ｄの矢印）幾つかの細胞の角（Ｂの矢じり）にのみ局在している。＊は、澱粉顆粒によっていったんは占有された空間を示す。ＭＬは、これらの角で満ちた拡張したミドルラメラを示す。スケールバー：Ａ及びＢ １００ ｍｍ、Ｃ 及びＤ ２ ｍｍ。

Claims (59)

1. （ｉ） 核酸構築物の植物細胞への導入後に、少なくとも１つの目的の細胞壁多糖類−修飾酵素の生産を改変するヌクレオチド配列からなる核酸構築物を準備し、
   （ｉｉ） 核酸構築物で植物細胞を形質転換し、かつ
   （ｉｉｉ） その形質転換した植物細胞から、少なくとも１つの細胞壁多糖類−修飾酵素の生産が変化している植物細胞培養物、植物組織又はトランスジェニック植物を得て、
   野生型植物に対して、標的とされる基質細胞壁多糖類が修飾され、少なくとも１つの単糖の割合が少なくとも１０％変化しているか、又は少なくとも１つのグリコシド結合の割合が少なくとも１０％変化している単糖プロフィルを有するトランスジェニック植物細胞、植物組織又は植物を得ることからなる、
   野生型状態に対して、細胞壁複合多糖類構造が修飾されており、その修飾が全体的なグリコシド結合パターン及び単糖プロフィルの少なくとも１つである、トランスジェニック植物物質の製造方法。
2. 構築物の植物細胞への導入後に、少なくとも１つの目的の細胞壁多糖類−修飾酵素の生産を改変するヌクレオチド配列が、標的とされる細胞壁多糖類を修飾し得る酵素をコードする配列である請求項１に記載の方法。
3. コード配列が、コード配列の発現を管理するプロモーターに操作可能に連結されている請求項２に記載の方法。
4. 生産が改変される、少なくとも１つの目的の細胞壁多糖類−修飾酵素が内因性酵素である請求項１に記載の方法。
5. 構築物の植物細胞への導入後に、少なくとも１つの目的の細胞壁多糖類−修飾酵素の生産を改変するヌクレオチド配列が、標的とされる細胞壁多糖類を修飾し得る酵素をコードする内因性配列の発現を調節する配列である請求項４に記載の方法。
6. 標的とされる細胞壁多糖類を修飾し得る酵素をコードする内因性配列の発現を調節する配列が、リプレッサーの発現を低下させるか、又は内因性の目的細胞壁多糖類−修飾酵素の阻害剤の生産を低下させるアンチセンス配列をコードする配列である請求項５に記載の方法。
7. 標的とされる細胞壁多糖類を修飾し得る酵素をコードする内因性配列の発現を調節する配列が、組換え事象後に、内因性の目的の細胞壁修飾酵素に操作可能に連結し、細胞壁−修飾酵素のコード配列の発現を管理できる新たな又は修飾プロモーターの挿入を生じる配列である、請求項５に記載の方法。
8. 構築物の植物細胞への導入後に、少なくとも１つの目的の細胞壁多糖類−修飾酵素の生産を改変するヌクレオチド配列が、組換え事象後に、標的とされる細胞壁多糖類を修飾し得る酵素をコードする内因性配列の発現を異なる位置に標的化させる配列である請求項４に記載の方法。
9. 多糖類−修飾酵素が、微生物又は真菌由来である請求項２に記載の方法。
10. 核酸構築物が、植物細胞への導入後に、細胞ゲノムに組み込まれないウイルスベクターである請求項１〜６及び９のいずれかに記載の方法。
11. プロモーターが、植物由来である請求項３に記載の方法。
12. プロモーターが、貯蔵器官特異的プロモーターを含む、組織又は器官特異的プロモーターである請求項１１に記載の方法。
13. プロモーターが、顆粒結合型澱粉合成酵素（ＧＢＳＳ）プロモーター及びＢ３３プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、ポテトの塊茎での発現を管理し得るプロモーターである請求項１２に記載の方法。
14. 標的とされる細胞壁複合多糖類が、ペクチン及びヘミセルロース多糖類からなる群から選択される請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
15. 多糖類−修飾酵素が、エンド−ラムノガラクツロナンヒドロラーゼ、エンド−ラムノガラクツロナンリアーゼ、エンド−ガラクタナーゼ、エンド−アラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、ガラクトシダーゼ、例えばβ−ガラクトシダーゼ、キシロシダーゼ及びエキソ−ガラクツロナーゼ及びその類似体又はイソ型からなる群から選択される請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
16. 構築物の植物細胞への導入後に、少なくとも１つの目的の細胞壁多糖類−修飾酵素の生産を改変するヌクレオチド配列が宿主植物の内因性遺伝子と十分に異なり、同時抑制を生じない、前記請求項のいずれかに記載の方法。
17. 補助酵素が目的の細胞壁多糖類−修飾酵素と同時に発現し、同時発現により、多糖類−修飾酵素の基質への接触が促進される前記請求項のいずれかに記載の方法。
18. 補助酵素が、メチルエステラーゼ及びアセチルエステラーゼを含むエステラーゼ、ならびにアラビノフラノシダーゼ、ガラクトシダーゼ、キシロシダーゼ又はフコシダーゼのようなポリマーからひとつの単糖を除くグリコシダーゼからなる群から選択される請求項１７に記載の方法。
19. （ｉ） 植物細胞での発現により、少なくとも１つの細胞壁多糖類−修飾酵素を、通常は存在しない植物細胞の区画に標的化させるか、又は植物細胞で天然に生産され、細胞壁多糖類の生合成に影響を及ぼすポリペプチドの発現を変えるヌクレオチド配列からなる核酸構築物を準備し、
    （ｉｉ） 植物細胞を核酸構築物で形質転換し、かつ
    （ｉｉｉ） 形質転換植物細胞から、少なくとも１つの細胞壁多糖類−修飾酵素が野生型植物に対して異なる区画に生じる植物細胞培養物、植物組織又はトランスジェニック植物を得ることからなる、
    少なくとも１つの細胞壁複合多糖類の植物細胞における生合成を修飾し、野生型状態に対して、細胞壁複合多糖類構造が修飾されており、修飾が全体的なグリコシド結合パターン及び単糖プロフィルの少なくとも１つである、トランスジェニック植物物質を得る方法。
20. 得られるトランスジェニック植物細胞、植物組織又は植物において、標的とされる基質細胞壁多糖類が、野生型植物に対して、少なくとも１つの単糖の割合が少なくとも１０％変化するか、又は少なくとも１つのグリコシド結合の割合が少なくとも１０％変化する単糖プロフィルを有するように修飾されている、請求項１９に記載の方法。
21. 少なくとも１つの細胞壁多糖類−修飾酵素が、ゴルジスタックと融合しているか、又はそれから分離している膜小胞を含むゴルジ装置に標的化されている請求項１９に記載の方法。
22. 植物細胞での発現により、少なくとも１つの細胞壁多糖類−修飾酵素がゴルジ装置に標的化されるヌクレオチド配列が、少なくとも１つの細胞壁多糖類−修飾酵素からなるキメラ遺伝子産物をコードする配列及びゴルジにキメラ遺伝子産物を標的化しうる配列である請求項２１に記載の方法。
23. 標的化配列が、タイプＩＩ膜アンカーゴルジタンパク質又はそのフラグメント又は可溶性ゴルジ標的化タンパク質又はそのフラグメントである請求項２２に記載の方法。
24. 可溶性ゴルジ標的化タンパク質が、アカエンドウマメ可逆的グリコシル化性ポリペプチド（ＲＧＰ１）である請求項２３に記載の方法。
25. タイプＩＩ膜アンカーゴルジタンパク質が、シアリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ及びガラクトシルトランスフェラーゼからなる群から選択される請求項２３に記載の方法。
26. 植物細胞での発現により、少なくとも１つの細胞壁多糖類−修飾酵素を通常は存在しない植物細胞の区画に標的化させるヌクレオチド配列が、導入される植物細胞ゲノムのプロモーターに操作可能に連結している請求項１９〜２５のいずれかに記載の方法。
27. （ｉ） 核酸構築物の植物細胞への導入後に、非アポプラスト又は非ゴルジ区画で細胞壁多糖類−修飾酵素を発現させるか、又はインビボの条件では不活性であるが、植物細胞由来の植物物質の収穫後に活性化することのできる形態で、細胞壁多糖類−修飾酵素を発現させるヌクレオチド配列からなる核酸構築物を準備し、
    （ｉｉ） その核酸構築物で植物細胞を形質転換し、かつ
    （ｉｉｉ） 少なくとも１つの細胞壁複合多糖類を、非アポプラスト又は非ゴルジ区画で発現される細胞壁多糖類−修飾酵素と接触させることにより、又はインビボで不活性な形態で発現される酵素が活性化される条件に収穫した植物物質を付すことにより、適当な収穫後の条件下で、少なくとも１つの細胞壁複合多糖類を収穫後に酵素的に処理できるトランスジェニック植物物質を前記の形質転換植物細胞から得ることからなる、
    少なくとも１つの細胞壁複合多糖類が植物物質自体に存在する酵素により収穫後に酵素的に処理される部分を含むトランスジェニック植物を得る方法。
28. 核酸構築物の植物細胞への導入後に、細胞壁多糖類修飾酵素を非アポプラスト又は非ゴルジ区画で発現させるヌクレオチド配列が、植物の生育中に細胞壁多糖類−修飾酵素を液胞、小胞体、細胞質及びプラスチドからなる群から選択される細胞区画に標的化させる配列である請求項２７に記載の方法。
29. 非アポプラスト又は非ゴルジ区画で発現される細胞壁多糖類−修飾酵素が、植物細胞に導入される核酸構築物に含まれる配列によってエンコードされる請求項２８に記載の方法。
30. 非アポプラスト又は非ゴルジ区画で発現される細胞壁多糖類−修飾酵素が、核酸構築物が導入される細胞ゲノムに存在する内因性配列によってエンコードされる請求項２８に記載の方法。
31. 細胞壁多糖類−修飾酵素が、エンド−ポリガラクツロナーゼ、エンド−ペクチンリアーゼ、ペクテートリアーゼ、ラムノガラクツロナンヒドロラーゼ、ラムノガラクツロナンリアーゼ、エンド−グルカナーゼ、エンド−キシラナーゼ及びそのイソ型もしくは類似体からなる群から選択される請求項２７〜３０のいずれかに記載の方法。
32. 細胞壁多糖類−修飾酵素の発現が、植物プロモーターによって管理される請求項２７〜３１のいずれかに記載の方法。
33. 植物物質自体に存在する酵素によって収穫後に酵素的に処理される少なくとも１つの細胞壁複合多糖類が、ペクチン及びヘミセルロース多糖類からなる群から選択される請求項２７〜３２のいずれかに記載の方法。
34. ペクチンの収穫後プロセシングが、ラムノガラクツロナンとホモガラクツロナン領域間の領域である請求項３３に記載の方法。
35. 植物細胞が、植物物質自体に存在する酵素によって収穫後に酵素的に処理される細胞壁多糖類を含む少なくとも１つの細胞壁複合多糖類の構造をインビボで修飾し得る酵素を発現させる核酸配列でさらに形質転換される請求項２７〜３４のいずれかに記載の方法。
36. 少なくとも１つの細胞壁複合多糖類の構造をインビボで修飾し得る酵素を発現させる核酸配列が、細胞壁多糖類−修飾酵素をコードする配列である請求項３５に記載の方法。
37. 少なくとも１つの細胞壁複合多糖類の構造をインビボで修飾し得る酵素を生じる核酸配列が、細胞壁多糖類−修飾酵素をコードする内因性配列の発現に影響を及ぼす生産物をコードする配列である請求項３６に記載の方法。
38. 細胞壁多糖類−修飾酵素がアポプラストに標的化されている請求項３６又は３７に記載の方法。
39. 少なくとも１つの細胞壁複合多糖類の構造をインビボで修飾し得る酵素が、エンド−ラムノガラクツロナンヒドロラーゼ、エンド−ラムノガラクツロナンリアーゼ、エンド−ガラクタナーゼ、エンド−アラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、ガラクトシダーゼ、例えばβ−ガラクトシダーゼ、キシロシダーゼ及びエキソ−ガラクツロナーゼ、その類似体又はイソ型からなる群から選択される請求項３５〜３８のいずれかに記載の方法。
40. （ｉ） 請求項２８〜３９のいずれかに記載の方法を用いて、トランスジェニック植物を準備し、
    （ｉｉ） その植物を培養して、収穫し、少なくとも１つの細胞壁複合多糖類を植物物質自体に存在する酵素によって収穫後に酵素的に処理できる部分を、植物から単離し、
    （ｉｉｉ） その部分を、非アポプラスト又は非ゴルジ区画で発現される細胞壁多糖類−修飾酵素をその細胞壁多糖類基質と接触させる条件、又はインビボ条件下で不活性な形態で発現される細胞壁多糖類−修飾酵素が活性化されて修飾細胞壁多糖類を生じる条件に付し、かつ
    （ｉｖ） 修飾細胞壁多糖類物質を単離することからなる、
    野生型状態に対して、構造及び組成が修飾されている、植物細胞壁多糖類物質を得る方法。
41. 得られる物質中の得られる修飾細胞壁多糖類が、少なくとも１つの単糖の割合が少なくとも１０％変化しているか、又は少なくとも１つのグリコシド結合の割合が少なくとも１０％変化している単糖プロフィルを有するように修飾される請求項４０に記載の方法。
42. 少なくとも１つの細胞壁複合多糖類が植物物質自体に存在する酵素によって収穫後に酵素的に処理される植物部分が、ポテトの植物部分である請求項４０又は４１に記載の方法。
43. 収穫後に修飾される細胞壁多糖類が、ペクチンである請求項３９〜４２のいずれかに記載の方法。
44. 請求項３９〜４３の何れかの方法によって得られる、野生型状態に対して構造及び組成が修飾された植物細胞壁多糖類物質。
45. 請求項１〜１８のいずれかの方法によって得られるトランスジェニック植物、又はその植物の子孫もしくはその一部。
46. 請求項４５に記載のトランスジェニック植物又はその子孫又は一部から得られる植物細胞壁多糖類含有物質。
47. 対応する野生型細胞壁多糖類を含む物質に対して、少なくとも１つの機能特性が変化している、請求項４６に記載の植物細胞壁多糖類−含有物質。
48. 変化した機能特性が、薬理活性、水結合能、加工性、ゲル化性、粘稠特性及び消化性からなる群から選択される請求項４７に記載の植物細胞壁多糖類−含有物質。
49. 食品、飼料製品、医薬品又は医療品及び化粧品からなる群から選択される製品の製造における、請求項４５に記載のトランスジェニック植物又はその植物の子孫又はその一部、あるいは請求項４６〜４８のいずれかに記載の植物細胞壁多糖類−含有物質の使用。
50. 医薬組成物、インプラント物質、医療器具、創傷ドレッシング及び外科粘着剤からなる群から選択される製品を含む、請求項４６〜４８のいずれかに記載の植物細胞壁多糖類−含有物質からなる医薬品又は医療品。
51. 請求項１９〜３９のいずれかに記載の方法によって得られるトランスジェニック植物又はその植物の子孫又はその一部。
52. 請求項５１に記載のトランスジェニック植物又はその子孫又は一部から得られる植物細胞壁多糖類−含有物質。
53. 対応する野生型細胞壁多糖類を含む物質に対して、少なくとも１つの機能特性が変化している請求項５２に記載の植物細胞壁多糖類−含有物質。
54. 変化した機能特性が、薬理活性、水結合能、加工性、ゲル化性、粘稠特性及び消化性からなる群から選択される請求項５３に記載の植物細胞壁多糖類−含有物質。
55. 食品、飼料製品、医薬品又は医療品及び化粧品からなる群から選択される製品の製造における、請求項５１に記載のトランスジェニック植物又はその植物の子孫又はその一部、あるいは請求項５２〜５４のいずれかに記載の植物細胞壁多糖類−含有物質の使用。
56. 医薬組成物、インプラント物質、医療器具、創傷ドレッシング及び外科粘着剤からなる群から選択される製品を含む、請求項５２〜５４のいずれかに記載の植物細胞壁多糖類−含有物質からなる医薬品又は医療品。
57. （ｉ） 請求項１〜１８及び１９〜３９のいずれかに記載の方法を用いて、培養可能なトランスジェニック植物、又は培養可能なその子孫を準備し、
    （ｉｉ） 適当な植物培養条件下でそのトランスジェニック植物又はその子孫を培養し、修飾構造及び／又は修飾組成を有する少なくとも１つの細胞壁複合多糖類からなる植物物質を得て、かつ
    （ｉｉｉ） 修飾細胞壁多糖類からなる物質を培養した植物から単離することからなる、
    野生型状態の対応する細胞壁多糖類に対して、修飾構造及び／又は修飾組成を有する、植物細胞壁複合多糖類からなる物質の製造方法。
58. 培養される植物又はその子孫がポテト植物である請求項５７に記載の方法。
59. 培養植物から単離される物質が、野生型植物に対して、少なくとも１つの単糖の割合が少なくとも１０％変化しているか、又は少なくとも１つのグリコシド結合の割合が少なくとも１０％変化している単糖プロフィルを有するように修飾されている細胞壁多糖類からなる、請求項５７又は５８に記載の方法。

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