JP2005220091A

JP2005220091A - アンギオテンシン変換酵素阻害ペプチド

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Publication number: JP2005220091A
Application number: JP2004030816A
Authority: JP
Inventors: Kazunori Katayama; 員典片山; Hidetaka Fuchu; 英孝府中; Masaaki Sugiyama; 雅昭杉山; Michio Rokushiya; 三治男六車
Original assignee: Marudai Food Co Ltd
Current assignee: Marudai Food Co Ltd
Priority date: 2004-02-06
Filing date: 2004-02-06
Publication date: 2005-08-18
Anticipated expiration: 2024-02-06
Also published as: JP4429031B2

Abstract

【課題】本発明の課題は、豚肉由来の機能性成分として、高血圧予防効果が期待されるアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害ペプチドを提供することである。
【解決手段】豚肉由来のタンパク質から抽出したミオシンＢをペプシンで加水分解し、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害ペプチドを得る。
【選択図】なし

Description

本発明は、アンギオテンシン変換酵素阻害剤等として有用なペプチド、さらに該ペプチドを含む高血圧予防用食品および降圧剤に関する。

アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）は主にヒトの血管の内皮細胞、肺、腎臓及び脳に存在する。この酵素は、血管の収縮を引き起こし、血圧を上昇させるために、Ｃ末端から２つのアミノ酸（Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）を切断することにより、不活性なアンギオテンシンＩを活性なアンギオテンシンIIに変換し得る。したがって、ＡＣＥは血圧を上昇させることができる。

アンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）のＡＣＥへの結合はアンギオテンシンIIの生成を減少し得る。ＡＣＥＩを食品に加えると、高血圧症状を減少させるのにプラスの効果を引き起こすであろう。現在のところ、多くのペプチドがＡＣＥの阻害についての効果を有することが知られている（特許文献１〜６）。それらは異なったアミノ酸配列と長さを有する。
特開２００１−２３３８９８号公報特開２００１−２３３８９５号公報特許第３４６５９２２号特許第３４７４６１０号特開平５−２３８９４６号公報特開平４−９５０９９号公報

従って、本発明は、食肉（特に豚肉）由来の機能性成分として、高血圧予防効果が期待されるアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害ペプチドを提供することを主な課題とする。

本発明は、食肉由来の新規なアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害ペプチドを見出した。

本発明は、以下の項１〜６の活性ペプチド、アンギオテンシン変換酵素阻害剤ならびにその製造法、高血圧予防用食品および降圧剤に関する。
項１．下記式で示されるポリペプチド：
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ。
項２．以下の４種のペプチドのいずれかからなるアンギオテンシン変換酵素阻害剤：
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ；
Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ；
Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ；及び
Ｇｌｎ−Ｔｙｒ。
項３．食肉由来のミオシンＢ素材をペプシンで加水分解することを特徴とするアンギオテンシン変換酵素阻害剤の製造法。
項４．アンギオテンシン変換酵素阻害剤がＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒである項３の製造法。
項５．Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ；
Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ；
Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ；及び
Ｇｌｎ−Ｔｙｒ
からなる群より選択される少なくとも１種のペプチドを含む高血圧予防用食品。
項６．Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ；
Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ；
Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ；及び
Ｇｌｎ−Ｔｙｒ
からなる群より選択される少なくとも１種のペプチドを含む降圧剤。

本発明のペプチドは、食肉由来の安全なタンパク質（ミオシンＢ）をペプシンで分解したペプチドなので、長期摂取しても安定性の高いものである。

本発明のペプチドＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ（KRVIQY）は、食肉由来のタンパク質から抽出したミオシンＢをペプシンで加水分解することによって得られる。また、ペプチドKRVIQYの部分構造ペプチドは、Fmoc固相合成などの公知の方法に従い合成できる。

以下、食肉として豚肉を例にとり説明するが、豚肉以外の食肉（牛肉、馬肉、魚肉、鶏肉など）についても同様に実施することができる。

本発明のペプチドKRVIQYは、ミオシンＢのペプシン加水分解生成物を、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相HPLCなどを組み合わせて精製することにより得られる。

本発明のペプチドとしては、ブタミオシンＢのペプシン分解物またはその分画もしくは濃縮分画が使用され得る。

本発明の製造法において、豚肉由来のタンパク質から抽出することができるミオシンＢをペプシンで加水分解すると、ACE阻害活性を有するペプチドＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ（KRVIQY）が生成することが見出された。このペプチドは、骨格筋ミオシン重鎖の190-195位由来と認められた。

本発明の製造法において、ミオシンＢは、肉の３倍量の高濃度塩溶液（０．６ＭＫＣｌなど）で豚肉由来のタンパク質から０〜２０℃で抽出され得る。また、ミオシンＢの抽出時間は、５分〜１２０時間であり得る。ミオシンＢは、ミオシン、アクチン、トロポミオシン、トロポニンの複合体であり得る。

本発明の製造法において、本発明のペプチドは、ペプシンを用いて、ミオシンＢをｐＨ１〜４で２５〜４５℃で５分〜７２時間加水分解することによって生成され得る。使用されるペプシンとしては、ブタペプシン、ウシペプシン、ヒトペプシンなどが挙げられ得る。

本発明の製造法において、ペプシンによるミオシンＢのタンパク分解混合物を使用可能とするために、脱塩処理が行われ得る。脱塩処理は、ゲルろ過クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーなどによって行われ得る。

本発明のペプチドは、高血圧予防用食品または降圧剤中に含まれ得る。

本発明のペプチドを含む高血圧予防用食品または降圧剤は、高血圧を予防するために投与され得る。

本発明のペプチドを含む高血圧予防用食品または降圧剤は、投与される場合、血圧を穏やかに低下させ得る。

本発明のペプチドを含む高血圧予防用食品または降圧剤は、投与される場合、血圧の低下を長期間、好ましくは４８時間、維持し得る。

本発明のペプチドを含む高血圧予防用食品または降圧剤は、投与される場合、乾咳などの副作用が実質的にないことが期待される。

本発明の降圧剤の形態としては、経口製剤、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、丸剤等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの製剤には、有効成分（ブタミオシンＢのペプシン分解物またはその分画もしくは濃縮分画）の他に医薬の分野で通常使用される賦形剤、希釈剤、担体などが適宜含まれ得る。

本発明の降圧剤の用法用量は、患者の症状、年齢、体重などによって異なるが、例えばポリペプチドとして成人１日当たり乾燥重量で０．１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは１ｍｇ〜１００ｍｇを１回もしくは２回以上に分けて投与する。

本発明の高血圧予防用食品は、固形または半固形状であってもよいし、液状（飲料）であってもよい。該食品には、上記有効成分（ブタミオシンＢのペプシン分解物またはその分画もしくは濃縮分画）が配合される。高血圧予防用食品に対する本発明のペプチドの配合割合は、高血圧予防用食品の形態、素材によって異なり、通常０．０００１〜５０重量％程度を含有する。本発明のペプチドの１日の摂取量としてトータルで、成人１日当たり、乾燥重量で０．１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは１ｍｇ〜１００ｍｇである。

本発明の高血圧予防用食品は、本発明のペプチドのみから構成されていてもよいが、通常は他の食品とともに既存の食品の形態で製造される。具体的な食品としては、ハム、ウインナー、惣菜、粉末飲料、キャンディー、老人用食品等が挙げられる。

本発明の高血圧予防用食品は、正常高値（収縮期血圧１３０〜１３９ｍｍＨｇ、拡張期血圧８５〜８９ｍｍＨｇ）、軽症高血圧（収縮期血圧１４０〜１５９ｍｍＨｇ、拡張期血圧９０〜９９ｍｍＨｇ）のヒトに投与したときに、有効に血圧を低下させることができる。

本発明により、豚肉タンパク質由来の新規なアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害ペプチドを提供することができる。

KRVIQYは有原らが報告したミオシン由来ペプチド（Meat Science, 57: 319-324, 2001）よりも強いACE阻害活性を示し、これまでに報告されている動物筋肉食品由来のACE阻害ペプチドの中で最も強い活性を示した。

一般的にジペプチドもしくはトリペプチドなどの小さなペプチドのみが、腸管から吸収される(Adibi et al. Clinical research, 17: 376, 1969) とされているが、一方では、Pappenheimer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 91: 1942-1945, 1994) はオクタペプチドが細胞間隙経路で腸管から吸収されることを示している。Shimizu et al. (Peptides, 18: 681-687, 1997) は疎水性ノナペプチドが経細胞輸送により上皮細胞を通過することを明らかにしている。さらにSatake et al. (Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 66: 378-384, 2002)は消化酵素に対する耐性が高く腸管内に長時間滞留するペプチドの場合は、なんらかのトランスポート機能を利用して吸収される可能性を示唆している。これらのことから、本発明による新規ACE阻害ペプチドKRVIQYも腸管から吸収される可能性があると考えられる。すなわち、KRVIQYが腸管から吸収されて、ACE阻害剤として有効に機能する可能性が期待される。

下記実施例において、より具体的に本発明を説明する。

以下実施例において測定されたACEに対する５０％阻害活性（IC₅₀）は、ウサギ肺由来のACEに対するもので、Cushman -Cheungの方法（Biochemical Pharmacology, 20: 1637-1648, 1971）で測定した。

実施例１
国産の豚ロース肉からWeber-Edsall溶液（０．６ＭＫＣｌ、０．０４Ｍ炭酸水素ナトリウム、０．０１Ｍ炭酸ナトリウム）で抽出したミオシンＢをブタペプシンで、ｐＨ２で３７℃で６時間加水分解した。このミオシンＢのペプシン加水分解物のウサギ肺由来のACEに対するIC₅₀は19.3 μg/mlであった。未加水分解ミオシンＢにはACE阻害活性が認められなかったことから、活性の発現はペプシン分解で生じたペプチドに由来することが分かった。そこで、この加水分解物からのACE阻害ペプチドの単離を検討した。

該加水分解物をまず、Superdex30 prep grade（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いるゲル濾過クロマトグラフィーに供した。すなわち、バッファー（20 mM 酢酸ナトリウム、150 mM 塩化ナトリウム、pH６）で該加水分解物をアプライし、同バッファーで溶出した（図１）。流速は0.45 ml/分とし、６分毎(2.7 ml)に分画した。得られた画分をそれぞれ濃縮して、その活性を測定した。ここで得られた最も活性の高い画分（画分No.56）をInertsil ODS-2（ジーエルサイエンス社製）を用いる逆相HPLCに供し、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)を含むアセトニトリルの0-50%のグラジェント溶出(流速0.5 ml/分)で分画した。これ以降のHPLCでは225 nmの吸光度をモニターした。活性画分はさらに、同じカラムで0.1%TFAを含むアセトニトリルの10-24%のグラジェント溶出(流速0.5 ml/分)で分画した。ここで得られた活性画分をCOSMOSIL 5PE-MS（ナカライテスク社製）を用いる逆相HPLCに供して、精製を数回行った。溶出は、まず0.1%TFAを含むアセトニトリル濃度13％のイソクラティック溶出（流速0.1 ml/min）で行った（図２）。ここで得られた活性の高い画分をさらに、アセトニトリル濃度10％（流速0.1 ml/min）、8％(流速0.3 ml/min)、7％(流速0.5 ml/min)、6％(流速0.5 ml/min)と段階的に低い濃度でイソクラティック溶出を行い、単一と思われる画分を得た。

精製で得られた画分のアミノ酸配列を、G1000A型プロテインシーケンサー（Hewlett Packard社製）でシーケンス解析した。得られたペプチドは骨格筋ミオシン重鎖の190位から195位にあたるKRVIQYであると認められた。これはこれまでに報告のない、新規なACE阻害ペプチドであった。KRVIQYのACE阻害活性は6.1 μMであり、これまでに報告されている豚肉タンパク質由来ペプチドの中で最も強いACE阻害活性を示した。

豚ミオシンＢのペプシン加水分解物を試料とするゲル濾過クロマトグラフィーを行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。図１に示される活性画分をInertsil ODS-2を用いる逆相HPLCに二度供して得られた活性画分を、更にCOSMOSIL 5PE-MSを用いる逆相HPLCに供した際のクロマトグラムを示す図である。

Claims

下記式で示されるポリペプチド：
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ。
以下の４種のペプチドのいずれかからなるアンギオテンシン変換酵素阻害剤：
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ；
Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ；
Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ；及び
Ｇｌｎ−Ｔｙｒ。
食肉由来のミオシンＢ素材をペプシンで加水分解することを特徴とするアンギオテンシン変換酵素阻害剤の製造法。
アンギオテンシン変換酵素阻害剤がＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒである請求項３の製造法。
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ；
Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ；
Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ；及び
Ｇｌｎ−Ｔｙｒ
からなる群より選択される少なくとも１種のペプチドを含む高血圧予防用食品。
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ；
Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ；
Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ；及び
Ｇｌｎ−Ｔｙｒ
からなる群より選択される少なくとも１種のペプチドを含む降圧剤。