JP2006298780A - Ｈｇｆ遺伝子と粗大凝集アルブミン−ポリエチレンイミン（ｍａａ−ｐｅｉ）との複合体 - Google Patents

Abstract

【課 題】 肺疾患の治療剤を提供することである。
【解決手段】ＨＧＦをコードするＤＮＡと粗大凝集アルブミン−ポリエチレンイミン（ＭＡＡ−ＰＥＩ）との複合体及びそれらを含有することを特徴とする肺疾患治療用注射剤。
【選択図】なし

Description

本発明は、肝細胞増殖因子（以下、ＨＧＦと略記する。）をコードするＤＮＡと粗大凝集アルブミン−ポリエチレンイミン（以下において、粗大凝集アルブミン−ポリエチレンイミンをＭＡＡ−ＰＥＩとも表示する。）とが結合してなる複合体及びそれを含有する肺疾患治療用注射剤に関する。

肺傷害疾患としては、例えば、肺炎、肺気腫、肺結核、慢性閉塞性肺疾患などが挙げられ、特に、肺の線維化による傷害（例えば、塵肺など）、免疫力の低下した患者や老人の罹患する嚥下性肺炎等は予後不良の経過をとることがあり、その治療剤の確立が強く望まれている。

肺に傷害が加わった時には、ＨＧＦが肺自身で新たに産生され、ＨＧＦが肺のＨＧＦレセプターを介して肺の上皮細胞でのＤＮＡ合成を促進し、肺組織での細胞増殖が上昇され、肺傷害の修復が促進されることが知られている。このため、ＨＧＦ又はＨＧＦ遺伝子を含有する肺疾患の予防剤又は治療剤が提案されている。（特許文献１を参照。）。しかし、投与されるＨＧＦのほとんどが肝臓に取り込まれ、肺ではほとんど検出されないか、検出されても投与したＨＧＦの１０％以下の僅かな量であることが報告されている（非特許文献１参照。）。このため、肺をＨＧＦのターゲット器官とするには、ＨＧＦを多量に投与する必要がある。

また、肺線維症のＨＧＦ遺伝子治療の実験的な試みには、ベクターとして主にアデノウイルスベクターが使われてきた。しかし、アデノウイルスベクターは様々な炎症を惹起することが知られており、慢性炎症性疾患である肺線維症に臨床応用するには解決すべき問題が多く、実用化には至っていないのが現状である。

なお、ポリエチレンイミンと遺伝的高分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、触媒的活性核酸等）を用いた製剤は高レベルの肺トランスフェクションをもたらし、噴霧化中にも安定であることが示された（特許文献２を参照。）。そして、前記製剤は、経口吸入及び鼻吸入により肺に投与されることで、嚢胞性線維症、喘息、肺癌、食道癌、結腸癌、白血病、乳癌、肉腫、及び黒色腫等を治療し得ることが記載されている。
しかし、上記いずれの文献にも、ＨＧＦに関する記載は認められない。
特開平０６−１７２２０７号公報 特表２００２−５４１１２５号公報 モリヒロ・カト（ＭＯＴＯＨＩＲＯ ＫＡＴＯ）他４名、ザ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー・アンド・エクスペリメンタル・セラポイティクス（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、１９９９年、第２９０巻、ｐ．３７３−３７９

本発明は、ＨＧＦをコードするＤＮＡとＭＡＡ−ＰＥＩとが結合してなる複合体及びそれらを含有する肺疾患治療用注射剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、粗大凝集アルブミンが、肺の毛細血管を通過することができずに一時的に捕捉され，一過性の微小塞栓となって肺に選択的に集積し得ることに注目し、ＨＧＦをコードするＤＮＡとＭＡＡ−ＰＥＩとが結合してなる複合体が、粗大凝集アルブミンと同様肺に選択的に集積し、かつ該集積部位でＤＮＡを発現しＨＧＦを産生し得ることを見出した。本発明者らは、さらに研究をすすめ本発明を完成した。

すなわち、本発明は、
（１）ＨＧＦをコードするＤＮＡと粗大凝集アルブミン−ポリエチレンイミン（ＭＡＡ−ＰＥＩ）とが結合してなる複合体、
（２）ＤＮＡが次のいずれかであることを特徴とする前記（１）に記載の複合体；
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（３）ＤＮＡが次のいずれかであることを特徴とする前記（１）に記載の複合体；
（ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｂ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（４）ＤＮＡが発現ベクターに挿入されていることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載の複合体、
（５）発現ベクターがプラスミドであることを特徴する前記（４）記載の複合体、
（６）複合体の粒子径が１０μｍ以上１００μｍ未満であることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれかに記載の複合体、
（７）前記（６）記載の複合体を含有することを特徴とする肺疾患治療用注射剤、
（８）肺疾患が、肺線維症、間質性肺炎、肺気腫、肺高血圧症、肺炎、肺結核、慢性閉塞性肺疾患、塵肺及び嚥下性肺炎から選択される少なくとも１の疾患であることを特徴とする前記（７）に記載の肺疾患治療用注射剤、
に関する。

本発明の複合体は、静脈内に投与されたのち右心内で血流と完全に混合され、肺の毛細血管に送られる。前記複合体は、肺の毛細血管を通過することができずに一時的に捕捉され，一過性の微小塞栓となって肺に選択的に集積し得る。そして該集積部位において、ＭＡＡ−ＰＥＩと結合したＤＮＡ又は発現プラスミドに挿入されたＤＮＡが発現し、ＨＧＦを産生し得るので、肺において効率的にＨＧＦを利用できる。すなわち、従来ＨＧＦを注射しても肺には１０％以下しか分布できなかったが、本発明の複合体を含有する注射剤を静脈内等に投与すると、本発明の複合体は肺に選択的に取り込まれるため、ＨＧＦを、肺に局所的にかつ高濃度に分布させることができる。

また、本発明の複合体は肺に選択的に集積し、該集積部位でＨＧＦタンパクを産生するので、ＨＧＦ発現ベクターの投与量を従来に比べ、１／１０程度に減少させることができる。さらに、本発明の複合体は肺に選択的に集積するので、本発明の複合体投与による他の臓器への影響を最小限に抑制することができる。

本発明は、ＨＧＦをコードするＤＮＡと粗大凝集アルブミン−ポリエチレンイミン（ＭＡＡ−ＰＥＩ）との複合体であることを特徴とする。

本発明で用いられるＨＧＦをコードするＤＮＡとは、ＨＧＦの発現可能なＤＮＡをいう。
ＨＧＦ（配列表の配列番号３）は、当初、肝細胞に対する増殖促進因子として発見されたものであり、その遺伝子は１９８９年にクローニングされている（Ｍｉｙａｚａｗａ，
Ｋ． ｅｔ ａｌ， ＢＢＲＣ． １６３， ９６７−９７３ （１９８９）； Ｎａｋａｍｕｒａ． Ｔ， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３４２， ４４０−４４３ （１９８９））。本発明に使用されるＤＮＡとしては、例えば特許第２７７７６７８号公報、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９８９年、第１６３巻、ｐ．９６７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９０年、第１７２巻、ｐ．３２１等に記載のＨＧＦのＤＮＡを適当な発現ベクター（非ウイルスベクター、ウイルスベクター）に組み込んだもの等が挙げられる。ここでＨＧＦをコードするＤＮＡの塩基配列は、前記文献に記載されているものの他、ジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ；登録番号 Ｄ９０３３４）等のデータベースにも登録されているものを好ましく用いることができる。したがってこれらの配列情報に基づき適当なＤＮＡ部分をＰＣＲのプライマーとして用い、例えば肝臓等のｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ反応を行うこと等により、ＨＧＦのＤＮＡをクローニングすることができる。これらのクローニングは、例えばモレキュラー・クローニング法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ、 ２００１：以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す。）等に従い、当業者ならば容易に行うことができる。
本発明の複合体に用いる発現ベクターは、非感染性又は非炎症性のベクターが好ましい。非感染性又は非炎症性のベクターを使用することによって、例えば、アデノウイルス等のウイルス由来のベクター等において懸念される外来ウイルスによる感染や炎症等の恐れがない。

さらに、本発明で使用されるＤＮＡは上記に限定されず、例えば５アミノ酸欠損型ＨＧＦ（配列表の配列番号４）のような、発現するタンパク質がＨＧＦと生物学的機能が同等であるタンパク質（例えば、同族体（ホモログ）、変異体及び誘導体等）をコードするＤＮＡが包含される。かかる同族体、変異体又は誘導体をコードするＤＮＡとしては、前記ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡや、前記ＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１若しくは複数（好ましくは数個）のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ等のうち、ＨＧＦとしての作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。

該ＤＮＡは、例えば通常のハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等により容易に得ることができ、具体的には前記モレキュラー・クローニング法等を参考にして行うことができる。

なお、本明細書においてＤＮＡは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡ及び組織由来のＲＮＡを包含する意味で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書においてＤＮＡとは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ及びｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片のいずれもが含まれる。

ＨＧＦをコードするＤＮＡとしては、具体的には、例えば、（ａ）配列番号：１又は２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、又は（ｂ）配列番号：１又は２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＨＧＦと実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ等が好ましく挙げられる。なお、配列番号：１又は２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば上記ＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７〜１．０Ｍ程度の塩化ナトリウム存在下、約６５℃程度でハイブリダイゼーションを行った後、約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムからなる。）を用い、約６５℃程度の条件下でフィルターを洗浄後オートラジオグラフィーによって同定できるＤＮＡを意味する。

上記の配列番号：１又は２で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡとして具体的には、配列番号：１又は２で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡ等が挙げられる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法、例えば、上記モレキュラー・クローニング法等に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。

また、公知のＨＧＦの塩基配列情報から従来公知の方法を用いて化学合成によりクローニングすることもできる。化学合成法としては、例えば、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機 ｍｏｄｅｌ３９２（パーキン・エルマー株式会社製）等のＤＮＡ合成機で化学合成する方法等が挙げられる。

ＤＮＡの塩基配列の置換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、Ｍｕｔａｎ^ＴＭ−ｓｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造）、Ｍｕｔａｎ^ＴＭ−Ｋ（宝酒造）等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行うことができる。クローン化された本発明のＨＧＦをコードするＤＮＡは、目的によりそのまま、又は所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。

本発明に用いられるＨＧＦをコードするＤＮＡは、細胞内でのその安定性を高めるため、また、もし毒性があるならその毒性をより小さなものにするために修飾されていてもよい。このような修飾には、例えばＪ．Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｔｅｃｈ Ｊａｐａｎ，Ｖｏｌ．８、ｐ２４７（１９９２）；Ｖｏｌ．８，ｐ３９５（１９９２）；Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）等に記載された方法等が用いられる。また、本発明に用いられるＨＧＦをコードするＤＮＡ等は、塩基以外の他の物質が付加されたものであってもよい。前記他の物質としては、糖；酸又は塩基；リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体；又は、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロール等）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸等）などが挙げられる。前記他の物質は、核酸の３’末端あるいは５’末端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができる。本発明のＤＮＡ等は、その末端が化学修飾されたものであってもよい。末端の修飾基としては、核酸の３’末端あるいは５’末端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ等のヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、例えば、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコール等のグリコール等から導かれる当該分野で公知である水酸基の保護基が挙げられる。

本発明に用いられるＨＧＦをコードするＤＮＡは、発現ベクターに挿入されていてもよい。発現ベクターとしては、ＨＧＦを発現することができる発現ベクターが好ましい。
ＤＮＡが挿入された発現ベクターは、例えば、ＨＧＦをコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片を、適当な発現ベクターに連結することにより構築することができる。発現ベクターの構築は、公知技術［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（１９８９）］等に従って実施できる。

前記発現ベクターとしては、プラスミドが好ましく、例えば大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＣＲ４、ｐＣＲ２．１、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、ｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐＣＡＧＧＳ［Ｇｅｎｅ，１０８，１９３−２００（１９９１）］、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社、ストラジーン社）、ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；８，４６６−４７２（１９８８））、ｐＥＦ−ＢＯＳ［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；１８，５３２２（１９９０）］、特表平１１−５１１００９公報記載のプラスミド等が挙げられる。

前記発現ベクターは、投与部位でのＨＧＦの発現を強化するため、プロモーター及びエンハンサー等を含んでいるものが好ましい。

本発明において使用される粗大凝集アルブミン（ＭＡＡ）は、微細化性を有しており、必要な時間肺に滞留後、微細化されて排泄され、肺シンチグラフィー等に利用されている粗大凝集アルブミン等を好ましく用いることができる。ＭＡＡは、哺乳動物、特にヒト血清アルブミンを用いるのが好ましい。ＭＡＡは、Ｃｏｌｏｍｂｅｔｔｉら（Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ Ｊ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ． ２：１８０−１８４（１９７５年））の方法により調製できる。

粗大凝集アルブミンと結合する、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、カチオン密度の高いポリマーである。ＰＥＩは、エチレンイミンを酸触媒の存在下に重合させることにより製造することができる。該製造方法としては、例えば、エチレンイミンをポリメタロオキソ酸塩もしくは２，６−ジピバロイルオキシ安息香酸の存在下で重合させる方法（特開平１１−１５８２７１号公報）等が挙げられる。
ＰＥＩとしては、分子量約２００００〜７００００のものが好ましい。

カチオン密度の高いポリマーのＰＥＩはＭＡＡと結合することにより、その結合体（ＭＡＡ−ＰＥＩ）は、負に荷電した分子に結合し得る。ＭＡＡ−ＰＥＩは、アメリカ特許公報６８２１９５５号公報に記載の方法により調製できる。ＤＮＡは通常、負に荷電しているので、ＭＡＡ−ＰＥＩにＤＮＡを結合させることができる。

本発明においても、ＨＧＦをコードするＤＮＡとＭＡＡ−ＰＥＩとが結合してなる複合体（以下、本発明の複合体という。）は、ＰＥＩ表面が正に荷電しており、ＨＧＦをコードするＤＮＡ又はベクターがマイナスに荷電していることにより、イオン結合によって結合されるものである。
本発明の複合体は、例えばアメリカ特許公報６８２１９５５号公報に記載の方法に準じて、例えば、ＨＧＦをコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡを含有する発現ベクターとＭＡＡ−ＰＥＩとを、例えば生理食塩水やＰＢＳ等の溶媒中でゆっくり攪拌し、その後その溶液を約０〜４０℃、好ましくは室温で、約１０〜６０分間、好ましくは１５〜３０分間インキュベートすることによって製造することができる。
本発明の複合体における、ＨＧＦをコードするＤＮＡの含有量は、特に限定されないが、通常約０．００１〜０．５（ｗ／ｗ％）、好ましくは約０．００５〜０．２（ｗ／ｗ％）、約０．０１〜０．１６（ｗ／ｗ％）で用いることができる。

本発明の複合体を含有する製剤としては、種々の製剤形態をとることができるが、注射剤が好ましい。注射剤は常法により調製することができ、例えば、本発明の複合体を適切な基剤に懸濁し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であれば、特に制限されず、蒸留水、塩化ナトリウム、又は塩化ナトリウムと他の無機塩等との混合物の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等が挙げられる。また、常法に従い、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油又はレシチン若しくは非イオン性界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、懸濁液、分散液として注射剤を調製してもよい。
上記注射剤には、安定化剤を添加することができる。安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチンソルビトール、エチレングルコール又はプロピレングリコールなどが挙げられる。更に、本発明の注射剤は製剤化に必要な添加物、例えば、塩化第一スズ等の還元剤、エデト酸ナトリウム等の酸化防止剤、ベンジルアルコール等の無痛化剤等を含んでいてもよい。
これらの注射剤を粉末化、凍結乾燥等の操作により用時調整用製剤とすることもできる。

注射剤中の本発明の複合体の含有量は、約１０〜１００万個／ｍＬ、好ましくは約３０〜６０万個／ｍＬに調製するのが好ましい。

注射剤中の本発明の複合体の粒子径は、注射剤として使用できる粒子径である必要があり、１００μｍ以上の粒子を含まないものが好ましい。該粒子径は約１０以上１００μｍ未満、好ましくは約１０〜６０μｍである。ただし、注射剤以外の剤形で用いる場合には、その粒子径は特に限定されない。

本発明の複合体を含有する注射剤は、いくつかの投与経路により投与することができ、例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することができるが、静脈内投与が最も好ましい。その投与量は、患者の症状、年齢、体重などにより適宜調整されるが、通常本発明の複合体として、患者（６０ｋｇ）に対して約１０〜１００万個／日、好ましくは約３０〜６０万個／日である。投与は、約１〜５日、好ましくは約３〜４日間隔で行なうのが好ましい。なお、本発明の複合体が溶液中で沈殿している場合には、該沈殿を撹拌してから、投与するのが好ましい。

投与された本発明の複合体は、肺に選択的に集積し、該集積部位において、ＤＮＡが発現してＨＧＦを産生するので、ヒトをはじめとする哺乳動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ等）のＨＧＦが有効とされる肺疾患の治療に用いることができる。肺疾患としては、例えば、肺線維症、間質性肺炎、肺気腫、肺高血圧症、肺炎、肺結核、慢性閉塞性肺疾患、塵肺又は嚥下性肺炎肺線維症が挙げられる。これらの肺疾患の中でも、特に肺線維症の治療に効果を発揮する。

以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、実施例において、ＰＢＳはリン酸緩衝食塩水を示し、ＢＬＭはブレオマイシンを示す。また、データは平均値±標準偏差を示す。異なる２群のデータを統計学的に比較するためにはＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を用い、危険率５％以下を有意差があると判定した。

［ＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ発現プラスミドの調製］
１．ＨＧＦ発現プラスミドの調製
ヒトＨＧＦの全長ｃＤＮＡ（２．２ｋｂ）を、ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ １０８：１９３−２００、１９９１）のＸｈｏ Ｉサイトに挿入し、チキンβ―アクチンプロモーターの制御下にヒトＨＧＦ遺伝子を発現するプラスミド（以下において、ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳとも表示する。）を調製した。

２．ＭＡＡ−ＰＥＩの調製
ヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡと略記する。）５０ｍｇ（０．７２μｍｏｌ）を、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム１ｍＬと混合した溶液（ｐＨ８．５）に、０．２５ｍｇ（０．８μｍｏｌ）Ｎ−サクシンイミジル ３−（ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）のＤＭＳＯ溶液１０μＬを添加し、反応させた（以下、ＨＳＡ溶液ともいう）。ＰＥＩ（分子量２５，０００；Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）１８ｍｇ（０．７２μｍｏｌ）を、精製水１ｍＬに溶解した溶液を、１Ｍ塩酸でｐＨ８．５に調整した（以下、ＰＥＩ溶液ともいう）。該ＰＥＩ溶液に、０．２５ｍｇ（０．８μｍｏｌ）Ｎ−サクシンイミジル ３−（ピリジルジチオ）プロピオネートのＤＭＳＯ溶液１０μＬを攪拌しながら加え、数時間撹拌した。ＰＢＳで平衡化したＮＡＰ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）にＨＳＡ及びＰＥＩ溶液を別々に添加した。ＰＥＩ溶出液に、Ｒｅｄｕｃｔａｃｒｙｌ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）１５ｍｇを加え還元処理を数時間おこなった。次いで、ＨＳＡに対するＰＥＩのモル比が１：２になるように、ＨＳＡ溶出液中にＰＥＩ溶出液をゆっくり撹拌しながら添加した。攪拌を一晩中続け、この溶液をＰＢＳで５ｍＬに調製し、１Ｍ塩酸でｐＨを５．５−６．０に調整した。前記調製溶液を激しく攪拌しながら８５℃で凝集化を行った。凝集したＭＡＡ−ＰＥＩを穏やかに遠心分離し、沈殿（ＭＡＡ−ＰＥＩ）をＰＢＳ中で再懸濁し、遠心分離することによって２回洗浄した。そして、洗浄後のＭＡＡ−ＰＥＩをＰＢＳで最終容積４ｍＬとなるよう再懸濁した。

３．ＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳの調製
上記２で調製したＭＡＡ−ＰＥＩ溶液を生理食塩水で１０質量％となるよう希釈懸濁した。その希釈懸濁溶液（１７５μＬ）をゆっくり撹拌しながら、上記１で調整したＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ（２００ｎｇ／μＬ ＰＢＳ）２５μＬを滴下した。プラスミドの添加されたＭＡＡ−ＰＥＩ懸濁溶液を室温で２０分間インキュベートし、ＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳを得た。

［参考例］
アデノウイルスベクターの調製
ヒトＨＧＦ発現プラスミドの起炎症作用をアデノウイルスベクターによるものと比較するために、外来性の挿入遺伝子を組み込んでいない非増殖性アデノウイルスベクター（以下において、ＡｄＣＭＶ−Ｎｕｌｌとも表示する。）を準備した。

［試験例］
１．ＭＡＡの肺内分布の確認試験
^９９ｍＴｃ−ＭＡＡ（ラングシンチ Ｔｃ−９９ｍ、日本メジフィジックス株式会社）６０μＬをマウス尾静脈より静脈内に注入し、ピンホールコリメーターを装着したガンマカメラにて経時的に撮像した。

その結果を図１に示した。ガンマカメラ像は、^９９ｍＴｃ−ＭＡＡがマウスの肺部位に集積していることを示した（図１Ａ）。また、^９９ｍＴｃ−ＭＡＡ投与後１時間及び６時間の各臓器における^９９ｍＴｃによる放射線量を図１Ｂに示した。^９９ｍＴｃ−ＭＡＡ６時間後においても肺における^９９ｍＴｃの放射線量が高かった。

２．ＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳによる肺でのトランスフェクション能力
（１）プラスミド投与量とＨＧＦ発現量との関係
ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ（０、０．５、１、５μｇ）及びＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ（０、０．５、１、５μｇ）を、マウス（各群５匹）尾静脈よりそれぞれ静脈内に注入し、２時間後に肺のＨＧＦをｈｕｍａｎ ＨＧＦ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ社）で測定し、ＨＧＦ産生量とした。

その結果を図２に示した。肺におけるＨＧＦ産生量は、ＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与群（黒カラム）では１μｇ投与群が最も高値であり、ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与群よりも有意（ｐ＜０．０５）に高値であった。５μｇを投与した場合でもＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳを投与したほうが、ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与群よりもＨＧＦ発現量は高値であった。

（２）トランスフェクション能力
ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ（１０μｇ）及びＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ（１μｇ）を、マウス（各群５匹）尾静脈よりそれぞれ静脈内に注入し、経時的に肺におけるＨＧＦ発現量をｈｕｍａｎ ＨＧＦ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ社）で測定した。また、ＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ（１μｇ）をマウス（各群５匹）尾静脈より静脈内に注入し、その３日及び６日後にさらにＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ（１μｇ）を静脈内に注入し、経時的に肺におけるＨＧＦ発現量を同様に測定した。

その結果を図３に示した。ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ（１０μｇ）投与後のマウス肺中のＨＧＦの発現は１２時間から２４時間まで徐々に増加し、２日で最高レベルに達し、５日で消失した（図３；−□−）。これに対して、ＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ（１μｇ）投与群におけるＨＧＦの発現の持続時間は、１４日以上持続した（図３；−■−）。３日及び６日後にさらにＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ（１μｇ）投与した群では、肺におけるＨＧＦ発現量は、投与後９日まで増加し、その後減少した（図３；黒塗り三角）。

３．ＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与後の臓器移行性試験
ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ（１０μｇ）及びＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ（１μｇ）を、マウス（各群５匹）尾静脈よりそれぞれ静脈内に注入し、３日後にエーテル麻酔下、マウスの血液を腋窩動脈から採血後、肺、肝臓、脾臓、腎臓、心臓を摘出し、血清及び各臓器におけるＨＧＦ発現量をｈｕｍａｎ ＨＧＦ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ社）で測定した。

その結果を図４に示した。ＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与群の肝臓におけるＨＧＦ発現量は、ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与群に比較して、有意に低かった。また、ＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与群の脾臓、腎臓及び心臓では殆どＨＧＦの発現が認められなかった。ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与群及びＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与群共、血清中にＨＧＦの発現は認められなかった。

４．プラスミド血管内安全性確認試験
アデノウイルスベクター（ＡｄＣＭＶ−Ｎｕｌｌ） １×１０^１０粒子、ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ（１０μｇ）又はＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ（１μｇ）を、マウス（各群７匹）尾静脈より静脈内に注入し、５時間後の炎症性サイトカイン［ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子）及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）］の血清中濃度を各々ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ社）で測定した。なお、対照としてＰＢＳを同様に静脈内に投与した。
その結果を図５に示した。アデノウイルスベクター投与５時間後の、血清中ＴＮＦ−α及びＩＬ−６は著明に上昇した。それに対してＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ又はＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与群の血清中ＴＮＦ−α及びＩＬ−６は共に、ＰＢＳ投与による効果と統計学的な差を認めなかった。本結果は、ＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳの血管内での安全性を示すものである。

５．ＨＧＦ発現プラスミド投与による抗炎症効果及び抗線維化効果
（１）動物の処置
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（メス、１７−２０ｇ）に、塩酸ケタミン（三共株式会社）及び塩酸キシラジン（バイエル株式会社）麻酔下、塩酸ブレオマイシン（日本化薬株式会社）９０μｇを経鼻投与した。ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ（１０μｇ／２００μＬ）又はＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ（１μｇ／２００μＬ）は生理食塩水で調製し、ブレオマイシン投与後第１、４及び７日目に尾静脈より静脈内投与した。マウスはエーテル麻酔下、腋窩動脈から採血し、脱血死させた。対照としてＰＢＳ又はｐＣＡＧＧＳを投与した。
（２）抗炎症効果
ブレオマイシン投与後７日目に肺を摘出し、肺組織の炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α及びＩＬ−６）をＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ社）で測定した。
その結果を図６に示した。ブレオマイシン投与後７日目のＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与群の肺組織中のＴＮＦ−α及びＩＬ−６は、ＰＢＳ投与群と比較して、有意に低かった。
（３）抗線維化効果
ブレオマイシン投与後２１日目に肺を摘出し、肺組織のヒドロキシプロリン量を測定した。ヒドロキシプロリン量の測定は以下によった。すなわち、ホルマリン固定した右肺を、アセトンに６時間浸した後、エーテルにて脱脂を行なった。十分に乾燥した肺をすりつぶして、６Ｎの塩酸を用いて１１５℃で１６時間の加水分解を行なった。高速液体クロマトグラフィーにてヒドロキシプロリン含量を測定した。また、常法に従って病理切片を作成し、組織学的観察をおこなった。
その結果を図７に示した。ＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与群では、ブレオマイシンによるヒドロキシプロリン産生の抑制が認められた。
また、病理組織学的観察においても、ＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与群では、ブレオマイシンによる線維性病変が減少していた。
（４）アポトーシスに対する効果
ブレオマイシン投与後３日目及び７日目に肺を摘出し、常法に従ってパラフィン包埋切片を作成した。前記切片を倍率１０００倍で、スライド当たり、無作為に１０視野選択して、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）でアポトーシス細胞を検出した。前記選択した１０視野を１ユニットとし、ユニット当たりのアポトーシス細胞数（アポトーシス細胞／肺ユニットエリア）を測定した。
その結果を図８に示した。ブレオマイシンにより増加するアポトーシス細胞が、ＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与群では、有意に減少した。

（５）ＨＧＦ受容体に対する効果
ＨＧＦ受容体に対する効果は、肺に存在するリン酸化されたｃ−Ｍｅｔを、ウエスタンブロットを用いて検出することにより実施した。
すなわち、ブレオマイシン投与後３日及び７日後の肺を摘出し、プロテアーゼインヒビターを含む冷却したＰＢＳで肺を還流し、液体窒素にて凍結した。この肺０．１ｇを１ｍＬの溶解液［プロテアーゼインヒビターを含む：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ β−グリセロホスフェート（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、１０％グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４（オルトバナジン酸(Ｖ)ナトリウム）、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）、プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社）５μＬ／ｍＬ］に懸濁した。その後ローテーターにて４℃、０．５〜１時間攪拌し、遠心分離した（１５，０００ｒｐｍ，３０分間）。可溶画分を採取し、そして可溶画分にｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加し、インキュベートした。遠心分離してｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ｓｅｐｈａｒｏｓｅを除去し、得られた上清に抗Ｍｅｔ抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ Ｂ−２）を加え、免疫沈降させた。免疫沈降物をジチオスレイトールで還元後、５質量％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動にかけ、エレクトロトランスファーによりポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に転写した。ＰＶＤＦ膜に転写されたリン酸化されたＭｅｔを、リン酸化認識抗体（ＵＢＩ ７−２１１；コスモ・バイオ株式会社）を用いて検出した。

その結果を図９に示した。ＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与群では、ｃ−Ｍｅｔのチロシンのリン酸化を誘因することがわかった。
このことは、本発明の複合体は、肺においてＨＧＦを産生し、かつ肺でのＨＧＦ受容体のｃ−Ｍｅｔのチロシンのリン酸化を誘因してＨＧＦ依存的な細胞分化を促進することを示唆するものである。

〔製剤例１〕
実施例１で作成した複合体 ３ ｍｇ
塩化第一スズ ０．１ｍｇ
ベンジルアルコール １０．４ｍｇ
酢酸ナトリウム ７．２ｍｇ
プロピレングリコール ８３ ｍｇ
注射用水 適量
上記を常法に従い混合し、全量を１ｍＬとする。バイアル瓶に入れ、使用めで凍結保存する。

本発明の複合体及び該複合体を含有する注射剤は、安全に肺疾患の治療に利用できる。

図１は、マウスに^９９ｍＴｃ−ＭＡＡを静脈内投与後の臓器分布を示す図である。図中Ａは、ガンマカメラ像を示し、Ｂは各臓器における^９９ｍＴｃの放射線量を示す。■は、１時間後の各臓器における^９９ｍＴｃの放射線量を示し、□は、６時間後の各臓器における^９９ｍＴｃの放射線量を示す。 図２は、プラスミド投与量とＨＧＦ発現量との関係を示す図である。図中、□はＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与群を、■はＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与群を示す。 図３は、ｐＣＡＧＧＳとＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳのトランスフェクション能力を示す図である。図中、□はＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与群を、■はＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与群を、黒塗り三角はＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ３回投与群を示す。矢印は、ＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ３回投与群におけるＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与時を示す。 図４は、ＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与後の各臓器でのＨＧＦ発現量を試験した図を示す。図中、□はＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与群を、■はＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ投与群を示す。＊は有意差、ｐ＜０．０５を示す。 図５は、プラスミド投与後の炎症性サイトカインを示す図である。図中、■はＴＮＦ−αを、□はＩＬ−６を示す、＊は有意差、ｐ＜０．０５を示す。 図６は、ブレオマイシン誘発肺炎症に対する効果を示す図である。図中、■はＴＮＦ−αを、□はＩＬ−６を示す、＊は有意差、ｐ＜０．０５を示す。 図７は、ブレオマイシン誘発肺線維症に対する効果を示す図である。図中、ドットカラムはＨＧＦ発現プラスミド単独（ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ １０μｇ）投与群を、斜線カラムはＭＡＡ−ＰＥＩにＨＧＦ発現プラスミド（ＭＡＡ−ＰＥＩ−ＨＧＦ／ｐＣＡＧＧＳ １μｇ）投与群を示す。＊は有意差、ｐ＜０．０５を示す。 図８は、ブレオマイシン誘発肺アポトーシス細胞に対する効果を示す図である。＊は有意差、ｐ＜０．０５を示す。 図９は、ブレオマイシン投与後３日及び７日後の肺におけるリン酸化されたｃ−Ｍｅｔのウエスタンブロットの結果を示す図である。

Claims (8)

1. 肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）をコードするＤＮＡと粗大凝集アルブミン−ポリエチレンイミン（ＭＡＡ−ＰＥＩ）とが結合してなる複合体。
2. ＤＮＡが次のいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の複合体；
   （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；又は
   （ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
3. ＤＮＡが次のいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の複合体；
   （ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；又は
   （ｂ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
4. ＤＮＡが発現ベクターに挿入されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の複合体。
5. 発現ベクターがプラスミドであることを特徴する請求項４記載の複合体。
6. 複合体の粒子径が１０μｍ以上１００μｍ未満であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の複合体。
7. 請求項６記載の複合体を含有することを特徴とする肺疾患治療用注射剤。
8. 肺疾患が、肺線維症、間質性肺炎、肺気腫、肺高血圧症、肺炎、肺結核、慢性閉塞性肺疾患、塵肺及び嚥下性肺炎から選択される少なくとも１の疾患であることを特徴とする請求項７に記載の肺疾患治療用注射剤。