JP2006010621A - 非特異的吸着防止方法、該方法を用いたバイオアッセイ用基板の製造方法、相互作用の検出方法、並びに、試薬キット。 - Google Patents

Abstract

【課題】
物質間の相互作用の場を提供する反応領域内の正に帯電した固相表面に対する、核酸など負電荷を持つ物質、インターカレーターの非特異的吸着を防止する方法を提供すること。バイオアッセイ用基板製造方法及び相互作用検出方法を提供すること。
【解決手段】
物質間の相互作用の場を提供する反応領域内に貯留又は保持される緩衝液の塩濃度を調整することによって、反応領域内の正に帯電した固相表面に対する負電荷を持つ物質の非特異的吸着を防止する方法を提供する。緩衝液の塩濃度を調整することによって、検出用物質、標的物質、インターカレーターなどの非特異的吸着を防止できる。この方法は、ＤＮＡチップなどのバイオアッセイ用基板製造の際や、ハイブリダイゼーションなど、物質間の相互作用検出の際にも用いることができる。
【選択図】 図３

Description

本発明は、ＤＮＡチップなどバイオアッセイ用基板の反応領域内に貯留又は保持される緩衝液の塩濃度を調整することにより、反応領域内の正に帯電した固相表面に対する負電荷を持つ物質・インターカレーターの非特異的吸着を防止する方法に関する。また、前記方法を用いたバイオアッセイ用基板の製造方法、ハイブリダイゼーションなど相互作用の検出方法、並びに、物質間の相互作用検出用の試薬キットに関する。

現在、ＤＮＡチップなどのバイオアッセイ用基板が、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析などに利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。

バイオアッセイ用基板とは、ガラス基板・シリコン基板などの上に多種・多数の核酸・タンパク質などの検出用物質を高密度に集積して固定したものをいう。基板上に多種・多数の検出用物質を固定することにより、ハイブリダイゼーションなどの分子間相互反応を起こす標的物質を網羅的に解析することができる。

基板上に検出用物質を固定する方法としては、例えば、基板上の反応領域内にアビジンで被膜した固相表面を設ける方法が用いられている。反応領域内に設けられたアビジン層とビオチン修飾された検出用物質がアビジン−ビオチン結合することにより、基板上に検出用物質を効率よく固定することができる。

なお、特許文献１には、ＤＮＡチップに関して、消光剤を用いて、蛍光検出時のバックグラウンドを低減する方法が記載されている。
特開２００３−８４００２号公報

バイオアッセイ用基板を製造する際やハイブリダイゼーションなどの相互作用を検出する際には、核酸など負の電荷を持つ物質を用いる場合が多い。従って、アビジン層などのように反応表面に設けられた固相表面が正に帯電している場合、核酸など負の電荷を持つ物質が非特異的に固相表面に吸着するという課題があった。

また、反応表面に設けられた固相表面が正に帯電している場合、インターカレーターも非特異的に固相表面に吸着する場合があった。

さらに、例えば、バイオアッセイ用基板を製造する際には、検出用物質が固相表面に非特異的に吸着するため、洗浄工程を設けて、非特異的吸着物質を除去する必要があった。そのため、基板製造の工程が複雑となり、検出用物質などの試薬を大幅にロスするという問題があった。

その他、例えば、ハイブリダイゼーションなどの相互作用を検出する際には、標的物質やインターカレーターなどが固相表面に非特異的に吸着することによってバックグラウンドノイズが発生し、相互作用検出の精度が低下するという問題もあった。

そこで、本発明は、物質間の相互作用の場を提供する反応領域内の正に帯電した固相表面に対する、核酸など負の電荷を持つ物質、インターカレーターなどの非特異的吸着を防止する方法、並びに、該方法を用いたバイオアッセイ用基板製造方法及び相互作用検出方法を提供することを主な目的とする。

本発明では、上記課題を解決するための手段として、物質間の相互作用の場を提供する反応領域内に貯留又は保持される緩衝液の塩濃度を調整することによって、正に帯電した固相表面に対する負電荷を持つ物質の非特異的吸着を防止する方法を提供する。

ここで、負電荷を持つ物質には、例えば、固相表面に固定する検出用物質、検出用物質と相互作用する標的物質などがある。検出用物質と標的物質は、一本鎖又は二本鎖の核酸などであり、負電荷を持つ。

緩衝液の塩濃度を調整することによる、負電荷を持つ物質の非特異的吸着防止作用は、イオン遮蔽又は対イオン濃縮によるものと推定する。即ち、次の機序に基づくものと考えられる。緩衝液の塩濃度を調整することにより、緩衝液中に陽イオン、陰イオンが過剰に存在することとなる。過剰に存在する陽イオンは、負電荷を持つ物質を緩やかに取り囲み、固相表面から負電荷を持つ物質を遮蔽する。一方、陰イオンも、正に帯電した固相表面と引き付けあって緩やかに該固相表面を覆うため、負電荷を持つ物質から固相表面を遮蔽する。従って、正に帯電した固相表面と負電荷を持つ物質が緩衝液の塩濃度を調整することによって遮蔽されるため、固相表面への負電荷を持つ物質の非特異的吸着が防止されると考えられる。

また、本発明では、検出用核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションの場を提供する反応領域内に貯留又は保持される緩衝液の塩濃度を調整することによって、正に帯電した固相表面に対するインターカレーターの非特異的吸着を防止する方法、を提供する。

反応領域内に貯留又は保持される緩衝液の塩濃度を調整することによって、核酸など負の電荷を持つ物質だけでなく、正に帯電した固相表面に対するインターカレーターの非特異的吸着を防止も防止できる。

上記した本発明に係る非特異的吸着防止方法は、まず、ＤＮＡチップなどのバイオアッセイ用基板製造の際に用いることができる。例えば、物質間の相互作用の場を提供する反応領域に設けられたアビジン層に対して、ビオチン修飾された検出用物質を固定する工程では、緩衝液の塩濃度を調整することによって、反応領域内に滴下又は注入などして入れる検出用物質の、固相表面への非特異的吸着を防止することができる。

検出用物質の固相表面への非特異的吸着を防止することにより、非特異的に吸着した物質を除去するための洗浄工程を軽減し、製造工程を簡略化することができる。また、検出用物質など試薬のロスを大幅に減らすことができる。さらに、アビジン層とビオチン修飾された検出用物質との反応時間を選定することによって、アビジン層への検出用物質の固定密度を制御することもできる。

緩衝液の塩濃度を調整することによって、検出用物質の固相表面への非特異的吸着を防止できるため、例えば、アビジン層の重量の変化を測定することにより、アビジン層とビオチン修飾された検出用物質との特異的な結合量を推定することができる。そのため、アビジン層とビオチン修飾された検出用物質との反応時間を選定することによって、アビジン層への検出用物質の固定密度を制御することができる。

次に、上記した本発明に係る非特異的吸着防止方法は、ハイブリダイゼーションなど、物質間の相互作用を検出する際にも用いることができる。例えば、上記の方法を用いることにより、反応領域内に滴下又は注入などして入れた標的物質の固相表面への非特異的吸着を防止することができる。

標的物質の固相表面への非特異的吸着を防止することにより、非特異的に吸着した物質を除去する洗浄工程を省略又は簡略化できるため、相互作用を検出する際の手順を簡略化することができる。

また、検出用物質と相互作用しなかった標的物質の固相表面への非特異的吸着を防止できるため、ノイズの発生を抑えることができ、相互作用検出の精度を向上させることができる。

その他、標的物質の非特異的吸着を防止することにより、標的物質の添加量を減らすことができるため、標的物質など試薬のロスを大幅に減らすことができる。また、最小限の標的物質を添加することにより相互作用を検出できるため、反応領域内で標的物質が検出用物質に絡まるなど、想定外の反応を避けることが可能となり、その観点からも相互作用検出の精度を向上させることができる。

次に、上記した本発明に係る非特異的吸着防止方法は、インターカレーターを用いたハイブリダイゼーション検出にも用いることができる。例えば、上記の方法を用いることにより、反応領域内に滴下又は注入などして入れたインターカレーターの固相表面への非特異的吸着を防止することができる。

また、インターカレーターを用いたハイブリダイゼーション検出に用いることにより、例えば、標的物質とインターカレーターを同時に反応領域内に入れることも可能になるため、ハイブリダイゼーション検出時の実験手順を簡略化できるという有利性がある。

加えて、本発明では、物質間の相互作用検出用の試薬キットを提供する。この試薬キットは、例えば、塩濃度を所定の濃度に調整した緩衝液、又は該緩衝液を作製するための組成物を少なくとも備える。前記相互作用がハイブリダイゼーションの場合、この試薬キットは、例えば、ハイブリダイゼーションの検出に用いるインターカレーターをさらに備えてもよい。キット化することにより、試薬調製の手順を省くことができるため、アッセイ全体の手順を簡略化できる。

なお、本発明では、各技術用語を、以下のように定義する。

「非特異的吸着」は、正に帯電した固相表面に対して負電荷を持つ物質が吸着することをいい、アビジン−ビオチン結合などの検出用物質の固定に係わる反応、ハイブリダイゼーションなどの相互作用、インターカレーターによるハイブリダイゼーション検出など、基板製造や相互作用の検出に特異的に用いられる結合は含まれない。

「検出用物質」とは、反応領域中に予め固定又は遊離させた物質であり、該物質と特異的に相互作用する物質を検出するための探り針として機能する。「標的物質」とは、前記検出用物質と特異的に相互作用する物質をいう。検出用物質・標的物質には、例えば、核酸、タンパク質などがある。

「ハイブリダイゼーション」は、検出用物質と標的物質が核酸である場合の前記両物質の相互作用であり、相補的な塩基配列構造を備える核酸の間で起こる相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。

「核酸」とは、プリン又はピリミジン残基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ポリアミドヌクレオチド誘導体）、などを広く含む。

「反応領域」は、物質間の相互作用の反応場を提供できる領域又は空間であり、例えば、液相やゲルなどを貯留できるウエル形状を有する反応場を挙げることができる。

「固相表面」は、基板やビーズなどの固体材料の表面であって、ハイブリダイゼーションその他の相互作用の反応場を提供できる領域又は空間との臨界面を意味する。

「アビジン層」は、前記固相表面を被覆するアビジンの層である。「アビジン」は、ビタミンＢ群の一種であるビオチンと特異的に結合する糖タンパク質である。例えば、固相表面のアビジン層と、ビオチン修飾した核酸と、をアビジン−ビオチン結合させることにより、核酸を固相表面に固定することができる。

「インターカレーター」は、二本鎖核酸などに挿入結合可能である物質、又は、該物質を含む組成物である。インターカレーターが蛍光標識されている場合又は蛍光物質それ自体である場合、蛍光により二本鎖核酸（ハイブリダイゼーション）の存在を確認できる。蛍光により二本鎖核酸を検出できるインターカレーターとしては、例えば、ＰＯＰＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｉ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎなどがある。

本発明により、正に帯電した固相表面に対する負電荷を持つ物質の非特異的吸着を防止できる。

まず、本発明に係る非特異的吸着を防止する方法について説明する。

前記の通り、本発明では、検出用物質と標的物質との間の相互作用の場を提供する反応領域内に貯留又は保持される緩衝液の塩濃度を調整することによって、正に帯電した固相表面に対する負電荷を持つ物質・インターカレーターの非特異的吸着を防止することができる。

本発明に用いる緩衝液は、塩濃度を調整できるものであれば、特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）、ＨＥＰＥＳ緩衝液などのグット緩衝液、トリス緩衝液などを用いることができる。用いる塩についても、特に限定されないが、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ_２などが好適である。

上述の通り、本発明に係る方法は、まず、ＤＮＡチップなどのバイオアッセイ用基板製造の際に用いることができる。例えば、物質間の相互作用の場を提供する反応領域に設けられたアビジン層に対して、ビオチン修飾された検出用物質を固定する工程において、所定の濃度に塩濃度を調整した緩衝液を用いることによって、反応領域内に滴下又は注入などして入れる検出用物質の、固相表面への非特異的吸着を防止することができる。

また、本発明に係る方法は、ハイブリダイゼーションなど、物質間の相互作用を検出する際にも用いることができる。例えば、所定の濃度に塩濃度を調整した緩衝液を用いることによって、反応領域内に滴下又は注入などして入れた標的物質の固相表面への非特異的吸着を防止することができる。インターカレーターを用いたハイブリダイゼーション検出の場合、インターカレーターの固相表面への非特異的吸着も防止することができる。

次に、本発明に係る試薬キットについて説明する。

本発明に係る試薬キットは、所定の塩濃度に調整した緩衝液、又は、該緩衝液を作製するための組成物、を少なくとも備える構成にする。前記組成物の場合、蒸留水で希釈・溶解することなどにより、簡易に、前記緩衝液を作製できることが好ましい。

ＤＮＡチップなどバイオアッセイ用基板の製造時に用いる試薬をキット化する場合、前記緩衝液のほか、例えば、アビジン、ビオチン、検出用核酸にビオチンを修飾するための酵素、または前記試薬を濃縮・粉末化などした組成物、などを備える構成にしてもよい。

また、ハイブリダイゼーションなど相互作用を検出する際に用いる試薬をキット化する場合、前記緩衝液のほか、例えば、標的核酸を作製するための試薬（組織・細胞などからＤＮＡ、ｍＲＮＡなどを抽出する際に必要な酵素、ｃＤＮＡ合成に必要な酵素など）、インターカレーター、または前記試薬を濃縮・粉末化などした組成物、などを備える構成にしてもよい。

実施例１は、緩衝液中の塩濃度を調整することにより、アビジン層への核酸の非特異的吸着を防止できることを示した実験である。実験手順は、以下のとおりである。

まず、三種類の緩衝液（ＮａＣｌ濃度１３７ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ）を準備した。ＮａＣｌ濃度２００ｍＭ及び２５０ｍＭの緩衝液は、一般的に用いられているＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４、ＮａＣｌ濃度１３７ｍＭ）にＮａＣｌをさらに添加し、ＮａＣｌ濃度２００ｍＭ及び２５０ｍＭになるように調製した。

また、Ａｕ表面上をアビジンで被覆した水晶振動子を用意した。アビジンは、和光純薬工業株式会社製（製品名「アビジン」）のものを用いた（以下同じ）。Ａｕ表面上へのアビジンの被覆は、本実験に用いた生体分子間相互作用定量ＱＣＭ装置「ＡＦＦＩＮＩＸ Ｑ」（型式「ＱＣＭ２０００」、水晶発振方式、発振周波数２７ｍＨｚ、株式会社イニシアム製、以下「ＱＣＭ装置」とする）のプロトコルに記載された方法に従って行った。

次に、ＱＣＭ装置の反応槽に各緩衝液と５００ｎＭの３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを入れ、その中に、前記水晶振動子を浸した。そして、水晶振動子の振動数の変化（デルタＦ、単位Ｈｚ）を測定することにより、水晶振動子上のアビジン層に吸着した３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドの吸着量を求めた。なお、３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す合成核酸を用いた。オリゴヌクレオチドは、エスペックオリゴサービス株式会社が受託合成した（以下同じ）。結果を表１に示す。

表１に示すとおり、ＮａＣｌ濃度１３７ｍＭの緩衝液では、約１ｎｇ（０．１１ｐｍｏｌ）の３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドが吸着したのに対し、ＮａＣｌ濃度２００ｍＭ及び２５０ｍＭの緩衝液では、３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドの吸着を防止できた。従って、３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドの濃度が５００ｎＭのとき、緩衝液中のＮａＣｌ濃度を２００ｍＭ以上にすることにより、３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドの、アビジン層への非特異的吸着を有効に防止できることが分かった。

例えば、アビジン−ビオチン結合によって検出用物質を基板上の反応領域内に固定する場合、基板上の反応領域内に、正に帯電したアビジン層を設ける。一方、固相表面に固定する検出用物質や該検出用物質と相互作用する標的物質は核酸など負電荷を持つ物質であるため、正に帯電したアビジン層と非特異的に吸着する（表１中、ＮａＣｌ濃度１３７ｍＭの場合参照）。

それに対し、本実験は、緩衝液中の塩濃度を調整することにより、正に帯電した固相表面をもつバイオアッセイ用基板におけるヌクレオチドなど負電荷を持つ物質の非特異的吸着を有効に防止できることを示している。

従って、この実験結果には、例えば、バイオアッセイ用基板の製造時において、固相表面への検出用物質の非特異的吸着を防止できるという有利性がある。バイオアッセイ用基板製造では、検出用物質を反応領域内に滴下・注入などして入れて、固相表面に検出用物質を固定する工程を含む。検出用物質の固相表面への非特異的吸着を防止することにより、非特異的に吸着した検出用物質の洗浄工程を省くことができるため、製造工程を簡略化することができる。その他、検出用物質などの試薬のロスを大幅に減らすこともできる。

また、例えば、ハイブリダイゼーションなど相互作用を検出する際においても、反応領域内に滴下・注入などして入れた標的物質の非特異的吸着を防止できるという有利性がある。標的物質の固相表面への非特異的吸着を防止することにより、非特異的に吸着した標的物質を除去するために洗浄する手順を省くことができるため、相互作用を検出する際の手順を簡略化することができる。その他、検出用物質と相互作用しなかった標的物質の固相表面への非特異的吸着を防止できるため、ノイズの発生を抑えることができ、相互作用の検出精度を向上させることもできる。

なお、検出用物質の固定量をＱＣＭ装置で測定した場合の測定値は、デルタＦ＝１５０〜２００Ｈｚであるのに対し、ＮａＣｌ濃度１３７ｍＭの緩衝液を用いた場合の測定値は、表１の通り、デルタＦ＝３４Ｈｚである。即ち、オリゴヌクレオチドの非特異的吸着（ノイズ）は、検出用物質の２０％量に相当した。

実施例２は、アビジン層とビオチン修飾された前記検出用物質との反応時間を選定することによって、アビジン層への検出用物質の固定密度を制御できることを示した実験である。実験手順は、以下のとおりである。

まず、緩衝液と３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドについて、下記条件のものを、準備した。（１）ＮａＣｌ濃度１３７ｍＭの緩衝液と１００ｎＭの３０ｍｅｒオリゴヌクレオチド、（２）ＮａＣｌ濃度２５０ｍＭの緩衝液と１００ｎＭの３０ｍｅｒオリゴヌクレオチド、（３）ＮａＣｌ濃度２５０ｍＭの緩衝液と最終濃度５０ｎＭの３０ｍｅｒオリゴヌクレオチド。また、実施例１と同様、Ａｕ表面上をアビジンで被覆した水晶振動子を用意した。なお、３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドは、３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドの５’末端をビオチン修飾した合成核酸を用いた（配列番号２）。ビオチン修飾は、Ｂｉｏｔｉｎ修飾用試薬「Ｂｉｏｔｉｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ」（ＧＬＥＮ ＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）を用いて行った（以下同じ）。

次に、ＱＣＭ装置の各反応槽に、前記各条件の緩衝液と３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを入れ、その中に、前記水晶振動子を浸した。そして、水晶振動子の振動数の変化（デルタＦ、単位Ｈｚ）を経時的に測定し、水晶振動子上のアビジン層に吸着した３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドの吸着量を経時的に求めた。結果を図１から図３に示す。

図１は、ＮａＣｌ濃度１３７ｍＭの緩衝液と１００ｎＭの３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いた場合の、振動数の変化（デルタＦ、単位Ｈｚ）を示す図である。

図１では、水晶振動子を反応槽に浸した直後から、急激に振動数が変化し、約３分で飽和条件のほぼ８０％に達している。これは、緩衝液として通常のＮａＣｌ濃度のものを用いていることにより、アビジン−ビオチン修飾オリゴヌクレオチドの結合に加えて、アビジン層にオリゴヌクレオチドが非特異的に吸着したためと推察する。この場合、振動数の変化が急激であるため、経過時間により、アビジン−ビオチン修飾オリゴヌクレオチドの結合量（基板上に固定したオリゴヌクレオチドの密度）を制御することはできない。また、この場合、非特異的吸着が多いため、基板上に固定されたビオチン修飾オリゴヌクレオチドの量を定量化することもできない。

図２は、ＮａＣｌ濃度２５０ｍＭの緩衝液と１００ｎＭの３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いた場合の、図３は、ＮａＣｌ濃度２５０ｍＭの緩衝液と５０ｎＭの３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いた場合の、振動数の変化（デルタＦ、単位Ｈｚ）を示す図である。

図２、図３では、時間の経過に伴い、緩やかに振動数が変化している。このことは、必要なビオチン修飾オリゴヌクレオチドが基板上に固定された時点で反応を止めることにより、基板上に固定されたビオチン修飾オリゴヌクレオチドの量（密度）を調節することができることを示している。また、振動数の変化（デルタＦ、単位Ｈｚ）に基づき、基板上に固定する検出用物質の固定量を定量化することもできる。

従って、本実験結果は、例えば、バイオアッセイ用基板の製造時において、固定する検出用物質の密度や固定量を制御できることを示している。

特に、図３は振動数の変化がシグモイド型を示しているため、反応時間を選定することによりビオチン修飾オリゴヌクレオチドの量（密度）を調節することが容易であり、１０^１０個／ｍｍ^２の精度でオリゴヌクレオチドの密度を制御することが可能である。

なお、図２、図３では、塩濃度の高い緩衝液を用いているため、アビジン層とオリゴヌクレオチドとの非特異的吸着はなく、アビジン−ビオチン修飾オリゴヌクレオチドの特異的結合の結合量によって、振動数の変化が起こっていると考えられる。

実施例３は、緩衝液中の塩濃度を調整することによる、検出用物質の固定密度を制御する方法を示した実験である。実験手順は、以下のとおりである。

まず、一般的に用いられているＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４、ＮａＣｌ濃度１３７ｍＭ）にＮａＣｌをさらに添加し、ＮａＣｌ濃度２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭの各緩衝液を調製した。また、実施例１と同様、Ａｕ表面上をアビジンで被覆した水晶振動子を用意した。その他、本実験では、３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドには、５’末端をビオチン修飾した合成核酸（配列番号２）を用いた。

次に、ＱＣＭ装置の各反応槽に、前記各条件の緩衝液と３０ｍｅｒオリゴヌクレオチド５００ｎＭを入れ、その中に、前記水晶振動子を浸した。そして、水晶振動子の振動数の変化（デルタＦ、単位Ｈｚ）を測定し、３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドの特異的固定量、即ち、水晶振動子上のアビジン層とアビジン−ビオチン結合により特異的に結合した３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドの結合量、を求めた。結果を表２、図４に示す。

なお、本実験では、緩衝液のＮａＣｌ濃度がすべて２５０ｍＭ以上であるため、実施例１より明らかなように、３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドの非特異的吸着はないと考えられる。従って、本実験の結果（水晶振動子の振動数の変化）は、アビジン−ビオチン結合により水晶振動子に特異的に結合した３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドの結合量に基づく値であると推定することができる。

表２、図４に示すように、緩衝液中のＮａＣｌ濃度を調整すると、水晶振動子上のアビジン層に吸着した３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドの特異的固定量は減少した。即ち、例えば、バイオアッセイ用基板製造時において、緩衝液中の塩濃度を調整することにより、検出用物質の固定量・固定密度を制御できることが分かった。

バイオアッセイ用基板を用いて定量的・定性的測定を行う場合、基板上に固定する検出用物質の固定量や固定密度を制御する必要がある。本実験結果は、緩衝液中の塩濃度を調整することにより、アビジン−ビオチン結合量を制御でき、検出用物質の固定密度を制御できることを示している。

また、この結果には、塩濃度を調整することによりオリゴヌクレオチドなどの非特異的吸着を防止でき、また、緩衝液の塩濃度調整という簡易な方法で検出用物質の固定密度を制御できるため、バイオアッセイ用基板の製造工程を簡略化できるという有利性がある。

実施例４は、検出用物質の濃度を低くした場合に、基板上に検出用物質を効率よく固定できるかについて調べた実験である。また、本実験では、塩としてＭｇＣｌ_２を用いた場合についても検討した。実験手順は、以下のとおりである。

まず、塩としてＮａＣｌを用いた緩衝液と、塩としてＭｇＣｌ_２を用いた緩衝液を調製した。ＮａＣｌを用いた緩衝液は、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）にさらにＮａＣｌを添加して、ＮａＣｌ濃度２００ｍＭに調整した。ＭｇＣｌ_２を用いた緩衝液は、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にＭｇＣｌ_２１０ｍＭ溶解して作成した。また、実施例１と同様、Ａｕ表面上をアビジンで被覆した水晶振動子を用意した。その他、本実験では、３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドには、５’末端をビオチン修飾した合成核酸（配列番号２）を用いた。

次に、ＱＣＭ装置の反応槽に各緩衝液と５ｎＭの３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを入れ、その中に、アビジンで被膜した水晶振動子を浸した。そして、アビジン−ビオチン結合により水晶振動子に検出用物質（オリゴヌクレオチド）を固定するとともに、水晶振動子の振動数の変化（デルタＦ、単位Ｈｚ）を測定することにより３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドの固定量を求めた。

その結果、検出用物質の固定は６０分で飽和し、固定量は、ＮａＣｌを用いた緩衝液では０．３９ｐｍｏｌ、ＭｇＣｌ_２を用いた緩衝液では０．５８ｐｍｏｌであった。この固定量は、１００ｎＭの検出用物質を用いて固定した場合とほぼ同量である。即ち、５ｎＭの検出用物質を用いて固定した場合でも、１００ｎＭ以上の検出用物質を用いた場合とほぼ同など量を固定できることが分かった。従って、上記緩衝液を用いることにより、検出用物質の必要量を大幅に軽減することができる。

また、ＮａＣｌを用いた緩衝液だけでなく、ＭｇＣｌ_２を用いた緩衝液によっても、非特異的吸着を防止できることが分かった。

実施例５は、標的物質の濃度を低くした場合に、ハイブリダイゼーションを検出できるかについて調べた実験である。また、本実験では、実施例４と同様、塩としてＭｇＣｌ_２を用いた場合についても検討した。実験手順は、以下のとおりである。なお、３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドには、配列番号３に示す合成核酸を用いた。

まず、実施例４と同様に、ＮａＣｌ濃度２００ｍＭの緩衝液と、ＭｇＣｌ_２濃度１０ｍＭの緩衝液を調製した。また、実施例４により作成した水晶振動子を準備した。なお、この水晶振動子は、アビジン−ビオチン結合により、検出用オリゴヌクレオチドが固定されている。検出用オリゴヌクレオチド固定量は、前記の通り、ＮａＣｌ濃度２００ｍＭの緩衝液では０．３９ｐｍｏｌ、ＭｇＣｌ_２濃度１０ｍＭの緩衝液では０．５８ｐｍｏｌである。

次に、ＱＣＭ装置の反応槽に各緩衝液と標的核酸（５ｎＭの３０ｍｅｒオリゴヌクレオチド）を入れ、その中に、検出用物質が固定された水晶振動子を浸した。そして、検出用物質とハイブリダイゼーションした標的物質の量及びその経時的変化を、水晶振動子の振動数の変化（デルタＦ、単位Ｈｚ）を測定することにより求めた。

その結果、約５０分でハイブリダイゼーションは飽和し、ハイブリダイゼーションした標的核酸の量は、ＮａＣｌ濃度２００ｍＭの緩衝液では０．４１ｐｍｏｌ、ＭｇＣｌ_２濃度１０ｍＭの緩衝液では０．５８ｐｍｏｌであった。また、ハイブリダイゼーションが飽和に達した後、約３０分間水晶振動子を反応層中に放置したが、それ以降の質量変化は見られなかった。

そこで、ハイブリダイゼーションが飽和に達した後、標的核酸を反応層内に追加し、反応層内の標的核酸の量が１０ｎＭになるようにした。そして、水晶振動子を反応層中に放置し、質量変化を観察した。その結果、標的核酸を追加した後も、特に質量変化は見られなかった。

以上の実験結果より、次のことが明らかになった。

まず、本実験では、検出用核酸と標的核酸との間の、ほぼ１：１のハイブリダイゼーションを実現できた。このことは、標的核酸の濃度を５ｎＭと希薄にした場合でも、充分にハイブリダイゼーションを検出できることを示している。従って、標的核酸の必要量を大幅に軽減でき、低コストでの測定が可能となる。

また、塩濃度を調整することにより標的核酸の非特異的吸着を防止できるため、ハイブリダイゼーションに必要な標的ヌクレオチド量を実験的に測定できるようになった。

従来のように核酸が固層表面上に非特異的に吸着する条件下では、吸着の飽和量が種々の不特定要素によって変化するため、標的核酸の必要最低限量を特定できなかった。本実験により、標的核酸の必要最低限量を特定できるため、実験の効率化や精度の向上を図ることができる。なお、本実験における標的核酸の必要最低限量は、検出用核酸の固定量、反応系の大きさ、拡散速度に基づいて、一意的に決定できる。

その他、上記手順で測定することにより、必要最小限量の標的核酸でハイブリダイゼーションを実施できるため、検出用核酸と標的核酸とが絡まるなど、想定外の反応が起きる可能性をより低減でき、測定精度の向上を図ることができる有利性がある。

実施例６は、緩衝液中の塩濃度を調整することにより、インターカレーターの非特異的吸着を防止できることを示した実験である。実験手順は以下のとおりである。

まず、一般的に用いられているＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４、ＮａＣｌ濃度１３７ｍＭ）にＮａＣｌをさらに添加し、ＮａＣｌ濃度２５０ｍＭの緩衝液を調製した。また、実施例１と同様、Ａｕ表面上をアビジンで被覆した水晶振動子を用意した。

次に、ＱＣＭ装置の各反応槽に、前記緩衝液とインターカレーター（「ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ」（商品名、Ｃａｍｂｒｅｘ社製、「ＳＹＢＲ」はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社の登録商標、以下「ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ」とする）を入れ、その中に、前記水晶振動子を浸した。そして、水晶振動子の振動数の変化（デルタＦ、単位Ｈｚ）を測定し、水晶振動子上のアビジン層に吸着したインターカレーターの吸着量を求めた。なお、インターカレーターとして用いたＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉは、プロトコル推奨の希釈液を、さらに１００００倍希釈したものを用いた。

その結果、ＮａＣｌ濃度２５０ｍＭの緩衝液中では、アビジン層へのインターカレーターの吸着は見られなかった。従って、アビジン層のように正に帯電した固層表面であっても、緩衝液中の塩濃度を調整することにより、核酸と同様、インターカレーターのアビジン層への非特異的吸着を防止できることが、本実験より明らかになった。

このことは、インターカレーターを用いたハイブリダイゼーションの定量化が可能であることを示している。緩衝液中の塩濃度を調整することにより、インターカレーターのアビジン層への非特異的吸着を防止できるため、非特異的吸着に基づく蛍光（ノイズ）は発生しない。従って、ハイブリダイゼーションに基づく蛍光のみを検出できるため、測定精度を向上することができるほか、蛍光強度により、ハイブリダイゼーションの定量的な検出が可能になると考える。

実施例７は、緩衝液中の塩濃度を調整することにより、アビジン層への二本鎖核酸の吸着を防止できることを示した実験である。実験手順は、以下のとおりである。

まず、二種類の緩衝液（ＮａＣｌ濃度５０ｍＭ、２５０ｍＭ）を準備した。各緩衝液は、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に、ＮａＣｌ濃度５０ｍＭ、又は、２５０ｍＭを添加して作製した。また、実施例１と同様、Ａｕ表面上をアビジンで被覆した水晶振動子を用意した。

次に、各緩衝液に、検出用の３０ｍｅｒオリゴヌクレオチド（検出用核酸）と標的３０ｍｅｒオリゴヌクレオチド（標的核酸）を入れ、９０℃、５分間の条件を付加後、自然冷却し、Ｂ型の二本鎖核酸を作製した。なお、本実験では、検出用の３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドとして、５’末端をビオチン修飾した合成核酸（配列番号２）を、標的３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドとして、配列番号３の合成核酸を用いた。

次に、ＱＣＭ装置の反応槽に各緩衝液と前記二本鎖核酸を入れ、その中に、アビジンで被膜した水晶振動子を浸した。そして、水晶振動子の振動数の変化（デルタＦ、単位Ｈｚ）を測定することにより二本鎖核酸の吸着量を求めた。結果を表３に示す。

表３に示すとおり、ＮａＣｌ濃度５０ｍＭの緩衝液では、二本鎖核酸がアビジン層に、０．５９ｎｇ吸着したのに対し、ＮａＣｌ濃度２５０ｍＭの緩衝液では、二本鎖核酸のアビジン層への吸着を防止できた。従って、本実験結果は、緩衝液中の塩濃度を調整することにより、二本鎖核酸の固層表面への非特異的吸着を有効に防止できることを示している。

また、Ｂ型の二本鎖核酸は、一本鎖核酸よりも高密度に負電荷を持つため、一本鎖核酸よりも固層表面上に吸着しやすいが、本実験において、塩濃度を調整することによりＢ型の二本鎖核酸の非特異的吸着をも防止できることが明らかとなった。また、このことは、塩濃度を調整することにより、Ｂ型の二本鎖核酸よりも負電荷の高いＡ型の二本鎖核酸の非特異的吸着をも防止できることを示唆している。

その他、本実験のように予めアニーリングを施す手順を入れることにより、ＱＣＭ装置のように、測定機器の性質上高温条件下での測定が不可能で、測定機器中でアニーリングできない場合にも、測定可能にすることができる有利性がある。また、アニーリングを施し、Ｂ型核酸にしたものをＱＣＭ反応層内に入れることで、２５℃でＢ型二本鎖核酸を形成できない短いオリゴ核酸も測定可能にできる有利性がある。

なお、二本鎖核酸の固層表面への非特異的吸着を防止できることは、標的物質として二本鎖核酸を反応領域内に滴下・注入した後、インターカレーターでハイブリダイゼーションを検出する場合に、特に有用である。即ち、二本鎖核酸と特異的に結合したインターカレーター量をＱＣＭ装置などで測定する場合、二本鎖核酸の非特異的吸着に基づくノイズを防止できるため、インターカレーター量の測定精度を向上できる。

実施例８は、緩衝液中の塩としてＮａＣｌの代わりにＭｇＣｌ_２を用いた場合にも、アビジン層へのオリゴ核酸の吸着を防止できることを示した実験である。実験手順は、以下のとおりである。

まず、（１）リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にＭｇＣｌ_２１０ｍＭを溶解した緩衝液と、（２）０．１ＭＨＥＰＥＳにＭｇＣｌ_２２０ｍＭを溶解しＮａＯＨでｐＨ７．４に調整した緩衝液を作製した。また、実施例１と同様、Ａｕ表面上をアビジンで被覆した水晶振動子を用意した。

次に、ＱＣＭ装置の反応槽に各緩衝液と１０ｎＭの３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを入れ、その中に、アビジンで被膜した水晶振動子を浸した。そして、水晶振動子の振動数の変化（デルタＦ、単位Ｈｚ）を測定することにより３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドの吸着量を求めた。なお、３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドには、実施例１と同様の合成核酸を用いた。結果を表４に示す。

表４に示すとおり、両緩衝液条件下では、オリゴヌクレオチドのアビジン層への吸着は見られなかった。従って、ＭｇＣｌ_２を用いることによっても、オリゴヌクレオチドの固層表面への非特異的吸着を防止できることがわかった。

また、ＭｇＣｌ_２を用いることにより、緩衝液中の塩濃度を１０ｍＭから２０ｍＭに下げることができることが分かった。このことは、低塩濃度条件が必要な場合にも、本発明を応用できることを示している。

その他、塩としてＭｇＣｌ_２を用いることによる、固層表面上へのオリゴヌクレオチドの非特異的吸着を防止する方法を確立したことで、固層表面上でＺ型ＤＮＡを形成する必要がある場合にも対応することができる。

なお、本実施例は、バイオアッセイ用基板製造時における検出用物質を固相表面に固定する際、及び、ハイブリダイゼーションなどの相互作用を検出する際、の両者に適用可能である。

本発明にかかる方法は、ＤＮＡチップなどバイオアッセイ用基板の製造及びハイブリダイゼーションなど相互反応の検出に有用な技術であり、産業上の利用可能性がある。

ＮａＣｌ濃度１３７ｍＭの緩衝液を用いた場合の、振動数の変化（デルタＦ、単位Ｈｚ）を示す図。 ＮａＣｌ濃度２５０ｍＭの緩衝液と１００ｎＭの３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いた場合の、振動数の変化（デルタＦ、単位Ｈｚ）を示す図。 ＮａＣｌ濃度２５０ｍＭの緩衝液と５０ｎＭの３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを用いた場合の、振動数の変化（デルタＦ、単位Ｈｚ）を示す図。 検出用核酸の固定密度と緩衝液濃度との関係を示した図。

Claims (14)

1. 検出用物質と標的物質との間の相互作用の場を提供する反応領域内に貯留又は保持される緩衝液の塩濃度を調整することによって、正に帯電した固相表面に対する負電荷を持つ物質の非特異的吸着を防止する方法。
2. 検出用核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションの場を提供する反応領域内に貯留又は保持される緩衝液の塩濃度を調整することによって、正に帯電した固相表面に対するインターカレーターの非特異的吸着を防止する方法。
3. 前記負電荷を持つ物質は、前記検出用物質であることを特徴とする請求項１記載の方法。
4. 前記負電荷を持つ物質は、前記検出用物質と相互作用する前記標的物質であることを特徴とする請求項１記載の方法。
5. 前記負電荷を持つ物質は、一本鎖又は二本鎖の核酸であることを特徴とする請求項１記載の方法。
6. 請求項１記載の方法を用いて、検出用物質と標的物質との間の相互作用の場を提供する反応領域内に存在するアビジン層に対して、ビオチン修飾された検出用物質を固定する工程、を少なくとも含むバイオアッセイ用基板の製造方法。
7. 前記アビジン層とビオチン修飾された前記検出用物質との反応時間を選定することによって、前記アビジン層への検出用物質の固定密度を制御することを特徴とする請求項６記載のバイオアッセイ用基板製造方法。
8. 前記バイオアッセイ用基板は、ＤＮＡチップであることを特徴とする請求項７記載のバイオアッセイ用基板の製造方法。
9. 請求項１又は請求項２記載の方法を用いることを特徴とする物質間の相互作用検出方法。
10. 前記相互作用は、ハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項９記載の物質間の相互作用検出方法。
11. インターカレーターを用いて前記ハイブリダイゼーションを検出することを特徴とする請求項１０記載の物質間の相互作用検出方法。
12. 所定の塩濃度に調整した緩衝液又は該緩衝液を作製するための組成物を少なくとも備える、物質間の相互作用検出用の試薬キット。
13. 前記相互作用は、ハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項１２記載の試薬キット。
14. 前記ハイブリダイゼーションを検出するためのインターカレーターを備えることを特徴とする請求項１３記載の試薬キット。
    

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