JP2005281183A - Ｐｍｌ活性化剤による急性白血病の治療薬、およびその利用 - Google Patents

Abstract

【課題】白血病細胞の分化誘導剤、および該分化誘導剤を含む白血病に対する治療薬の提供を課題とする。
【解決手段】本発明者はAML1複合体の機能は、AML1複合体の構成因子であるPMLタンパク質の脱リン酸化により活性化されることを見いだし、PMLタンパク質のリン酸化を制御する特異的なタンパク質リン酸化酵素PMLKを同定した。PMLKの阻害剤は、PMLタンパク質の脱リン酸化を介してAML1複合体を活性化することにより、白血病細胞の分化を誘導できると考えられる。
【選択図】なし

Description

本発明は、PMLタンパク質の発現活性化剤もしくは機能活性化剤、またはPMLKタンパク質の発現抑制剤もしくは機能抑制剤を含む白血病細胞の分化誘導剤に関する。また、白血病治療薬のための候補化合物のスクリーニング方法に関する。

ヒト白血病やリンパ腫では、特異的な染色体転座が高い頻度で見られ、その結果生じる融合遺伝子産物の発現やがん遺伝子の発現異常が、ヒト白血病やリンパ腫の発症に関与する（非特許文献１参照）。AML1遺伝子は最も高頻度に染色体転座の標的となり、急性骨髄性白血病のM2サブタイプに高頻度にみられるt(8;21)転座における21番染色体の転座点に位置する遺伝子として同定された（非特許文献２参照）。その他、AML1遺伝子はこれまでにt(3;21)（非特許文献３および４参照）、t(12;21)（非特許文献５および６参照）、t(16;21)（非特許文献７および８参照）など様々な染色体転座に関与することが明らかにされている。また、AML1遺伝子は、染色体転座がみられない急性骨髄性白血病（AML）、骨髄異形成症候群(MDS)、および高頻度に白血病を発症する家族性血小板減少症（FPD）等においても突然変異がみられる（非特許文献９〜１１参照）。

AML1タンパク質はCBFβタンパク質とヘテロ二量体を形成して特異的なDNA配列に結合することにより、多くの造血細胞特異的な遺伝子の発現を制御する。AML1およびCBFβは共に成体型造血に必須であることが遺伝子破壊マウスを用いた解析から明らかにされている（非特許文献１２〜１６参照）。AML1は他の転写因子、あるいはp300/CBP（非特許文献１７参照）あるいはMOZ（非特許文献１８参照）などの転写共役因子と結合して機能し、転写複合体を統合する因子として機能することが提唱されている。AML1と複合体を形成する因子の多くは、白血病でみられる染色体転座の標的になっていることは特筆すべきである。CBFβはinv(16)（非特許文献１９参照）に関与し、p300はt(8;22) 転座（非特許文献２０および２１参照）あるいはt(11;22)転座（非特許文献２１参照）、CBPはt(8;16)転座（非特許文献２３参照）あるいはt(11;16)転座（非特許文献２４〜２６参照）、そしてMOZはt(8;16)転座（非特許文献２３参照）、inv(8)（非特許文献２７参照）あるいはt(8;22) 転座（非特許文献２０および２１参照）に関与する。AML1の変異を含め、これらを総計すると、急性骨髄性白血病の40-50%でAML1複合体の構成因子のいずれかに異常が認められたため、AML1複合体が急性白血病における染色体転座の主要な標的であると考えられる。

前骨髄性白血病（PML）遺伝子は、急性前骨髄性白血病の殆どに見られるt(15;17)転座に関与する（非特許文献２８〜３３参照）。PML遺伝子欠損マウスの解析からPMLは造血前駆細胞の分化・細胞増殖・癌化を制御することが示唆されている（非特許文献３４参照）が、その作用機序については、ほとんど分かっていない。PMLはアポトーシスの誘導、増殖停止、細胞老化といったがん抑制機能に関与する（非特許文献３５参照）。PMLは他の多くのタンパク質と共に核内の斑点状の領域に局在する。このようなPMLと共局在するタンパク質にはSp100, p53, pRb, Daxx, CBPなどが含まれることから、PMLが遺伝子発現やゲノム安定性といった様々な核内のプロセスを制御することが示唆されている。PML遺伝子から異なるスプライシングにより多くのアイソフォームが発現することが知られているが（非特許文献３６および３７参照）、各アイソフォームの特異的な機能については不明な点が多い。

Look, A.T.著、「Oncogenic transcription factors in the human acute leukemia.」、Science、1997年、Vol.278、p.1059-64 Miyoshi, H.外５名著、「t(8;21) breakpoints on chromosome 21 in acute myeloid leukemia are clustered within a limited region of a single gene, AML1.」、Proc Natl Acad Sci U S A、1991年、Vol. 88、p.10431-4 Nucifora, G. 外４名著、「The 3;21 translocation in myelodysplasia results in a fusion transcript between the AML1 gene and the gene for EAP, a highly conserved protein associated with the Epstein-Barr virus small RNA EBER 1.」、 Proc Natl Acad Sci U S A、1993年、Vol.90、p.7784-8 Mitani, K.外８名著、「Generation of the AML1-EVI-1 fusion gene in the t(3;21)(q26;q22) causes blastic crisis in chronic myelocytic leukemia.」、Embo J、1994年、Vol.13、p.504-10 Golub, T.R.外９名著、「Fusion of the TEL gene on 12p13 to the AML1 gene on 21q22 in acute lymphoblastic leukemia.」、Proc Natl Acad Sci U S A、1995年、Vol.92、p.4917-21 Romana, S.P.外６名著、「The t(12;21) of acute lymphoblastic leukemia results in a tel-AML1 gene fusion.」、Blood、1995年、Vol.85、p.3662-70 Berger, R.外３名著、「Secondary acute myeloblastic leukemia with t(16;21) (q24;q22). involving the AML1 gene.」、Hematol Cell Ther、1996年、Vol.38、p.183-6 Gamou, T.外８名著、「The partner gene of AML1 in t(16;21) myeloid malignancies is a novel member of the MTG8(ETO) family.」、Blood、1998年、Vol.91、p.4028-37 Osato M.外１０名著、「Biallelic and heterozygous point mutations in the runt domain of the AML1/PEBP2alphaB gene associated with myeloblastic leukemias.」、Blood、1999年Mar15、Vol.93(6)、p.1817-24 Imai Y, 外９名著、「Mutations of the AML1 gene in myelodysplastic syndrome and their functional implications in leukemogenesis.」、Blood、2000年Nov 1、Vol.96(9)、p.3154-60 Preudhomme C,外１２名著、「High incidence of biallelic point mutations in the Runt domain of the AML1/PEBP2 alpha B gene in Mo acute myeloid leukemia and in myeloid malignancies with acquired trisomy 21.」、Blood、2000年Oct 15、Vol.96(8)、p.2862-9 Okuda, T.外４名著、「AML1, the target of multiple chromosomal translocations in human leukemia, is essential for normal fetal liver hematopoiesis.」、Cell、1996年、Vol.84、p.321-30 Sasaki K, Y.H.外７名著、「Absence of fetal liver hematopoiesis in mice deficient in transcriptional coactivator core binding factor beta.」、Proc Natl Acad Sci U S A、1996年、Vol.93、p.12359-12363 Wang Q,外５名著、「Disruption of the Cbfa2 gene causes necrosis and hemorrhaging in the central nervous system and blocks definitive hematopoiesis.」、Proc Natl Acad Sci U S A.、1996年Apr 16、Vol.93(8)、p.3444-9 Wang, Q.外15名著、「The CBFbeta subunit is essential for CBFalpha2 (AML1) function in vivo.」、Cell、1996年、Vol.87、p.697-708 Niki, M.外９名著、「Hematopoiesis in the fetal liver is impaired by targeted mutagenesis of a gene encoding a non-DNA binding subunit of the transcription factor, polyomavirus enhancer binding protein 2/core binding factor.」、Proc Natl Acad Sci U S A、1997年、Vol.94、p.5697-702 Kitabayashi, I.外３名著、「Interaction and functional cooperation of the leukemia-associated factors AML1 and p300 in myeloid cell differentiation.」、Embo J、1998年、Vol.17、p.2994-3004. Kitabayashi I, 外４名著、「Activation of AML1-mediated transcription by MOZ and inhibition by the MOZ-CBP fusion protein.」、EMBO J.、2001年Dec 17、Vol.20(24)、p.7184-96 Liu P, 外７名著、「Fusion between transcription factor CBF beta/PEBP2 beta and a myosin heavy chain in acute myeloid leukemia.」、Science、1993年Aug 20、Vol.261(5124)、p.1041-4 Chaffanet M, G.L., 外４名著、「MOZ is fused to p300 in an acute monocytic leukemia with t(8;22).」、Genes Chromosomes Cancer、2000年、Vol.28、p.138-144 Kitabayashi I, 外７名著、「Fusion of MOZ and p300 histone acetyltransferases in acute monocytic leukemia with a t(8;22)(p11;q13) chromosome translocation.」、Leukemia、2001年Jan、Vol.15(1)、p.89-94 Ida, K.著、「Adenoviral E1A-associated protein p300 is involved in acute myeloid leukemia with t(11;22)(q23;q13).」、Blood、1997年、Vol.90、p.4699-704 Borrow, J.著、「The translocation t(8;16)(p11;p13) of acute myeloid leukaemia fuses a putative acetyltransferase to the CREB-binding protein.」、Nat Genet、1996年、Vol.14、p.33-41 Taki T, 外３名著、「The t(11;16)(q23;p13) translocation in myelodysplastic syndrome fuses the MLL gene to the CBP gene.」、Blood、1997年、Vol.89、p.3945-3950 Sobulo, O.M.著、「MLL is fused to CBP, a histone acetyltransferase, in therapy-related acute myeloid leukemia with a t(11;16)(q23;p13.3). 」、Proc Natl Acad Sci U S A、1997年、Vol.94、p.8732-7 Satake N, I.Y., 外６名著、「Novel MLL-CBP fusion transcript in therapy-related chronic myelomonocytic leukemia with a t(11;16)(q23;p13) chromosome translocation.」、Genes Chromosomes Cancer、1997年、Vol.20、p.60-63 Carapeti M, 外３名著、「A novel fusion between MOZ and the nuclear receptor coactivator TIF2 in acute myeloid leukemia.」、Blood、1998年May 1、Vol.91(9)、p.3127-33 de The H, 外４名著、「The t(15;17) translocation of acute promyelocytic leukaemia fuses the retinoic acid receptor alpha gene to a novel transcribed locus.」、Nature、1990年、Vol.347、p.558-561 de The H,外５名著、「The PML-RAR alpha fusion mRNA generated by the t(15;17) translocation in acute promyelocytic leukemia encodes a functionally altered RAR.」、Cell、1991年、Vol.66、p.675-684 Goddard AD, 外３名著、「Characterization of a zinc finger gene disrupted by the t(15;17) in acute promyelocytic leukemia.」、Science、1991年、Vol.254、p.1371-1374 Kakizuka A, 外７名著、「Chromosomal translocation t(15;17) in human acute promyelocytic leukemia fuses RAR alpha with a novel putative transcription factor, PML.」、Cell、1991年、Vol.66、p.663-674 Pandolfi PP, 外６名著、「Structure and origin of the acute promyelocytic leukemia myl/RAR alpha cDNA and characterization of its retinoid-binding and transactivation properties.」、Oncogene、1991年、Vol.6、p.1285-1292 Kastner P, 外８名著、「Structure, localization and transcriptional properties of two classes of retinoic acid receptor alpha fusion proteins in acute promyelocytic leukemia (APL): structural similarities with a new family of oncoproteins.」、EMBO J.、1992年、Vol.11、p.629-642 Wang ZG, 外７名著、「Role of PML in cell growth and the retinoic acid pathway.」、Science、1998年、Vol.279、p.1547-1551 Salomoni PおよびPandolfi PP.、「The role of PML in tumor suppression.」、Cell、2002年、Vol.108、p.165-170 Fagioli M, 外８名著、「Alternative splicing of PML transcripts predicts coexpression of several carboxy-terminally different protein isoforms.」、Oncogene、1992年、Vol.7、p.1083-1091 Jensen K, 外２名著、「PML protein isoforms and the RBCC/TRIM motif.」、Oncogene、2001年、Vol.20、p.7223-7233

本発明は、PMLタンパク質による白血病細胞の分化誘導現象のメカニズムの解明を目的の一つとし、さらに、得られた知見を基に、新たな白血病細胞の分化誘導剤、並びに、該分化誘導剤を含む白血病の治療薬の提供を課題とする。

本発明者は上記課題を解決するため鋭意研究を行なった。白血病の治療薬として、第一に考えられるのは、白血病特異的に発現する融合タンパク質の活性を抑制する分子標的試薬である。既に臨床応用されているグリベック（ノバルティスファーマ株式会社）は、慢性骨髄性白血病において９０％以上で発現するBCR-ABL融合チロシンキナーゼを特異的に阻害する。しかしながら、急性白血病では染色体転座の種類が多様で、急性骨髄性白血病で最も多いとされるAML1-MTG8、CBFβ-MYH11、PML-RARαの発現は、それぞれ全体の10-20%程度であり、これらの融合タンパク質が共通の分子標的にはなりにくかった。

そこで、本発明者は次に期待できる治療薬として、染色体転座の主要な標的であるAML1複合体を活性化する試薬に注目した。これまでに機能が解析されたAML1-MTG8、CBFβ-MYH11、MOZ-CBPはいずれもAML1タンパク質に対しドミナントネガティブに作用し、AML1タンパク質による転写活性化を抑制することが明らかになった。多くの白血病では対立遺伝子は正常であることから、正常なAML1複合体も共存していると考えられ、融合タンパク質により抑制されたAML1複合体を再活性化する試薬は急性白血病の治療への応用が期待できる。実際、本発明者は、AML1遺伝子を強制発現することにより、白血病細胞の分化が促進されることを示した。

また、本発明者は、AML1タンパク質はPMLタンパク質と複合体(AML1-PML複合体)を構成することを発見し、該複合体の機能は、構成因子であるPMLタンパク質の脱リン酸化により活性化されることを見出した。さらに本発明者は、PMLタンパク質のリン酸化を制御する特異的なタンパク質リン酸化酵素PMLKを同定することに成功した。

PMLKの阻害剤は、PMLタンパク質の脱リン酸化を介してAML1-PML複合体を活性化することにより、白血病細胞の分化を誘導できると考えられる。即ち、PMLタンパク質の機能活性化物質、またはPMLKタンパク質の機能阻害物質は、白血病細胞の分化誘導剤となることが期待される。これらのPMLタンパク質およびPMLKタンパク質に関する知見については、本発明者によって初めて見出されたものである。

JNKタンパク質（PMLKタンパク質）が、哺乳動物幹細胞の分化に関与していることが報告されている（特許国際公報WO03102151）ものの、該JNKのリン酸化の基質についてはこれまでのところ明らかになっておらず、細胞の分化誘導の機序は、依然として不明であった。即ち、本発明者によって見出された上述のPMLを基質とするリン酸化に関する知見は、これまでのところ、全く知られていなかった。本発明者によって見出された知見により、PMLタンパク質のリン酸化をターゲットとする、白血病細胞の分化誘導剤、あるいは白血病治療剤が初めて提供された。さらに、PMLタンパク質のリン酸化状態を指標とすることにより、白血病細胞の分化誘導剤、あるいは、白血病の治療剤を、簡便にスクリーニング方法することが可能となった。
上述の如く本発明者は、PMLKタンパク質の白血病細胞の分化誘導のメカニズムの解明に成功し、白血病細胞の分化誘導剤の発明を完成させるに至った。

本発明は、PMLタンパク質の発現活性化剤もしくは機能活性化剤、またはPMLKタンパク質の発現抑制剤もしくは機能抑制剤を含む白血病細胞の分化誘導剤、並びに、該分化誘導剤を含む白血病の治療薬に関し、より具体的には、
〔１〕 ＰＭＬタンパク質の発現活性化物質または機能活性化物質を含む、白血病細胞の分化誘導剤、
〔２〕 ＰＭＬタンパク質の機能活性化物質が、ＰＭＬタンパク質脱リン酸化酵素の活性化物質、もしくはＰＭＬタンパク質リン酸化酵素の阻害物質である、〔１〕に記載の白血病細胞の分化誘導剤、
〔３〕 ＰＭＬタンパク質上の部位であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の５０５位、５１８位、５２７位、および／または５３０位のセリン部位のリン酸化を抑制する、もしくは該セリン部位の脱リン酸化を促進する物質を含む、白血病細胞の分化誘導剤、
〔４〕 ＰＭＬＫタンパク質の発現阻害物質または機能阻害物質を含む、白血病細胞の分化誘導剤、
〔５〕 ＰＭＬＫタンパク質の発現阻害物質が、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物である、〔４〕に記載の白血病細胞の分化誘導剤、
（ａ）ＰＭＬＫ遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）ＰＭＬＫ遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）ＰＭＬＫ遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果による阻害作用を有する核酸
〔６〕 〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の白血病細胞の分化誘導剤を有効成分として含む、白血病治療薬、
〔７〕 以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、白血病治療剤のスクリーニング方法、
（ａ）ＰＭＬＫ遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞におけるＰＭＬＫタンパク質の発現量または活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、発現量または活性を低下させる化合物を選択する工程
〔８〕 以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、白血病治療剤のスクリーニング方法、
（ａ）ＰＭＬタンパク質および被検化合物を接触させる工程
（ｂ）ＰＭＬタンパク質のリン酸化状態を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記リン酸化の程度を低下させる化合物を選択する工程
〔９〕 以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、白血病治療剤のスクリーニング方法、
（ａ）ＰＭＬタンパク質、ＰＭＬＫタンパク質、および被検化合物を接触させる工程
（ｂ）ＰＭＬタンパク質を基質とする、ＰＭＬＫタンパク質のリン酸化活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記リン酸化活性を低下させる化合物を選択する工程
〔１０〕 ＰＭＬタンパク質におけるリン酸化部位が、配列番号：２に記載のＰＭＬタンパク質のアミノ酸配列において、５０５位、５１８位、５２７位、および／または５３０位のセリン部位である、〔８〕または〔９〕に記載のスクリーニング方法、
を提供するものである。

多くの白血病では対立遺伝子は正常であることから、正常なAML1-PML複合体も共存していると考えられ、融合タンパク質により抑制されたAML1-PML複合体を再活性化する試薬は急性白血病の治療への応用が期待できる。実際、AML1遺伝子を強制発現することにより、白血病細胞の分化が促進されることが示された。また、PMLKの阻害剤は、骨髄細胞の好中球への分化を誘導することを明らかにした。これらの結果から、PMLの発現もしくは機能を活性する化合物、またはPMLKの発現もしくは機能を阻害する化合物は、実際に白血病治療に有効であると考えられる。

また本発明者によって見出された知見を基に、白血病治療薬の新規なスクリーニング方法が提供された。本発明のスクリーニング方法によって、新規な作用機序による白血病治療効果を有する化合物を、効率的に取得することが可能である。

本発明者によって初めて、AML1-PML複合体の機能が、PMLタンパク質の脱リン酸化により活性化されることが見い出された。また、PMLタンパク質のリン酸化を制御するPMLタンパク質特異的なリン酸化酵素であるPMLKが同定された。即ち、PMLタンパク質のリン酸化を抑制する物質（化合物）、または該タンパク質の脱リン酸化を促進する物質（化合物）は、AML1タンパク質を活性化し、白血病細胞の分化誘導作用を有するものと考えられる。
上述のようにPMLKタンパク質は、PMLタンパク質を基質とするリン酸化酵素活性を有することから、PMLKの発現あるいは機能を阻害する化合物は、PMLタンパク質の脱リン酸化を介してAML1-PML複合体を活性化し、白血病細胞の分化を誘導することによって、白血病の治療に有効であると考えられる。

白血病とは一般的に、骨髄中の造血幹細胞と呼ばれる血液細胞の基になる細胞またはこれに由来する前駆細胞が異常に増殖する疾患である。この原因は一つまたはいくつかの遺伝子に突然変異や染色体転座により異常が生じ、その結果として細胞分化・増殖・アポトーシス（細胞死）の制御異常が起こり、そのため骨髄中で白血球が増殖し、血液中に芽球と呼ばれる未成熟な白血球が増える。正常な状態では白血球は体内に入ってきた細菌やウイルスなどを攻撃し身体を保護する働きがあるため、白血病に罹患すると身体を保護する働きが失われる。また、急性白血病では、未熟な白血球だけが作られ、正常な白血球や血小板、赤血球が全く作られなくなり病気が急速に進行する。

また本発明において「白血病細胞」とは、白血病患者に由来する骨髄細胞および末梢血細胞、これらをそのまま或いは不死化した後試験管内で培養した細胞、および実験動物や培養細胞への遺伝子の導入や白血病ウイルスの感染により誘導した白血病を模倣する細胞を指す。具体的には、Ｋ５６２、ＭＬ１、Ｕ９３７などの白血病由来の培養細胞を挙げることができる。

本発明者は、AML1タンパク質と複合体を形成するPMLタンパク質が活性化されることにより、即ちPMLタンパク質が脱リン酸化され、PMLタンパク質の機能が活性化することにより、その結果、AML1タンパク質が活性化され、白血病細胞の分化誘導が引き起こされることを見出した。つまり、PMLタンパク質自体、またはPMLタンパク質の発現活性化物質もしくは機能活性化物質は、AML1タンパク質活性化剤となると考えられる。該AML1タンパク質活性化剤は、白血病細胞の分化誘導作用を有するものと考えられ、例えば白血病の治療薬となると考えられる。

本発明はまず、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの少なくとも１つを含有するAML1タンパク質活性化剤に関する。（尚、本発明においては、以下の（ａ）および（ｂ）のタンパク質をまとめて、「PMLタンパク質」と記載する場合あり）。
（ａ）PMLタンパク質
（ｂ）PMLタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、PMLタンパク質変異体であって、PMLタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードするDNA、または該タンパク質を発現するベクター

本発明におけるPMLタンパク質は通常、分化誘導を行うべき白血病細胞を有する生物種に由来する（内因性の）タンパク質である。本発明のPMLタンパク質は、ヒトPMLタンパク質であることが好ましいが、その由来する生物種は特に制限されず、マウス等の哺乳動物のPMLタンパク質を挙げることができる。一例として、ヒトPMLタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に、該タンパク質をコードするDNA配列を配列番号：１に示す。

本発明における「PMLタンパク質」は、天然のタンパク質の他、遺伝子組換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は、例えばPMLタンパク質が発現していると考えられる細胞（組織）の抽出液に対し、PMLタンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、PMLタンパク質をコードするDNAで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。
本発明において、「機能的に同等なタンパク質」とは、PMLタンパク質において明らかにされている活性と同様の活性を備えたタンパク質である。上記「活性」とは、例えば、AMLタンパク質の結合する活性（相互作用する活性）等を挙げることができる。タンパク質間の結合活性（相互作用活性）の測定は、当業者においては、公知の方法によって、適宜実施することができる。

また、本発明におけるPMLタンパク質としては、PMLタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号：２に記載の配列）に対して、例えば７０%以上、望ましくは９０%以上、更に望ましくは９５%以上の相同性を有するタンパク質は、PMLタンパク質と機能的に同等なタンパク質として示すことができる。また、本発明におけるアミノ酸の改変は、通常、５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは１０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは３アミノ酸以内である。
上記の機能的に同等なタンパク質とは、例えば、ヒトPMLタンパク質変異体、ヒトPMLタンパク質のヒト以外の生物におけるホモログ等を挙げることができる。

また、本発明におけるPMLタンパク質をコードするDNAは、染色体DNAであっても、cDNAであってもよい。PMLタンパク質をコードする染色体DNAは、例えば、細胞等から染色体DNAのライブラリーを調製し、PMLタンパク質をコードするDNAにハイブリダイズするプローブを用いた、該ライブラリーのスクリーニングにより取得することができる。またPMLタンパク質をコードするcDNAは、PMLタンパク質が発現していると考えられる細胞（組織）からRNA試料を抽出し、PMLタンパク質をコードするDNAにハイブリダイズするプライマーを用いたRT-PCR法等の遺伝子増幅技術により取得することができる。

本発明におけるPMLタンパク質または該タンパク質をコードするDNAは、PMLタンパク質と機能的に同等であれば、その塩基配列やアミノ配列が改変された変異体であってもよい。このような変異体は、天然のものでも人工のものでもよい。人工的に変異体を調製するための方法は当業者に公知である。例えば、Kunkel法（Kunkel, T. A. et al., Methods Enzymol. 154, 367-382 (1987)）、ダブルプライマー法（Zoller, M. J. and Smith, M., Methods Enzymol. 154, 329-350 (1987)）、カセット変異法（Wells, et al., Gene 34, 315-23 (1985)）、メガプライマー法（Sarkar, G. and Sommer, S. S., Biotechniques 8, 404-407 (1990)）などが知られている。

また本発明においては、AML1活性化剤として、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードするDNA、または該タンパク質を発現するベクターを使用することも可能である。
（ａ）PMLタンパク質、
（ｂ）PMLタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、PMLタンパク質変異体であって、PMLタンパク質と機能的に同等なタンパク質

本発明のAML1活性化剤は、AML1の活性化を作用機序とする白血病細胞の分化誘導剤、あるいは、白血病の治療剤となることが期待される。

上記タンパク質をコードするDNAは、効率的な発現のために機能的にプロモーターと結合していることが好ましい。これらプロモーターとしては、本来のPML遺伝子プロモーターを利用することができるが、これ以外にも、公知の種々のプロモーター、例えばCMVプロモーター等を用いることができる。また、当業者であれば、公知の種々の発現ベクターを用いて、容易に上記タンパク質を発現するベクターを作製することができる。

上記ベクターは、遺伝子治療用に使用することも可能である。遺伝子治療とは、機能を有するタンパク質をコードするDNAを含むベクターを患者に投与し、治療または予防することをいう。遺伝子治療に使用することができるベクターには、例えば、アデノウイルスベクター（例えばpAdex1cw）やレトロウイルスベクター（例えばpZIPneo）等が挙げられるが、これに制限されない。ベクターへの上記タンパク質をコードするDNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことができる。生体内への投与はex vivo法でもよいが、in vivo法が好ましい。

また本発明は、PMLタンパク質の発現活性化物質または機能活性化物質を含む、AML1タンパク質の活性化剤、並びに、白血病細胞の分化誘導剤を提供する。

本発明における「タンパク質の発現活性化物質」は、タンパク質の発現を有意に活性化（上昇）させる物質（化合物）である。本発明の上記「発現活性化」には、該タンパク質をコードする遺伝子の転写活性化、および／または該遺伝子の転写産物からの翻訳活性化が含まれる。
本発明のPMLタンパク質の発現活性化物質としては、例えば、PML遺伝子の転写調節領域（例えば、プロモーター領域）に結合して、該遺伝子の転写を促進する物質（転写活性化因子等）を挙げることができる。
また、本発明においてPMLタンパク質の発現活性の測定は、当業者においては周知の方法、例えば、ノーザンブロット法、ウェスタンブロット法等により、容易に実施することができる。

またPMLタンパク質の機能活性化物質とは、PMLタンパク質の機能を有意に活性化させる物質である。本発明者によって、PMLタンパク質が脱リン酸化されることによって、PMLタンパク質が活性化されることが見出された。従って、本発明のPMLタンパク質の機能活性化物質として、例えば、PMLタンパク質のリン酸化を抑制する物質、PMLタンパク質リン酸化酵素の阻害物質、もしくはPMLタンパク質脱リン酸化酵素の活性化物質等を挙げることができる。上記リン酸化酵素としては、PMLKタンパク質を挙げることができる。即ち、PMLKタンパク質の発現もしくは機能を阻害することによっても、白血病細胞の分化を誘導させることが可能である。上記脱リン酸化酵素とは、PMLタンパク質上のリン酸基を除去する反応を担う酵素を指す。

上記PMLKタンパク質は、PMLタンパク質を基質とするリン酸化酵素であり、通常、PMLタンパク質上の５０５位、５１８位、５２７位、および／または５３０位のセリン部位をリン酸化する。本発明者は、当該部位が脱リン酸化されることによりAML1が活性化し、その結果、白血病細胞が分化誘導されることを見出した。

従って、本発明における脱リン酸化酵素としては、好ましくは、PMLタンパク質（配列番号：２に記載のアミノ酸配列）上の５０５位、５１８位、５２７位、および／または５３０位のセリン部位を脱リン酸化する活性を有するものが好ましい。なお、配列番号：２以外の配列からなるPMLタンパク質（ホモログ等）においては、リン酸化される部位が、必ずしも、上記の数値で示す部位と一致しない場合も考えられる。従って、本発明において、「リン酸化され得るPMLタンパク質上の部位」には、上記部位に相当するセリン部位が含まれる。「相当するセリン部位」か否かは、当業者においては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列と相同性アラインメント等を行うことにより、例えば、配列番号：２における５０５位のセリン部位が、他のPMLタンパク質ホモログ等において、何番目の部位のセリンに相当するのかを、適宜、知ることができる。

本発明は、PMLタンパク質上の部位であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の５０５位、５１８位、５２７位、および／または５３０位のセリン部位のリン酸化を抑制する、もしくは該セリン部位の脱リン酸化を促進する物質を含む、白血病細胞の分化誘導剤を提供する。
また本発明は、PMLKタンパク質の発現阻害物質または機能阻害物質を含む、白血病細胞の分化誘導剤に関する。
本発明における「タンパク質の発現阻害物質」は、タンパク質の発現を有意に低下させる、あるいは、発現を完全に抑制させる物質（化合物）である。本発明の上記「発現阻害」には、該タンパク質をコードする遺伝子の転写阻害、および／または該遺伝子の転写産物からの翻訳阻害が含まれる。

なお、本発明におけるPMLKとは、通常、PMLのリン酸化を制御するキナーゼ（リン酸化酵素）をさす。詳しくはPMLタンパク質上の部位であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の５０５位、５１８位、５２７位、および／または５３０位のセリン部位のリン酸化を制御するキナーゼである。本発明のPMLKには、例えば、JNK/SAPK、またはp38MAP kinase等が含まれる。本発明におけるPMLKタンパク質として、例えば、配列番号：４、６、または８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。

また、本発明における、PMLKタンパク質の機能阻害物質としては、例えば、PMLKタンパク質に結合する抗体（PMLKタンパク質を認識する抗体）を挙げることができる。該抗体は、PMLKタンパク質と結合することにより、PMLKタンパク質の機能を阻害し、その結果、白血病細胞の分化が誘導されることが期待される。本発明の上記抗体は、特に制限されないが、PMLK以外のタンパク質とは結合せず、特異的にPMLKタンパク質と結合する（PMLKタンパク質を認識する）抗体であることが好ましい。

本発明のPMLKタンパク質に結合する抗体（抗PMLK抗体）は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然のPMLKタンパク質、あるいはGSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントPMLKタンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、プロテインA、プロテインGカラム、PMLKタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、PMLKタンパク質若しくはその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、PMLKタンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、PMLKタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。

本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、本発明のPMLKタンパク質に結合する限り、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかに、ヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物も含まれる。

抗体取得の感作抗原として使用される本発明のPMLKタンパク質は、その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、例えばマウス、ヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、本明細書に開示される遺伝子配列またはアミノ酸配列を用いて得ることができる。

本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質あるいはタンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（N）末端断片やカルボキシ（C）末端断片が挙げられる。本明細書における「抗体」とはタンパク質の全長または部分断片に反応する抗体を意味する。

また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばEBウィルスに感染したヒトリンパ球をin vitroでタンパク質、タンパク質発現細胞またはその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。

本発明のPMLKタンパク質に結合する抗体は、例えば、白血病細胞の分化誘導を目的とした使用が考えられる。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。

また、上記PMLKタンパク質の発現阻害（抑制）物質としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）の核酸を挙げることができる。本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を含む、白血病細胞の分化誘導剤を提供する。
（ａ）PMLK遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）PMLK遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）PMLK遺伝子の発現をRNAi効果による阻害作用を有する核酸

本発明における「核酸」とはRNAまたはDNAを意味する。特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上, 新生化学実験講座2 核酸IV遺伝子の複製と発現, 日本生化学会編, 東京化学同人, 1993, 319-347.）。

本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用によりPMLK遺伝子の発現を阻害してもよい。一つの態様としては、PMLK遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、PMLK遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで、所望の動物へ形質転換できる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。

また、PMLK遺伝子の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、RNAを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループIイントロン型やRNase Pに含まれるM1 RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.）。

例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15という配列のC15の3'側を切断するが、その活性にはU14とA9との塩基対形成が重要とされ、C15の代わりにA15またはU15でも切断され得ることが示されている（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.）。基質結合部位が標的部位近傍のRNA配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することができる（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 239, 285.、小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.、Koizumi, M. et al., Nucl Acids Res, 1989, 17, 7059.）。

また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される（Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なRNA切断リボザイムを作出できることが示されている（Kikuchi, Y. ＆ Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751.、菊池洋, 化学と生物, 1992, 30, 112.）。このように、リボザイムを用いて本発明におけるPMLK遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。

内在性遺伝子の発現の阻害は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖RNAを用いたRNA干渉（RNA interferance；RNAi）によっても行うことができる。RNAiとは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNAを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも阻害される現象のことを指す。RNAiの機構の詳細は明らかではないが、最初に導入した二本鎖RNAが小片に分解され、何らかの形で標的遺伝子の指標となることにより、標的遺伝子が分解されると考えられている。RNAiに用いるRNAは、PMLK遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と完全に同一である必要はないが、完全な相同性を有することが好ましい。

また本発明の白血病細胞の分化誘導剤によって白血病細胞の分化が促進されれば、白血病の治療へ応用することが可能である。本発明の白血病細胞の分化誘導剤は、白血病の治療薬となるものと考えられ、この治療薬もまた、本発明に含まれる。即ち本発明は、本発明の白血病細胞の分化誘導剤を有効成分として含む、白血病治療薬（白血病治療のための医薬組成物）を提供する。

白血病患者においては、未分化な白血病細胞が増殖していることから、本発明の白血病細胞の分化誘導剤は、未分化の細胞を正常細胞へ分化誘導する作用を有すると考えられ、所謂、分化誘導療法に利用できると考えられる。従って、本発明の白血病細胞分化誘導剤は白血病の治療薬として大いに有用である。本発明の治療薬が有効な白血病としては、特に制限されるものではないが、例えば、急性骨髄性白血病が挙げられる。

本発明の分化誘導剤または白血病治療薬（本明細書において、「分化誘導剤」および「白血病治療薬」を合わせて「薬剤」と記載する場合あり）は、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とすることができる。非経口剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、あるいは座剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。外用薬剤には、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示すことができる。主成分である本発明の分化誘導剤を含むように、上記の剤型とする製剤技術は公知である。

例えば、経口投与用の錠剤は、本発明の薬剤に賦形剤、崩壊剤、結合剤、および滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤には、乳糖、デンプン、あるいはマンニトール等が一般に用いられる。崩壊剤としては、炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般に用いられる。結合剤には、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドンが用いられる。滑沢剤としては、タルクやステアリン酸マグネシウム等が公知である。

本発明の薬剤を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコーティングを施すことができる。コーティング剤には、エチルセルロースやポリオキシエチレングリコール等を用いることができる。

また注射剤は、主成分である本発明の薬剤を適当な分散剤とともに溶解、分散媒に溶解、あるいは分散させることにより得ることができる。分散媒の選択により、水性溶剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油やプロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩化ナトリウムやブドウ糖等の公知の等張化剤を加えることができる。更に、塩化ベンザルコニウムや塩酸プロカインのような無痛化剤を添加することができる。

本発明の白血病治療薬は、本発明の薬剤を固形、液状、あるいは半固形状の組成物とすることにより外用剤とすることができる。固形、あるいは液状の組成物については、先に述べたものと同様の組成物とすることで外用剤とすることができる。半固形状の組成物は、適当な溶剤に必要に応じて増粘剤を加えて調製することができる。溶剤には、水、エチルアルコール、あるいはポリエチレングリコール等を用いることができる。増粘剤には、一般にベントナイト、ポリビニルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸、あるいはポリビニルピロリドン等が用いられる。この組成物には、塩化ベンザルコニウム等の保存剤を加えることができる。また、担体としてカカオ脂のような油性基材、あるいはセルロース誘導体のような水性ゲル基材を組み合わせることにより、座剤とすることもできる。

本発明の薬剤は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトを含む哺乳動物に対して、必要量が投与される。本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。

また本発明は、白血病治療剤のスクリーニング方法（白血病治療薬のスクリーニング方法）を提供する。
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様においては、PMLKタンパク質の発現量または活性を指標とする方法である。即ち、PMLKタンパク質の発現もしくは活性を低下させる化合物は、該タンパク質のPMLタンパク質の脱リン酸化を活性化しAML1タンパク質を活性化させることにより、白血病細胞の分化を誘導し、その結果、白血病に対して治療効果を有することが期待される。

本発明の上記方法においては、まず、PMLK遺伝子を発現する細胞に被検化合物を接触させる。
本方法に用いる「細胞」は、特に制限されないが、好ましくはヒト由来の細胞である。「PMLK遺伝子を発現する細胞」としては、内因性のPMLK遺伝子を発現している細胞、または外来性のPMLK遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外来性のPMLK遺伝子が発現した細胞は、通常、PMLK遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。

本発明のスクリーニング方法に供する被検化合物としては、特に制限はない。例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられるが、これらに限定されない。また、これらの被検化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。

上記方法において、PMLK遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は、通常、PMLK遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うことができる。

本方法においては、次いで、PMLK遺伝子を発現する細胞におけるPMLKタンパク質の発現量または活性を測定する。発現量の測定は、当業者が簡便に行ない得るものであり、一般的な方法、例えばノーザンブロット法、ウェスタンブロット法等により適宜実施することが可能である。例えば、PMLK遺伝子を発現する細胞に接触させた被検化合物に付した標識を指標にして測定することも可能である。
尚、本発明において「発現」とは、タンパク質をコードする遺伝子からの転写（mRNAの生成）、または該遺伝子の転写産物からの翻訳のいずれの場合をも意味する。

また、PMLKタンパク質の活性を指標にして上記スクリーニング方法を実施する場合には、特に制限されるものではないが、例えば、PMLKタンパク質のPMLタンパク質を基質とするリン酸化酵素活性を指標とする。即ち、PMLKタンパク質のPMLタンパク質を基質とするリン酸化酵素活性を低下させる化合物は、PMLタンパク質を活性化しAML1タンパク質を活性化させることにより、白血病細胞の分化誘導を促進させ、その結果、白血病に対して治療効果を有することが期待される。
PMLKタンパク質の活性の測定は、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することができる。一例を示せば、PMLKタンパク質のリン酸化酵素活性は、後述の実施例に記載の方法によって、適宜測定することができる。

本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合と比較して、PMLKタンパク質の発現量または活性を低下させる化合物を選択する。本方法により単離される化合物は、白血病細胞の分化誘導作用を有することが期待され、さらに白血病治療薬として有用である。
また、本発明の上記方法に従って、被検化合物から白血病細胞の分化誘導剤をスクリーニングすることも可能である。

また、本発明のスクリーニング方法の別の態様としては、PMLタンパク質のリン酸化状態を指標とする方法が挙げられる。PMLタンパク質は脱リン酸化状態において活性化される。従って、PMLのリン酸化状態を検出し、リン酸化の程度を指標とすることにより、白血病治療剤のスクリーニング（白血病治療薬のスクリーニング）が可能である。

本方法においては、まずPMLタンパク質と被検化合物とを接触させる。通常、PMLタンパク質を発現する細胞もしくは該細胞の抽出液と被検化合物とを接触させるが、単離・精製されたPMLタンパク質に被検化合物を接触させてもよい。

次いでPMLタンパク質のリン酸化状態を測定する。リン酸化状態の測定は、当業者においては一般的な方法、例えば、リン酸化特異的抗体を用いたウェスタンブロット法等により、適宜実施することができる。
本発明の上記方法において、リン酸化状態を測定するPMLタンパク質上の部位は、特に制限されないが、好ましくは、PMLタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列）における５０５位、５１８位、５２７位、および／または５３０位のセリン部位である。
また、基質となるPMLタンパク質は、変異を含まない野生型タンパク質であることが好ましいが、PMLKタンパク質によってリン酸化を受ける部位（例えば、上記の５０５位、５１８位、５２７位、および／または５３０位のセリン部位）を含む部分ポリペプチドもしくは、該部位を含む変異ポリペプチドであってもよい。

本方法においては次いで、被検化合物を接触させない場合と比較して、前記リン酸化の程度を低下（脱リン酸化の程度を上昇）させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、白血病細胞の分化誘導作用を有することが期待され、白血病治療薬として有用である。
また、本発明の上記方法に従って、被検化合物から白血病細胞の分化誘導剤をスクリーニングすることも可能である。

本発明のスクリーニング方法のさらに別の態様としては、PMLKタンパク質のリン酸化酵素活性を指標とする方法である。即ち、PMLKタンパク質のPMLタンパク質を基質とするリン酸化活性を指標とする方法である。PMLKタンパク質のリン酸化活性を低下させる化合物は、PMLタンパク質の脱リン酸化を促進し、AML1タンパク質を活性化する。その結果、白血病細胞の分化が誘導され、白血病に対する治療効果が期待される。

本方法においては、まずPMLタンパク質、PMLKタンパク質、および被検化合物を接触させる。次いで、PMLタンパク質を基質としたPMLKタンパク質のリン酸化活性を測定する。
上記方法において使用するPMLKタンパク質は、変異を含まない野生型タンパク質であることが好ましいが、PMLタンパク質をリン酸化する活性を有するものであれば、PMLKタンパク質の一部のアミノ酸配列が置換・欠失されたタンパク質（ポリペプチド）であって構わない。
また、基質となるPMLタンパク質も、変異を含まない野生型タンパク質であることが好ましいが、PMLKタンパク質によってリン酸化を受ける部位を含む、部分ポリペプチドもしくは、該部位を含む変異ポリペプチドであってもよい。
上記方法においてPMLKタンパク質によってリン酸化を受けるPMLタンパク質上の部位は、特に制限されるものではないが、好ましくは、PMLタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列）において５０５位、５１８位、５２７位、および／または５３０位のセリン部位である。
PMLKタンパク質のリン酸化酵素活性は、上述のように、例えば、リン酸化特異的抗体を用いたウェスタンブロット法等により、測定するすることができる。

上記方法においてはさらに、被検化合物を接触させない場合と比較して、前記PMLKタンパク質のリン酸化活性を低下させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、PMLKタンパク質のPMLタンパク質を基質とするリン酸化活性を阻害する結果、白血病細胞の分化を誘導し、白血病に対する治療効果を有するものと考えられる。

本発明のスクリーニング方法によって取得される化合物は、AML1タンパク質の活性化作用を有することが期待される。従って、本発明は上記スクリーニング方法の各工程を含む、AML1活性化剤のスクリーニング方法を包含する。

以下本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕 AML1とPMLの複合体形成
AML1遺伝子の全長であるAML1bおよびAML1遺伝子のＣ末端領域を欠くスプライシングアイソフォームであるAML1aについて、それぞれFLAGを結合した。FLAG-AML1bおよびFLAG-AML1aをレトロウイルスベクターによりマウス骨髄性前駆細胞LGで発現させた。抗FLAG抗体アフィニティーカラムを用いてAML1b複合体を精製した。その結果、AML1b複合体には多くのタンパク質が特異的に含まれていた（図１Ａ）。
次いで、AML1bと共に精製された分子量120kDaのタンパク質をトリプシン消化して質量分析により解析した。その結果、４つのペプチドが同定され、これらはPMLタンパク質のアミノ酸配列であることが分かった（図１Ｂ）。
また、抗PML抗体を用いたウエスタンブロット法による解析から、精製したAML1b複合体にはPMLが含まれることが確認された（図１Ｃ）。
さらに、K562細胞抽出液を抗PML抗体を用いて免疫沈降し、抗AML1抗体でウエスタンブロットを行った。その結果、PMLの免疫沈降物にはAML1が含まれることが分かった（図１Ｄ）。

〔実施例２〕 AML1とPML Iアイソフォームとの特異的な結合
PMLアイソフォームとPML Iの変異体の発現ベクターを作成した。PML遺伝子はスプライシングの差異により多くのアイソフォームを発現するが、そのうち主要なアイソフォームであるPML I〜VIとＣ末端又はアミノ酸２１７位から３１９位を欠失した変異体を用いてAML1との結合を調べた（図２Ａ）。
上記したPMLアイソフォームにFLAGを付け、HA-AML1bと共に293T細胞にリン酸カルシウム法によりトランスフェクションし、４８時間後、細胞抽出液を調整した。抗FLAG抗体で免疫沈降し、抗HA抗体でウエスタンブロットを行ったところ、PML IのみがAML1bと共沈殿することが示された（図２Ｂ）。
同様にして、FLAGを付けたPMLの変異体とAML1bとの結合を調べた。Ｃ末端領域を欠失したd592はAML1bと結合できないことから、PMLのC末端領域がAML1bとの結合に必要であることが明らかになった（図２Ｃ）。

〔実施例３〕 PMLによるAML1依存性転写の活性化
PML-/-及び野生型のマウス胎児性繊維芽細胞(MEF)に、AML1結合配列を持つCCP1-lucレポーター遺伝子(50 ng)、200 ngのpLNCX-AML1b (レーン4〜9)、250 ngのpCMV-p300 (レーン6〜9)、30 ng(レーン2、5、8) 又は100 ng (レーン3、6、9)のpLNCX-PML I及び2 ngのpRL-CMVをリン酸カルシウム法により導入した。２４時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。PMLはp300及びAML1による転写を特にPML-/-のMEFで顕著に促進した（図３ＡおよびＢ、ＡはPML-/-、Ｂは野生型）。

〔実施例４〕 PMLによるマウス骨髄性細胞L-Gの好中球への分化促進
L-G細胞に野生型(WT)及びSUMO-1化部位を欠失した変異体（3R、図２Ａ参照）のPML IをLNCXレトロウイルスベクターにより導入し、ウエスタンブロットにより発現を確認した。その結果、3R変異体ではSUMO-1化されたPML Iが同定できなかった（図４Ａ）。
また、LNCX-PML I、LNCX-PML I 3R、LNCX-AML1bを導入したL-G細胞をG-CSF（5 ng/ml）存在下で培養し、細胞数の変化を調べた。その結果、野生型PML Iの発現はAML1bと同様にL-G細胞の増殖を抑制したが、PML I 3Rはこれとは逆に増殖を促進した（図４Ｂ）。また、G-CSF処理６日目のL-G細胞をメイギムザ染色した。その結果、野生型PMLを発現する細胞では好中球分化の指標である分葉化が見られたが、コントロール細胞やPML I 3Rを発現する細胞では見られなかった（図４Ｃ）。また同じくG-CSF処理８日目のL-G細胞をメイギムザ染色した。その結果、コントロール細胞で分葉化が見られたが、PML I 3Rを発現する細胞では見られなかった（図４Ｄ）。
このように野生型のPML IはL-G細胞の増殖を抑制し分化を促進するが、PML I 3R変異体はドミナントネガティブに作用することから、PMLによるL-G細胞の分化促進にはSUMO-1化が重要であることが示唆された。

〔実施例５〕 M1細胞の分化に伴うPMLの脱リン酸化とSUMO-1化
マウス骨髄性前駆細胞M1を、IL-6(20ng/ml)存在下で３日ないし４日培養し、メイギムザ染色したところ、マウロファージ様に分化したことが分かった（図５Ａ）。
また、無処理及びIL-6処理３日のM1細胞を抗PML抗体及び抗AML1抗体で免疫染色した。その結果、細胞分化に伴いPML及びAML1が斑点状の領域（nuclear body）に共局在していた（図５Ｂ）。
M1細胞をIL-6で１日から４日処理し、PMLの変化をウエスタンブロットで調べた。その結果、IL-6処理２〜３日でPMLの脱リン酸化が誘導され、その後３日目からSUMO-1化が促進された（図５Ｃ）。
このように、M1細胞の分化に伴って、PMLの脱リン酸化およびSUMO-1化が誘導されることが分かった。

〔実施例６〕 PMLのリン酸化部位
LNCX-FLAG-PMLIを導入したL-G細胞から抗FLAG抗体アフィニティカラムによりPML Iを精製し、トリプシン消化後質量分析機により解析した。その結果、PML Iタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）における505、518、527、530位のセリン残基がリン酸化部位であることが示された（図６Ａ）。
このようにして同定された４カ所のセリン残基をアラニンに置換した変異体を作成し、293T細胞又はL-G細胞に導入した。ウエスタンブロットによる移動度の解析から、これらの残基がリン酸化されていることが確認された（図６ＢおよびＣ）。また、リン酸化部位を欠失した変異体はSUMO-1化が促進されていることから、これらの結果と合わせ、脱リン酸化がSUMO-1に重要であることが示唆された。

〔実施例７〕 PMLKタンパク質JNK及びp38によるPMLのリン酸化
野生型PML I又は４カ所のリン酸化部位（セリン505、518、527、530）をアラニンに置換した変異体PML I 4Aを、活性型JNK1(レーン１、MKK7-JNK1)、野生型JNK1及び活性型MKK7（レーン２）又はp38γ及び活性型MKK6と共に293T細胞に導入した。２４時間後ウエスタンブロットにより移動度の変化を調べた。その結果、JNK及びp38の活性化によりPML Iのリン酸化が誘導された（図７Ａ）。
HA-PML Iを導入した293T細胞をJNK及びp38を活性化するanisomycine（10μg/ml）で処理し、ウエスタンブロットにより移動度の変化を調べた。その結果、anisomycine処理によりPML Iのリン酸化が誘導された（図７Ｂ）。
HA-PML Iを導入したL-G細胞をJNKの阻害剤SP600125（10μM）で処理し、ウエスタンブロットにより移動度の変化を調べた。その結果、SP600125処理によりPML Iの脱リン酸化が誘導された（図７Ｃ）。
これらの結果から、JNK及びp38がPMLをリン酸化することが示された。

〔実施例８〕 JNK阻害による細胞分化誘導
ヒト骨髄性白血病細胞K562をJNKの特異的阻害剤であるSP600125で２日間処理し、メイギムザ染色により形態の変化を調べた。その結果、処理後では好中球様に分葉化した細胞が多く見られた（図８）。

図１Ａは、FLAG-AML1b及びFLAG-AML1aをレトロウイルスベクターにより発現させたマウス骨髄性前駆細胞LGから、抗FLAG抗体アフィニティーカラムを用いてAML1b複合体を精製した結果を示す写真である。図１Ｂは、図１ＡでAML1bと共に精製された分子量120kDaのタンパク質をトリプシン消化して質量分析により解析した結果を示す図である。図１Ｃは、抗PML抗体を用いたウエスタンブロット法による解析結果を示す写真である。図１Ｄは、K562細胞抽出液を抗PML抗体を用いて免疫沈降し、抗AML1抗体でウエスタンブロットを行った結果を示す写真である。 図２Ａは、PMLアイソフォームとPML Iの変異体の構造を示す図である。図２Ｂは、FLAGを付けたPMLアイソフォームをHA-AML1bと共に293T細胞にトランスフェクションし、４８時間後に抗FLAG抗体で免疫沈降し、抗HA抗体でウエスタンブロットを行った結果を示す写真である。図２Ｃは、FLAGを付けたPMLの変異体とAML1bとの結合をウエスタンブロットによって調べた結果を示す写真である。 図３は、PML-/-(A)及び野生型(B)のマウス胎児性繊維芽細胞(MEF)にAML1結合配列を持つCCP1-lucレポーター遺伝子(50 ng)、200 ngのpLNCX-AML1b (レーン4〜9)、250 ngのpCMV-p300 (レーン6〜9)、30 ng (レーン2、5、8) 又は100 ng (レーン3、6、9)の pLNCX-PML I及び 2 ngのpRL-CMVをリン酸カルシウム法により導入し、２４時間後のルシフェラーゼ活性測定結果を示すグラフである。 図４Ａは、L-G細胞に野生型(WT)及びSUMO-1化部位を欠失した変異体（3R）のPML IをLNCXレトロウイルスベクターにより導入し、ウエスタンブロットにより発現を確認した結果を示す写真である。図４Ｂは、LNCX-PML I、LNCX-PML I 3R、LNCX-AML1bを導入したL-G細胞をG-CSF（5 ng/ml）存在下で培養し、細胞数の変化を調べた結果を示すグラフである。図４Ｃは、G-CSF処理６日目のメイギムザ染色像を示す写真である。図４Ｄは、G-CSF処理８日目のメイギムザ染色像を示す写真である。 図５Ａは、M1をIL-6(20ng/ml)存在下で３日ないし４日培養し、メイギムザ染色した結果を示す写真である。図５Ｂは、無処理及びIL-6処理３日のM1細胞を抗PML抗体及び抗AML1抗体で免疫染色した結果を示す写真である。図５Ｃは、Ｍ１細胞をIL-6で１日から４日処理し、PMLの変化をウエスタンブロットで調べた結果を示す写真である。 図６Ａは、精製したPML Iをトリプシン消化後質量分析機により解析した結果を示す。PML Iタンパク質のアミノ酸配列における505、518、527、530位のセリン残基がリン酸化部位であることが示された。図６ＢおよびＣは、同定された４カ所のセリン残基をアラニンに置換した変異体を作成し、293T細胞(Ｂ)又はL-G細胞(Ｃ)に導入し、ウエスタンブロットによる解析結果を示す写真である。 図７Ａは、野生型PML I（上パネル）又は４カ所のリン酸化部位（セリン505、518、527、530）をアラニンに置換した変異体PML I 4A（下パネル）を活性型JNK1(レーン１、MKK7-JNK1)、野生型JNK1及び活性型MKK7（レーン２）又はp38γ及び活性型MKK6と共に293T細胞に導入し、２４時間後ウエスタンブロット解析した結果を示す写真である。図７Ｂは、HA-PML Iを導入した293T細胞をanisomycine（10μg/ml）で処理し、ウエスタンブロットにより移動度の変化を調べた結果を示す写真である。図７Ｃは、HA-PML Iを導入したL-G細胞をSP600125（10μM）で処理し、ウエスタンブロットにより移動度の変化を調べた結果を示す写真である。 図８は、K562細胞をSP600125で２日間処理し、メイギムザ染色した結果を示す写真である。

Claims (10)

1. ＰＭＬタンパク質の発現活性化物質または機能活性化物質を含む、白血病細胞の分化誘導剤。
2. ＰＭＬタンパク質の機能活性化物質が、ＰＭＬタンパク質脱リン酸化酵素の活性化物質、もしくはＰＭＬタンパク質リン酸化酵素の阻害物質である、請求項１に記載の白血病細胞の分化誘導剤。
3. ＰＭＬタンパク質上の部位であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の５０５位、５１８位、５２７位、および／または５３０位のセリン部位のリン酸化を抑制する、もしくは該セリン部位の脱リン酸化を促進する物質を含む、白血病細胞の分化誘導剤。
4. ＰＭＬＫタンパク質の発現阻害物質または機能阻害物質を含む、白血病細胞の分化誘導剤。
5. ＰＭＬＫタンパク質の発現阻害物質が、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物である、請求項４に記載の白血病細胞の分化誘導剤。
   （ａ）ＰＭＬＫ遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
   （ｂ）ＰＭＬＫ遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
   （ｃ）ＰＭＬＫ遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果による阻害作用を有する核酸
6. 請求項１〜５のいずれかに記載の白血病細胞の分化誘導剤を有効成分として含む、白血病治療薬。
7. 以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、白血病治療剤のスクリーニング方法。
   （ａ）ＰＭＬＫ遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
   （ｂ）前記細胞におけるＰＭＬＫタンパク質の発現量または活性を測定する工程
   （ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、発現量または活性を低下させる化合物を選択する工程
8. 以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、白血病治療剤のスクリーニング方法。
   （ａ）ＰＭＬタンパク質および被検化合物を接触させる工程
   （ｂ）ＰＭＬタンパク質のリン酸化状態を測定する工程
   （ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記リン酸化の程度を低下させる化合物を選択する工程
9. 以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、白血病治療剤のスクリーニング方法。
   （ａ）ＰＭＬタンパク質、ＰＭＬＫタンパク質、および被検化合物を接触させる工程
   （ｂ）ＰＭＬタンパク質を基質とする、ＰＭＬＫタンパク質のリン酸化活性を測定する工程
   （ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記リン酸化活性を低下させる化合物を選択する工程
10. ＰＭＬタンパク質におけるリン酸化部位が、配列番号：２に記載のＰＭＬタンパク質のアミノ酸配列において、５０５位、５１８位、５２７位、および／または５３０位のセリン部位である、請求項８または９に記載のスクリーニング方法。