JP2005306873A - ヌクレオシド誘導体、並びにその製造方法および使用 - Google Patents

Abstract

【課題】 新規な感光性保護基を有するヌクレオシド誘導体であって、当該保護基が特に迅速に、かつ副反応を生じることなく開裂しうるヌクレオシド誘導体及びその製造法を提供する。
【解決手段】 下記化学式：

（式中、Ｒ_１〜Ｒ_７は、水素原子、ハロゲン原子、ＮＯ_２、ＣＮ、ＯＣＨ_３、アルキル基、アルコキシ基もしくはアルコキシアルキル基、または、炭素原子数２〜５のアリール基もしくは脂肪族アシル基であり、Ｘは、Ｃ＝ＯまたはＣ＝Ｓであり、Ｙは、Ｓ、Ｏ、ＮＲ’、Ｃ（Ｒ’）_２であり、Ｒ’は、水素原子、アルキル基、またはアリール基であり、Ｚは、ＳＯ_２、ＯＣＯ、ＯＣＳ、ＳＣＳ、ＣＯまたはＣＳであり、ｎは０、１、２または３であり、ただしｎが０の場合、ＺはＣＯ、ＣＳ、およびＳＯ_２から選択され、Ｎはヌクレオチドである）で表される、感光性保護基を有するヌクレオシド誘導体及びその製造法。
【選択図】なし

Description

本発明は、感光性保護基を有するヌクレオシド誘導体、並びに、その製造方法および、例えば空間アドレスされた光制御合成による固体基板上へのＤＮＡチップの製造のための前記誘導体の使用に関する。

分子から官能基を選択的かつ容易に開裂させることは、化学および生物学の多くの分野、特に、ポリマーや天然物質等のような主要な化学種の合成において、重要な役割を果たしている。

これに関連して、例えば、好ましくない副反応によって、意図する２つの分子の連結に影響を与えうる、またはこの連結を阻害しうる特定の反応性基を、これらが所望の連結反応に関与しないように、化学的または物理的に再開裂可能な保護官能基によって選択的に「マスク」または保護することが時として行われている。

溶液中で基材上に結合相手である生体分子が固定化された広範なコンビナトリアルライブラリを用いることは、同一のまたは異なる構造クラスの生体分子どうしの分子の探索の比較研究に特に有利である。「生体分子」という語は、当業者によれば、核酸およびその誘導体、タンパク質、ペプチド、並びに炭化水素のクラスに属する特定の化合物を意味するものと理解される。

共通の分子探索の原理を用いる広範なコンビナトリアルライブラリは、特に核酸の分析に非常に有用である。例えば医学や薬剤の研究において、ガラスまたはポリマー基板上に固定化された、ＤＮＡまたは任意の所望のオリゴヌクレオチドのＤＮＡチップ、すなわち、いわゆるマイクロアレイ（Ｓ．Ｐ．Ａ． Ｆｏｄｏｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７ （１９９７） ３９３， ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）が時に用いられている。

ここで、ＤＮＡチップはさらに、遺伝子分析および遺伝子診断にも重要な役割を果たしている。かようなＤＮＡチップを製造するために最も広く用いられている技術は、感光性保護基、すなわち、特定の波長を有する紫外光により選択的に再開裂されてさらなる反応のために保護官能性を付与しうる、ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチド構成単位の反応性のための保護基、を用いた固体基板上への空間アドレスされた、平行な、オリゴヌクレオチドの光制御合成である。

これに関連して、上記のようなフォトリソグラフィ技術は、ＤＮＡチップの製造に有用である。基板上への所望のオリゴヌクレオチド鎖の合成デザインは、例えば露光（この目的にはＵＶ／ＶＩＳ領域の電磁波が用いられる）によって次のヌクレオチド用の連結部位を露出する、不安定な、好ましくは感光性の保護基によって、制御される。これらの感光性保護基により、コンビナトリアル戦略は空間選択的な露光を用いて、発展しうる。

この戦略を用いると、合成サイクル数の増加とともにその数が指数関数的に増加する、極めて高密度で空間アドレス可能なオリゴヌクレオチドのマイクロアレイの製造が可能となる。各要素について現状で到達しうるのは２５μｍ^２未満の領域であり、理論的には１ｃｍ^２あたり１０^６超のプローブ領域が収容されうる。露光は、現状ではデジタルプロジェクション技術に用いられているようなマイクロミラーアレイ（Ｓ． Ｓｉｎｇｈ−Ｇａｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ． １７ （１９９９） ９７４， Ｍａｓｋｌｅｓｓ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ｕｓｉｎｇ ａ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ Ａｒｒａｙ）により行われている。従って、時間がかかり高価な露光マスクの作製が省略され、これによりフォトリソグラフィ技術によるＤＮＡチップの迅速な製造が可能となる。

よって、フォトリソグラフィ合成の主要な問題は、有機化学および生物有機化学において種々の化学的な変形に用いられているこれらの感光性保護基の種類に関連するものである（Ｖ．Ｎ．Ｒ． Ｐｉｌｌａｙ， Ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｉｃ Ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐｓ； ｉｎ： Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ９， ｅｄ． Ａ． Ｐａｄｗａ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｂａｓｅｌ， １９８７） ｐａｇｅ ２２５ ｅｔ ｓｅｑ．）。最も広く用いられているのは、２−ニトロベンジル基を基礎とする感光性保護基である（Ｊ．Ｅ．Ｔ． Ｃｏｒｒｅｙ ａｎｄ Ｅ．Ｒ． Ｔｒｅｎｔｏｎ， Ｃａｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ； ｉｎ： Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｗｉｔｃｈｅｓ， ｉｎ： Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ， Ｖｏｌ． ２， ｅｄ． Ｈａｒｒｙ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ （Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， １９９３）， ｐａｇｅ ２４３ ｅｔ ｓｅｑ．）。

ＤＮＡチップの製造時に、例えば３’末端から５’末端へ、または５’末端から３’末端へとオリゴヌクレオチド合成する際に末端ＯＨ基を保護する目的で、これまでかなりの期間に亘ってＤＮＡチップの製造時の標準的な保護基であった２−ニトロベンジル型の保護基に含まれるＭｅＮＰＯＣ（α−メチルニトロピペロニルオキシカルボニル）が、現在では好ましく用いられている（Ｓ．Ｐ．Ａ． Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１ （１９９１）， ７６７， Ｌｉｇｈｔ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ， Ｓｐａｔｉａｌｌｙ Ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）。

非常に反応性の高い脱離基である芳香族ニトロソケトンを光照射後に形成することは、この種の保護基については好ましくない。よって、好ましくない副反応および正常な反応が進行するが、これにより、得られるオリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドのヌクレオチド合成に欠陥をもたらされることがよくある。かような正常反応および副反応は例えば、存在する感光性保護基自身が電磁波により励起され、励起状態において、分解、分子内および分子間転位などの複数の副反応を引き起こしうることにより生じる。

さらに、ＤＮＡチップの製造用には２−（２−ニトロフェニル）エトキシカルボニル化合物が知られている。この保護基は、２−ニトロスチレン誘導体として開裂する（ＤＥ−ＰＳ ４４ ４４ ９９６， ＤＥ−ＰＳ １９６ ２０ １７０ ａｎｄ Ｕ．Ｓ． ５，７６３，５９９）。副反応の妨害については、一般的にはほとんど反応しない２−ニトロスチレンとして開裂する結果、これらの化合物は上記の化合物よりも妨害しやすいとはいえない。

短期間ではあるが、ＤＭＢＯＣ基（３’，５’−ジメトキシベンゾイニルオキシカルボニル基）が、選択的ポリヌクレオチド合成における保護基として用いられていた（Ｍ．Ｃ． Ｐｉｒｒｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６３ （１９９８）， ２４１， Ｐｒｏｏｆｉｎｇ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ ｗｉｔｈ ３’，５’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｉｎｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｄｅｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）。

このように従来用いられていた他の保護基としては、例えば、ＮＰＰＯＣ（２−（２−ニトロフェニル）プロピルオキシカルボニル）、ＭｅＮＰＰＯＣ（２−（３，４−メチレンジオキシ−２−ニトロフェニル）プロピルオキシカルボニル）、ＭｅＮＰＯＣ（２−（３，４−メチレンジオキシ−２−ニトロフェニル）オキシカルボニル）、ＤＭＢＯＣ（時メトキシベンゾイニリルオキシカルボニル）、ＮＰＥＳ（２−（２−ニトロフェニル）エチルスルホニル）、およびＮＰＰＳ（（２−ニトロフェニル）プロピルスルホニル）がある。

このようにして合成されるＤＮＡチップのエラー率については、現在用いられている感光性保護基もまだ満足のいく結果を示してはいない（Ｄ．Ｊ． Ｌｏｃｋｈｅａｒｔ ａｎｄ Ｅ．Ａ． Ｗｉｎｓｅｌｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ４０５ （２０００） ８２７， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ Ａｒｒａｙｓ）。

また、かような保護基は通常、用いられるＵＶ／ＶＩＳ波長に対する吸収性が小さいため、これらの保護基の開裂は充分には行われない。加えて、このようにして好ましくない反応産物を有する副反応を妨害すると、ＤＮＡチップ上のオリゴヌクレオチドの大部分が用いられることができない。

さらに、現在知られている保護基は、定量的に反応しうる水銀灯の３６５ｎｍの光線を一般的な照射強度で用いると数分間の照射時間を必要とするため、この開裂反応の反応速度は、このように知られている保護基については不充分なほど遅い。

よって、本発明の目的は、従来技術についての上記の欠点を示さず、新規な感光性保護基を有するヌクレオシド誘導体であって、当該保護基が特に迅速に、かつ副反応を生じることなく開裂しうるヌクレオシド誘導体を提供することである。

上記の目的は、感光性保護基を含有し、下記化学式１：

式中、Ｒ_１は、水素原子、ハロゲン原子、ＮＯ_２、ＣＮ、ＯＣＨ_３、炭素原子数１〜４のアルキル基（好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基もしくはブチル基）、アルコキシ基もしくはアルコキシアルキル基、または、置換されていてもよい炭素原子数２〜５のアリール基もしくは脂肪族アシル基であり、
Ｒ_２〜Ｒ_７は、それぞれ独立して、水素原子、ＮＯ_２、ＣＮ、ＯＣＨ_３、分子鎖状もしくは直鎖状の、炭素原子数１〜５のアルキル基（好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基もしくはペンチル基）、アルコキシ基もしくはアルコキシアルキル基、または置換されていてもよい炭素原子数２〜５のアリール基もしくは脂肪族アシル基であり、
Ｘは、Ｃ＝ＯまたはＣ＝Ｓであり、
Ｙは、Ｓ、Ｏ、ＮＲ’、Ｃ（Ｒ’）_２であり、この際Ｒ’は、水素原子、分子鎖状もしくは直鎖状の炭素原子数１〜５のアルキル基、または置換されていてもよいアリール基であり、
Ｚは、ＳＯ_２、ＯＣＯ、ＯＣＳ、ＳＣＳ、ＣＯまたはＣＳであり、
ｎは０、１、２または３であり、ただしｎが０の場合、ＺはＣＯ、ＣＳ、およびＳＯ_２から選択され、
Ｎは、下記化学式２または３：

式中、Ｐは、水素原子、またはヌクレオチド化学で一般的な保護基もしくはオリゴヌクレオチドの製造のために一般的な反応性基である、
のような３’または５’置換可能なヌクレオシドから選択され、
Ｂは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、２，６−ジアミノプリン−９−イル、５−メチルシトシニル−１−イル、５−アミノ−４−イミダゾールカルボン酸−１−イル、または５−アミノ−４−イミダゾールカルボン酸アミド−３−イルであり、この際、Ｂがアデニン、シトシンもしくはグアニンである場合には、Ｂは第１級アミノ基および一時的なもしくは永久的な保護基を有し、またはＢがチミンもしくはウラシルである場合には、ＢはＯ^４位に永久的な保護基を有してもよい、
Ｒ_８は、水素原子、ＯＨ、ハロゲン原子、ＯＲ’またはＳＲ’であり、この際Ｒ’は上記と同様の定義であるか、または、炭素原子数２〜５の脂肪族アシル基もしくはヌクレオチド化学で一般的な保護基である、
の構造モチーフを有するヌクレオシド誘導体を提供することにより、解決される。

Ｒ_１〜Ｒ_７基のアルキル基、アルコキシ基またはアルコキシアルキル基は、直鎖状であっても分子鎖状であってもよく、置換（全体で１個または数個のハロゲン原子のみによって）されていても非置換であってもよく、そして飽和であっても不飽和であってもよい。例えばメチレン基を介して官能基間に架橋結合が存在してもよく、これにより別の環構造が生じる。同様のことは、Ｒ_１〜Ｒ_８基のアシル基またはアリール基についても同様にあてはまる。ここで考慮しているアルキル基は、ハロゲン原子を有するアルキル基である。好ましいアルキル基は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基である。好ましいアルコキシ基は、メトキシ基、エトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基である。好ましい脂肪族アシル基は、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基である。好ましい（ヘテロ）アリール基は、フェニル基、チエニル基、チオフェニル基、フリル基、フラニル基、ピラニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピリジル基、ピラジニル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、インドリル基、ピロリニル基、イミダゾリニル基、ピラゾリニル基、チアゾリニル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、および得られる融合環である。

Ｐについて、「オリゴヌクレオチドの製造のために一般的な反応性基」は、例えばホスファイトアミド基である。勿論、ホスファイトアミドに代えて、ホスホジエステル、ホスホトリエステルまたはＨ−ホスホネートもまた用いられうる。

ＰおよびＲ_８について、「ヌクレオチド化学で一般的な保護基」とは、特にＲ_８においては、一般的なＯ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｏ−アセタールまたはＯ−シリルエーテル保護基のようなＨ（ＤＮＡの場合）またはＯ（ＲＮＡの場合）の保護基である。好ましい保護基は、Ｏ−メチル基またはＯ−エチル基、Ｏ−テトラヒドロピラニル基、Ｏ−メトキシテトラヒドロピラニル基、Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル基、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基またはダンシル基である。

必要に応じて塩基Ｂと永久的に結合していてもよいこれらの保護基は、好ましくはアシル保護基に基づくものである。なかでも、フェノキシアセチル基、ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル基、イソブチリル基、アセチル基、ベンゾイル基、アリルオキシカルボニル基、フタロイル基、ダンシルエチルオキシカルボニル基、２−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニル基、またはジメチルホルムアミジノ基が好ましい。アデニン、シトシンおよびグアニンの場合には、環外アミノ基を導入する目的で、好ましくはフェノキシアセチル基、ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル基、アセチル基、または２−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニル基が用いられる。また、グアニンのＯ^６位は、必要であれば保護基である２−（４−ニトロフェニルスルホニル）エチル基または２−（４−ニトロフェニル）エチル基により保護されていてもよい。同様に、チミンまたはウラシルのＯ^４位が、２−（４−ニトロフェニルスルホニル）エチル基または２−（４−ニトロフェニル）エチル基のような保護基を有していてもよい。

本願において「ハロゲン原子（Ｈａｌ）」とはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉを意味し、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉが好ましい。本発明のヌクレオシド誘導体は、例えば、下記で参照される図１に示す手法により製造される。この際特定のハロゲン原子およびアルキル基に言及している場合には、同様の効果を有する均等物をも含んでいる。例えば、「クロロ」は、対応するヨウ化物や臭化物の使用を排除するものではない。このことはアルキル基にもあてはまり、例えば「メチル」は、エチル基、プロピル基またはブチル基などを含む他の低級アルキル化合物をも含む。

本発明に係る保護基は、より迅速に、かつ３８０ｎｍ超、好ましくは３９０ｎｍ超、より好ましくは４００ｎｍ超の波長の可視光の照射によっても効率的に開裂しうるという点で、本発明の誘導体は既知の誘導体に対して驚くべき利点を有している。

本発明によれば、化学式１のアントラセン骨格において、−Ｃ（Ｒ_１）−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｚ−Ｎ基のオルト位にＮＯ_２基が位置すると、開裂時にβ脱離反応が進行しうるため、好ましい。

この際、アントラセン環の１〜４位における全てのオルト置換パターンが含まれる。具体的なオルト置換パターンは下記化学式７〜１２：

式中、各置換基は上記と同様の定義である。

本発明の感光性の３’または５’ヌクレオシドは、フォトリソグラフィによる核酸チップの合成に用いられうる。当業者であれば、この目的のための手法は熟知している。

本発明に係る保護基または本発明のヌクレオシド誘導体を用いると、オリゴヌクレオチドチップまたは核酸チップの光制御合成において特に長い波長の光を用いることができるため、有利である。これに関し、上記の波長は好ましくは３８０ｎｍ超であり、より好ましくは３９０ｎｍ超であり、さらに好ましくは４００ｎｍ超である。

「基板」とは、本発明の化合物と化学結合しうる化合物を意味し、好ましくは、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、炭化水素（糖）である。しかしながら、「基板」という語はまた、ガラス、ポリマー、金属、セラミックスなどの、表面に官能基が付与された担体材料をも含む。

本願において、「ヌクレオチド」という語は、好ましくは、リン酸エステル結合（３’−５’および５’−３’を含む）を介して互いに連結された２〜１０個のヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを意味する。この際、前記結合は、しかしながら、本発明のヌクレオチドには、１０個超のヌクレオシド構成単位を有するポリヌクレオチドも含まれる。

本発明のヌクレオシド誘導体の製造方法は、特に制限されず、公知の方法を単独であるいは組み合わせて使用できる。例えば、多段階合成または二段階合成により合成されうる。一般的には、まず、従来公知の一般的な合成方法によって、下記化学式１３：

式中、Ｒ_１〜Ｒ_７、Ｘ、Ｙ、およびｎは、上記と同様の定義である、
で表される、対応する置換パターンを有するアルコールである環システムを合成する。

第二段階では、このアルコールを、従来公知の手法に従って、下記化学式４：

式中の基は上記と同様の定義であり、Ｈａｌはハロゲン原子である、
で表されるアシル化試薬へと変換する。例えば、ジホスゲンを用いてクロロ炭酸エステルへ、チオホスゲンを用いてクロロチオ炭酸エステルへ、または塩化スルホニルへ変換する。続いて、同様に誘導体化されたヌクレオシド（例えば、チミジン）を、このアシル化試薬を用いてアシル化し、本発明のヌクレオシド誘導体を得る。なお、前記ヌクレオシドは、例えば、下記化学式５または６：

式中、Ｒ_８およびＢは上記と同様の定義であり、Ｐはヌクレオチド化学で一般的な保護基である、
で表される。本発明の製造方法の可能性は、例えば図１に示す例によって説明されうる。

本発明の製造方法に用いるための遊離ヌクレオシドは、好ましくは、当初は２つの遊離ＯＨ基（一方は３’位に位置し、他方は５’位に位置する）を有する。これらのうちの１つは、３’位または５’位への、例えばＤＭＴ基またはダンシル基などのオーソゴナル（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ)保護基の導入により即座に保護され、これにより、他方の遊離ＯＨ基（５’または３’）は、前記アシル化試薬と反応しうる。必要であれば、この中間体保護基を開裂させて、遊離の３’または５’ＯＨ基をさらなる反応に使用してもよい。

本発明のさらなる利点および形態は、詳細な説明および添付の図面から得られる。

上記の特徴および下記で説明される特徴は、明示した組み合わせのみで用いられるわけではなく、本発明の範囲から逸脱しない限り他の組み合わせでも用いられうる。

添付の図面および非制限的な実施形態によって、本発明を詳細に説明する。

図１は、本発明のヌクレオシド誘導体を製造するための合成スキームを示す図である。

図２は、従来技術のヌクレオシド誘導体と本発明のヌクレオシド誘導体とで、保護基の開裂反応（脱保護反応）の速度を比較した図である。

図３は、種々の溶媒中での本発明のヌクレオシド誘導体の保護基の開裂速度を示す図である。

図４は、３９０ｎｍ超の波長における脱保護反応の速度を示す図である。

図５は、４１０ｎｍ超の波長における脱保護反応の速度を示す図である。

ここで図２は、詳細には、従来技術のヌクレオシド誘導体であるＮＰＰＯＣチミジン（ＮＰＰＯＣ−ｄＴ）の保護基が開裂する際の反応速度を、本発明のヌクレオシド誘導体である２−ＮＴＸ−３−ＰＯＣ−チミジン（２−ＮＴＸ−３ＰＯＣ−ｄＴ）（５’−［２−ニトロ−９−オキソ−３−（２−プロピルオキサカルボニル）チオキサントン］チミジン）と比較して示す図である。

開裂反応の反応時間に対する反応物の定量的な減少を、双方の化合物について、メタノール／水の混合物中で３６５ｎｍ（Ｈｇランプ）の波長にて測定した。

図２からわかるように、２−ＮＴＸ−３ＰＯＣ−ｄＴの反応物の濃度（グラフ１）は、ＮＰＰＯＣ−ｄＴ（グラフ２）の濃度よりも顕著に速く減少している。このことは、グラフ３および４に対応する生成物の濃度の増加と非常によく相関している。

感光性保護基として２−ＮＴＸ−３ＰＯＣを用いた場合には、たった３秒間の反応時間後に９０％の生成物が得られた（グラフ３）のに対し、ＮＰＰＯＣでは、２倍の長さの６秒間の反応時間後でもチミジンが４０％しか得られなかった（グラフ４）。

図３は、３６５ｎｍ（Ｈｇランプ、ＵＧ１フィルタ）で、種々の溶媒中において２−ＮＴＸ−３ＰＯＣ−ｄＴから感光性保護基が開裂する反応の進行を、反応物中での２−ＮＴＸ−３ＰＯＣ−ｄＴの減少およびチミジン生成物の増加について示す図である。

ジオキサン／水中での反応を除き、アセトニトリル／水、またはメタノール／水の混合物中での反応速度はほぼ同程度に速かった。

図４は、本発明のヌクレオシド誘導体の保護基が開裂する際の脱保護反応の速度を、従来技術の保護基と比較して、３９０ｎｍ超の波長で示す図である（いずれの場合もチミジンを用いた）。ＮＰＰＯＣ、５−ベンジル（Ｂｚ）−ＮＰＰＯＣ、および４−エチル−５−フェニル−ＮＰＰＯＣの保護基を比較すると、２−ＮＴＸ−３−ＰＯＣまたはＴＳ７ＰＯＣ（５’Ｏ−［（２−ニトロフェニル）−５−（９−オキソ−９Ｈ−チオキサントン−２−イル）ペンチルオキシカルボニル］）の保護基を用いた場合の脱保護反応が最も速かった。本発明に係る保護基である２−ＮＴＸ−３ＰＯＣ（グラフ１）は、４００ｎｍの波長にて、約４分間の反応時間まではＴＳ７ＰＯＣ（グラフ２）と比べてやや遅かったが、最終的にはＴＳ７ＰＯＣとほぼ同程度の値まで到達した。

本発明に係る保護基とは異なり、ＴＳ７ＰＯＣは、通常の保護基に対して感光性単位が結合している、保護基のいわゆる「分子内活性化」の原理を利用している（例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００２３６１に記載されている）。驚くべきことに、本願では、迅速な脱保護反応には不可欠であると従来考えられていた紫外線感光剤、すなわち、開裂反応の反応速度を増加させるための、ＴＳ７ＰＯＣのような分子内結合した感光剤、および、例えばＷＯ０３／７４５４２に記載のような別途添加される感光剤、の双方が省略されうることが明らかとなった。

本発明に係る誘導体や保護基を用いると、開裂反応速度を増加させるための感光剤の存在によって達成される反応速度に匹敵する反応速度が得られる。

図５によれば、本発明に係る保護基、すなわち２−ＮＴＸ−３ＰＯＣを用いると、従来の保護基と比べて、４２０ｎｍでの開裂速度が非常に速く、従来の保護基ではほとんど反応がみられないのに対して、約３０秒間の反応時間で９０％の開裂が起こる（グラフ１）ことが示される。

＜５’−［２−ニトロ−９−オキソ−３−（２−プロピルオキシカルボニル）−チオキサントン］チミジン（化合物７）の合成＞
化合物１の合成を、図１に模式的に説明する。沸騰ＤＭＦ中、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）の存在下で、チオール基およびアセチル基を有する酸（化合物１）を（２−ニトロ−５−ブロモ）エチルベンゼン（化合物２）と反応させて、２−（３−エチル−４−ニトロフェニルスルフィド）安息香酸（化合物３）を合成し、７０〜８０％の収率で固体として単離した。濃硫酸中で当該安息香酸（化合物３）を０．５〜１時間加熱し、次いでこの反応混合物を水中に添加し、濾過により３−エチル−２−ニトロ−９−オキソチオキサントン（化合物４）を得て、さらに精製することなく次の段階に用いた。上記で得たこのチオキサントンのニトロ誘導体（化合物４）を、ＤＭＳＯ中、ＤＢＵの存在下で、６０〜７０℃にて４〜５時間パラホルムアルデヒドと反応させて、４−ニトロ−９−オキソ−３−（２−プロパノール）チオキサントン（化合物５）を得て、カラムクロマトグラフィにより高収率で単離した。この化合物５を、ＴＨＦ中、トリエチルアミンの存在下で０〜４℃にてジホスゲンで処理し、２−ニトロ−９−オキソ−３−（２−プロピルオキシカルボニル−クロライド）チオキサントン（化合物６）を高収率で得た。化合物６を用い、０〜４℃にてチミジンをアシル化し、５’−［２−ニトロ−９−オキソ−３−（２−プロピルオキサカルボニル）チオキサントン］チミジン（化合物７）を得て、カラムクロマトグラフィにより単離した。

化合物５のスペクトルデータ

化合物６のスペクトルデータ

本発明のヌクレオシド誘導体を製造するための合成スキームを示す図である。 従来技術のヌクレオシド誘導体と本発明のヌクレオシド誘導体とで、保護基の開裂反応（脱保護反応）の速度を比較した図である。 種々の溶媒中での本発明のヌクレオシド誘導体の保護基の開裂速度を示す図である。 ３９０ｎｍ超の波長における脱保護反応の速度を示す図である。 ４１０ｎｍ超の波長における脱保護反応の速度を示す図である。

Claims (9)

1. 下記化学式１：
   

   

   式中、Ｒ_１は、水素原子、ハロゲン原子、ＮＯ_２、ＣＮ、ＯＣＨ_３、炭素原子数１〜４のアルキル基、アルコキシ基もしくはアルコキシアルキル基、または、置換されていてもよい炭素原子数２〜５のアリール基もしくは脂肪族アシル基であり、
   Ｒ_２〜Ｒ_７は、それぞれ独立して、水素原子、ＮＯ_２、ＣＮ、ＯＣＨ_３、分子鎖状もしくは直鎖状の、炭素原子数１〜５のアルキル基、アルコキシ基もしくはアルコキシアルキル基、または置換されていてもよい炭素原子数２〜５のアリール基もしくは脂肪族アシル基であり、
   Ｘは、Ｃ＝ＯまたはＣ＝Ｓであり、
   Ｙは、Ｓ、Ｏ、ＮＲ’、またはＣ（Ｒ’）_２であり、この際Ｒ’は、水素原子、分子鎖状もしくは直鎖状の炭素原子数１〜５のアルキル基、または置換されていてもよいアリール基であり、
   Ｚは、ＳＯ_２、ＯＣＯ、ＯＣＳ、ＳＣＳ、ＣＯまたはＣＳであり、
   ｎは０、１、２または３であり、ただしｎが０の場合、ＺはＣＯ、ＣＳ、およびＳＯ_２から選択され、
   Ｎは、下記化学式２または３：
   

   

   式中、Ｐは、水素原子、またはヌクレオチド化学で一般的な保護基もしくはオリゴヌクレオチドの製造のために一般的な反応性基である、
   であり、
   Ｂは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、２，６−ジアミノプリン−９−イル、５−メチルシトシニル−１−イル、５−アミノ−４−イミダゾールカルボン酸−１−イル、または５−アミノ−４−イミダゾールカルボン酸アミド−３−イルであり、この際、Ｂがアデニン、シトシンもしくはグアニンである場合には、Ｂは第１級アミノ基および一時的なもしくは永久的な保護基を有し、またはＢがチミンもしくはウラシルである場合には、ＢはＯ^４位に永久的な保護基を有してもよい、
   Ｒ_８は、水素原子、ＯＨ、ハロゲン原子、ＯＲ’またはＳＲ’であり、この際Ｒ’は上記と同様の定義であるか、または、炭素原子数２〜５の脂肪族アシル基もしくはヌクレオチド化学で一般的な保護基である、
   で表される、感光性保護基を有するヌクレオシド誘導体。
2. 化学式１において、−Ｃ（Ｒ_１）−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｚ−Ｎ基のオルト位にＮＯ_２基が位置する、請求項１に記載のヌクレオシド誘導体。
3. 化学式２において、Ｐであるオリゴヌクレオチドの製造のために一般的な保護基がホスファイトアミド基である、請求項１または２に記載のヌクレオシド誘導体。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のヌクレオシド誘導体の製造方法であって、
   下記化学式４：
   

   

   式中の基は上記と同様の定義であり、Ｈａｌはハロゲン原子である、
   で表される化合物を、下記化学式５または６：
   

   

   式中、Ｒ_８およびＢは上記と同様の定義であり、Ｐはヌクレオチド化学で一般的な保護基である、
   で表されるヌクレオシドと反応させて、ヌクレオシド誘導体を得る、ヌクレオシド誘導体の製造方法。
5. Ｐをさらに反応させる、請求項４に記載の製造方法。
6. 得られた前記ヌクレオシド誘導体の５’位または３’位にホスファイトアミド基を導入する、請求項４または５に記載の製造方法。
7. オリゴヌクレオチドチップまたは核酸チップの光制御合成に使用される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヌクレオシド誘導体。
8. 前記光制御合成に用いられる光の波長が３８０ｎｍ超である、請求項７に記載のヌクレオシド誘導体。
9. 前記波長が３９０ｎｍ超である、請求項８に記載のヌクレオシド誘導体。

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