JP2005295860A - 核酸解析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 高次構造を取るようなＤＮＡを解析ターゲットとした核酸解析方法を提供する。
【解決手段】 二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ１に変性し、ゲノムＤＮＡの解析しようとする解析ターゲットの領域の配列あるいは変異に特異的なプライマー３、４を一本鎖ＤＮＡ１にハイブリダイズさせ、基質、ポリメラーゼ及び1本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（ＳＳＢ）を用いてプライマーを始点とする相補鎖合成を行い、化学発光試薬を用いて、相補鎖合成により生じるピロリン酸５を化学発光させ、発光を検出することにより、ゲノムＤＮＡにおける変異の有無を解析する。
【選択図】 図１

Description

ゲノム解析が進展し、昨今では遺伝子発現の多様性の原因ではないかと考えられているゲノム中の一塩基多型（ＳＮＰｓ:Single Nucleotide Polymorphisms）の解析が注目されている。現在使われている塩基置換解析法には種々あるが、短時間に短いＤＮＡ配列を決定し、決定されたＤＮＡ塩基配列を用いてミューテーションを調べようとする場合には、Ｎｙｒｅｎらのパイロシーケンシングが有効である。パイロシーケンシングは、ターゲットＤＮＡにプライマーをハイブリダイズさせ、相補鎖伸長反応で生成するピロリン酸をＡＴＰに変え、ＡＴＰにルシフェリンを作用させて発光させ、この化学発光を検出することにより、相補鎖合成で取り込まれた基質（ｄＮＴＰ）を知り、ＤＮＡ塩基配列を決定する方法である。

神原らはこのパイロシーケンシングを基に、プライマーの3´末端近傍をターゲットのＳＮＰｓ部位にハイブリダイズさせ、相補鎖合成を進行させて得られるピロリン酸をＡＴＰに変換して化学発光させ、ＳＮＰｓを検出する方法を報告している（ＢＡＭＰＥＲ法：Bioluminometric Assay with Modified Primer Extension Reaction、下記非特許文献１）。

ここでは、３´末端のプライマーがターゲットにきちんとハイブリダイズした時にだけ、相補鎖合成が起こる特性を利用して、野生種のターゲットと変異種のターゲットを見分けている。すなわち、伸長産物の有無ではなく伸長反応の有無をピロリン酸の生成量を化学発光で測定することで判定している。しかしこの方法では、ターゲットのＤＮＡが高次構造を取らないように、測定に先立ってＰＣＲで対象となるＤＮＡの長さを限定し、コピー数を増やしてから、磁気ビーズなどを用いて1本鎖ＤＮＡをまず精製しなければならない。次いで、これを鋳型として塩基の変異に特異的な相補鎖合成を行い、得られるピロリン酸をＡＴＰに変え、ルシフェリンと反応させて得られる化学発光を測定するという複雑なプロセスが必要であった。

また、鋳型となる1本鎖ＤＮＡの作製を行わず、２本鎖ＤＮＡを直接ターゲットとする場合には、ターゲットのＤＮＡが高次構造を取らないように、測定に先立ってＰＣＲで対象となるＤＮＡの長さを限定し、コピー数を増やしてから、２本鎖ＤＮＡ中に含まれるＰＣＲ時に生成したピロリン酸や障害となる１本鎖ＤＮＡを分解した後、特異的な相補鎖合成、化学発光を行うというように解析に手間がかかっていた。

一方、ターゲットＤＮＡにプライマーをハイブリダイズさせた後、伸長した相補鎖をエキソヌクレアーゼにより切断し、再度相補鎖伸長を行うことにより、多くのピロリン酸を生成して、解析する方法も試みられた。これは、ＰＣＲ増幅を必要としない方法であるが、ターゲットＤＮＡの５´末端をビーズ等の固体単体に固定したり、あるいは修飾したりしてエキソヌクレアーゼによりターゲットＤＮＡが分解を受けないようにしておく必要があった。

Nucl.Acid Res.29, e93(2001)

神原らが報告したＢＡＭＰＥＲ法は、簡便で安価な化学発光を利用するＤＮＡ変異検出方法である。しかし解析ターゲットのゲノムＤＮＡの高次構造によるＤＮＡポリメラーゼの進行妨害を防ぐため、ＰＣＲで解析ターゲットの長さを限定し、ＰＣＲ反応中に生成した障害物を分解あるいは精製除去しなければならない。また、解析ターゲットが長さの限定されたＰＣＲ産物であるため、後の化学発光で充分な信号強度を得るために、ＰＣＲ反応を数サイクル行いピロリン酸を量産していた。これは作業の手間や時間がかかる上、鋳型ＤＮＡやｄＮＴＰの分解を招き、反応効率や解析結果にも影響を与える。一方、ＰＣＲ増幅のいらない方法も試みられたが、ターゲットＤＮＡの５´末端をビーズ等の固体単体に固定したりあるいは修飾したりして、エキソヌクレアーゼによりターゲットＤＮＡが分解を受けないようにしておく必要があった。そこで鋳型ＤＮＡやｄＮＴＰの分解を防ぐためにも、ＰＣＲサイクル反応とは異なり、またエキソヌクレアーゼによる反応とは違う効率の良い方法が望まれていた。

本発明の目的は、高次構造を取るようなＤＮＡを解析ターゲットとした核酸解析方法を提供することである。

本発明では、ゲノムＤＮＡとゲノムＤＮＡの解析しようとする解析ターゲットの領域の配列あるいは変異に特異的なプライマーを変性、ハイブリダイズ後、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（ＳＳＢ：Single Stranded DNA Binding Protein）を投入する。これにより一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質はプライマーがハイブリダイズしなかった一本鎖ＤＮＡに結合し、その部分の一本鎖の構造を保持する。このため、ＤＮＡの高次構造によるＤＮＡポリメラーゼの進行妨害が起こらず、その後の相補鎖伸長反応を一回だけ行うことで得られたピロリン酸を化学発光試薬と反応させて解析ターゲットの有無を効率よく解析できる。

本発明により、変異解析を迅速に行うことができ、サーマルサイクラーのような温度と時間を厳密に繰返し管理する装置が不要となる。

図１に本発明のスキームを説明する。以下、図１を参照して、本発明を説明する。

[ゲノムＤＮＡとプライマーの変性]
解析部位２を有するゲノムＤＮＡ１をターゲットとし、反応槽に入れる。ターゲットの領域の配列に特異的であり、３´末端が期待される塩基配列の変異部分の塩基にハイブリダイズするよう設計されたプライマー３、４をそれぞれ反応槽に加えて、熱変性する。プライマー３はＤＮＡの野生種（ワイルドタイプ）に相補的なプライマーであり、プライマー４はＤＮＡの変異種（ミュータント）に相補的なプライマーである。こうしてＤＮＡの高次構造を解消し、二本鎖を一本鎖にする。

［ゲノムＤＮＡとプライマーのハイブリダイズ］
変性の終了した反応槽において、ターゲットＤＮＡ１とプライマー３及びプライマー４をハイブリダイズさせる。

［ＳＳＢの投入］
ターゲットＤＮＡ１とプライマー３、４をハイブリダイズさせた後、各反応槽の温度を下げ、ＳＳＢを投入してプライマー３、４がハイブリダイズしなかったゲノムＤＮＡの一本鎖部分にＳＳＢを結合させる。これによりターゲットＤＮＡ１の一本鎖部分の構造を保持し、ＤＮＡの高次構造によるＤＮＡポリメラーゼの進行妨害を防ぐ。

［相補鎖合成］
基質及びＤＮＡポリメラーゼを各反応槽に加えて、相補鎖の相補鎖合成工程を行う。ＳＳＢの投入によりＤＮＡの高次構造が解消され、相補鎖合成を一回のみでも行うことができる。相補鎖合成は、プライマーの３´末端がターゲットＤＮＡ１の解析部位２と完全に相補的である場合には相補鎖伸長は起こるが、プライマーの３´末端がターゲットＤＮＡ１の解析部位２と完全に相補的でない場合には相補鎖伸長は起こらないか、あるいは起こりにくい。そこで、プライマーの３´末端が変異の期待される部位にくるように設計されたプライマー３、４を用いて相補鎖合成が起こるか起こらないかで、変異の有無を調べることができる。

解析ターゲットのゲノムＤＮＡは、ヒトの血液や組織の一部より抽出されたものを使用する。またヒトに限定されることはない。実施例では高次構造を取り得る数十ｋｂｐ以上のゲノムＤＮＡを200ｎｇ使用しているが、100〜500ｎｇでも良い。またここで限定した長さや二本鎖であることに限らず、数十ｋｂｐ以下や一本鎖ＤＮＡ、場合によってはＲＮＡでも良い。ＲＮＡを使用する場合には、逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、以下の手順はゲノムの場合と同じである。

本実施例では、ターゲットの領域の配列に特異的なプライマーを、以下で説明する（配列１）及び（配列２）に示すように30マーに設計したことで、ターゲットＤＮＡとプライマーの特異性が向上した。勿論30マー以上でも、支障はない。（配列1）及び（配列2）のＤＮＡプライマーはターゲット配列に相補的でない人工的なミスマッチ塩基を３´末端から３塩基目に持っているが、ミスマッチ塩基の場所はこの位置に限らず、またミスマッチ塩基を持たなくとも良い。

本実施例では伸長反応を37℃で行っているが、Taq Polymeraseの伸長速度は、一般に75℃の時を100とすると37℃の時には0.8になってしまう。しかし実施例では、ＳＳＢによりゲノムＤＮＡの高次構造を解消したため、相補鎖伸長を一回のみ行うことで解析することが出来た。勿論、37℃でも充分な伸長速度を持つような、例えばｕｓｂ社のT7 DNA Polymeraseを使用することも出来る。

相補鎖伸長反応時の基質となるｄＮＴＰは、高温にさらされると分解してピロリン酸を生じるため、実施例では解析結果に影響を及ぼすことがある。そこで、実施例では変性、ハイブリダイズ、相補鎖伸長の各工程を一回ずつ行い、サイクル反応によりｄＮＴＰを何度も高温にさらさないようにした。また、ｄＮＴＰには市販時に１ｕＬあたり600〜700 ｆｍｏｌ程度のピロリン酸が含まれていることがあり、これが不要発光を起こしノイズの原因となる。そこで使用する前にｄＮＴＰをピロホスファターゼで処理している。

相補鎖合成で生成したピロリン酸を検出する化学発光試薬はルシフェリン、ルシフェラーゼ等を含有するものである。

本実施例で使用した一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質(SSB:E.coliSingle-stranded DNA binding protein)は、４つの同一なサブユニット（18.9 ｋＤａ）から成り、複製や組換えに関連があると言われている。ある種の遺伝子では全長の増幅産物を得るのに極めて有効と言われ、また高温でも安定なことからＰＣＲの使用に適している。本実施例では、ゲノムＤＮＡとプライマーをハイブリダイズさせた後、ＳＳＢを溶液に投入してプライマーがハイブリダイズしなかったゲノムＤＮＡの一本鎖部分にＳＳＢを結合させた。これによりターゲットＤＮＡの一本鎖部分の構造を保持し、ＤＮＡの高次構造によるＤＮＡポリメラーゼの進行妨害を防ぐことで、その後の相補鎖伸長を一回のみ行う。またＳＳＢと同様一本鎖ＤＮＡに結合するＲｅｃＡ蛋白質（RecA protein）を使用することも可能である。

本実施例では温度と時間が自由に設定できる装置、例えばMJ Research社のサーマルサイクラー（PTC-200）を使用した。温度と時間の設定を変えることにより、二本鎖ＤＮＡを変性して一本鎖ＤＮＡとしたり、酵素反応による相補鎖伸長反応を行ったりできる。実施例では、95℃5分で変性、70℃60分でハイブリダイズ、37℃1分でＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖伸長反応を行った。また鋳型となるＤＮＡや反応基質のｄＮＴＰは高温で分解するため、反応効率や解析結果をよくするために、実施例では変性、ハイブリダイズ、相補鎖伸長の各工程を一回ずつ行い、サイクル反応により何度もＤＮＡやｄＮＴＰを高温にさらさないようにした。

尚、実施例では温度と時間の設定にサーマルサイクラーを用いたが、本発明においては、サーマルサイクラーのような温度と時間を厳密に繰返し管理する装置は必ずしも必要ではなく、水浴や恒温槽のような比較的シンプルな装置を用いても、本発明を十分に実行できる。

本実施例ではPerkin Elmer社のルミノメーター（Wallec 1420 ARVOsx）を使用し、相補鎖合成時に生成したピロリン酸を化学発光（λ＝530 ｎｍ）として測定した。実施例で使用した化学発光試薬の場合、スペクトルは最大波長が530 ｎｍで、半値幅は497〜565 ｎｍである。このため一般のホトマルチプライヤーを用いた市販のプレートリーダーでも使用可能である。

以下、段階毎に具体的に実施例を説明する。
１.ゲノムＤＮＡとプライマーの変性
本実施例はβ２アドレナリン受容体遺伝子を解析するもので、ゲノムＤＮＡ１（約２００ｎｇ）をターゲットとし、前記ターゲットＤＮＡ１をそれぞれ反応槽−１、反応槽−２に入れる。ターゲットの領域の配列に特異的であり、３´末端が期待される塩基配列の変異部分の塩基にハイブリダイズするよう設計されたプライマー３、４(0.9 ｕＭ)をそれぞれ反応槽−１、反応槽−２に加えて、95℃、5分で変性する。

（配列１） ＴＴＣＴＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴＴＣＣ
（配列２） ＴＴＣＴＴＧＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴＴＣＡ

（配列１）はＤＮＡの野生種に相補的なプライマー３、（配列２）は変異種に相補的なプライマー４である。こうしてＤＮＡの高次構造を解消し、二本鎖を一本鎖にする。実施例では変性温度を95℃、５分としたが、92〜95℃でも良く、また時間も５分以上でもよいが、必要以上の高温長時間では、ＤＮＡの分解を招くことになる。

２．ゲノムＤＮＡとプライマーのハイブリダイズ
変性の終了した反応槽−１、反応槽−２を70℃とし、60分かけてターゲットＤＮＡ１とプライマー３、４をハイブリダイズさせる。プライマー3、4のＴｍ値から実施例ではハイブリダイズを70℃とし、ハイブリダイズが充分完了するように60分行ったが、これより低い温度でも良く、また60分よりも短くても良い。

３.ＳＳＢの投入
ターゲットＤＮＡ１とプライマー３、４をハイブリダイズさせた後、反応槽−１、反応槽−２を37℃まで下げ、ＳＳＢ(100 ｎｇ)をそれぞれ反応槽−１、反応槽−２に投入してプライマー３、４がハイブリダイズしなかったゲノムＤＮＡの一本鎖部分にＳＳＢを結合させる。これによりターゲットＤＮＡの一本鎖部分の構造を保持し、ＤＮＡの高次構造によるＤＮＡポリメラーゼの進行妨害を防ぐ。ＳＳＢは高温でも安定であると言われるが、実施例では最初から反応槽−１、反応槽−２にＳＳＢを投入して変性、ハイブリダイズ、相補鎖合成を行ったところ、相補鎖の伸長が認められず、変異の有無を解析できなかった。原因は不明である。しかし、変性、ハイブリダイズ後、37℃に下がった反応槽−１、反応槽−２にＳＳＢを投入したところ、この後実施例で説明するように変異の有無を解析することができた。

４.相補鎖合成
本実施例では、ｄＮＴＰ ｍｉｘ(45 ｕＭ)及びＤＮＡポリメラーゼ（0.1375 Ｕ）を反応槽−１、反応槽−２に加えて、37℃1分間相補鎖の相補鎖合成工程を行った。ＳＳＢの投入によりＤＮＡの高次構造が解消され、相補鎖合成を一回のみ行う。反応体積は5.5 ｕＬである。

相補鎖合成は、プライマーの３´末端がターゲットＤＮＡ１の解析部位２と完全に相補的である場合には相補鎖伸長は起こるが、プライマーの３´末端がターゲットＤＮＡと完全に相補的でない場合には相補鎖伸長は起こらないか、あるいは起こりにくい。そこで、プライマーの３´末端が変異の期待される部位にくるように設計されたプライマー３、４を用いて相補鎖合成が起こるか起こらないかで、変異の有無を調べることができる。

相補鎖合成時間は例えば10分又は30分又は60分でも良いが、本実施例では１分間で解析が可能であった。

また、本実施例では、変性、ハイブリダイズ、相補鎖合成の各工程を一回ずつ行ったことで、ゲノムＤＮＡの分解を防ぎ、効率の良い方法を提供したが、勿論変性、ハイブリダイズ、相補鎖合成の工程を一セットとして数回のサイクルで行うことも可能である。この場合、相補鎖合成の後、加熱を行い、相補鎖を一旦解離した後、ハイブリダイズ、及び相補鎖合成の工程を繰り返す。

５．発光反応
化学発光試薬（ルシフェリン、ルシフェラーゼ等を含む）10 ｕＬを反応槽−１、反応槽−２に加えて、相補鎖合成で生成したピロリン酸５をＡＴＰに変換してルシフェリンと反応させる。得られた化学発光は、ルミノメーターで測定する。野生種に対応したプライマー３を加えた反応槽−１から得られる発光強度が、変異種に対応したプライマー４を加えた反応槽−２から得られる発光強度よりも数倍以上大きい時には、ターゲットが野生種であることが分かる。一方、逆の場合は変異種である。また一対の染色体がそれぞれ異なる種（野生種と変異種）をそれぞれ持つ時には反応槽−１、反応槽−２の発光強度はほぼ同じとなり、ヘテロと分かる。

実測例を図２に示した。この例では、β２アドレナリン受容体遺伝子を解析した。ここでは、（配列１）を持つ野生種に特異的プライマー３と（配列２）を持つ変異種に特異的プライマー４を用いて測定した。図２では、（配列1）を持つ野生種に特異的プライマー３を用いた結果を白い棒グラフ６、（配列２）を持つ変異種に特異的プライマー４を用いた結果を黒い棒グラフ７で示す。検体１と検体３は野生種用プライマーにのみ反応したため野生型ホモであることが分かった。検体２は野生種用、変異種用両プライマーに反応し、ヘテロであることが分かった。

一方、本実施例においてＳＳＢを反応槽−１、反応槽−２に投入しない際には、検体１と検体２では、相補鎖伸長が認められず、検体３では誤った伸長反応により本来は野生型ホモであるが、変異型ホモという判定結果であった。

ＳＮＰｓなど遺伝子の変異を解析する手法において、ＳＳＢを用いる報告はない。実施例により開示された方法によれば、ＤＮＡの高次構造によるＤＮＡポリメラーゼの進行妨害を防ぐために、測定に先立ちＰＣＲ等で対象となるＤＮＡの長さを限定し、増幅する必要は無くなり、高次構造を取り得る数十ｋｂｐ以上のＤＮＡも解析ターゲットとすることが出来る。また、ＳＳＢによるＤＮＡの高次構造解消のために、相補鎖伸長を一回のみ行うことでも変異の有無を解析できる。

本実施例によれば、従来のＢＡＭＰＥＲ法に比べ、ＳＳＢを投入することで、下記のような効果を奏する。（１）ＰＣＲ増幅が不要であり、操作がシンプルで複雑な装置は不要であり、操作時間も短い。（２）高次構造を取り得る数十ｋｂｐ（塩基対）以上のＤＮＡ、場合によっては高次構造を取り得る数百ｂｐ（塩基対）程度のＤＮＡも核酸変異解析のターゲットとすることが出来る。（３）相補鎖伸長合成を一回行うだけでも十分なピロリン酸発光を検出できる。この結果、変異解析を迅速に行うことができる他、サーマルサイクラーのような温度と時間を厳密に繰返し管理する装置が不要となるなど、解析装置を小型化することができる。又、本実施例は、ＢＡＭＰＥＲ法の改良であるため、（４）生成したピロリン酸の発光を検出するものであり、蛍光を検出する他の核酸変異解析法に比べて、装置の小型化、低コスト化に役立つ。

本発明のスキームを説明する図。 実施例における実測例を示す図。

符号の説明

１・・・ターゲットＤＮＡ
２・・・ターゲットＤＮＡのミューテーションの有無を調べる位置
３・・・ターゲットＤＮＡの野生種に相補的なプライマー
４・・・ターゲットＤＮＡの変異種に相補的なプライマー
５・・・ピロリン酸
６・・・実施例における特異的プライマー３を用いた結果
７・・・実施例における特異的プライマー４を用いた結果

Claims (7)

1. 二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性し、
   ゲノムＤＮＡの解析しようとする解析ターゲットの領域の配列あるいは変異に特異的なプライマーを一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせ、
   基質、ポリメラーゼ及び1本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を用いてプライマーを始点とする相補鎖合成を行い、
   化学発光試薬を用いて、相補鎖合成により生じるピロリン酸を化学発光させ、
   発光を検出することにより、ゲノムＤＮＡにおける変異の有無を解析する核酸解析方法。
2. 請求項１記載の核酸解析方法であって、二本鎖ＤＮＡが、１０ｋｂｐ（塩基対）以上の長さである方法。
3. 請求項１記載の核酸解析方法であって、二本鎖ＤＮＡが、高次構造を取るのに十分な長さである方法。
4. 請求項１記載の核酸解析方法であって、相補鎖伸長合成を一回のみ行う方法。
5. 請求項１記載の核酸解析方法であって、相補鎖伸長合成を二回以上行った後に、化学発光試薬を用いて、相補鎖合成により生じるピロリン酸を化学発光させ、発光を検出する方法。
6. 請求項１記載の核酸解析方法であって、ハイブリダイズ時よりも低い温度において、1本鎖ＤＮＡ結合蛋白質を用いる方法。
7. 請求項１記載の核酸解析方法であって、一塩基多型（ＳＮＰｓ）の解析である方法。
   

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