JP2007015948A - ヌクレオシド誘導体 - Google Patents

Abstract

【課題】 蛍光特性に優れると共に、蛍光スペクトルが長波長シフトした、核酸塩基の誘導体を提供する。
【解決手段】 ヌクレオシド誘導体は（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−ジヒドロピロロピリミドピリミジンジオン等のピリミドピリミジンを有するヌクレオシド誘導体。
【選択図】 なし

Description

本発明は、ヌクレオシド誘導体に関する。特には、蛍光特性に優れると共に、蛍光スペクトルが長波長シフトした、ヌクレオシド誘導体に関する。
に関する。

ＤＮＡやＲＮＡの構成単位であるヌクレオシドは、リボースやデオキシリボースにアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシルのいずれかの塩基が結合した化合物である。これらの塩基のうち、アデニンとチミン（ウラシル）、又はグアニンとシトシンとは互いに水素結合を介して結合する塩基対形成能を有しており、この塩基対形成能を用いたＤＮＡとＤＮＡ、ＲＮＡとＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡ同士の分子認識は生命体の遺伝情報の維持、発現、制御の分子メカニズムである。また、この分子認識現象は遺伝子解析、遺伝子増幅、クローニング、核酸医薬による遺伝子発現制御等、遺伝子工学、分子生物学、医学における人為的遺伝子制御の手法の基板となる技術である。

近年においては、化学合成された核酸が、ＰＣＲプローブやＤＮＡチップ等に用いられたり、アンチセンスやＳｉＲＮＡ等の遺伝子制御法、超分子化学等の様々な分野で用いられるようになってきている。これらの技術には、天然型の核酸のみならず、人工的に化学修飾を施して合成された機能性人工核酸が利用されるようになってきた。

このような人工核酸として、例えば、周囲の環境によって蛍光特性が変化する人工核酸塩基を有するヌクレオシド誘導体は、ＤＮＡやＲＮＡの高次構造の研究のみならず、リボザイム、アプタマー、アンチセンス核酸等の機能性核酸及び核酸医薬素材の標識分子として有用である。また、近年においては、塩基対形成時に塩基対を形成する塩基に応じて、その蛍光特性が変化し得る蛍光人工核酸塩基が種々報告されており、ＳＮＰｓ解析等に応用されるようになっている。このような環境応答型の蛍光人工核酸塩基には、蛍光分子を天然核酸塩基に連結したもの、又は人工核酸塩基そのものに蛍光特性を有するものがある。

シトシン塩基の誘導体においては、蛍光分子を天然核酸塩基に連結したものとして、非特許文献１には、蛍光分子としてピレン残基を天然核酸塩基に直接連結した誘導体が、非特許文献２には、エチニル基を介して連結した誘導体が、非特許文献３には、フルオレン残基を連結した誘導体が報告されている。

また、人工核酸塩基そのものに蛍光特性を有するものとしては、蛍光性シトシン塩基誘導体が種々報告されている。例えば、非特許文献４には、蛍光特性をもつ、ピリドピリミジン骨格を有する誘導体が、非特許文献５には、蛍光特性をもつ、ペンゾピリミジン骨格を有する誘導体が、非特許文献６には、蛍光特性をもつ、ピロロピリミジン骨格を有する誘導体が報告されている。

また、特許文献１には、塩基対形成時に、塩基対を形成する塩基に応じて、その蛍光特性が変化し得る蛍光人工核酸塩基として、ピリミドピリミジン骨格を有する人工核酸塩基が開示されている。該公報に開示された人工核酸塩基は、天然型シトシン塩基と同様に、グアニン塩基と塩基対を形成することができるのみならず、アデニン塩基とも塩基対を形成することのできる人工核酸である。また、その蛍光特性はグアニン塩基と塩基対を形成した場合にのみ大きく消光するので、ＳＮＰｓ解析に応用が可能である。

上述したように、蛍光特性を有するシトシン塩基誘導体については、報告例があるが、いずれの誘導体も、蛍光特性が実用化するほどの強度を有していないため、実用化に至っていないのが現状である。また、蛍光スペクトルに関しても、更に長波長にシフトしたものが望まれている。

Chem.Commun., 2003 p1878-1879) Tetrahyd.Lett., 2004, vol.45 p3543-3546) J.Am.Chem.Soc., 2004, vol.126, p6528-6529) Nucl.Acids Res. Vol.13, p7119-128) J.Am.Chem.Soc., 2003, vol.125, p9296-9297) Tetrahyd.Lett. vol.45, p2457-2461) 特開２００５−１５３９５号公報

従って、本発明の目的は、蛍光特性に優れると共に、蛍光スペクトルが長波長シフトした、核酸塩基の誘導体を提供することにある。

上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、ピリミドピリミジンを修飾することにより得られる、特定の構造を有するヌクレオシド誘導体が、上記目的を達成し得るという知見を得た。
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、下記一般式（１）で表わされるヌクレオシド誘導体を提供するものである。

（上記式中、Ｒ^１は、水素、又はアルコキシ基を有していてもよいトリチル基を表し、Ｒ^２は水素、アルコキシ基、アルコキシアルキルオキシ基、２−シアノエチル基、水酸基、又はハロゲンを表し、Ｘ、Ｙ及びＺは、同一であっても異なっていてもよく、Ｎ又はＣＲ^３を表わし、Ｒ^３は、水素、アルキル基、ニトロ基、アミノ基、ジアルキルアミノ基、シアノ基、アリール基、ヘテロアリール基、又はアルコキシ基を表わす。また、Ｘ及びＹ、又はＹ及びＺが共にＣＲ^３で表される場合には、それらが互いに結合して環構造を形成していてもよい。）

また、本発明は、下記一般式（３）で表わされるヌクレオシド誘導体を提供する。

（上記式中、Ｒ^１は、水素、又はアルコキシ基を有していてもよいトリチル基を表し、Ｒ^２は水素、アルコキシ基、アルコキシアルキルオキシ基、２−シアノエチル基、水酸基、又はハロゲンを表し、Ｘ、Ｙ及びＺは、同一であっても異なっていてもよく、Ｎ又はＣＲ^３を表わし、Ｒ^３は、水素、アルキル基、ニトロ基、アミノ基、ジアルキルアミノ基、シアノ基、アリール基、ヘテロアリール基、又はアルコキシ基を表わし、Ｒ^７はリン酸保護基を表し、Ｒ^８は窒素原子上に炭素数１〜６個の同一又は異なるアルキル基が２個結合したジアルキルアミノ基を表す。また、Ｘ及びＹ、又はＹ及びＺが共にＣＲ^３で表される場合には、それらが互いに結合して環構造を形成していてもよい。）

また、本発明は、上記ヌクレオシド誘導体を含むオリゴ核酸を提供する。
また、本発明は、上記オリゴ核酸を含んでなる、遺伝子解析用プローブ提供する。

本発明のヌクレオシド誘導体は、優れた蛍光特性を有すると共に、蛍光スペクトルが長波長シフトしたものである。本発明のヌクレオシド誘導体の優れた蛍光特性により発する蛍光を検出することにより、例えば、ハイブリダイゼーションの様子を容易に検出することができる。従って、本発明のヌクレオシド誘導体は遺伝子検出及び遺伝子診断等の様々な分野で利用することが可能である。

以下、本発明のヌクレオシド誘導体について説明する。
本発明は、第一の態様として、下記一般式（１）で表わされるヌクレオシド誘導体に係る。また、本発明は、第二の態様として、下記一般式（３）で表わされるヌクレオシド誘導体に係る。
まず、本発明の第一の態様に係る、下記一般式（１）で表わされるヌクレオシド誘導体について説明する。

上記一般式（１）において、Ｒ^１は、水素、又はアルコキシ基を有していてもよいトリチル基を表す。アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、１−ブチルオキシ基、１−ペンチルオキシ基、１−ヘキシルオキシ基等が挙げられる。Ｒ^１としては、具体的には、下記一般式（２）で表わされる基が挙げられる。

上記一般式（２）において、Ｒ^４、Ｒ^５及びＲ^６は、同一であっても異なっていてもよく、水素又はアルコキシ基である。アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、１−ブチルオキシ基、１−ペンチルオキシ基、１−ヘキシルオキシ基等が挙げられる。
上記一般式（１）において、Ｒ^２は水素、アルコキシ基、アルコキシアルキルオキシ基、２−シアノエチル基、水酸基、又はハロゲンを表す。アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、１−ブチルオキシ基、１−ペンチルオキシ基、１−ヘキシルオキシ基等が挙げられ、ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素が挙げられる。

また、上記一般式（１）において、Ｘ、Ｙ及びＺは、同一であっても異なっていてもよく、Ｎ又はＣＲ^３を表わす。ここで、Ｒ^３は、水素、アルキル基、ニトロ基、アミノ基、ジアルキルアミノ基、シアノ基、アリール基、ヘテロアリール基、又はアルコキシ基を表わし、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などのアルキル基を示し、イソプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ネオペンチル基などのように分枝したアルキル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等のシクロアルキル基を含む。

本発明の一般式（１）で表わされるヌクレオシド誘導体としては、例えば、Ｘ、Ｙ及びＺがＣＨであり、Ｒ^１及びＲ^２が水素である、ピロロピリミドピリミジン誘導体（２ーデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−ジヒドロピロロピリミドピリミジンジオン、下記式（４）で表わされる化合物）が挙げられる。また、本発明の一般式（１）で表わされるヌクレオシド誘導体としては、例えば、Ｘ、Ｙ及びＺがＣＨであり、Ｒ^１がアルコキシ基を有するトリチル基であり、Ｒ^２が水素であり、Ｒ^４及びＲ^５がメトキシ基である、ピロロピリミドピリミジン誘導体（２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル）−ジヒドロピロロピリミドピリミジンジオン、式（５）で表わされる化合物）が挙げられる。
また、Ｘ及びＹ、又はＹ及びＺが共にＣＲ^３で表される場合には、それらが互いに結合して環構造を形成していてもよい。環構造としては、例えばベンゼン環等が挙げられ，ベンゼン環にアルキル基、ニトロ基、アミノ基、ジアルキルアミノ基、シアノ基、アリール基、ヘテロアリール基、アルコキシ基等が１個以上結合している場合も含まれる。

次に、本発明の第二の態様に係る、下記一般式（１）で表わされるヌクレオシド誘導体について説明する。本発明の第二の態様に係るヌクレオシド誘導体は、下記一般式（３）で表わされる。

上記一般式（３）において、Ｒ^１は、水素、又はアルコキシ基を有していてもよいトリチル基を表す。アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、１−ブチルオキシ基、１−ペンチルオキシ基、１−ヘキシルオキシ基等が挙げられる。また、Ｒ^２は水素、アルコキシ基、アルコキシアルキルオキシ基、２−シアノエチル基、水酸基、又はハロゲンを表す。アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、１−ブチルオキシ基、１−ペンチルオキシ基、１−ヘキシルオキシ基等が挙げられ、ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素が挙げられる。

また、上記一般式（３）において、Ｘ、Ｙ及びＺは、同一であっても異なっていてもよく、Ｎ又はＣＲ^３を表わす。ここで、Ｒ^３は、水素、アルキル基、ニトロ基、アミノ基、ジアルキルアミノ基、シアノ基、アリール基、ヘテロアリール基、又はアルコキシ基を表わし、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などのアルキル基を示し、イソプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ネオペンチル基などのように分枝したアルキル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等のシクロアルキル基を含む。

上記一般式（３）において、Ｒ^７はリン酸保護基を表す。リン酸保護基としては、通常のリン酸保護基であれば特に制限なく用いることができ、例えば、メチル基、２−シアノエチル基、２−トリメチルシリルエチル基等が挙げられる。
また、Ｒ^８は窒素原子上に炭素数１〜６個の同一又は異なるアルキル基が２個結合したジアルキルアミノ基を表す。ジアルキルアミノ基としては、例えば、ジエチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基等が挙げられる。

本発明の一般式（３）で表わされるヌクレオシド誘導体としては、例えば、Ｘ、Ｙ及びＺがＣＨであり、Ｒ^１がアルコキシ基を有するトリチル基であり、Ｒ^２が水素であり、Ｒ^４及びＲ^５がメトキシ基であり、Ｒ^７が２−シアノエチル基であり、Ｒ^８がジイソプロピルアミノ基である、ピロロピリミドピリミジン誘導体（２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル）−ジヒドロピロロピリミドピリミジンジオン ３’−Ｏ−ホスホロアミダイト、式（６）で表わされる化合物）が挙げられる。
また、Ｘ及びＹ、又はＹ及びＺが共にＣＲ^３で表される場合には、それらが互いに結合して環構造を形成していてもよい。環構造としては、例えばベンゼン環等が挙げられ，ベンゼン環にアルキル基、ニトロ基、アミノ基、ジアルキルアミノ基、シアノ基、アリール基、ヘテロアリール基、アルコキシ基等が１個以上結合している場合も含まれる。

本発明のヌクレオシド誘導体は、当業者に公知の方法を用いて合成することができる。本発明のヌクレオシド誘導体は、既知の５−ヨードシトシン誘導体から一段階で合成することができる。すなわち、既知化合物である５位をヨード化したシトシン誘導体に対し、ピロールのホウ酸誘導体を鈴木−宮浦反応によりカップリングし、同時に進行する分子内環形成反応を経ることによって合成することができる。具体的には、本明細書の実施例に記載されている方法に従って合成することができる。

次に、本発明のオリゴ核酸について説明する。本発明のオリゴ核酸は、本発明のヌクレオシド誘導体の少なくとも１種を含む。本発明のオリゴ核酸は、その用途によっても異なるが、ヌクレオチド単位が、通常は１０〜１００個程度からなり、その構成単位として、本発明のヌクレオシド誘導体を少なくとも１個含有してなる。本発明のオリゴ核酸は、上記ヌクレオシド誘導体を分子内に少なくとも１個含む分子全般を指し、例えば、複数ヌクレオシドの水酸基同士が互いにリン酸ジエステル結合で結合してオリゴマーを形成したオリゴヌクレオチド中に上記本発明のヌクレオシド誘導体を少なくとも１個含む分子が例として挙げられる。ここで用いられるヌクレオシドとしては、例えば、リボース−１−イルもしくは２−デオキシリボース−１−イル基と任意の基とが結合した物質全般を意味する。例えば、２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシシチジン、チミジン、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン等が挙げられる。
本発明のオリゴ核酸に含まれる、ヌクレオシド、本発明のヌクレオシド誘導体の種類、数、組み合わせ、位置等も、使用目的及び用途に応じて、当業者が適宜選択することができる。

本発明のオリゴ核酸は、本発明のヌクレオシド誘導体を用いて、当業者に公知の任意の方法で合成することができる。本発明のオリゴ核酸は、オリゴＤＮＡ又はオリゴＲＮＡである。本発明のオリゴ核酸は、本発明のヌクレオシド誘導体を含有してなり、例えば、ＰＣＲ用のＤＮＡプローブ、ＤＮＡ医薬品素材（アンチセンスＤＮＡ、デコイＤＮＡ、オリゴＤＮＡを利用した遺伝子修復用の素材）、及び遺伝子解析用プローブ、又は遺伝子解析用のＲＮＡプローブ、ＲＮＡ医薬品素材（アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＲＮＡｉを利用した遺伝子発現制御）、人工酵素、アプタマー等として用いることができる。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
製造例１
（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−ジヒドロピロロピリミドピリミジンジオン（ｄＣｐｐｐ）の合成
５−ヨードデオキシシチジン（１７７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（５．６ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）、トリフェニルフォスフィン−３，３’，３’’−スルホン酸ナトリウム塩（２０ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（５３ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、及びＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロール−２−ホウ酸（１０６ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を、脱気した水−アセトニトリル（２：１、ｖ／ｖ、５ｍＬ）に溶解し、この溶液を６０℃の温度で３０分間撹拌した。撹拌を行った後、溶液に、酢酸パラジウム（５．６ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）、トリフェニルフォスフィン−３，３’，３’’−スルホン酸ナトリウム塩（２０ｍｇ、０，０３５ｍｍｏｌ）、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロール−２−ホウ酸（１０６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を加え、さらに６０℃の温度で３０分間撹拌した。次いで、水（１０ｍＬ）を加えたのち、半分量になるまで溶媒を減圧下留去する。溶媒留去を行った後、クロロホルム（２０ｍＬ）を加え、飽和塩化ナトリウム水溶液、及び飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を用いて有機層を洗浄した。有機層を回収後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、Ｃ２００シリカゲルを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール、９９：１、ｖ／ｖ）により精製を行い、（ｄＣｐｐｐ、式（４）で表わされる化合物）を得た（８８ｍｇ、収率：５５％）。

^１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ１．９１−２．１６（１Ｈ、ｍ）、２．２２−２．３６（１Ｈ、ｍ）、３．６２−３．８１（２Ｈ、ｍ）、３．８２−３．８６（１Ｈ、ｍ）、４．１８−４．２２（１Ｈ、ｍ）、５．０６（１Ｈ、ｂｒ）、５．２９（１Ｈ、ｂｒ）、６．１１（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、Ｊ＝６．３Ｈｚ）、６．４４−６．４９（２Ｈ、ｍ）、７．５０ー７．５２（１Ｈ、ｍ）、８．５３（１Ｈ、ｓ）

製造例２
２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル）−ジヒドロピロロピリミドピリミジンジオンの合成
製造例１で得られた（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−ジヒドロピロロピリミドピリミジンジオン（２００ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（６ｍＬ）に溶解し、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（２３５ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）を加え、室温（約２５℃）で３時間撹拌した。次いで、反応溶液をクロロホルム（１０ｍＬ）で希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液用いて有機層を２回洗浄した。有機層の洗浄後、有機層を回収し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、Ｃ２００シリカゲルを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム）により精製を行い、２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル）−ジヒドロピロロピリミドピリミジンジオン（式（５）で表される化合物を得た（３２７ｍｇ、収率：８４％）。

^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３） δ２．１９−２．３０（１Ｈ、ｍ）、２．９３−３．０６（１Ｈ、ｍ）、３．１８−３．２６（１Ｈ、ｍ）、３．５２−３．６０（１Ｈ、ｍ）、３．６２（６Ｈ、ｓ）、４．２２−４．３１（１Ｈ、ｍ）、４．４３−４．４９（１Ｈ、ｍ）、５．５２−５．５９（１Ｈ、ｍ）、６．０８−６．１２（１Ｈ、ｍ）、６．３６（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、Ｊ＝５．６Ｈｚ）、６．６１−６．７３（４Ｈ、ｍ）、７．０４−７．３８（１０Ｈ、ｍ）、８．５５（１Ｈ、ｓ）、１０．１８（１Ｈ、ｂｒ）

製造例３
２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル）−ジヒドロピロロピリミドピリミジンジオン ３’−Ｏ−ホスホロアミダイトの合成
製造例２で得られた２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル）−ジヒドロピロロピリミドピリミジンジオン（４００ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルを用いて共沸脱水した後、塩化メチレン（７ｍＬ）を加えた溶解させた。次いで、ジイソプロピルアミン（５４．８μＬ、０．３９ｍｍｏｌ）、（２−シアノエトキシ）−ビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスフィン（２４５μＬ、０．７７ｍｍｏｌ）、及び１Ｈ−テトラゾール（２７ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を加え室温（約２５℃）で５時間撹拌した。次いで、反応溶液をクロロホルム（１０ｍＬ）で希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を用いて有機層を２回洗浄した。有機層の洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて有機層を乾燥し、Ｃ２００シリカゲルを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％トリエチルアミン、ヘキサンークロロホルム（６：４、ｖ／ｖ））により精製を行い、２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル）−ジヒドロピロロピリミドピリミジンジオン ３’−Ｏ−ホスホロアミダイトを得た（４８６ｍｇ、収率：９３％）。

^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３） δ１．０５−１．２１（１２Ｈ、ｍ）、２．３０−２．４２（２Ｈ、ｍ）、２．５８−２．６３（１Ｈ、ｍ）、２．７９−２．９３（１Ｈ、ｍ）、３．２６−３．３３（１Ｈ、ｍ）、３．４９−３．９０（１２Ｈ、ｍ）、４．２７−４．３２（１Ｈ、ｍ）、４．５３−４．６８（１Ｈ、ｍ）、５．４７−５．５１（１Ｈ、ｍ）、６．１８−６．２２（１Ｈ、ｍ）、６．３５−６．４０（１Ｈ、ｍ）、６．７６−６．８２（４Ｈ、ｍ）、７．２０−７．４９（１０Ｈ、ｍ）、８．６４−８．６９（１Ｈ、ｍ）

比較製造例１
６−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボルラノシル）−４，６−ジヒドロ−１Ｈ，３Ｈ−ピリミド〔４，５−ｄ〕ピリミジン−２，７−ジオンの合成
２’−デオキシウリジン（１０ ｇ， ４３．８ ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（２０ｇ）を水酸化カリウム水溶液（２００ ｍＬ，０．５ Ｎ）に懸濁し、６５℃の温度で撹拌を行った。系内のｐＨを維持するように水酸化カリウム水溶液（１０ ｍＬ，１．０Ｎ）を加えながら７日間撹拌を行った。撹拌終了後、反応系をＤｏｗｅｘ ５０Ｗｘ８（ＯＨ⁻型）、及びＤｏｗｅｘ５０Ｗｘ８（Ｈ^＋型）に通過させた後、溶媒をあらかた減圧留去した。残渣にメタノールを加え完全に溶かし、６０Ｎ球状シリカゲル（６０ｇ）を加え、溶媒を減圧留去した。クロロホルム−メタノール（９：１、ｖ／ｖ）を溶出溶媒にシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し２’−デオキシ−５−ヒドロキシメチルウリジンを得た（７．３５ ｇ， ２８．５ ｍｍｏｌ、収率：６５％）。

^１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ２．０４−２．０９（２Ｈ，ｍ）， ３．５２−３．５５（２Ｈ，ｍ）， ３．７５−３．７９（１Ｈ， ｍ），４．１１（１Ｈ，ｓ）， ４．１２ （１Ｈ，ｓ）， ４．１９−４．２３（１Ｈ， ｍ），４．８８ （１Ｈ，ｔ，Ｊ＝ ５．５ Ｈｚ），４．９４ （１Ｈ， ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），５．２３ （１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３ Ｈｚ）， ６．１７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６ Ｈｚ，Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ）， ７．７１ （１Ｈ，ｓ），１１．３０（１Ｈ，ｂｒ）

上述のようにして得られた２’−デオキシ−５−ヒドロキシメチルウリジン（２．２ｇ，８．５ ｍｍｏｌ）を無水ジオキサンで５回共沸し、無水ジオキサン（４０ｍＬ）に懸濁した。クロロトリメチルシラン（５．４ｍＬ，４３ｍｍｏｌ）を加え、密栓して６５℃の温度で一時間撹拌を行った。次いで、反応溶液を室温（約２５℃）に戻し、溶媒を減圧留去した後、残渣に無水ジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）を加えた。次いで、アジ化ナトリウム（２．８ｇ，４３ ｍｍｏｌ）を加え、室温で５分間撹拌を行った。水（１００ ｍＬ）を加えたのち、クロロホルム−ピリジン（１：１， ｖ／ｖ）を有機層として逆抽出を行った。有機層を回収して溶媒を減圧留去したのち、無水ジメチルホルムアミドで５回共沸し、残渣に無水ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）を加えた。イミダゾール（３．５ ｇ，５１ｍｍｏｌ）、ｔ−ブチルクロロジメチルシラン（３．８４ ｇ，２５．６ ｍｍｏｌ）を加え、室温（約２５℃）で２時間撹拌を行った。次いで、酢酸エチル（１５０ｍＬ）を加え、有機層を水（１００ ｍＬ）で洗浄を行い、次いで、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ ｍＬ）で有機層を２度洗浄を行った。次いで、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。ヘキサン−クロロホルム（９：１，ｖ／ｖ）を溶出溶媒にシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し５−アジドメチル−３’，５’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−２’−デオキシウリジンを得た。（３．９５ｇ， ７．７ ｍｍｏｌ、収率：９１％）

^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３）δ０．０９（６Ｈ，ｓ），０．１２（６Ｈ，ｓ），０．９０（９Ｈ，ｓ），０．９３（９Ｈ，ｓ），１．９５−２．０６（１Ｈ，ｍ），２．２７−２．３４（１Ｈ，ｍ），３．７４−３．９０（２Ｈ，ｍ），３．９４−３．９８（１Ｈ，ｍ），４．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．８Ｈｚ），４．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．８Ｈｚ），４．３９−４．４１（１Ｈ，ｍ），６．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．７１（１Ｈ，ｓ），８．０３（１Ｈ，ｂｒ）；^１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３） −５．５，−４．９，−４．７，１７．９，１８．３，２５．６，２５．８，４１．４，４６．９，６２．７，７１．９，８５．１，８７．８，１０９．２，１３８．１，１４９．９，１６２．８

上述のようにして得られた５−アジドメチル−３’，５’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−２’−デオキシウリジン（２．１ｇ，４ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（４０ｍＬ）に溶解した後、炭酸ナトリウム水溶液（０．１ Ｍ，８０ｍＬ）を加えた。テトラブチルアンモニウムブロマイド（６４４ ｍｇ，２ｍｍｏｌ）、及び２，４，６−トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロライド（１．８６ｇ， ６．０ ｍｍｏｌ）を加え激しく一時間撹拌した。クロロホルムで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で有機層を二度洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥しせ、溶媒を減圧下留去した。残渣に無水ジオキサン（５０ｍＬ）を加え、アンモニアガス雰囲気下、６時間撹拌を行った。溶媒を減圧留去したのち、クロロホルム（２０ｍＬ）で希釈し飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で有機層を２度洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下留去し、クロロホルム−メタノール（９８：２，ｖ／ｖ）を（溶出溶媒にシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し５−アジドメチル−３’，５’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−２’−デオキシシチジンを得た（１．３３ｇ， ２．７ ｍｍｏｌ、収率：６４％）。

^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３）δ０．０６（６Ｈ，ｓ），０．１１（６Ｈ，ｓ），０．８８（９Ｈ，ｓ），０．９３（９Ｈ，ｓ），１．９２−２．０３（１Ｈ，ｍ），２．４１−２．５１（１Ｈ，ｍ），３．７３−３．９２（２Ｈ，ｍ），３．９４−３．９７（１Ｈ，ｍ），４．０８（２Ｈ，ｓ），４．３２−４．３７（１Ｈ，ｍ），６．２６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），７．８１（１Ｈ，ｓ）

５−アジドメチル−３’，５’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−２’−デオキシシチジン（１．３ｇ，２．５５ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解し、１０％ Ｐｄ−Ｃ（１２８ ｍｇ）を加え水素ガス雰囲気下４時間撹拌を行った。反応系をセライト濾過した後、溶媒を減圧下留去した。残渣を無水ジメチルホルムアミドで５回共沸したのち、無水ジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）に溶解した。１，１’−カルボニル−ビス−１Ｈ−イミダゾール（４５５ｍｇ，２．８ｍｍｏｌ）を加え３時間撹拌を行った。酢酸エチル（３００ｍｌ）で希釈し、有機相を水で一度洗浄し、次いで、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２度有機相を洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下留去し、クロロホルム−メタノール（９９：１，ｖ／ｖ）を溶出溶媒にシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し６−（２−デオキシ−３，５−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４，６−ジヒドロ−１Ｈ，３Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７−ジオンを得た（１．３３ｇ， ２．７ ｍｍｏｌ、収率：８５％）。

^１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ）δ０．０５（６Ｈ，ｓ），０．０７（６Ｈ，ｓ），０．８５（１８Ｈ，ｓ），２．０５−２．１１（１Ｈ，ｍ），２．１８−２．２７（１Ｈ，ｍ），３．７１−３．７３（２Ｈ，ｍ），３．８２−３．８８（１Ｈ，ｍ），４．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．１Ｈｚ），４．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．１Ｈｚ），４．２８−４．３４（１Ｈ，ｍ）， ６．０９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），７．３２（１Ｈ，ｓ），７．７９（１Ｈ，ｓ），１０．１０（１Ｈ，ｓ）；^１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ） −５．４，−５．４，−４．９，−４．７，１７．７，１８．０，２５．７，２５．７，３８．３，４０．５，６２．６，７２．０，８５．６，８７．２，９７．２，１３７．９，１５２．６，１５４．０，１６０．７

上述のようにして得られた６−（２−デオキシ−３，５−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−β−Ｄ−リボフラノシル）−４，６−ジヒドロ−１Ｈ，３Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７−ジオン（４０９ｍｇ，０．８ｍｍｏｌ）を無水アセトニリルで５回共沸したのち、テトラブチルアンモニウムフルオライドハイドレート（６２７ｍｇ，２．４ｍｍｏｌ，無水テトラヒドロフラン溶液（１０ｍＬ））を加え、３時間撹拌を行った。次いで、水（３０ｍＬ）に希釈し、水層をクロロホルムで３回洗浄したのち、エタノールを用いて共沸しながら溶媒を減圧下留去した。メタノール−水（７：３，ｖ／ｖ）から結晶化させ６−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４，６−ジヒドロ−１Ｈ，３Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７−ジオン（ｄＣｈｐｐ）を得た（２０４ ｍｇ， ０．７１ ｍｍｏｌ、収率：８９％）。

^１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ１．９１−２．１０（１Ｈ，ｍ），２．１７−２．２３（１Ｈ，ｍ），３．５２−３．６３（２Ｈ，ｍ），３．７７−３．８３（１Ｈ，ｍ），４．０９（１Ｈ，ｓ），４．１８−４．２２（１Ｈ，ｍ），５．００（１Ｈ，ｂｒ），５．２４（１Ｈ，ｂｒ），６．１０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），７．３３（１Ｈ， ｂｒ），８．０３（１Ｈ，ｓ），１０．０７（１Ｈ，ｂｒ）

実施例１
製造例１で得られたｄＣｐｐｐを、１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０に１μＭになるように溶解して得られたｄＣｐｐｐ溶液を３６９ｎｍで励起し、蛍光スペクトルの測定を行った。また、比較として、比較製造例１で得られたｄＣｈｐｐについても同様にして溶液を作製し、３００ｎｍで励起して、蛍光スペクトルの測定を行った。結果を表１及び図１に示す。図１は、蛍光スペクトルの測定を行った結果を示すグラフであり、横軸は波長、縦軸は強度を示す。

表１及び図１から明らかなように、比較製造例１によって得られたｄＣｈｐｐは、６０ｎｍのストークスシフトを有しているのに対し、製造例１によって得られたｄＣｐは、４９０ｎｍに放射光を有しており、比較製造例１によって得られたｄＣｈｐｐよりも長波長に蛍光発光を有し、かつ大きなストークスシフトを示すことがわかった。

蛍光スペクトルの測定を行った結果を示すグラフである。

Claims (11)

1. 下記一般式（１）で表わされるヌクレオシド誘導体。
   

   

   （上記式中、Ｒ^１は、水素、又はアルコキシ基を有していてもよいトリチル基を表し、Ｒ^２は水素、アルコキシ基、アルコキシアルキルオキシ基、２−シアノエチル基、水酸基、又はハロゲンを表し、Ｘ、Ｙ及びＺは、同一であっても異なっていてもよく、Ｎ又はＣＲ^３を表わし、Ｒ^３は、水素、アルキル基、ニトロ基、アミノ基、ジアルキルアミノ基、シアノ基、アリール基、ヘテロアリール基、又はアルコキシ基を表わす。また、Ｘ及びＹ、又はＹ及びＺが共にＣＲ^３で表される場合には、それらが互いに結合して環構造を形成していてもよい。）
2. Ｘ、Ｙ及びＺがＣＨである、請求項１に記載のヌクレオシド誘導体。
3. Ｒ^１が水素である、請求項１又は２に記載のヌクレオシド誘導体。
4. Ｒ^１が、下記一般式（２）で表わされる基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヌクレオシド誘導体。
   

   

   （上記式中、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６は、同一であっても異なっていてもよく、水素、又はアルコキシ基である。）
5. 下記一般式（３）で表わされるヌクレオシド誘導体。
   

   

   （上記式中、Ｒ^１は、水素、又はアルコキシ基を有していてもよいトリチル基を表し、Ｒ^２は水素、アルコキシ基、アルコキシアルキルオキシ基、２−シアノエチル基、水酸基、又はハロゲンを表し、Ｘ、Ｙ及びＺは、同一であっても異なっていてもよく、Ｎ又はＣＲ^３を表わし、Ｒ^３は、水素、アルキル基、ニトロ基、アミノ基、ジアルキルアミノ基、シアノ基、アリール基、ヘテロアリール基、又はアルコキシ基を表わし、Ｒ^７はリン酸保護基を表し、Ｒ^８は窒素原子上に炭素数１〜６個の同一又は異なるアルキル基が２個結合したジアルキルアミノ基を表す。また、Ｘ及びＹ、又はＹ及びＺが共にＣＲ^３で表される場合には、それらが互いに結合して環構造を形成していてもよい。）
6. Ｘ、Ｙ及びＺがＣＨである、請求項５に記載のヌクレオシド誘導体。
7. Ｒ^１が水素である、請求項５又は６に記載のヌクレオシド誘導体。
8. Ｒ^１が、下記一般式（２）で表わされる基である、請求項５〜７のいずれか１項に記載のヌクレオシド誘導体。
   

   

   （上記式中、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６は、同一であっても異なっていてもよく、水素、又はアルコキシ基である。）
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のヌクレオシド誘導体からなる群から選択された少なくとも１種のヌクレオシド誘導体を含むオリゴ核酸。
10. オリゴＤＮＡ又はオリゴＲＮＡである、請求項９に記載のオリゴ核酸。
11. 請求項９又は１０に記載のオリゴ核酸を含んでなる、遺伝子解析用プローブ。
    
    

Images