JP2005331471A - アッセイデバイスおよび検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 検出感度が高く、正確な検出を行うことができるＥＩＡデバイス及び該デバイスを用いた検出方法を提供する。
【解決手段】 メンブランストリップを用いたＥＩＡであって、メンブランストリップ部の一端に吸収パッド部、他端のメンブランストリップ部をはめ込むことができ、基質液を加えて貯めることのできる凹部を有する基質部であって凹部に基質液を加えたとき基質液の液面が検出部より低く設定された基質部、前記メンブランストリップ部に検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原を酵素で標識した標識抗体または標識抗原が乾燥状態で含有されている標識部、該標識部と前記吸収パッド部の間のメンブランストリップ部に検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原が固相化された検出部を設けたＥＩＡデバイスならびに該ＥＩＡデバイスを用いて検体試料液中の被検出物を検出する方法。
【選択図】 なし

Description

本発明は、検体試料液中の抗原または抗体を検出するために用いられるエンザイムイムノアッセイデバイス及びそれを用いた検出方法に関する。

検体試料液中の抗原または抗体を検出する方法としてストリップ状のニトロセルロースメンブラン等のメンブランストリップを用いたエンザイムイムノアッセイが用いられている（特許文献１、特許文献２および特許文献３参照）。

従来のメンブランストリップを用いたエンザイムイムノアッセイデバイスの態様を図２に示す。メンブランストリップ部７の一方の端に吸収パッド部８、もう一方の端に展開液パッド部９を設け、検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原を酵素で標識した標識体が含有された標識体パッドからなる検体点着部１０、検体点着部１０と吸収パッド部８の間のメンブランストリップ部に検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原が固相化された検出部１１がそれぞれ設けられている。

使用時に、検体試料液を検体点着部１０に加え、つづいて標識酵素の基質を含む展開液を展開液パッド部９に加える。

標識体は、検体試料液中の検出すべき抗原または抗体と抗原抗体反応しながら、また、標識体と基質の一部は展開液が検出部１１に到達する前に酵素反応して発色しながら泳動し、検出部１１に到達すると固相化されている抗体または抗原に捕捉される。基質も同方向に泳動し、捕捉された標識体の標識酵素が基質と酵素反応するので検出部１１が着色する。

一方、検体試料液中に検出すべき抗原または抗体が存在しない場合は、標識体が検出部１１に捕捉されないので検出部１１は着色しない。

従って、検体試料液中に検出すべき抗原または抗体が存在するか否かを、検出部１１の着色の有無で知ることができる。

特許３２４８４３６号公報 特許３２８４８９６号公報 特許３２３７５４０号公報

上記したような従来のエンザイムイムノアッセイデバイスは、メンブランストリップ部に展開液パッド部が設けられており、標識酵素に対する基質を含む展開液が展開液パッド部に加えられる。しかしながら、従来の展開液パッド部を設けたイムノアッセイデバイスでは、基質を含む展開液を展開液パッド部に加えたとき基質を含む展開液が展開液パッド部からすぐにメンブランストリップ部に流れ、標識体と検体中の被検出物が検出部に到達する前に酵素と基質が酵素反応して発色しながら展開するため検出部以外の部位のメンブランストリップ上でも発色がおこり、検出部での発色との区別がつかなくなり十分な検出感度が得られないという問題がある。

従って、本発明の目的は、毛管現象によって基質がメンブランストリップを展開する速度を遅延させることにより標識体と検体中の被検出物が検出部に到達する前に酵素と基質が反応して発色するのを防ぎ、従来のデバイスに比べて、検出感度が高く、正確な検出を行うことができるエンザイムイムノアッセイデバイス及び該デバイスを用いた検出方法を提供することにある。

本願発明者は、鋭意研究を行った結果、吸収パッド部と反対側のもう一方の端のメンブランストリップ部をはめ込むことのできるプラスチックホルダー等からなり基質液を加えて貯めることのできる凹部を有する基質部を設け、検体試料液で乾燥した標識抗体または標識抗原を溶解して毛管現象により検出部に到達させ、つづいて基質液が遅れて検出部に到達するように展開させることにより、上記目的が達成できることを見出し本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、検体試料液中の被検出物を検出するための、メンブランストリップを用いたエンザイムイムノアッセイであって、メンブランストリップ部の一方の端に吸収パッド部、吸収パッド部と反対側のメンブランストリップ部の一端にメンブランストリップの端部をはめ込んだプラスチックホルダー等からなり基質液を加えて貯めることのできる凹部を有する基質部であり該凹部に基質液を加えたとき基質液の液面が検出部の位置より低く設定された基質部、前記メンブランストリップ部に検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原を酵素で標識した標識体が乾燥状態で含有されている標識部、該標識部と前記吸収パッド部の間のメンブランストリップ部に検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原が固相化された検出部を設けたエンザイムイムノアッセイデバイスおよび上記のエンザイムイムノアッセイデバイスを用いて検体試料液中の被検出物を検出する方法であって、検体試料液を標識部に加え、つづいて基質液を基質部に加えて展開させ、連続した一連の反応により起こる前記検出部における着色の有無を観察することにより検体試料液中の被検出物を検出する方法を提供する。

本発明の方法により、高感度で特異的な抗原または抗体を検出できるエンザイムイムノアッセイデバイス及び該デバイスを用いた検出方法を確立することができた。

本発明のエンザイムイムノアッセイデバイスの構成及びそれを用いた検出方法の具体例を以下に詳細に説明する。

１．デバイスの構成
図１は、本発明のエンザイムイムノアッセイデバイスの好ましい実施態様の模式図である。
すなわち、メンブランストリップ部１の一方の端に吸収パッド部２、もう一方の端にメンブランストリップ部の一端がはめ込まれ、基質液を加えて貯めることのできる凹部６を有する基質部３、前記メンブランストリップ部１に検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原を酵素で標識した標識抗体または標識抗原が乾燥状態で含有されている標識部４、該標識部４と前記吸収パッド部２の間のメンブランストリップ部に検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原が固相化された検出部５を設けたデバイスである。

（１）メンブランストリップ部
メンブランストリップ部の材質は、特に限定されないが、多孔性の吸水性の材質であり、検体試料液や基質液が毛管現象により展開し得る材質である。ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオレフィン、セルロース、これらの混合繊維からなる材質が用いられ、好ましくはニトロセルロースメンブランが用いられる。

メンブランの厚さは特に限定されないが、好ましくは１００〜２００μｍ程度である。また、メンブランは長方形のストリップで用い、その大きさは、特に限定されないが、通常、３ｍｍ〜９ｍｍ×４０ｍｍ〜６０ｍｍ程度である。

（２）吸収パッド部
吸収パッド部は、本発明のエンザイムイムノアッセイデバイスの一端に設けられデバイスを展開する液体を吸収することによりメンブラン上の液体の流れを促進する。
吸収パッド部は、多量の液を吸収できるよう、吸水性の材質でできており、例えば、セルロース、ガラス繊維などでできた不織布等が用いられる。
また、その大きさは、特に限定されないが、通常、３ｍｍ〜１５ｍｍ×１０ｍｍ〜４０ｍｍ、厚さ０．５ｍｍ〜３ｍｍ程度である。

（３）検出部
検出部は、検出すべき抗原または抗体と抗原抗体反応により特異的に結合して検出すべき抗原または抗体を捕捉するための抗体または抗原が固相化されている。抗体または抗原は、例えばライン状に固相化すればよい。固相化は、タンパク質をニトロセルロースメンブラン等の固相に固相化するための公知の方法で行うことができる。抗体は、精製したポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が用いられる。抗原は、精製した天然の抗原またはリコンビナント抗原が用いられる。

（４）標識部
吸水性の材質、例えばスポンジ及びガラス繊維などでできた不織布等の材質が用いられ、その大きさは、特に限定されないが、通常、３ｍｍ〜１０ｍｍ×３ｍｍ〜１０ｍｍ、厚さ０．５ｍｍ〜３ｍｍ程度で、酵素標識した標識抗体または標識抗原が乾燥状態で含有されている。標識部は、上記の吸水性の材質に標識抗体または標識抗原を含浸させ、乾燥させればよい。標識抗体または標識抗原は、検出すべき抗原または抗体と抗原抗体反応により特異的に結合する抗体または抗原に酵素を標識したものが用いられる。抗体は、精製したポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が用いられる。抗原は、精製した天然の抗原またはリコンビナント抗原が用いられる。
標識に用いる酵素としては、一般的にエンザイムイムノアッセイに用いられるアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等を用いることができる。

（５）基質部
基質部は基質液を加えて貯めることのできる凹部を有するプラスチックホルダー等からなり、吸収パッドと反対側のメンブランストリップ部の一端を凹部にはめ込み、基質液が毛管現象によりメンブランストリップ部に吸い上げられて展開できる構造となっている。基質部は基質液を加えたときに、基質液の上部液面がメンブランストリップ部の検出部の位置より２〜８ｍｍ低い位置に存在するように設計することが好ましいが、これに限定されない。基質液の上部液面がメンブランストリップ部の検出部より低い位置に設けられているとは、アッセイデバイスを検査用作業机上などの水平面に置いて検出を行うときに、基質部に基質液を加えたときに、基質液の上部液面と検出部の鉛直線方向における位置を比較した場合、基質液の上部液面が検出部より低い位置に存在することをいう。また、「はめ込む」とはメンブランストリップの端部が基質部の凹部に入り、該凹部に基質液を加えたときにメンブランストリップの端部が基質液と接触するように適当な固定手段により固定されていることをいう。適当な固定手段は限定されず、例えば基質部に適当なきり込みを設け、該切り込みにメンブランストリップを挿し込むことにより固定してもよいし、接着剤等によりメンブランストリップを基質部に結合してもよい。このように、基質液の上部液面が検出部より低い位置に存在すると、基質部に添加した基質液の展開が重力に逆らって起こるので、展開速度が遅くなる。基質部の凹部は、基質液が液層の高さが２〜５ｍｍになるように５０〜３００μＬ量入れられる大きさが好ましいが、これに限定されない。例えば、図１に示すように、プラスチック等の適当な材料でできた凹部を有する容器状の基質部にメンブランストリップの一端を、前記凹部の底面に接触するようにはめ込めばよい。この際、基質部凹部の上端がメンブランストリップよりも低い位置に存在するように設計すれば、基質部に基質液を加えたときに基質液面が検出部より高い位置に存在することはない。

基質としては、酵素反応時に色素が不溶化となる性質を有する基質を用いることが好ましく、例えば、標識酵素がアルカリホスファターゼの場合には５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸／ニトロテトラゾリウムブルー、β−ガラクトシダーゼの場合には５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ペルオキシダーゼの場合には３，３'−ジアミノベンチジン等を用いることができる。

（６）検体試料液
本発明にいう検体試料液は、咽頭あるいは鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、咽頭あるいは鼻腔洗浄液、唾液、血清、便懸濁液、尿、培養液及びそれらを緩衝液で希釈したものを用いることができるがこれらに限定されない。

希釈に用いる緩衝液としては、免疫学的試験に通常使用される緩衝液等を使用することができ、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グッドの緩衝液等が挙げられ、塩化ナトリウム、界面活性剤、ウシ血清アルブミン、アジ化ナトリウム等を適宜加えることができるが、これらに限定されない。

（７）被検出物
本発明にいう検出すべき抗原は、何ら限定されず、検出しようとするいかなる物質であってもよい。たとえば、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、ノーウォーク様ウイルス等のウイルス抗原、レジオネラ属菌、溶連菌、ＭＲＳＡ等の細菌抗原、ホルモン等をあげることができるが、これらに限定されない。
また、検出すべき抗体も限定されず、上記細菌、ウイルス等に対する抗体が挙げられる。

２．本発明のデバイスを用いた検出方法
使用時に、本発明のデバイスを用い、検体試料液を標識部４に加え、つづいて基質液を基質部３に加える。検体試料液は標識抗体または標識抗原を溶解させ、標識抗体または標識抗原は、検体試料液中に検出すべき抗原または抗体が存在すれば抗原抗体反応しながら移動し、検出部５に到達すると固相化されている抗体または抗原に捕捉される。基質液も同方向に移動し、捕捉された標識抗体または標識抗原の標識酵素が基質と酵素反応するので検出部５が着色する。

一方、検体試料液中に検出すべき抗原または抗体が存在しない場合は、標識抗体または標識抗原が検出部５に捕捉されないので検出部５は着色しない。

従って、検体試料液中に検出すべき抗原または抗体が存在するか否かを、検出部５の着色の有無で判定することができる。なお、捕捉されなかった他の成分及び検体試料液等は吸収パッド部２に吸収される。

検体試料液の量は、被検出物により異なるが、通常２０〜１００μＬ程度である。
検体試料液及び基質液をそれぞれ所定の場所に加えてから着色の有無を判定するまでに要する時間は通常１０〜３０分間程度である。

本発明のエンザイムイムノアッセイデバイスでは、従来のデバイスと異なり、メンブランストリップ部の吸収パッド部と反対側のメンブランストリップ部の一端をはめ込んだプラスチックホルダー等からなり、基質液を加えて貯めることのできる凹部を有する基質部が設けられている。基質部は、基質部に基質液を加えたときに基質液の液面がメンブランストリップ部の検出部より低くなるように設計されており、所定量の基質液を基質部に加えたとき、基質液は重力に逆らってメンブラン上を展開移動していくため、移動速度は抑制される。基質液はメンブランストリップ部の毛管現象により吸い上げられるため高低差を適宜選ぶことにより基質液の流速を遅く調節することができ、大部分の標識抗体または標識抗原と被検出物が検出部に到達したのちに基質液が検出部に到達する。
このことにより検出に必要な基質を適時に反応の場に供給でき検出感度が上がる。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例１
１．抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体の作製
（１）抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体
Ａ型インフルエンザウイルス抗原をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、３７℃インキュベーター中で維持し、Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原を固相したプレートを用いたＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞２株をそれぞれプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。

得られた腹水からプロティンＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー法により、それぞれＩｇＧを精製し、２種類の精製抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体を得た。

（２）抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体
Ｂ型インフルエンザウイルス抗原を用い、（１）と同様の方法で、２種類の精製抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体を得た。

２．酵素標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体の作製
（１）アルカリホスファターゼ標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体の作製
精製抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体のうち１種類について４５ｍｇを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）で透析後、ペプシン１０ｍｇを添加し、３７℃で１時間、Ｆａｂ'消化処理を行った。処理液をウルトロゲルＡｃＡ３４カラムで分画して抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆ（ａｂ'）_２精製画分を得た。前記画分を約１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮後、０．１Ｍメルカプトエチルアミンと１０：１の体積比で混合し、３７℃で９０分間還元処理を行った。処理液をウルトロゲルＡｃＡ３４カラムで分画して抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ'精製画分を得た後、約１ｍＬにまで濃縮した。
１０ｍｇ／ｍＬのアルカリホスファターゼ１．５ｍＬを１ｍＭ塩化マグネシウムならびに０．１ｍＭ塩化亜鉛を含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７．６）に透析後、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド０．７ｍｇを添加し、３０℃で１時間処理した。処理後の溶液をセファデックスＧ−２５カラムで分画し、最初のピークを回収してマレイミド−アルカリホスファターゼを得た後、約１ｍＬにまで濃縮した。

濃縮した抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ'とマレイミド−アルカリホスファターゼを１：２．３の蛋白比で混合し、４℃で２０時間穏やかに撹拌して反応させ、アルカリホスファターゼ標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ'を得た。更に、反応液をウルトロゲルＡｃＡ３４カラムで分画し、未反応物を除去して精製アルカリホスファターゼ標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ'を得た。精製アルカリホスファターゼ標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体Ｆａｂ'は、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、
０．１５ｍＭ塩化亜鉛、０．０９％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）の組成からなる標識抗体希釈液で希釈した後、０．２２μｍ孔径の濾過フィルターで濾過し、アルカリホスファターゼ標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体を得た。

（２）アルカリホスファターゼ標識抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体の作製
精製抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体のうち１種類について、（１）と同様の方法で、アルカリホスファターゼ標識抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体を得た。

３．デバイスの作製
（１）Ａ型インフルエンザウイルス用デバイス
ニトロセルロースメンブラン（HiFlow Plus HF06504 ミリポア社製）を２０ｃｍ×５ｃｍに切り、このニトロセルロースメンブランの吸収パッド部側のメンブラン端から1ｃｍの位置に精製水を用いて至適濃度に希釈した抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体液（上記と別のクローン）で幅０．５ｍｍの２０ｃｍラインを描き、減圧下で乾燥して抗体を固相化し、カッターで５ｍｍ×５ｃｍのストリップに裁断してメンブランストリップ部を作製した。濾紙（ＷＡ１．５ ワットマン社製）を５ｍｍ×３ｃｍの大きさに裁断し、メンブランストリップ部の端に５ｍｍ重ねて吸収パッド部を設けた。

ついで、６ｍｍ×６ｍｍ×０．５ｍｍのポリビニルスポンジに標識抗体を含有させた標識部を検出部から４ｍｍ離れたメンブラン上に設けた。該標識部は、１０％（Ｗ／Ｖ）トレハロース、４％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン、０．２％（Ｗ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１５ｍＭ塩化亜鉛を含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）にアルカリホスファターゼ標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体を至適濃度に加えたものを２５μＬ量ポリビニルスポンジ（Ｆ(Ａ)アイオン社製）に含浸させたのち減圧下で乾燥して用いた。

更に、吸収パッド部と反対側のメンブランストリップ部の一端をプラスチックホルダーの凹部にはめ込んで基質部を設けてデバイスを作製した。基質部の基質液の液面とメンブランストリップ部の検出部部位との高低差は３ｍｍに設定した。

基質液は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸／ニトロテトラゾリウムブルー（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）溶液（Ｂ１９１１ シグマアルドリッチ社製）を用いた。

（２）Ｂ型インフルエンザウイルス用デバイス
（１）と同様の方法で、Ｂ型インフルエンザウイルス用デバイスを作製した。
検出
検体としてＡ型インフルエンザウイルス抗原液並びにＢ型インフルエンザウイルス抗原液をそれぞれ用いた。
インフルエンザウイルス抗原液を０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン、１％（Ｗ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で１０倍階段希釈し検体試料液とした。
検体試料液をデバイスの標識部に２５μＬ加え、つづいて基質液を基質部に２００μＬ加え、１５分後に判定を行った。

比較検討
同時に、従来法デバイスを作製して、操作し比較試験を行った。
結果
Ａ型インフルエンザウイルス用デバイスを用いた時、Ａ型インフルエンザウイルス抗原は１０^５（pfu/mL）まで陽性で、Ｂ型インフルエンザウイルス抗原は陰性となり特異的にＡ型インフルエンザウイルス抗原を検出できることが確かめられた。
Ｂ型インフルエンザウイルス用デバイスを用いた時、Ｂ型インフルエンザウイルス抗原は１０^５（pfu/mL）まで陽性で、Ａ型インフルエンザウイルス抗原は陰性となり特異的にＢ型インフルエンザウイルス抗原を検出できることが確かめられた。

一方、比較法は特異的に抗原を検出できるが検出感度が本発明法より低かった。
得られた結果を表１及び表２に示す。

表１及び２に示すように、高感度で特異的な抗原を検出できることがわかる。

本発明のエンザイムイムノアッセイデバイスの態様を示す図である。 従来のエンザイムイムノアッセイデバイスの態様を示す図である。

符号の説明

１ メンブランストリップ部
２ 吸収パッド部
３ 基質部
４ 標識部
５ 検出部
６ 凹部
７ メンブランストリップ部
８ 吸収パッド部
９ 展開液パッド部
１０ 検体点着部
１１ 検出部

Claims (2)

1. 検体試料液中の被検出物を検出するための、メンブランストリップを用いたエンザイムイムノアッセイデバイスであって、メンブランストリップ部の一方の端に吸収パッド部、もう一方の端にメンブランストリップ部の一端がはめ込まれ、基質液を加えて貯めることのできる凹部を有する基質部であって凹部に基質液を加えたとき基質が毛管現象によってメンブランストリップを移動する速度を遅延させるために基質液の液面が検出部部位より低く設定された基質部、前記メンブランストリップ部に検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原を酵素で標識した標識抗体または標識抗原が乾燥状態で含有されている標識部、該標識部と前記吸収パッド部の間のメンブランストリップ部に検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原が固相化された検出部を設けたエンザイムイムノアッセイデバイス。
2. 請求項１記載のエンザイムイムノアッセイデバイスを用いて検体試料液中の被検出物を検出する方法であって、検体試料液を標識部に加え、つづいて基質液を基質部に加えて展開させ、連続した一連の反応により起こる前記検出部における着色の有無を観察することにより検体試料液中の被検出物を検出する方法。

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