JP2006296420A - 親水性ジオールデヒドラターゼ及び疎水性グリセロールデヒドラターゼを製造する方法 - Google Patents

親水性ジオールデヒドラターゼ及び疎水性グリセロールデヒドラターゼを製造する方法 Download PDF

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Masaharu Mukoyama
正治 向山
Tetsuo Toratani
哲夫 虎谷
Kosei Tobimatsu
孝正 飛松
Masahiro Kawada
真裕 川田
Shinzo Yasuda
信三 安田
Hiroshi Horikawa
洋 堀川
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Okayama University NUC
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Okayama University NUC
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Abstract

【課題】ジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼの酵素活性を維持したまま、これらの酵素の水に対する溶解性を変化する手段を提供する。
【解決手段】ジオールデヒドラターゼ又はグリセロールデヒドラターゼのβサブユニット及び／又はγサブユニットにおいてＮ末端アミノ酸を変異させることにより、ジオールデヒドラターゼ又はグリセロールデヒドラターゼの水に対する溶解性を変化させる方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、ジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼの水に対する溶解性を変化させる方法、水に対する溶解性が変化したジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼ、並びにこれらの酵素により１位及び２位に水酸基を有する脂肪族ポリオールを脱水する方法に関する。
ジオールデヒドラターゼは、１，２−ジオールを脱水して対応するアルデヒドに変換する反応を、アデノシルコバラミン（補酵素Ｂ１２）依存的に触媒する酵素として知られている（非特許文献１及び２）。ジオールデヒドラターゼは、Klebsiella属細菌及びCitrobacter属細菌などにおいて、特に、１，２−ジオールの存在下、好気的条件での増殖において誘導される（非特許文献３〜５）。グリセロールも基質とされうるが、１，２−ジオールに比べて基質特異性は低い。ジオールデヒドラターゼは、６０ｋＤａ、３０ｋＤａ及び１９ｋＤａの３つのサブユニット（それぞれαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニット）からなる分子量約２２万の酵素であり、これらのサブユニットをコードする遺伝子はタンデムに並んでいることがわかっている（非特許文献６）。
グリセロールデヒドラターゼは、ジオールデヒドラターゼとその触媒作用及びサブユニット構造などが類似しているが、免疫学的性質や基質特異性などが異なるアイソザイムである（非特許文献７〜９）。グリセロールデヒドラターゼは、６１ｋＤａ、２１ｋＤａ及び１６ｋＤａの３つのサブユニット（それぞれαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニット）からなることがわかっている。
いずれの酵素とも既にクローニングが行われ、大腸菌による大量発現系も確立されている（非特許文献１０）。しかし、ジオールデヒドラターゼは、水に対する溶解性が低い酵素であるため（非特許文献１１〜１２）、組換え体ジオールデヒドラターゼを大量に得ることが難しいという問題、親水性の条件下での反応に用いることができないという問題があった。ジオールデヒドラターゼを水に可溶化する方法として、界面活性剤で処理する方法が知られているが、当該方法を用いると酵素活性が失われるという問題があった。
一方、グリセロールデヒドラターゼは、水に対する溶解性が高い酵素であるため（非特許文献７及び１３）、疎水性条件下での反応には適していないという問題があった。疎水性条件下でグリセロールを基質として反応を実施したいときに、グリセロールデヒドラターゼのかわりにジオールデヒドラターゼを使用することも考えられるが、ジオールデヒドラターゼはグリセロールデヒドラターゼに比べてグリセロールに対する基質特異性が低いため、やはりグリセロールデヒドラターゼを疎水性条件下での反応に用いる手段が望まれていた。
従って、ジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼの酵素活性を維持したまま、これらの酵素の水に対する溶解性を変化する手段が望まれていた。
ジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼの対応するサブユニットのアミノ酸配列を比較すると、βサブユニットのＮ末端の３２アミノ酸、及びγサブユニットのＮ末端の３７アミノ酸を除き、高度の相同性を有することが報告されている（非特許文献１４）。しかし、上記のような互いに相違するアミノ酸領域がジオールデヒドラターゼの溶解性に影響を及ぼしているかは明らかではなく、また、これらのＮ末端アミノ酸領域を欠失させたジオールデヒドラターゼ又は付加したグリセロールデヒドラターゼが、それぞれ親水性条件下又は疎水性条件下で触媒活性を示すかについても明らかではなかった。
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本発明の課題は、ジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼの酵素活性を維持したまま、これらの酵素の水に対する溶解性を変化する手段を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ジオールデヒドラターゼとグリセロールデヒドラターゼの各サブユニットのアミノ酸配列において相違するＮ末端アミノ酸の特定の領域がこれらの酵素の水に対する溶解性を決定づけていることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）ジオールデヒドラターゼ又はグリセロールデヒドラターゼのβサブユニット及び／又はγサブユニットにおいてＮ末端アミノ酸を変異させることにより、ジオールデヒドラターゼ又はグリセロールデヒドラターゼの水に対する溶解性を変化させる方法。
（２）Ｎ末端アミノ酸の変異が、
ジオールデヒドラターゼを構成するβサブユニット及び／又はγサブユニットにおけるＮ末端アミノ酸を欠失させること、又は
グリセロールデヒドラターゼを構成するβサブユニット及び／又はγサブユニットにおけるＮ末端に、ジオールデヒドラターゼの対応するサブユニットのＮ末端アミノ酸を付加すること、
を含む、（１）記載の方法。
（３）ジオールデヒドラターゼのβサブユニット及び／又はγサブユニットにおけるＮ末端アミノ酸の変異が、
ジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の９〜６４個のアミノ酸を欠失させること、及び／又は
ジオールデヒドラターゼのγサブユニットのＮ末端の５〜４２個のアミノ酸を欠失させること
を含む（２）記載の方法。
（４）グリセロールデヒドラターゼのβサブユニット及び／又はγサブユニットにおけるＮ末端アミノ酸の変異が、
グリセロールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端に、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の９〜６４個のアミノ酸を付加すること、
グリセロールデヒドラターゼのγサブユニットのＮ末端に、ジオールデヒドラターゼのγサブユニットのＮ末端の５〜４２個のアミノ酸を付加すること
を含む（２）記載の方法。
（５）αサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを含むジオールデヒドラターゼであって、
βサブユニットのＮ末端の９〜６４個のアミノ酸が欠失しており、及び／又はγサブユニットのＮ末端の５〜４２個のアミノ酸が欠失しており、かつ水溶性である前記ジオールデヒドラターゼ。
（６）αサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを含むジオールデヒドラターゼであって、
αサブユニットが以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ジオールデヒドラターゼのβサブユニット及びγサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
であり、
βサブユニットが以下の（ｃ）〜（ｆ）から選択されるタンパク質：
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号３において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ジオールデヒドラターゼのαサブユニット及びγサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
（ｅ）配列番号３においてＮ末端の９〜６４個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｆ）（ｅ）に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ジオールデヒドラターゼのαサブユニット及びγサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
であり、
γサブユニットが以下の（ｇ）〜（ｊ）から選択されるタンパク質：
（ｇ）配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｈ）配列番号５において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ジオールデヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
（ｉ）配列番号５においてＮ末端の５〜４２個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｊ）（ｉ）に記載アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ジオールデヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質
であり、
ただし、βサブユニットが（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であるときγサブユニットは（ｇ）及び（ｈ）のタンパク質ではない、前記ジオールデヒドラターゼ。
（７）（５）又は（６）のジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子。
（８）（７）記載の遺伝子を含むベクター。
（９）（８）記載のベクターを含む形質転換体。
（１０）αサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを含むグリセロールデヒドラターゼにおいて、
βサブユニットのＮ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の９〜６４個のアミノ酸が付加しており、及び／又はγサブユニットのＮ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の９〜６４個のアミノ酸が付加しており、かつ水に不溶性である前記グリセロールデヒドラターゼ。
（１１）αサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを含むグリセロールデヒドラターゼにおいて、
αサブユニットが以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号７において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのβサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
であり、
βサブユニットが以下の（ｃ）〜（ｆ）から選択されるタンパク質：
（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号９において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
（ｅ）配列番号９のＮ末端に配列番号３のＮ末端の９〜６４個のアミノ酸が付加してなるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｆ）（ｅ）に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
であり、
γサブユニットが以下の（ｇ）〜（ｊ）から選択されるタンパク質：
（ｇ）配列番号１１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｈ）配列番号１１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
（ｉ）配列番号１１のＮ末端に配列番号５のＮ末端の５〜４２個のアミノ酸が付加してなるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｊ）（ｉ）に記載アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質
であり、
ただし、βサブユニットが（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であるときγサブユニットは（ｇ）及び（ｈ）のタンパク質ではない、前記グリセロールデヒドラターゼ。
（１２）（１０）又は（１１）記載のグリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子。
（１３）（１２）記載の遺伝子を含むベクター。
（１４）（１３）記載のベクターを含む形質転換体。
（１５）以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子：
（ａ）配列番号１７の塩基配列からなる遺伝子、
（ｂ）配列番号１７で表される塩基配列からなる遺伝子に対し相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（１６）（１５）記載の遺伝子を含むベクター。
（１７）（１６）記載のベクターを含む形質転換体。
（１８）αサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを含むグリセロールデヒドラターゼにおいて、
αサブユニットが以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１８において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのβサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
であり、
βサブユニットが以下の（ｃ）〜（ｆ）から選択されるタンパク質：
（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号９において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
（ｅ）配列番号１９のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｆ）配列番号１９において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
であり、
γサブユニットが以下の（ｇ）〜（ｊ）から選択されるタンパク質：
（ｇ）配列番号１１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｈ）配列番号１１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｊ）配列番号２０において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
であり、
ただし、βサブユニットが（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であるときγサブユニットは（ｇ）及び（ｈ）のタンパク質ではない、前記グリセロールデヒドラターゼ。
（１９）１位及び２位に水酸基を有する脂肪族ポリオールを脱水して、１位にアルデヒド基を有するアルデヒドを生成する方法あって、
１位及び２位に水酸基を有する脂肪族ポリオールと（５）若しくは（６）記載のジオールデヒドラターゼ及び／又は（１０）、（１１）若しくは（１８）記載のグリセロールデヒドラターゼとを反応させることを含む前記方法。
（２０）１位及び２位に水酸基を有する脂肪族ポリオールを脱水して、１位にアルデヒド基を有するアルデヒドを生成する方法あって、
１位及び２位に水酸基を有する脂肪族ポリオールの存在下、（７）記載のジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子及び／又は（１２）若しくは（１５）記載のグリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子を含む形質転換体を培養することを含む前記方法。
本発明により、ジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼの水に対する溶解性を、酵素活性を維持しつつ変化させることができる。
本発明は、グリセロールデヒドラターゼのβサブユニット及び／又はγサブユニットにおいてＮ末端アミノ酸を変異させることにより、ジオールデヒドラターゼ又はグリセロールデヒドラターゼの水に対する溶解性を変化させる方法に関する。
本発明において、ジオールデヒドラターゼとは、当技術分野で通常用いられる意味を有し、すなわち、１，２−ジオールを脱水して対応するアルデヒド及び水へ変換する反応を、アデノシルコバラミン（補酵素Ｂ１２）依存的に触媒する活性を有する酵素である。ジオールデヒドラターゼは、６０ｋＤａ、３０ｋＤａ及び１９ｋＤａの３つのサブユニット（それぞれαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニット）を含む。
本発明において、グリセロールデヒドラターゼは、当技術分野で通常用いられる意味を有し、すなわち、グリセロールを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド及び水へ変換する反応を、アデノシルコバラミン（補酵素Ｂ１２）の存在下で触媒する活性を有する酵素である。グリセロールデヒドラターゼは、６１ｋＤａ、２１ｋＤａ及び１６ｋＤａの３つのサブユニット（それぞれαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニット）を含む。
ジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼにおいては、上記α、β、γサブユニットと補酵素が会合することにより、酵素活性が発揮される。
ジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼは、上記酵素活性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、Lactobacillus属、Citrobacter属、Clostridium属、Klebsiella属、Enterobacter属、Caloramator属、Salmonella属及びListeria属等に属する細菌に由来するものが挙げられる。
本発明の方法では、上記ジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼのβ及び／又はγサブユニットにおいてＮ末端アミノ酸を変異させることにより、酵素の水に対する溶解性を変化させる。
ジオールデヒドラターゼにおけるＮ末端アミノ酸の変異は、好ましくは、βサブユニット及び／又はγサブユニットにおけるＮ末端アミノ酸を欠失させることにより行う。βサブユニットにおいて欠失させるＮ末端アミノ酸は、Ｎ末端側から９〜６４個、好ましくは１４〜３５個、より好ましくは１８〜２５個である。γサブユニットにおいて欠失させるＮ末端アミノ酸は、Ｎ末端側から５〜４２個、好ましくは１０〜３５個、より好ましくは１５〜２５個である。
グリセロールデヒドラターゼにおけるＮ末端アミノ酸の変異は、好ましくは、βサブユニット及び／又はγサブユニットにおけるＮ末端に、ジオールデヒドラターゼの対応するサブユニットのＮ末端アミノ酸を付加することにより実施できる。グリセロールデヒドラターゼのサブユニットに付加するジオールデヒドラターゼの対応するサブユニットのＮ末端アミノ酸は、どの属に属する細菌由来のものでもかまわないが、タンパク質発現を行う宿主と同じか近縁の科に属する細菌由来のもの、好ましくは同じか近縁の属に属する細菌由来のものとするのが好ましい。
本発明の方法においては、各酵素のβサブユニット若しくはγサブユニットのいずれかにおいてのみＮ末端アミノ酸を変異させてもよく、又は双方のサブユニットにおいてＮ末端アミノ酸を変異させてもよい。いずれの場合にも本発明の効果が得られる。
本発明はまた、上記方法によって得られた水に対する溶解性の変化した変異型ジオールデヒドラターゼ及び変異型グリセロールデヒドラターゼに関する。以下、β及び／又はγサブユニットのＮ末端アミノ酸が変異したジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼを、それぞれ変異型ジオールデヒドラターゼ及び変異型グリセロールデヒドラターゼと称し、Ｎ末端アミノ酸が変異していないジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼを、それぞれ野生型ジオールデヒドラターゼ及び野生型グリセロールデヒドラターゼと称する場合がある。
すなわち本発明の一実施形態は、αサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを含むジオールデヒドラターゼであって、βサブユニットのＮ末端の９〜６４個のアミノ酸が欠失しており、及び／又はγサブユニットのＮ末端の５〜４２個のアミノ酸が欠失しており、かつ水溶性である前記ジオールデヒドラターゼに関する。ここでα又はγサブユニットにおいて欠失しているＮ末端アミノ酸の数については上記のとおりである。
本発明の変異型ジオールデヒドラターゼには、βサブユニット及びγサブユニットのいずれかのＮ末端アミノ酸が欠失しているもの、並びにβサブユニット及びγサブユニットの双方のＮ末端アミノ酸が欠失しているものが包含される。
本発明の変異型ジオールデヒドラターゼは、上記変異を含み水溶性であるとともに、ジオールデヒドラターゼ活性を有する限り特に限定されない。本発明において水溶性であるとは、変異型ジオールデヒドラターゼ遺伝子が発現したタンパク質の大部分が水に可溶であることを意味する。具体的には、酵素タンパク質を発現させた微生物菌体を適当な緩衝液に懸濁させて充分破砕した後、懸濁液を遠心分離した試料の上清部分に、酵素活性の大部分が存在することで確認できる。
本発明の変異型ジオールデヒドラターゼとしては、例えば、Lactobacillus属、Citrobacter属、Clostridium属、Klebsiella属、Enterobacter属、Caloramator属、Salmonella属及びListeria属等に属する細菌、好ましくはKlebsiella属細菌、より好ましくはKlebsiella oxytocaに由来するジオールデヒドラターゼのβサブユニット及び／又はγサブユニットにおいて、Ｎ末端アミノ酸が欠失したジオールデヒドラターゼが挙げられる。
野生型ジオールデヒドラターゼのα、β及びγサブユニットの公知のアミノ酸配列及び各サブユニットをコードする遺伝子の塩基配列は、公開されたデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に、例えば、アクセッション番号：Ｄ４５０７１で登録されている。
より具体的には、野生型ジオールデヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列としては配列番号１のアミノ酸配列が挙げられ、αサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列としては配列番号２の塩基配列が挙げられ、βサブユニットのアミノ酸配列としては配列番号３のアミノ酸配列が挙げられ、βサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列としては配列番号４の塩基配列が挙げられ、γサブユニットのアミノ酸配列としては配列番号５のアミノ酸配列が挙げられ、γサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列としては配列番号６の塩基配列が挙げられる。
本発明の一実施形態において、変異型ジオールデヒドラターゼは、α、β及びγサブユニットを含み、
αサブユニットが、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
βサブユニットが、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３においてＮ末端の９〜６４個、好ましくは１４〜３５個、さらに好ましくは１８〜２５個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
γサブユニットが、配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５においてＮ末端の５〜４２個、好ましくは１０〜３５個、さらに好ましくは１５〜２５個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質である。
ただし、ここで、βサブユニットが配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質であるときは、γサブユニットは配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質ではない。
本発明においてαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットには、野生型酵素における各サブユニットだけでなく、Ｎ末端アミノ酸が変異した変異型のサブユニットも包含される。
上記のアミノ酸配列で特定される各サブユニットと機能的に同等のタンパク質を対応するサブユニットとして含む変異型ジオールデヒドラターゼもまた本発明に包含される。
本発明において、各サブユニットと機能的に同等のタンパク質とは、当該タンパク質が各配列番号で特定されるタンパク質と同等の生物学的機能、生化学的機能を有することを指す。例えば、「配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質」と機能的に同等のタンパク質としては、「配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ジオールデヒドラターゼのβサブユニット及びγサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質」が挙げられる。
数個とは、通常２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個をいう。また、例えば「ジオールデヒドラターゼのβサブユニット及びγサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質」とは、βサブユニット及びγサブユニット、少なくとも野生型のβサブユニット及びγサブユニットと会合して、野生型ジオールデヒドラターゼと同等の酵素活性を示すタンパク質、すなわち、さらにアデノシルコバラミン（補酵素Ｂ１２）の存在下でジオールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質を意味する。
また、機能的に同等のタンパク質は、通常、アミノ酸配列レベルにおいて高い同一性を有する。高い同一性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも８０％以上の同一性、好ましくは９０％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性、さらに好ましくは９９％以上の同一性を指す。
より具体的には、本発明の一実施形態において、変異型ジオールデヒドラターゼは、αサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを含み、
αサブユニットが以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ジオールデヒドラターゼのβサブユニット及びγサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
であり、
βサブユニットが以下の（ｃ）〜（ｆ）から選択されるタンパク質：
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号３において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ジオールデヒドラターゼのαサブユニット及びγサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
（ｅ）配列番号３においてＮ末端の９〜６４個、好ましくは１４〜３５個、さらに好ましくは１８〜２５個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｆ）（ｅ）に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ジオールデヒドラターゼのαサブユニット及びγサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
であり、
γサブユニットが以下の（ｇ）〜（ｊ）から選択されるタンパク質：
（ｇ）配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｈ）配列番号５において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ジオールデヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
（ｉ）配列番号５においてＮ末端の５〜４２個、好ましくは１０〜３５個、さらに好ましくは１５〜２５個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｊ）（ｉ）に記載アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ジオールデヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質
であり、
ただし、βサブユニットが（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であるときγサブユニットは（ｇ）及び（ｈ）のタンパク質ではない。
本発明の変異型ジオールデヒドラターゼは、野生型ジオールデヒドラターゼと異なり水に可溶性であるが、野生型ジオールデヒドラターゼと同等の酵素活性を維持している。従って、組換え体ジオールデヒドラターゼを大量に得ることができるとともに、親水性の条件下で酵素反応を実施することができる。
本発明の別の実施形態は、α、β及びγサブユニットを含む変異型グリセロールデヒドラターゼであって、βサブユニットのＮ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の９〜６４個のアミノ酸が付加しており、及び／又はγサブユニットのＮ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の５〜４２個アミノ酸が付加しており、かつ水に不溶性である前記変異型グリセロールデヒドラターゼに関する。ここでβ又はγサブユニットにおいてＮ末端に付加しているジオールデヒドラターゼの対応するサブユニットのＮ末端アミノ酸の数については上記のとおりである。
本発明の変異型グリセロールデヒドラターゼには、βサブユニット及びγサブユニットのいずれかのＮ末端にアミノ酸付加を有するもの、並びにβサブユニット及びγサブユニットの双方のＮ末端にアミノ酸付加を有するものが包含される。いずれの場合にも本発明の効果が得られる。
本発明の別の実施形態は、α、β及びγサブユニットを含む変異型グリセロールデヒドラターゼであって、βサブユニットのＮ末端の１〜５０個のアミノ酸がジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の９〜７０個のアミノ酸と置換されており、及び／又はγサブユニットのＮ末端の１〜２０個のアミノ酸がジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の５〜５０個のアミノ酸と置換されており、かつ水に不溶性である前記変異型グリセロールデヒドラターゼに関する。
本発明の変異型グリセロールデヒドラターゼには、βサブユニット又はγサブユニットのいずれかのＮ末端のみ置換されるもの、並びにβサブユニット及びγサブユニットの双方のＮ末端が置換されるものが包含される。いずれの場合にも本発明の効果が得られる。
本発明の変異型グリセロールデヒドラターゼは、上記変異を含み水に不溶性であるとともに、グリセロールデヒドラターゼ活性を有する限り特に限定されない。本発明において水に不溶性であるとは、変異型グリセロールデヒドラターゼ遺伝子が発現したタンパク質の大部分が水に不溶であることを意味する。具体的には、酵素タンパク質を発現させた微生物菌体を適当な緩衝液に懸濁させて充分破砕した後、懸濁液を遠心分離した試料の沈殿部分に、酵素活性の大部分が存在することで確認できる。
本発明の変異型グリセロールデヒドラターゼとしては、例えば、Lactobacillus属、Citrobacter属、Clostridium属、Klebsiella属、Enterobacter属、Caloramator属、Salmonella属及びListeria属等に属する細菌、好ましくはKlebsiella属細菌、より好ましくはKlebsiella pneumoniaeに由来するグリセロールデヒドラターゼのβサブユニット及び／又はγサブユニットにおいて、Ｎ末端アミノ酸に付加又は置換を有するジオールデヒドラターゼが挙げられる。
野生型グリセロールデヒドラターゼのα、β及びγサブユニットの公知のアミノ酸配列及び各サブユニットをコードする遺伝子の塩基配列は、公開されたデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に、例えばアクセッション番号：Ｕ３０９０３で登録されている。
より具体的には、野生型グリセロールデヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列としては配列番号７のアミノ酸配列が挙げられ、αサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列としては配列番号８の塩基配列が挙げられ、βサブユニットのアミノ酸配列としては配列番号９のアミノ酸配列が挙げられ、βサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列としては配列番号１０の塩基配列が挙げられ、γサブユニットのアミノ酸配列としては配列番号１１のアミノ酸配列が挙げられ、γサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列としては配列番号１２の塩基配列が挙げられる。
本発明の一実施形態において、変異型グリセロールデヒドラターゼは、α、β及びγサブユニットを含み、
αサブユニットが、配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
βサブユニットが、配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号９のＮ末端に配列番号３のＮ末端の９〜６４個、好ましくは３５〜６０個のアミノ酸が付加してなるアミノ酸配列からなるタンパク質、
γサブユニットが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１１のＮ末端に配列番号５のＮ末端の５〜４２個、好ましくは１０〜３５個、さらに好ましくは１５〜２５個のアミノ酸が付加してなるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
ただし、ここで、βサブユニットが配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質であるときは、γサブユニットは配列番号１１のアミノ酸配列からなるタンパク質ではない。
本発明の一実施形態において、変異型グリセロールデヒドラターゼは、α、β及びγサブユニットを含み、
αサブユニットが、配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、
βサブユニットが、配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号９のＮ末端の１〜５０個、好ましくは２０〜３０個のアミノ酸が、配列番号３のＮ末端の９〜７０個、好ましくは３５〜６４個、さらに好ましくは３５〜６２個のアミノ酸と置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
γサブユニットが、配列番号１１のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１１のＮ末端の１〜２０個、好ましくは１〜８個のアミノ酸が、配列番号５のＮ末端の５〜５０個、好ましくは３０〜４５個のアミノ酸と置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質である。
ただし、ここで、βサブユニットが配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質であるときは、γサブユニットは配列番号１１のアミノ酸配列からなるタンパク質ではない。
上記のアミノ酸配列で特定される各サブユニットと機能的に同等のタンパク質を対応するサブユニットとして含む変異型グリセロールデヒドラターゼもまた本発明に包含される。例えば、「配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質」と機能的に同等のタンパク質としては、「配列番号７において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのβサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質」が挙げられる。上記のとおり、機能的に同等のタンパク質は、通常、アミノ酸配列レベルにおいて高い同一性を有する。
また、例えば「グリセロールデヒドラターゼのβサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質」とは、βサブユニット及びγサブユニット、少なくとも野生型のβサブユニット及びγサブユニットと会合して、野生型グリセロールデヒドラターゼと同等の酵素活性を示すタンパク質、すなわち、さらにアデノシルコバラミン（補酵素Ｂ１２）の存在下でグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質を意味する。
より具体的には、本発明の一実施形態において、変異型グリセロールデヒドラターゼは、αサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを含み、
αサブユニットが以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号７において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのβサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
であり、
βサブユニットが以下の（ｃ）〜（ｆ）から選択されるタンパク質：
（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号９において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
（ｅ）配列番号９のＮ末端に配列番号３のＮ末端の９〜６４個、好ましくは３５〜６０個のアミノ酸が付加してなるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｆ）（ｅ）に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
であり、
γサブユニットが以下の（ｇ）〜（ｊ）から選択されるタンパク質：
（ｇ）配列番号１１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｈ）配列番号１１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
（ｉ）配列番号１１のＮ末端に配列番号５のＮ末端の５〜４２個、好ましくは１０〜３５個、さらに好ましくは１５〜２５個のアミノ酸が付加してなるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｊ）（ｉ）に記載アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質であり、
ただし、βサブユニットが（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であるときγサブユニットは（ｇ）及び（ｈ）のタンパク質ではない。
一実施形態において本発明の変異型グリセロールデヒドラターゼは、αサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを含み、
αサブユニットが以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１８において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのβサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
であり、
βサブユニットが以下の（ｃ）〜（ｆ）から選択されるタンパク質：
（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）配列番号９において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
（ｅ）配列番号１９のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｆ）配列番号１９において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
であり、
γサブユニットが以下の（ｇ）〜（ｊ）から選択されるタンパク質：
（ｇ）配列番号１１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｈ）配列番号１１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｊ）配列番号２０において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
であり、
ただし、βサブユニットが（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であるときγサブユニットは（ｇ）及び（ｈ）のタンパク質ではない。
グリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質とは、野生型グリセロールデヒドラターゼと同等の酵素活性を示すタンパク質、すなわち、さらにアデノシルコバラミン（補酵素Ｂ１２）の存在下でグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質を意味する。数個とは、通常２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個をいう。上記各サブユニットを構成するタンパク質には、各アミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等のタンパク質、すなわち、アミノ酸配列レベルにおいて高い同一性を有するタンパク質であって、各サブユニットの活性を有するタンパク質も包含される。高い同一性とは、上記のとおりアミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも８０％以上の同一性、好ましくは９０％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性、さらに好ましくは９９％以上の同一性を指す。
本発明の変異型グリセロールデヒドラターゼは、水に不溶性であるため、疎水性条件下でも酵素反応を実施することができる。従って、疎水性条件下でグリセロールを基質として反応を実施したい場合に、好適である。
β及び／又はγサブユニットのＮ末端アミノ酸に変異を有するジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼは、当技術分野で公知の方法により調製できる。
ジオールデヒドラターゼのＮ末端アミノ酸が欠失したサブユニットは、例えば、公知のジオールデヒドラターゼをプロテーゼで処理することにより得られる。プロテアーゼとしては、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、ズブチリシン、スロンビン、サーモリシン、パパイン、プラスミン等が挙げられる。例えば、ジオールデヒドラターゼをトリプシン処理し、得られた反応液の上清から水溶性のβ又はγサブユニットを得ることができる。プロテアーゼ処理の条件は、当業者であれば適宜設定することができるが、通常１．０μｇ／ｍｌのトリプシンの存在下、約１５℃で約１０〜１４時間、好ましくは約１２時間反応させる。
あるいは、本発明の変位型ジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼは、公知のジオールデヒドラターゼ又はグリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子、すなわち各サブユニットをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて、当技術分野において通常用いられる方法により調製できる。すなわち、Ｎ末端アミノ酸が変異した各サブユニットをコードする遺伝子をベクターに挿入し、該ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換体を培養することにより調製できる。
本発明の一実施形態は、本発明の変異型ジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子、本発明の変異型グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子、これら遺伝子の一方又は双方を含むベクター、該ベクターによって形質転換された、変異型ジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子及び／又は変異型グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子を含む形質転換体に関する。本発明において、「遺伝子」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡやｃＤＮＡも含むものとする。また、全長遺伝子のみならずＥＳＴも含むものとする。
本発明の変異型ジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子には、αサブユニットをコードする遺伝子、βサブユニットをコードする遺伝子、及びγサブユニットをコードする遺伝子を含み、Ｎ末端の９〜４６個のアミノ酸が欠失しており、及び／又はγサブユニットのＮ末端の５〜４２個のアミノ酸が欠失しており、かつ水溶性である前記ジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子が包含される。
一実施形態において、変異型ジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子は、αサブユニットをコードする遺伝子、βサブユニットをコードする遺伝子、及びγサブユニットをコードする遺伝子を含み、
αサブユニットをコードする遺伝子が、配列番号２の塩基配列からなる遺伝子であり、
βサブユニットをコードする遺伝子が、配列番号４の塩基配列からなる遺伝子であるか、又は配列番号４の５’末端の２７〜１９２個、より好ましくは４２〜１０５個、さらに好ましくは５４〜７５個の塩基が欠失した塩基配列からなる遺伝子であり、
γサブユニットをコードする遺伝子が、配列番号６の塩基配列からなる遺伝子であるか、又は配列番号６の５’末端の１５〜１２６個、より好ましくは３０〜１０５個、さらに好ましくは４５〜７５個の塩基が欠失した塩基配列からなる遺伝子である。ただし、βサブユニットをコードする遺伝子が配列番号４の塩基配列からなる遺伝子である場合、γサブユニットをコードする遺伝子は配列番号６の塩基配列からなる遺伝子ではない。なお、欠失させる塩基の数は、読み枠を考慮して決定する。また、開始コドンの付加、選択した宿主内で発現しやすいようなＮ末端側の配列設定等の諸条件も考慮する。
上記の各サブユニットをコードする遺伝子と機能的に同等の遺伝子を、対応するサブユニットをコードする遺伝子として含む変異型ジオールデヒドラターゼ遺伝子もまた本発明に包含される。
あるタンパク質をコードする遺伝子と機能的に同等の遺伝子とは、当該タンパク質と機能的に同等のタンパク質をコードする遺伝子を意味し、当該遺伝子を調製する当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning 2nd ed.,9.47-9.58,Cold Spring Harbor Lab.press,1989）を利用する方法が挙げられる。
例えば、αサブユニットをコードする遺伝子としての「配列番号２の塩基配列からなる遺伝子」と機能的に同等の遺伝子としては、「配列番号２の塩基配列の全部又は一部からなる遺伝子に対し相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジオールデヒドラターゼのβサブユニット及びγサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」が挙げられる。また、配列番号２の塩基配列と少なくとも６５％の同一性、好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも８５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子も包含される。
塩基配列の一部とは、各塩基配列の一部分の塩基配列であって、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせるのに十分な塩基配列の長さを有するものであり、例えば、少なくとも１５塩基、好ましくは少なくとも１００塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基の配列である。好ましくは各塩基配列において連続する少なくとも１５塩基、好ましくは少なくとも１００塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基の配列である。ここで「連続する」とは、基準とする塩基配列のうち連続した塩基配列を含むことを意味する。
本明細書において、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、すなわち、各塩基配列に対し高い相同性（相同性又は同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）を有するポリヌクレオチドがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、このような条件は、当該分野において周知慣用な手法、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、マイクロアレイ法又はサザンブロットハイブリダイゼーション法などにおいて、具体的には、ポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ；１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）溶液を用い、６５℃でメンブランを洗浄することにより達成できる。
また、塩基配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ＬＡＭＰ法などを利用して、各遺伝子と機能的に同等の遺伝子を単離することも可能である。
より具体的には、一実施形態において、本発明の変異型ジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子は、αサブユニットをコードする遺伝子、βサブユニットをコードする遺伝子、及びγサブユニットをコードする遺伝子を含み、
αサブユニットをコードする遺伝子が、以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子：
（ａ）配列番号２の塩基配列からなる遺伝子、
（ｂ）配列番号２の塩基配列の全部又は一部からなる遺伝子に対し相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジオールデヒドラターゼのβサブユニット及びγサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
であり、
βサブユニットをコードする遺伝子が、以下の（ｃ）〜（ｆ）から選択される遺伝子：
（ｃ）配列番号４の塩基配列からなる遺伝子、
（ｄ）配列番号４の塩基配列の全部又は一部からなる遺伝子に対し相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジオールデヒドラターゼのαサブユニット及びγサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｅ）配列番号４の５’末端の２７〜１９２個、より好ましくは４２〜１０５個、さらに好ましくは５４〜７５個の塩基が欠失した塩基配列からなる遺伝子
（ｆ）（ｅ）に記載の塩基配列の全部又は一部からなる遺伝子に対し相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジオールデヒドラターゼのαサブユニット及びγサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
であり、
γサブユニットをコードする遺伝子が、以下の（ｇ）〜（ｊ）から選択される遺伝子：
（ｇ）配列番号６の塩基配列からなる遺伝子、
（ｈ）配列番号６の塩基配列の全部又は一部からなる遺伝子に対し相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジオールデヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｉ）配列番号６の５’末端の１５〜１２６個、より好ましくは３０〜１０５個、さらに好ましくは４５〜７５個の塩基が欠失した塩基配列からなる遺伝子
（ｊ）（ｉ）に記載の塩基配列の全部又は一部からなる遺伝子に対し相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジオールデヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
であるが、
βサブユニットをコードする遺伝子が（ｃ）又は（ｄ）であるときは、γサブユニットをコードする遺伝子は（ｇ）及び（ｈ）ではない。
本発明の変異型グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子には、αサブユニットをコードする遺伝子、βサブユニットをコードする遺伝子、及びγサブユニットをコードする遺伝子を含み、βサブユニットのＮ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の９〜６４個のアミノ酸が付加しており、及び／又はγサブユニットのＮ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の５〜４２個のアミノ酸が付加しており、かつ水に不溶性である前記グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子が包含される。
一実施形態において、変異型グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子は、αサブユニットをコードする遺伝子、βサブユニットをコードする遺伝子、及びγサブユニットをコードする遺伝子を含み、
αサブユニットをコードする遺伝子が、配列番号８の塩基配列からなる遺伝子であり、
βサブユニットをコードする遺伝子が、配列番号１０の塩基配列からなる遺伝子であるか、又は配列番号１０の５’末端に、配列番号４の５’末端の２７〜１９２個、より好ましくは１０５〜１８０個の塩基が付加した塩基配列からなる遺伝子であり、
γサブユニットをコードする遺伝子が、配列番号１２の塩基配列からなる遺伝子であるか、又は配列番号１２の５’末端に、配列番号６の５’末端の１５〜１２６個、より好ましくは３０〜１０５個、さらに好ましくは４５〜７５個の塩基が付加した塩基配列からなる遺伝子である。ただし、βサブユニットをコードする遺伝子が配列番号１０の塩基配列からなる遺伝子である場合、γサブユニットをコードする遺伝子は配列番号１２の塩基配列からなる遺伝子ではない。なお、付加する塩基の数は、読み枠を考慮して決定する。
一実施形態において、変異型グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子は、αサブユニットをコードする遺伝子、βサブユニットをコードする遺伝子、及びγサブユニットをコードする遺伝子を含み、
αサブユニットをコードする遺伝子が、配列番号８の塩基配列からなる遺伝子であり、
βサブユニットをコードする遺伝子が、配列番号１０の塩基配列からなる遺伝子であるか、又は配列番号１０の５’末端の３〜１５０個の塩基、より好ましくは３０〜１２０個の塩基、さらに好ましくは６０〜９０個の塩基が、特に好ましくは８１個の塩基が、配列番号４の５’末端の２７〜２１０個、より好ましくは１０５〜１９２個、さらに好ましくは１０５〜１８６の塩基、特に好ましくは１８０の塩基と置換された塩基配列からなる遺伝子であり、
γサブユニットをコードする遺伝子が、配列番号１２の塩基配列からなる遺伝子であるか、又は配列番号１２の５’末端の１〜６０個の塩基、より好ましくは１〜２４個の塩基、特に好ましくは３個の塩基が、配列番号６の５’末端の１５〜１５０個、より好ましくは９０〜１３５個、特に好ましくは９９塩基と置換された塩基配列からなる遺伝子である。
ただし、βサブユニットをコードする遺伝子が配列番号１０の塩基配列からなる遺伝子である場合、γサブユニットをコードする遺伝子は配列番号１２の塩基配列からなる遺伝子ではない。なお、付加又は置換する塩基の数は、読み枠を考慮して決定する。
上記の各サブユニットをコードする遺伝子と機能的に同等の遺伝子を、対応するサブユニットをコードする遺伝子として含む変異型グリセロールデヒドラターゼ遺伝子もまた本発明に包含される。
例えば、αサブユニットをコードする遺伝子としての「配列番号８の塩基配列からなる遺伝子」と機能的に同等の遺伝子としては、「配列番号８の塩基配列の全部又は一部からなる遺伝子に対し相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼのβサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」が挙げられる。また、各配列番号の塩基配列と少なくとも６５％の同一性、好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも８５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子も包含される。
より具体的には、一実施形態において、本発明の変異型グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子は、αサブユニットをコードする遺伝子、βサブユニットをコードする遺伝子、及びγサブユニットをコードする遺伝子を含み、
αサブユニットをコードする遺伝子が、以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子：
（ａ）配列番号８の塩基配列からなる遺伝子、
（ｂ）配列番号８の塩基配列の全部又は一部からなる遺伝子に対し相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼのβサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
であり、
βサブユニットをコードする遺伝子が、以下の（ｃ）〜（ｆ）から選択される遺伝子：
（ｃ）配列番号１０の塩基配列からなる遺伝子、
（ｄ）配列番号１０の塩基配列の全部又は一部からなる遺伝子に対し相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｅ）配列番号１０の５’末端に、配列番号４の５’末端の２７〜１９２個、より好ましくは１０５〜１８０個の塩基が付加した塩基配列からなる遺伝子
（ｆ）（ｅ）に記載の塩基配列の全部又は一部からなる遺伝子に対し相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
であり、
γサブユニットをコードする遺伝子が、以下の（ｇ）〜（ｊ）から選択される遺伝子：
（ｇ）配列番号１２の塩基配列からなる遺伝子、
（ｈ）配列番号１２の塩基配列の全部又は一部からなる遺伝子に対し相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｉ）配列番号１２の５’末端に、配列番号６の５’末端の１５〜１２６個、より好ましくは３０〜１０５個、さらに好ましくは４５〜７５個の塩基が付加した塩基配列からなる遺伝子
（ｊ）（ｉ）に記載の塩基配列の全部又は一部からなる遺伝子に対し相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
であるが、
βサブユニットをコードする遺伝子が（ｃ）又は（ｄ）であるときは、γサブユニットをコードする遺伝子は（ｇ）及び（ｈ）ではない。
本発明の変異型グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子の具体例としては、以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子が挙げられる：
（ａ）配列番号１７の塩基配列からなる遺伝子、
（ｂ）配列番号１７で表される塩基配列からなる遺伝子に対し相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
ここでストリンジェントな条件については、上記のとおりである。従って、本発明の変異型グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子には、配列番号１７の塩基配列に対し高い相同性（相同性又は同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）を有する塩基配列からなる遺伝子であって、グリセロールデヒドラターゼの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が包含される。グリセロールデヒドラターゼの活性を有するタンパク質については、上記のとおりである。
本発明の変異型ジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼには、他のペプチドが融合されたものも含まれる。融合に付される他のペプチドとしては、例えばＦＬＡＧ（Hopp, T. P. et. al., BioTechnology 6: 1204-1210,1988）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋ ｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃの断片、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、イムノグロブリンヒンジ領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。これらのペプチドを融合させることにより、レセプター誘導体の精製や標識を容易に実施することができる。
本発明の変異型ジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼの調製に使用されるベクターとしては、当技術分野において一般的に使用されるものを用いることができる。例えば、形質転換における宿主として大腸菌を用いる場合には、例えば、大腸菌内で複製させるための「ｏｒｉ」、及び形質転換された大腸菌を選抜するための遺伝子（例えば、アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等の薬剤耐性遺伝子）をベクター上に有することが望ましく、このようなベクターとして具体的には、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ２．１、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７等を挙げることができる。
特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば大腸菌での発現を目的とした場合は、ｌａｃＺプロモーター（Ward et. al., Nature 341: 544-546, 1989）、ａｒａＢプロモーター（Better et. al., Science 240: 1041-1043, 1988）、又はＴ７プロモーター等を有するベクターを例示することができる。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン）、ｐＥＧＦＰ、及びｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＬ２１が好ましい）等が挙げられる。また、発現ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。
他のベクターとしては、例えば哺乳動物由来の発現ベクター（例えばｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Nucleic Acids. Res. 18(17): 5322, 1990）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えばｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば「Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ」（インビトロゲン）、ｐＮＶ１１ 、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えばｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）等が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Mulligan et. al., Nature 277: 108, 1979）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１プロモーター（Mizushima et. al., Nucleic Acids Res. 18: 5322, 1990）、ＣＭＶプロモーター等を持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８等）耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えばｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３等が挙げられる。
また、複製開始点としては、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のために、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
ベクターが導入される宿主としては特に制限はなく、例えば大腸菌や種々の真核細胞等を用いることが可能である。真核細胞を使用する場合、例えば動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle, et. al., Nature 291: 358-340, 1981）、あるいは昆虫細胞、例えばＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, 1980）やＣＨＯ Ｋ−１（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60: 1275, 1968）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。植物細胞としては、例えばニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来の細胞が挙げられる。真菌細胞としては、酵母、例えばサッカロミセス（Saccharomyces）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えばアスペルギルス（Aspergillus）属、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）が知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞としては、大腸菌（E. coli）、例えばＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ、ＢＬ２１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
また、宿主として動物を使用する場合、哺乳類動物、植物、昆虫が挙げられる。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993）。また、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。さらに、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。
本発明の形質転換体を作製するためには、上記宿主に上記ベクターを導入する。そのための方法としては、大腸菌等の宿主細胞へのベクターの導入の場合、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法（Chu, G. et. al., Nucl. Acid Res. 15: 1311-1326, 1987）を用いることができる。また、培養細胞等の宿主細胞へのベクターの導入の場合、例えばリン酸カルシウム法（Chen, C. and Okayama, H. Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752, 1987）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata, M. A. et. al., Nucl. Acids Res. 12: 5707-5717, 1984、Sussman, D. J.and Milman, G. Mol. Cell. Biol. 4: 1642-1643, 1985）、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム）を用いた方法、リポフェクチン法（Derijard, B. Cell 7: 1025-1037, 1994、Lamb, B. T. et. al., Nature Genetics 5: 22-30, 1993、Rabindran, S. K. et. al., Science 259: 230-234, 1993）等の方法を用いることが可能である。
さらに、動物にＤＮＡを導入する場合、該ＤＮＡを適当なベクター（例えばアデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）等が挙げられるが、これらに制限されない）に組み込み、例えばレトロウイルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウィルス法等により生体内に導入することが可能である。
また、昆虫にベクターを導入する場合、例えば目的のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより行うことができる（Susumu, M. et. al., Nature 315: 592-594, 1985）。また植物にＤＮＡを導入する場合、例えば目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばニコチアナ・タバカムに感染させることでベクターを導入することができる（Julian K.-C. Ma et.al., Eur. J. Immunol. 24: 131-138, 1994）。
本発明に係る変異型ジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼは、上記の形質転換体を培養することにより生産させることができる。培養は公知の方法に従って行うことができる。例えば、動物細胞の培養であれば、一般的に、培養液としては、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭ等を使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、通常、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜５００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
本発明の変異型ジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼは、宿主細胞内又は細胞外（培地等）から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えばクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタンパク質を分離、精製することができる。又は、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製することが可能である。
クロマトグラフィーとしては、例えば上記のエピトープタグに対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed DanielR. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。
また、本発明の変位型ジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えタンパク質として宿主細胞（例えば動物細胞や大腸菌等）内で発現させた場合には、発現させた組み換えタンパク質はグルタチオンカラム又はニッケルカラムを用いて精製することができる。融合タンパク質の精製後、必要に応じて融合タンパク質のうち、目的のタンパク質以外の領域を、トロンビン又はファクターＸａ等により切断し、除去することも可能である。
本発明はまた、本発明の変異型ジオールデヒドラターゼ及び／又はグリセロールデヒドラターゼにより、１位及び２位に水酸基を有する脂肪族ポリオールを脱水して、１位にアルデヒド基を有するアルデヒドを生成する方法に関する。
上記方法は、１位及び２位に水酸基を有する脂肪族ポリオールと本発明の変異型ジオールデヒドラターゼ及び／又はグリセロールデヒドラターゼとを反応させることにより実施できる。本発明の方法は、１位及び２位に水酸基を有する脂肪族ポリオールと変異型ジオールデヒドラターゼ又はグリセロールデヒドラターゼのいずれかとを反応させてもよいし、双方の酵素と反応させてもよい。
酵素反応条件は、当業者であれば適宜設定できるが、通常、アデノシルコバラミン（補酵素Ｂ１２）の存在下、０．１Ｍ程度の１，２-プロパンジオール水溶液と酵素を接触させることにより発生するプロピオンアルデヒドを検出することで酵素活性の測定をすることが可能である。活性確定後に、基質量に応じた酵素量を設定し反応条件を決定していく。
あるいは、１位及び２位に水酸基を有する脂肪族ポリオール及びアデノシルコバラミン（補酵素Ｂ１２）の存在下で、上記変異型ジオールデヒドラターゼ及び／又はグリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子を含む形質転換体を培養することにより実施できる。形質転換体は、変異型ジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子のみ又は変異型グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子のみを含んでいてもよいし、双方の遺伝子を含んでいてもよい。
培養条件は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って、炭素源として１位及び２位に水酸基を有する脂肪族ポリオールを用いることにより行われる。例えば、比較的リッチな培地、例えば２培地等を用いて好気培養し、菌体量を増やしてから嫌気条件にし、炭素源を与えて発酵を行う。ｐＨは、宿主の生育を妨害せず、かつ発酵液から酸を分離するときの障害とならない試薬を用いて調整する。炭酸ナトリウム、アンモニア、ナトリウムイオン供給源、例えば塩化ナトリウムを添加してもよい。また、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化アンモニウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液等の一般的なアルカリ試薬を用いてもよい。培養期間中ｐＨは、５．０〜８．０、好ましくは５．５〜７．５に保持する。培養は、通常５％ＣＯ２存在下、３０〜４０℃で１〜３０日間行う。
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。また、無機物としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
培養中は、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、インデューサーを培地に添加することもできる。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加することができる。
あるいは、上記において得られた形質転換体の培養物から遠心分離などによって集菌を行い、適当な緩衝液に懸濁する。この菌体懸濁液を１位及び２位に水酸基を有する脂肪族ポリオールを含む緩衝液に懸濁し、反応を行ってもよい。反応の条件は、例えば、反応温度は１０〜８０℃、好ましくは１５〜５０℃、反応時間は５分〜９６時間、好ましくは１０分〜７２時間、ｐＨは５．０〜８．０、好ましくは５．５〜７．５である。
また、該培養物の処理物を用いて反応を行うこともできる。該処理物としては、菌体破砕物、菌体破砕物又は培養上清から調製した粗酵素、精製酵素等が挙げられる。また、常法により担体に固定化した菌体、該処理物、酵素等を用いることができる。
１位及び２位に水酸基を有する脂肪族ポリオールとしては、１，２−ジオール（炭素数２〜６、好ましくは２〜４の１，２−アルカンジオールおよびその誘導体、例えば、１，２−プロパンジオール）及びグリセロール、１,２-ブタンジオール、エチレングリコール、１，２，３，４−ブタンテトラオール、１，２，３-ブタントリオール、１，２，４-ブタントリオール、１−モノグリセリド等が挙げられる。１，２−ジオールを基質とする場合には、ジオールデヒドラターゼが好ましく、グリセロールを基質とする場合には、グリセロールデヒドラターゼが好ましい。
１位及び２位に水酸基を有する脂肪族ポリオールは、本発明の変異型ジオールデヒドラターゼ又はグリセロールデヒドラターゼの触媒作用により、１位にアルデヒド基を有するアルデヒドに変換される。具体的には、本発明の方法により、１，３−プロパンジオールはプロピオンアルデヒドに変換され、グリセロールは３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに変換される。
本発明の変異型ジオールデヒドラターゼは水溶性であることから、親水性の条件下では、変異型ジオールデヒドラターゼよる反応を行うのが好ましい。また、本発明の変異型グリセロールデヒドラターゼは水に不溶性であることから、疎水性の条件下では、変異型グリセロールデヒドラターゼによる反応を行うのが好ましい。変異型ジオールデヒドラターゼ及びジオールデヒドラターゼを共存させて反応を行うことにより、反応系における親水場では変異型ジオールデヒドラターゼよる触媒反応を行い、さらに反応系における疎水場では変位型グリセロールデヒドラターゼによる触媒反応を行うことができる。また、野生型ジオールデヒドラターゼと変異型ジオールデヒドラターゼを共存させて反応させたり、野生型グリセロールデヒドラターゼと野生型グリセロールデヒドラターゼを共存させて反応させることにより、反応効率を改善することができる。
本発明の方法は、その他の反応を含む複合的反応の一部として、１位及び２位に水酸基を有する脂肪族ポリオールを脱水して、１位にアルデヒド基を有するアルデヒドを生成する場合も包含する。例えば、Klebsiella属細菌及びCitrobacter属細菌などにおいては、グリセロールは２段階の酵素触媒反応を経て、１，３−プロパンジオールに変換されるが、第１段階において、グリセロールデヒドラターゼがグリセロールを３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）及び水へ変換し（グリセロール→３−ＨＰＡ＋Ｈ２Ｏ）、第２段階において、３−ＨＰＡがＮＡＤ＋−結合オキシドレダクターゼにより１，３−プロパンジオールに還元される（３−ＨＰＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋→１，３−プロパンジオール＋ＮＡＤ＋）。本発明の方法は、上記のような複合反応における第１段階の反応において利用することもできる。
実施例１ 組換え型ジオールデヒドラターゼのトリプシン処理
ジオールデヒドラターゼ遺伝子を発現している組換え体大腸菌を、２％ １，２−プロパンジオールを含む５０ｍＭ リン酸カリウムバッファ（ｐＨ８．０）中で、超音波処理により破砕した。沈澱を同じバッファで３回洗浄した（Tobimatsu, T. et al., Arch. Biochem. Biophys., 347, 132-140 (1997)）。得られた粗製の膜画分を種々の濃度のトリプシンを含む同一のバッファ中に、タンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように再懸濁した。１５℃で１２時間インキュベートした後、過剰のダイズトリプシン阻害剤（４００μｇ／ｍｌ）を添加することにより反応を停止した。得られた懸濁液を遠心分離し（１６，０００×ｇ、３０分）、可溶性画分（上清）及び沈澱画分を分離した。その後、上清の酵素活性（白色）及び沈澱画分の酵素活性（黒色）を測定した（図１Ａ）。１．０μｇ／ｍｌのトリプシンで処理することにより得られる可溶性画分に含まれるジオールデヒドラターゼ、すなわち水溶性の変異型ジオールデヒドラターゼは、酵素活性を失うことなく可溶化されていることがわかる。
ジオールデヒドラターゼの活性は、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン法により、基質として１，２−プロパンジオールを用いて測定した（Toraya, T. et al., J. Biol. Chem., 252, 963-970 (1977)）。ジオールデヒドラターゼの１ユニットは、１分あたり１μｍｏｌのプロピオンアルデヒドの生成を触媒する酵素活性の量として定義した。野生型ジオールデヒドラターゼの溶解性は非常に低いことから、アッセイするホモジェネート、抽出物及び酵素溶液は、２％ １，２−プロパンジオール及び０．５〜１％のＢｒｉｊ３５を含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファ（ｐＨ８．０）で希釈した。
トリプシン消化した後の、上清及び沈澱画分に含まれるタンパク質を、１１％ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図１Ｂ）。その結果、沈澱画分においては、分子量３０，０００のβサブユニット、分子量１９，０００のγサブユニットが観察されるのに対し、１．０μｇ／ｍｌのトリプシンで処理することにより得られる可溶性画分においては、分子量２７，０００のβサブユニット、分子量１７，０００のγサブユニットが主に観察された。可溶性画分に含まれるβサブユニットとγサブユニットのアミノ酸配列を解析したところ、分子量２７，０００のβサブユニットは、βサブユニットのＮ末端の２０アミノ酸が欠失したものであり、分子量１７，０００のγサブユニットは、γサブユニットのＮ末端の１６アミノ酸が欠失したものであった。なお、αサブユニットにおいては、トリプシン処理による分子量の減少は観察されなかった。
ジオールデヒドラターゼをトリプシンで限定的にタンパク質分解したときの、α、β及びγサブユニットのＮ末端領域の断片化パターンを示す（図１Ｃ）。
実施例２ 発現プラスミドの構築
実施例１の結果から、βサブユニットのＮ末端から２０アミノ酸を欠失させることにより、及び／又はγサブユニットのＮ末端から１６アミノ酸を欠失させることにより、ジオールデヒドラターゼを水溶性に変化させることができるかどうかを試験するため、βサブユニット及び／又はγサブユニットにおいてＮ末端アミノ酸配列が欠失した変異型ジオールデヒドラターゼを産生するための発現プラスミドを以下のように構築した。
βサブユニットのＮ末端２０アミノ酸のみが欠失したジオールデヒドラターゼに対する発現プラスミドをｐＵＳＩ２Ｅ（αＤβ’ＤγＤ）とし、γサブユニットのＮ末端１６アミノ酸のみが欠失したジオールデヒドラターゼに対する発現プラスミドをｐＵＳＩ２Ｅ（αＤβＤγＤ）と記載し、β及びγサブユニットの双方のＮ末端アミノ酸が欠失したジオールデヒドラターゼに対する発現プラスミドをｐＵＳＩ２Ｅ（αＤβ’Ｄγ’Ｄ）とする。また、Ｎ末端２０アミノ酸が欠失したβサブユニットをβ’サブユニットと記載し、Ｎ末端１６アミノ酸が欠失したγサブユニットをγ’サブユニットと記載する場合もある。
ｐＵＳＩ２Ｅ（Tobimatsu, T.et al., J. Biol. Chem., 270, 7142-7148 (1995)）をＮｄｅＩを用いて部分的に消化し、４種のｄＮＴＰの存在下、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理した。そしてセルフライゲーションにより、プラスミドｐＵＳＩ２ＥＮｄを作成した。ｐＵＳＩ２Ｅ（ＤＤ）からの３．０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ ＤＮＡフラグメントを、ｐＵＳＩ２ＥＮｄのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ領域に挿入し、ｐＵＳＩ２ＥＮｄ（ＤＤ）を作成した。ジオールデヒドラターゼの各サブユニットにおいて、Ｎ末端２０アミノ酸が欠失したβ’サブユニットをコードするＤＮＡセグメント及びＮ末端１６アミノ酸が欠失したγ’サブユニットをコードするＤＮＡセグメントを、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン）及び以下のプライマー対を用いたＰＣＲにより増幅した。
β’サブユニット：
５’−ＧＣＧＡＧＣＡＴＡＴＧＧＧＣＡＧＣＧＡＴＡＡＡＣＣＧ−３’（配列番号１３）
５’−ＴＣＡＧＡＴＣＴＴＡＡＡＧＣＧＣＣＡＣＧＣＧＣＡＧ−３’（配列番号１４）
γ’サブユニット：
５’−ＴＴＧＡＧＣＣＡＴＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣ−３’（配列番号１５）
５’−ＡＧＡＧＡＴＣＴＴＡＡＴＣＧＴＣＧＣＣＴＴＴＧＡＧ−３’（配列番号１６）
増幅した６４０ｂｐ及び５００ｂｐのＤＮＡフラグメントを、ＴＡクローニングキット（インビトロジェン）を用いてｐＣＲ２．１ベクターにクローニングし、ＮｄｅＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、ｐＵＳＩ２ＥＮｄ（ＤＤ）からの５．０ｋｂのＮｄｅＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントに連結し、プラスミドｐＵＳＩ２ＥＮｄ（β’Ｄ）及びｐＵＳＩ２ＥＮｄ（γ’Ｄ）をそれぞれ作成した。プラスミドｐＵＳＩ２Ｅ（αＤ）（Tobimatsu, T. et al., Arch. Biochem. Biophys., 347, 132-140 (1997)）を、ＢｇｌＩＩで消化し、ｐＵＳＩ２ＥＮｄ（β’Ｄ）から得られた０．７ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントに連結し、プラスミドｐＵＳＩ２Ｅ（αＤβ’Ｄ）を得た。プラスミドｐＵＳＩ２Ｅ（αＤβ’Ｄ）をＢｇｌＩＩで消化し、ｐＵＳＩ２ＥＮｄ（γ’Ｄ）及びｐＵＳＩ２ＥＮｄ（γＤ）から得られた０．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントに連結し、プラスミドｐＵＳＩ２Ｅ（αＤβ’Ｄγ’Ｄ）及びｐＵＳＩ２Ｅ（αＤβ’ＤγＤ）をそれぞれ作成した。プラスミドｐＵＳＩ２Ｅ（αＤβＤ）をＢｇｌＩＩで消化し、ｐＵＳＩ２ＥＮｄ（γ’Ｄ）から得られた０．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントに連結し、プラスミドｐＵＳＩ２Ｅ（αＤβＤγ’Ｄ）を得た。配列決定により、ＰＣＲ増幅中に望ましくない変異が起こっていないことを確認した。
発現プラスミドによる大腸菌の形質転換及び形質転換体の培養は、Tobimatsu, T.et al., J. Biol. Chem., 270, 7142-7148 (1995)に記載された方法と同様に実施した。
各変異型酵素を発現している組換え体大腸菌の細胞ホモジェネート（ｈｏｍｏ）、上清（ｓｕｐ）及び沈澱画分（ｐｐｔ）に含まれるタンパク質を、１１％ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、タンパク質染色を行った。分子量マーカーとしてＳＤＳ−７（Ｓｉｇｍａ）を用いた。α、β、β’、γ及びγ’サブユニットの位置を、右側の矢印によって示す（図２）。
沈澱画分（ｐｐｔ）の結果を見ると、ジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子を含む組換え体大腸菌（以下、変異株と称する場合もある）においてβ’及びγ’サブユニットのバンドは、野生株のβ及びγサブユニットのバンドほど濃いバンドではないことがわかる。一方、上清（ｓｕｐ）の結果を見ると、変異株におけるβ’及びγ’サブユニットのバンドは、野生型ジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子を含む組換え体大腸菌（以下、野生株と称する場合もある）のβ及びγサブユニットのバンドより濃いことがわかる。以上からβ及び／又はγサブユニットのＮ末端が欠失したジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子を含む変異株において、水溶性のジオールデヒドラターゼが産生されたことがわかる。
実施例３ 上清及び沈澱におけるジオールデヒドラターゼ活性
実施例２で得られた各発現プラスミドを有する組換え体大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（９．２〜９．８×１０１０）を洗浄し、２％ １，２−プロパンジオールを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファ（ｐＨ８．０）２．６ｍｌに再懸濁し、超音波処理により破砕した。得られた細胞ホモジェネートを遠心分離し（１７，５００×ｇ、３０分）、上清及び沈澱画分を分離した。得られた沈澱を２．６ｍｌの同じバッファで洗浄し、２％ １，２−プロパンジオール及び１％ Ｂｒｉｊ３５を含む１０ｍＭ リン酸カリウムバッファ（ｐＨ８．０）に再懸濁し同じ体積とした。ジオールデヒドラターゼ活性は、適切に希釈した後で実施例１と同様に測定した。結果を以下の表１に示す。
Figure 2006296420
表１の結果から、可溶性画分に回収されたジオールデヒドラターゼの割合は、いずれの変異株においても９６％を超えていたが、野生株においては、２％に過ぎなかった。以上から本発明の変異型ジオールデヒドラターゼが高度に水溶性であることがわかる。また、野生型ジオールデヒドラターゼにおいては、β及びγサブユニットのＮ末端アミノ酸領域が、この酵素の沈澱や凝集に必須であることがわかる。また、変異型ジオールデヒドラターゼが酵素活性を有することから、水溶性の変異型ジオールデヒドラターゼが酵素活性を有することもわかる。
実施例４ 変異型ジオールデヒドラターゼと野生型ジオールデヒドラターゼの比較
αサブユニット、β’サブユニット及びγ’サブユニットを含む変異型ジオールデヒドラターゼ、野生型ジオールデヒドラターゼ、並びに１．０μｇ／ｍｌのトリプシンで、１５℃で１２時間処理したジオールデヒドラターゼを比較するため、プラスミドｐＵＳＩ２Ｅ（αＤβ’Ｄγ’Ｄ）を有する大腸菌の無細胞抽出物をＰＡＧＥに付した。無細胞抽出物のＰＡＧＥは、０．１Ｍの１，２−プロパンジオールの存在下、Davis, B.J., Ann. N. Y. Acad. Sci., 121, 404-427 (1964)）に記載の非変性条件下で、又はLaemmli, U.K., Nature, 227, 680-685 (1970)に記載の変性条件下で実施した。ウェスタンブロット分析は、Tobimatsu, T. et al., J. Biol. Chem., 270, 7142-7148 (1995)に記載の方法に従って実施した（図３）。
非変性条件下の５％ゲル上のＰＡＧＥの後、タンパク質染色（図３Ａ）又は活性染色（図３Ｂ）を実施した。野生型及びトリプシン消化ジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼの位置を、右側の矢印により示す。酵素活性を示すタンパク質バンドを切り出し、１１％ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、タンパク質染色した（図３Ｃ）。タンパク質染色は、クマシーブリリアントブルー Ｒ−２５０を用いて実施した。サブユニットの位置を、右側の矢印で示す。分子量マーカーとしてＳＤＳ−７（Ｓｉｇｍａ）を用いた。
図３Ａ及びＢに示されるように、ジオールデヒドラターゼ活性を示すバンドは、変異型ジオールデヒドラターゼを含む無細胞抽出物にのみ観察された。この活性なバンドをゲルから切り出してＳＤＳ−ＰＡＧＥに付したところ、観察された３種のペプチドのバンドは、ジオールデヒドラターゼのトリプシン処理によって得られる分子量６０，０００、２３，０００及び１７，０００のバンドと一致した（図３Ｃ）。
以上からプラスミドｐＵＳＩ２Ｅ（αＤβ’Ｄγ’Ｄ）を有する大腸菌によって産生された組換え体変異型ジオールデヒドラターゼが触媒活性を有すること、並びに、分子量６０、０００、２３，０００及び１７，０００のサブユニットを含むことが確認された。
実施例５ 変異型ジオールデヒドラターゼの精製及び分析
ｐＵＳＩ２Ｅ（αＤβ’Ｄγ’Ｄ）を有する大腸菌３．３ｇから、超音波処理により無細胞抽出物を調製した。該無細胞抽出物の硫安分画（４０〜５０％）により得られた沈澱を２％ １，２−プロパンジオールを含むバッファに溶解し、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂカラム（３５０ｍＬ）にロードした。４ユニット／ｍｇを超える比活性を有する酵素を含む画分を回収した。該酵素溶液をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）で濃縮し、４ｖｏｌの２％ １，２−プロパンジオールと混合した。該溶液を、予め２％ １，２−プロパンジオールを含む１０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ８）で平衡化しておいたＤＥＡＥセルロース（Ｓｅｒｖａ）カラム（１ｍＬ）にロードした。カラムを同じバッファの５ｖｏｌで洗浄し、５０ｍＭ ＫＣｌを含む同じバッファ、続いて１００ｍＭ ＫＣｌを含む同じバッファの５ｖｏｌで展開した。３５ユニット／ｍｇを超える比活性を有する精製酵素を、酵素の特性決定に使用した。タンパク質は、Lowry, O.H. et al., J. Biol. Chem., 193, 265-275 (1951)に記載の方法により、結晶化ウシ血清アルブミンを標準として用いて、アッセイした。比活性はユニット／タンパク質（ｍｇ）として記載した。
得られた変異型ジオールデヒドラターゼ（αβ’γ’）調製物の比活性は４７ユニット／ｍｇであった。デンシトメトリー分析により、得られた変異型ジオールデヒドラターゼの純度は５５％であったことから、この変異型ジオールデヒドラターゼの比活性は８５ユニット／ｍｇであると考えられる。この比活性の値は、K. oxytocaから水溶性の形態で精製されたジオールデヒドラターゼの比活性（９１．５ユニット／ｍｇ）及び野生型のジオールデヒドラターゼの比活性（１０６ユニット／ｍｇ）に匹敵するものであった。
また、基質としてのＤＬ−１，２−プロパンジオールに対するＫｍ値は、変異型ジオールデヒドラターゼで０．１１ｍＭであり、野生型ジオールデヒドラターゼで０．１０ｍＭであった。以上から、本発明の変異型ジオールデヒドラターゼが、野生型のジオールデヒドラターゼと比べ、触媒活性において同等であることがわかる。
実施例６ 疎水化グリセロールデヒドラターゼの調製
グリセロールデヒドラターゼ（ＧＤ）とジオールデヒドラターゼ（ＤＤ）のサブユニットは高い相同性を有しているが、βとγサブユニットのＮ末端領域は、ＧＤが短く、更にβサブユニットはそれに続く３０数アミノ酸残基がなくなっている（図４）。ＤＤで余分に付いているＮ末端領域だけでなく、βサブユニットの相同性が低い領域も酵素の低溶解性に関与する可能性がある。
変異型酵素として、βおよびγサブユニットがそれぞれ下向き矢印＃２と＃３までＤＤの配列を持ちそれ以降をＧＤの配列を持つ変異体２（αＧＮβＤ２Ｇ２γＤＧ）を作成した。すなわち、変異体２は、グリセロールデヒドラターゼ（ＧＤ）のβサブユニットのＮ末端の１〜２７番目のアミノ酸をジオールデヒドラターゼ（ＤＤ）のＮ末端の１〜６０番目のアミノ酸に置き換え、さらにγサブユニットのＮ末端の１番目のアミノ酸をジオールデヒドラターゼ（ＤＤ）のＮ末端の１〜３３番目のアミノ酸に置き換えたグリセロールデヒドラターゼ変異体である。上記変異体の遺伝子構造の概略を図５に示す。また得られる変異体２の塩基配列を配列番号１７に示す。変異体２においてαサブユニットのアミノ酸配列を配列番号１８に、βサブユニットのアミノ酸配列を配列番号１９に、γサブユニットのアミノ酸配列を配列番号２０に示す。
上記変異型グリセロールデヒドラターゼ（変異体２）を産生するための発現プラスミド：ｐＮＥＸ（αＧＮβＤ２Ｇ２γＤＧ）を実施例２と同様に構築した。
ｐＮＥＸベクターの構造を図６に示す。またｐＮＥＸ（αＧ）の作成手順を図７に示す。ｐＵＳＩ２Ｅ（αＧ）も同様に作成した。挿入ＤＮＡ断片（図８）は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン）及び図９に示すプライマー対を用いたＰＣＲにより増幅した。得られるＰＣＲ断片を図１０に示す。ＰＣＲはＫＯＤ Ｄａｓｈにて、以下の条件のｓｔｅｐ ｄｏｗｎ ＰＣＲ法で行った。
Figure 2006296420
増幅断片をｐＮＥＸ（αＧ）またはｐＵＳＩ２Ｅ（αＧ）に連結することにより、発現プラスミドを作成した。
発現プラスミドによる大腸菌の形質転換及び形質転換体の培養は、Tobimatsu, T.et al., J. Biol. Chem., 270, 7142-7148 (1995)に記載された方法と同様に実施した。
各変異型酵素を発現している組換え体大腸菌をトルエン処理し（図１１）、細胞破壊と分離操作を行った（図１２）。組換え体大腸菌の細胞ホモジェネート（ｈｏｍｏ）、上清（ｓｕｐ）、沈澱画分（ｐｐｔ）及び洗液（ｗａｓｈ）に含まれるタンパク質を、１１％ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、タンパク質染色を行った（図１３）。
またそれぞれの画分についてグリセロールデヒドラターゼ活性を測定した。コントロールとして野生型（ＷＴ）のジオールデヒドラターゼを用いた。結果を以下の表に示す。
Figure 2006296420
大腸菌で組み換え体として発現させた野生型のグリセロールデヒドラターゼ（ＧＤ）の場合は、酵素活性の大部分が上清画分にみられ可溶型で存在することが報告されているが（Yamanishi M, et al., Eur. J. Biochem. 269,4484-494 (2002); Tobimatsu T, et al., J. Biol. Chem., 271(37), 22352-22357(1996)）、表３より、変異体２では、酵素活性の大半が沈澱画分にみられたことから、ＧＤが低溶解性化していることが明らかである。すなわち、本発明により、変異型グリセロールデヒドラターゼの水に対する溶解性が変化し、疎水性のグリセロールデヒドラターゼが得られたことが示された。
トリプシン消化がジオールデヒドラターゼの活性と溶解性に及ぼす影響を示す。 Ｎ末端アミノ酸が欠失したβ及び／又はγサブユニットを有する変異型ジオールデヒドラターゼの大腸菌における発現及び分布を示す。 αβ’γ’変異型ジオールデヒドラターゼとトリプシン消化ジオールデヒドラターゼとの比較を示す。 Klebsiella pneumoniae由来のグリセロールデヒドラターゼ（ＧＤ）とKlebsiella oxytoca由来のジオールデヒドラターゼ（ＤＤ）の各サブユニットのアミノ酸配列の相同性を示す。 変異体２の遺伝子構造の概略図を示す。 ｐＮＥＸベクターの構造を示す。 ｐＮＥＸ（αＧ）の作成手順を示す。 挿入ＤＮＡ断片（ＮβＤＧγＤＧ）を示す。 実施例６で発現プラスミドの作成においてＰＣＲに用いたプライマー対及びプライマー領域の相補性を示す。↓のところがジオールデヒドラターゼとグリセロールデヒドラターゼとがつながる場所を示す。 図９に示したプライマー対を用いて得られるＰＣＲ断片を示す。 組換え体大腸菌をトルエン処理した手順を示す。 組換え体大腸菌をトルエン処理した後、細胞破壊と分離操作を行った手順を示す。 変異型グリセロールデヒドラターゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、タンパク質染色を行った結果を示す。

Claims (20)

  1. ジオールデヒドラターゼ又はグリセロールデヒドラターゼのβサブユニット及び／又はγサブユニットにおいてＮ末端アミノ酸を変異させることにより、ジオールデヒドラターゼ又はグリセロールデヒドラターゼの水に対する溶解性を変化させる方法。
  2. Ｎ末端アミノ酸の変異が、
    ジオールデヒドラターゼを構成するβサブユニット及び／又はγサブユニットにおけるＮ末端アミノ酸を欠失させること、又は
    グリセロールデヒドラターゼを構成するβサブユニット及び／又はγサブユニットにおけるＮ末端に、ジオールデヒドラターゼの対応するサブユニットのＮ末端アミノ酸を付加すること、
    を含む、請求項１記載の方法。
  3. ジオールデヒドラターゼのβサブユニット及び／又はγサブユニットにおけるＮ末端アミノ酸の変異が、
    ジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の９〜６４個のアミノ酸を欠失させること、及び／又は
    ジオールデヒドラターゼのγサブユニットのＮ末端の５〜４２個のアミノ酸を欠失させること
    を含む請求項２記載の方法。
  4. グリセロールデヒドラターゼのβサブユニット及び／又はγサブユニットにおけるＮ末端アミノ酸の変異が、
    グリセロールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端に、ジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の９〜６４個のアミノ酸を付加すること、
    グリセロールデヒドラターゼのγサブユニットのＮ末端に、ジオールデヒドラターゼのγサブユニットのＮ末端の５〜４２個のアミノ酸を付加すること
    を含む請求項２記載の方法。
  5. αサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを含むジオールデヒドラターゼであって、
    βサブユニットのＮ末端の９〜６４個のアミノ酸が欠失しており、及び／又はγサブユニットのＮ末端の５〜４２個のアミノ酸が欠失しており、かつ水溶性である前記ジオールデヒドラターゼ。
  6. αサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを含むジオールデヒドラターゼであって、
    αサブユニットが以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
    （ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｂ）配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ジオールデヒドラターゼのβサブユニット及びγサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
    であり、
    βサブユニットが以下の（ｃ）〜（ｆ）から選択されるタンパク質：
    （ｃ）配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｄ）配列番号３において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ジオールデヒドラターゼのαサブユニット及びγサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
    （ｅ）配列番号３においてＮ末端の９〜６４個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｆ）（ｅ）に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ジオールデヒドラターゼのαサブユニット及びγサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
    であり、
    γサブユニットが以下の（ｇ）〜（ｊ）から選択されるタンパク質：
    （ｇ）配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｈ）配列番号５において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ジオールデヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
    （ｉ）配列番号５においてＮ末端の５〜４２個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｊ）（ｉ）に記載アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ジオールデヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットと会合したときにジオールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質
    であり、
    ただし、βサブユニットが（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であるときγサブユニットは（ｇ）及び（ｈ）のタンパク質ではない、前記ジオールデヒドラターゼ。
  7. 請求項５又は６記載のジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子。
  8. 請求項７記載の遺伝子を含むベクター。
  9. 請求項８記載のベクターを含む形質転換体。
  10. αサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを含むグリセロールデヒドラターゼにおいて、
    βサブユニットのＮ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の９〜６４個のアミノ酸が付加しており、及び／又はγサブユニットのＮ末端にジオールデヒドラターゼのβサブユニットのＮ末端の５〜４２個のアミノ酸が付加しており、かつ水に不溶性である前記グリセロールデヒドラターゼ。
  11. αサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを含むグリセロールデヒドラターゼにおいて、
    αサブユニットが以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
    （ａ）配列番号７のアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｂ）配列番号７において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのβサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
    であり、
    βサブユニットが以下の（ｃ）〜（ｆ）から選択されるタンパク質：
    （ｃ）配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｄ）配列番号９において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
    （ｅ）配列番号９のＮ末端に配列番号３のＮ末端の９〜６４個のアミノ酸が付加してなるアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｆ）（ｅ）に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
    であり、
    γサブユニットが以下の（ｇ）〜（ｊ）から選択されるタンパク質：
    （ｇ）配列番号１１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｈ）配列番号１１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
    （ｉ）配列番号１１のＮ末端に配列番号５のＮ末端の５〜４２個のアミノ酸が付加してなるアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｊ）（ｉ）に記載アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質
    であり、
    ただし、βサブユニットが（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であるときγサブユニットは（ｇ）及び（ｈ）のタンパク質ではない、前記グリセロールデヒドラターゼ。
  12. 請求項１０又は１１記載のグリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子。
  13. 請求項１２記載の遺伝子を含むベクター。
  14. 請求項１３記載のベクターを含む形質転換体。
  15. 以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子：
    （ａ）配列番号１７の塩基配列からなる遺伝子、
    （ｂ）配列番号１７で表される塩基配列からなる遺伝子に対し相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグリセロールデヒドラターゼの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
  16. 請求項１５記載の遺伝子を含むベクター。
  17. 請求項１６記載のベクターを含む形質転換体。
  18. αサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを含むグリセロールデヒドラターゼにおいて、
    αサブユニットが以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
    （ａ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｂ）配列番号１８において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのβサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
    であり、
    βサブユニットが以下の（ｃ）〜（ｆ）から選択されるタンパク質：
    （ｃ）配列番号９のアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｄ）配列番号９において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
    （ｅ）配列番号１９のアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｆ）配列番号１９において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びγサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
    であり、
    γサブユニットが以下の（ｇ）〜（ｊ）から選択されるタンパク質：
    （ｇ）配列番号１１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｈ）配列番号１１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
    （ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｊ）配列番号２０において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グリセロールデヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットと会合したときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する前記タンパク質、
    であり、
    ただし、βサブユニットが（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であるときγサブユニットは（ｇ）及び（ｈ）のタンパク質ではない、前記グリセロールデヒドラターゼ。
  19. １位及び２位に水酸基を有する脂肪族ポリオールを脱水して、１位にアルデヒド基を有するアルデヒドを生成する方法あって、
    １位及び２位に水酸基を有する脂肪族ポリオールと請求項５若しくは６記載のジオールデヒドラターゼ及び／又は請求項１０、１１若しくは１８記載のグリセロールデヒドラターゼとを反応させることを含む前記方法。
  20. １位及び２位に水酸基を有する脂肪族ポリオールを脱水して、１位にアルデヒド基を有するアルデヒドを生成する方法あって、
    １位及び２位に水酸基を有する脂肪族ポリオールの存在下、請求項７記載のジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子及び／又は請求項１２若しくは１５記載のグリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子を含む形質転換体を培養することを含む前記方法。
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