JP2007108146A - ウエルの配列方向を検出する方法および光分析装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 マイクロプレートのウエルの配列方向を検出する方法を提供する。
【解決手段】 倒立型蛍光顕微鏡の液浸対物レンズがマイクロプレート２０の底面に対して予め定められた形状と大きさの軌跡２５を水平方向に描くように、ステージ８を水平方向に移動させる。液浸対物レンズが軌跡２５を描く間にマイクロプレート２０の底面からの反射光を測定する。反射光の強度に基づいて軌跡２５が横切ったウエル壁２３の位置を検出する。さらに、検出されたウエル壁２３の位置から軌跡２５がつくる正方形の中に交差したウエル壁２３の十字２４を検出する。さらに、十字２４の中心で交差するプレートＸ軸２７およびプレートＹ軸２８、すなわちウエル２２の配列方向を検出する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、マイクロプレートのウエルの配列方向を検出する方法および光分析装置に関する。

光分析装置に用いられるマイクロプレートは、業界規格（ＳＢＳ規格：Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）に準拠されて形成されている。業界規格では、プレート本体の外形サイズが同じで、ウエル数が例えば９６ウエル、３８４ウエル、１５３６ウエルのように規定されている。これらのウエル数が増加したすなわちウエルが細分化されたマイクロプレートでは、ウエルを分離する隔壁の厚さが１ｍｍ以下に形成されている。

特開２００２−１４０３５号公報は、マイクロプレートのウエルが細分化すると、１つのマイクロプレートから得た各測定データを管理することが困難となる問題点を挙げ、この問題点を解決するために、マイクロプレート自体に配置状態を示す所定の標識を設け、標識の投影像を撮像素子により検出し、検出した投影像の状態に基づいて、各ウエルからの各光が成す各投影像の形成位置を認識することを開示している。

特開２００３−５７１８０号公報は、２次元状に広がるサンプルの位置決めを容易に行うために、サンプルを透過またはサンプル表面で反射した励起光を受光する２次元状の受光素子と、この受光素子による観察像に基づいてサンプルの位置を決定し移動させることを開示している。
特開２００２−１４０３５号公報 特開２００３−５７１８０号公報

しかしながら、特開２００２−１４０３５号公報に記載の配置状態を示す標識を設けたマイクロプレートを専用容器とすると、業界規格に従っていても標識のないマイクロプレートは利用できないので、ユーザーにとって不便である。また、特開２００３−５７１８０号公報に記載されるように受光素子による観察像を得るためには、観察用のカメラを設けることが必要になるので、装置全体が大きくなってしまう。

本発明の目的は、マイクロプレートのウエルの配列方向を検出する方法および光分析装置を提供することにある。

本発明によるマイクロプレートのウエルの配列方向を検出する方法は、複数のウエルを有するマイクロプレートと対物レンズとを相対的に移動させながら、前記マイクロプレートの底面に光を照射し、前記対物レンズを介して底面からの反射光の強度を測定するステップと、測定された前記反射光の強度に基づいてウエル壁の形状を検出するステップと、検出された前記ウエル壁の形状に基づいてウエル配列方向を検出するステップとを有している。

本発明によるマイクロプレートのウエルの配列方向を検出する方法は、複数のウエルを有するマイクロプレートと対物レンズとを相対的に移動させながら、前記マイクロプレートに光を照射し、前記対物レンズを介して前記マイクロプレートからの蛍光を測定するステップと、測定された前記蛍光の強度に基づいてウエル壁の形状を検出するステップと、検出された前記ウエル壁の形状に基づいてウエル配列方向を検出するステップとを有している。

本発明による光分析装置は、複数のウエルを有するマイクロプレートを移動させるステージと、前記マイクロプレートからの光を受光する対物レンズと、前記ステージが前記マイクロプレートを移動させるとともに、前記対物レンズが前記マイクロプレートからの光を受光して得られた光の強度に基づいてウエル壁の形状を検出するウエル壁検出手段と、検出された前記ウエル壁の形状に基づいてウエル配列方向を検出する配列方向検出手段とを備え、前記対物レンズは、前記マイクロプレートの底面からの反射光、または、前記ウエルと前記ウエル壁が発する蛍光を受光する。

本発明によれば、マイクロプレートのウエルの配列方向を検出する方法および光分析装置が提供される。

＜第一実施形態＞
本発明の第一実施形態である蛍光分析装置１０を以下に説明する。図２に本実施形態の蛍光分析装置１０を示す。蛍光分析装置１０は、光源５と、共焦点光学系を用いた倒立型蛍光顕微鏡１と、蛍光標識された試料が発する蛍光を取得して電気信号に変換する光電気信号変換部２と、光電気信号変換部２で求めた測定データに基づいて試料の特性を求めるデータ処理装置３と、求めた測定データに基づいて試料の各種特性を表示する表示装置４とを有する。また、蛍光分析装置１０には、上記各部を制御する制御装置６（図５を参照）が設けられる。光源５は例えばレーザー光発生装置で構成される。光電気信号変換部２はフォトマルチプライヤやアバランシェフォトダイオードで構成される。

倒立型蛍光顕微鏡１は、マイクロプレート２０を移動させるステージ８と、マイクロプレート２０からの光を受光する液浸対物レンズ７と、液浸対物レンズ７とマイクロプレート２０との間に液体１５を供給する液体供給装置１９と、ステージ８をｘｙ方向に駆動するステージ駆動装置９と、光源５で発生した光を液浸対物レンズ７に導く光経路１６と、液浸対物レンズ７で得られた光を光電気信号変換部２に導く光経路１７とを有する。

液浸対物レンズ７の上方には、マイクロプレート２０が配置される。図３にマイクロプレート２０を上から見た図（液浸対物レンズ７はマイクロプレート２０の下に配置されていて見えない）を示す。マイクロプレート２０のＩＶ−ＩＶ断面で、マイクロプレート２０と液浸対物レンズ７を側面から見た図を図４に示す。マイクロプレート２０は、図４に示すように容器支持部材であるステージ８に支持されて、液浸対物レンズ７の上方に配置される。マイクロプレート２０の底面２１と液浸対物レンズ７との間には、液体供給装置１９によって、液体供給ノズルから液体１５が供給される。ステージ８がｘｙ方向に駆動されることによって、マイクロプレート２０はｘｙ方向に移動する。マイクロプレート２０としては、試料を収容する凹形の容器であるウエル２２を複数持ち、光源５からの光を透過する底面２１を有するものが好ましい。

図５に制御装置６を示す。制御装置６は、光源５および光経路１６，１７に配置された光学装置を制御する光源・光学系制御部６１、ステージ駆動装置９を制御するステージ制御部６２、液体供給装置１９を制御する液体供給制御部６３、液浸対物レンズ７の移動や焦点合わせを制御する対物レンズ制御部６４、各制御部６１〜６４に命令を与える中央制御部６０を有する。

これまでに述べた装置構成において、光源５と光経路１６上に配置された光学装置は、マイクロプレート２０に光を照射する光学系を構成している。また、光経路１７上に配置された光学装置は、マイクロプレート２０からの光を受光して得られた光の強度に基づいてウエル壁の形状を検出するウエル壁検出手段を構成している。さらに、データ処理装置３は、前述した試料の特性を求める機能のほかに、検出されたウエル壁の形状に基づいてウエル配列方向を検出する配列方向検出手段としても機能する。

図６に蛍光分析装置１０の運転手順を示す。蛍光分析装置の運転手順を、（１）準備、（２）ウエル２２の配列方向の検出、（３）蛍光測定、（４）終了の４つの過程に沿って説明する。

（１）準備
オペレーターは試料が収容されたマイクロプレート２０をステージ８に乗せ、蛍光分析装置の運転を開始する。（ステップＳ３１）
運転が開始されると、中央制御部６０はステージ制御部６２にステージの駆動を命令する。ステージ制御部６２は、測定を始めるウエル２２ａの下に液浸対物レンズ７が配置されるように、ステージ８を駆動させる。（ステップＳ３２）
中央制御部６０は液浸対物レンズ７とマイクロプレート２０との間に液体１５を供給することを液体供給制御部６３に命令する。液体供給制御部６３は液体供給装置１９を駆動し、液体供給装置１９が液浸対物レンズ７上に予め定められた量の液体１５を供給ノズルから吐出させる。（ステップＳ３３）
中央制御部６０は、液浸対物レンズ７の移動を行うことを対物レンズ制御部６４に命令する。対物レンズ制御部６４は液浸対物レンズ７を光軸方向（ｚ軸方向）でマイクロプレート２０へ近づける。（ステップＳ３４）
（２）ウエル２２の配列方向の検出
次いで中央制御部６０は、液浸対物レンズ７の焦点合わせを行うことを対物レンズ制御部６４に命令し、光源・光学系制御部６１にレーザー光の供給を命令する。光源・光学系制御部６１が光源５からレーザー光を出射するのと同時に、対物レンズ制御部６４はマイクロプレート２０の底面２１上に液浸対物レンズ７の焦点を合わせる。（ステップＳ３５）
中央制御部６０は、マイクロプレート２０を水平方向（ｘｙ平面内）に移動させることをステージ制御部６２に命令するとともに、底面２１からの反射光を測定することをデータ処理装置３に命令する。ステージ制御部６２は、液浸対物レンズ７が底面２１に対して、予め定められた形状と大きさの軌跡２５を水平方向に描くように、ステージ８を水平方向に移動させる。本実施形態では、軌跡２５は一辺がウエル２２の一辺よりも長い正方形で、ウエル壁２３を横切るように描かれ、液浸対物レンズ７が正方形の頂点ａを出発し、頂点ｂ，ｃおよびｄを通過して、再び頂点ａに戻るようにして描かれる。つまり、軌跡２５は閉じており、その内部にウエル壁２３の交差する部分を含む。正方形の辺ａｂおよび辺ｃｄはステージ８のｘ軸であるステージｘ軸１１に平行で、辺ｂｃおよび辺ｄａはステージ８のｙ軸であるステージｙ軸１２に平行である（図１を参照）。

液浸対物レンズ７が軌跡２５を描く間に、データ処理装置３は底面２１からの反射光を測定する。ステージ８の移動が終わると光源・光学系制御部６１はレーザー光の供給を止める。（ステップＳ３６）。

マイクロプレート２０の下から光を照射して底面２１からの反射光を測定すると、ウエル２２の領域とウエル壁２３の領域とでは反射率が異なる。ウエル壁２３の真下の底面２１での反射率はウエル２２の真下の底面２１での反射率より大きい（図７を参照）。したがって、反射光の強度は、ウエル壁２３の真下で大きく、ウエル２２の真下で小さくなるから、軌跡２５に沿って反射光の強度を測定すれば、強度の大小から、軌跡２５上にウエル２２が存在するのか、ウエル壁２３が存在するのかが検出できる。

データ処理装置３は、反射光の強度の大小から軌跡２５が横切ったウエル壁２３の位置を検出し、検出されたウエル壁２３の位置からさらに、軌跡２５がつくる正方形の中に交差したウエル壁２３の十字２４を検出する（図８を参照）。さらにデータ処理装置３は、十字２４の中心で交差するプレートＸ軸２７およびプレートＹ軸２８、すなわちウエル２２の配列方向を検出する（図９を参照）。

そしてデータ処理装置３は、ステージ８のステージｘ軸１１とプレートＸ軸２７とのずれ量２９、およびステージ８のステージｙ軸１２とマイクロプレート２０のプレートＹ軸２８とのずれ量３０を求め（図１０を参照）、その値をステージ制御部６２に送る。（ステップＳ３７）
データ処理装置３が十字２４を検出できない場合、または十字２４の検出に適した測定データが得られなかった場合には、データ処理装置３は中央制御部６０に検出不可の信号を送る（ステップＳ３８）。

データ処理装置３から検出不可の信号を受け取った中央制御部６０は、反射光の測定を再度行うことをステージ制御部６２およびデータ処理装置３に命令する。中央制御部６０は、前回とは異なる位置で軌跡２５を描くことを、または前回とは異なる大きさの軌跡２５を描くことを、ステージ制御部６２に命令する。（ステップＳ３９）
再度、ステージ制御部６２はマイクロプレート２０を水平方向に移動させ、データ処理装置３は底面２１からの反射光を測定する。（ステップＳ３６）
（３）蛍光測定
中央制御部６０は、液浸対物レンズ７の焦点合わせを行うことを対物レンズ制御部６４に命令し、光源・光学系制御部６１にレーザー光の供給を命令する。光源・光学系制御部６１が光源５からレーザー光を供給するのと同時に、対物レンズ制御部６４はマイクロプレート２０のウエル２２中に焦点を合わせる。（ステップＳ４０）
中央制御部６０は、試料が発する蛍光を測定することをデータ処理装置３に命令する。データ処理装置３は蛍光測定を行い、試料の各種特性を求めて表示装置４に表示する。蛍光測定が終わると、光源・光学系制御部６１はレーザー光の供給を止める。（ステップＳ４２）
最初の蛍光測定が終わると、次のウエル２２での蛍光測定のため、中央制御部６０はステージ制御部６２にステージ８の移動を命令する。ステージ制御部６２は、データ処理装置３で求められたずれ量２９，３０に基づいて、ステージ８の移動方向を補正しながら、隣接するウエル２２の下に液浸対物レンズ７が配置されるようにステージ８を駆動させる（ステップＳ４３）。

予定されたウエル２２での蛍光測定がすべて終了するまで、マイクロプレート２０の移動・焦点合わせおよび測定を繰り返す（ステップＳ４１〜ステップＳ４３）。このとき、液浸対物レンズ７とマイクロプレート２０との間の液体１５の量を保つために、途中で液体１５を供給するステップを設けてもよい。

（４）終了
予定されたウエル２２での測定が終了すると、中央制御部６０は、液浸対物レンズ７をマイクロプレート２０から遠ざけることを対物レンズ制御部６４に命令する。対物レンズ制御部６４は命令に従って液浸対物レンズ７をマイクロプレート２０から遠ざける（ステップＳ４４）。この後、オペレーターはマイクロプレート２０を交換する（ステップＳ４５）。

本実施形態では、マイクロプレート２０の底面２１からの反射光の強度に基づいてウエル壁２３の形状を検出し、ウエル壁２３の形状に基づいてウエル２２の配列方向を検出している。このため、マイクロプレート２０に特定の標識を設けたり、観察用のカメラを新たに追加したりすることなく、ウエル２２の配列方向を検出できる。

本実施形態によれば、ウエル壁２３の十字２４を検出し、検出された十字２４からウエル２２の配列方向とステージ８の移動方向とのずれ量を検出して、ずれ量を基にステージ８の移動方向と移動量を補正することによって、マイクロプレート２０を精度良く移動することができるので、細分化されたウエル２２中の試料について各種特性を精度良く求めることができる。

＜第二実施形態＞
第一実施形態では、１ヵ所で液浸対物レンズ７が軌跡２５を描き、そこでウエル壁２３の十字２４を検出して、ウエル２２の配列方向とステージ８の移動方向とのずれ量を求めたが、本実施形態では、２ヶ所で液浸対物レンズ７が軌跡２５，５６を描き、ウエル壁の十字の中心座標を検出し、２つの座標からステージ８の移動方向とのずれ量を求める（図３を参照）。本実施形態では、蛍光分析装置の運転方法のうち、（１）準備、（３）本測定および（４）終了は図６に示した手順と同じである。

本実施形態でのウエル２２の配列方向の検出の手順を、図１１を用いて説明する。図１１は、蛍光分析装置の運転方法のうち、（２）ウエル２２の配列方向の検出の手順部分を示している。

本実施形態では、データ処理装置３は測定データに基づいて、１つ目のウエル壁２３がつくる十字２４およびその中心２６（図３を参照）を検出する。（ステップＳ３５〜ステップＳ３９）
その後、中央制御部６０がステージ制御部６２にステージ８の駆動を命令する。ステージ制御部６２は、ウエル２２ｂの下に液浸対物レンズ７が配置されるように、ステージ駆動装置９を制御してステージ８を移動させる。（ステップＳ５０）
軌跡２５で行ったのと同様に、データ処理装置３は軌跡５６でのウエル壁２３の位置を検出し、２つ目のウエル壁の十字とその中心５７（図３を参照）を検出する。（ステップＳ５１〜ステップＳ５４）
そして、データ処理装置３は検出した２つの中心２６および中心５７から、ウエル２２の配列方向とステージ８の移動方向とのずれ量を求め、ステージ制御部６２に送る。（ステップＳ５５）
本実施形態によれば、マイクロプレート２０上で、離れた２点のウエル壁２３の中心２６および中心５７を利用するので、ウエル２２の配列方向とステージ８の移動方向とのずれ量をより精度良く検出できる。したがって、マイクロプレート２０をより精度良く移動することができるので、細分化されたウエル２２中の試料について各種特性をより精度良く求めることができる。

上記２つの実施形態では、ウエル２２の配列方向とステージ８の移動方向とのずれ量を検出するために、底面２１に焦点合わせをして、液浸対物レンズ７が描いた軌跡２５に沿って底面２１からの反射光の強度を測定し、反射光の強度からウエル壁２３を検出したが、ウエル２２中に焦点合わせをして、液浸対物レンズ７が描いた軌跡２５に沿ってウエル２２内の試料やウエル壁２３自体が発する蛍光を測定し、蛍光強度からウエル壁２３を検出するようにしてもよい。

また、測定された反射光の強度や蛍光の強度からウエル壁２３を検出するときに、強度の大小でウエル２２とウエル壁２３との境界を検出しても、予め決めたしきい値と比較してウエル壁２３を検出してもよい。

また、上記２つの実施形態では、軌跡２５を正方形としたが、ウエル壁２３がつくる十字２４が特定できれば、軌跡はどのような形状でもよく、閉じていなくてもよい。

また、上記２つの実施形態では、ウエル２２が正方形であるマイクロプレート２０について、ウエル壁２３を検出したが、ウエルがハニカム（六角形）や円形の場合でも、予め、ウエルの形状、大きさ、配置、ウエル壁の形状などのマイクロプレートの情報を制御装置で利用でき、かつ、ウエルの配列方向が特定できる軌跡を描くようにステージ８を移動することによって、ウエルの配列方向を検出することができる。

また、上記２つの実施形態で説明した蛍光分析装置は、試料を計測または観察するための対物レンズや光学部品を用いてマイクロプレートの位置を検出できるので、位置検出用の観察装置が不要となるから、装置全体を小型化することができる。また、位置検出用の標識が付けられていない標準のマイクロプレート２０を使用することができ、ユーザーの利便性が高い。

マイクロプレートと軌跡の位置関係を示している。 本発明の第一実施形態の蛍光分析装置を示している。 マイクロプレートの上面図である。 図３のＩＶ−ＩＶ線に沿った断面図であり、マイクロプレートと液浸対物レンズの配置を示している。 図２の蛍光分析装置の制御装置を示している。 図２の蛍光分析装置の運転手順を示している。 マイクロプレートの底面での反射率とウエル壁の位置との関係を示している。 マイクロプレートの底面に対する液浸対物レンズの相対移動の軌跡とウエル壁とを示している。 マイクロプレートの底面に対する液浸対物レンズの相対移動の軌跡とプレートＸ軸およびプレートＹ軸とを示している。 ステージｘ軸およびステージｙ軸とプレートＸ軸およびプレートＹ軸とを示している。 本発明の第二実施形態によるウエルの配列方向の検出手順を示している。

符号の説明

１…倒立型蛍光顕微鏡、２…光電気信号変換部、３…データ処理装置、４…表示装置、５…光源、６…制御装置、７…液浸対物レンズ、８…ステージ、９…ステージ駆動装置、１０…蛍光分析装置、１１…ステージｘ軸、１２…ステージｙ軸、１５…液体、１６…光経路、１７…光経路、１９…液体供給装置、２０…マイクロプレート、２１…底面、２２…ウエル、２２ａ…ウエル、２２ｂ…ウエル、２３…ウエル壁、２４…十字、２５…軌跡、２６…中心、２７…プレートＸ軸、２８…プレートＹ軸、２９…ずれ量、３０…ずれ量、５６…軌跡、５７…中心、６０…中央制御部、６１…光源・光学系制御部、６２…ステージ制御部、６３…液体供給制御部、６４…対物レンズ制御部。

Claims (5)

1. 複数のウエルを有するマイクロプレートと対物レンズとを相対的に移動させながら、前記マイクロプレートの底面に光を照射し、前記対物レンズを介して底面からの反射光の強度を測定するステップと、
   測定された前記反射光の強度に基づいてウエル壁の形状を検出するステップと、
   検出された前記ウエル壁の形状に基づいてウエル配列方向を検出するステップと
   を備えることを特徴とするマイクロプレートのウエルの配列方向を検出する方法。
2. 前記反射光の強度を測定するステップは、前記マイクロプレートに対する前記対物レンズの軌跡がウエル壁を横切るように、前記マイクロプレートと前記対物レンズとを相対的に移動させるステップを含むことを特徴とする請求項１のマイクロプレートのウエルの配列方向を検出する方法。
3. 前記軌跡の形状は閉じており、かつ内部にウエル壁の交差する部分を含むことを特徴とする請求項２のマイクロプレートのウエルの配列方向を検出する方法。
4. 複数のウエルを有するマイクロプレートを移動させるステージと、
   前記マイクロプレートからの光を受光する対物レンズと、
   前記ステージが前記マイクロプレートを移動させるとともに、前記対物レンズが前記マイクロプレートからの光を受光して得られた光の強度に基づいてウエル壁の形状を検出するウエル壁検出手段と、
   検出された前記ウエル壁の形状に基づいてウエル配列方向を検出する配列方向検出手段とを備え、
   前記対物レンズは、前記マイクロプレートの底面からの反射光、または、前記ウエルと前記ウエル壁が発する蛍光を受光することを特徴とする光分析装置。
5. 複数のウエルを有するマイクロプレートと対物レンズとを相対的に移動させながら、前記マイクロプレートに光を照射し、前記対物レンズを介して前記マイクロプレートからの蛍光を測定するステップと、
   測定された前記蛍光の強度に基づいてウエル壁の形状を検出するステップと、
   検出された前記ウエル壁の形状に基づいてウエル配列方向を検出するステップと
   を備えることを特徴とするマイクロプレートのウエルの配列方向を検出する方法。

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