JP2005537480A - 高密度アレイ - Google Patents

Abstract

本発明は、種々の密度を有するアレイ、具体的には高密度アレイ作成方法を提供する。一般に、本方法は、プリンティング工程および照射工程を含む。プリンティング工程では、レセプター分子を含む所定の体積の試薬溶液を所望のパターンで固体支持体に塗布する。一態様において、レセプター分子を光反応作用因子で誘導体化する。代替の態様において、固体支持体は光反応剤を含む。好ましい態様において、レセプター分子は核酸である。照射工程では、光反応基を照射してレセプター分子を固体支持体に固定化する。一態様において、プリントされるスポットと同じ中心−中心距離（例えば、「ピッチ」）を有するがより小さい直径を有するマスクをプリントされるパターン上に置き、照射する。マスクは、プリントされるスポットより小さな直径を有するスポットを照射することが好ましい。したがって、本発明によれば、固定化される試薬スポットは、元のプリントされるスポットより小さい直径を有する。代替の態様において、ミラード・レーザー技術を用いて照射工程を行うことができる。所望する場合、オフセットスポットの塗布および照射を繰り返して、高密度アレイを形成することができる。

Description

本発明は、核酸の固体支持体への固定化に関する。より具体的には、本発明は、高密度核酸アレイに関する。

マイクロアレイは、上に異なる核酸配列が固定化された小さな表面（典型的には、２〜３ｃｍ²のシリコンウエハまたはガラススライド）である。典型的には、in situ固相合成または核酸の表面への共有的な固定化によって、核酸が正確な位置で表面上に固定化される。核酸は、相補的な核酸配列検出用のプローブとして働く。アレイは、数百から数千の固定化された核酸を有することができる。高密度アレイは、１平方ｃｍあたり１０００を上回る核酸の配列を有することができる。

マイクロアレイを用いるため、蛍光標識したＤＮＡまたはＲＮＡ配列（合成するか、あるいは対象の細胞から得るかのいずれかである）をアレイと接触させる。蛍光標識したフラグメントのハイブリダイゼーションパターンは、情報の宝庫を提供することができる。

マイクロアレイは、多くの細胞遺伝子の発現を一度に追跡する特有の能力を有し、研究者が同時に何千もの遺伝子の挙動を見ることが可能となる。したがって、アレイは診断に有用である。特有の遺伝子発現パターンの検出は、癌、アルツハイマー病、骨粗鬆症および心臓病等の疾患の開始の正確な指摘において医師を助けることができる。アレイは、どの遺伝子が特定の疾患で活性であるかを理解するのにも有用である。アレイは、病原体の同定、法医学用途、ＲＮＡの発現のモニタリング、およびde novoシーケンシングにも有用である。例えば、Lipshutz, et al., Bio Techniques, 19 (3); 442-447(1995)を参照のこと。

種々の技術を用いて、マイクロアレイを製造することができる。例えば、アレイ表面上での固相合成により、種々のオリゴヌクレオチドを製造することができる。例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９２／１００９２号（アフィマックス・テクノロジー・N. V.（Affymax Technologies N.V.））を参照のこと。固相合成によって比較的高い密度を有するアレイを製造することができるが、核酸配列の長さは限定される。この技術では、核酸合成における各付加工程によりいくつかのエラーまたは切断配列が生じてしまうことがよく見られる。しかしながら、in situ固相合成によって製造されるオリゴヌクレオチドマイクロチップでは、合成後の精製技術（例えば、ＨＰＬＣ）ができない。したがって、そのようなアレイは、一般に、エラーの量を限定するために比較的短い核酸配列（およそ２０マー）で構築される。

あるいは、予め存在する核酸（例えば、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、またはＰＣＲ産物）をアレイ表面に固定化することにより、マイクロアレイを製造することができる。例えば、シンテニ（Synteni）（カルフォルニア州パロアルト）は、ポリリシンをガラススライドに塗布することによりｃＤＮＡのアレイを製造している。ｃＤＮＡのアレイを、コーティングしたスライド上にプリントする。次いで、プリントされるスライドをＵＶ光に暴露してＤＮＡをポリリシンと架橋することにより、ｃＤＮＡがアレイに固定化される。

本発明は、種々の密度を有するアレイ、具体的には高密度アレイ（例えば、１平方センチメートルあたり約１０，０００〜１００，０００個のスポットの密度または約３０〜約１００マイクロメートルの間のピッチを有するアレイ）の作成方法を提供する。

一般に、方法には、プリンティング工程および照射工程が含まれる。プリンティング工程では、ある体積（約０．５ピコリットルおよび５００ピコリットルの間）のレセプター分子を含む試薬溶液を所望のパターンで固体支持体に塗布する。一態様において、レセプター分子を光反応作用因子で誘導体化する。代替の態様において、固体支持体は光反応作用因子を含む。一般に、パターンスポットの中心−中心距離は約２００ｐｍおよび１ｍｍの間であり、スポットの直径は一般に約１００μｍおよび５００μｍの間である。好ましい態様において、レセプター分子は核酸（例えば、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、またはＰＣＲ産物）である。

照射工程では、光反応基を照射して、レセプター分子を固体支持体に固定化する。一態様において、プリントされるスポットと同じ中心−中心距離（例えば、「ピッチ」）を有するがより小さなスポット直径を有するマスクをプリントされるパターン上に置き、照射する。マスクは、プリントされるスポットより小さな直径を有するスポットを照射することが好ましい。したがって、本発明によれば、固定化される試薬のスポットは、元のプリントされるスポットより小さな直径を有する。代替の態様において、ミラード・レーザー技術（mirrored lazer technology)を用いて照射工程を行うことができる。

典型的には、照射工程後、固定化されている試薬（例えば、レセプター分子）を洗浄工程により除去する。次いで、プロセスを繰り返されることができるが、元のパターンとはオフセットである。所望する場合、プロセスを複数回繰り返して高密度アレイを製造することができる。

「フォトリソグラフィ」との用語は、区画されたパターンで表面を電磁放射線に暴露することによって表面上にそのパターン（またはそのパターンの陰画）が生じさせるプロセスをいう。典型的には、結合の形成または破壊によってパターンが生じる。「フォトリソグラフィ」には、マスクキング技術およびミラード・レーザー照射等の他の技術が含まれる。

本明細書に記載される通り、「試薬溶液」は、レセプター分子を含む溶液をいう。典型的には、試薬溶液には緩衝液も含まれる。一般に、アレイ上の別個の位置で異なるレセプター分子を有するアレイが形成されるように、アレイは、各々が異なるレセプター分子を含む、少なくとも１つ「試薬溶液」、より典型的には複数の「試薬溶液」を用いて製造される。

本明細書に記載される通り、「レセプター分子」は、固体支持体上に固定化される結合対のメンバーをいう。好ましい態様において、レセプター分子は核酸である。しかしながら、レセプター分子は、リガンドに特異的に結合する他の分子のいずれでもよい。例えば、レセプター分子は、免疫グロブリン等のタンパク質、レクチン等の細胞レセプター、またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆ_abフラグメント、Ｆ_ab’フラグメント等）であることができる。

本明細書に記載される通り、「標的リガンド」または「標的」は、本発明の方法または系で検出および／または定量化される試料中に存在すると思われる核酸配列等のリガンドをいう。一態様において、核酸は、試料中に検出される遺伝子または遺伝子フラグメントを含む。「試料」との用語は、その最も広い意で用いる。該用語には、標的リガンドを含むと思われる被検物または培養物が含まれる。

本明細書に記載される通り、「相補的な」または「相補性」との用語は、核酸（すなわち、核酸または標的核酸等のヌクレオチドの配列）に関して用いる場合、ワトソンおよびクリックによって展開された塩基対合則によって関係づけられる配列をいう。例えば、配列「Ｔ−Ｇ−Ａ」に対し、相補的配列は「Ａ−Ｃ−Ｔ」である。相補性は、いくつかの核酸塩基だけが塩基対合則に従って一致する「一部分」であってもよい。あるいは、核酸間の「完全な」または「全ての」相補性であってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対して影響を及ぼす。

「相補的な」または「相補性」との用語は、核酸以外の分子と組み合わせて用いる場合、特定の結合対のメンバーである分子等の結合相手と結合できる分子をいう。

「ハイブリダイゼーション」との用語は、相補的な核酸の対合に関して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）、および核酸内のＧ：ＣとＡ：Ｔとの比等の要因によって影響を受ける。

本明細書に記載される通り、「核酸」との用語は、プリンおよびピリミジンに由来する塩基を有するポリヌクレオチド化合物の基のいずれもいう。「核酸」との用語は、個々の核酸塩基またはオリゴヌクレオチド（例えば、共有結合された少なくとも２個のヌクレオチドの短鎖核酸配列、典型的には長さが約５００個未満のヌクレオチド、より典型的には長さが２０〜１００個の間のヌクレオチド）をいうのに用いることができる。「核酸」との用語は、ｃＤＮＡまたはＰＣＲ産物で見出されるもの等（例えば、長さが数百個または数千個のヌクレオチドの配列）、長い配列の核酸もいう。対して、核酸配列の正確なサイズは、核酸の最終機能または使用に依存する多くの要因に依存する。

固体支持体核酸合成、ＤＮＡ複製、逆転写等の当該技術分野で現在利用可能な技術を用いて、核酸を製造することができる。あるいは、天然供給源から核酸を単離することができる。核酸は、例えば一本鎖、二本鎖等の任意の好適な形態、または核タンパク質としてであることができる。核酸はホスホジエステル結合を一般に含むが、いくつかの場合に、ヌクレオチドは類似骨格、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）を有することができる。核酸には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）（相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）等）、リボ核酸（ＲＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。核酸がデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組み合わせを含む場合、核酸はＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの双方、ＲＮＡまたは双方を含むことができる。更に、核酸は、ウラシル、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、並びにイノシン、キサンテン、ヒポキサンチン、および他の非標準または人工的な塩基等の他の塩基の任意の組み合わせを含むことができる。

ＰＮＡは、ネイティブな糖リン酸エステルＤＮＡ骨格がポリペプチドで置き換わったＤＮＡ擬態物である。この置換は、分子の安定性を増加し、親和性および特異性の双方も改善すると言われている。

概観
一般に、本発明は、マイクロアレイの作成方法を提供する。マイクロアレイは一般に、異なるレセプター分子が付着した固体支持体を含み、各々は、他の領域から物理的に離れている予め区画された領域に位置する。

本発明は、核酸（およびハイブリダイゼーションによって特異的に「結合する」その能力）を特に参照して記載する一方で、本発明は、免疫学的な結合対、またはその他のリガンド／抗リガンド結合対、またはドラッグディスカバリー用の標的等のリガンドが未だ見出されていないタンパク質等、他の特異的な結合作用因子にも適用性を有すると理解する。

本方法は、種々の密度を有するアレイの作成に好適であるが、高密度アレイの作成に特に好適である。本明細書に記載される通り、「高密度アレイ」との用語は、１平方センチメートルあたり１，０００個を上回るスポット、典型的には１平方センチメートルあたり５，０００個を上回るスポット、最も典型的には１平方センチメートルあたり１０，０００個および１００，０００個の間のスポットのレセプター分子の密度を有するマイクロアレイをいう。一般に、「高密度アレイ」では、スポットは、約３０〜約１００マイクロメートルの間の「ピッチ」（例えば、約３０〜約１００マイクロメートルの間の中心から中心までの距離）で固定化される。対照的に、プリント技術により製造された最も市販されているマイクロアレイは、１平方センチメートルあたりおよそ１００〜１０００個のスポットの密度を有する。一般に、最も市販されているアレイでは、スポットは、中心から中心まで約１００〜約２００マイクロメートルの間のピッチで固定化されている。

本明細書に記載される通り、「スポット」は、少なくとも１つ、より典型的には複数の特定のレセプター分子を含む局在領域をいう。各々の「スポット」には、異なるレセプター分子が含まれることが好ましい。「スポットパターン」は、固体支持体の表面上でのスポットのコンフィギュレーションをいう。いつくかの場合では、各々のスポットが所定の距離によってすべての隣接するスポットから分離している均一なスポットパターンを有することが望ましい。しかしながら、均一なスポットパターンを有する必要はない（例えば、あるスポットと隣接するすべてのスポットと間の距離は同じでなくてもよい）。

一般に、本方法には、プリンティング工程および照射工程が含まれる。プロセスを図１および２に模式図する。プリンティング工程（図１の工程Ａおよび図２Ａの工程１）では、所定の堆積（約０．５ピコリットルおよび５００ピコリットルの間）の試薬溶液を所望のパターンで固体支持体に塗布する。一般に、プリントされるスポットの中心−中心距離（Ｐ）は、約２００μｍおよび１０００μｍの間であり、プリントされるスポットの直径（Ｄ）は、一般に約１００μｍおよび５００μｍの間である。

一態様において、レセプター分子を少なくとも１つのタイプの光反応基で誘導体化する。本明細書に記載される通り、「タイプ」との用語は、反応基をいう。例えば、ある「タイプ」の光反応基はアジドであり、別の「タイプ」の光反応基はアリールケトンである。したがって、レセプター分子をあるタイプの光反応基の複数コピーで誘導体化することができる。あるいは、レセプター分子を種々のタイプの光反応基の１つ以上のコピーで誘導体化することができる。（同じ概念を以下の代替例に適用する）。代替の態様において、固体支持体は、少なくとも１つのタイプの光反応基を含む。他の代替例も企図され、例えば、レセプター分子および固体支持体の双方が少なくとも１つのタイプの光反応基を含む。別の態様において、照射した際に要素が相互作用して安定な結合、好ましくは共有結合を形成するように、レセプター分子および固体支持体が光反応基の相補的な要素を含むことができる。更に別の態様において、照射の前に固体支持体に塗布される試薬溶液は、少なくとも１つのタイプの光反応基含むことができる。

照射工程（図１の工程Ｂおよび図２Ａの工程２に示される）では、レセプター分子が固体支持体に固定化される反応が開始されるように、光反応基を照射する。一態様において、プリントされるスポットと同じ中心−中心距離または「ピッチ」（Ｐ）を有するマスクをプリントされるパターン上に置き、照射する。本明細書に記載される通り、「同じ」との用語は、スポットのピッチが用いられる機器の精度内で同じであることを意味する。したがって、中心−中心距離間にわずかな分散(variance)があるであろうが、一般にこの分散は無視できる。

固定化されたレセプター分子のスポットがプリントされるスポット（Ｄ）より小さな直径（Ｄ’）を有するように、プリントされるスポット自体の直径（Ｄ）より小さな直径（Ｄ’）でプリントされるスポットが放射線によって照射されることがマスクによって可能になることが好ましい。あるいは、ミラード・レーザー技術を用いて、照射工程を達成することができる。

典型的には、照射工程後に、固定化されているレセプター分子を洗浄工程により除去する（図１の工程Ｃおよび図２Ａの工程３）。次いで、プロセスを繰り返すことができるが、存在するスポットパターンとはオフセットである（図１の工程Ｄおよび図２Ｂ）。本明細書に記載される通り、「オフセット」との用語は、固定化されたスポットの位置をいう。プリントされるスポットは重なっていても、重なっていなくてもよい。「存在するスポット」との用語は、表面上の任意の固定化されたスポットパターンをいう。所望する場合、プロセスを複数回繰り返して、高密度アレイを製造することができる。

例えば、プリントされるスポットが１００μｍの直径および２００μｍのピッチ（中心から中心）を有し、光活性化されるスポットが２０μｍの直径を有する（プリントされるスポットと同じピッチである）場合、マスクは同じスペース内に２５個のアレイを収容するようにオフセットとし、これによりアレイ密度を２５倍増加することができる。したがって、本発明の方法を用いて、プリントによってｃｍ²あたり２５００個のスポットを有するアレイを作製する能力を有する場合、ｃｍ²あたり６２，５００個のスポットを有するアレイを製造することができる。

有利なことに、本発明の方法は、マスクを１つだけ必要とする（しかしながら、所望する場合、２つ以上のマスクを用いることができる）。ミラード・レーザー照射を用いる場合、マスクは必要でない。したがって、本発明の方法は、複数のマスクを必要とするフォトリソグラフィin situ固相合成と比較して、高密度アレイの製造コストを有意に低くすることができる。更に、in situ固相合成の場合よりも長い核酸配列（ｃＤＮＡさえも含む）を固定化することができ、固定化前に配列を精製することができる。

アレイあたりのスポットの数は、アレイのサイズおよび組成並びにアレイの最終用途に依存することができる。ある種の診断用アレイでは異なるスポットがほんのわずかに必要とすることができる一方で、発現分析等の他の使用では所望の情報を収集するためにより多くのスポットを必要とすることができる。

核酸
本発明の方法によれば、レセプター分子を含む試薬溶液を固体支持体上にプリントする。レセプター分子は、天然供給源から得られるあるいは任意の好適な方法を用いて合成された核酸であることが好ましい。核酸の合成方法は既知である。例えば、核酸をポリメラーゼ連鎖反応または生化学的合成等の慣用的な技術により製造し、次いで精製することができる。

核酸の長さ（すなわち、ヌクレオチド塩基の数）は、５塩基から数千塩基まで広く変化をもたせることができる。特異的なハイブリダイゼーションを達成するため、核酸は長さが少なくとも１０塩基であることが好ましい。約１０〜５００塩基の範囲である配列を有する核酸が典型的であり、約２０〜２００塩基の配列、および４０〜１００塩基を有するものも同様である。有利なことに、本発明の方法を用いて、基体表面上での核酸配列のフォトリソグラフィin situ固相合成によって容易に得ることができる核酸配列よりも長い核酸配列を有するアレイを作成することができる。例えば、３０塩基より多い核酸を用いることができ、同様に、４０塩基より多い核酸、５０塩基より多い核酸、または１００塩基より多い核酸を用いることができる。すなわち、本発明の方法を用いて、ｃＤＮＡおよびＰＣＲ産物を固体支持体上に固定化することができる。より高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用いることで非特異的なハイブリダイゼーションを減少または排除することができるため、一般に、より長い（例えば、２５塩基より多い）配列を有する核酸が好ましい。しかしながら、所望する場合には、より短い核酸を用いることができる。

基体
本発明によれば、レセプター分子を本明細書中で基体と呼ぶ固体支持体上に固定化する。一般に、「固体支持体」または「基体」との用語は、用いる溶媒に不溶であり、上に核酸を固定化することができる二次元または三次元の表面を提供する材料をいう。固体支持体の組成は、レセプター分子が付着するもの、好ましくは共有的に付着するものであればどんなものでもよい。固体支持体の組成は、レセプター分子を付着させる方法に依存して変化をもたせることができる。

支持体表面は、レセプター−リガンド結合と相互作用せず、高量の非特異的結合を受けないことが好ましい。好適な材料には、生物学的または非生物学的材料、有機または無機材料が含まれる。好適な固体支持体には、プラスチック、官能化セラミック、樹脂、多糖類、官能化シリカ、またはシリカをベースとした材料、官能化ガラス、官能化金属、フィルム、ゲル、膜、ナイロン、絹、羊毛、綿等の天然繊維、並びにポリマーで作製される固体支持体が含まれるが、限定するものではない。本明細書に記載される通り、「官能化」との用語は既知の方法によって有機修飾を無機表面に付加して、光反応基が反応することができる結合を提供することをいう。高分子表面が好ましく、好適なポリマーには、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリエチレンテトラフタレート、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ブチルゴム、スチレンブタジエンゴム、天然ゴム、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリカーボネート、およびポリメチルペンテンが含まれるが、限定するものではない。

先に言及した通り、固体支持体は、二次元表面または三次元の表面を提供することができる。孔またはマトリクスへ核酸の移動が可能となるような浸透性を有する所望の長さ、幅、および厚さの固体支持体を用いて、三次元の表面を提供することができる。核酸を固体支持体の長、幅、および高さ（厚さ）に沿って固定化することができるので、より高密度の核酸を二次元表面上より三次元の表面上の所与の面積に固定化することができる。

固体支持体への核酸の非特異的吸着を減少する表面を選択することが好ましい。一般に、親水性表面は非特異的な吸着を減少させる。

「親水性」および「疎水性」は、それぞれ水を相容れるものおよびおよび水を相容れないものとして組成物を広く記載するために本明細書中で用いられる。一般に、親水性化合物は、相対的に極性であり、しばしばイオン化可能である。そのような化合物は、通常、水分子を強力に結合する。疎水性化合物は、通常、相対的に非極性であり、非イオン化である。一般に、疎水性表面によって水分子は表面でまたは表面近くで氷様のコンフィギュレーションの構造をとるようになる。疎水性および親水性は相対的な用語であり、種々の組成、液体、表面が互いに対して相対的に疎水性または親水性であることができる意で本明細書中で用いられる。

固体支持体の次元は変動することができ、所望のアレイの次元および所望の多様性の量等の要因によって決定することができる。一態様において、核酸をシートまたはフィルム形態の基体上に固定化し、続いて該基体を切断して個々のアレイとする。あるいは、個々のアレイを独立して製造することができる。固体支持体を顕微鏡スライド等の他の支持体上に単独でまたは複数で位置づけることもできる。

指摘した通り、いくつかの態様において、光活性可能な核酸（すなわち、フォト基で誘導体化されるレセプター分子）を表面上に固定化する。本発明の光活性可能な核酸を、核酸を表面に固定化するために光活性可能な基と反応する炭素−水素結合を有する任意の表面に塗布することができる。適切な基体の例には、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ（塩化ビニル）、ポリカーボネート、ポリ（メタクリル酸メチル）、パリレン、およびガラスまたはその他の無機表面を前処理するために用いられる多数の有機シランのいずれもが含まれるが、限定するものではない。光活性可能な核酸はアレイ表面上にプリントされ、次いで均一な照射によって光活性化されて、それらを特異的なパターンで表面に固定化することができる。それらは表面に連続的に均一に塗布され、次いで一連のマスクを通した照射によって光活性化されて、特定の領域中に特定の配列を固定化することもできる。したがって、異なるマスクを通した複数の照射による特定の光誘導体化された核酸の複数の連続的塗布、および光カップリング工程後にカップリングしていない光核酸を除去するための注意深い洗浄を用いて、固定化された核酸のアレイを製造することができる。光活性可能な核酸も、塗布および光固定化によって表面上に均一に固定化することができる。

プリント
本発明によれば、レセプターを含むある体積の試薬溶液を選択位置で固体支持体に塗布する。既知の技術を用いて、例えば改良した市販のプリント機器を用いて試薬溶液を基体に塗布することができる。例えば、本発明の照射プロセスを可能にするために、市販のプリント機器を改良することが必要である。固体支持体上に試薬を正確かつ繰り返してスポッティングを行うのに自動化ｘ−ｙ−ｚポジショナーを用いることが好ましい。ｘ−ｙ−ｚポジショナーは、３つの（ｘ、ｙ、およびｚ）方向すべてで少なくとも１０μｍの精度を有することが好ましい。一般に、スポッティングロボットは、センサーまたは視覚照合（visual referencing）を必要としない。

一般に、プリントの段階では、小さな体積（例えば、０．１ピコリットルおよび１ナノリットルの間、より典型的には、０．５ピコリットルおよび５００ピコリットルの間）の所望のレセプター分子を含む試薬溶液を基体表面に塗布する。プリントされるスポットの直径は、基体表面並びに塗布される溶液の体積および粘稠度に依存して変化をもたせることができる。典型的には、プリントされるスポットは、約１００〜５００μｍの間の直径（Ｄ）を有する。ピッチ（Ｐ）は一般に、ポットの直径によって影響を受ける。一般に、ピッチ（Ｐ）は、スポットの直径の２倍以上である（例えば、ピッチは一般に、２００ｍおよび１０００ｍの間である）。

基体表面上の光反応基
一態様において、固体支持体は、少なくとも１つのタイプの光反応基でコーティングした表面含む。

光反応基は本明細書中で定義されており、好ましい基はそのような性質を保持する条件下で保存されるのに十分に安定している。例えば、米国特許第５，００２，５８２号を参照のこと（その開示を、参照することにより本明細書に取り込む）。電磁スペクトルの種々の部に応答する潜在的な反応基を選択することができ、スペクトルの紫外部または可視部に応答するもの（本明細書中では「光反応」と呼ぶ）が特に好ましい。

光反応基は、加えられる特定の外部刺激に応答して活性種の生成を行い、例えば同じまたは異なる分子によって提供される隣接する化学構造への結果として生じる共有結合を伴う。光反応基は、保存条件下では共有結合が変わらないままであるが、外部エネルギー源によって活性化された際には他の分子と共有結合を形成する分子中の原子の基である。

本明細書に記載される通り、「光反応基」は、照射等の加えられる特定の外部エネルギー源に応答して、活性種（例えば、ナイトレン、カルベン、および励起されたケトン状態等の遊離ラジカル）の生成を行い、隣接する化学構造への結果として生じる共有結合を伴う、少なくとも１つの反応性部分を含む。光反応基は、電磁スペクトルの種々の部、典型的には、スペクトルの紫外部、可視部、または赤外部に応答するように選択することができる。「照射」は、表面に電磁放射線を加えることをいう。

一態様によれば、表面上で固定化されるレセプター分子を光反応基で修飾してもよいし、修飾しなくてもよい。

例えば、固体支持体は、ポリカチオン性ポリマーコーティングを有するガラス基体を含むことができる。この態様において、ポリマーコーティングは、ポリリシンまたはポリアルギニン等のカチオン性ポリペプチドを含む。既知の技術を用いてそのような固体支持体を製造することができる。例えば、均一な厚さのポリカチオン性ポリマーフィルムをスライド表面上に置いてフィルムを形成し、次いで該フィルムを乾燥してコーティングを形成することにより、スライドを製造することができる。添加されるポリカチオン性ポリマーの量は、少なくともポリマーの単分子層を固体支持体表面上に形成するのに十分であることが好ましい。フィルムは、一般に、表面上の負のシリル−ＯＨ基およびポリマー中の荷電しているアミン基の間の静電気的結合によって表面に結合する。ポリ−ｌ−リシンでコーティングされたガラススライドは、例えばシグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）（ミズーリ州セントルイス）からも市販されている。核酸配列をそのような表面上でプリントし、次いで照射して、核酸をカチオン性ポリマーに架橋することができる。

レセプター分子に付着される光反応基
代替の態様において、活性化されてレセプター分子を支持体表面に固定化することができる１つ以上の少なくとも１つのタイプの光反応基によりレセプター分子を誘導体化する。この態様によれば、光誘導体化されたレセプター分子は、好適な照射を加えることによって支持体表面に共有的に固定化される。光反応基は、レセプター分子に沿った１つ以上の点で直接または間接的に共有結合されることが好ましい。任意の好適な様式で、１つ以上のフォト基をレセプター分子に結合することができる。例えば、レセプター分子が核酸である場合、少なくとも１つの誘導体化された核酸塩基とともに核酸を合成することができる。あるいは、フォト基を３’末端において、５’末端において、核酸自体の長さに沿って、またはそれらの任意の組み合わせで与えるような様式で、天然に存在するまたは従前に合成された核酸を誘導体化することができる。

ホスホジエステル化学に基づく方法、より最近では固相ホスホラミダイト技術に基づく方法を含む任意の好適な手法を用いて、光活性可能なオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド成分を合成することができる。一般に、T. Brown and D.Brown, "Modern Machine-Aided Methods of Oligonucleotide Synthesis", Chapter 1, pp.1-24 in Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, F. Eckstein, ed., IRL Press(1991)を参照のこと（その開示を、参照することにより本明細書に取り込む）。

オリゴヌクレオチドの逐次合成は、一般に、結合ヌクレオチド誘導体の５’ヒドロキシル基および一連の遊離ヌクレオチド誘導体の３’−ヒドロキシル基の間での連続するジエステル結合の形成を伴う。合成のプロセスは、典型的には、カラムにパッキングされているシリカゲルまたはホウケイ酸塩ガラスのビーズ等の固体支持体にリンカーアームによってヌクレオチド誘導体がその３’末端で付着することから開始する。遊離ヌクレオチド誘導体上のある基を活性化する能力には、反応混合物中の他の場所に存在する他の潜在的に活性な基を可逆的な化学修飾によって「保護」することを必要とする。反応性ヌクレオチド誘導体は、３’−リン酸エステル基が例えばジアルキルホスホラミダイトによって置換され、活性化されたときに結合ヌクレオチドの遊離５’−ヒドロキシル基と反応して亜リン酸トリエステルを生ずる遊離モノマーである。次いで、次の合成工程前に、亜リン酸トリエステルを酸化して安定なリン酸エステルトリエステルとする。

固定化される反応体の３’−ヒドロキシルは、それを支持体へ付着することによって保護し、遊離モノマーの５’ヒドロキシルは、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基によって保護して自己重合を阻止することができる。３’−リン酸エステルのヒドロキシルを保護するのに、通常、２−シアノエチル基が用いられる。更に、個々の塩基上の反応基も保護する。ヌクレオチド外環状アミノ基の保護のため、種々の化学物質が開発されている。Ｎ−アセチル化デオキシヌクレオチドを製造するためのＮ−アセチル保護基が、そのような目的のために広く受け入れられている。

各反応後に、過剰な試薬を洗浄してカラムから除去し、無水酢酸を用いて任意の未反応の５’−ヒドロキシル基をブロッキングまたは「キャッピング」し、ジクロロ酢酸を用いて５’−ＤＭＴ基を除去することで、次の合成ラウンドにおいて伸長される結合オリゴマーが他の活性化されたモノマーと反応することが可能になる。

最終的に、十分に組み立てられたオリゴヌクレオチドを、ＨＰＬＣまたはいくつかのその他の方法により精製するために、固体支持体から切断し、脱保護する。切断に有用な試薬および条件は、結合の性質に依存する。スクシニル基を介した結合によって汎用的に提供されるエステル結合では、濃水酸化アンモニウム水溶液を用いた塩基の脱保護と同時に切断を行うこともできる。

核酸の修飾方法の総説は、（Bioconjugate Chem., 3 (1): 165-186,1990）に含まれている。記載される方法には、オリゴヌクレオチド合成中に導入される修飾、酵素修飾、およびネイティブなＤＮＡまたはＤＮＡ合成後の化学修飾が含まれる。これらの戦略すべてを用いて、フォト基を核酸上に導入するように試薬を設計することができるであろう。

ホスホラミダイト法を用いた合成中にフォト基を導入するために、多数の異なる試薬タイプを設計することができるであろう。１つのタイプの光試薬は、別々に保護することができる２つの反応基を有することができる。一例は、フォト基および第１級および第２級アルコールを有する側鎖を含む試薬である。第１級アルコールをＤＭＴ基で保護する。この試薬を用いて、第２級アルコールおよびカルボン酸基を含むシリカ支持体の間にエステル結合をつくることによってＤＮＡの３’末端にフォト基を提供することができることができるであろう。合成中にフォト基を他の任意の部位に据えるために、第２級アルコールを適当に保護したクロロホスホラミダイト（すなわち、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホラミダイトものと反応させる。保護されるヌクレオチドをＤＮＡ合成のために現在用いているのと同じ様式で、この試薬を用いる。フォト基および１つだけのヒドロキシルを有する試薬をクロロホスホラミダイトで誘導体化し、５’末端誘導体化試薬をつくることができるであろう。ホスホラミダイト法以外の化学を用いたオリゴヌクレオチド合成中にフォト基を提供するために、同様の様式で、試薬を設計することができるであろう。

オリゴヌクレオチドの合成後の誘導体化も可能である。これを達成する１つの方法は、合成中にアミン基をオリゴヌクレオチドに導入することである。オリゴヌクレオチドの５’末端でアミンを導入するための試薬が市販されている。種々の化学的手法を用いて、フォト基をアミン誘導体化ＤＮＡに付加することができるであろう。一例は、フォト基およびＮ−オキシスクシンイミドエステル（ＮＯＳ）を含む試薬を使用することである。ＮＯＳエステルをアミンと反応させることによって、フォト基を導入する。

３’または５’末端のいずれかに光反応基を有する核酸とは対照的に、分子骨格に沿って光反応基を有する核酸を製造することができるであろう。そのような光核酸試薬の製造のため、多くの手法を企図することができる。例えば、核酸を構成するヌクレオチド上に存在する塩基は、フォト基および塩基に共有的にカップリングするのに好適な化学反応基を有するへテロ二官能性光試薬を用いて光誘導体化されることができるであろう多数の反応基を有する。このプロセスによって、骨格に沿った位置およびフォト基の数に関しては比較的非選択的な核酸の誘導体化になるであろう。

さらなる例では、典型的にはＤＮＡ合成で用いられるヌクレオチド基本要素を、ヌクレオチドの塩基残基上に存在する反応性官能基の１つにフォト基を付着させることにより、光反応基で誘導体化することができるであろう。自動合成機中で得られた試薬を典型的な反応条件で使用することよって、フォト基をオリゴ鎖に沿った設計ポイントに導入することが可能になるであろう。好ましい例では、典型的なＤＮＡ合成中にオリゴ骨格に沿った特定の位置にアミン等の反応基を導入するために用いられる多数の市販の非ヌクレオチド試薬がある。これらの反応基を導入するオリゴ合成の完了後、次に反応性部位と反応させることで光反応基が導入されるであろう。あるいは、これらの非特異的な試薬をオリゴ合成での使用前に誘導化することができるであろう。

光反応基は、実質的に化学的および／または生物学的機能を保持する様式でレセプター分子を支持体に付着させるために選択的または特異的に活性化することができる誘導体化されたレセプター分子を提供する。この態様によれば、光反応基の「直接的な」付着は、光反応化合物がレセプター分子に直接付着することを意味する。他方において、「間接的な」付着は、光反応化合物およびレセプター分子が合成または天然ポリマー等の共有の構造に付着することをいう。得られた光誘導体化レセプター分子は、通常は表面前処理が必要ではない種々の基体表面に対して好適な照射を加えることにより共有的に固定化することができる。この態様の方法は、１つ以上の光反応基をレセプター分子に熱化学的に付着することおよびそのレセプター分子誘導体を基体表面上に光化学的に固定化することの双方を伴う。

「間接的な」付着方法では、リガンドとしての完全な状態のオリゴをポリマー骨格に沿って付着することにより、オリゴを本発明の試薬に導入することができるであろう。そのような高分子光オリゴ試薬の製造のために、多くの手法を企図することができる。一例では、アクリロイル等の重合可能なビニル基を末端にまたは骨格に沿ってオリゴに共有的に付着することにより、オリゴをモノマーの形態で製造することができる。このことは、塩化アクリロイルとアミン誘導体化されたオリゴとの反応により達成することができるであろう。次いで、これらのオリゴモノマーを、アクリルアミドまたはビニルピロリドン等の他のコモノマーととともに、光誘導体化されたモノマーと共重合することができるであろう。得られたポリマーは、フォト基およびポリマー骨格に沿ってランダムに付着したオリゴを有するであろう。あるいは、フォト基を構造の一部として有する鎖移動試薬を用いることにより、ポリマーの一方の末端に光反応基を有するポリマーを製造することができるであろう。

この手法のさらなる進展では、第２の工程において、予め形成されたポリマーをオリゴで誘導体化することができるであろう。この手法では、各々が適当に置換されたオリゴと反応することができる化学反応基がポリマー骨格に沿って位置しているポリマーを製造する。例えば、ＮＯＳエステル等の活性基を有するポリマーをアミン官能基を含むオリゴと反応させることで、オリゴをアミド結合を通してポリマー骨格に共有的に付着させることができるであろう。光誘導体化されたモノマーを用いてこのポリマーを製造することができ、あるいは、オリゴと同様の様式で、フォト基を予め形成されたポリマーに付加することができるであろう。あるいは、フォト基を構造の一部として有する鎖移動試薬を用いることにより、ポリマーの一方の末端に光反応基を有するポリマーを製造することができるであろう。次いで、第２の工程において、オリゴは反応基に付加されるであろう。

任意の固体支持体、好ましくは、光反応基と反応して核酸を表面に固定化することができる炭素−水素結合を有する固体支持体に、レセプター分子を塗布することができる。適切な基体の例には、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ（塩化ビニル）、ポリカーボネート、ポリ（メタクリル酸メチル）、パリレン、およびガラスまたは他の無機表面を前処理するために用いられる多数の有機シランのいずれもが含まれるが、限定するものではない。

光誘導されたレセプター分子を用いた高密度アレイの製造は、核酸（または他の成分）の非特異的な吸着を減少する表面を用いることができるので、一般に、固体支持体の表面上で光反応基を用いる方法より好ましい。

光誘導体化された核酸および該核酸の作製方法は、光活性可能な核酸誘導体と題する同一出願人による米国特許出願第０９／０２８，８０６号に詳細に記載されている。この出願は、本出願の同一出願人が保有し、その全部の内容を、参照することにより本明細書に取り込む。

光反応基
一態様によれば、レセプター分子を光反応基で誘導体化する。アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アンスロン、およびアンスロン様複素環（すなわち、１０位にＮ、Ｏ、またはＳを有するもの等のアンスロンの複素環アナログ）、またはそれらの置換（例えば、環置換）誘導体等の光反応性アリールケトンが好ましい。好ましいアリールケトンの例には、アクリドン、キサントン、およびチオキサントン含むアンスロンの複素環式誘導体、およびそれらの環置換誘導体が含まれる。約３６０ｎｍを上回る励起波長を有するチオキサントンおよび誘導体が特に好ましい。

アジドも光反応基の好適なクラスであり、フェニルアジド、特に４−フルオロ−３−ニトロフェニルアジド等のアリールアジド（Ｃ₆Ｒ₅Ｎ₃）、アジドギ酸エチル、アジドギ酸フェニル等のアシルアジド（−ＣＯ−Ｎ₃）、ベンゼンスルホニルアジド等のスルホニルアジド（−ＳＯ₂−Ｎ₃）、並びにジフェニルホスホリルアジドおよびジエチルホスホリルアジド等のホスホリルアジド（ＲＯ）₂ＰＯＮ₃を含む。ジアゾ化合物は光反応基の他のクラスを構成し、ジアゾメタンおよびジフェニルジアゾメタン等のジアゾアルカン（−ＣＨＮ₂）、ジアゾアセトフェノンおよび１−トリフルオロメチル−１−ジアゾ−２−ペンタノン等のジアゾケトン（−ＣＯ−ＣＨＮ₂）、ジアゾ酢酸ｔ−ブチルおよびジアゾ酢酸フェニル等のジアゾ酢酸エステル（−Ｏ−ＣＯ−ＣＨＮ₂）、および３−トリフルオロメチル−３−フェニルジアジリン等のベータ−ケト−アルファ−ジアゾ酢酸エステル（−ＣＯ−ＣＮ₂−ＣＯ−Ｏ−）、およびケテンおよびジフェニルケテン等のケテン（−ＣＨ＝Ｃ＝Ｏ）を含む。

光反応基が活性化されると、レセプター分子は、互いにおよび／または光反応基の残基を介して共有結合により材料表面に共有結合する。代表的な光反応基および活性化されたときのそれらの残基を以下に示す。

光活性可能な核酸は、アレイ表面上にプリントされ、次いで均一な照射によって活性化されて、それらを特異的なパターンで表面に固定化することができる。それらは、表面に連続的に均一に塗布され、次いで一連のマスクを通した照射によって光活性化されて、特定の領域中に特定の配列を固定化することもできる。したがって、異なるマスクを通した複数の照射による特定の光誘導体化された核酸の複数の連続的塗布、およびフォトカップリング工程後にカップリングしていない光核酸を除去するための注意深い洗浄を用いて、固定化された核酸のアレイを製造することができる。光活性可能な核酸も、塗布および光固定化によって表面上に均一に固定化することができる。

照射
本発明によれば、試薬溶液を固体支持体上にプリントした後、照射工程において、少なくともいくつかのレセプター分子を固体支持体上に固定化することができる。

一態様では、上記の通り、照射工程を用いて、プリントされるスポットの直径より小さい直径を有する本質的に円形のコンフィギュレーションで核酸を固定化することができる。本明細書に記載される通り、「本質的に円形の」との用語は、形状が概して円形の形状であることをいうが、いくつかの不規則変化があってもよい。例えば、形状はわずかに楕円形であってもよいし、形状を区画する縁は完全に滑らかでなくてもよい。更に、照射工程を用いて、非円形のコンフィギュレーションを有する固定化された核酸の「スポット」を作成することができる。例えば、核酸を四角形、三角形、十字、ダッシュ等の形状で固定化することができる。特異的な形状の「スポット」は、ハイブリダイゼーションパターンの検出を容易にすることができるであろう。一般に、照射されたスポットにより区画される面積は、プリントされるスポットの直径により区画される面積より小さい。本質的に円形のプリントされるスポットの直径（Ｄ）により区画される面積（Ａ）は、面積＝π（Ｄ／２）²で表される式によって計算される面積をいう。

別の態様において、異なる形状の「スポット」を互いに重ねることができるであろう（図３）。例えば、第１の核酸配列を固体支持体上にプリントすることができ（図３（１）（Ａ））、四角形の形状の光パターンで照射することができるであろう（その結果、核酸は、四角形で固定化される；図３（１）（Ｂ））。第２の核酸を固体支持体上にプリントする前に（（図３（２）（Ａ））、固定化されていない核酸を除去する（図３（１）（Ｃ））。次には、核酸を三角形の光パターンで照射することができるであろう（図３（２）（Ｂ））。再び、核酸を除去する。この技術を用いて、あるタイプの標的リガンドの存在下で四角形の形状のスポットが検出され、異なるリガンドの存在下で三角形の形状のスポットが検出されるアレイを製造することができる。別の態様において、異なるコンフィギュレーションを有するスポットをオフセットすることができる。

マスクされた照射
一態様において、マスクされた照射によって、レセプター分子を固体支持体に固定化する。本明細書に記載される通り、「固定化される」との用語は、レセプター分子が支持体表面に安定的に付着されることを意味する。そのような付着は共有的であることが好ましいが、他の好適な安定的な付着も企図される。

一般に、照射によって定められるレセプター分子の固体支持体への固定化を調節するためのマスク使用技術は、既知である。簡単に言えば、本発明では、レセプター分子の固体支持体上への固定化を定めるためのマスク（例えば、クロムまたはガラスマスク）を用いた。本発明によれば、プリントされるスポットは、プリントされるスポットと同じピッチ（中心−中心距離）で開口部を有するマスクを通して照射される。しかしながら、プリントされるスポットでの照射の直径は、プリントされるスポット自体の直径より小さいことが好ましい。したがって、固定化されるレセプター分子の直径は、プリントされるスポットの直径より小さい。

マスクは、中心から中心からまで約１００μｍ〜約５００μｍの間のピッチを有することが好ましく、約１００μｍ〜約２００μｍの間であることがより好ましい。各スポットに対する照射の直径は、１００μｍ未満が好ましく、５０μｍ未満が好ましい。照射の直径は、約１０μｍおよび５０μｍの間、より典型的には２０μｍおよび４０μｍの間であるこができる。いくつかの場合では、１０μｍ未満の照射の直径を有することが望ましい。限定要因は、用いる光の波長および／または検出系の分解能であることができる。

レセプター分子の固定化に用いる光反応基によって、波長を少なくとも一部決定することができる。すなわち、所与の光反応基は、特定の波長の光で照射することが好ましい。

ミラード・レーザー照射
フォトリソグラフィの代替として、レセプター分子を固体支持体に固定化するためにミラード・レーザー照射を用いることができる。この態様によれば、デジタル・マイクロミラーを用いて、プリントされるスポットの特定領域に照射を向け、レセプター分子を固体支持体上に固定化することができる。例えば、好適なデジタルマイクロミラーアレイは、コンピュータ・ディスプレー・プロジェクション・システムで汎用されているテキサス・インスツルメンツ(Texas Instrument's)（テキサス州ダラス）のデジタル・マイクロミラー装置（ＤＭＤ）である。ミラーを個々に配置させることができ、かつ、任意の所与のパターンまたは画像を広範囲の波長で作成するために用いることができる。

ミラード・レーザー照射の有利な点には、核酸のフォトリソグラフィin situ固相合成と比較してコストが低いことが含まれる（例えば、マイクロミラー装置のミラーを調整することは、複数のマスクを作製するより安価である）。

使用方法
本発明のマイクロアレイは、ハイスループット（大規模ハイブリダイゼーションアッセイ）および複合体混合物の費用効果の高い分析に用いることができる。例えば、アッセイは、ＤＮＡシーケンシング、遺伝子診断、および生物のジェノタイピングを含む遺伝子用途に好適である。

アレイは、生物学的試料中の非常に種々の核酸を検出するように適合させることができる。使用の際は、標的リガンドをアレイ上の対応する相補物にハイブリダイズすることが可能となる好適な条件下で、１つ以上の標的リガンドを含むと思われる試料にアレイを暴露することができる。アッセイアレイ上に標的核酸が存在するか非存在しないかは、選択されたシグナル生成および検出系により決定することができるそのような検出方法は、当該技術分野で既知である。

遺伝子マッピングのために、遺伝子またはクローン化ＤＮＡフラグメントを規則正しく並んだＤＮＡ配列アレイにハイブリダイゼーションし、アレイに塗布されたＤＮＡ要素の同定をアレイ上で検出されたパターンにより確定する。ゲノムの物理地図を構築する際は、固定化されたクローン化ＤＮＡフラグメントのアレイを他のクローン化ＤＮＡフラグメントとハイブリダイゼーションさせて、プローブ混合物中のクローン化フラグメントが重複し、したがってアレイ上の固定化されたクローンに隣接しているかを確定する。

固定化されたＤＮＡ配列のアレイは、遺伝子診断にも用いることができる。例えば、複数の形態の変異遺伝子を含むアレイを、固定化型の遺伝子のたった１つと優先的に相互作用する患者ＤＮＡの標識した混合物でプロービングすることができる。

固定化されたＤＮＡ配列のアレイをＤＮＡプローブ診断で用いることもできる。例えば、不明な病原体ＤＮＡの試料を既知の多くのタイプの病原体ＤＮＡを含むアレイにハイブリダイズすることにより、病原性微生物の同定を確定することができる同様の技術を生物のジェノタイピングにも用いることができる。ｃＤＮＡおよびＲＮＡ等の他の遺伝子対象分子をアレイ上に固定化するか、アレイに塗布された標識プローブとして用いることができる。

一態様において、標的核酸（本明細書中で「リガンド」と呼ぶ）を検出可能な標識で標識することができる。５’末端部位、３’末端部位、または核酸長内の内部部位において標識を導入することができる。あるいは、「サンドイッチ」アッセイを用いることができる。サンドイッチアッセイでは、捕捉プローブを基体表面上に固定化し、標的リガンドと接触させて、付着複合体を形成する。捕捉プローブは、該捕捉プローブがリガンドの特定のサブパートに結合するように設計される。次いで、付着複合体をリガンドの別のサブパートと結合する標識した検出プローブと接触させる。好ましい検出可能な標識には、放射性同位体、安定な同位体、酵素（典型的には、色素生産基質との組み合わせで用いられる）、蛍光化学物質、発光化学物質、または有色化学物質が含まれる。検出可能な標識を核酸に導入するための多くの既知手順がある。

このように、本発明を記載してきた。本発明の範囲から逸脱することなく多くの改変を記載された態様に行うことができることは当業者に明らかである。したがって、本発明の範囲は、本出願に記載される態様に限定すべきではなく、特許請求の範囲の文言により記載される態様およびそれらの態様の均等物のみによって限定すべきである。

実施例１
ベンゾフェノン置換オリゴヌクレオチドの製造および評価
（ａ）Ｎ−スクシンイミジル６−（４−ベンゾイルベンズアミド）ヘキサノエート（ＢＢＡ−ＥＡＣ−ＮＯＳ）の製造
実施例３（ａ）に記載されるようにして製造された４−ベンゾイルベンゾイルクロリド６０．００ｇ（０．２４６モル）をクロロホルム９００ｍｌに溶解した。６−アミノヘキサン酸３３．８ｇ（０．２５８モル）を１Ｎ ＮａＯＨ７５０ｍｌに溶解し、酸塩化物溶液を攪拌しながら加えた。混合物を室温で４５分間激しく攪拌して乳濁液を生成した。次いで、生成物を１２Ｎ ＨＣｌ７５ｍｌで酸性化し、クロロホルム３×５００ｍｌで抽出した。合わせた抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発した。６−（４−ベンゾイルベンズアミド）ヘキサン酸をトルエン／酢酸エチル（３／１）から再結晶化し、融点１０６．５〜１０９．５℃の生成物７７．１９ｇ（９３％収率）を得た。

６−（４−ベンゾイルベンズアミド）ヘキサン酸６０．００ｇ（０．１７７モル）を乾燥フラスコに加え、乾燥１，４−ジオキサン１２００ｍｌに溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド２１．４ｇ（０．１８６モル）を加え、続いて１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド４１．９ｇ（０．２０３モル）を加え、反応物を湿気から保護するための乾燥管の下で混合物を室温で一晩攪拌した。濾過して１，３−ジシクロヘキシル尿素を除去し、溶媒を減圧下で除去し、得られたオイルをジオキサン３００ｍｌで希釈した。形成された任意の残存固体を濾過により除去し、溶媒除去後にＢＢＡ−ＥＡＣ−ＮＯＳをエタノールから２回再結晶化して、融点１２３〜１２６℃の白色固体６０．３１ｇを得た。

（ｂ）アミノ修飾オリゴヌクレオチドの光誘導体化
Ｃ−１２スペーサー（アミン−ＩＤ１）を含む５’−アミノ修飾物を用いて合成された３０塩基のオリゴマー（３０マー）プローブ５’−ＴＴＣＴＧＴＧＴＣＴＣＣＣＧＣＴＣＣＣＡＡＴＡＣＴＣＧＧＧＣ−３’（ＩＤ１）は、ミッドランド・サーテイファイド・リエージェント・カンパニー社（Midland Certified Reagent Company）（テキサス州ミッドランド）で注文により作製された。オリゴヌクレオチドアミン−ＩＤ１ １００μｇ（１０ｎモル、水中で保存された２．５４ｍｇ／ｍｌ ３９．４μｌ）を先の実施例１（ａ）に記載されるようにして製造されたＢＢＡ−ＥＡＣ−ＮＯＳ４３．８μｇ（１００ｎモル、ＤＭＦ中で保存された５ｍｇ／ｍｌ ８．８μｌ）および１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）４μｌとともに振盪器上でマイクロ遠心管中で混合した。反応を室温で３時間進めた。未反応のＢＢＡ−ＥＡＣ−ＮＯＳを除去するために、反応物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）１４８μｌで希釈し、次いで製造元の仕様書に従ってＮＡＰ−５カラム（ファルマシア・バイオテック、スウェーデンウプサラ）上に充填した。ＰＢＳを用いてカラムを平衡化し、オリゴヌクレオチドをカラムから溶出した。セファデックスＧ−２５ゲルを含むＮＡＰ−５カラムによって、低分子量化合物からオリゴヌクレオチドを分離した。合計で３．１Ａ₂₆₀単位またはベンゾフェノンにより誘導体化されたオリゴヌクレオチドＩＤ１ ９６μｇを除去した。

（ｃ）ベンゾフェノン置換オリゴヌクレオチドの評価
１ウエルあたり５ｐモル／０．１ｍｌのオリゴアミン−ＩＤ１およびベンゾフェノン−ＩＤ１を、インキュベーション緩衝液（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．５、１ｍＭＥ ＤＴＡ、１５％Ｎａ₂ＳＯ₄）中のポリプロピレン（ＰＰ、コーニング・コスター（Coring Costar）、マサチューセッツ州ケンブリッジ）マイクロウエルプレート中で一晩室温でインキュベートした。プレートの半分をヘラウス・バルブ（Heraeus bulb）(W.C.ヘラウスGmbH（W.C.Heraeus GmbH）、ドイツ連邦共和国ハーナウ）および３００ｎｍ以下の光をすべて遮断するカットオフフィルターを含むダイマックス・ランプ（Dymax lamp）（型式番号PC-2、ダイマックス・カンパニー社（Dymax Corporation）、コネチカット州トリントン）で照射した。照射時間は、３３０〜３４０ｎｍの波長範囲における１〜２ｍＷ／ｃｍ²の強度で２分間とした。照射しなかった残り半分のプレートは、吸着されたオリゴ対照として役立てた。次いで、すべてのプレートを、マイクロプレート自動洗浄器（型式ＥＬ ４０３Ｈ、バイオテック・インスツルメンツ（Bio-Tek Instruments）、バーモント州ウィヌースキ）を用いて、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄した。

相補的な５’−ビオチン−ＣＧＧＴＧＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＣＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＧＣＧＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＡＡ−３’（ＩＤ２）検出プローブまたは非相補的な５’−ビオチン−ＣＣＧＴＧＣＡＣＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＴＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧＡＣ−３’（ＩＤ３）オリゴヌクレオチドを用いて、以下に記載したようにハイブリダイゼーションを行った。両オリゴは、マヨ・クリニック（Mayo Clinic）（ミネソタ州ロチェスター）から得た。プレートを５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸塩、ｐＨ７．０）、０．１％ラウロイルサルコシン、１％カゼイン、および０．０２％硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）からなるハイブリダイゼーション緩衝液で５５℃で３０分間ブロッキングした。検出プローブを固定化されたプローブにハイブリダイゼーションしたとき、１ウエルあたり０．１ｍｌ中の検出プローブの５０ｆモルのアリコートを加え、５５℃で１時間インキュベートした。次いで、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで、プレートを５５℃で５分間洗浄した。結合検出プローブを、ストレプトアビジンおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼ（SA-HRP、ピアス（Pierce）、イリノイ州ロックフォード）の０．５μｇ／ｍｌ共役体０．１ｍｌでアッセイし、これを３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、続いてペルオキシダーゼ基質（Ｈ₂Ｏ₂およびテトラメチルベンジジン、KirkegardおよびPerry Laboratories、メリーランド州ゲーサーズバーグ）を加え、２０分後にマイクロウエルプレートリーダー（Model ３５５０、Bio-Rad Labs、マサチューセッツ州ケンブリッジ）上で６５５ｎｍで測定した。

表１に列記した結果は、照射したベンゾフェノン誘導体化オリゴヌクレオチドは吸着したオリゴヌクレオチド対照より高いハイブリダイゼーションシグナルを与えることを示している。逆に、照射および吸着した非誘導体化オリゴヌクレオチドにより生じたハイブリダイゼーションシグナルの間には違いはなかった。

実施例２
ソラレン置換オリゴヌクレオチドの製造および評価
３０マーの５’−ソラレン−ＩＤ１は、ソラレン−Ｃ₆−ホスホラミダイトを用いてミッドランド・サーテイファイド・リエージェント・カンパニー社によって注文により合成された。光反応ポリビニルピロリドン（ＰＶ０５、サーモディクス社（SurModics）、ミネソタ州エデンプライリー（Eden Prairie））１ｍｇ／ｍｌを含むコーティング溶液を水中で製造した。ＰＶ０５コーティング溶液０．１ｍｌを含むポリプロピレンマイクロウエルを室温で３０分間インキュベートした。溶液をウエルから吸引し、フィルターを用いなかったことを除いて実施例１（ｃ）に記載した条件を用いてプレートを２分間照射した。

１ウエルあたり５ｐモル／０．１ｍｌのオリゴアミン−ＩＤ１およびソラレン−ＩＤ１を、インキュベーション緩衝液中の未処理およびＰＶ０５処理ＰＰマイクロウエルプレート中で室温で一晩インキュベートした。実施例１（ｃ）に記載したように、プレートを照射し、ハイブリダイゼーションした。表２の結果は、ＰＶ０５処理したＰＰ表面上の照射したソラレン誘導体化オリゴヌクレオチドは、吸着した対照よりも高いハイブリダイゼーションシグナルを有していたことを示している。逆に、照射および吸着した非誘導体化オリゴヌクレオチドにより生じたハイブリダイゼーションシグナルの間には違いはなかった。

実施例３
オリゴヌクレオチド誘導体化光ポリマーの製造および評価
（ａ）４−ベンゾイルベンゾイルクロリド（ＢＢＡ−Ｃ１）の製造
４−ベンゾイル安息香酸（ＢＢＡ）１．０ｋｇ（４．４２モル）を還流冷却器および吊り攪拌器を備えた乾燥５リットルモルトンフラスコに加え、続けて塩化チオニル６４５ｍｌ（８．８４モル）およびトルエン７２５ｍｌを加えた。次いで、ジメチルホルムアミド３．５ｍｌを加え、４時間加熱還流した。冷却後、溶媒を減圧下で除去し、残存塩化チオニルをトルエン３×５００ｍｌを用いて３度の蒸発により除去する。生成物をトルエン／ヘキサン（１／４）から再結晶化し、真空オーブン中での乾燥後、９８８ｇ（収率９１％）を得た。生成物の融点は、９２〜９４℃であった。８０ＭＨｚ（¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃））での核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析は、所望の生成物と一致した：芳香族プロトン７．２０−８．２５（ｍ、９Ｈ）。化学シフト値はすべて、テトラメチルシラン内部標準から低磁場側のｐｐｍである。例えば実施例３（ｃ）に記載される光活性可能なポリマーの合成に用いられるモノマーの製造における使用のため、または例えば実施例１（ａ）に記載されるヘテロ二官能性化合物のため、最終化合物を保存した。

（ｂ）Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（ＡＰＭＡ）の製造
ＣＨ₂Ｃｌ₂１０００ｍｌ中の１，３−ジアミノプロパン１９１０ｇ（２５．７７モル）の溶液を１２リットルのモルトンフラスコに加え、氷浴中で冷却した。次いで、ＣＨ₂Ｃｌ₂２５０ｍｌ中の炭酸ｔ−ブチルフェニル１０００ｇ（５．１５モル）の溶液を、反応温度を１５℃以下に保つ速度で滴下して加えた。添加後、混合物を室温に暖め、２時間攪拌した。反応混合物をＣＨ₂Ｃｌ₂９００ｍｌおよび氷５００ｇで希釈し、続いて２．２Ｎ ＮａＯＨ２５００ｍｌをゆっくり加えた。溶液が塩基性であることを確実にするための試験をした後、生成物を分液漏斗に移し、有機層を除去し、抽出物番号１として取り置いた。次いで、各抽出物を別々のフラクションとしたまま、水溶液をＣＨ₂Ｃｌ₂３×１２５０ｍｌで抽出した。次いで、４つの有機抽出物を、フラクション番号１から始まりフラクション番号４まで、０．６Ｎ ＮａＯＨ１２５０ｍｌの単一部で連続して洗浄した。０．６Ｎ ＮａＯＨ１２５０ｍｌの新たな部を用いて、この洗浄手順を２回繰り返した。次いで、有機抽出物を合わせ、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。溶媒を濾過し、一定の重量まで蒸発することによって、Ｎ−モノ−ｔ−ＢＯＣ−１，３−ジアミノプロパン８２５ｇが得られ、これを更に精製せずに用いた。

ＣＨＣｌ₃１０２０ｍｌ中の無水メタクリル酸８０６ｇ（５．２３モル）の溶液を吊り攪拌器を備えた１２リットルのモルトンフラスコ中に入れ、氷浴上で冷却した。フェノチアジン６０ｍｇを阻害剤として加え、続いてＣＨＣｌ₃８２５ｍｌ中のＮ−モノ−ｔ−ＢＯＣ−１，３−ジアミノプロパン８２５ｇ（４．７３モル）を滴下して加えた。添加速度は、いずれの時間でも１０℃以下の反応温度を保つように調節した。添加完了後、氷浴を除去し、混合物を一晩攪拌したままとした。生成物を水２４００ｍｌで希釈し、分液漏斗に移した。十分に混合した後、水層を除去し、有機層を２Ｎ ＮａＯＨ２４００ｍｌで洗浄して、水層が塩基性であることを確実にした。次いで、有機層をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濾過して乾燥剤を除去した。生成物および溶媒の合わせた重量が約３０００ｇとなるまで、ＣＨＣｌ₃溶媒の一部分を減圧下で除去した。次いで、ヘキサン１１．０リットルを攪拌されたＣＨＣｌ₃溶液にゆっくり加えることにより、所望の生成物を沈殿させ、続いて４℃で一晩保存した。生成物を濾過によって単離し、固体をヘキサン９００ｍｌおよびＣＨＣｌ₃１５０ｍｌの溶媒の組み合わせにより２回すすいだ。固体を十分に乾燥することにより、ＤＳＣによる融点が８５．８℃であるＮ−［Ｎ’−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−３−アミノプロピル］−メタクリルアミド９００ｇを得た。ＮＭＲ分光計での分析は、所望の生成物と一致した：¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）アミドＮＨの６．３０−６．８０、４．５５−５．１０（ｍ、２Ｈ）、ビニルプロトン５．６５、５．２０（ｍ、２Ｈ）、Ｎの隣りのメチレン２．９０−３．４５（ｍ、４Ｈ）、メチル１．９５（ｍ、３Ｈ）、残りのメチレン１．５０−１．９０（ｍ、２Ｈ）、およびｔ−ブチル１．４０（ｓ、９Ｈ）。

３ッ首の２リットル丸底フラスコは、吊り攪拌器およびガススパージ管を備えていた。メタノール７００ｍｌをフラスコに加え、氷浴上で冷却した。攪拌しながら、ＨＣｌガス流を約５リットル／分の速度で合計４０分間溶媒中にバブリングした。最終ＨＣｌ／ＭｅＯＨ溶液のモル濃度は、フェノールフタレインを指標として用いた１Ｎ ＮａＯＨでの滴定により８．５Ｍであると決定された。Ｎ−［Ｎ’−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−３−アミノプロピル］メタクリルアミド９００ｇ（３．７１モル）を吊り攪拌器およびガス出口アダプターを備えた５リットルのモルトンフラスコに加え、続けてメタノール溶媒１１５０ｍｌを加えた。いくつかの固体がこの溶媒体積を有するフラスコに残存していた。フェノチアジン３０ｍｇを阻害剤とて加え、続いて８．５Ｍ ＨＣｌ／ＭｅＯＨ溶液６５５ｍｌ（５．５７モル）を加えた。ガスを出しながら固体はゆっくりと溶解したが、反応は発熱性ではなかった。混合物を一晩室温で攪拌して、反応が完了したことを確実にした。次いで、いずれの固体も濾過により除去し、追加のフェノチアジン３０ｍｇを加えた。次いで、溶媒を減圧下で攪拌し、得られた固体残渣を減圧下で蒸発しながらイソプロパノール３×１０００ｍｌと共沸混合した。最終的に、生成物をに還流イソプロパノール２０００ｍｌに溶解し、酢酸エチル４０００ｍｌを攪拌しながらゆっくりと加えた。混合物をゆっくりと冷却し、４℃で一晩保存した。Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩を濾過により単離し、一定の重量まで乾燥すると、収量６３０ｇが得られ、ＤＳＣによる融点は１２４．７℃であった。ＮＭＲ分光計での分析は、所望の生成物と一致した：¹ＨＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）ビニルプロトン５．６０、５．３０（ｍ、２Ｈ）、アミドＮの隣りのメチレン３．３０（ｔ、２Ｈ）、アミンＮ近くメチレン２．９５（ｔ、２Ｈ）、メチル１．９０（ｍ、３Ｈ）、および残りのメチレン１．６５−２．１０（ｍ、２Ｈ）。例えば実施例３（ｃ）に記載される光活性可能なポリマーの合成に用いられるモノマーの製造における使用のため、最終化合物を保存した。

（ｃ）Ｎ−［３−（４−ベンゾイルベンズアミド）プロピル］メタクリルアミド（ＢＢＡ−ＡＰＭの製造
実施例３（ｂ）に記載される一般方法に従って製造されたＡＰＭＡ１２０．０ｇ（０．６７２モル）を吊り攪拌器を備えた乾燥２リットル３つ首丸底フラスコに加えた。フェノチアジン２３〜２５ｍｇを阻害剤として加え、続いてクロロホルム８００ｍｌを加えた。懸濁液を氷浴上で１０℃以下に冷却し、実施例３（ａ）に記載される一般方法に従って製造されたＢＢＡ−Ｃｌ１７２．５ｇ（０．７０５モル）固体として加えた。次いで、クロロホルム５０ｍｌ中のトリエチルアミン２０７ｍｌ（１．４８５モル）を１〜１．５時間にわたって滴下して加えた。氷浴を取り除き、周囲温度での攪拌を２．５時間継続した。次いで、生成物を０．３Ｎ ＨＣｌ６００ｍｌおよび０．０７ＮＨＣｌ２×３００ｍｌで洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後、クロロホルムを減圧下で除去し、生成物を、各々の再結晶化において重合を阻止するためのフェノチアジン２３〜２５ｍｇを用いて、トルエン／クロロホルム（４／１）から２回再結晶化した。ＢＢＡ−ＡＰＭＡの典型的な収率は９０％であり、融点は１４７〜１５１℃であった。ＮＭＲ分光計の分析は、所望の生成物と一致した：¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）芳香族プロトン７．２０−７．９５（ｍ、９Ｈ）、アミドＮＨ６．５５（ブロードｔ、１Ｈ）、ビニルプロトン５．６５、５．２５（ｍ、２Ｈ）、メチレンの隣りのアミドＮ’ｓ３．２０−３．６０（ｍ、４Ｈ）、メチル１．９５（ｓ、３Ｈ）、および残りのメチレン１．５０−２．００（ｍ、２Ｈ）。例えば実施例３（ｅ）に記載される光活性可能なポリマーの合成での使用のため、最終化合物を保存した。

（ｄ）Ｎ−スクシンイミジル６−マイイミドヘキサノエート（ＭＡＬ−ＥＡＣ−ＮＯＳ）の製造
官能化モノマーを以下の様式で製造し、実施例３（ｅ）で記載されているように用いて活性化エステル基をポリマーの骨格に導入した。６−アミノヘキサン酸１００．０ｇ（０．７６２モル）を、吊り攪拌器および乾燥管を備えた３ッ首の３リットルフラスコ中で酢酸３００ｍｌに溶解した。無水マレイン酸７８．５ｇ（０．８０１モル）を酢酸２００ｍｌに溶解し、６−アミノヘキサン酸溶液に加えた。混合物を沸騰水浴上で加熱しながら１時間攪拌すると、白色固体が形成した。一晩室温で冷却した後、固体を濾過により回収し、ヘキサン２×５０ｍｌですすいだ。乾燥後、（Ｚ）−４−オキソ−５−アザ−２−ウンデセン二酸の典型的な収量は１５８〜１６５ｇ（９０〜９５％）あり、融点は１６０〜１６５℃であった。ＮＭＲ分光計での分析は、所望の生成物と一致した：¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）アミドプロトン８．６５−９．０５（ｍ、１Ｈ）、ビニルプロトン６．１０、６．３０（ｄ、２Ｈ）、窒素の隣りのメチレン２．８５−３．２５（ｍ、２Ｈ）、カルボニルの隣りのメチレン２．１５（ｔ、２Ｈ）、および残りのメチレン１．００−１．７５（ｍ、６Ｈ）。

（Ｚ）−４−オキソ−５−アザ−２−ウンデセン二酸１５０．０ｇ（０．６５４モル）、無水酢酸６８ｍｌ（７３．５ｇ、０．７２１モル）、およびフェノチアジン５００ｍｇを吊り攪拌器を備えた２リットルの３ッ首丸底フラスコに加えた。トリエチルアミン９１ｍｌ（０．６５３モル）およびＴＨＦ６００ｍｌを加え、攪拌しながら加熱還流した。合計で４時間還流した後、黒ずんだ混合物を６０℃未満に冷却し、水３リットル中の１２Ｎ ＨＣｌ２５０ｍｌの溶液に注ぎ込んだ。混合物を室温で３時間攪拌し、次いでセライト５４５パッドを通して濾過し、固体を除去した。濾液をクロロホルム４×５００ｍｌで抽出し、合わせた抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥した。重合を阻止するためにフェノチアジン１５ｍｇを加えた後、溶媒を減圧下で除去した。６−マイイミドヘキサン酸をヘキサン／クロロホルム（２／ｌ）から再結晶化して、典型的な収量７６〜８３ｇ（５５〜６０％）が得られ、融点は８１〜８５℃であった。ＮＭＲ分光計での分析は、所望の生成物と一致した：¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）マレイミドプロトン６．５５（ｓ、２Ｈ）、窒素の隣りのメチレン３．４０（ｔ、２Ｈ）、カルボニルの隣りのメチレン２．３０（ｔ、２Ｈ）、および残りのメチレン１．０５−１．８５（ｍ、６Ｈ）。

６−マイイミドヘキサン酸２０．０ｇ（９４．７ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下でクロロホルム１００ｍｌに溶解し、続いて塩化オキサリル４１ｍｌ（０．４７ｍｏｌ）を加えた。室温で２時間攪拌した後、溶媒を減圧下で除去し、追加のクロロホルム４×２５ｍｌを用いて最後の過剰の塩化オキサリルを除去した。酸塩化物をクロロホルム１００ｍｌに溶解し、続いてＮ−ヒドロキシスクシンイミド１２．０ｇ（０．１０４ｍｏｌ）およびトリエチルアミン１６．０ｍｌ（０．１１４ｍｏｌ）を加えた。室温で一晩攪拌した後、生成物を水４×１００ｍｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除去することにより、生成物（８２％）２４．０ｇが得られ、これを更に精製せずに用いた。ＮＭＲ分光計での分析は、所望の生成物と一致した：¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）マレイミドプロトン６．６０（ｓ、２Ｈ）、窒素の隣りのメチレン３．４５（ｔ、２Ｈ）、スクシンイミジルプロトン２．８０（ｓ、４Ｈ）、カルボニルの隣りのメチレン２．５５（ｔ、２Ｈ）、および残りのメチレン１．１５−２．００（ｍ、６Ｈ）。例えば実施例３（ｅ）に記載される光活性可能なポリマーの合成に用いられるモノマーの製造における使用のため、最終化合物を保存した。

（ｅ）アクリルアミド、ＢＢＡ−ＡＰＭＡ、およびＭＡＬ−ＥＡＣ−ＮＯＳののコポリマーの製造
本発明の光活性可能なコポリマーを以下の様式で製造した。アクリルアミド３．８４９ｇ（５４．１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）５２．９ｍｌに溶解し、続いて実施例３（ｃ）に記載した一般方法に従って製造されたＢＢＡ−ＡＰＭＡ０．２１３ｇ（０．６１ｍｍｏｌ）、実施例３（ｄ）に記載した一般方法に従って製造されたＭＡＬ−ＥＡＣ−ＮＯＳ０．９３８ｇ（３．０４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）０．０５３ｍｌ（０．３５ｍｍｏｌ）、および２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）０．１４２ｇ（０．８６ｍｍｏｌ）に溶解した。溶液を、ヘリウムスパージで４分間脱酸素化し、続いてアルゴンスパージで更に４分間脱酸素化した。次いで、密封容器を５５℃で一晩加熱し、重合を完了した。固体生成物を濾過によって単離し、濾過ケークをＴＨＦおよびＣＨＣｌ₃で十分にすすいだ。生成物を真空オーブン中で３０℃で乾燥して、白色固体５．２３４ｇを得た。ＮＭＲ分析（ＤＭＳＯ−ｄ₆）によって２．７５ｐｐｍでのＮＯＳ基の存在を確認し、フォト基の充填はポリマー１ｇあたり０．１０４ｍｍｏｌＢＢＡであると決定された。ＭＡＬ−ＥＡＣ−ＮＯＳは、この反応物中で５モル％の重合可能なモノマーを構成していた。

（ｆ）オリゴヌクレオチド誘導体化光ポリマーの製造および評価
ＩＤ１に対して記載されているアミン修飾を有する４０マーのプローブ５’−ＧＴＣＴＧＡＧＴＣＧＧＡＧＣＣＡＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＡ−３’（ＩＤ４）を合成した。オリゴアミン−ＩＤ４ ４０μｇ（水中で保存される２．６７ｍｇ／ｍｌ １５μｌ）を、実施例３（ｅ）に記載されるようにして製造されたアクリルアミド、ＢＢＡ−ＡＰＭＡ、およびＭＡＬ−ＥＡＣ−ＮＯＳのコポリマー８０μｇ（新しく作られた水中の１ｍｇ／ｍｌ ８０μｌ）、およびインキュベーション緩衝液３０５μｌとともにインキュベートした。反応混合物を室温で２時間攪拌した。得られた光ポリ−ＩＤ４を更に精製することなく固定化のために用いた。

１ウエルあたり１０ｐモルオリゴ／０．１ｍｌのアミン−ＩＤ４および光ポリ−ＩＤ４を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中のＰＰおよびポリ（塩化ビニル）マイクロウエルプレート（PVC、ダイナテック（Dynatech）、バージニア州シャンティイー（Chantilly））中で３７℃で１．５時間インキュベートした。プレートを実施例ｌ（ｃ）に記載されるようにして照射または吸着した。相補的なＩＤ３検出オリゴヌクレオチドまたは非相補的なＩＤ２オリゴヌクレオチドを用いて、実施例ｌ（ｃ）に記載されるようにしてハイブリダイゼーションを行った。表３の結果は、照射した光ポリ−オリゴヌクレオチドは、ＰＰおよびＰＶＣ表面上で吸着された対照よりそれぞれ１３倍および２倍高いハイブリダイゼーションシグナルを有していたことを示している。対照的に、照射は、アミン−ＩＤ４固定化に対して有用な効果を有していなかった。

実施例４
直接合成によるベンゾフェノン標識オリゴヌクレオチドの製造
（ａ）４−ブロモメチルベンゾフェノン（ＢＭＢＰ）の製造
４−メチルベンゾフェノン７５０ｇ（３．８２モル）を吊り攪拌器を備えた５リットルのモルトンフラスコに加え、ベンゼン２８５０ｍｌに溶解する。次いで、溶液を加熱還流し、続いてベンゼン３３０ｍｌ中の臭素６１０ｇ（３．８２モル）を滴下して加える。添加速度を約１．５ｍｌ／分とし、フラスコを９０ワット（９０ジュール／秒）のハロゲンスポット光で照射し、反応を開始する。タイマーをランプとともに用いて、１０％デューティサイクル（オン５秒、オフ４０秒）を施し、続いて２０％デューティサイクル（オン１０秒、オフ４０秒）を１時間施す。冷却後、反応混合物を水１００ｍｌ中の重亜硫酸ナトリウム１０ｇで洗浄し、続いて水３×２００ｍｌで洗浄する。生成物を硫酸ナトリウムで乾燥し、トルエン／ヘキサン（１／３）から２回再結晶化する。実施例４（ｂ）に記載される核酸の誘導体化に好適な試薬の製造における使用のため、最終化合物を保存した。

（ｂ）４−ベンゾイルベンジルエーテル−Ｃ₁₂−ホスホラミダイトの製造
１，１２−ドデカンジオール５．０ｇ（２４．７ｍｍｏｌ）を、乾燥フラスコ中で無水ＴＨＦ５０ｍｌに窒素下で溶解する。鉱油（１２．４ｍｍｏｌ）中の水素化ナトリウム０．４９４ｇの６０％分散液を５分間にわたって何回かに分けて加える。得られる混合物を室温で１時間攪拌する。ヨウ化ナトリウム（０．１８５ｇ、１．２３ｍｍｏｌ）およびテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムブロミド（０．３９８ｇ、１．２３ｍｍｏｌ）とともに、実施例４（ａ）に記載される一般方法に従って製造されたＢＭＢＰ３．４０ｇ（１２．４ｍｍｏｌ）を固体として加える。混合物を２４時間穏やかに還流しながら攪拌する。次いで、反応物を冷却し、水でクエンチし、５％ＨＣｌで酸性化し、クロロホルムで抽出する。有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を真空下で除去する。クロロホルムを用いてシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーカラム上で生成物を精製して非極性不純物を溶出し、続いて生成物を８０：２０のクロロホルム：酢酸エチルで溶出する。適切なフラクションをプールすることによって、減圧下で溶媒を除去した後、所望の化合物が得られる。

上記のエーテル生成物０．１００ｇ（０．２５２ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下でクロロホルムに溶解する。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．１３０ｇ（１．００ｍｍｏｌ）を加え、氷浴を用いて温度を０℃に調整する。次いで、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホラミダイト０．１７９ｇ（０．７５６ｍｍｏｌ）を約１０分間にわたって３つに等しく分けて加える。攪拌を合計で３時間継続し、この時間後に反応物を５％ＮａＨＣＯ₃でクエンチし、クロロホルム５ｍｌで希釈する。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発して、残存オイルが得られる。クロロホルム溶媒中の５％メタノール、続いて水酸化アンモニウム／メタノール／クロロホルム（．５／２．５／７）溶媒系を用いて、粗生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーカラム上で精製する。適切な画分をプールし、溶媒を除去して、核酸の誘導体化に好適な所望の生成物を与える。

（ｃ）ベンゾフェノン標識オリゴヌクレオチドの製造
標準的なオリゴヌクレオチド手順を用いて３０マーのオリゴヌクレオチドをシリカビーズ上で合成し、ビーズをアルゴン雰囲気下で密封容器中に置く。次いで、クロロホルム０．５ｍｌ中の実施例４（ｂ）で製造されるホスホラミダイト１２．５ｍｇ（２２μｍｏｌ）およびアセトニトリル０．５ｍｌ中のテトラゾール５ｍｇ（７１μｌｍｏｌ）の溶液を加える。混合物を穏やかに１時間攪拌し、続いて上清を除去する。ビーズをクロロホルム、アセトニトリル、および塩化メチレンで洗浄し、続いてＴＨＦ／ピリジン／水（４０／２０／１）中の０．１Ｍヨウ素溶液１．５ｍｌで５分間酸化する。この溶液の除去後、ビーズを塩化メチレンで洗浄し、アルゴン流で乾燥する。次いで、濃水酸化アンモニウムをビーズに加え、それらを室温で１時間放置する。次いで、水酸化アンモニウム溶液を除去し、ビーズを追加の水酸化アンモニウム１ｍｌですすぐ。次いで、合わせた溶液抽出物を５５℃で一晩保存し、続いて凍結乾燥して、光標識オリゴヌクレオチドを単離する。

図１は、本発明の方法のフローチャートである。 図２Ａは、本発明の方法の模式図である。 図２Ｂは、本発明の方法の模式図である。 図３は、本発明の代替方法の模式図である。

Claims (33)

1. （ａ）レセプター分子を含む、少なくとも１つの試薬溶液を固体支持体に塗布（applying）し、第１の塗布されたスポットパターンを形成する工程であって；前記第１の塗布されたスポットパターン中のスポットは面積（area）を有し、前記試薬溶液、前記レセプター分子、前記固体支持体、またはそれらの任意の組み合わせは、少なくとも１つの光反応基を含むものと；
   （ｂ）前記第１の塗布されたスポットパターンを照射して、前記レセプター分子を第１の固定化されたスポットパターンで前記固体支持体に固定化する工程であって；前記第１の固定化されたスポットパターン中のスポットは面積を有し、前記第１の固定化されたスポットパターン中のスポットの面積は前記第１の塗布されたスポットパターン中のスポットの面積より小さいものと、を含むマイクロアレイの作成方法。
2. 前記塗布工程がプリンティングを含む請求項１に記載の方法。
3. 前記照射工程がマスクされた照射を含む請求項１に記載の方法。
4. 前記照射工程がミラード・レーザー照射を含む請求項１に記載の方法。
5. 前記レセプター分子が少なくとも１つの光反応基を含む請求項１に記載の方法。
6. 前記固体支持体が少なくとも１つの光反応基を含む請求項１に記載の方法。
7. 前記第１の塗布されたスポットパターンのスポットは中心−中心距離を有し、前記第１の固定化されたスポットパターンのスポットは中心−中心距離を有し、前記第１の塗布されたスポットパターンおよび前記第１の固定化されたスポットパターンの中心−中心距離は同じである請求項１に記載の方法。
8. 前記照射工程後に洗浄工程を更に含む請求項１に記載の方法。
9. （ａ）レセプター分子を含む、少なくとも１つの試薬溶液を前記固体支持体に塗布して、第２の塗布されたスポットパターンを形成する工程であって；前記第２の塗布されたスポットパターン中のスポットは面積を有し、前記試薬溶液、前記レセプター分子、前記固体支持体、またはそれらの任意の組み合わせは、少なくとも１つの光反応基を含むものと；
   （ｂ）前記第２の塗布されたスポットパターンを照射して前記レセプター分子を前記固体支持体に固定化し、第２の固定化されたスポットパターンを形成する工程であって；前記第２の固定化されたスポットパターン中のスポットは面積を有し、前記第２の固定化されたスポットパターン中のスポットの面積は前記第２の塗布されたスポットパターン中のスポットの面積より少なく、前記第２の固定化されたスポットパターン中のスポットは前記第１の固定化されたスポットパターンのスポットとはオフセットであるものと、を更に含む請求項１に記載の方法。
10. （ａ）レセプター分子を含む、少なくとも１つの試薬溶液を前記固体支持体に塗布して、塗布されたスポットパターを形成する工程であって；前記塗布されたスポットパターン中のスポットは面積を有し、前記試薬溶液、前記レセプター分子、前記固体支持体、またはそれらの任意の組み合わせは、少なくとも１つの光反応基を含むものものと；
    （ｂ）前記塗布されたスポットパターンを照射して、前記レセプター分子を固定化されたスポットパターン中の前記固体支持体に固定化する工程であって；前記固定化されたスポットパターン中のスポットは面積を有し、前記固定化されたスポットパターン中のスポットの面積は前記塗布されたスポットパターン中のスポットの面積より少なく、前記固定化されたスポットパターン中のスポットは存在する固定化されたスポットパターンとはオフセットであるものと、の繰り返し工程を更に含み、繰り返し工程（ａ）および（ｂ）を用いて高密度アレイを形成する請求項９に記載の方法。
11. 前記第１の固定化されたスポットパターンはピッチを有し、前記第２の固定化されたスポットパターンはピッチを有し、前記第２の固定化されたスポットパターンのピッチは前記第１の固定化されたスポットパターンのピッチと同じである請求項９に記載の方法。
12. 前記照射工程が円形のコンフィギュレーションの前記第１の塗布されたスポットパターンを照射する工程を含む請求項１に記載の方法。
13. 前記照射工程が非円形のコンフィギュレーションの前記第１の塗布されたスポットパターンを照射する工程を含む請求項１に記載の方法。
14. （ａ）レセプター分子を含む、少なくとも１つの試薬溶液を前記固体支持体に塗布して、第２の塗布されたスポットパターンを形成する工程であって；前記第２の塗布されたスポットパターン中のスポットは面積を有し、前記試薬溶液、前記レセプター分子、前記固体支持体、またはそれらの任意の組み合わせは少なくとも１つの光反応基を含むもの；（ｂ）前記第１の固定化されたスポットパターン以外の異なるコンフィギュレーションの前記第２の塗布されたスポットパターンを照射して、前記レセプター分子を前記第１の固定化されたスポットパターン以外の異なるコンフィギュレーションを有する第２の固定化されたスポットパターン中の前記固体支持体に固定化する工程であって；前記第２の固定化されたスポットパターン中のスポットは面積を有し、前記第２の固定化されたスポットパターン中のスポットの面積は前記第２の塗布されたスポットパターン中のスポットの面積より小さい）を更に含む請求項１に記載の方法。
15. 前記第２の固定化されたスポットパターンが前記第１の固定化されたスポットパターンとはオフセットである請求項１４に記載の方法。
16. 前記第２の固定化されたスポットパターンが前記第１の固定化されたスポットパターン上に重なっている請求項１４に記載の方法。
17. 請求項１に記載の前記方法によって製造されたマイクロアレイ。
18. 請求項１０に記載の前記方法によって製造されたマイクロアレイ。
19. 請求項１４に記載の前記方法によって製造されたマイクロアレイ。
20. １００μｍ未満の直径を有し、かつ、少なくとも３０塩基の配列を有する核酸を含む核酸スポットのパターンを有する固体支持体を含むマイクロアレイ。
21. 前記核酸が少なくとも４０塩基の配列を有する請求項２０に記載のマイクロアレイ。
22. 前記核酸が少なくとも５０塩基の配列を有する請求項２０に記載のマイクロアレイ。
23. 前記核酸がｃＤＮＡを含む請求項２０に記載のマイクロアレイ。
24. 前記核酸スポットが５０μｍ未満の直径を有する請求項２０に記載のマイクロアレイ。
25. 核酸スポットの前記パターンが１平方センチメートルあたり５，０００個のスポットを上回る密度を有する請求項２０に記載のマイクロアレイ。
26. 核酸スポットの前記パターンが１平方センチメートルあたり１０，０００個および１００，０００個のスポットの間の密度を有する請求項２０に記載のマイクロアレイ。
27. 前記スポットが本質的に円形のコンフィギュレーションを有する請求項２０に記載のマイクロアレイ。
28. 前記スポットが非円形のコンフィギュレーションを有する請求項２０に記載のマイクロアレイ。
29. 異なるコンフィギュレーションを有するスポットを含む請求項２０に記載のマイクロアレイ。
30. 異なるコンフィギュレーションを有する前記スポットが互いにオフセットである請求項２９に記載のマイクロアレイ。
31. 異なるコンフィギュレーションを有する前記スポットが互いに重なっている請求項２９に記載のマイクロアレイ。
32. 前記固体支持体が二次元の固体支持体を含む請求項２０に記載のマイクロアレイ。
33. 前記固体支持体が三次元の固体支持体を含む請求項２０に記載のマイクロアレイ。

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