JP2004507234A - メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンポリペプチドとその製造及び使用の方法 - Google Patents

メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンポリペプチドとその製造及び使用の方法 Download PDF

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Abstract

新規のディスインテグリンポリペプチド、そのようなポリペプチドをつくる方法、並びにディスインテグリン関連の障害及び状態を治療し、メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンポリペプチド活性を変調する剤を同定するためにそれらを使用する方法、が提供される。

Description

【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、３５　Ｕ．Ｓ．Ｃ．　１１９条に基づいて、２０００年７月２８日出願の米国暫定特許出願第６０／２２１，８３８号の利益を主張し、その開示内容は参照により本明細書に組込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ヒトメタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンポリペプチドファミリーへの相同性を有するポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びその製造及び使用の方法に関する。
【０００３】
背景技術
メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンポリペプチドは、本明細書でＡＤＡＭ（Ａ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ Ａｎｄ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ；ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼのドメイン）ポリペプチド又は「ＡＤＡＭｓ」とも呼ばれ、多ドメイン性Ｉ型膜ポリペプチドの関連群である。ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドのあるメンバーは、例えば、生殖組織又は筋肉細胞を含む、ある細胞型で高度に発現される。さらに、ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドのメンバーは、発生を通して一般に恒常的に発現される。
【０００４】
今日、数多くのＡＤＡＭ遺伝子が同定されており、ファーチリン（ｆｅｒｔｉｌｉｎ）α及びβ（インテグリン仲介性の結合と卵子及び精子の融合に関わり、ＰＨ−３０α及びβとして以前知られていた）、精巣上体先端タンパク質（ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ａｐｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）Ｉ、シリテスチン（ｃｙｒｉｔｅｓｔｉｎ）、ＭＤＣ（ヒト乳癌における腫瘍サプレッサーの候補物）、メルトリン（ｍｅｌｔｒｉｎ）−α（筋管形成のプロセスにおける筋芽細胞の融合を仲介する）、ＭＳ２（マクロファージ表面抗原）、及びメタルギジン（ｍｅｔａｒｇｉｄｉｎ）を含む。さらに、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）モチーフのあるディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼドメインを含有する、ＡＤＡＭＴＳ−１と命名された新たなＡＤＡＭファミリー遺伝子が、様々な炎症プロセス、並びに癌悪液質の進展と密接に関連していることが示された（Ｋｕｎｏ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： ５５６−５６２ （１９９７））。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）にある新たなＡＤＡＭのメンバーは、ｋｕｚｂａｎｉａｎ 遺伝子（「ＫＵＺ」）と呼ばれ、ショウジョウバエの神経発生に関与していることが見出された（Ｒｏｏｋｅ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３： １２２７−１２３１ （１９９６年８月））。
【０００５】
典型的なＡＤＡＭファミリーポリペプチドは、プロ−、メタロプロテイナーゼ様−、ディスインテグリン様−、システインリッチ、上皮増殖因子様リピートの膜貫通及び細胞質ドメインからなる細胞表面ポリペプチドである。あるＡＤＡＭｓでは、メタロプロテイナーゼドメインが、増殖因子、接着タンパク質、及び炎症性因子の放出のような、タンパク質プロセシング機能に関与すると考えられている。ディスインテグリンドメインは、血小板凝集、腫瘍細胞又は好中球の遊走、及び血管新生のような、インテグリン仲介性細胞接着（細胞と細胞、細胞とマトリックスの接着）相互作用においてある役割を果たす可能性がある。ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドのこのような活性は、メタロプロテイナーゼ及びインテグリンの基質との相互作用を通じて行われる可能性が高く、メタロプロテイナーゼの基質はＡＤＡＭファミリーのポリペプチドのメタロプロテイナーゼ触媒ドメインへ結合し、そして、インテグリンはディスインテグリンドメインに結合する。増殖因子、接着タンパク質、及び炎症性因子の放出のようなタンパク質プロセシング機能と細胞接着の仲介におけるその推定される役割のために、ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドは、炎症、癌、アレルギー、生殖系及び血管系の状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）に関連していると推定されている。ＡＤＡＭポリペプチドファミリーの特徴及び活性は、Ｂｌａｃｋ， Ｒ． Ａ． ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ， Ｊ． Ｍ．， １９９８， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０： ６５４−６５９； 及び Ｓｃｈｌｏｎｄｏｒｆｆ， Ｊ． ａｎｄ Ｂｌｏｂｅｌ， Ｃ． Ｐ．， １９９９， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １１２： ３６０３−３６１７ にさらに記載されていて、これらは参照により本明細書に組込まれる。
【０００６】
発明の概要
本明細書に初めて提供されるのは、メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリン（ＭＰＤ）ポリペプチド及びＡＤＡＭ（「ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ」）ポリペプチドファミリーへの相同性を有するポリペプチド配列と、ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドに含まれる機能性ドメイン、並びにそれらの製造の方法と使用の方法である。
【０００７】
本発明は、配列番号３〜４及び６〜２７；ディスインテグリン活性を有する配列番号６の断片；ディスインテグリン活性を有する配列番号８の断片；ディスインテグリン活性を有する配列番号１４の断片；メタロプロテイナーゼ活性を有する配列番号２４の断片；ディスインテグリン活性を有する配列番号２４の断片；ほぼ残基４３ないし１４８の配列番号６；ほぼ残基１ないし３６６の配列番号８；ほぼ残基３８ないし３６６の配列番号８；ほぼ残基１ないし６２２の配列番号１４；ほぼ残基８４ないし６２２の配列番号１４；ほぼ残基２９９ないし６２２の配列番号１４；ほぼ残基１ないし７０１の配列番号２１；ほぼ残基１ないし２７７の配列番号２４；ほぼ残基２７８ないし４３５の配列番号２４；ほぼ残基１ないし３３２の配列番号２５；ほぼ残基１ないし６２７の配列番号２５；ほぼ残基１ないし２１５の配列番号２６；ほぼ残基１１８ないし２１５の配列番号２６；ほぼ残基２２４ないし３８３の配列番号２６；及び、ほぼ残基２９ないし５７４の配列番号２７からなる群から選択される配列を含んでなる、実質的に精製されたポリペプチドを提供する。
【０００８】
本発明はまた、配列番号３〜４、６〜１１、１３〜１８、２０、又は２３〜２７に示されるような配列に、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９７％相同である配列を含んでなる実質的に精製されたポリペプチドを提供し、ここでこのポリペプチドは、メタロプロテイナーゼ若しくはディスインテグリン活性を有する。
【０００９】
さらに本発明は、上記に示されるような、第二のポリペプチドへ連結したポリペプチドを提供し、ここで第二のポリペプチドは、ロイシンジッパーポリペプチド、Ｆｃポリペプチド、又はペプチドリンカー部分である。
【００１０】
さらに本発明には、上記に示されるようなポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、並びにそのポリヌクレオチドを含んでなるベクター、及び本発明のポリヌクレオチドを含んでなる組換え宿主細胞が含まれる。
【００１１】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含有する宿主細胞をポリペプチドの発現を促進する条件の下で培養することを含んでなる、ポリペプチドを産生するための方法を提供する。
【００１２】
さらに本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞をポリペプチドの発現を促進する条件の下で培養することによって産生されるポリペプチドを提供する。
【００１３】
本発明は、上記に示されるようなポリペプチドへ特異的に結合する実質的に精製された抗体を提供する。１つの態様では、抗体がモノクローナル抗体である。もう１つの態様では、抗体がヒト若しくはヒト化抗体である。
【００１４】
本発明によりまた提供されるのは、上記又は本明細書に示されるポリペプチドの阻害剤若しくは結合剤を設計する方法であって、この方法は、該ポリペプチドの三次元構造を決定し、この三次元構造について基質若しくはリガンドの結合部位を分析し、該ポリペプチドと相互作用することが予測される分子を設計し、そして、及び該分子の阻害若しくは結合活性を決定する、ことを含んでなる。
【００１５】
さらに本発明は、本明細書に示されるポリペプチドの活性を変調する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）剤（ａｇｅｎｔ）を同定するための方法を提供し、この方法は、剤を該ポリペプチドと、剤とポリペプチドが相互作用するような条件の下で接触させ；そして、該剤の存在下での該ポリペプチドの活性を対照（例、剤の不在下でのポリペプチド）と比較して決定する、ことを含んでなり、ここで活性の変化は、該ポリペプチドの活性を変調する剤の示標となる。１つの態様では、ポリペプチドの活性が、ディスインテグリン活性、細胞接着活性、血管新生活性、メタロプロテイナーゼ活性、及びそれらの組合せ（例、メタロプロテイナーゼ及びディスインテグリン活性）からなる群から選択される。もう１つの態様では、剤が、抗体、小分子、ペプチド、及びペプチド模擬体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）からなる群から選択される。
【００１６】
本発明はまた、細胞若しくは哺乳動物において血管新生を変調するための方法を提供し、この方法は、該細胞若しくは哺乳動物へ、ディスインテグリン活性を変調するのに有効な量で本明細書に示される本発明のポリペプチドを接触させるか又は投与することを含んでなる。細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 若しくは ｉｎ ｖｉｖｏ で接触され得る。
【００１７】
本発明によりまた提供されるのは、本明細書に示される本発明のポリペプチドに内皮細胞を接触させることを含んでなる、内皮細胞遊走を変調するための方法である。
【００１８】
本発明は、インテグリンを発現する細胞若しくは哺乳動物へ、ディスインテグリン活性を有するポリペプチドの有効量を接触させるか又は投与することを含んでなる、インテグリンのリガンドへの結合を阻害する方法を提供する。１つの態様では、哺乳動物が、眼科障害；悪性及び転移性の状態；炎症性疾患；骨粗鬆症と加速された骨吸収により仲介される他の状態；再狭窄；不適切な血小板の活性化、動員（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）、又は凝集；血栓症；及び組織修復若しくは創傷治癒を必要とする状態からなる群から選択される状態に罹患している。
【００１９】
本発明のポリペプチドと本発明の方法には、多量体（例、二量体又は三量体）の形態であるポリペプチドが含まれる。この多量体は、Ｆｃポリペプチド、ロイシンジッパー、又はペプチドリンカーを含み得る。
【００２０】
さらに本発明は、本明細書に示される１つ以上のポリペプチドのセットを表すデータセット；コンピュータ；及び、コンピュータ上の実行可能フォーマットにおいてポリペプチドを分析するためのコンピュータアルゴリズム、を含んでなる、本発明のポリペプチド若しくはポリヌクレオチドを分析するためのシステムを提供する。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、メタロプロテイナーゼ及び／又はディスインテグリン活性を有するか又は有すると推定されるポリペプチドを提供する。これらメタロプロテイナーゼ様／ディスインテグリン様（ＭＰＤ）ポリペプチドは、インテグリン関連性、及びメタロプロテイナーゼ関連性の疾患の治療及び診断における使用、並びに、診断薬及び関連治療薬の開発における使用を見出す。
【００２２】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、細胞外マトリックスの主要成分をすべて分解し、組織再構築と発生及び炎症に関連した修復において主要な役割を担う、構造的に類似した亜鉛依存性酵素のファミリーを構成する（Ｍａｔｒｅｓｉａｎ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ６： １２１−１２５， １９９０； 及び Ｗｏｅｓｓｎｅｒ， ＦＡＳＥＢ Ｊ． ５： ２１４５−２１５４， １９９１）。ＭＭＰには、コラゲナーゼ、ゲラチナーゼＡ及びＢ、ストロメライシン、マトリライシン、メタロエラスターゼ、及び膜型マトリックスメタロプロテイナーゼが含まれる。ＭＭＰの過剰発現及び活性化は、関節炎、癌、及び多発性硬化症のような広範囲の疾患に関連づけられている。ＭＭＰは、典型的には、後期腫瘍細胞の侵襲及び転移に関連した基底膜の破壊に関わると示唆されてきたが、１つのＭＭＰメンバーであるマトリライシンは、初期のヒト結直腸腫瘍において発現されることが示された（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４： １４０２−１４０７， １９９７）。ＭＭＰの異常発現は、腫瘍侵襲性（Ｍｉｇｎａｔｔｉ ａｎｄ Ｒｉｆｋｉｎ， Ｃｅｌｌ ４７： ４８７−４９８， １９８６； 及び Ｋｈｏｋｈａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３： ９４７−９５０， １９８９）、関節炎（Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８４： ６７８−６８５， １９８９； 及び ＭｃＣａｃｈｒｅｎ， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ３４： １０８５−１０９３， １９９１）、及びアテローム性硬化症（Ｈｅｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８： ８１５４−８１５８， １９９１）を含む破壊プロセスの一因となり得る。本明細書で同定されるメタロプロテイナーゼは、例えば、炎症性疾患及び障害の病理発生の一因となる候補タンパク質である。従って、本明細書に提供されるメタロプロテイナーゼポリペプチドは、炎症性障害を治療するために、そして、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ 及び ｉｎ ｖｉｔｒｏ の両方での阻害剤の開発の供給源として使用され得る。本明細書に提供されるメタロプロテイナーゼへの阻害剤は、例えば炎症を含む、過剰なプロテイナーゼ活性に関連した疾患及び障害を改善し得る。
【００２３】
ＡＤＡＭファミリータンパク質のディスインテグリンドメインは、血小板凝集、接着、腫瘍細胞若しくは好中球の遊走、及び血管新生のような、インテグリン仲介性の細胞−細胞、及び細胞−マトリックス相互作用の防止に機能する。コントルトロスタチン（ｃｏｎｔｏｒｔｒｏｓｔａｔｉｎ）のような、以前に記載された（Ｔｒｉｋｈａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５４： ４９９３−４９９８， １９９４）ディスインテグリンは、ヒト転移性メラノーマ（Ｍ２４細胞）の、Ｉ型コラーゲン、ビトロネクチン、及びフィブロネクチンへの細胞接着を阻害するために使用されたことがあるが、ラミニンへはない。さらに、コントルトロスタチンは、マウス転移モデルにおけるＭ２４細胞の肺コロニー形成を阻害する。
【００２４】
ほとんどのメタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンポリペプチドの構造には、シグナルドメイン、メタロプロテイナーゼドメイン、ディスインテグリンドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインが含まれる。例えば、ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドの様々なメンバーに共通の典型的な構造要素には、ＮからＣの順に、シグナル配列、プロドメイン、メタロプロテイナーゼドメイン、ディスインテグリンドメイン、システイン−リッチドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインが含まれる。メタロプロテイナーゼドメイン／モチーフの内部にはある重要な残基（例、ＨＥｘＧＨｘｘＧｘｘＨＤモチーフ（配列番号２８））が存在するので、そのようなきわめて保存された残基の置換は、このポリペプチドの機能の変化若しくは欠乏に結びつく可能性がある。配列番号２８の保存されたメタロプロテイナーゼ活性部位配列を有するＡＤＡＭには、ＡＤＡＭ１、８〜１０、１２〜１３、１５〜１７、１９〜２１、２４〜２６、２８、及び３０が含まれる。また、メタロプロテイナーゼ触媒ドメインは、ジスルフィド結合による機能性ポリペプチド構造の形成に必要とされ得る４つの保存されたシステインを含有する。ディスインテグリン及びシステインリッチの領域には、３１の高度に保存されたシステインが存在するが、ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドのほとんどすべてにこれら３１のシステインがある。当業者が理解されるように、ポリペプチド内部にあるこれらの領域の境界は近似していて、そのようなドメインの正確な境界（その目的のために利用可能なコンピュータ・プログラムを使用することによって予測することが可能である）は、ＡＤＡＭポリペプチドファミリー内部のメンバーごとに異なる可能性がある。
【００２５】
ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドは、適度なほどによく保存され、ヒトのファミリーメンバーはお互いに類似していて、マウス、ラット、さらにはキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）や線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）のような他の種由来のＡＤＡＭファミリーメンバーに類似している（例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ， ２０ （６）： ２７８， １９９９ ；さらなる情報については、以下のインターネット・ウェブサイト（ｗｗｗ）を参照のこと：ｇｅｎｅ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｕｓｅｒｓ／ｈｅｓｔｅｒ／ｍｅｔａｌｏ．ｈｔｍｌ； ｕｔａ．ｆｉ／−ｌｏｉｉｋａ／ＡＤＡＭｓ／ＨＡＤＡＭｓ．ｈｔｍｌ；及び ｐｅｏｐｌｅ．Ｖｉｒｇｉｎｉａ．ＥＤＵ／−ｊａｇ６ｎ／Ｔａｂｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ＡＤＡＭｓ．ｈｔｍｌ．）。しかしながら、ＡＤＡＭポリペプチドファミリーのサブファミリーは、配列類似性と関連する生物学的活性を基に定義可能である。１つのそのようなサブファミリーは、ＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥのポリペプチドを含み、これは、これまでに同定されたＡＤＡＭポリペプチドファミリー内の他のメンバーと比較すると、お互いに対してより高い配列類似性を示す。ＡＤＡＭ１０及び１７は、ディスインテグリン−システインリッチ領域において、他のＡＤＡＭ間のこの領域には３１の保存されたシステインがあるのと対照的に、２１のシステインを有する。従って、ＡＤＡＭは、２０〜３１の保存システイン（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又は３１の保存システイン）を有する可能性がある。ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥとＡＤＡＭ−１０はまた、「シェダーゼ（ｓｈｅｄｄａｓｅｓ）」であり、それらは他の膜タンパク質の細胞外ドメインを切断して放出すると考えられている。もう１つのサブファミリーの主要機能はインテグリン又は他のタンパク質へ結合することであるかもしれない。例えば、ＡＤＡＭ−２は、プロセシングを受けてプロドメインとメタロプロテイナーゼ触媒ドメインの両方を除去し、ディスインテグリンドメインを曝露することで、そのコグネイトへそれが結合することが可能になる。定義され得るもう１つのサブファミリーは、精巣特異的であると思われるＡＤＡＭである；これらのタンパク質には、ＡＤＡＭ２〜３、１６、１８、２０〜２１、２４〜２６、及び２９〜３０が含まれ、ＡＤＡＭ５及び６は、特に精巣特異的である。
【００２６】
ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドは、例えば、泌尿生殖組織（例、腎臓組織と生殖組織）、神経組織、及び筋肉組織を含む多くの細胞型で発現されている。ＡＤＡＭポリペプチドへの結合パートナーには、少なくとも一部はインテグリンとの相互作用を介して内皮細胞へ結合し、そしてＴ細胞へ結合するいくつかのＡＤＡＭファミリーポリペプチドのディスインテグリン−システインリッチドメインにより示されるように、例えば、内皮細胞とＴ細胞により発現されるものがある。ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドのメンバーとその結合パートナーとの相互作用は、生殖組織、神経組織、及び筋肉細胞を含む細胞型と、結合パートナーを発現する内皮細胞及びＴ細胞との相互作用に仲介することに関わる可能性がある。
【００２７】
あるＡＤＡＭファミリーポリペプチドのディスインテグリンドメインは、細胞表面インテグリンのような結合パートナーと相互作用し得る（例えば、同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／０５７０１号を参照のこと、この開示内容はそのまま参照により本明細書に組込まれる）。１つ以上の結合パートナーへ結合することによって、ディスインテグリンドメインのポリペプチドは、ＡＤＡＭポリペプチドのその結合パートナーへの結合により仲介される生物学的活性（例、血管新生）を阻害し得る。あるＡＤＡＭファミリーポリペプチドはディスインテグリンドメインを介してインテグリン結合活性を示すので、ディスインテグリン活性の変調は、接着（例えば、精子の卵子への結合におけるＡＤＡＭ１及び２の役割と、糸球体及び尿細管（ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ　ａｎｄ　ｔｕｂｕｌａｒ）の上皮細胞の、腎組織の基底層との相互作用におけるＡＤＡＭ９の役割）を変調するであろう。ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドの個別メンバーとこれらポリペプチドの断片及び他の誘導体が上記の活性を示す程度は、ディスインテグリン−Ｆｃ構築物による内皮細胞遊走の阻害、等のような標準アッセイ法により決定され得る。ＡＤＡＭポリペプチドとその結合パートナーとの結合を検出するか又は測定するのに特に適したアッセイは、ＦＡＣＳ分析である。ＡＤＡＭファミリーポリペプチドの生物学的活性及びパートナー結合特性を評価するための追加のアッセイは以下に記載する。本発明ではメタロプロテイナーゼドメインを欠失する本発明のポリペプチドが考慮され、他のＡＤＡＭファミリーポリペプチドのメタロプロテイナーゼ活性に関して優性ネガティブとして作用する可能性がある（例えば、『ヒトディスインテグリンタンパク質（Ａ ＨＵＭＡＮ ＤＩＳＩＮＴＥＧＲＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ）』と題する、国際公開ＷＯ／　　　　　　、２００１年７月２７日出願、を参照のこと。この開示内容はそのまま参照により本明細書に組込まれる）。
【００２８】
ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドは、共通の特徴として、ディスインテグリン活性を介したインテグリン関連性相互作用、及び／又はメタロプロテイナーゼ活性を介したタンパク分解を共有する、炎症、癌、アレルギー、生殖、神経障害及び疾患、血管新生、及び血管系の疾患若しくは状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）に関与している。ＡＤＡＭポリペプチドの生物学的活性が関与していることが知られているか又はその可能性がある、炎症、癌、アレルギー、生殖、神経障害及び疾患、血管新生、及び血管系の状態の例は、慢性関節リウマチ、敗血症ショック、糸球体疾患、急性腎不全、アルツハイマー病、及び不適正な骨吸収である。ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドのメンバーとその基質、リガンド、受容体、結合パートナー、又は他の相互作用ポリペプチドとの相互作用を遮断するか又は阻害することは本発明の１つの側面であり、ＡＤＡＭポリペプチド活性の阻害剤若しくは変調因子の使用により上記の疾患及び状態を治療する、変調する、又は改善するための方法を提供する。１つの態様では、ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドのメンバーとそのコグネイト（ｃｏｇｎａｔｅ）との相互作用が、ＡＤＡＭファミリーポリペプチド又はそのコグネイトを含有するサンプルをＭＰＤポリペプチド若しくは抗ＭＰＤ抗体と接触させることによって影響を受ける。
【００２９】
非常に低いディスインテグリン活性が関与するある種の状態では、これらの状態を治療するか又は改善する方法は、例えば、ディスインテグリン活性を有するＭＰＤポリペプチドの量若しくは活性を、そのようなポリペプチド又はその活性断片若しくは融合ポリペプチドを提供することか、又は内因性若しくは外因性ＭＰＤポリペプチドを活性化する剤を提供することによって高めることを含む。ＭＰＤポリペプチドのさらなる使用には、炎症、癌、アレルギー、生殖、神経障害、及び血管系疾患の診断試薬；インテグリンポリペプチドと受精プロセス、インテグリンの精製及びプロセシング、及び／又は内皮細胞若しくはＴ細胞の研究についての研究用試薬；又は治療剤を細胞へデリバリーするための担体／標的指向ポリペプチドとしての使用が含まれる。
【００３０】
本明細書で使用されるように、「タンパク質」と「ポリペプチド」は、長さや翻訳後の修飾（例、グリコシル化、又はリン酸化）にかかわらず、アミノ酸の鎖を意味し、天然タンパク質、合成若しくは組換えのポリペプチド及びペプチド、並びに、例えば、ＭＰＤアミノ酸配列の全部若しくは一部を含む第一部分と、異なるヌクレオチド配列の全部若しくは一部によりコードされる第二部分とのハイブリッドからなる組換え分子が含まれる。典型的には、タンパク質又はポリペプチドは、通常それが天然に存在することに由来する他の成分から実質的に純粋である。「実質的に純粋」若しくは「精製された」という用語は、ポリペプチドへ言及される場合、それが天然では結合しているタンパク質及び天然に存在する有機分子から少なくとも３０％フリーであるポリペプチドを意味する。好ましくは、本発明の実質的に純粋なポリペプチドは、重量にして、少なくとも３５〜５０％；好ましくは６０〜７０％；より好ましくは少なくとも７５％〜９０％；そして最も好ましくは少なくとも９９％、他の天然に存在する分子から精製されている。本発明の実質的に純粋なポリペプチドは、例えば、天然源からの抽出によるか、このポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドの発現によるか、又はこのポリペプチドを化学合成することによって得ることができる。純度は、適正な方法、例えば、クロマトグラフィー、ＰＡＧＥ、又はＨＰＬＣ分析により測定され得る。
【００３１】
本明細書で使用されるように、「ＭＰＤポリペプチド」は、図１に示されるようなアミノ酸配列を含有するか又は含むポリペプチド；図１に示される配列へ実質的な相同性又は実質的な同一性を有するポリペプチド；上記配列の断片；及び上記の保守的変異体を意味する。本発明は、配列番号１〜２７に示されるような配列を含んでなるＭＰＤポリペプチドを提供する。
【００３２】
ディスインテグリン活性に関連した配列を含んでなるＭＰＤポリペプチドには、配列番号６；ほぼ残基４３ないし１４８の配列番号６；ほぼ残基１ないし３６６の配列番号８；ほぼ残基３８ないし３６６の配列番号８；配列番号１１；配列番号１３；ほぼ残基１ないし６２２の配列番号１４；ほぼ残基８４ないし６２２の配列番号１４；ほぼ残基２９９ないし６２２の配列番号１４；配列番号１６；ほぼ残基１ないし７０１の配列番号２１；配列番号２３；配列番号２４；ほぼ残基２７８ないし４３５の配列番号２４；ほぼ残基１ないし６２７の配列番号２５；配列番号２６；及びほぼ残基２２４ないし３８３の配列番号２６が含まれ、本明細書では「ＭＰＤディスインテグリンポリペプチド」（ＭＰＤｄｉｓ）と呼ぶ。本明細書で使用されるように、「ほぼ〜ないし」や「ほぼ〜の」という用語は、そのような参照された配列の残基の間にある配列を包含すると理解される。例えば、「ほぼ４３ないし１４８の」は、４４〜１４８、４５〜１４８、４６〜１４８、等；及び、４３〜１４７、４３〜１４６、等を意味する。
【００３３】
メタロプロテイナーゼ活性に関連した配列を含んでなるＭＰＤポリペプチドには、ほぼ残基１ないし６２２の配列番号１４；ほぼ残基８４ないし６２２の配列番号１４；配列番号１８；ほぼ残基１ないし７０１の配列番号２１；配列番号２２；配列番号２４；ほぼ残基１ないし２７７の配列番号２４；ほぼ残基１ないし３３２の配列番号２５；ほぼ残基１ないし６２７の配列番号２５；ほぼ残基１ないし２１５の配列番号２６；ほぼ残基１１８ないし２１５の配列番号２６；及び配列番号２６が含まれ、本明細書では、「ＭＰＤメタロプロテイナーゼポリペプチド」と呼ぶ。
【００３４】
ＭＰＤポリペプチドは、ＡＤＡＭファミリーのメンバーと関連メタロプロテイナーゼ／ディスインテグリンポリペプチドに対して高度の相同性を有することが示されているので、ＡＤＡＭポリペプチド、ディスインテグリンポリペプチド、又はメタロプロテイナーゼポリペプチドの予測される機能若しくは活性を有する。従って、本発明は、配列番号１〜２６、及び２７からなる群から選択される配列を含んでなるＭＰＤポリペプチドを提供する。１つの態様では、ＭＰＤポリペプチドが、ディスインテグリン活性、メタロプロテイナーゼ活性、又はその組合せを有する。本発明のポリペプチドが所望のディスインテグリン活性若しくはメタロプロテイナーゼ活性を有するかどうかを決定する方法は、本明細書の以下に記載の方法によりこのポリペプチドをアッセイすることによって達成され得る。
【００３５】
ＡＤＡＭとマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）では、例えば、ＨＥｘＧＨｘｘＧｘｘＨＤモチーフ（配列番号２８）を含む、多数の保存配列が同定されている。さらに、潜在的な保存モチーフには、ＬＮＩｘ（Ｉ／Ｖ）（Ａ／Ｖ）ＬＶＧＬＥ（Ｖ／Ｉ）ＷＴモチーフ（配列番号２９）が含まれる。例えば、配列番号４〜５、１０、１４、２１〜２２、及び２５〜２６は、それぞれ、残基２０８ないし２１９、１５ないし２６、２２９ないし２４０、５５５ないし５６６、３ないし１４、２６９ないし２８０、及び１５４ないし１６５に、配列ＨＥｘＧＨｘｘＧｘｘＨＤ（配列番号２８）を含む。配列番号２４は、保存されたＨＥｘＧＨｘｘＧｘｘＨＤモチーフへの実質的な同一性を有する配列を含む。従って、配列番号４、５、１０、１４、２１、２２、２４、２５、又は２６を含んでなるポリペプチドは、メタロプロテイナーゼ活性を有すると予測される。配列番号４、８、１０、１４、１８〜１９、２１、及び２５は、ＬＮＩｘ（Ｉ／Ｖ）（Ａ／Ｖ）ＬＶＧＬＥ（Ｖ／Ｉ）ＷＴモチーフとの同一性を有する配列を含むので、配列番号４、８、１０、１４、１８〜１９、２１、又は２５を含んでなるポリペプチドはメタロプロテイナーゼ活性を有すると予測される。本発明はまた、ＴＭＤＣ　ＩＩＩ、ＴＭＤＣ　ＩＶＡ、及びＴＭＤＣ　ＩＶＣを含む、精巣メタロプロテイナーゼ様、ディスインテグリン様、システインリッチ（ＴＭＤＣ）タンパクファミリーへ高度の相同性を有する配列番号２、３、７、９、１７、２０、及び２７を提供する。表１は、本発明の代表的なポリペプチドの、ＴＭＤＣタンパクファミリーメンバーとの相対同一性を示す。従って、本明細書では、メタロプロテイナーゼ活性、及び／又はディスインテグリン活性を有する、配列番号２、３、７、９、１７、２０、又は２７に示されるような配列を含んでなるポリペプチド、及びその断片が提供される。
【００３６】
【表１】
Figure 2004507234
【００３７】
ＴＭＤＣファミリーメンバーへの相同性を有する上記の配列に加えて、本発明はまた、ＡＤＡＭ（ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ）ファミリーのタンパク質への相同性を有するポリペプチドを提供する。そのようなポリペプチドには、メタロプロテイナーゼドメインが含まれる。好ましくは、配列番号４、１０、１４、２１、２５、及び２６を含んでなるポリペプチドのメタロプロテイナーゼドメインは、ほぼ配列番号４の６５ないし２７４；配列番号１０の２４ないし２３５；配列番号１４の８５ないし２９０；配列番号２１の２０２ないし４１１；配列番号２５の１２３ないし３３２；及び配列番号２６の１１８ないし２１５のアミノ酸残基からの配列を含む。当業者は、それぞれのメタロプロテイナーゼドメインのＮ末端及びＣ末端残基が近似であり、このドメインの一端からの約１〜１０のアミノ酸の変動は本発明の範囲から逸脱しないと理解するであろう。例えば、このドメインの一端へアミノ酸を加えても、この分子の活性は変化しない可能性がある。そのような修飾の効果は、本明細書に記載の方法を使用してアッセイされ得る。配列番号２〜５、７〜１０、１４、１７〜１９、２１〜２２、及び２４〜２７に示されるような配列を含んでなるポリペプチドも、メタロプロテイナーゼ活性に加えてディスインテグリン活性を有する可能性がある。
【００３８】
ディスインテグリンドメインは、典型的には、配列ＣＧＮ（Ｇ／Ｋ）ｘ（Ｌ／Ｖ）（Ｅ／Ｄ）ｘ（Ｇ／Ｎ）ＥＥＣＤＣＧ（配列番号３０）（以後、「ＣＧＮ−ＧＥＥＣ」モチーフ）を有する保存モチーフを含有するとして特徴づけられる。本発明は、ＣＧＮ（Ｇ／Ｋ）ｘ（Ｌ／Ｖ）（Ｅ／Ｄ）ｘ（Ｇ／Ｎ）ＥＥＣＤＣＧ（配列番号３０）への実質的な同一性のあるモチーフを有するとして特徴づけられるディスインテグリン活性を有するポリペプチドを提供する。例えば、配列番号４、１０、１４、２１、及び２４〜２６はＣＧＮ−ＧＥＥＣモチーフを含有するので、配列番号４、１０、１４、２１、２４、２５又は２６を含んでなるポリペプチドは、ディスインテグリン活性を有すると予測される。配列番号１１は残基４３ないし５７に推定ＣＧＮ−ＧＥＥＣ配列を有するので、配列番号１１を含んでなるポリペプチドはディスインテグリン活性を有すると予測される。さらに、ＡＤＡＭファミリーのタンパク質は、そのディスインテグリン及びシステイン−リッチドメインに数多くの保存システイン残基を有することで特徴づけられる。例えば、配列番号６、８、１２、１３、１６、及び２３は、数多くのＡＤＡＭファミリーメンバー（例、ＡＤＡＭ９（受託番号：ＮＰ　００３８０７、これは参照により本明細書に組込まれる））と並列させると、そのようなＡＤＡＭファミリーメンバーのディスインテグリンドメインにある保存システイン残基が同じ位置に並ぶ。従って、本発明はまた、ディスインテグリン活性を有する、配列番号６、８、１２、１３、１６、及び２３に示されるような配列を含んでなるポリペプチドを提供する。
【００３９】
表２は、本発明のいくつかのポリペプチドのドメインを特徴づける相対的なドメイン及び残基の要約を提供する。そのような活性に対応する相対的なドメイン及び残基は、類似分子及びコンピュータアルゴリズムに基づいた推定物であり、従って、例えば、材料の供給源、使用される細胞型、使用される発現系、等を含む多数の要因に依存して、わずかに変化する可能性がある。そのような要因は当業者に明らかであり、正しく評価される。
【００４０】
【表２】
Figure 2004507234
【００４１】
さらに本発明は、配列番号１５を含んでなるメタロプロテイナーゼ及び／又はディスインテグリン活性を有するポリペプチドを提供する。例えば、配列番号１５は、ＡＤＡＭ９に対して、ＡＤＡＭ９のメタロプロテイナーゼドメインの直後とディスインテグリンドメインの前で相同性を有する。
【００４２】
本発明のポリペプチドにはまた、図１に示される配列に対して十分であるか又は実質的な程度の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列が含まれる。実質的に同一な配列は、当業者により、ＭＰＤポリペプチドと共通の構造ドメインを有する、及び／又は生物学的活性を有すると同定され得る。類似性若しくは同一性を決定する方法は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、等のようなコンピュータアルゴリズムを利用し得る。
【００４３】
２つの核酸若しくはポリペプチドの関連において「実質的に同一」という語句は、比較ウィンドウ全体で最大の対応があるように並列され、例えば、配列比較アルゴリズムによるか、又はマニュアル並列や目視検査により測定される場合に、少なくとも５０％、６０％、好ましくは８０％、又は８５％、より好ましくは９０〜９５％、そして最も好ましくは９６％、９７％、９８％、又は９９％のヌクレオチド若しくはアミノ酸残基の同一性を有する配列を意味する。この定義はまた、試験配列が参照配列への実質的な同一性を有する場合に実質的な配列若しくはサブ配列相補性を有する、試験配列の相補体にも言及される。本明細書で使用される「比較ウィンドウ」には、２０〜１８００、通常は約５０〜２００、より通常は約７０〜１５０からなる群から選択される、任意数の連続位置の断片への言及が含まれ、ここでは、２つの配列を最適に並列した後で、ある配列が同一数の連続した位置の参照配列へ比較され得る。
【００４４】
配列比較のためには、典型的にはある配列が参照配列として機能し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照の配列をコンピュータへ入力し、必要ならばサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを使用し得るか、又は他のパラメーターを指定し得る。次いで、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列パーセント同一性が計算される。
【００４５】
比較に最適な配列の並列は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２： ４８２ （１９８１） の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３ （１９７０） の相同並列アルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ２４４４ （１９８８） の類似性検索法により、これらアルゴリズム（ウィスコンシン遺伝学ソフトウェア・パッケージ、遺伝学コンピュータ・グループ、５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒ．，マジソン、Ｗｉｓ．にある、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴ）のコンピュータによる実施によるか、又はマニュアル並列及び目視検査により実施し得る。
【００４６】
有用なアルゴリズムの１例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、進行性な対形成の並列を使用して関連した配列の群から多数の配列並列を創出し、関連性と配列パーセンント同一性を示す。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３５： ３５１ （１９８７） の進行的な並列法を簡略化したものを使用し、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ， ＣＡＢＩＯＳ ５： １５１ （１９８９） に記載の方法に類似している。この多並列法は、２つの最も類似した配列の対形成並列から始め、２つの並列された配列のクラスターを作製する。次いで、このクラスターを、次に最も関連している配列か又は並列配列のクラスターへ並列させる。２つの配列のクラスターを、２つの個別配列の対形成並列の単純な延長により並列する。一連の進行的、対形成並列により最終の並列が達成される。例えば、参照配列を他の試験配列と比較して、以下の変数：デフォルトギャップ加重（３．００）、デフォルトギャップ長加重（０．１０）、及び重み付けエンドギャップを使用して、配列パーセント同一性の関連比率を決定し得る。
【００４７】
配列同一性及び配列類似性の比率を決定するのに適しているもう１つのアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３ （１９９０） に記載されるようなＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ； ｗｗｗ−ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列にある同一の長さのワードと並列させたときに、ポジティブ値の閾値スコアであるＴに適合するか又はそれを満足させる、長さＷの短いワードを照会（ｑｕｅｒｙ）配列中に同定することによって、ハイスコア配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる。この最初の近隣ワードのヒットは、それを含有するより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシーズとして機能する。ワードのヒットは、それぞれの配列に沿って、累積並列スコアが増加され得るまで、両方向に拡張される。それぞれの方向でのワードヒットの拡張が中止されるのは：累積並列スコアが量Ｘによりその最大達成値から低下する；１つ以上のネガティブスコアの残基並列の蓄積により、累積スコアが０以下になる；又は、いずれかの配列の末端に達する場合である。ＢＬＡＳＴプログラムでは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング・マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １０９１５， １９８９ を参照のこと）並列（Ｂ）の５０、期待値（Ｅ）の１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較が使用される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの測定値は、最小確率量（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド若しくはアミノ酸配列間の適合が偶然に生じる確率値を提供する。例えば、あるテスト核酸の参照核酸との比較における最小確率量が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満であれば、この核酸は参照核酸に類似しているとみなされる。
【００４８】
あるいは、２つのアミノ酸又は２つの核酸配列のパーセント同一性は、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ． （Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２： ３８７， １９８４） により記載され、ウィスコンシン大学、遺伝学コンピュータ・グループから入手可能な、ＧＡＰコンピュータ・プログラム、バージョン６．０を使用して配列情報を比較することによって決定され得る。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルト変数には：（１）ヌクレオチドの（同一物について１、非同一物について０の値を含む）単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスと、Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ 編『ポリペプチドの配列及び構造のアトラス（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）』国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８ 頁、１９７９ により記載されるような、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｓｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ６７４５， １９８６ の重み付け比較マトリックス；（２）各ギャップについて３．０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の０．１０ペナルティ；及び（３）エンドギャップへのノーペナルティが含まれる。
【００４９】
当業者は、コードされる配列中の単一アミノ酸、又は少ないパーセントのアミノ酸を変化させる、付加する、又は欠失させる、核酸配列、ペプチド、又はポリペプチド配列への個々の置換、欠失、又は追加が、この変化が実質的に同一な生物学的活性（例えば、ディスインテグリン及び／又はメタロプロテイナーゼ活性）を有する分子をもたらす、「保守的に修飾された変異体」であることを理解されよう。例えば、あるアミノ酸の、化学的に類似したアミノ酸での置換をもたらす変化は、保守的に修飾された変異体である。機能的に類似したアミノ酸を提供する保守的な置換の表は、当技術分野で知られている。以下の６つの群は、お互いに保守的な置換であるアミノ酸をそれぞれ含有する：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， 『タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）』（１９８４）を参照のこと）。
【００５０】
２つのポリヌクレオチド若しくはポリペプチドが実質的に同一であることの１つの明示は、第一のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが、第二のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに対して産生される抗体と免疫学的に交差反応するということである。２つのポリヌクレオチドが実質的に同一であることのもう１つの明示は、２つの分子又はその相補体がストリンジェント条件の下で互いにハイブリダイズすることである。
【００５１】
任意のタイプの変化（例、アミノ酸の挿入、欠失、又は置換；ポリペプチドのグリコシル化状態の変化；その三次元構造若しくは自己会合状態を変化させるリフォールディング又は異性化；及び、他のポリペプチド若しくは分子とのその会合への変化）により本発明のＭＰＤポリペプチドから誘導されるポリペプチドも本発明により含まれる。従って、本発明により提供されるポリペプチドには、図１に示されるものに類似したアミノ酸配列により特徴付けられるが、種々の修飾が天然で提供されているか又は意図的に工学処理されているポリペプチドが含まれる。ディスインテグリン活性及び／又はメタロプロテイナーゼ活性を有する、配列番号１〜２６、又は２７に示されるような配列を含んでなるポリペプチドと生物学的活性を共有するポリペプチドが本発明に含まれる。
【００５２】
本発明には、インテグリン結合活性、内皮細胞遊走の阻害、及び血管新生の阻害からなる群から選択される少なくとも１つの活性を保持する、様々な形態のＭＰＤディスインテグリンポリペプチド若しくはドメインの使用が含まれる。ＭＰＤディスインテグリンポリペプチド／ドメイン（ＭＰＤｄｉｓ）とは、ディスインテグリン活性を有する本発明のＭＰＤポリペプチドの全部若しくは一部を含んでなるポリペプチドを包含するものである。好ましい態様では、ＭＰＤｄｉｓは、（システイン−リッチ領域のような）他のドメインを有するか又は有さない、ＭＰＤディスインテグリンドメインの全部若しくは一部、並びに、限定されないが、（ａ）断片、（ｂ）変異体、（ｃ）誘導体、（ｄ）融合ポリペプチド、及び（ｅ）多量体の形態（マルチマー）を含む、関連した形態を含有する。インテグリン結合、内皮細胞遊走、及び／又は血管新生の阻害を阻害する、これら関連した形態の能力は、以下に例示されるような方法を使用するか又は当技術分野で知られている他のアッセイを使用することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 若しくは ｉｎ ｖｉｖｏ で決定され得る。
【００５３】
当業者は、本明細書に記載の方法を使用して活性を容易にアッセイし得る。そのような方法は、例えば、ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドのメンバーにより示される、限定されないが細胞接着を含む、メタロプロテイナーゼ活性、ディスインテグリン活性、又は生物学的活性を測定する。例えば、ＭＰＤ活性（例、メタロプロテイナーゼ活性及び／又はディスインテグリン活性）を中和する抗ＭＰＤ抗体は、注目するポリペプチドに抗ＭＰＤ抗体を接触させ、この注目するポリペプチドに関連した活性が中和されるかどうかを決定することによって、類似ポリペプチドをアッセイするために使用され得る。さらに、本発明のＭＰＤポリペプチドへ特異的に結合する抗体が、別の注目するポリペプチドと交差反応することは、この注目するポリペプチドが本発明のＭＰＤポリペプチドと構造上の特徴（例、一次、二次、又は三次のタンパク特徴）を共有することを示す。
【００５４】
本発明は、完全長で成熟した形態のＭＰＤポリペプチドを提供する。完全長ポリペプチドとは、最初に翻訳されるポリペプチドの完全な一次アミノ酸配列を有するものである。完全長ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、ｃＤＮＡ分子の完全オープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）の翻訳により得ることができる。多数のｍＲＮＡ形態が、選択的スプライシングか又は多数の翻訳開始部位の使用によりその座から産生される場合に、いくつかの完全長ポリペプチドが単一の遺伝子座によりコードていてもよい。ポリペプチドの「成熟形態」は、あるとすれば、例えば、シグナル配列の切断、又はプロドメインを除去するタンパク分解的な切断のような、翻訳後のプロセシング工程を受けたポリペプチドを意味する。特定の完全長ポリペプチドの多数の成熟形態が、例えば、シグナル配列の不正確な切断か、又はそのポリペプチドを切断するプロテアーゼの差次的調節により産生され得る。そのようなポリペプチドの成熟形態は、好適な哺乳動物細胞か又は他の宿主細胞における、完全長ポリペプチドをコードするポリペプチドの発現により入手され得る。成熟形態のポリペプチドの配列はまた、シグナル配列又はプロテアーゼ切断部位の同定を介した完全長形態のアミノ酸配列から決定可能であり得る。本発明のＭＰＤポリペプチドにはまた、先端切れであるが生物学的に活性なポリペプチド、例えば、天然に存在する可溶型のポリペプチドを産生し得る、選択的ｍＲＮＡプロセシングのような、転写後か又は翻訳後のプロセシング事象から生じるポリペプチドも含まれる。本発明にまた含まれるのは、ポリペプチドに由来する１つ以上の末端アミノ酸（一般に、１〜５の末端アミノ酸）のタンパク分解的な除去による、異なるタイプの宿主細胞における発現時のＮ若しくはＣ末端の違いといった、タンパク分解に起因する変異である。
【００５５】
本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドを発現させるのに適した培養条件の下で、形質転換されたか又は組換えの宿主細胞を培養することによって製造され得る。次いで、生じた発現されたポリペプチドは、ゲル濾過やイオン交換クロマトグラフィーのような、既知の精製法を使用して、そのような培養物から精製され得る。ポリペプチドの精製にはまた、ポリペプチドへ結合する剤を含有するアフィニティーカラム、つまり、コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）、又はＣｉｂａｃｒｏｍブルー３ＧＡセファロース（登録商標）のようなアフィニティー樹脂上での１回以上のカラム工程；フェニルエーテル、ブチルエーテル、又はプロピルエーテルのような樹脂を使用する、疎水相互作用クロマトグラフィーを含む１回以上の工程；又はイムノアフィニティークロマトグラフィーも含まれ得る。他のやり方では、本発明のポリペプチドはまた、精製を促進する形態で発現され得る。例えば、それは、例えばマルトース結合ポリペプチド（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、又はチオレドキシン（ＴＲＸ）へ結合した融合ポリペプチドとして発現され得る。そのような融合ポリペプチドの発現及び精製のキットは、それぞれ、ニューイングランド・バイオラボ（ベヴァリー、ＭＡ）、ファルマシア（ピスカタウェイ、ＮＪ）、及びインビトロゲン（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）から市販されている。ポリペプチドはまたエピトープのタグを付けた後で、そのようなエピトープへ向けられた特異抗体を使用して精製され得る。１つのそのようなエピトープ（「Ｆｌａｇ」）は、コダック（ニューヘーヴン、Ｃｏｎｎ．）から市販されている。最後に、疎水性のＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えば、ペンダントメチル又は他の脂肪族基を有するシリカゲルを利用する１回以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程が、ポリペプチドをさらに精製するために利用され得る。上記精製工程のいくつか又は全部はまた、様々に組合せて利用され、実質的に均質な組換えポリペプチドを提供し得る。このようにして精製されたポリペプチドは他の哺乳動物のポリペプチドから実質的にフリーであり、本発明により、「実質的に精製されたポリペプチド」と定義されるが、そのような精製されたポリペプチドには、ＭＰＤポリペプチド、断片、変異体、等へ特異的に結合する抗体が含まれる。本発明のポリペプチドはまた、トランスジェニック動物の産物として、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する体細胞若しくは生殖細胞により特徴づけられる、トランスジェニックのウシ、ヤギ、ブタ、又はヒツジのミルクの成分として発現される場合がある。
【００５６】
発現されるポリペプチドをアフィニティー精製するには、本発明のポリペプチドに対して産生されるモノクローナル抗体のようなアフィニティーカラムを利用することも可能である。これらのポリペプチドは、アフィニティーカラムから、慣用技術、例えば高塩の溶出緩衝液中からより低塩の緩衝液を使用して透析するか、又は利用するアフィニティーマトリックスに依存して、ｐＨ又は他の要因を変えることによって除去され得るか、又は、本発明から誘導されるポリペプチドのような、アフィニティー部分の天然に存在する基質を使用して競合的に除去され得る。本発明のこの側面では、本発明のポリペプチドへ結合するタンパク質（例、本発明の抗ＭＰＤ抗体）が、本発明のポリペプチドをその表面上で発現させる細胞を同定し、分離し、又は精製するのに適した固形支持体又は類似の基質へ結合され得る。例えば、本発明の抗ＭＰＤ抗体の固形支持体表面への付着は、任意の方法により達成され得て、例えば、磁気マイクロスフェアをこれらのポリペプチド結合タンパク質でコートして、磁場によりインキュベーション容器中に固定し得る。そのようなポリペプチド結合タンパク質をその上に有する固相に細胞混合物の懸濁液を接触させる。抗ＭＰＤ抗体は、本発明のポリペプチド（例、ＭＰＤの細胞外ドメイン）をその表面上に有する細胞に結合する。非結合細胞（例、ＭＰＤポリペプチドを欠く細胞）は、結合した細胞から洗浄除去される。このアフィニティー結合法は、そのようなポリペプチド発現細胞を溶液から精製する、スクリーニングする、又は分離するのに有用である。ポジティブに選択された細胞を固相から遊離する方法は当技術分野で知られていて、例えば、酵素の使用が含まれる。そのような酵素は、好ましくは、細胞に対して無毒で非損傷性であり、好ましくは、細胞表面結合パートナーを切断するために向けられる。他のやり方では、本発明のポリペプチド発現細胞を含有することが疑われる細胞の混合物が、最初に、本発明のビオチニル化結合ポリペプチドとインキュベートされる。インキュベーション時間は、典型的には、本発明のポリペプチドへの十分な結合を確実にするために、少なくとも１時間である。次いで、生じた混合物をアビジン被覆ビーズ充填カラムに通し、それにより、アビジンへのビオチンの高アフィニティーにより、細胞のビーズへの結合が提供される。アビジン被覆ビーズの使用は当技術分野で知られている（Ｂｅｒｅｎｓｏｎ， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０Ｄ： ２３９， １９８６ を参照のこと）。未結合材料の洗浄と結合細胞の遊離は、従来法を使用して実施される。
【００５７】
本発明のポリペプチドはまた、既知の慣用的な化学合成により生成され得る。本発明のポリペプチドを合成法により構築する方法は、当業者に知られている。合成的に構築されたポリペプチド配列は、天然のポリペプチドと一次、二次又は三次構造、及び／又はコンホメーション特性を共有することによって、生物学的活性を含む生物学的特性をそれと共通して保有する可能性がある。このように、合成されたポリペプチドは、天然の精製されたポリペプチドの生物学的に活性であるか又は免疫学的な代替品として、治療化合物のスクリーニング、及び抗体開発の免疫学的方法に利用され得る。
【００５８】
所望される純度の程度は、ポリペプチドの意図される使用に依存する。例えば、ポリペプチドが ｉｎ ｖｉｖｏ で投与される場合には、比較的高い程度の純度が所望される。そのような場合、他のポリペプチドに相当するポリペプチドのバンドがＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析では検出され得ないように、ポリペプチドが精製される。関連分野の当業者には、差次的グリコシル化、差次的な翻訳後プロセシング、等により、このポリペプチドに対応する多数のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより視覚化され得ることが理解されよう。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析で単一のポリペプチドバンドにより示されるような、実質的な均質性にまで精製される。このポリペプチドバンドは、銀染色、クマッシーブルー染色、又は（ポリペプチドが放射標識されている場合は）オートラジオグラフィーにより視覚化され得る。
【００５９】
ＭＰＤポリペプチドとこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの種相同体（ｓｐｅｃｉｅｓ　ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）も本発明により提供される。本明細書で使用されるように、「種相同体」は、ある一定のポリペプチド若しくはポリヌクレオチドの種とは異なる起源の種であるが、そのポリペプチド若しくはポリヌクレオチドへの有意な配列類似性を有するポリペプチド若しくはポリヌクレオチドのことである。種相同体は、本明細書に提供されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド由来の好適なプローブ若しくはプライマーを作り、所望の種由来の好適な核酸源をスクリーニングすることによって単離され、同定され得る。他のやり方では、相同体は、本発明のＭＰＤの配列（例、核酸若しくはアミノ酸の配列）を利用して、１つ以上の種由来の配列を含有するゲノムデータベースをスクリーニングすることによって同定され得る。そのようなゲノムデータベースは、数多くの種について（例えば、ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ； ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ； ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／−ｂａｌｌ； ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎ１．ｇｏｖ； ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｇ．ｇｏｖ； ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ； 及び ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｏｔｈｅｒ／ｂｉｏｌｏｇｙ のワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）上で）容易に利用可能である。本発明にはまた、そのアミノ酸若しくはヌクレオチド配列における違いが遺伝的多型性に起因する、天然に存在するそのようなポリペプチド及びポリヌクレオチドの代替的な形態である、ＭＰＤポリペプチドのアリル変異体（ａｌｌｅｌｉｃ　ｖａｒｉａｎｔ）とそれをコードしている核酸が含まれる。
【００６０】
中間配列検索（Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｅａｒｃｈ）（ＩＳＳ）は、２つのタンパク質を１つ以上の中間配列により連結させることによって、ごく近縁な相同体だけでなく遠縁の相同体も同定するために使用され得る。ＩＳＳは、かつての照会の結果を新たな検索のシーズとして繰り返し使用する。飽和（ｓａｔｕｒａｔｅｄ）ＢＬＡＳＴは、ＩＳＳを実行するパッケージである。タンパク配列から開始して、飽和ＢＬＡＳＴは、ＢＬＡＳＴ検索を実行し、次世代の検索を代表する配列を同定する。この方法は、収束までか、又はある前定義された判定基準が満たされるまで実行される。飽和ＢＬＡＳＴは、ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂｕｒｎｈａｍ−ｉｎｓｔ．ｏｒｇ／ｘｂｌａｓｔ のワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）で利用可能である（Ｌｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６ （１２）： １１０５， ２０００ も参照のこと）。
【００６１】
本発明のＭＰＤポリペプチドの断片が本発明に含まれ、線状の形態であるか、又は既知の方法を使用して環状化され得る（例えば、Ｈ． Ｕ． Ｓａｒａｇｏｖｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０， ７７３ （１９９２）； 及び Ｒ． Ｓ． ＭｃＤｏｗｅｌｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１４： ９２４５ （１９９２） を参照のこと、これらはいずれも参照により本明細書に組込まれる）。本発明のＭＰＤポリペプチドのペプチド断片と、そのような断片をコードするポリヌクレオチドには、ＭＰＤポリペプチド若しくはポリヌクレオチドの長さの少なくとも２５％（より好ましくは、少なくとも５０％、６０％、又は７０％であり、最も好ましくは少なくとも８０％）である、アミノ酸若しくはヌクレオチド配列の長さが含まれる。好ましくは、そのような配列は、重複部分及び同一性を最大化する一方で、配列ギャップを最小化するように並列させるときに、ＭＰＤポリペプチド若しくはポリヌクレオチドと少なくとも６０％（より好ましくは少なくとも７０％〜７５％、８０％〜８５％、９０％〜９５％、少なくとも９７％〜９７．５％、又は少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有する。また本発明に含まれるのは、好ましくは少なくとも８〜１０、又はより好ましくは少なくとも２０、又はなおより好ましくは少なくとも３０、又は最も好ましくは少なくとも４０の連続したアミノ酸を含んでなるセグメントを含有するか又はコードする、ポリペプチド、ペプチド断片、及び、そのような断片をコードするポリヌクレオチドである。そのようなポリペプチド及び断片はまた、重複部分及び同一性を最大化する一方で、配列ギャップを最小化するように並列させるときに、例えばＡＤＡＭファミリーポリペプチドのいずれかのそのようなセグメントと少なくとも７０％（少なくとも７５％、８０％〜８５％、９０％〜９５％、少なくとも９７％〜９７．５％、又は少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）を共有するセグメントを含有し得る。目視検査、数的計算、又はコンピュータアルゴリズムによりパーセント同一性を計算し得る。
【００６２】
本発明はまた、ＭＰＤポリペプチドのある断片若しくはドメインを含んでなる、このペプチドの可溶形態を提供する。ディスインテグリン活性を有する可溶性断片は、特に注目される。例えば、（上記に論じられるような）高度に保存されたＣＧＮ−ＧＥＥＣ配列から始まるが、膜貫通領域（例えば、表２を参照のこと）を欠くアミノ酸である。膜貫通領域は、公的に利用可能なコンピュータアルゴリズムを使用して同定され得る。他の可溶形態には、残基１ないし４３のアミノ酸で始まり１４８までを含む配列番号６；残基１ないし３８のアミノ酸で始まり３６６までを含む配列番号８；配列番号１１；配列番号１３；残基１ないし８４のアミノ酸で始まり６２２までを含む配列番号１４；残基１ないし２９９のアミノ酸で始まり６２２までを含む配列番号１４；配列番号１６；ほぼ残基１ないし７０１の配列番号２１；配列番号２３；残基１ないし２７８のアミノ酸で始まり４３５までを含む配列番号２４；ほぼ残基１ないし６２７の配列番号２５；及び、残基１ないし２２４のアミノ酸で始まり３８３までを含む配列番号２６を含んでなるポリペプチドが含まれる。そのようなポリペプチドは、それが発現される細胞から分泌され得る。本発明のポリペプチドの細胞内及び膜貫通ドメインは、そのようなドメインを配列情報から決定するための既知技術に従って同定され得る。例えば、本発明のポリペプチド配列を、既知のドメインを有するＡＤＡＭファミリーポリペプチドの他のメンバーと並列することにより、本発明のポリペプチドのドメインに関する情報が提供される。当業者は、特定ドメインの配列の範囲内でのわずかな修飾がこの分子の生物学的活性に影響を及ぼすことなくなし得ることを理解されよう。従って、特定ドメインのどの方向でも、同定された配列における１、２、３、４、又は５〜１０のアミノ酸の変化は、本発明により含まれる。
【００６３】
本発明のもう１つの側面では、ポリペプチドは、メタロプロテイナーゼドメイン、ディスインテグリンドメイン、又は細胞質ドメインのような、ＡＤＡＭポリペプチドドメインの様々な組合せを含み得る。従って、本発明のポリペプチドとポリヌクレオチドには、メタロプロテイナーゼドメインのようなドメインの２つ以上のコピー、ディスインテグリンドメインのようなドメインの２つ以上のドメイン、又はそれぞれのドメインの少なくとも１つを含んでなるか又はコードするものが含まれ、これらのドメインは、そのようなポリペプチド内で任意の順序で提示され得る。また含まれるのは、組換えポリペプチドとそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、ここでこの組換えポリペプチドは、「キメラポリペプチド」若しくは「融合ポリペプチド」であって、第二のポリペプチドへ機能的に連結した、配列番号１〜２６又は２７に示されるようなＭＰＤ配列を含む。第二のポリペプチドは、ＭＰＤポリペプチドの機能とは無関係であるか又はそれに関連している活性若しくは機能を有する、注目される任意のポリペプチドであり得る。例えば、第二のポリペプチドは、例えば、ＡＤＡＭポリペプチドの細胞外、細胞質、メタロプロテイナーゼ、又は膜貫通ドメインのような、ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドに関連しているが異なるメンバーのドメインであり得る。「機能的に連結している」という用語は、ＭＰＤ配列と第二のポリペプチド配列が互いに正しいフレームで融合していることを示すものである。第二のポリペプチドは、図１に示されるようなＭＰＤ配列のＮ末端若しくはＣ末端へ融合され得る。例えば、１つの態様では、融合ポリペプチドは、ＭＰＤ配列がＧＳＴ配列のＣ末端へ融合している、ＧＳＴ−ＭＰＤ融合ポリペプチドである。そのような融合ポリペプチドは、組換えＭＰＤ配列の精製を促進し得る。もう１つの態様では、融合ポリペプチドは、そのＮ末端に異種シグナル配列を含んでなるＭＰＤ配列である。ある種の宿主細胞（例、哺乳動物宿主細胞）では、ＭＰＤポリペプチドの発現及び／又は分泌が異種シグナル配列の使用により増加され得る。もう１つの例として、ＭＰＤポリペプチド又はその断片は、細菌で発現されるタンパク質の精製を促進するヘキサヒスチジン・タグか、又は真核細胞で発現されるタンパク質の精製を促進する赤血球凝集素タグへ融合され得る。さらに、融合ポリペプチドは、例えば、米国特許第５，０１１，９１２号と Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： １２０４， １９８８ に記載される、ポリ−Ｈｉｓ又は抗原同定ペプチドを含み得る。１つのそのようなペプチドはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドでであり、これは、きわめて抗原性があり、特異モノクローナル抗体により不可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現される組換えポリペプチドの迅速なアッセイと容易な精製を可能にする。参照により本明細書に組込まれる、米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、４Ｅ１１と命名されたマウスハイブリドーマは、ある種の二価金属カチオンの存在下で、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドへ結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞系は、受託番号ＨＢ９２９５の下でＡＴＣＣに寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドへ結合するモノクローナル抗体は、イーストマンコダック社、イメージングシステム部門、ニューヘーヴン、コネティカットから入手可能である。
【００６４】
本発明に含まれるのは、ＭＰＤポリペプチドを含む、オリゴマー又は融合ポリペプチドである。融合パートナーとして使用され得るオリゴマーは、二量体、三量体又はより高次のオリゴマーを含む、共有結合しているか、又は非共有結合している多量体の形態であり得る。本発明の１つの側面では、オリゴマーはポリペプチド成分の結合活性若しくは触媒活性を維持し、それへ二価、三価、等の結合若しくは触媒の部位を提供する。別の態様では、本発明は、ポリペプチドへ融合したペプチド部分間の共有若しくは非共有性の相互作用を介して連結した多数のポリペプチドを含んでなるオリゴマーへ向けられる。そのようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）、又はオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであり得る。ロイシンジッパーと抗体から誘導されるある種のポリペプチドは、以下により詳しく記載されるように、それに付いたポリペプチドのオリゴマー化を促進し得るペプチドの１つである。
【００６５】
典型的には、リンカーは、ペプチドリンカー部分である。リンカー部分の長さは、ＭＰＤ配列を含んでなるポリペプチドの生物学的活性を最適化するように選択され、不適当な実験をせずに経験的に決定され得る。リンカー部分は、ＭＰＤポリペプチドが基質若しくはリガンドと自由に相互作用することを可能にするほど長くて柔軟であるべきである。好ましいリンカー部分は、約１〜３０のアミノ酸残基の長さ、好ましくは約２〜１５のアミノ酸残基のペプチドである。好ましいリンカー部分は、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、ＧＧＧＧＳ（配列番号３１）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３２）、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ（配列番号３３）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号３４）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号３５）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号３６）、又はＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ（配列番号３７）である。連結部分については、例えば、Ｈｕｓｔｏｎ， Ｊ． Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ８５： ５８７９ （１９８８）、Ｗｈｉｔｌｏｗ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６： ９８９ （１９９３）、及び Ｎｅｗｔｏｎ， Ｄ． Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５： ５４５ （１９９６） に記載されている。他の好適なペプチドリンカーは、参照により本明細書に組込まれる、米国特許第４，７５１，１８０号及び４，９３５，２３３号に記載されるものである。所望されるペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列は、好適な従来技術を使用して、ＭＰＤポリペプチド又はその断片をコードするＤＮＡ配列の中に、それと同じリーディングフレームで、挿入され得る。例えば、このリンカーをコードする化学合成されたオリゴヌクレオチドが配列中で連結され得る。特定の態様では、融合ポリペプチドは、ペプチドリンカーにより分離された、２〜４の可溶性ＭＰＤポリペプチドを含む。
【００６６】
ＭＰＤポリペプチドの変異体が膜貫通（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ）ドメインを包含するように構築される態様では、それらはＩ型膜ポリペプチドを形成する。そのような態様では、融合パートナーをＭＰＤポリペプチドのＣ末端へ連結させることが好ましい。他のやり方では、膜貫通ポリペプチドは、リガンドも知られている既知の細胞外受容体ドメインポリペプチドと融合され得る。次いで、そのような融合ポリペプチドは、結合したＭＰＤポリペプチドにより誘発される細胞内シグナル伝達経路を制御するように操作され得る。細胞膜全体に及ぶポリペプチドはまた、細胞表面受容体のアゴニスト若しくはアンタゴニスト、又は細胞接着分子と融合して、ＭＰＤの細胞内効果をさらに変調し得る。本発明のもう１つの側面では、好ましいＭＰＤポリペプチド断片と他の融合ポリペプチドドメインとの間にインターロイキンを位置づけることができる。
【００６７】
本発明のＭＰＤポリペプチドにはまた、適正なオルガネラ標的指向シグナル又は局在化宿主タンパク質への融合により、ポリペプチドを特定の細胞部位へ向ける局在化配列が含まれ得る。局在化配列、又はシグナル配列をコードするポリヌクレオチドは、ＭＰＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’末端で連結又は融合され得るので、生じる融合ポリヌクレオチド／ポリペプチドのアミノ末端にシグナルペプチドが位置づけられる。真核生物では、シグナルペプチドは、小胞体を通してポリペプチドを輸送するように機能する。次いで、この分泌タンパク質は、ゴルジ装置を通って分泌小胞へ、そして細胞外スペース、又は外部環境へ輸送される。シグナルペプチドには、タンパク分解酵素の認識部位を含有するプレ−プロ（ｐｒｅ−ｐｒｏ）ペプチドが含まれる。
【００６８】
局在化配列は、核−、小胞体−、ペルオキシソーム−、又はミトコンドリアの局在化配列、又は局在化タンパク質であり得る。局在化配列は、例えば、ストライヤー、Ｌ．『生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』Ｗ．Ｈ．フリーマン（１９９５）の３５章「タンパク質の標的指向（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」に記載される、標的指向配列であり得る。ある重要な局在化配列には、核（例、ＫＫＫＲＫ（配列番号３８））、ミトコンドリア（ＭＬＲＴＳＳＬＦＴＲＲＶＱＰＳＬＦＲＮＩＬＲＬＱＳＴ（配列番号３９））、小胞体（ＫＤＥＬ（配列番号４０））、ペルオキシソーム（ＳＫＦ）、形質膜（ＣＡＡＸ（配列番号４１））、ＣＣ、ＣＸＣ、又はＣＣＸＸ（配列番号４２）、形質膜の細胞質側（ＳＮＡＰ−２５への融合）、又はゴルジ装置（フリンへの融合）へ標的指向するものが含まれる。
【００６９】
もう１つの態様では、本発明のポリペプチド又はその断片は、ポリペプチド結合部位の結合価を増やすことを含む、多種多様な目的のために、免疫グロブリンのような担体分子へ融合され得る。１例として、このポリペプチドの断片は、リンカー配列を介して、免疫グロブリンのＦｃ部分へ融合され得る。ポリペプチドの二価形態では、そのような融合がＩｇＧ分子のＦｃ部分へなされ得る。他の免疫グロブリンのアイソタイプもそのような融合物を産生するために使用され得る。例えば、ポリペプチド−ＩｇＭ融合物ならば、本発明のポリペプチドの十価形態を産生するだろう。１つの態様では、本発明は、Ｆｃポリペプチドドメインと、ＭＰＤポリペプチド配列（残基１ないし４３のアミノ酸で始まり１４８までを含む配列番号６；残基１ないし３８のアミノ酸で始まり３６６までを含む配列番号８；配列番号１１；配列番号１３；残基１ないし８４のアミノ酸で始まり６２２までを含む配列番号１４；残基１ないし２９９のアミノ酸で始まり６２２までを含む配列番号１４；配列番号１６；ほぼ残基１ないし７０１の配列番号２１；配列番号２３；残基１ないし２７８のアミノ酸で始まり４３５までを含む配列番号２４；ほぼ残基１ないし６２７の配列番号２５；及び、残基１ないし２２４のアミノ酸で始まり３８３までを含む配列番号２６）を有する融合ポリペプチドを提供する。
【００７０】
本明細書で使用される「Ｆｃポリペプチド」という用語には、Ｆｃ領域のＣＨドメインのいずれか又は全部を含んでなる、抗体のＦｃ領域から構成される、ネーティブ及びムテインの形態のポリペプチドが含まれる。二量体化を促進するヒンジ領域を含有する、そのようなポリペプチドの先端切れ形態（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｆｏｒｍ）も含まれる。好ましいポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体から誘導されるＦｃポリペプチドを含む。１つの代替物として、免疫グロブリンから誘導されるポリペプチドを使用して、オリゴマーが製造される。抗体から誘導されたポリペプチドの様々な部分（Ｆｃドメインを含む）へ融合したある種の異種ポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチドの製造は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ． （ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８： １０５３５， １９９１）； Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ． （Ｎａｔｕｒｅ ３４４： ６７７， １９９０）； 及び Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ （『免疫グロブリン融合ポリペプチドの構築（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）』Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 補遺４、１０． １９． １−１０． １９． １１ 頁、１９９２）に記載されている。免疫グロブリンをベースとするオリゴマーの製造及び使用の方法は当技術分野で知られている。本発明の１つの態様は、本発明のポリペプチドを、抗体から誘導されるＦｃポリペプチドへ融合することによって作成される２つの融合ポリペプチドを含んでなる二量体へ向けられる。ポリペプチド／Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする融合遺伝子を適正な発現ベクターへ挿入する。ポリペプチド／Ｆｃ融合ポリペプチドは、組換え発現ベクターか、又は融合ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドで形質転換されたか又はトランスフェクトされた宿主細胞において発現され、抗体分子のように組立てられ、そのときに、鎖間ジスルフィド結合がＦｃ部分間で形成され、二価分子を産生する。ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１（参照により本明細書に組込まれる）に記載される、１つの好適なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＮ末端ヒンジ領域からＦｃ領域のネーティブＣ末端へ広がる単鎖ポリペプチドである。もう１つの有用なＦｃポリペプチドは、参照により本明細書に組込まれる米国特許第５，４５７，０３５号と Ｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，（ＥＭＢＯ Ｊ． １３： ３９９２， １９９４）に記載されるＦｃムテインである。このムテインのアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａへ変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕへ変化し、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａへ変化していることを除けば、ＷＯ９３／１０１５１に示される天然Ｆｃ配列のそれと同一である。このムテインは、Ｆｃ受容体への低下したアフィニティーを示す。Ｆｃ部分（及びそれから形成されるオリゴマー）を含んでなる、上記の融合ポリペプチドは、ポリペプチドＡ若しくはポリペプチドＧのカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製の利点を提供する。他の態様では、本発明のポリペプチドは、抗体の重（Ｈ）鎖若しくは軽（Ｌ）鎖の可変部分で置換され得る。融合ポリペプチドが抗体の重鎖と軽鎖の両方でつくられる場合、４つものＭＰＤポリペプチド又はその断片を有するオリゴマーを形成することが可能である。
【００７１】
本発明のオリゴマーを製造するためのもう１つの方法は、ロイシンジッパーの使用を伴う。ロイシンジッパードメインとは、それが見出されルポリペプチドのオリゴマー化（二量体又は三量体）を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、当初いくつかのＤＮＡ結合ポリペプチドにおいて同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０： １７５９， １９８８）、以来、多種多様な異なるポリペプチドに見出されてきた。ジッパードメインは、しばしば４若しくは５のロイシン残基が他のアミノ酸とともに分散している反復性の七個のリピートを含む。
【００７２】
本発明のキメラ若しくは融合ポリペプチドは、標準的な組換えＤＮＡ技術により産生され得る。１つの態様では、様々なポリペプチド配列についてコードするポリヌクレオチド断片が、例えば、平滑末端化若しくは付着末端化した末端の連結、適正な末端を提供するための制限酵素消化、付着末端の適宜埋め込み、望まれない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、及び酵素的連結を利用することによって、慣用技術に従ってインフレームで一緒に連結される。もう１つの態様では、自動化ＤＮＡ合成機を含む慣用技術により融合遺伝子が合成され得る。他のやり方では、２つの連続遺伝子断片間の相補的な重複部分（ｏｖｅｒｈａｎｇｓ）を生じるアンカープライマー（これは、その後アニールされて再増幅され得て、キメラ遺伝子配列を産生する）を使用して、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行うことができる（例えば、『分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）』Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． 編、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ：１９９２を参照のこと）。さらに、すでに融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をコードする多くの発現ベクターが市販されている。
【００７３】
さらに本発明には、関連した天然パターンのグリコシル化を伴うか又は伴わないポリペプチドが含まれる。酵母若しくは哺乳動物の発現系（例、ＣＯＳ−１若しくはＣＨＯ細胞）で発現されるポリペプチドは、発現系の選択に依存して、分子量とグリコシル化のパターンにおいて、天然ポリペプチドに類似しているか、又はそれから有意に異なり得る。大腸菌のような細菌発現系における本発明のポリペプチドの発現は、非グリコシル化分子を提供する。さらに、ある製法では、多数の差次的にグリコシル化されたポリペプチドの分子種が含まれ得る。グリコシル基は、従来法、特にグリコペプチダーゼを利用する方法により除去され得る。
【００７４】
もう１つの態様では、ポリペプチド若しくはポリヌクレオチドの修飾が既知の技術を使用してなし得る。ポリペプチド配列中での注目すべき修飾には、コード配列中にある選択されたアミノ酸残基の変更、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、置き換え（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、挿入、又は欠失が含まれ得る。例えば、１つ以上のシステイン残基が欠失されるか、又は別のアミノ酸に置換されて、分子のコンホメーションを変化させる場合があり、これは、折り畳み又は再生のときに不正確な分子内ジスルフィド結合の形成を防ぐことを伴う可能性がある変化である。そのような変更、置換、置き換え、挿入、又は欠失の技術は当業者に知られている（例えば、米国特許第４，５１８，５８４号を参照のこと）。もう１つの例として、ポリペプチドの細胞外ドメイン中のＮ−グリコシル化部位はグリコシル化を排除するように修飾して、哺乳動物及び酵母の発現系において、炭水化物が低減した類似体の発現を可能にしてもよい。真核ポリペプチド中のＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸の三つ組、Ａｓｎ−Ｘ−Ｙ（ここで、Ｘは、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸であり、Ｙは、Ｓｅｒ又はＴｈｒである）により特徴づけられる。これらの三つ組をコードするヌクレオチド配列への適正な置換、追加、又は欠失は、炭水化物残基のＡｓｎ側鎖での結合の防止をもたらす。例えば、Ａｓｎを異なるアミノ酸に置き換えるように選択される、単一ヌクレオチドの変更は、Ｎ−グリコシル化部位を不活性化するのに十分である。他のやり方では、Ｓｅｒ又はＴｈｒを、Ａｌａのような別のアミノ酸に置き換えることができる。ポリペプチド中のＮ−グリコシル化部位を不活性化するための既知の方法には、参照により本明細書に組込まれる、米国特許第５，０７１，９７２号とＥＰ２７６，８５６号に記載されるものが含まれる。
【００７５】
本発明の範囲内にある追加の変異体には、グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基、等のような他の化学部分との共有若しくは集合コンジュゲートを形成することによって、その誘導体を作成するように修飾され得るポリペプチドが含まれる。共有誘導体は、ポリペプチドのアミノ酸側鎖上の官能基、又はそのＮ末端若しくはＣ末端へ化学部分を連結させることによって製造され得る。（検出可能な）診断用剤又は治療用剤をそれに付けて含んでなるコンジュゲートが本明細書で考慮される。好ましくは、そのような変更、置換、置き換え、挿入、又は欠失は、ポリペプチドの所望される活性を保持する。
【００７６】
本発明はまた、ＭＰＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも１０塩基の長さであるヌクレオチドのポリマー形態を意味する。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又は両タイプのヌクレオチドの修飾された形態であり得る。この用語には、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの一本鎖及び二本鎖の形態が含まれる。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組合せが含まれる。本発明のポリヌクレオチドには、完全長の遺伝子とｃＤＮＡ分子、並びにそれらの断片の組合せが含まれる。本発明のポリヌクレオチドは、ヒトの供給源から選好的に誘導されるが、本発明には、非ヒト種から誘導されるものも含まれる。
【００７７】
「単離されたポリヌクレオチド」は、それが誘導される生物体の天然に存在するゲノムではそれがすぐ近くに隣接しているコード配列（一方は５’末端にあり、他方は３’末端にある）の両方に必ずしも隣接していないポリヌクレオチドを意味する。従って、この用語には、例えば、ベクター、例えば発現ベクター；自己複製プラスミド若しくはウイルス；又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡへ組込まれているか、又は他の配列から独立した分離分子（例、ｃＤＮＡ）として存在する組換えポリヌクレオチド分子が含まれる。
【００７８】
本発明のＭＰＤポリヌクレオチドは、（１）配列番号１〜２６又は２７に示されるような配列を含んでなるポリペプチド、又はその断片をコードする；（２）（１）へ相補的な配列を有する；（３）中程度〜高程度（ｍｏｄｅｒａｔｅ　ｔｏ　ｈｉｇｈｌｙ）にストリンジェントな条件の下で（１）のポリヌクレオチドへ特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド；及び（４）ＴがＵでもあり得る（１）〜（３）のポリヌクレオチド（例、ＲＮＡ配列）である。本発明にまた含まれるのは、本発明のＭＰＤポリヌクレオチドの相同体である。これらのポリヌクレオチドは、ゲノム若しくはｃＤＮＡ分子の好適な供給源からの単離、又は利用可能な配列データベースのコンピュータ検索を含む、いくつかの方法で同定され得る。本明細書に記載されるアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド相同体を単離するためのプローブ若しくはプライマーとして、又はデータベース検索のクエリー配列として使用され得る。本発明のアミノ酸配列からの「戻し翻訳（ｂａｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」により、縮重オリゴヌクレオチド配列が入手され得る。ＭＰＤポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を単離して増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用し得る。標的ポリヌクレオチド分子の所望される末端を規定するオリゴヌクレオチドは、５’及び３’のプライマーとして利用される。従って、本発明のポリヌクレオチドの断片は、関連配列を同定若しくは増幅するか、又は本発明のＭＰＤの完全長配列を得るためのプローブ及びプライマーとして有用である。オリゴヌクレオチドは、増幅されたＤＮＡ断片の組合せの発現ベクターへの挿入を容易にする、制限エンドヌクレアーゼの認識部位をさらに含有してもよい。ＰＣＲ技術は当技術分野で知られている（例えば、『ＰＣＲプロトコール：方法及び応用の手引き（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）』Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ． 編、アカデミック・プレス社（１９９０）を参照のこと）。
【００７９】
本発明にはまた、減少したストリンジェンシー条件、より好ましくは中程度にストリンジェントな条件、そして最も好ましくは高程度にストリンジェントな条件の下で、ＭＰＤポリヌクレオチドへハイブリダイズするポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドが含まれる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本変数と好適な条件を設計するための手引きについては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ， 及び Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ （１９８９，『分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）』、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、Ｎ．Ｙ．，９章及び１１章；及び『分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）』１９９５， Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． 編、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社、２．１０節と６．３〜６．４節、参照により本明細書に組込まれる）に示されていて、例えば、ポリヌクレオチドの長さ及び／又は塩基組成に基づいて、当技術分野の技術者により容易に決定され得る。中程度ストリンジェント条件を達成する１つのやり方は、５ｘＳＳＣ，０．５％　ＳＤＳ，１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する前洗浄溶液、約５０％のホルムアミド、６ｘＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液、及び約５５℃のハイブリダイゼーション温度（又は、約５０％のホルムアミドを含有するもののような、他の類似のハイブリダイゼーション溶液、約４２℃のハイブリダイゼーション温度）、及び０．５ｘＳＳＣ，０．１％　ＳＤＳ中、約６０℃の洗浄条件の使用を伴う。一般に、高程度ストリンジェント条件は上記のようなハイブリダイゼーション条件として定義されるが、約６８℃、０．２ｘＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳでの洗浄である。ハイブリダイゼーション及び洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１ｘＳＳＣは、０．１５Ｍ　ＮａＣｌと１５ｍＭ　クエン酸ナトリウムである）の代わりにＳＳＰＥ（１ｘＳＳＰＥは、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、及び１．２５ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４である）を代用し得るが、洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間実施する。当業者に知られていて、以下にさらに記載されるように（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９ を参照のこと）、ハイブリダイゼーション反応と二本鎖の安定性を支配する基本原理を適用することによって所望される程度のストリンジェンシーを達成するためには、洗浄温度と洗浄塩濃度を必要に応じて調整し得ることが理解されるべきである。核酸を未知配列の標的ポリヌクレオチドへハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは、ハイブリダイズする核酸のそれであると仮定される。既知配列の核酸がハイブリダイズされる場合、ハイブリッドの長さは、核酸の配列を並列して、最適な配列相補性の領域（群）を同定することによって決定され得る。５０塩基対未満の長さであることが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低いものであるべきである（ここで、Ｔｍは、以下の式により決定される）。１８塩基対未満の長さのハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔの塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃの塩基数）。１８塩基対より多い長さのハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃ　％）−（６００／Ｎ）｛ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１ｘＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）｝。好ましくは、そのようなハイブリダイズするそれぞれの核酸は、それがハイブリダイズする本発明のポリヌクレオチドの長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、６０％、又は７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０％）である長さを有し、それがハイブリダイズする本発明のポリヌクレオチドと少なくとも６０％（より好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、又は少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有する。
【００８０】
「保守修飾変異体」は、ポリペプチドとポリヌクレオチドの両方に適用される。特定のポリヌクレオチドに関して言えば、保守修飾変異体は、同一であるか又は本質的に同一であるアミノ酸をコードするポリヌクレオチド中にあるコドンを意味する。遺伝暗号の縮重性のために、多数の機能的に同一なポリヌクレオチドがある一定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵは、いずれもアミノ酸のアラニンをコードする。従って、アラニンがあるコドンにより特定されるどの位置でも、このコドンは、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載されるいずれかの対応コドンへ変更され得る。このような変異は「サイレント変異」であり、保守修飾変異の１種である。あるポリペプチドをコードする本明細書のあらゆるポリヌクレオチド配列も核酸の可能なサイレント変異を記載する。当業者には、ポリヌクレオチド中の各コドン（但し、通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために修飾され得ることがわかるだろう。従って、記載される各配列には、ポリヌクレオチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異が潜在的に含まれている。
【００８１】
本発明はまた、Ｈａｃｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １４： ４４１−４４７ （１９９６） に記載されるような「ＤＮＡチップ」上で本発明のポリヌクレオチドを分析するための方法論を提供する。例えば、ＭＰＤポリペプチド、断片又はその変異体若しくは突然変異体をコードする配列を含んでなるオリゴヌクレオチドの高密度アレイがこのチップへ適用されて固定化され、ある集団中の配列変異を検出するために使用され得る。試験サンプル中のポリヌクレオチドが固定化オリゴヌクレオチドへハイブリダイズする。標的ポリヌクレオチドの固定化プローブへのハイブリダイゼーションプロフィールを定量化し、参照プロフィールと比較する。生じた遺伝子情報は、分子診断に使用され得る。ＤＮＡチップ上のオリゴヌクレオチドの密度は、必要に応じて変更し得る。
【００８２】
本発明はまた、本明細書に開示されるポリヌクレオチドへ対応する遺伝子を提供する。「対応する遺伝子」は、転写されて、ｃＤＮＡ分子が誘導されるｍＲＮＡを産生するゲノムの領域であり、そのような遺伝子の調節された発現に必要なゲノムの隣接領域が含まれる場合がある。従って、対応遺伝子には、限定されないが、コード配列、５’及び３’非翻訳領域、選択的にスプライスされるエクソン、イントロン、プロモーター、エンハンサー、及びサイレンサー、又はサプレッサーの諸要素が含まれ得る。対応する遺伝子は、本明細書に開示される配列情報を使用して、既知の方法に従って単離され得る。そのような方法には、適正なゲノムライブラリー、又は他のゲノム材料の供給源にある遺伝子を同定及び／又は増幅するために、開示される配列情報から、プローブ若しくはプライマーを製造することが含まれる。
【００８３】
本発明のポリペプチド及び断片の発現、単離、及び精製は、限定されないが以下の方法を含む、好適な技術により達成され得る。
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドを組換え的に産生するために、Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ４４８５ （１９９１）； 及び Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．『クローニングベクター：実験マニュアル（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）』エルセヴィエ、ニューヨーク（１９８５，及び補遺）に開示されるｐＭＴ２若しくはｐＥＤ発現ベクターのように、発現調節配列へ機能可能的に連結され得る。多くの好適な発現調節配列が当技術分野で知られている。組換えポリペプチドを発現させる一般的な方法も知られていて、Ｒ． Ｋａｕｆｍａｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５： ５３７ （１９９０） に例示されている。本明細書に定義されるように、「機能可能的に連結している」は、このポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが、調節配列へ機能可能的に連結したベクター又はポリヌクレオチドで形質転換（トランスフェクト）された宿主細胞により発現されるように、本発明の単離されたポリヌクレオチドと発現調節配列がベクター若しくは細胞の内部に位置していることを意味する。
【００８４】
さらに、（天然の又は異種の）適正なシグナルペプチドをコードする配列が発現ベクターへ組込まれ得る。シグナルペプチド若しくはリーダーの選択は、組換えポリペプチドが産生されることになる宿主細胞の型のような要因に依存し得る。哺乳動物の宿主細胞において機能的である異種シグナルペプチドの例には、インターロイキン（ＩＬ）−７のシグナル配列（米国特許第４，９６５，１９５号を参照のこと）；ＩＬ−２受容体のシグナル配列（Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ７６８， １９８４ を参照のこと）；ＩＬ−４受容体シグナルペプチド（ＥＰ　３６７，５６６を参照のこと）；Ｉ型ＩＬ−１受容体シグナルペプチド（米国特許第４，９６８，６０７号を参照のこと）；及びＩＩ型ＩＬ−１受容体シグナルペプチド（ＥＰ　４６０，８４６を参照のこと）が含まれる。意図される宿主細胞中で機能的であるシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは、ポリペプチドが細胞から分泌されると、ポリペプチドから切り離される。ポリペプチド調製物には、このシグナルペプチドの１つ以上の部位での切断から生じる、様々なＮ末端アミノ酸を有するポリペプチドの混合物が含まれ得る。
【００８５】
ＤＮＡを哺乳動物細胞へ導入するための確立された方法が記載されている（Ｋａｕｆｍａｎ， Ｒ． Ｊ．， 『哺乳動物細胞の大量培養（Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）』１９９０， １５−６９ 頁）。細胞をトランスフェクトするには、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）若しくはリポフェクタミン−プラス（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ）脂質試薬（ギブコ／ＢＲＬ）のような、市販の試薬を使用する追加のプロトコールが使用され得る（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ７４１３， １９８７）。さらに、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．（『分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）』、第２版、１〜３巻、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、１９８９）にあるような従来法を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトするには、エレクトロポレーションを使用し得る。安定な形質転換体の選択は、例えば、細胞毒性薬への抵抗性のような、当技術分野で知られている方法を使用して実施され得る。Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５： ４８７， １９９０ は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）抵抗性のような、いくつかの選択スキームを記載する。ＤＨＦＲ選択に適した株は、ＤＨＦＲが欠損している、ＣＨＯのＤＸ−Ｂ１１株である（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ４２１６， １９８０）。ＤＨＦＲ　ｃＤＮＡを発現するプラスミドがＤＸ−Ｂ１１株へ導入され得て、このプラスミドを含有する細胞だけが適正な選択培地で増殖し得る。発現ベクターへ組込まれ得る他の選択可能マーカーの例には、Ｇ４１８及びヒグロマイシンＢのような抗生物質への抵抗性を与えるｃＤＮＡが含まれる。これら化合物への抵抗性に基づいて、このベクターを収容する細胞が選択される。
【００８６】
他のやり方では、相同的組換え、又は「遺伝子標的指向（ｇｅｎｅ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」技術により遺伝子産物が入手され得る。そのような技術は、本発明のＭＰＤポリペプチドをコードする内因性遺伝子の発現を誘導するために、（ＣＭＶプロモーター、等のような）外因性転写調節要素をゲノム上の特定のあらかじめ定められた部位へ導入することを利用する。宿主の染色体若しくはゲノムへ組込む位置は、遺伝子の位置及び配列が既知であれば、当業者により容易に決定され得る。好ましい態様では、本発明はまた、増加した量の遺伝子産物を産生するために、増幅可能遺伝子と一緒に外因性転写調節要素を導入することを考慮する。相同的組換え又は遺伝子標的指向の実施については、Ｓｃｈｉｍｋｅ， ｅｔ ａｌ．「哺乳動物体細胞での遺伝子の増幅（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５１： ８５ （１９８７） と Ｃａｐｅｃｃｈｉ， ｅｔ ａｌ．， 「新しいマウスの遺伝学：遺伝子標的指向によるゲノムの変更（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ： Ａｌｔｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ ｂｙ Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ）」ＴＩＧ ５： ７０ （１９８９） に説明されている。
【００８７】
ポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、真核及び原核の細胞が含まれる。哺乳動物宿主細胞には、例えば、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ２３： １７５， １９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１０）細胞系、アフリカミドリザルの腎臓細胞系ＣＶ１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　７０）から誘導されたＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系（ＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ． ＥＭＢＯ Ｊ． １０： ２８２１， １９９１ を参照のこと）、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換された霊長類の細胞系、正常２倍体細胞、一次組織、一次外移植片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫ、又はＪｕｒｋａｔ細胞の ｉｎ ｖｉｔｒｏ 培養物から誘導された細胞株が含まれる。他のやり方では、酵母のような低級真核性物や細菌のような原核生物においてポリペプチドを産生することが可能であり得る。潜在的に好適な酵母株には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ 株、Ｃａｎｄｉｄａ、又は異種ポリペプチドを発現することが可能な酵母株が含まれる。潜在的に好適な細菌株には、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、又は異種ポリペプチドを発現することが可能な細菌株が含まれる。ポリペプチドが酵母又は細菌でつくられる場合、機能的なポリペプチドを得るためには、例えば、適正な部位のリン酸化若しくはグリコシル化により、そこで産生されるポリペプチドを修飾することが必要であり得る。そのような共有付加は、既知の化学法若しくは酵素法を使用して達成され得る。ポリペプチドはまた、１つ以上の昆虫発現ベクター中にある好適な調節配列へ本発明のポリヌクレオチドを機能可能的に連結させ、昆虫発現系を利用することによって産生され得る。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料及び方法は、参照により本明細書に組込まれる、Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， テキサス農業実験本部会報（Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）Ｎｏ． １５５５ （１９８７）、及び Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： ４７ （１９８８） に記載される方法と同様に、例えば、インビトロゲン、サンディエゴ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．からのキット形態（ＭａｘＢａｃ（登録商標）キット）で市販されている。本明細書に開示される核酸構築体から誘導されるＲＮＡを使用してポリペプチドを産生するために、無細胞翻訳系も利用され得る。好ましくは、少なくとも１つの発現調節配列へ機能可能的に連結した、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」である。
【００８８】
ＭＰＤポリペプチドを中和するか、又はＭＰＤポリヌクレオチドの発現（転写又は翻訳のいずれか）を阻害する任意の方法が、ＭＰＤポリペプチドの生物学的活性を減少するために使用され得る。
【００８９】
１つの態様では、例えば、ＭＰＤ　ｍＲＮＡ転写物の翻訳を阻害するか又は妨げるための既知のアンチセンス若しくはリボザイムアプローチ；ＭＰＤ遺伝子の転写を阻害するための三重らせんアプローチ；又は、ＭＰＤ遺伝子又はその内因性プロモーター若しくはエンハンサー要素を不活性化するか又は「ノックアウト」するための標的化相同的組換えを使用して、内因性ＭＰＤ発現のレベルを減少するためのアンタゴニストが設計され得る。そのようなアンチセンス、リボザイム、及び三重らせんのアンタゴニストは、損なわれていないか、又は適宜、突然変異体のＭＰＤ活性のいずれかを減少するか又は阻害するために設計され得る。
【００９０】
アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子は、標的化ｍＲＮＡへハイブリダイズし、ポリペプチドの翻訳を妨げることによってｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンスアプローチは、ＭＰＤポリヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡへ相補的であるオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれか）の設計を伴う。絶対的な相補性は、好ましいものの、要求されない。メッセージの５’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドンまで、及びそれを含む５’非翻訳配列に相補的であるオリゴヌクレオチドは、翻訳を阻害するのに最も効果的に作用するはずである。アンチセンス核酸は、好ましくは、６〜約５０のヌクレオチドの長さに及ぶオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ混合物、それらの誘導体又は修飾のバージョンであり、一本鎖又は二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格で修飾され得て、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、等を向上させてもよい。オリゴヌクレオチドには、（例えば、宿主細胞受容体を ｉｎ ｖｉｖｏ で標的指向するための）ペプチド、又は細胞膜を通過する輸送を促進する剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ８６： ６５５３， １９８９； Ｌｅｍａｉｔｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８４： ６４８， １９８７； ＰＣＴ公開番号　ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）、又はハイブリダイゼーション誘導切断剤、又は挿入剤（例えば、Ｚｏｎ， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ５： ５３９， １９８８ を参照のこと）のような、他の付帯基が含まれ得る。アンチセンス分子は、例えば、組織若しくは細胞の誘導部位への直接注射により、ＭＰＤポリヌクレオチド配列を有する転写物を ｉｎ ｖｉｖｏ で発現する細胞へデリバリーされるか、又は所望される細胞を標的指向するように設計された修飾アンチセンス分子（例えば、標的細胞表面上で発現される受容体若しくは抗原へ特異的に結合するペプチド若しくは抗体へ連結したアンチセンス）は、全身的に投与され得る。好ましいアプローチは、強いｐｏｌ　ＩＩＩ若しくはｐｏｌ　ＩＩプロモーターの制御下にアンチセンスオリゴヌクレオチドが置かれている組換えＤＮＡ構築体を活用する。
ＭＰＤポリヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子は、ＭＰＤ　ｍＲＮＡの翻訳を妨げる（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４；米国特許第５，８２４，５１９号を参照のこと）。リボザイムは、他の一本鎖ＲＮＡを特異的に切断する能力を保有するＲＮＡ分子である。リボザイムは配列特異的であるので、特定の配列のあるｍＲＮＡだけが不活性化される。２つの基本タイプのリボザイム、即ち、テトラヒメナ型（Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ， Ｎａｔｕｒｅ， ３３４： ５８５， １９８８）と「ハンマーヘッド」型が存在する。テトラヒメナ型のリボザイムが４つの塩基の長さである配列を認識するのに対し、「ハンマーヘッド」型リボザイムは、１１〜１８塩基の長さの塩基配列を認識する。認識配列が長いほど、その配列が標的ｍＲＮＡ種の中で排他的に存在する可能性が高くなる。従って、ハンマーヘッド型リボザイムのほうがテトラヒメナ型リボザイムより好ましい。アンチセンスアプローチと同じように、リボザイムは修飾されたオリゴヌクレオチドから構成され、強い構成的ｐｏｌ　ＩＩＩ若しくはｐｏｌ　ＩＩプロモーターの制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築体を使用してデリバリーされ得る。
【００９１】
他のやり方では、標的遺伝子の調節領域（例えば、標的遺伝子のプロモーター、及び／又はエンハンサー）へ相補的なＤＮＡ配列を標的指向させ、標的遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成させることによって、内因性のＭＰＤ発現を抑制し得る（一般論として、Ｈｅｌｅｎｅ， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．， ６（６）， ５６９， １９９１； Ｈｅｌｅｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ６６０： ２７， １９９２； 及び Ｍａｈｅｒ， Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１２）， ８０７， １９９２ を参照のこと）。
【００９２】
本発明のアンチセンス、リボザイム、及び三重らせんの分子は、ＤＮＡ及びＲＮＡの分子の合成について当技術分野で知られている任意の方法により製造され得て、それには、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから供される自動化ＤＮＡ合成機を使用する固相ホスホロアミダイト化学合成のような、オリゴデオキシリボヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオチドを化学合成するための技術が含まれる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６： ３２０９， １９８８ の方法により合成され得る。メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御孔ガラスポリマー支持体の使用により製造され得る（Ｓａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ８５： ７４４８， １９８８）。他のやり方では、ＲＮＡ分子が、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列の ｉｎ ｖｉｔｒｏ 及び ｉｎ ｖｉｖｏ 転写により産生され得る。
【００９３】
内因性遺伝子発現はまた、標的化相同的組換えを使用して、標的遺伝子又はそのプロモーターを不活性化するか又は「ノッキングアウト」するこよによって抑制され得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１７： ２３０， １９８５； Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｃｅｌｌ ５１， ５０３， １９８７； Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５， ３１３， １９８９ を参照のこと。これらはいずれもそのまま参照により本明細書に組込まれる）。例えば、内因性標的遺伝子へ相同なＤＮＡが隣接した突然変異体の非機能性標的遺伝子（又は完全に無関係なＤＮＡ配列）が、選択可能マーカー、及び／又はネガティブ選択可能マーカーを伴うか又は伴わずに使用され得る。標的化相同的組換えを介したＤＮＡ構築体の挿入は、標的遺伝子の不活性化をもたらす。そのようなアプローチは、不活性標的遺伝子をもった非ヒト動物の子孫を産生するために胚性幹細胞への修飾が使用され得る場合に特に適している（例えば、Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ， １９８７ と Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， １９８９， 同上、を参照のこと；また、Ｇｒｉｓｈｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７ （５４６２）： ２４９４， ２０００ 及び Ｄｅｒｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １４（１３）： １５７８， ２０００ の「ＲＮＡ干渉」（「ＲＮＡｉ」）技術も参照のこと）。
【００９４】
本明細書で使用されるように、「トランスジェニック動物」は、胚細胞へ挿入され、その細胞から発生する動物のゲノムの一部となるトランス遺伝子を包含する動物、又はそのような動物の子孫である。トランス遺伝子技術により産生され得る任意の非ヒト動物が本発明に含まれるが、哺乳動物が好ましい。好ましい哺乳動物には、非ヒト霊長類、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ、ブタ、ウサギ、及び、モルモット、ハムスター、ラット、アレチネズミ（ｇｅｒｂｉｌｓ）、及びマウスのような齧歯動物が含まれる。
【００９５】
「トランス遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」は、トランスジェニック動物で発現され得る、１つ以上の選択される配列（例えば、ＭＰＤ　ｍＲＮＡを切断するリボザイムをコードする、ＭＰＤ　ｍＲＮＡへのアンチセンス分子をコードする、突然変異体のＭＰＤ配列をコードする、等）を含むポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチドは、トランスジェニック動物に対して部分的又は全体的に異種である、即ち外来であるか、又はトランスジェニック動物の内因性遺伝子に対して同種であるが、天然の遺伝子の位置とは異なる位置で動物のゲノムへ挿入されるように設計される。トランス遺伝子には、選択されるＤＮＡの発現に必要な１つ以上のプロモーターとイントロンのような他のＤＮＡ配列が含まれる場合があり、いずれも選択されるＤＮＡへ機能可能的に連結され、エンハンサー配列が含まれる場合もある。
【００９６】
トランスジェニック動物は、特定の経路若しくは表現型に対する、増加又は減少したＭＰＤレベルの影響を同定するために使用され得る（例えば、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ４４３８， １９８５； Ｊａｅｎｉｓｃｈ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７３： １２６０， １９７６； Ｈｏｇａｎ， ｅｔ ａｌ．， １９８６『マウス胚の操作法（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ）』コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、Ｎ．Ｙ．；Ｊａｈｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ６９２７， １９８５； Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ６１４８； Ｓｔｅｗａｒｄ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， ６： ３８３， １９８７； Ｊａｈｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２９８： ６２３， １９８２ を参照のこと）。
【００９７】
もう１つの態様では、本発明のポリペプチドと免疫反応する抗体が本明細書に提供される。上記に示すような、ＭＰＤのポリペプチド、断片、変異体、融合ポリペプチド、等がそれと免疫反応する抗体を産生するときの「免疫原」として利用され得る。そのような抗体は、抗体の抗原結合部位を介してポリペプチドへ特異的に結合する。特異的に結合する抗体は、ＭＰＤポリペプチド、相同体、及び変異体を特異的に認識し、それと結合するが、他の分子とは結合しない。好ましい態様では、抗体は、本発明のＭＰＤアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的であって、他のポリペプチドとは交差反応しない。
【００９８】
より特定すると、上記のポリペプチド、断片、変異体、融合ポリペプチド、等は、抗体の形成を誘発する抗原決定基若しくはエピトープを含有する。これらの抗原決定基若しくはエピトープは、直線状、又は高次構造的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）（断続的）のいずれかであり得る。直線状エピトープがポリペプチドのアミノ酸の単一部分からなるのに対し、高次構造的若しくは断続的エピトープは、ポリペプチド鎖の様々な領域に由来し、ポリペプチドの折り畳みに応じて近傍へ集められるアミノ酸部分からなる。エピトープは、当技術分野で知られている任意の方法により同定され得る。さらに、本発明のポリペプチドに由来するエピトープは、アッセイにおける研究試薬として、そして、ポリクローナル血清や培養ハイブリドーマ由来の上澄液のような物質から特異結合抗体を精製するために使用され得る。そのようなエピトープ又はその変異体は、固相合成、ポリペプチドの化学的若しくは酵素的切断のような当技術分野で知られている技術を使用するか、又は組換えＤＮＡ技術を使用して産生され得る。
【００９９】
本発明のポリペプチドに対するポリクローナル及びモノクローナル抗体は、いずれも従来技術により調製され得る。例えば、『モノクローナル抗体、ハイブリドーマ：生物学的分析の新次元（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ）』（Ｋｅｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ． 編）プレナム・プレス、ニューヨーク（１９８０）；及び、『抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）』（Ｈａｒｌｏｗ と Ｌａｎｄ 編）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８８）；Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（米国特許第４，３７６，１１０号）；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４： ７２， １９８３； Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０： ２０２６， １９８３）；及び、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９８５，『モノクローナル抗体と癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）』アラン・Ｒ．リス社、７７−９６頁）を参照のこと。本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系も本明細書で意図される。そのようなハイブリドーマは、従来技術により産生され、同定され得る。抗体の産生のために、様々な宿主動物が、ＭＰＤポリペプチド、その断片、変異体、又は突然変異体を用いた注射で免疫化され得る。そのような宿主動物には、限定されないが、少し挙げると、ウサギ、マウス、及びラットが含まれ得る。免疫学的応答を高めるには、様々なアジュバントが使用され得る。宿主の種に依存して、そのようなアジュバントには、限定されないが、フロイント（完全及び不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、アオガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、及び、ＢＣＧ（カルメット−ゲランの桿菌）及び坐瘡プロピオンバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）のような潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。モノクローナル抗体は、従来技術により回収され得る。そのようなモノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含む免疫グロブリンのクラス、及びそのサブクラスのものであり得る。
【０１００】
さらに、適正な抗原特異性のあるマウス抗体分子由来の遺伝子を、適正な生物学的活性のあるヒト抗体分子由来の遺伝子といっしょにスプライスすることによる「キメラ抗体」の産生（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３１４： ４５２， １９８５）のために開発された技術も使用することができる。キメラ抗体は、ブタｍＡｂから導かれた可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域を有するもののように、様々な部分が異なる動物種から誘導されている分子である。本発明のモノクローナル抗体にはまた、マウスモノクローナル抗体のヒト化バージョンも含まれる。そのようなヒト化抗体は既知の技術により調製され得て、抗体がヒトへ投与されるときに、低減した免疫原性という利点を提供し得る。キメラ抗体とさらに工学処理されるモノクローナル抗体の産生の方法には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （Ｎａｔｕｒｅ ３３２： ３２３， １９８８）， Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． （ＰＮＡＳ ８４： ３４３９， １９８７）， Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ． （Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７： ９３４， １９８９） 及び Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ （ＴＩＰＳ １４： １３９， Ｃａｎ， １９９３） に記載されるものが含まれる。抗体をトランスジェニック的に産生する方法は、ＧＢ　２，２７２，４４０、米国特許第５，５６９，８２５及び５，５４５，８０６号と、それからの優先権を主張する関連特許に見出し得るが、これらはいずれも参照により本明細書に援用される。好ましくは、ヒトでの使用では、抗体はヒトのものであるか又はヒト化されていて、そのような抗体を作成するための技術も知られている。ヒト抗体を作成するためのトランスジェニック動物は、例えば、メダレクス（Ｍｅｄａｒｅｘ）社（プリンストン、ＮＪ）とアブジェニクス（Ａｂｇｅｎｉｘ）社（フレモント、ＣＡ）から入手可能である。
【０１０１】
特異エピトープを認識する抗体断片は、既知の技術により産生され得る。例えば、そのような断片には、限定されないが、抗体分子のペプシン消化により産生され得るＦ（ａｂ’）２断片と、この（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって産生され得るＦａｂ断片が含まれる。あるいは、所望される特異性をもったモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能にするために、Ｆａｂ発現ライブラリーが構築され得る（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６： １２７５， １９８９）。単鎖抗体の産生に記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２： ４２３， １９８８； Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ５８７９， １９８８； 及び Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３４： ５４４， １９８９）も、ＭＰＤアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対する単鎖抗体を産生するために採用され得る。さらに、ＭＰＤポリペプチドへの抗体はまた、ＭＰＤポリペプチドを「模倣」し、当業者に知られた技術を使用してＭＰＤポリペプチドへ結合し得る抗イディオタイプ抗体を産生するために活用され得る（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ ＆ Ｂｏｎａ， ＦＡＳＥＢ Ｊ ７（５）： ４３７， １９９３； 及び Ｎｉｓｓｉｎｏｆｆ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７（８）： ２４２９， １９９１ を参照のこと）。
【０１０２】
そのような抗体を同定するためのスクリーニング方法が知られていて、例えば、免疫アフィニティークロマトグラフィーを含み得る。抗体は、アゴニスト的な（即ち、リガンド模倣的な）特性でスクリーニングされ得る。そのような抗体は、細胞表面上のＭＰＤポリペプチドへ結合すると、天然に存在するＭＰＤ結合パートナーが細胞表面上のポリペプチドへ結合するときに誘導される生物学的効果に類似した生物学的効果（例えば、生物学的シグナルの伝達）を誘導し得る。アゴニスト性抗体は、ＭＰＤ仲介性の副刺激経路又は細胞間情報伝達を誘導するために使用され得る。
【０１０３】
さらに、本発明のＭＰＤポリペプチド配列を有するポリペプチドの、その結合パートナー若しくは基質への結合を阻止する抗体は、そのような結合から生じるＭＰＤポリペプチド仲介性の細胞間情報伝達若しくは副刺激を阻害すること、及び／又はＭＰＤポリペプチドのインテグリンコグネイトを同定するために使用され得る。そのような阻止抗体は、ＭＰＤポリペプチドへの結合パートナー（例えば、インテグリン）を発現するある種の細胞へのそのポリペプチドの結合を阻害する能力について抗体を試験することのような好適なアッセイ方法を使用して、同定され得る。あるいは、阻止抗体は、ＭＰＤポリペプチドの標的細胞への結合から生じる生物学的効果を阻害する能力についてのアッセイにおいて同定され得る。１つの態様では、フローサイトメトリ−のインテグリンｍＡｂをベースとした結合阻害アッセイが、内皮細胞の表面上で発現されるインテグリンへのＭＰＤｄｉｓ−Ｆｃポリペプチドの結合を示すために使用される。そのようなアッセイでは、ヒト内皮細胞が使用され得る。ヒト内皮細胞は、αｖβ３、αｖβ５、β１、β４、α１、α２、α３、α４、α５、及びα６インテグリンを発現する。ＭＰＤｄｉｓ−Ｆｃポリペプチドを内皮細胞と接触させる。ヒトインテグリンαｖβ３（ＬＭ６０９，抗ＣＤ５１／６１，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ；Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４： ５６９， １９９４）、α２β１（ＢＨＡ２．１，抗ＣＤ４９ｂ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ， Ｂｉｏｌ． ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ ９； ８６５， １９９８）、α５β１（ＳＡＭ−１，抗ＣＤ４９ｅ，Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ； Ａ． ｔｅ Ｖｅｌｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４０； １５４８， １９８８）、α３β１（ＡＳＣ−６，抗ＣＤ４９ｃ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ； Ｐａｔｔａｒａｍａｌａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ． Ｒｅｓ． ２２２； ２８１， １９９６）、α４β１（ＨＰ２／１，抗ＣＤ４９ｄ，イムノテック、マルセイユ、フランス；ヒト白血球分化抗原に関する第４回国際会議ワークショップ、ウィーン、オーストリア、１９８９、ワークショップ番号ｐ０９１）、α６β１（ＧｏＨ３，抗ＣＤ４９ｆ，イムノテック；ヒト白血球分化抗原に関する第４回国際会議ワークショップ、ワークショップ番号ｐ０５５）、α６β４（４３９−９Ｂ，抗ＣＤ１０４，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， サンディエゴ、ＣＡ；Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５ 『白血球Ｖ型：白血球分化抗原（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ Ｖ： Ｗｈｉｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎｓ）』オックスフォード・ユニバーシティ・プレス、ニューヨーク）、及びαｖβ５（ＭＡＢ　１９６１，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ； Ｗｅｉｎａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９； ６９４０， １９９４）に特異的なモノクローナル抗体は、ＨＭＶＥＣ−ｄへ特異的に結合することが示された。これらの抗体のそれぞれは、指定されたインテグリンのそのリガンド（例、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン）への結合を特異的に阻止することが知られている。ＭＰＤｄｉｓ−Ｆｃポリペプチドの結合を阻害するインテグリンｍＡｂの能力は、ＭＰＤポリペプチドのディスインテグリンドメインがどのインテグリンへ結合するか、そして、間接的に、ディスインテグリンドメインがどのインテグリン結合活性に拮抗し得るかを明らかにする。選択されたインテグリンへ結合するＭＰＤｄｉｓ−Ｆｃポリペプチドは、インテグリン−リガンド相互作用を妨害し、内皮細胞の機能、血管新生、及び他の生物学的活性を ｉｎ ｖｉｔｒｏ 及び ｉｎ ｖｉｖｏ で変調する能力についてさらに試験される。
【０１０４】
従って、ＭＰＤポリペプチドの細胞表面結合パートナーとの相互作用により引き起こされるか又は（直接的又は間接的に）悪化される障害が治療され得る。治療法は、ＭＰＤ結合仲介性の生物学的活性を阻害するのに有効な量で、阻止抗体を被検者（ｓｕｂｊｅｃｔ）へ ｉｎ ｖｉｖｏ 投与することを伴う。本明細書で使用されるように、「被検者」は任意の動物、好ましくは哺乳動物（例、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、霊長類、等）、そして最も好ましくはヒトであり得る。一般に、モノクローナル抗体は、そのような治療法での使用に好ましい。１つの態様では、抗原結合抗体断片が利用される。ＭＰＤポリペプチドに対する抗体と生理学的に許容される希釈剤、賦形剤、又は担体を含んでなる組成物が本明細書に提供される。
【０１０５】
また本明細書に提供されるのは、抗ＭＰＤポリペプチド抗体へ付いた、検出可能（例、診断用）であるか、又は治療用の剤を含んでなるコンジュゲートである。このコンジュゲートは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 若しくは ｉｎ ｖｉｖｏ の方法に使用を見出す。本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチド若しくは断片の存在を検出する ｉｎ ｖｉｔｒｏ 又は ｉｎ ｖｉｖｏ のいずれかのアッセイに使用され得る。抗体はまた、本発明のポリペプチド若しくは断片を免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製することに利用され得る。
【０１０６】
もう１つの態様では、注目する生物学的に活性なポリペプチド、又はそれらが相互作用する小分子、例えば、基質、結合剤、阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト、等の構造類似体を産生するために、合理的薬剤設計が使用される。本明細書に提供される方法は、ポリペプチドのより活性であるか、又はより安定な形態であるか、又はポリペプチドの ｉｎ ｖｉｖｏ での機能を高めるか、又はそれに干渉する薬剤を形成するか又は同定するために使用され得る（Ｈｏｄｇｓｏｎ， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９： １９， １９９１， 参照により本明細書に組込まれる）。１つのアプローチでは、本発明のポリペプチド、リガンド若しくは結合パートナー、又は、ポリペプチド−結合パートナー複合体の三次元構造が、Ｘ線結晶学、核磁気共鳴、又はコンピュータ相同性モデリング、又は最も典型的には、これらアプローチの組合せにより決定される。類似分子を設計すること、効率的な阻害剤を同定すること、又は本発明のポリペプチドへ結合し得る小分子を同定することのために、関連した構造情報が使用される。ＡＤＡＭポリペプチド構造情報、好ましくはＭＰＤ構造情報の、分子モデリングソフトウェアシステムにおける使用は、ＭＰＤ活性を変調するのに有用な阻害剤若しくは結合剤の設計を提供する。本発明の特定の方法は、基質若しくはリガンドの可能な結合部位についてＭＰＤポリペプチドの三次元構造を分析すること、予測される反応部位を取込む新たな分子を合成すること、及び、この新たな分子を本明細書にさらに記載されるようにアッセイすることを含む。タンパク質の三次元構造に基づいて基質又は結合剤をモデル化するためのアルゴリズム、ソフトウェア、及び方法の例が、ＰＣＴ公開ＷＯ１０７５７９Ａ２に記載されていて、この開示内容は参照により本明細書に組込まれる。
【０１０７】
本明細書にさらに記載されるような機能アッセイにより選択される標的特異抗体を単離し、次いで、その結晶構造を解読し、それにより後続の薬剤設計の基礎となり得るファルマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を生ずることも可能である。機能的な、薬理学的に活性な抗体への抗イディオタイプ抗体（抗ｉｄｓ）を産生することによってポリペプチド結晶学を完全に回避することが可能である。鏡像の鏡像として、抗ｉｄｓの結合部位は、元の受容体の類似体となることが期待される。従って、化学的若しくは生物学的に産生されたペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するために抗ｉｄが使用され得る。そうなれば、単離されたペプチドは、ファルマコアとして機能する。
【０１０８】
本発明は、ＭＰＤポリペプチドの活性若しくは発現を変調する薬剤を同定するための方法を提供する。そのような方法には、ＭＰＤポリペプチド若しくはポリヌクレオチドを含有するサンプルを、試験剤とポリペプチド若しくはポリヌクレオチドが相互作用することを可能にする条件の下で試験剤と接触させること、及び、その試験剤の存在若しくは不在下でＭＰＤポリペプチドの発現若しくは活性を測定することが含まれる。
【０１０９】
１つの態様では、ＭＰＤポリヌクレオチドを含有する細胞を、細胞と試験剤とが相互作用することが可能になる条件の下で試験剤と接触させる。そのような条件には、典型的には、活用される特定の細胞型に一致した、当技術分野で知られている通常の細胞培養条件が含まれる。高められた温度に関連した条件下か、又は細胞による試験剤の取込みを促進する試薬の存在下で試験剤と細胞が相互作用することを可能にすることが望ましい場合がある。対照は、同様に、但し、試験剤の不在下で処置される。あるいは、ＭＰＤの活性若しくは発現が試験剤との接触に先立って測定され（例、標準若しくは対照の測定）されてから、試験剤との接触の後で再び測定され得る。次いで、処置された細胞を対照と比較すると、対照と比較したＭＰＤの発現若しくは活性における差異は、ＭＰＤの活性若しくは発現を変調する剤の存在を示唆する。
【０１１０】
ＭＰＤ発現が測定される場合、ＭＰＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡの細胞における量を検出することは、例えば、ＰＣＲ又はノーザンブロットにより定量化され得る。サンプル中にあるＭＰＤポリペプチドの量の変化が測定される場合、ＭＰＤポリペプチドを検出するか又は定量することは、抗ＭＰＤ抗体を使用し、既知の技術を使用して実施され得る。
【０１１１】
試験剤は、タンパク質の活性若しくは発現の変調に典型的に使用される任意の分子であり得て、例えば、小分子、化学品、ペプチド模擬体、抗体、ペプチド、ポリヌクレオチド（例、アンチセンス若しくはリボザイムの分子）、等が含まれる。従って、コンピュータをベースとする薬剤設計により開発される剤が、ＭＰＤの活性若しくは発現の変調に対する剤の活性を決定するための本明細書に記載されるアッセイ及び方法を使用して、実験室で試験され得る。ＭＰＤの変調には、活性又は発現の増加又は減少が含まれる。
【０１１２】
本発明のＭＰＤポリペプチド（断片、変異体、オリゴマー、及び他の形態を含む）は、多種多様なアッセイにおいて有用である。例えば、本発明のＭＰＤポリペプチドは、ＡＤＡＭファミリーポリペプチドのメンバーの結合パートナーを同定するために使用され得て、これはまた、細胞間情報伝達、共刺激、又は免疫細胞活性を変調するためにも使用され得る。他のやり方では、それらは、細胞間情報伝達、共刺激経路、又は免疫細胞活性を変調する、非結合パートナーの分子若しくは物質を同定するために使用され得る。
【０１１３】
ＭＰＤポリペプチドとその断片は、結合パートナーを同定するために使用され得る。例えば、それらは、従来の結合アッセイのような、好適なアッセイにおいて、候補結合パートナーへ結合する能力について試験され得る。例を挙げると、ＭＰＤポリペプチド又はその断片は、検出可能な分子（例、放射性核種、発色団、及び比色若しくは蛍光反応を触媒する酵素、等）で標識化され得る。標識されたポリペプチドを、候補結合パートナーを発現する細胞と接触させる。次いで、細胞を洗浄して未結合の標識ポリペプチドを除去し、標識の性質に従って選択される好適な技術により、細胞に結合した標識の存在が決定される。
【０１１４】
１つの態様では、抗インテグリン抗体の使用により、結合パートナーのインテグリンが同定される。ＭＰＤｄｉｓ−Ｆｃポリペプチドの結合を阻害するインテグリンｍＡｂの能力は、ディスインテグリンドメインがどのインテグリンへ結合するか、そして、間接的に、ディスインテグリンドメインがどのインテグリン結合活性に拮抗し得るかを明らかにする。選択されたインテグリンへ結合するＭＰＤｄｉｓ−Ｆｃポリペプチドは、インテグリン−リガンド相互作用を妨害し、内皮細胞の機能、血管新生、及び他の生物学的活性を ｉｎ ｖｉｔｒｏ 及び ｉｎ ｖｉｖｏ で変調する能力についてさらに試験される。
【０１１５】
結合アッセイのもう１つの例では、候補結合パートナーのｃＤＮＡを含有する組換え発現ベクターをＣＶ１−ＥＢＮＡ−１細胞にトランスフェクトする。この細胞を、例えば、様々な濃度の可溶性ＭＰＤポリペプチド／Ｆｃ融合ポリペプチドと、３７℃で１時間インキュベートする。細胞を洗浄し、一定飽和濃度の１２５Ｉ−マウス抗ヒトＩｇＧとインキュベートする。洗浄後、トリプシン処理により細胞を遊離させる。上記に利用されるマウス抗ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に対して向けられていて、Ｊａｃｋｓｏｎ・Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．、ウェストグローブ、ＰＡから入手され得る。この抗体は、細胞へ結合したＦｃポリペプチドのＦｃ部分へ結合する。細胞に結合した１２５Ｉ−抗体をパッカード・オートガンマ（Ａｕｔｏｇａｍｍａ）カウンターで定量する。
【０１１６】
ＭＰＤポリペプチドが（例えば、受容体−リガンド相互作用において）別のポリペプチドへ結合するか、又は潜在的に結合する場合、ＭＰＤポリヌクレオチドはまた、結合が起こる他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定するか、又は結合相互作用の阻害剤を同定するための、相互作用トラップアッセイ（例えば、Ｇｙｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ７５： ７９１， １９９３ を参照のこと）において使用され得る。これらの結合相互作用に関わるポリペプチドはまた、結合相互作用のペプチド若しくは低分子の阻害剤若しくはアゴニストをスクリーニングするために使用され得る。
【０１１７】
もう１つのタイプの好適な結合アッセイは、競合結合アッセイである。例を挙げると、候補結合パートナーへの結合につい天然のポリペプチドと競合する変異体の能力をアッセイすることによって、変異体の生物学的活性を決定し得る。競合結合アッセイは、慣用の方法論により実施され得る。競合結合アッセイに利用され得る試薬には、放射標識ＭＰＤの断片若しくは変異体と、細胞表面上で（内因性又は組換えの）ＭＰＤを発現するインタクト細胞が含まれる。インタクト細胞の代わりに、（固相上の）ポリペプチドＡ若しくはポリペプチドＧのＦｃ部分との相互作用を介して固相へ結合した可溶性の結合パートナー／Ｆｃ融合ポリペプチドを代用し得る。ポリペプチドＡ及びＧを含有するクロマトグラフィーカラムには、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ．、ピスカタウェイ、ＮＪから供されるものが含まれる。
【０１１８】
ＭＰＤポリペプチドのメタロプロテイナーゼ活性を測定するために、酵素アッセイが使用され得る。例えば、ＭＰＤメタロプロテイナーゼポリペプチドの活性は、蛍光標識化ＭＰＤメタロプロテイナーゼ基質をＭＰＤメタロプロテイナーゼポリペプチドとインキュベートし、蛍光又は蛍光の位置の変化を測定することによって測定され得る。蛍光標識化基質の現像については当技術分野で知られている。
【０１１９】
細胞間情報伝達、共刺激、インテグリン結合、内皮細胞遊走、血管新生、又は免疫細胞活性に対する、ＭＰＤポリペプチド、ＭＰＤ断片、及び抗体の影響は、標的細胞における細胞間情報伝達、共刺激、インテグリン結合、内皮細胞遊走、血管新生、又は免疫細胞活性を誘導、増進、抑制、又は抑止するポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニスト若しくはアンタゴニストと、細胞又は細胞の集団を接触させることによってアッセイされ得る。ＭＰＤポリペプチド、アゴニスト、又はアンタゴニストの同定は、当業者に知られた多種多様なアッセイにより行うことができる。そのようなアッセイに含まれるのは、細胞間情報伝達、共刺激、インテグリン結合、内皮細胞遊走、又は血管新生に影響するＭＰＤポリペプチドの能力を評価するものである。そのようなアッセイには、例えば、ＭＰＤポリペプチド又はその可溶性ディスインテグリン断片の存在下での（例えば、インテグリン関連の結合を介した）細胞−細胞相互作用の分析が含まれる。そのようなアッセイでは、ＭＰＤ配列を有するポリペプチドの存在下での細胞−細胞相互作用、細胞マトリックス相互作用、又はインテグリン関連結合の割合を決定し、そのような結合若しくは相互作用が、例えば可溶性ディスインテグリンＭＰＤ（ＭＰＤｄｉｓ）配列の存在下で変化するかどうかを決定するだろう。本発明のこの側面の例示的なアッセイには、内皮細胞遊走アッセイが含まれる。他のアッセイも当技術分野で知られている。
【０１２０】
もう１つの側面では、本発明は、細胞若しくは培養物に対する、試験剤が細胞−細胞相互作用、細胞−マトリックス相互作用、インテグリン関連結合活性、内皮細胞遊走活性、あるいは細胞若しくは培養物に対する試験剤の血管新生活性に影響を及ぼす能力を検出する方法を提供する。この側面では、本方法は：（１）第一群の標的細胞を、ＭＰＤ配列を含んでなるポリペプチド（例えば、配列番号１〜２７；又は可溶性ＭＰＤディスインテグリンポリペプチド）、ＭＰＤポリペプチドのリガンド若しくは受容体、又はそれらの断片を含んでなるポリペプチドを含む試験剤と、使用される特定アッセイに適した条件の下で、接触させること；（２）標的細胞間での細胞−細胞相互作用、細胞−マトリックス相互作用、インテグリン関連結合活性、内皮細胞遊走活性、又は血管新生活性の正味割合（ｎｅｔ　ｒａｔｅ）を測定すること；及び（３）試験剤の不在下、他の点では第一群の細胞と同一である条件の下で、ＭＰＤポリペプチドリガンド又はその断片を含有する対照細胞の間での細胞−細胞相互作用、細胞−マトリックス相互作用、インテグリン関連結合活性、内皮細胞遊走活性、又は血管新生活性の正味割合を観測することを含む。この態様では、対照細胞における細胞間情報伝達若しくは共刺激の正味割合が、ＭＰＤ分子、並びに試験剤の両方で処理された細胞のそれと比較される。この比較により、ＭＰＤ活性を変調する剤の示標となる、細胞−細胞相互作用、細胞−マトリックス相互作用、インテグリン関連結合活性、内皮細胞遊走活性、又は血管新生活性の正味割合における差異が提供される。試験剤は、細胞−細胞相互作用、細胞−マトリックス相互作用、インテグリン関連結合活性、内皮細胞遊走活性、又は血管新生活性を活性化若しくはアップレギュレートすることによるか、又は阻害若しくはダウンレギュレートすることのいずれかにより、エフェクターとして機能し得る。
【０１２１】
本発明のポリペプチドは、サイトカイン産生若しくは阻害活性、細胞増殖（誘導するか又は阻害する）、又は細胞分化（誘導するか又は阻害する）活性を示し得る。既知のあらゆるサイトカインを含む、今日までに発見された多くのポリペプチド因子は、１つ以上の細胞増殖アッセイにおいて活性を示したので、このアッセイは、サイトカイン活性の簡便な確認法として役立つ。本発明のポリペプチドの活性は、限定されないが、３２Ｄ、ＤＡ２、ＤＡ１Ｇ、Ｔ１０、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ＋（プレＢＭ＋）、２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７ｅ、及びＣＭＫを含む細胞系についての、数多くの定常因子依存型細胞増殖アッセイのいずれかにより裏付けられる。本発明のＭＰＤポリペプチドの活性は、以下の方法により測定され得る：
Ｔ細胞若しくは胸腺細胞の増殖アッセイには、限定されないが、『免疫学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）』Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， 編、Ｐｕｂ．グリーン・パブリッシング・アソシエーツ、及びウィリー−インターサイエンス（第３章、マウス白血球機能の ｉｎ ｖｉｔｒｏ アッセイ ３．１−３．１９；第７章、ヒトの免疫学的試験）；Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７： ３４９４， １９８６； Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５： １７０６， １９９０； Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３３： ３２７， １９９１； Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４９： ３７７８， １９９２； Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２： １７５６， １９９４ に記載されるものが含まれる。
【０１２２】
サイトカイン産生、及び／又は脾臓細胞、リンパ節細胞、又は胸腺細胞の増殖のアッセイには、限定されないが、『免疫学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）』Ｅ． Ｍ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， 編、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、トロント、１９９４の「ポリクローナルＴ細胞刺激（Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）」Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ａ． Ｍ． ａｎｄ Ｓｈｅｖａｃｈ， 第１巻、３．１２．１−３．１２．１４ 頁と、「マウス及びヒトのγ−インターフェロンの測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ γ）」Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ， Ｒ． Ｄ． 第１巻、６．８．１−６．８．８ 頁に記載されるものが含まれる。
【０１２３】
造血及びリンパ生成細胞の増殖及び分化のアッセイには、限定されないが、『免疫学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）』Ｃｏｌｉｇａｎ 編、第１巻、６．３．１−６．３．１２ 頁、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、トロント、１９９１の「ヒト及びマウスのインターロイキン−２及びインターロイキン−４の測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ａｎｄ Ｍｕｒｉｎｅ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ４）」Ｂｏｔｔｏｍｌｙ， ｅｔ ａｌ．，； ｄｅＶｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７３： １２０５， １９９１； Ｍｏｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３６： ６９０， １９８８； Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ８０： ２９３１， １９８３；『免疫学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）』Ｃｏｌｉｇａｎ 編、第１巻、６．６．１−６．６．５ 頁、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、トロント、１９９１の「マウス及びヒトのインターロイキン−６の測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６）」Ｎｏｒｄａｎ， Ｒ．； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ８３： １８５７， １９８６；『免疫学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）』Ｃｏｌｉｇａｎ 編、第１巻、６．１５．１ 頁、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、トロント、１９９１の「ヒトインターロイキン−１１の測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １１）」Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．；『免疫学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）』Ｃｏｌｉｇａｎ 編、第１巻、６．１３．１ 頁、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、トロント、１９９１の「マウス及びヒトのヒトインターロイキン−９の測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ９」Ｃｉａｒｌｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．に記載されるものが含まれる。
【０１２４】
抗原に対するＴ細胞クローン応答のアッセイ（特に、ＡＰＣ−細胞相互作用に影響を及ぼすと共に、Ｔ細胞の影響を導くポリペプチドを、増殖とサイトカイン産生を測定することによって同定する）には、限定されないが、『免疫学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）』Ｃｏｌｉｇａｎ 編、Ｐｕｂ．グリーン・パブリッシング・アソシエーツ、及びウィリー−インターサイエンス（第３章、マウス白血球機能の ｉｎ ｖｉｔｒｏ アッセイ；第６章、サイトカインとその細胞受容体；第７章、ヒトの免疫学的試験）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ６０９１， １９８０； Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． １１： ４０５， １９８１； Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７： ３４９４， １９８６； Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４０： ５０８， １９８８ に記載されるものが含まれる。
【０１２５】
胸腺細胞若しくは脾臓細胞の細胞毒性のアッセイには、限定されないが、『免疫学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）』Ｃｏｌｉｇａｎ 編、Ｐｕｂ．グリーン・パブリッシング・アソシエーツ、及びウィリー−インターサイエンス（第３章、マウス白血球機能の ｉｎ ｖｉｔｒｏ アッセイ、３．１−３．１９ 頁；第７章、ヒトの免疫学的試験）；Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８： ２４８８， １９８１； Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２８： １９６８， １９８２； Ｈａｎｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３５： １５６４， １９８５； Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７： ３４９４， １９８６； Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４０： ５０８， １９８８； Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１： １９９２； Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． Ｉｍｍ． １３３： ３２７， １９９１； Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． １５３： ３７０９， １９９４ に記載されるものが含まれる。
【０１２６】
Ｔ細胞依存性ＩｇＧ応答及びアイソタイプスイッチングのアッセイ（特に、Ｔ細胞依存性抗体応答を変調し、Ｔｈ１／Ｔｈ２プロフィールに影響を及ぼすポリペプチドを同定する）には、限定されないが、Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４４： ３０２８， １９９０； 及び、『免疫学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）』Ｃｏｌｉｇａｎ 編、第１巻、３．８．１−３．８．１６ 頁、ウィリー・アンド・サンズ、トロント、１９９４の「Ｂ細胞機能のアッセイ：ｉｎ ｖｉｔｒｏ 抗体産生（Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｂ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ： Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」Ｍｏｎｄ， Ｊ． Ｊ． ａｎｄ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ， Ｍ． に記載されるものが含まれる。
【０１２７】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）のアッセイ（特に、Ｔｈ１及びＣＴＬの応答を産生するポリペプチドを同定する）には、限定されないが、『免疫学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）』Ｃｏｌｉｇａｎ 編、Ｐｕｂ．グリーン・パブリッシング・アソシエーツ、及びウィリー−インターサイエンス（第３章、マウス白血球機能の ｉｎ ｖｉｔｒｏ アッセイ、３．１−３．１９ 頁；第７章、ヒトの免疫学的試験）； Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， １９８６， 同上； Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， １９８８， 同上；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４９： ３７７８， １９９２ に記載されるものが含まれる。
【０１２８】
樹状細胞依存性アッセイ（特に、天然Ｔ細胞を活性化する樹状細胞により発現されるポリペプチドを同定する）には、限定されないが、Ｇｕｅｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３４： ５３６， １９９５； Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ｏｆ Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７３： ５４９， １９９１； Ｍａｃａｔｏｎｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４： ５０７１， １９９５； Ｐｏｒｇａｄｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ ｏｆ Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８２： ２５５， １９９５； Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７： ４０６２， １９９３； Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４： ９６１， １９９４； Ｍａｃａｔｏｎｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ｏｆ Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６９： １２５５， １９８９； Ｂｈａｒｄｗａｊ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９４： ７９７， １９９４； 及び Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ｏｆ Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７２： ６３１， １９９０ に記載されるものが含まれる。
【０１２９】
リンパ球生存／アポトーシスのアッセイ（特に、超抗原誘導後のアポトーシスを防止するポリペプチドとリンパ球のホメオスタシスを調節するポリペプチドを同定する）には、限定されないが、Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １３： ７９５， １９９２； Ｇｏｒｃｚｙｃａ ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｕｋｅｍｉａ ７： ６５９， １９９３； Ｇｏｒｃｚｙｃａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３： １９４５， １９９３； Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６６： ２３３， １９９１； Ｚａｃｈａｒｃｈｕｋ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５： ４０３７， １９９０； Ｚａｍａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １４： ８９１， １９９３； Ｇｏｒｃｚｙｃａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １： ６３９， １９９２ に記載されるものが含まれる。
【０１３０】
Ｔ細胞拘束及び発生の初期段階に影響を及ぼすポリペプチドのアッセイには、限定されないが、Ａｎｔｉｃａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８４： １１１， １９９４； Ｆｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５５： １１１， １９９４； Ｇａｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８５： ２７７０， １９９５； Ｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ７５４８， １９９１ に記載されるものが含まれる。
【０１３１】
胚性幹細胞分化のアッセイ（特に、胚分化造血作用に影響を及ぼすポリペプチドを同定する）には、限定されないが、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １５： １４１， １９９５； Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． ａｎｄ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １３： ４７３， １９９３； ＭｃＣｌａｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８１： ２９０３， １９９３ に記載されるものが含まれる。
【０１３２】
幹細胞の生存及び分化のアッセイ（特に、リンパ生成−造血を調節するポリペプチドを同定する）には、限定されないが、『造血細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ）』Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｔ ａｌ． 編、巻、２６５−２６８頁、ウィリー−リス社、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．１９９４ の「メチルセルロースコロニー形成アッセイ（Ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ａｓｓａｙｓ）」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｍ． Ｇ．； Ｈｉｒａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： ５９０７−５９１１， １９９２；『造血細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ）』Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｔ ａｌ． 編、巻、２３−２９頁、ウィリー−リス社、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．１９９４ の「高い増殖ポテンシャルを有する始原造血コロニー形成細胞（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｐｒｏｆｅｒａｔｉｖｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）」ＭｃＮｉｅｃｅ， Ｉ． Ｋ． ａｎｄ Ｂｒｉｄｄｅｌ， Ｒ． Ａ．； Ｎｅｂｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ２２： ３５３， １９９４；『造血細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ）』Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｔ ａｌ． 編、巻、１−２１頁、ウィリー−リス社、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．１９９４ の「玉石領域形成細胞アッセイ（Ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ ａｒｅａ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌ ａｓｓａｙ）」Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ ；『造血細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ）』Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｔ ａｌ． 編、巻、１６３−１７９頁、ウィリー−リス社、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．１９９４ の「ストローマ細胞存在下での長期骨髄培養（Ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ）」Ｓｐｏｏｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．；『造血細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ）』Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｔ ａｌ． 編、巻、１３９−１６２頁、ウィリー−リス社、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．１９９４ の「長期培養開始の細胞アッセイ（Ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ａｓｓａｙ）」Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ に記載されるものが含まれる。
【０１３３】
組織生成活性のアッセイには、限定されないが、特許公開番号ＷＯ９５／１６０３５（骨、軟骨、腱）；特許公開番号ＷＯ９５／０５８４６（神経、ニューロン）；特許公開番号ＷＯ９１／０７４９１（皮膚、内皮）に記載されるものが含まれる。創傷治癒活性のアッセイには、限定されないが、Ｗｉｎｔｅｒ，『表皮の創傷治癒（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ）』７１−１１２頁（Ｍａｉｂａｃｈ と Ｒｏｖｅｅ 編）、イヤーブック・メディカル・パブリッシャーズ（Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）社、シカゴ（Ｅａｇｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍｅｒｔｚ， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ ７１： ３８２−８４ （１９７８） による変更）に記載されるものが含まれる。
【０１３４】
アクチビン／インヒビン活性のアッセイには、限定されないが、Ｖａｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ９１： ５６２， １９７２； Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１： ７７９， １９８６； Ｖａｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１： ７７６， １９８６； Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１８： ６５９， １９８５； Ｆｏｒａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３： ３０９１， １９８６ に記載されるものが含まれる。
【０１３５】
細胞の運動及び接着のアッセイには、限定されないが、『免疫学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）』Ｃｏｌｉｇａｎ 編、Ｐｕｂ．グリーン・パブリッシング・アソシエーツ、及びウィリー−インターサイエンス（第６．１２章、α−及びβ−ケモカインの測定、６．１２．１−６．１２．２８）； Ｔａｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９５： １３７０−１３７６， １９９５； Ｌｉｎｄ ｅｔ ａｌ． ＡＰＭＩＳ １０３： １４０， １９９５；Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５： １７４４； Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２： ５８６０， １９９４； Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３： １７６２， １９９４ に記載されるものが含まれる。
【０１３６】
止血及び血栓溶解活性のアッセイには、限定されないが、Ｌｉｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２６： １３１， １９８６； Ｂｕｒｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ． ４５： ４１３， １９８７； Ｈｕｍｐｈｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ５： ７１， １９９１； Ｓｃｈａｕｂ， Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ ３５： ４６７， １９８８ に記載されるものが含まれる。
【０１３７】
受容体−リガンド活性のアッセイには、限定されないが、『免疫学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）』Ｃｏｌｉｇａｎ 編、Ｐｕｂ．グリーン・パブリッシング・アソシエーツ、及びウィリー−インターサイエンス（第７．２８章、静的条件下での細胞接着の測定、７．２８．１−７．２８．２２）； Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ６８６４， １９８７； Ｂｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６８： １１４５， １９８８；Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６９： １４９， １９８９； Ｓｔｏｌｔｅｎｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １７５： ５９， １９９４； Ｓｔｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ８０： ６６１， １９９５ に記載されるものが含まれる。
【０１３８】
カドヘリンの接着及び侵襲サプレッサー活性のアッセイには、限定されないが、Ｈｏｒｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０（３２）： １８８０９， １９９５； Ｍｉｙａｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １１： ２５４７， １９９５； Ｏｚａｗａ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ６３： １０３３， １９９０ に記載されるものが含まれる。
【０１３９】
本発明により提供されるＭＰＤ配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、数多くの診断又は他の有用な目的に使用され得る。本発明のポリヌクレオチド（例えば、配列番号１〜２６若しくは２７をコードするポリヌクレオチド）は、対応するポリペプチドが選好的に発現される組織のマーカーとして、サザンゲル上の分子量マーカーとして、染色体を同定するか又は関連した遺伝子の位置をマップして被検者の内因性ＤＮＡ配列と比較し、潜在的な遺伝障害を同定するための染色体マーカー若しくはタグとして、ハイブリダイズさせることにより新規な関連ポリヌクレオチドを発見するためのプローブとして、遺伝子フィンガープリンティングのためにＰＣＲプライマーを誘導するための情報源として、他の新規核酸を発見する方法において既知のポリヌクレオチドを「取り去る」ためのプローブとして、抗ＤＮＡ抗体を産生させるか又は他の免疫応答を誘発するための抗原として、及び、遺伝子治療に使用され得る。
【０１４０】
プローブとプライマー．開示されるＭＰＤポリヌクレオチド、及びその断片の組合せの使用には、プローブ若しくはプライマーとしての断片の使用がある。一般に、そのような断片は、少なくとも約１７の連続したヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。他の態様では、ＤＮＡ断片は、少なくとも３０、又は少なくとも６０の隣接したヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本変数と好適な条件を設計するための手引きは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９ に示され、上記に詳しく記載されている。遺伝暗号の知識を上記に示されるアミノ酸配列と組合せて使用すれば、縮重オリゴヌクレオチドのセットを調製し得る。そのようなオリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ断片が単離されて同定される、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして有用である。ある種の態様では、縮重プライマーが、非ヒト遺伝子ライブラリーのプローブとして使用され得る。そのようなライブラリーには、限定されないが、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、及び電子的なＥＳＴ（発現配列タグ）若しくはＤＮＡライブラリーさえも含まれる。次いで、この方法により同定される相同配列は、本明細書で同定されるＭＰＤ配列の非ヒト相同体を同定するためのプローブとして使用され得る。
【０１４１】
染色体マッピング．ＭＰＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、これらポリヌクレオチドの開示される断片及び組合せは、既知の技術を使用する当業者により、これらの配列がマップされるヒト染色体を同定するために使用され得る。有用な技術には、限定されないが、オリゴヌクレオチドを含む配列若しくは部分を放射線ハイブリッドマッピング（高い解像度）のような様々な既知技術のプローブとして使用すること、染色体スプレッドへの ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（中位の解像度）、及び個別のヒト染色体を含有するハイブリッド細胞系へのサザンブロットハイブリダイゼーション（低い解像度）が含まれる。以下のウェブサイトは、放射線ハイブリッドマッピングに関する追加の情報を提供する：ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｆｔｐ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｈｕｍａｎ ＳＴＳ ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｊｕｌｙ９７／０７−９７．ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ．
本発明のＭＰＤポリペプチド配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとこれらポリヌクレオチドの開示される断片及び組合せは、ＭＰＤポリペプチドに対応する遺伝子に関連した異常を分析するために使用され得る。これにより、このマーカーが再配置されるか又は欠失されている状態を識別することが可能になる。さらに、本発明のポリヌクレオチド又はその断片は、位置不明の他の遺伝子をマップするための位置マーカーとして使用され得る。このポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドに対応する遺伝子の欠損、又は不十分な量により（直接的又は間接的に）仲介される障害（例、ＭＰＤ関連障害）の治療法を開発するときに使用され得る。本明細書に開示されるポリヌクレオチドと関連配列により、欠陥遺伝子の検出と、正常遺伝子でのその置換が可能になる。欠陥遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 診断アッセイにおいて、この遺伝子の欠陥部分を収容しているか、又はＭＰＤ関連障害を有していることが疑われる被検者に由来する遺伝子の配列と本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列の比較により検出され得る。
【０１４２】
ＭＰＤポリペプチドとそのペプチド断片の使用には、限定されないが、以下のものが含まれる：デリバリー用剤；治療及び研究用の試薬；分子量及び等電点電気泳動のマーカー；ペプチド断片化の対照；未知ポリペプチドの同定；及び抗体の調製。
【０１４３】
本発明のＭＰＤポリペプチド（例、配列番号１〜２６若しくは２７）は、ポリペプチド精製試薬として使用され得る。例えば、ＭＰＤポリペプチドは、固形支持体素材へ付けて、アフィニティークロマトグラフィーによりその結合パートナー（例、インテグリン分子）を精製するために使用され得る。特定の態様では、ポリペプチドを従来の方法により固形支持体へ付ける。１例として、ポリペプチドのアミノ酸側鎖と反応する官能基を含有するクロマトグラフィーカラムが利用可能である（ファルマシア・バイオテク社、ピスカタウェイ、ＮＪ）。あるいは、ＭＰＤ−Ｆｃポリペプチドを、Ｆｃ部分との相互作用により、ポリペプチドＡ−若しくはポリペプチドＧ−含有クロマトグラフィーカラムへ付ける。このポリペプチドはまた、細胞表面上で結合パートナーを発現する細胞を精製するか又は同定することに使用を見出す。ポリペプチドは、カラムクロマトグラフィーマトリックス、又は類似の好適な基質のような固相へ結合される。例えば、磁気ミクロスフェアをこのポリペプチドで被覆して、インキュベーション容器中で磁場により固定し得る。結合パートナー発現細胞を含有する細胞混合物の懸濁液を、このポリペプチドをその上に有する固相と接触させる。細胞表面上で結合パートナーを発現する細胞が固相上のポリペプチドへ結合してから、未結合細胞が洗浄除去される。他のやり方では、ポリペプチドを検出可能な部分へコンジュゲーとさせてから、結合パートナーの発現について試験される細胞とインキュベートし得る。インキュベーションの後で、未結合の標識化物質を除去し、検出可能な部分の細胞上での存在若しくは不在を決定する。
【０１４４】
担体及びデリバリー用剤．本発明のポリペプチドはまた、それへ付けた剤を、同定された結合パートナー（例、インテグリン）を担う細胞へデリバリーするための担体としても使用を見出す。このように、このポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 若しくは ｉｎ ｖｉｖｏ の方法で、診断若しくは治療用の剤をそのような細胞へデリバリーするために使用され得る。ポリペプチドへ付けることができる検出（診断）及び治療用の剤には、限定されないが、毒素、他の細胞毒性剤、薬物、放射性核種、発色団、比色若しくは蛍光反応を触媒する酵素、等が含まれ、意図される応用に従って、特定の剤が選択される。毒素のなかには、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、緑膿菌の外毒素Ａ、リボソーム不活性化ポリペプチド、トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）のような真菌毒素と、それらの誘導体及び断片（例、単鎖）がある。診断使用に適した放射性核種には、限定されないが、１２３Ｉ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、及び７６Ｂｒが含まれる。治療使用に適した放射性核種の例は、１３１Ｉ、２１１Ａｔ、７７Ｂｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、１０９Ｐｄ、６４Ｃｕ、及び６７Ｃｕである。そのような剤は、好適な従来法により、ポリペプチドへ付けることができる。ポリペプチドはアミノ酸側鎖に官能基を含み、これが所望される薬剤の官能基と反応し得て、例えば共有結合を形成する。他のやり方では、ポリペプチド又は剤が、所望される反応性の官能基を産生するか付けるように誘導化され得る。この誘導化は、様々な分子をポリペプチドへ付けるために利用可能な二官能性カップリング試薬（ピアス・ケミカル・カンパニー、ロックフォード、イリノイ）の１つを付けることを含み得る。特に興味深いのは、結合パートナーを発現する細胞をＭＰＤディスインテグリン部分（例、インテグリン）へ標的指向するのに使用され得る、可溶性ＭＰＤディスインテグリンである。そのような可溶性ＭＰＤディスインテグリンは、例えば、ディスインテグリンのコグネイトインテグリンを発現する細胞へ試薬を標的指向するために使用され得る。同様に、そして以下により詳しく論じるように、ＭＰＤポリペプチドに特異的な抗体が、診断若しくは治療用の剤で標識化され、ＭＰＤポリペプチドを発現する細胞へその診断若しくは治療剤を標的指向するために使用され得る。
【０１４５】
ＭＰＤポリペプチドとＭＰＤ断片（例、ディスインテグリン及び／又はメタロプロテイナーゼ活性を有する断片）は、ＡＤＡＭポリペプチド、特にＭＰＤポリペプチドの生物学的活性を ｉｎ ｖｉｔｒｏ 若しくは ｉｎ ｖｉｖｏ の方法で変調するときに利用され得る。本発明に含まれるのは、融合ポリペプチドの断片としてか又は成分として発現されるときに、天然のＭＰＤ活性を含む、天然のＡＤＡＭポリペプチド機能の変調因子として作用するＭＰＤポリペプチドのドメインである。例えば、本発明の実質的に精製されたポリペプチドドメインは、ＭＰＤポリペプチドの内因性結合パートナーへの結合を阻害するために使用され得る。そのような使用は、有効に、ＭＰＤの相互作用を阻止し、ＭＰＤ活性を阻害するだろう。本発明のなおもう１つの側面では、ＭＰＤ結合パートナーの可溶性形態（例えば、可溶性インテグリンドメイン）が、内因性ＭＰＤポリペプチドへ結合し、その活性化を競合的に阻害するために使用される。
【０１４６】
もう１つの態様では、本発明は、インテグリンを有効量のＭＰＤｄｉｓポリペプチドと接触させることを含んでなる、インテグリンのそのリガンドへの結合を阻害し、それによりインテグリンの生物学的活性を阻害する方法へ向けられる。さらに本発明は、有効量のＭＰＤｄｉｓポリペプチドを投与することを含んでなる、内皮細胞の遊走を阻害する方法と血管新生を阻害する方法へ向けられる。ある態様では、ＭＰＤｄｉｓポリペプチドが多量体、好ましくはロイシンジッパー多量体又はＦｃポリペプチドの形態である。あるいは、実質的に精製されたか又は修飾された本発明のＭＰＤポリペプチドを、ＭＰＤポリペプチドと膜結合性ではないＭＰＤ結合パートナーとの相互作用を変調するために投与してもよい。
【０１４７】
ＭＰＤポリペプチドへ結合する抗体は、ＭＰＤポリペプチドの活性を阻害し得て、アンタゴニストとして作用する可能性がある。例えば、ＭＰＤポリペプチドの１つ以上のエピトープ、又は保存されたＭＰＤポリペプチドの変異体又は断片のエピトープへ特異的に結合する抗体が、ＭＰＤ活性を阻害するために使用され得る。「特異的に結合する」とは、ＭＰＤポリペプチド又はその断片への抗体が無関係のポリペプチドとは交差反応しないことを意味する。好ましくは、そのような抗体は、ＡＤＡＭファミリーの他のメンバーと交差反応しない。
【０１４８】
他の側面では、さらに本発明には、高められたディスインテグリン活性が有益である疾患の症状を治療するか又は改善するための、ＭＰＤ活性のアゴニストの使用が含まれる。好ましい側面では、本発明には、ＭＰＤポリヌクレオチド又はその断片、あるいはＭＰＤアミノ酸配列（例、配列番号１〜２６若しくは２７）又はその断片を含んでなるポリペプチドを含んでなる組成物を投与することが伴う。投与は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ の細胞へ、ｅｘ ｖｉｖｏ の細胞へ、ｉｎ ｖｉｖｏ の細胞へ、及び／又は多細胞生物へなされ得る。好ましい治療形態には、ディスインテグリン活性を有するＭＰＤの可溶性形態が含まれる。そのような可溶性ＭＰＤディスインテグリンポリペプチドは、その結合パートナー（例、インテグリン）へ結合し、その結合パートナーに関連した生物学的活性を刺激する。
【０１４９】
本発明のなおもう１つの側面では、組成物が、疾患の治療のために、宿主生物で発現するＭＰＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することを含む。この点で特に好ましいのは、ＭＰＤポリペプチドの異常な（例えば、減少した）内因性活性に関連した機能不全の治療のための、ヒト被検者における発現である。さらに、本発明には、ＭＰＤアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの内因性活性を高めることが見出された化合物を細胞及び／又は生物体へ投与することが含まれる。ＭＰＤポリペプチド活性を高める化合物の１つの例は、ＭＰＤポリペプチドへ結合し、構成的な細胞内シグナル伝達（又は「リガンド模倣」）を引き起こすか、又はＭＰＤポリペプチド活性の天然の阻害剤の結合を妨げることによって、ＭＰＤポリペプチド活性を高めるか又は刺激する抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。
【０１５０】
生物学的経路及び相互作用の多様性及び相互関連性のために、本発明のＭＰＤポリペプチド、断片、変異体、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、及び結合パートナーは、本明細書でさらに記載されるような、細胞−細胞及び細胞−マトリックス相互作用（例、インテグリン仲介性の障害）、内皮細胞遊走、血管新生、炎症、癌、アレルギー、生殖系、神経系、及び血管系の状態に関連した医学的状態及び疾患を治療するのに有用であり得る。使用される治療用の分子若しくは諸分子は、治療される状態の原因と関与する生物学的経路に依存し、ＭＰＤポリペプチドの様々な変異体、アンタゴニスト、及び結合パートナーが類似しているか又は異なる効果を有する可能性のあることを考慮する。例えば、ＭＰＤポリペプチド又はその断片は、ＡＤＡＭ結合パートナーと相互作用し、メタロプロテイナーゼのその基質への活性を妨げることによって、（例えば、ＡＤＡＭファミリーポリペプチドの他のメンバーに由来する）メタロプロテイナーゼのタンパクプロセシング機能のアンタゴニストとして作用する可能性がある。従って、ＭＰＤは、増殖因子、接着タンパク質、及び炎症性因子の放出のような、タンパクプロセシングを変調する可能性がある。
【０１５１】
本明細書に記載される、開示されるＭＰＤポリペプチド、その断片、抗体、組成物、及び組合せ療法は、細菌、ウイルス、又は原生動物感染症、及びそれから生じる合併症を治療する医薬品において有用である。大動脈瘤；動脈炎；血管閉塞；冠動脈バイパス手術の合併症；虚血／再灌流損傷；心臓疾患；心不全；及び心筋梗塞を含む心臓血管障害が、開示されるＭＰＤポリペプチド、その断片、抗体、医薬組成物、又は組合せ療法で治療可能である。さらに、本発明のＭＰＤポリペプチド、その断片、抗体、組成物、及び組合せ療法は、慢性疼痛状態を治療し、様々な内分泌系の障害、胃腸系の状態、生殖泌尿系の障害、及び貧血と血液障害を治療するために使用され得る。
【０１５２】
癌と癌細胞転移を含む細胞増殖障害におけるインテグリン（例、αｖβ３、αｖβ５、β１、β４、α１、α２、α３、α４、α５、及びα６インテグリン）の役割により、本明細書では、様々な血液学的及び腫瘍学的障害を治療するためにＭＰＤポリペプチド、その断片、抗体、組成物、又は組合せ療法を使用するための方法が提供される。例えば、可溶性ＭＰＤディスインテグリンドメインは、急性骨髄性白血病、エプシュタイン−バーウイルス陽性鼻咽喉癌、グリオーマ、結腸、胃、前立腺、腎細胞、子宮頚部及び卵巣の癌、肺癌（ＳＣＬＣ及びＮＳＣＬＣ）を含む様々な形態の癌、さらには癌関連の悪液質、疲労、無力症、悪液質の腫瘍外症候群、及び高カルシウム血症を、インテグリン関連相互作用を変調することによって治療するために使用され得る。
【０１５３】
本発明のポリペプチド、断片、抗体、組成物、又は組合せ療法で治療可能なさらなる疾患は、肉腫、骨肉腫、及び、腺癌（例、乳癌）及び扁平上皮癌のような癌腫を含む固形腫瘍である。可溶性ＭＰＤディスインテグリンドメインの投与は、そのような腫瘍細胞の細胞−細胞及び細胞−マトリックス相互作用を変調し、及び／又は血管新生とそのような腫瘍への血液供給を変調し得る。
【０１５４】
さらに、ＭＰＤポリペプチド、その断片、組成物、又は組合せ療法は、急性骨髄性白血病、慢性若しくは急性リンパ芽球性白血病、及び毛様細胞白血病を含む白血病を治療するのに有用である。ＭＰＤポリペプチド、断片、抗体、組成物、及び組合せ療法で治療され得る、侵襲転移の潜在力を有する他の悪性腫瘍には、多発性骨髄腫と、自己免疫リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、慢性リンパ芽球性白血病、毛様細胞白血病、慢性リンパ性白血病、末梢Ｔ細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、バーキット・リンパ腫、エプシュタイン−バーウイルス陽性Ｔ細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫、ホジキン病、びまん性攻撃性リンパ腫、急性リンパ性白血病、Ｔ−ガンマリンパ増殖疾患、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（即ち、菌状息肉腫）、及びセザリー症候群のような様々なリンパ増殖障害が含まれる。
【０１５５】
少なくとも１つのＭＰＤポリペプチド、その断片、又は抗体、及び１つ以上の抗血管新生因子、又は他の治療剤の組合せ物が被検者へ投与され得る。さらなる治療剤は、ＭＰＤポリペプチド、その断片、又は抗体の投与に先行してか、それと同時か、又はその後で投与され得る。１つ以上の治療剤の使用が特に有利であるのは、治療されている被検者が固形腫瘍を有する場合である。本発明のある態様では、治療は、放射線で哺乳動物を治療することをさらに含む。短距離療法と遠隔療法を含む放射線は、ＭＰＤポリペプチド、断片、抗体、又はＭＰＤ結合パートナー、及び／又は追加の治療剤の投与に先行してか、それと同時か、又はその後で投与され得る。
【０１５６】
ある態様では、本方法には、ＭＰＤポリペプチド、その断片、又は抗体に追加する、アルキル化剤、代謝アンタゴニスト、植物アルカロイドと他の植物由来の化学療法剤、抗腫瘍抗生物質、抗腫瘍酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、白金類似体、副腎皮質抑制剤、ホルモン及び抗ホルモン、抗体、免疫治療剤、放射治療剤、及び生物学的応答調節剤からなる群から選択される１つ以上の治療薬の投与が含まれる。
【０１５７】
ある態様では、本方法には、ＭＰＤポリペプチド、その断片、又は抗体に加えて、シスプラチン、シクロホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、ブレオマイシン、カルボプラチン、フルオロウラシル、５−フルオロデオキシウリジン、メトトレキセート、タキソール、アスパラギナーゼ、ビンクリスチン、及びビンブラスチン、インターロイキン類、インターフェロン類（α、β、又はδ）及びＴＮＦのようなリンホカイン類及びサイトカイン類、クロラムブシル、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾトシン、ダカルバジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ビンデシン、エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、Ｌ−アスパラギナーゼ、ヒドロキシ尿素、メチルヒドラジン、ミトタン、タモキシフェン、フルオキシメステロン、ＩＬ−８阻害剤、アンジオスタチン、エンドスタチン、クリングル５、アンジオポエチン−２又は他のアンジオポエチン−１のアンタゴニスト、血小板活性化因子のアンタゴニスト、塩基性線維芽球増殖因子のアンタゴニスト、並びにＣＯＸ−２阻害剤からなる群から選択される１つ以上の治療薬の投与が含まれる。
【０１５８】
ある態様では、本方法には、ＭＰＤポリペプチド、その断片、又は抗体に追加する、Ｆｌｔ３リガンド（米国特許第５，５５４，５１２号を参照のこと）、ＣＤ４０リガンド（米国特許第５，７１６，８０５号を参照のこと）、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、４−１ＢＢリガンド（米国特許第５，６７４，７０４号を参照のこと）、抗−４−１ＢＢ抗体、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦアンタゴニストとＴＮＦＲ／Ｆｃを含むＴＮＦ受容体アンタゴニスト、Ｔｅｋアンタゴニスト、ＴＷＥＡＫアンタゴニスト、及びＴＷＥＡＫ−Ｒ（米国特許出願６０／１７２，８７８及び６０／２０３，３４７号と、Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５４（６）： １２５３ を参照のこと）、ＴＷＥＡＫ−Ｒ／Ｆｃを含むアンタゴニスト、抗ＶＥＧＦ抗体を含むＶＥＧＦアンタゴニスト、ＶＥＧＦ受容体（Ｆｌｔ１及びＦｌｋ１、又はＫＤＲとしても知られている、ＶＥＧＦ−Ｒ１及びＶＥＧＦ−Ｒ２を含む）アンタゴニスト、ＣＤ１４８（ＤＥＰ−１、ＥＣＲＴＰ、及びＰＴＰＲＪとも呼ばれる。Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． １０： ２１３５−４５， １９９９； 及びＰＣＴ公開番号ＷＯ００／１５２５８，２０００年３月、を参照のこと）結合タンパク質、及びネクチン−３（Ｓａｔｏｈ−Ｈｏｒｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５（１４）： １０２９１， ２０００ を参照のこと；ヒトネクチン−３核酸とポリペプチド配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、それぞれＡＦ２８２８７４とＡＡＦ９７５９７である）アンタゴニストからなる群から選択される、その可溶性形態を含む、１つ以上の治療用ポリペプチドの投与が含まれる。
【０１５９】
ある好ましい態様では、本発明のＭＰＤポリペプチド、その断片、又は抗体が、Ｂｒｏｗｄｅｒ ｅｔ ａｌ． ａｎｄ Ｋｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０： １８７８， ２０００； Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０５ （８）： Ｒ１５， ２０００； Ｂａｒｉｎａｇａ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８： ２４５， ２０００ も参照のこと）により記載されるような「メトロノーム（ｍｅｔｒｏｎｏｍｉｃ）療法」の成分としてか、又はそれと組合わせて使用される。
【０１６０】
本発明は、医療障害、及び特に、ＭＰＤ関連障害に罹患している、被検者、好ましくは哺乳動物の被検者、そして最も好ましくはヒト被検者を治療するための化合物、組成物、及び方法を提供する。そのようなＭＰＤ関連障害には、ＭＰＤ配列を有するポリペプチドとその結合パートナー（例、インテグリン）との結合により（直接的若しくは間接的に）引き起こされるか、又は増悪される状態が含まれる。本開示の目的では、「病気」、「疾患」、「障害」、「医学的状態」、「異常状態」、等という用語は、「医療障害」と交換可能的に使用される。本明細書で使用される「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、及び「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語には、治癒、防止（例えば、予防）、及び緩和若しくは改善の治療が含まれる。そのような治療上の使用では、ＭＰＤポリペプチド及び断片、ＭＰＤポリペプチドをコードするＭＰＤポリヌクレオチド、及び／又は抗体のようなＭＰＤポリペプチドのアゴニスト若しくはアンタゴニストが、必要とする被検者へ、既知の手段により投与され得る。本発明の組成物は、天然のポリペプチド、変異体、誘導体、オリゴマー、及び生物学的に活性な断片のような、本明細書に記載される任意の形態でポリペプチドを含有し得る。特定の態様では、組成物は、可溶性ポリペプチド、又は可溶性ＭＰＤポリペプチド（例、可溶性ＭＰＤディスインテグリンドメイン）を含んでなるオリゴマーを含む。
【０１６１】
本発明の治療若しくは使用の方法を実施する場合、本発明の治療剤の治療有効量が、好ましくはＭＰＤポリペプチドの活性に関連した疾患を治療するか又は改善するために、治療されるべき病気を有する被検者へ投与される。「治療剤」には、限定されないが、任意のＭＰＤポリペプチド、断片、及び変異体；ＭＰＤポリペプチド、断片、及び変異体をコードするポリヌクレオチド；抗体のようなＭＰＤポリペプチドのアゴニスト若しくはアンタゴニスト；ＭＰＤポリペプチド結合パートナー；ＭＰＤポリペプチド、断片、変異体、及び結合パートナーから形成される複合体、等が含まれる。本明細書で使用されるように、「治療有効量」という用語は、意味のある被検者の利益、例えば、関連する医学的状態の治療、治癒、予防、又は改善、又はそのような状態の治療、治癒、予防、又は改善の速度の増加を示すのに十分である医薬組成物若しくは方法のそれぞれの治療剤又は他の有効成分の全体量を意味する。単独で投与される、個別の治療剤若しくは有効成分へ適用される場合、この用語は、その成分だけを意味する。併用して適用される場合、この用語は、組合せて、又は連続的若しくは同時に投与されても、治療効果をもたらす成分の組合せた量を意味する。本明細書で使用されるように、治療剤の「治療有効量を投与する」という用語は、障害の重症度を反映する少なくとも１つの指標において、改善、及び好ましくは持続した改善を誘導するのに十分な量で、及び時間の間、被検者が前記治療剤で治療されることを意味する。改善が「持続している」とみなされるのは、１週間以上離れた少なくとも２つの時で被検者が改善を示す場合である。改善の程度は、徴候若しくは症状に基づいて決定され、決定には、「生活の質（ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　ｌｉｆｅ）」アンケートのような、被検者へ与えられるアンケートが利用され得る。被検者の病気の程度を反映する様々な指標が、治療の量及び時間が十分であるかどうかを判定するために評価され得る。選択される指標（群）のベースライン値を、治療剤の初回用量の投与に先立つ被検者の検査により確定する。好ましくは、ベースライン検査は、初回用量を投与する約６０日以内になされる。治療剤が急性症状を治療するために投与されている場合、初回用量は、損傷が起こってから現実に可能な限りすぐ投与される。改善は、ＭＰＤポリペプチド、断片、抗体、又はＭＰＤ結合パートナーのような治療剤を投与することによって誘導され、そのとき被検者は、選択された指標（群）についてベースラインを上回る改善を示す。慢性状態を治療する場合、この改善の程度は、少なくとも１ヶ月以上、例えば１、２、又は３ヶ月、又はそれより長くか、際限ない期間の間、この医薬品を反復的に投与することによって得られる。急性状態を治療するには、１〜６週間の期間、または単回用量でさえしばしば十分である。被検者の病気の程度は、１つ以上の指標によれば、治療後に改善されたように見える場合もあるが、治療は、同一レベルで、又は低減された用量若しくは頻度で、際限なく継続され得る。治療は、いったん低減されるか又は中止されても、症状が再び現れたならば、元のレベルで再開され得る。
【０１６２】
当業者は、治療される障害の性質及び重症度、被検者の体重、年齢、一般状態、及び以前の病気及び／又は治療、及び投与の経路のような要因に依存して、好適な投与量が変化し得ることを理解されよう。予備用量は動物試験に従って決定され得て、ヒト投与への投与量のスケーリングは、標準投薬試験のような当技術分野で受け入れられた方法に従って実施される。例えば、治療有効量は、はじめは細胞培養アッセイから推定され得る。投与量は化合物の比活性に依存し、定常的な実験法により容易に決定され得る。用量は、毒性を最小化する一方で、細胞培養において決定されるようなＩＣ５０（即ち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む、循環血漿濃度範囲を達成する動物モデルにおいて定式化され得る。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。最終的には、担当医が、それぞれの個別患者を治療するのに用いる本発明のポリペプチドの量を決定する。最初、担当医は、本発明のポリペプチドの低用量を投与し、被検者の反応を観察する。被検者にとって最適な治療効果が得られるまで、本発明のポリペプチドのより高用量が投与される場合があり、その時点で投与量はそれ以上増加されない。本発明の方法を実施するために使用される様々な医薬組成物は、体重ｋｇあたり、約０．０１ｎｇ〜約１００ｍｇ（好ましくは約０．１ｎｇ〜約１０ｍｇ、より好ましくは約０．１マイクログラム〜約１ｍｇ）の本発明のポリペプチドを含有すると考えられる。本発明の１つの態様では、本明細書に開示される様々な医療障害を治療するために、ＭＰＤポリペプチド、断片、抗体、又はＭＰＤ結合パートナーが週に１回投与される。もう１つの態様では、ポリペプチド、断片、抗体、又はＭＰＤ結合パートナーが週に少なくとも２回、そしてもう１つの態様では、週に少なくとも３回注射される。注射される場合、ＭＰＤポリペプチド、断片、抗体、又はＭＰＤ結合パートナーの成人用量での有効量は１〜２０ｍｇ／ｍ２の範囲であり、好ましくは、約５〜１２ｍｇ／ｍ２である。あるいは、均一量が投与される場合があり、その量は５〜１００ｍｇ／用量の範囲であり得る。皮下注射により投与される均一量の代表的な用量範囲は、５〜２５ｍｇ／用量、２５〜５０ｍｇ／用量、及び５０〜１００ｍｇ／用量である。本発明の１つの態様では、ＭＰＤポリペプチド、断片、抗体、又はＭＰＤ結合パートナーを２５ｍｇ／用量で含有するか、又はあるいは、５０ｍｇ／用量で含有する、注射に許容される調製物を投与することによって、本明細書に記載される様々な適応症が治療される。２５ｍｇ若しくは５０ｍｇの用量は、特に慢性状態では、反復的に投与され得る。注射以外の投与の経路が使用される場合、用量は、標準的な医療行為に従って、適正に調整される。多くの事例で、約２５ｍｇ用量のＭＰＤポリペプチド、断片、抗体、又はＭＰＤ結合パートナーを少なくとも３週間の期間に及んで週に１〜３回、又は約５０ｍｇ用量のＭＰＤポリペプチド、断片、抗体、又はＭＰＤ結合パートナーを少なくとも３週間の期間に及んで週に１又は２回注射することによって、被検者の状態の改善が得られる（所望される程度の改善を誘導するにはより長い期間の治療が必要となる場合がある）。難治性の慢性状態では、治療方式が際限なく続けられる場合があり、被検者の医師により必要とみなされた場合は、用量や頻度に対して調整がなされる。上記の用量は、１８歳以上の人である成人被検者への例である。小児被検者（４〜１７歳）では、好適な治療方式は、週１回以上の皮下注射により投与される、０．４ｍｇ／ｋｇ、最大用量２５ｍｇまでのＭＰＤポリペプチド、断片、抗体、又はＭＰＤ結合パートナーの皮下注射を伴う。ＭＰＤポリペプチドに対する抗体がＭＰＤポリペプチドアンタゴニストとして使用される場合、好ましい用量範囲は０．１〜２０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇである。抗ＭＰＤポリペプチド抗体のもう１つの好ましい用量範囲は、０．７５〜７．５ｍｇ／体重ｋｇである。ヒト化抗体が好ましい。そのような抗体は、静脈内で注射されるか又は投与され得る。
【０１６３】
本発明のＭＰＤポリペプチド（限定されないが、組換え及び非組換えの供給源を含む、どんな供給源からも誘導される）の有効量を、生理学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤のような他の成分と共に含んでなる組成物が本明細書に提供される。「薬学的に許容される（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ）」という用語は、有効成分の生物学的活性の有効性に干渉しない無毒の物質を意味する。投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、及び、製剤をレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る、水性及び非水性の無菌注射溶液剤；及び、懸濁剤若しくは増粘剤を包含し得る水性及び非水性の無菌懸濁液剤が含まれる。ポリペプチドは、薬学的に有用な組成物を調製するために使用される既知の方法に従って製剤化され得る。それらは、単一の活性材料としてか又はある既定の適応症に適した他の知られた活性材料とともに、製剤的に許容される希釈剤（例、生理食塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、及びリン酸緩衝化溶液）、保存剤（例、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、乳化剤、可溶化剤、アジュバント、及び／又は担体と混合して組合せられ得る。医薬組成物に適した製剤には、『レミントン製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）』１６版、１９８０、マック・パブリッシング・カンパニー、イーストン、ＰＡに記載されるものが含まれる。ある態様では、吸着又は摂取を促進するために、ポリペプチドがペジレーション（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）を受ける場合がある。例えば、そのような組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合され得るか、又はポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、デキストラン、等のような高分子化合物へ取込まれ得るか、又はリポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単層若しくは多層の小胞、赤血球ゴースト、又はスフェロブラストへ取込まれ得る。リポソーム製剤に適した脂質には、限定されないが、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸、等が含まれる。そのようなリポソーム製剤の調製は、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，８３７，０２８号；及び米国特許第４，７３７，３２３号に開示されるように、当技術分野の技術レベル内にあり、これらはいずれも参照により本明細書に援用される。そのような組成物は、物理状態、溶解度、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ 放出速度、ｉｎ ｖｉｖｏ クリアランス速度に影響を及ぼすので、担体の特徴が選択される投与経路に依存するように、意図される適用に従って選択される。本発明の１つの好ましい態様では、ＭＰＤポリペプチドの持続放出形態が使用される。開示される方法での使用に適した持続放出形態には、限定されないが、（局所適用ヒドロゲルを含む）そのようなポリマーと混合される（米国特許第６，０３６，９７８号に記載されるアルギン酸塩ミクロ粒子のような）遅溶解性の生体適合性ポリマーに被包化されているか、又は生体適合性半浸透性インプラントに封入されているＭＰＤポリペプチドが含まれる。
【０１６４】
本発明のＭＰＤポリペプチドは、多量体（例、ヘテロ二量体若しくはホモ二量体）、又はそれ自身か他のポリペプチドとの複合体において活性であり得る。結果として、本発明の医薬組成物は、そのような多量体若しくは複合体の形態で本発明のポリペプチドを含み得る。本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチド（群）の複合体の形態であり得る。さらに本発明には、ＭＰＤポリペプチド、断片、抗体、又はＭＰＤ結合パートナーの、同一の被検者へ投与される１つ以上の他の薬物（それぞれの薬物はその医薬品に適した治療方式に従って投与される）との同時投与が含まれる。「同時投与」には、組合せ物の成分を用いた同時若しくは連続の治療、並びに、薬物が変更されるか、又は１つの成分が長期に投与され、他の成分が間欠的に投与される治療方式も含まれる。成分は、同一又は別個の組成物において、及び、同じか又は異なる投与経路により投与され得る。本発明の医薬組成物に含まれ得る成分の例は、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、及びエリスロポエチンのような、サイトカイン類、リンホカイン類、又は他の造血因子である。さらに医薬組成物は、ポリペプチドの活性を亢進させるか、又は治療におけるその活性若しくは使用を補填する他の剤を含有し得る。そのような追加の因子及び／又は剤は、本発明のポリペプチドとの相乗効果をもたらすか、又は副作用を最小化するために、医薬組成物に含まれる場合がある。逆に、本発明のＭＰＤポリペプチド、断片、抗体、又はＭＰＤ結合パートナーが、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解若しくは抗血栓溶解因子、又は抗炎症剤の副作用を最小化するために、特定のサイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解若しくは抗血栓溶解因子、又は抗炎症剤のある製剤に含まれる場合がある。同時に投与される薬物のさらなる例には、限定されないが、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛薬、コルチコステロイド、炎症性サイトカインのアンタゴニスト、非ステロイド性抗炎症剤、ペントキシフィリン、サリドマイド、及び、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、硫酸ヒドロキシクロロキン、メトトレキセート、レフルノミド、ミノサイクリン、ペニシラミン、スルファサラジン、及び（経口金、金チオリンゴ酸ナトリウム及びアウロチオグルコースのような）金化合物のような疾患改善抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）が含まれる。さらに、ＭＰＤポリペプチド、断片、抗体、又はＭＰＤ結合パートナーは、第二のＭＰＤポリペプチド、ＭＰＤポリペプチドに対する抗体、又はネーティブなＭＰＤポリペプチドの競合阻害剤として作用するＭＰＤポリペプチド誘導化ペプチドと組合され得る。
【０１６５】
ＭＰＤポリヌクレオチドを含んでなる組成物を含む、ＭＰＤポリペプチド、断片、抗体、又はＭＰＤ結合パートナーを治療的に投与するために、任意の有効な投与経路が使用され得る。非経口投与には、例えば、関節内、静脈内、筋肉内、病巣内、腹腔内、又は皮下の経路を介した、ボーラス注射又は連続注入による注射が含まれる。他の経路には、例えば疾患若しくは損傷の部位での局所投与が含まれる。他の好適な投与の手段には、インプラントからの持続放出；エアゾール吸入及び／又は通気；点眼；膣若しくは直腸の坐剤；頬内調製物；丸剤（ｐｉｌｌ）、シロップ剤、トローチ剤、又はチューイングガムを含む経口調製物；及び、ローション剤、ゲル剤、スプレー剤、軟膏剤、又は他の好適な技術のような局所調製物が含まれる。あるいは、ＭＰＤポリペプチド、断片、抗体、又はＭＰＤ結合パートナーは、このポリペプチドを発現する細胞を埋め込むことによって（例えば、ＭＰＤポリペプチド、断片、抗体、又はＭＰＤ結合パートナーを発現する細胞を埋め込むことによって）デリバリーされ得る。細胞はまた、そのような細胞において増殖するか、又は所望される効果若しくは活性を産生するために、本発明のポリペプチドの存在下、ｅｘ ｖｉｖｏ で培養され得る。次いで、処置された細胞を、治療目的のために ｉｎ ｖｉｖｏ で導入し得る。もう１つの態様では、ＭＰＤポリペプチド、断片、抗体、又はＭＰＤ結合パートナーをコードするポリヌクレオチドを用いた ｉｎ ｖｉｖｏ 若しくは ｅｘ ｖｉｖｏ トランスフェクションにより、ＭＰＤポリペプチド、断片、抗体、又はＭＰＤ結合パートナーを産生するように、被検者自身の細胞が誘導される。このポリヌクレオチドは、例えば、ＭＰＤポリペプチド、断片、抗体、又はＭＰＤ結合パートナーをコードする裸のＤＮＡ若しくはリポソーム被包化ＤＮＡを注射することによるか、又は他のトランスフェクションの手段により、被検者の細胞へ導入され得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、（限定されないが、ウイルスベクターの形態も含まれる）細胞若しくは生物への核酸の導入について知られている他の方法により被検者へ投与され得る。
【０１６６】
本発明のＭＰＤポリペプチド、その断片、抗体、又は結合パートナーの治療有効量が経口投与される場合、ポリペプチドは、典型的には、錠剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、又はエリキシル剤の形態であり得る。錠剤の形態で投与される場合、本発明の医薬組成物は、ゼラチンのような固形担体か、又はアジュバントを追加的に含有し得る。錠剤、カプセル剤、及び散剤は、約５〜９５％の本発明のポリペプチド、好ましくは約２５〜９０％の本発明のポリペプチドを含有する。液体の形態で投与される場合、水、石油、落花生油、鉱油、ダイズ油、又はゴマ油のような動物若しくは植物起源の油、又は合成油が追加され得る。医薬組成物の液体形態は、さらに、生理食塩水溶液、デキストロース又は他の糖の溶液、又はエチレングリコール、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコールのようなグリコールを含有する場合がある。液体の形態で投与される場合、医薬組成物は、約０．５〜９０重量％の本発明のポリペプチド、好ましくは約１〜５０％の本発明のポリペプチドを含有する。
【０１６７】
本発明のＭＰＤポリペプチド、断片、抗体、又は結合剤の治療有効量が静脈内、皮膚、又は皮下の注射により投与される場合、ポリペプチドは、発熱物質フリーの、非経口的に許容される水溶液の形態である。ｐＨ、等張性、安定性、等を当然考慮する、そのような非経口的に許容されるポリペプチド溶液の調製は、当技術分野の技量内にある。静脈内、皮膚、又は皮下注射に好ましい医薬組成物は、本発明のポリペプチドに加えて、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、デキストロース注射剤、デキストロース及び塩化ナトリウム注射液、乳酸リンゲル注射剤、又は当技術分野で知られている他の担体のような等張の担体を含有すべきである。本発明の医薬組成物はまた、安定化剤、保存剤、緩衝剤、抗酸化剤、又は当業者に知られている他の添加剤を含有し得る。本発明の医薬組成物を使用する静脈内療法の期間は、治療される疾患の重症度とそれぞれの個別被検者の状態と潜在的な特異体質応答に依存して変化する。本発明のポリペプチドの各適用の期間は、連続的な静脈内投与の１２〜２４時間の範囲にあると考慮される。最終的には、担当医が静脈内療法の適正な期間について決定する。
【０１６８】
組織の修復若しくは再生に有用である本発明の組成物では、治療法には、発熱物質フリーの生理学的に許容される組成物の形態を、局所に、全身に、局部に、又はインプラント若しくはデバイスと一緒に投与することが含まれる。さらに、組成物は、望ましくは、デリバリー用の粘稠な形態で組織損傷部位へ被包化又は注射され得る。さらなる有用な剤も、上記のように、場合により組成物に含まれ得るか、又は本発明の方法で組成物と同時に又は連続的に投与され得る。組成物には、ポリペプチド含有組成物を組織損傷部位へデリバリーすることを可能にし、発達する組織へある構造を提供し、体内へ吸収されることを最適に可能にするマトリックスが含まれ得る。マトリックス材料の選択は、生体適合性、生物分解性、機械特性、美容的外観、及び界面特性に基づく。組成物の潜在的なマトリックスには、硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びポリ無水物が含まれる。他の潜在的なマトリックスは、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、又は他のセラミックスのように、非生物分解性で化学的に定義される。マトリックスは、ポリ乳酸とヒドロキシアパタイト、又はコラーゲンとリン酸三カルシウムのように、上記のタイプの材料の組合せから構成され得る。進行は、例えば、Ｘ線、組織形態計測決定、及びテトラサイクリン標識化による、組織／骨の増殖及び／又は修復の定期的な評価によりモニターされ得る。
【０１６９】
ＭＰＤポリペプチド、断片、抗体、又はＭＰＤ結合パートナーを含んでなる組成物は、ヒト被検者に加えて、ペット（イヌ、ネコ、トリ、霊長類、等）、家畜動物（ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、トリ、等）のような非ヒト動物の病的状態の治療に有用である。そのような事例では、適正な用量が動物の体重に従って決定され得る。例えば、０．２〜１ｍｇ／ｋｇの用量が使用され得る。他のやり方では、用量が動物の体表面積に従って決定され、例示的な用量は、０．１〜２０ｍｇ／ｍ２、又はより好ましくは、５〜１２ｍｇ／ｍ２である。イヌ又はネコのような小動物では、好適な用量は０．４ｍｇ／ｋｇである。１つの態様では、ＭＰＤポリペプチド、断片、抗体、又はＭＰＤ結合パートナー（好ましくは、被検者と同じ種から導かれる遺伝子から構築される）が、動物の状態が改善するまで、注射又は他の好適な経路により週１回以上投与されるか、又はそれが際限なく投与され得る。
【０１７０】
本発明はまた、ＭＰＤポリペプチド、断片、及び変異体；ＭＰＤポリペプチド、断片、及び変異体をコードするポリヌクレオチド；抗体のような、ＭＰＤポリペプチドのアゴニスト若しくはアンタゴニスト；ＭＰＤポリペプチド結合パートナー；ＭＰＤポリペプチド、断片、変異体、及び結合パートナーから形成される複合体、等の、疾患若しくは障害を予防するか又は治療的に処置するための医薬品の製造における使用に関する。
【０１７１】
本発明によりさらに含まれるのは、１つ以上のＭＰＤポリペプチド、コードする核酸、及び対応する遺伝子を同定すること、及び／又は特性決定することを含んでなる、ＭＰＤポリペプチドを分析するためのシステム及び方法（これらのシステム及び方法は、好ましくは１つ以上のＭＰＤ分子のセットを表すデータセットを含んでなる）、又はその使用である。従って、本発明は、配列番号１〜２６又は２７に示されるような配列を含んでなるポリペプチドからなる群から選択されるメンバー；及び、前記配列の少なくとも１つが配列番号１〜２７に示されるような配列を含む、ポリペプチド配列のセットをその上に保存したコンピュータ読取り可能な媒体を提供する。
【０１７２】
本発明の１つの態様は、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドを分析するために計算環境と選択的に実行される複数のアルゴリズムを含む。ＡＤＡＭポリペプチドの分析の例には、限定されないが、セット中のポリペプチドのアミノ酸配列を表示すること、セット中のあるポリペプチドのアミノ酸配列をセット中の別のポリペプチドのアミノ酸配列と比較すること、セット中のポリペプチドの構造を予測すること、セット中のポリペプチドをコードする核酸のヌクレオチド配列を決定すること、及びセット中のポリペプチドに対応する遺伝子を同定することが含まれる。
【０１７３】
他に定義されなければ、本明細書で使用されるすべての技術及び科学の用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に提供される見出し及び小見出しは、いずれも読解を容易にするためだけのものであって、本発明を制限すると解釈されてはならない。本明細書で「使用される「ａ」、「ａｎ」（不定冠詞）と「ｔｈｅ」（定冠詞）は、文脈が明らかに単数形を指示することがなければ、複数を含むことを意味する。本明細書に記載されるものと類似若しくは同等の方法及び材料が本発明の実施若しくは試験に使用されうるが、好適な方法及び材料は以下に記載される。本明細書に言及されるあらゆる出版物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、そのまま参照により本明細書に組み込まれる。法的抵触の場合、諸定義を含む本明細書が、それを調整するだろう。さらに、材料、方法、及び実施例は例示のためであって、（本発明を）制限するためのものではない。以下の実施例は特定の態様を例示するものであって、本発明の範囲を制限しない。
【０１７４】
【実施例】
実施例１：ＭＰＤポリペプチドの同定
ヒトゲノムによりコードされることが予測されるアミノ酸配列を含有するデータセットを、Ｃｅｌｅｒａ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ロックビル、メリーランド）から受け取った。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用してこのデータセットを検索し、ＡＤＡＭファミリーポリペプチドを同定した。図１に示されるポリペプチドを、ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドを包含する、メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンポリペプチドへの実質的な相同性を有するものとして同定した。
【０１７５】
実施例２：ＲＡＣＥ分析
ＭＰＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ｃＤＮＡエンドの迅速増幅（ＲＡＣＥ）分析により同定する。すべてのＲＡＣＥ産物をベクターへクローン化し、配列決定する。ＲＡＣＥ産物の配列分析により、実質的に同一な配列を有する多数のクローンが提供される。ＲＡＣＥ分析キットは、Ｒｏｃｈｅ・Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｓｙｓｔｅｍｓを含む多数の企業から利用可能である。ＲＡＣＥ産物比較により見出されたコンセンサス配列に基づいて、プライマーを設計した。
【０１７６】
図１のポリペプチド配列から逆転写されたヌクレオチドを含んでなるプライマー対を使用して、リンパ節細胞、骨髄細胞、並びに当技術分野で知られている他の細胞型からのｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲ増幅する。生じたＰＣＲ産物をクローン化し、標準プロトコールを使用して配列決定する。
【０１７７】
図１に提供されるＭＰＤ配列の分析は、すべての配列が、ＡＤＡＭファミリーのポリペプチドのメンバーを含む、メタロプロテイナーゼ及び／又はディスインテグリン含有タンパク質への相同性を含有することを示す。例えば、配列番号４〜５、１０、１４、２１〜２２、及び２５〜２６は、それぞれ、残基２０８ないし２１９、１５ないし２６、２２９ないし２４０、５５５ないし５６６、３ないし１４、２６９ないし２８０、及び１５４ないし１６５で、配列ＨｅｘＧＨｘｘＧｘｘＨＤ（配列番号２８）を含む。配列番号２４は、保存されたＨｅｘＧＨｘｘＧｘｘＨＤモチーフへの実質的な同一性を有する配列を含む。従って、配列番号４、５、１０、１４、２１、２２、２４、２５、又は２６を含んでなるポリペプチドは、メタロプロテイナーゼ活性を有すると予測される。配列番号４、８、１０、１４、１８〜１９、２１、及び２５、並びにいくつかの既知メタロプロテイナーゼは、ＬＮＩｘ（Ｉ／Ｖ）（Ａ／Ｖ）ＬＶＧＬＥ（Ｖ／Ｉ）ＷＴを含んでなる配列への相同性を共有するので、配列番号４、８、１０、１４、１８〜１９、２１、及び２５を含んでなるポリペプチドは、メタロプロテイナーゼ活性を有すると予測される。本発明はまた、ＴＭＤＣ　ＩＩＩ、ＴＭＤＣ　ＩＶＡ、及びＴＭＤＣ　ＩＶＣを含む、精巣メタロプロテイナーゼ様、ディスインテグリン様、システインリッチ（ＴＭＤＣ）タンパク質ファミリーへの高度の相同性を有する配列番号２、３、７、９、１７、２０、及び２７を提供する。上記の表１は、本発明の代表的なポリペプチドの、ＴＭＤＣタンパク質ファミリーメンバーとの相対的な同一性を示す。
【０１７８】
ＴＭＤＣファミリーメンバーへの相同性を有する上記の配列だけでなく、図１の多数のポリペプチドは、ＡＤＡＭ（ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ）ファミリーのタンパク質への相同性を有する。そのようなポリペプチドには、高度に保存されたＨＥｘＧＨｘｘＧｘｘＨＤモチーフ（配列番号２８）及び／又はＬＮＩｘ（Ｉ／Ｖ）（Ａ／Ｖ）ＬＶＧＬＥ（Ｖ／Ｉ）ＷＴモチーフ（配列番号２９）を有することで特徴づけられる、メタロプロテイナーゼドメインが含まれる。例えば、配列番号４，１０、１４，２１、２５、及び２６は、ほぼ配列番号４の６５ないし２７４；配列番号１０の２４ないし２３５；配列番号１４の８５ないし２９０；配列番号２１の２０２ないし４１１；配列番号２５の１２３ないし３３２；及び配列番号２６の１１８ないし２１５のアミノ酸残基配列を含む。
【０１７９】
図１の多数のポリペプチドは、配列ＣＧＮ（Ｇ／Ｋ）ｘ（Ｌ／Ｖ）（Ｅ／Ｄ）ｘ（Ｇ／Ｎ）ＥＥＣＤＣＧ（配列番号３０）（本明細書では、以下、「ＣＧＮ−ＧＥＥＣ」モチーフ）を有する保存されたモチーフを含有することで典型的に特徴づけられるディスインテグリンドメイン配列への相同性を有する。例えば、配列番号４、１０、１４、２１、及び２４〜２６は、ＣＧＮ−ＧＥＥＣモチーフを含有するので、配列番号４、１０、１４、２１、２４、２５、又は２６を含んでなるポリペプチドは、ディスインテグリン活性を有すると予測される。配列番号１１は、残基４３ないし５７に推定ＣＧＮ−ＧＥＥＣ配列を有するので、配列番号１１を含んでなるポリペプチドは、ディスインテグリン活性を有すると予測される。さらに、ＡＤＡＭファミリーのタンパク質は、そのディスインテグリン及びシステイン−リッチドメインに多数の保存されたシステイン残基を有するものとして特徴づけられる。例えば、配列番号６、８、１２、１３、１６、及び２３を多数のＡＤＡＭファミリーメンバー（例えば、ＡＤＡＭ９（受託番号００３８０７））と並列させると、そのようなＡＤＡＭファミリーメンバーのディスインテグリンドメイン中にある保存されたシステイン残基が同じ位置に並ぶ。上記の表２は、本発明のポリペプチドのいくつかのドメインを特徴づける相関するドメイン及び残基の概要を提供する。
【０１８０】
ＭＰＤポリペプチド配列の変異体は、本明細書に提供される配列に基づいて同定され得る。ＭＰＤアミノ酸配列に対するアミノ酸の置換と他の変化（欠損、挿入、等）は、それが図１に示されるようなアミノ酸配列の保存された残基へ変化をもたらし、そして特にその変化が（脂肪族残基−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、又はＶａｌのいずれか１つを別の脂肪族残基で置換することのように）類似構造のアミノ酸を置換するのでなければ、ＭＰＤポリペプチド活性を変化させるか又は破壊する可能性がより高いと予測される。逆に、ＭＰＤアミノ酸配列に対して、他のＭＰＤポリペプチド配列の１つに由来する、並列のその位置での残基の置換をもたらす変化がなされるならば、そのような変更が変化したＭＰＤポリペプチドの機能に影響を及ぼす可能性はより少ないだろう。
【０１８１】
実施例３：本発明のポリペプチドへ結合するモノクローナル抗体
米国特許第４，４１１，９９３号に記載されるような慣用技術を使用して、実質的に精製されたＭＰＤポリペプチドを使用して、それと免疫反応するモノクローナル抗体を産生することができる。完全フロイントアジュバントで乳化したＭＰＤポリペプチド免疫原でマウスを免疫化し、１０〜１００μｇの範囲の量で皮下又は腹腔内に注射する。１０〜１２日後、この免疫化マウスを、不完全フロイントアジュバントで乳化した追加のＭＰＤポリペプチドで追加免疫する。その後、１週〜２週に１回の免疫化スケジュールで、マウスを定期的に追加免疫する。後眼窩出血又は尾先端切除により血清サンプルを定期的に採取し、ドットブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定）、又はＭＰＤポリペプチドのＭＰＤポリペプチド結合パートナーへの結合の阻害により、ＭＰＤポリペプチド抗体を試験する。
【０１８２】
適正な抗体力価の検出後、ポジティブ動物に、ＭＰＤポリペプチド／生理食塩水の静脈内注射を最後に１回与える。３〜４日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を採取し、脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞系、例えばＮＳ１、又は好ましくはＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１５８０）へ融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が産生され、これを、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）選択培地のマルチプル・マイクロタイタープレートで培養する。
【０１８３】
ハイブリドーマ細胞を、Ｅｎｇｖａｌｌ ｅｔ ａｌ．， （Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ． ８： ８７１， １９７１） 及び米国特許第４，７０３，００４号に開示される技術の適用により、実質的に純粋なＭＰＤポリペプチドに対する反応性についてＥＬＩＳＡで選択する。好ましいスクリーニング技術は、Ｂｅｃｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， （Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４４： ４２１２， １９００） に記載される抗体捕捉技術である。ポジティブなハイブリドーマ細胞を同系ＢＡＬＢ／ｃマウスへ腹腔内注射し、高濃度の抗ＭＰＤモノクローナル抗体を含有する腹水を産生し得る。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、様々な技術によりフラスコ若しくはローラーボトルにおいて ｉｎ ｖｉｔｒｏ で増殖させ得る。マウス腹水中に産生されるモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿に次いで、ゲル排除クロマトグラフィーにより精製され得る。他のやり方では、ポリペプチドＡ若しくはポリペプチドＧへの抗体の結合に基づいたアフィニティークロマトグラフィーが、ＭＰＤポリペプチドへの結合に基づいたクロマトグラフィーと同じように使用され得る。
【０１８４】
実施例４：染色体マッピング
ＰＣＲをベースとするマッピング戦略を使用して、ＭＰＤポリペプチドに対応する遺伝子をマップする。実施例８に記載されるようなＭＰＤ特異的ＰＣＲプライマーとＢＩＯＳ　ラボラトリーズ（ニューへーヴン、ＣＴ）からのＢＩＯＳ体細胞ハイブリッドＰＣＲ可能ＤＮＡキットを、製造業者の指示に従って使用して、最初のヒト染色体帰属（ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ）を行う。Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ ４ 放射線ハイブリッドパネル（リサーチジェネティクス、ハンツビル、ＡＬ）（例えば、Ｗａｌｔｅｒ， ＭＡ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７： ２２−２８， １９９４ を参照のこと）を使用して、より詳細なマッピングを実施する。次いで、この分析からのデータを、ＭＩＴ放射線ハイブリッドマッパー（Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｈｙｂｒｉｄ Ｍａｐｐｅｒ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｒｈｍａｐｐｅｒ．ｐｌ）へ、そこに含まれる指示に従って、電子的に提示する。この分析から特定の遺伝子マーカー名称が産まれ、これをＮＣＢＩ：（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅｍａｐ）へ電子的に提示すると、特定の染色体間隔が産生される。
【０１８５】
実施例５：角膜ポケットアッセイにおけるＭＰＤ−ディスインテグリンポリペプチドの活性
Ｆｃへ融合したＭＰＤディスインテグリンドメイン（ＭＰＤｄｉｓ−Ｆｃポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを構築するために、例えば、配列番号６；ほぼ残基４３ないし１４８の配列番号６；ほぼ残基１ないし３６６の配列番号８；ほぼ残基３８ないし３６６の配列番号８；配列番号１１；配列番号１３；ほぼ残基１ないし６２２の配列番号１４；ほぼ残基８４ないし６２２の配列番号１４；ほぼ残基２９９ないし６２２の配列番号１４；配列番号１６；ほぼ残基１ないし７０１の配列番号２１；配列番号２３；配列番号２４；ほぼ残基２７８ないし４３５の配列番号２４；ほぼ残基１ないし６２７の配列番号２５；配列番号２６；又はほぼ残基２２４ないし３８３の配列番号２６のアミノ酸残基のようなディスインテグリンドメインをコードし、ＣＧＮ−ＧＥＥＣ配列から始まり、膜貫通ドメインを示唆する疎水性配列の前で終わる核酸を、Ｆｃポリペプチドをコードする核酸配列へ融合する。この構築体は、シグナルペプチダーゼによりＣ末端Ｇ（グリシン）アミノ酸の後で切り離されるｉｇＫａｐｐａリーダーを使用し得る。従って、この分子の可溶形態は、この残基の後から始まると予測される。制限部位のコドンに対応する数個の残基は、ディスインテグリンドメインをＦｃドメインへ連結させるために使用されるディスインテグリンドメインのいずれかの末端に存在し得る。
【０１８６】
マウス角膜ポケットアッセイは、ＭＰＤｄｉｓ−Ｆｃポリペプチドによる血管新生の阻害を ｉｎ ｖｉｖｏ で定量化するために使用される。このアッセイでは、血管新生若しくは抗血管新生の活性について試験される剤がハイドロン（ｈｙｄｒｏｎ）ペレット中に徐放性形態で固定化され、麻酔されたマウスの角膜上皮中に創出されるマイクロポケットへ埋め込まれる。血管形成された角膜縁から正常に無血管角膜への増殖における血管の外観、密度、及び程度として血管形成を測定する。
【０１８７】
Ｋｅｎｙｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｍｏｌ． ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７： １６２５， １９９６ に記載されるようなハイドロンペレットは、スクラルファートを、ｂＦＧＦ（９０ｎｇ／ペレット）、ｂＦＧＦ及びＩｇＧ（１１μｇ／ペレット、対照）、又はｂＦＧＦと、ある濃度範囲の試験される剤（例えば、ＭＰＤｄｉｓ−Ｆｃポリペプチド）とともに取込む。このペレットを、６〜８週齢の雄Ｃ５７ＢＬマウスの後角膜縁に対して１ｍｍ内側でのマイクロ切開により創出した角膜固有質マイクロポケットへ外科的に埋め込む。５日後、ｂＦＧＦへの新血管形成応答のピーク時に、Ｚｅｉｓｓスリットランプを使用して、ペレットを含有する角膜経線の極軸から３５〜５０°の初期角度で角膜を写真撮影する。映像をデジタル化し、減法混色フィルター（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ４．０）により処理し、ヘモグロビン含量により、構築された微小血管の輪郭を描く。映像分析ソフトウェア（バイオクォント、ナッシュビル、ＴＮ）を使用して、血管形成されている角膜映像の分画、血管形成領域中の血管密度、及び全角膜内の血管密度を計算する。ｂＦＧＦ誘導性角膜血管新生の阻害を、ＭＰＤディスインテグリン−Ｆｃポリペプチドの用量の関数として決定する。
【０１８８】
実施例６：マウス移植モデルにおけるＭＰＤディスインテグリンポリペプチドによる新血管形成の阻害
あるマウスドナーから他の遺伝的に類似したマウスの耳の皮膚へ異所的に移植された心臓組織が生存するには、心筋機能の生存及びエネルギーを高めるために、移植された心臓と周囲の組織による十分な新血管形成が必要とされる。移植部位での不十分な血管構造は、この心臓への過度の虚血、組織損傷、及び、組織の生着の失敗を引き起こす。内皮細胞遊走及び血管形成に関与する因子に拮抗する剤は、移植部位での血管新生を減少させることにより、移植片の機能、最終的には生着そのものを制限する。マウス異所性心臓同種移植モデルを使用して、新血管形成に対するＭＰＤｄｉｓ−Ｆｃポリペプチドのアンタゴニスト効果を判定する。
【０１８９】
雌ＢＡＬＢ／ｃ（約１２週齢）レシピエントへ、同系のドナーマウス由来の新生心臓移植片を与える。０日目に、ドナー心臓組織をレシピエントの左耳介へ移植し、このマウスを２つの群へ分ける。対照群にはヒトＩｇＧ（Ｈｕ　ＩｇＧ）を、他の群にはＭＰＤｄｉｓ−Ｆｃを、いずれも腹腔内に与える。この処置は５日間連続する。生着後７日目と１４日目に、目に見える拍動機能をモニターすることによって、移植片の機能性を判定する。機能的な生着の阻害を、ＭＰＤｄｉｓ−Ｆｃの用量の関数として決定する。移植部位での浮腫と宿主及びドナーの組織血管構造に対するＭＰＤｄｉｓ−Ｆｃの効果を視覚化するために、（例えば、ＶＩＩＩ因子染色を使用して）移植された心臓の組織学を検査する。
【０１９０】
実施例７：ＭＰＤディスインテグリン（ＭＰＤｄｉｓ）ポリペプチドを用いた腫瘍の処置
ＭＰＤｄｉｓ−Ｆｃを固形腫瘍の動物モデルで試験する。腫瘍の頻度と腫瘍の成長を測定することによってＭＰＤｄｉｓ−Ｆｃの効果を判定する。ＭＰＤｄｉｓ−Ｆｃの生物学的活性はまた、カルシウム可動化アッセイや血小板の活性化、動員、又は凝集を測定するアッセイのような、当技術分野で知られている他の ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及び ｉｎ ｖｉｖｏ アッセイでも証明される。
【０１９１】
実施例８：ＭＰＤポリペプチドの組織発現
ＭＰＤポリペプチドコーディング領域に対応するオリゴヌクレオチドは、ヒトの組織及び細胞系のｃＤＮＡ（「ＭＴＣ　ｃＤＮＡ」、クローンテク）のパネルを使用して、ＭＰＤ　ｍＲＮＡの発現を評価するために使用され得る。所望される長さの予測されるコーディング領域断片を増幅するために、前方プライマーと逆プライマーを設計する。所望される長さの増幅されたＤＮＡ断片の存在により裏付けられるような、ＭＰＤ　ｍＲＮＡを発現した組織及び細胞系を同定する。本発明のＭＰＤポリペプチドはどんな組織でも発現されるわけではないので、本発明は、本発明のポリペプチドへの抗体を活用するか、又は本発明のポリヌクレオチドに特異的なオリゴヌクレオチドのプライマー若しくはプローブを活用することによって、組織型を決定する方法を提供する。
【０１９２】
従って、前方プライマー：５’−ＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧＴＧ−３’（配列番号４３）と逆プライマー：５’−ＧＴＣＡＴＡＣＣＣＡＡＡＴＴＡＴＧＡＣＣＡＡＧＣＴＣＡＧＧ−３’（配列番号４４）を使用して、以下の組織が配列番号８をコードする配列を有するｍＲＮＡを発現することを見出した：胎盤、肝臓、腎臓、膵臓、精巣、胃、リンパ節、心臓、肺、結腸、腺癌、胎児肝臓、胎児肺、胎児脾臓、胎児骨格筋、胎児胸腺、胎児腎臓、前立腺、胸腺、卵巣、白血球、及び食道。
【０１９３】
前述の発明を明瞭な理解のために例示及び実施例によりやや詳しく記載したが、当業者には、本発明の教示に照らせば、これに対してなし得るある種の変更及び改良が付帯の特許請求項の精神若しくは範囲から逸脱しないことが明瞭であろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のポリペプチド配列を１文字アミノ酸コードで示す。「Ｘ」は、任意のアミノ酸か又は複数の任意アミノ酸を表す。

Claims (28)

  1. （ａ）〜（ｕ）からなる群から選択される配列を含んでなる実質的に精製されたポリペプチド：
    （ａ）配列番号３〜４及び６〜２７；
    （ｂ）ディスインテグリン活性を有する配列番号６の断片；
    （ｃ）ディスインテグリン活性を有する配列番号８の断片；
    （ｄ）ディスインテグリン活性を有する配列番号１４の断片；
    （ｅ）メタロプロテイナーゼ活性を有する配列番号２４の断片；
    （ｆ）ディスインテグリン活性を有する配列番号２４の断片；
    （ｇ）ほぼ残基４３ないし１４８の配列番号６；
    （ｈ）ほぼ残基１ないし３６６の配列番号８；
    （ｉ）ほぼ残基３８ないし３６６の配列番号８；
    （ｊ）ほぼ残基１ないし６２２の配列番号１４；
    （ｋ）ほぼ残基８４ないし６２２の配列番号１４；
    （ｌ）ほぼ残基２９９ないし６２２の配列番号１４；
    （ｍ）ほぼ残基１ないし７０１の配列番号２１；
    （ｎ）ほぼ残基１ないし２７７の配列番号２４；
    （ｏ）ほぼ残基２７８ないし４３５の配列番号２４；
    （ｐ）ほぼ残基１ないし３３２の配列番号２５；
    （ｑ）ほぼ残基１ないし６２７の配列番号２５；
    （ｒ）ほぼ残基１ないし２１５の配列番号２６；
    （ｓ）ほぼ残基１１８ないし２１５の配列番号２６；
    （ｔ）ほぼ残基２２４ないし３８３の配列番号２６；及び
    （ｕ）ほぼ残基２９ないし５７４の配列番号２７。
  2. ディスインテグリン活性を有する、請求項１に記載の実質的に精製されたポリペプチド。
  3. メタロプロテイナーゼ活性を有する、請求項１に記載の実質的に精製されたポリペプチド。
  4. 配列番号３〜４、６〜１１、１３〜１８、２０、又は２３〜２７に示されるような配列に少なくとも９７％相同である配列を含んでなる実質的に精製されたポリペプチドであって、メタロプロテイナーゼ若しくはディスインテグリン活性を有する、前記ポリペプチド。
  5. 第二のポリペプチドへ連結し、第二のポリペプチドは、ロイシンジッパーポリペプチド、Ｆｃポリペプチド、又はペプチドリンカー部分である、請求項１に記載のポリペプチド。
  6. 請求項１に記載のポリペプチドをコードしている単離されたポリヌクレオチド。
  7. 請求項６に記載のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター。
  8. 請求項６に記載のポリヌクレオチドを含んでなる組換え宿主細胞。
  9. 請求項８に記載の宿主細胞をポリペプチドの発現を促進する条件の下で培養することを含んでなる、ポリペプチドを産生するための方法。
  10. 請求項８に記載の宿主細胞をポリペプチドの発現を促進する条件の下で培養することによって産生されるポリペプチド。
  11. 請求項１に記載のポリペプチドへ特異的に結合する実質的に精製された抗体。
  12. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項１１に記載の抗体。
  13. 抗体がヒト若しくはヒト化抗体である、請求項１１に記載の抗体。
  14. 請求項１に記載のポリペプチドの阻害剤若しくは結合剤を設計する方法であって、該ポリペプチドの三次元構造を決定する工程、この三次元構造について基質若しくはリガンドの結合部位を分析する工程、該ポリペプチドと相互作用することが予測される分子を設計する工程、そして該分子の阻害若しくは結合活性を決定する工程を含んでなる、前記方法。
  15. ポリペプチドの活性を変調する剤を同定するための方法であって：
    （ａ）剤を請求項１に記載のポリペプチドと、該剤と該ポリペプチドが相互作用するような条件の下で接触させること；そして
    （ｂ）該剤の存在下での該ポリペプチドの活性を対照と比較して決定することを含んでなり、ここで活性の変化は、該ポリペプチドの活性を変調する剤の示標となる、前記方法。
  16. 活性が、ディスインテグリン活性、細胞接着活性、血管新生活性、メタロプロテイナーゼ活性、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. ポリペプチドがディスインテグリン活性を有する、請求項１５に記載の方法。
  18. 剤が、抗体、小分子、ペプチド、及びペプチド模擬体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  19. 細胞若しくは哺乳動物において血管新生を変調するための方法であって、該細胞若しくは哺乳動物へ請求項１に記載のポリペプチドを、ディスインテグリン活性を変調するのに有効な量で接触させるか又は投与することを含んでなる、前記方法。
  20. 細胞が ｉｎ ｖｉｔｒｏ で接触される、請求項１９に記載の方法。
  21. 細胞が ｉｎ ｖｉｖｏ で接触される、請求項１９に記載の方法。
  22. 内皮細胞を請求項１に記載のポリペプチドと接触させることを含んでなる、内皮細胞遊走を変調するための方法。
  23. インテグリンを発現する細胞若しくは哺乳動物へ、ディスインテグリン活性を有する請求項２に記載のポリペプチドの有効量を接触させるか又は投与することを含んでなる、インテグリンのリガンドへの結合を阻害する方法。
  24. 哺乳動物が、眼科障害；悪性及び転移性の状態；炎症性疾患；骨粗鬆症と加速された骨吸収により仲介される他の状態；再狭窄；不適切な血小板の活性化、動員、又は凝集；血栓症；及び組織修復若しくは創傷治癒を必要とする状態からなる群から選択される状態を患っている、請求項２３に記載の方法。
  25. ポリペプチドが多量体の形態である、請求項１９若しくは２３に記載の方法。
  26. 多量体が、二量体又は三量体である、請求項２５に記載の方法。
  27. 多量体が、Ｆｃポリペプチド、ロイシンジッパー、又はペプチドリンカーを含む、請求項２５に記載の方法。
  28. 請求項１に記載の１つ以上のポリペプチドのセットを表すデータセット；
    コンピュータ；及び
    コンピュータ上の実行可能フォーマットにおいてポリペプチドを分析するためのコンピュータアルゴリズム
    を含んでなる、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを分析するためのシステム。
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