JP2006262829A - 生体試料前処理方法、解析システム及び生体試料前処理要素 - Google Patents

Abstract

【課題】試料中の分子を解析するためのサンプル前処理工程の効率化かつ簡便化を図ること。
【解決手段】試料中に含まれている各種分子を解析するためのサンプル前処理技術として必要な複数の各種酵素を固相上に酵素ごとに分離して固定化し、それらを一括して酵素反応させることを特徴とする。すなわち、ある生体試料と複数種類の酵素とをそれぞれ同一の条件で反応させて、酵素反応によるコンタミネーションを防止し、試料に一定の前処理を施す。
【選択図】図１

Description

本発明は試料中に含まれている各種分子を解析するための生体試料前処理方法、解析システム及び生体試料前処理要素に関する。

試料中の各種分子を解析する手法として、マススペクトロメトリー法や液体クロマトグラフィー法が主流になりつつある。マススペクトロメトリー法は、解析したい分子をイオン化した後にその電荷と質量数に応じて分離検出する手法である。一方、液体クロマトグラフィー法は、解析したい分子の諸性質に応じてそれと反応する担体に捕捉させた後に所定の条件で溶出することによって分離検出する手法である。

いずれの手法においても、試料中の分子を解析する場合はサンプルの前処理を行う必要がある。例えば、生体試料に含まれているタンパク質を解析する場合は、一般的にそれをタンパク質消化酵素処理等によりペプチド断片化する必要がある。同様に、例えば翻訳後修飾としてタンパク質に付加された糖鎖を解析する場合も、糖鎖遊離酵素等により糖鎖を予め遊離した後に回収する必要がある（特許文献１参照）。

以上のような分離検出手法で生体試料中の分子を解析する場合には、サンプル中の分子を各種酵素で処理する必要があるが、酵素ごとに反応の至適条件が異なるため、通常は各種酵素別に液相中で反応を行う。これは、酵素反応条件を各酵素の至適条件に合わせられる一方で、酵素溶液調製や反応等の作業工程が増えて煩雑になるとともに、各種酵素を作業ごとに使い捨てることになる。また、反応ごとに反応産物を回収する工程が加わるため、回収率にともなう回収産物量の低下を招く。さらに、液相中で酵素反応させることは、解析したいタンパク質以外に別種のタンパク質である酵素が遊離した状態で混在することになり、分離検出の工程で解析精度等に悪影響を及ぼす。

特開平０８−２２８７９５号公報

本発明は従来の問題点を解決し、試料中の分子を解析するためのサンプル前処理工程の効率化かつ簡便化を図ることを課題とする。

上記課題を解決するためになされた本発明は、試料中に含まれている各種分子を解析するためのサンプル前処理技術として必要な複数の各種酵素を固相上に酵素ごとに分離して固定化し、それらを一括して酵素反応させることを特徴とする。すなわち、ある生体試料と複数種類の酵素とをそれぞれ同一の条件で反応させて、酵素反応によるコンタミネーションを防止し、試料に一定の前処理を施すことが本発明の重要な特徴である。

本発明によれば、試料の前処理の効率化と簡便化が図れる。

本発明の実施例を、図面を用いてより詳細に解説する。但し、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。

図１（ａ）は、種類の異なる酵素２、３、４を固相１に固定化した状態を示し、それぞれの酵素は解析する分子および目的に応じて選択する。その種類、量および配置は問わない。これらの分離した酵素固定化基体を複数組み合わせて１つの反応容器内に設置して、一括して試料溶液と接触、反応させる。従って、このような用い方をすれば、試料の種類が異なっても任意の酵素の組み合わせとすることができる効果がある。

また、図１（ｂ）は、種類の異なる複数種類の酵素２’，３’，４’を、それぞれ分離して１つの基体１’に固定したものである。この場合は、１つの酵素固定化基体を用いて簡便に前処理反応に供することができる。

図２は図３の酵素反応ユニットの断面図で、（ａ）は側面断面図、（ｂ）は平面断面図である。図２と図３において同一の参照符号は同一の要素を示す。

酵素固定化基体の製造工程例を図４に示した。この製造フローについては以下の実施例で、必要に応じて説明する。

例えばタンパク質消化酵素の場合はトリプシン、キモトリプシン、プロナーゼ等、糖鎖遊離酵素の場合はグリコペプチダーゼ等が挙げられるが、これら酵素に限定されるものではない。例えば、糖タンパク質をサンプルとした場合、ペプチドと糖鎖を回収したい場合はトリプシンおよびグリコペプチダーゼの２種類の酵素、アミノ酸と糖鎖を回収したい場合はトリプシン、プロナーゼおよびグリコペプチダーゼの３種類の酵素を組み合わせて行える。

各種酵素２、３、４を固定化する固相１は支持体として成立するものであれば材質の種類は問わない。例えば、ガラス、樹脂、ウェハー、金属等が上げられ、形状も例えば平板状、球状、溝状、筒状等種類を問わない。そのサイズも使用する反応槽６等に適用できる範囲であれば構わない。

支持体１への各種酵素２、３、４の固定化は、固定化後の酵素活性を維持できる方式であればよい。例えばカリックスアレーンによるホスト−ゲスト結合方式、アルデヒド基やエポキシ基等の各種官能基を介する共有結合方式、アミノ基等を介する静電結合方式、ニトロセルロースメンブレン等による吸着方式等がある。ただし、ポリマーゲルによる包埋方式において、酵素が一部被覆され、有効表面積が減少することが考えられるが、これを利用することもできる。

例えば、カリックスアレーンによるホスト−ゲスト結合方式で支持体１上に各種酵素２、３、４を密に固定化することにより、ブロッキング工程（図４参照）を省略することも場合によっては可能である。

支持体１への各種酵素２、３、４の固定化は、固定化する酵素の種類によって一方の酵素が他方の酵素に反応することにより、分解等による機能阻害を引き起こす場合が考えられる。そのため、異種酵素が互いに接触しないように区分けして固定化することが必要である（図１、図４参照）。

図３において、各種酵素を固定化した酵素固定化基体５を反応槽６内に設置して反応液７を反応させる。例えば、溝状あるいは筒状等の支持体１、１’の形状によっては、支持体１、１’自体が酵素固定化と反応槽６とを兼ねる場合もある。

１つの支持体１’に対して複数の酵素２’、３’、４’を固定化し、その酵素固定化済み酵素固定化基体５を用いて複数の酵素反応を一括して行う方式でも構わない。また、１つの支持体１に対して１種類の酵素２、３、４を固定化して、各酵素を各々固定化した支持体１を複数集めることにより、複数の酵素反応を一括して行う方式でも構わない。

複数の酵素処理を一括して行うことで作業工程数を削減することにより、処理時間の短縮化および手間の低減が図れるとともに、各酵素の反応ごとに反応産物を回収する必要性がなくなる。その結果、回収率にともなう最終反応産物の回収量のロスを低減することができる。また、処理の途中で反応産物の回収あるいは分注等の操作回数が削減できるため、反応産物へのコンタミネーション抑制効果もある。

また、複数の酵素処理工程を一括して行うことで最終反応産物の回収量の低下を抑制できることは、特に微量な分子をターゲットにする場合のサンプルロスによる目的分子消失の危険性を防止する効果がある。このことは、例えばバイオマーカー探索やプロファイリング等の解析精度を向上させる上で重要である。

反応槽６内の反応溶液７の温度を支持体１、１’に固定化した酵素２、３、４、２’、３’、４’の反応に適した温度に温度制御装置１１により制御する。必ずしも至適条件でなければならないことはなく、必要十分な反応が行われる条件であれば構わない。場合によっては、酵素反応中に設定温度を可変することにより、各種酵素の反応至適条件に合わせる方式を適用しても構わない。

反応は静置条件下で行っても構わないが、反応効率を向上させるためには反応溶液７を撹拌することが望ましい。反応溶液７の撹拌は、例えば振動装置１０によって反応溶液振動膜９を振動させ、溶液を振動、ポンピング等による溶液の送液循環（特開２００４−２８３０８３号公報参照）によって行うか、反応槽自体の振盪あるいは旋回による溶液撹拌等によって行う。攪拌したで所定の時間反応させることにより、タンパク質の消化あるいは糖鎖の遊離を行う。

図７は実験例のフロー図であり、基体１上に貼り付けた酵素固定化用シール２９（疎水性シート）に酵素固定用ウェル３０を形成する（ａ）。酵素固定化用ウェル３０に、酵素溶液３１を滴下する（ｂ）。次いで、上記酵素固定化基体を、乾燥防止のために水滴３３を入れた密閉容器３２に収容する（ｃ）。反応ウェル３４の上記固定化酵素に変性／還元処理済み基質溶液３５を加える（ｄ）。このような状態で酵素と試料を反応させ（ｅ）、反応産物３６を得る（ｆ）。反応産物３６を回収した後、例えばマススペクトロメトリー１６や液体クロマトグラフィー１５等による分離検出のための試料として適用する。

本発明による反応槽６は、例えばマススペクトロメトリー１６や液体クロマトグラフィー１５のためのサンプル前処理ユニット１２として適用できる。サンプル１３のサンプルローディング工程、反応溶液１０が反応液送液口８より反応容器６に供給された反応液７の撹拌を含めた酵素反応工程、反応液回収工程を自動化あるいは半自動化することによって酵素反応装置１２として提供することができる。酵素を固定化した支持体５の適用による効率化により、装置のサイズの小型化を実現することも可能であり、特別な設置場所を確保することなしに取り扱うことが可能である。その一方で、装置スケールを適宜変更することも容易である。

さらに、回収した反応産物３６を各種分離検出装置１４への再ローディング工程等を自動化することによって全自動あるいは半自動の反応産物解析システム（図３）として提供することができる。分離検出装置１４は液体クロマトグラフィー１５、又は質量分析装置１６あるいはそれらの組み合わせでも良い。図３の解析システムはシステム制御装置１７によって制御される。

図５は、本発明による試料の前処理工程を説明するフロー図である。本実施例による各種酵素を固定化した酵素固定化基体５は、酵素が活性を有する限り繰り返して再利用することも可能である（図５）。このことにより解析コストの低減化を図ることが可能となる。また、酵素固定化基体５の洗浄に関しても酵素固定化基体５を反応槽６から取り外して簡便に行えることや、酵素固定化基体５が反応槽６と一体型になっている場合においても、洗浄溶液を送液するだけで簡便に洗浄することが可能である。この再利用は本実施例において必須ではないことに留意すべきである。

本発明のように、各種酵素２、３、４、２’、３’、４’を固相１、１’上に固定化して反応に適用することにより、反応産物３６への酵素２、３、４、２’、３’、４’の混入が回避できるため酵素除去精製の必要性もなく、反応産物３６の分離検出結果に影響を与えることがない。

本発明による各種酵素を固定化した酵素固定化基体５は、サンプル前処理ユニット１２に適合する要素として、各種解析に適用する酵素２、３、４、２’、３’、４’の組み合わせで固定化したものを提供することができる。このことにより、酵素溶液を必要な時にその都度調製する手間を省くことができる。

さらに、各種酵素を固定化した酵素固定化基体５を作製するための溶液分注装置（図６）を適用することにより、自動化あるいは半自動化の基体作製システムを構築することができる。図６において、位置補正装置２１によりレール２０上を移動するノズル２３を備えたヘッド２２から、酵素を含む溶液が支持体１に供給される。酵素溶液は酵素溶液リザーバー２６から適宜選択してノズル２３により分注される。ノズル２３は酵素溶液が代わる毎にノズル洗浄装置２４、ノズル乾燥装置２５により洗浄される。分注装置１９内の温度、湿度は温度／湿度センサー２８によりモニターされる。ポンプ２７は、必要な配管に接続される。分注装置は制御装置１８によって制御される。

本発明によれば、タンパク質あるいは糖鎖解析のための前処理技術を効率化かつ簡便化できる。また、酵素を固定化した酵素固定化基体５のリサイクルは、例えば今後タンパク質あるいは糖鎖解析分野への進出が期待される受託解析事業の業務効率化やコスト低減化に寄与することができる。

本発明は、タンパク質あるいは糖鎖解析だけでなく、酵素処理工程を必要とするその他の分野に対しても固定化する酵素２、３、４、２’、３’、４’の種類を変えることによって応用可能である。
（実験例）
本実験例では、タンパク質をペプチドに分解する酵素であるトリプシン並びにタンパク質またはペプチドから糖鎖を遊離する酵素であるグリコペプチダーゼを支持体１、１’上に固定化し、ヒト免疫グロブリンを基質としてペプチドへの分解および糖鎖の遊離を行った。
［支持体への酵素の固定化］
本実験では支持体（１）としてＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐ（Ｔｙｐｅ Ａ， Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎ Ｉｎｃ．製）を用いた。ＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐ上には、予め縦２５ｍｍ×横６５ｍｍの疎水性シート２９上に縦３ｍｍ×横１０ｍｍの酵素固定化用ウェル３０を縦２列に１ｍｍ間隔で配置した固定化用シール２９を貼付した。一方の酵素固定化用ウェル３０をトリプシン固定化用、もう一方の酵素固定化用ウェル３０をグリコペプチダーゼ固定化用とした。

トリプシン（Ｔ８８０２，Ｓｉｇｍａ社製）を５０％グリセロールを含んだＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）を用いて１ｍｇ／ｍｌに調製し、グリコペプチダーゼ（１−３６５−１９３，Ｒｏｃｈｅ社製）を５０％グリセロールおよび２５ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含んだ１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）によって０．６７Ｕ／μｌに調製した。

これら２種類の酵素溶液３１を別々にＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐ上の各酵素固定化用ウェル３０に２０μｌずつマイクロピペッターを用いて添加した。予め乾燥防止用の水滴３３を隅に滴下した密閉容器３２にＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐを設置し、４℃で一晩インキュベートしてトリプシンおよびグリコペプチダーゼをＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐに固定化した。

ＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐを５０ｍｌの洗浄溶液＜ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）＞に浸漬して５分間振盪後、洗浄溶液を交換してさらに５分間振盪して洗浄し、未結合の酵素を取り除いた。洗浄後、反応バッファー＜１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．５）＞で２回すすぎ、濾紙で余分な水分を取り除いた。
［酵素反応に用いる基質の変性および還元アルキル化処理］
基質としてヒト免疫グロブリン（Ｉ４５０６，Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。同基質をエッペンチューブに１ｍｇ秤量し、１ｍｌの変性溶液＜６Ｍ塩酸グアニジンおよび２．５ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む０．２ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．５）＞に希釈した。１μｌの還元溶液（６０ｍｇ／ｍｌジチオスレイトールを含む滅菌水）を添加し、溶液表面を３０秒間静かに窒素ガスを吹き付けた後、エッペンチューブのフタをパラフィルムで覆い３７℃で３時間静置してヒト免疫グロブリンを変性および還元処理した。

反応後、氷上に５分間放置して液温を下げ、２０μｌのアルキル化溶液（５０ｍｇ／ｍｌヨードアセトアミドを含む変性溶液）を添加した。溶液表面を３０秒間静かに窒素ガスを吹き付けた後、エッペンチューブのフタをパラフィルム（Ｐｅｃｈｉｎｅｙ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｉｎｃ．製）で覆い、室温で１時間静置して還元化したアミノ酸残基をアルキル化した。反応後の溶液中の塩酸グアニジンは、２００ｍｌの反応バッファーを用いて４℃で２時間の透析を３回繰り返すことにより取り除いた。
［固定化酵素によるヒト免疫グロブリンの酵素処理］
トリプシンおよびグリコペプチダーゼの固定化用に２つの酵素固定化用ウェル３０として分割した疎水性シート２９の一部分（縦１ｍｍ×横１０ｍｍ）をカッターナイフで切除した。これにより、トリプシン固定化領域およびグリコペプチダーゼ固定化領域がつながった反応用ウェル（縦７ｍｍ×横１０ｍｍ）３４を形成した。

５０μｌの還元アルキル化済みヒト免疫グロブリン３５を反応用ウェル３４に添加した後、予め乾燥防止用の水滴３３を隅に滴下した密閉容器３２にＰｒｏｔｅｏＣｈｉｐを設置し、３７℃で一晩インキュベートして基質を固定化酵素と反応させた後、反応産物３６を回収した。
［固定化トリプシン消化で得られたペプチドのＨＰＬＣ解析］
反応産物３６５μｌを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）１５に供試して、固定化トリプシン消化で得られた基質由来のペプチドの存在を検証した。

カラムにはＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ Ｃ１８ ＭＧ（２ｍｍ×７５ｍｍ，資生堂製）を使用した。移動相としてＡ液（０．１％ＴＦＡを含む５％アセトニトリル）およびＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９５％アセトニトリル）を用いた。溶出開始から開始後５０分にかけてＡ液比率１００％から６０％（Ｂ液比率０％から４０％）のリニアグラジエントを行った。引き続き開始後５０分から１００分にかけてＡ液比率６０％から０％（Ｂ液比率４０％から１００％）のリニアグラジエントの条件でカラムに吸着したペプチドを溶出した。流速は０．２ｍｌ／ｍｉｎとした。ペプチドの検出は紫外部（２１４ｎｍ）の吸光度で測定した。
［固定化グリコペプチダーゼ処理で得られた遊離糖鎖のＡＢＯＥ標識］
ペプチド分析に用いた５μｌを除いた反応産物３６の残り全量に対して遊離糖鎖の標識を行った。ＡＢＯＥ糖鎖標識化キット（Ｊ−オイルミルズ）を用い、４−アミノ安息香酸オクチルエステル（ＡＢＯＥ）で遊離糖鎖の還元末端を標識した。

反応産物３６をネジ口試験管に移して凍結乾燥した後、還元剤としてピリジンボランコンプレックスを含んだＡＢＯＥ試薬を添加し、８０℃で３０分間インキュベートして反応させた。室温に戻した後に蒸留水およびクロロホルムを各１ｍｌずつ添加し、撹拌後遠心分離して水層を回収した。さらに蒸留水を１ｍｌ添加した後、同様の精製操作を２回繰り返した。回収した水層は凍結乾燥により濃縮し、ＨＰＬＣ１５を用いた解析に供試した。
［ＡＢＯＥ標識糖鎖のＨＰＬＣ解析］
得られたＡＢＯＥ標識糖鎖のうち１／４０量をＨＰＬＣ解析に供試し、固定化グリコペプチダーゼ処理で得られた基質由来の遊離糖鎖の存在を検証した。

カラムにはホーネンパックＣ１８（４．６ｍｍ×７５ｍｍ，Ｊ−オイルミルズ）を使用した。移動相としてＡ液＜０．１Ｍ酢酸アンモニウムバッファー（ｐＨ４．０）：アセトニトリル＝７５：２５の混合溶液＞およびＢ液＜０．１Ｍ酢酸アンモニウムバッファー（ｐＨ４．０）：アセトニトリル＝５５：４５の混合溶液＞を用いた。溶出開始から開始後１０分にかけてＡ液比率９０％（Ｂ液比率１０％）の定濃度で送液した後、開始後１０分から５０分にかけてＡ液比率９０％から２０％（Ｂ液比率１０％から８０％）のリニアグラジエントを行ってカラムに吸着したＡＢＯＥ標識糖鎖を溶出した。流速は１ｍｌ／ｍｉｎとした。ＡＢＯＥ標識は３０５ｎｍで励起して３６０ｎｍの蛍光を検出した。
［実験結果］
図８にＨＰＬＣ１５によるペプチドの検出結果として、ペプチドクロマトグラム３７と紫外部吸収のベースライン３８を示した。固定化トリプシン消化により得られたペプチドの各フラグメントが溶出時間５分から８０分の間で認められることから、本実施例により基質であるヒト免疫グロブリンがペプチドに消化されることが示された。

一方、図９ではＨＰＬＣ１５によるＡＢＯＥ標識遊離糖鎖の検出結果として、遊離糖鎖クロマトグラム３９と蛍光検出時のベースライン４０を示した。固定化グリコペプチダーゼ処理により遊離したヒト免疫グロブリン由来糖鎖のピークが溶出時間１０分から３０分の間で認められることから、本実施例により基質であるヒト免疫グロブリンから糖鎖を遊離できることが示された。

以上の実験例から、本実施例によりタンパク質消化および糖鎖遊離に必要となる複数の酵素（２’、３’、４’を支持体１’上に分離して固定化し、両酵素反応を同条件で一括して行うことにより、目的とするペプチドおよび遊離糖鎖が得られることを実証した。このことは、本実施例がタンパク質あるいは糖鎖解析のためのサンプル前処理工程に適用できるとともに、同工程の効率化および簡便化が図れることを示している。

本実施例は、試料中に含まれている各種分子を解析するためのサンプル前処理技術として必要な複数の各種酵素を固相上に酵素ごとに分離して固定化し、それらを一括して酵素反応させるものである。そのため、サンプル前処理の効率化および簡便化が図れるとともに酵素の再利用が可能となる。また、解析時の酵素分子混在による解析精度低下を抑制することができる。

本発明は、生体試料の解析の前処理として利用可能であるほか、基礎研究分野、医療、創薬、検査、診断等の各分野に幅広く適用することが可能である。特にタンパク質の消化や糖鎖等の就職分子遊離等、生体分子の解析の前処理に利用可能な方法であり、酵素固定化基体、前処理システム等に関する。

本発明の実施例において用いられる酵素固定化基体を説明する斜視図で、（ａ）は１つの固相に１種類の酵素をそれぞれ独立して固定化した固定化体の斜視図、（ｂ）は１つの固相に複数種類の酵素を分離して固定した酵素固定化基体の斜視図である。 酵素反応槽の概略断面図で、（ａ）は側面断面図、（ｂ）は平面断面図である。 本発明の実施例による反応産物解析システムの概略図である。 実施例の酵素固定化基体の作製フローの概略図を示す。 実験例の酵素固定化基体を使用した分析作業フローの概略図を示す。 実施例の酵素溶液分注システムの概略図を示す。 実施例の作業工程フローの概略図を示す。 実施例におけるＨＰＬＣによるペプチド解析の結果を示すグラフである。 実施例におけるＨＰＬＣによるＡＢＯＥ標識糖鎖解析の結果を示すグラフである。

符号の説明

１…支持体（固相）、２…酵素Ａ、３…酵素Ｂ、４…酵素Ｘ、５…酵素固定化済み支持体、６…反応槽、７…反応溶液、８…反応溶液送液口、９…反応溶液振動膜、１０…反応溶液振動装置、１１…温度制御装置、１２…酵素反応ユニット、１３…サンプル、１４…分離検出ユニット、１５…液体クロマトグラフィー、１６…マススペクトロメトリー、１７…システム制御装置、１８…制御装置、１９…分注装置全体、２０…レール、２１…位置捕捉装置、２２…ヘッド、２３…ノズル、２４…ノズル洗浄装置、２５…ノズル乾燥装置、２６…各種酵素溶液リザーバー、２７…ポンプ、２８…温／湿度センサー、２９…固定化用シール（疎水性シート）、３０…酵素固定化用ウェル、３１…各種酵素溶液、３２…密閉容器、３３…乾燥防止用水滴、３４…反応用ウェル、３５…変性／還元処理済み基質溶液、３６…反応産物、３７…ペプチドクロマトグラム、３８…紫外部吸収のベースライン、３９…遊離糖鎖クロマトグラム、４０…蛍光検出時のベースライン。

Claims (13)

1. 生体試料中に含まれる複数の解析対象分子と、酵素を固相上に固定した酵素固定化基体とを接触して生体試料を前処理して解析する方法であって、上記酵素固定化基体は全体として複数種類の酵素を担持することを特徴とする生体試料の前処理方法。
2. 上記酵素固定化基体は、固相上に複数種類の酵素を種類毎に分離して固定したものである請求項１記載の生体試料の前処理方法。
3. 上記酵素固定化基体は、１つの固相上に複数種類の酵素を種類毎に分離して固定したものである請求項１記載の生体試料の前処理方法。
4. １つの固相上に１種類の酵素を固定した複数種類の酵素固定基体を同時に上記生体試料と接触させる請求項１記載の生体試料の前処理方法。
5. 反応槽内で一括して反応させることにより目的とする反応産物を得ることを特徴とする請求項１記載の生体試料の前処理方法。
6. 反応槽内で一括して反応させることにより反応産物より各種酵素を取り除く請求項１記載の生体試料の前処理方法。
7. 上記酵素固定化基体を反復して上記前処理に使用する請求項１記載の生体試料の前処理方法。
8. 酵素反応装置および分離検出装置と備え、上記酵素反応装置は生体試料中に含まれる複数の解析対象分子と、酵素を固相上に固定した酵素固定化基体とを接触して生体試料を前処理して解析する手段を含み、上記酵素固定化基体は全体として複数種類の酵素を担持することを特徴とする生体試料の解析システム。
9. 上記酵素固定化基体は、固相上に複数種類の酵素を種類毎に分離して固定したものである請求項８記載の生体試料の解析システム。
10. 上記酵素固定化基体は、１つの固相上に複数種類の酵素を種類毎に分離して固定したものである請求項８記載の生体試料の解析システム。
11. １つの固相上に１種類の酵素を固定した複数種類の酵素固定体を同時に上記生体試料と接触させる請求項８記載の生体試料の解析システム。
12. 固相と、該固相面に固定された酵素とを有する酵素固定化基体の複数種類を１セットとしたことを特徴とする生体試料前処理要素。
13. １つの固相と、該固相面に相互に分離して固定された複数種類の酵素を備えたことを特徴とする生体試料前処理酵素固定化基体。
    

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