JP2007306867A

JP2007306867A - 核酸抽出装置及び核酸抽出方法

Info

Publication number: JP2007306867A
Application number: JP2006140255A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiro Yamashita; 善寛山下; Tomoya Sakurai; 智也桜井
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp; Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2006-05-19
Filing date: 2006-05-19
Publication date: 2007-11-29
Also published as: CN101074440A; US20070269829A1; DE102007021952A1

Abstract

【課題】核酸を含有する試料から、高い核酸回収効率と精製度で迅速に核酸抽出を行うことが可能な核酸抽出装置及び方法を実現する。
【解決手段】核酸抽出器具１１はリブ１９を介してスタンド４１に保持される（Ａ）。溶液は第１開口部１４から第１容器１５に搬入用ピペットチップ４２で搬入される。第１容器１５内、第２容器１３内の圧力を各々制御する加減圧機器４３が第１開口部１４、第２開口部１２に接続部材４４を介して密着される（Ｂ）。加減圧機器４３により第１容器１５内が加圧され第２容器１３内が減圧され溶液が容器１５から１３へ固相１６を介して移動する（Ｃ）。溶液を固相１６を通して移動させる動作を適切な回数行ない加減圧機器４３を第１、２開口部１４、１２から外す。第２容器１３に移動した溶液は第２開口部１２から搬出用ピペットチップ４５により吸引され、器具１１外へ搬出される（Ｄ）。
【選択図】図４

Description

本発明は、核酸を含有する試料から核酸を抽出する核酸抽出装置及び方法に関する。

遺伝情報を担う物質である核酸の分析は、学術研究や医療等の多岐の分野で実施されている。核酸の分析方法としては主に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の核酸増幅技術の利用が多い。ここで、ＰＣＲとは核酸を塩基配列特異的に増幅する方法であり、ＰＣＲを応用することで目的の遺伝子の検出や定量等が可能である。

ＰＣＲ等の核酸分析を行うにあたっては、生物試料等から核酸を抽出し、分析反応に対する阻害物質を含有しない状態に精製する必要がある。

生物試料から核酸を抽出する方法としては、カオトロピック物質の存在下でシリカ含有固相に核酸が結合する性質（非特許文献１）がある。この性質に基づいて、配管内部にシリカ含有の固相を内蔵する核酸抽出器具を用て、核酸を抽出する方法がある（特許文献１、特許文献２）。

この方法は、生物試料とカオトロピック物質を混合して生物試料から核酸を遊離させ、核酸とカオトロピック物質を含む溶液を核酸抽出器具で吸排することにより混合液を固相に接触させて核酸を固相に結合させる。そして、固相から不純物を除去する為の溶液を核酸抽出器具で吸排することにより溶液を固相に接触させて固相から不純物を除去し、核酸を固相から溶離する為の溶液を核酸抽出器具で吸排することにより溶液を固相に接触させて核酸を固相から溶離する方法である。

特開平１１−１２７８５４号公報特開２００５−２４１２９９号公報 B.Vorgelstein and D. Gillespie, Proc. Nati. Acad. Sci. UAS, 76(2), 615-619 (1979)

上述した特許文献１、２に記載された方法によれば、核酸抽出器具により溶液を吸排することで、固相と溶液の接触効率を向上させ、核酸と固相の結合、洗浄、及び溶離効率を向上させ、高い回収効率と精製度の核酸抽出を実現することができる。

しかしながら、上記方法では、生体試料を含有し高い粘性を有する溶液を固相に通過させて、吸引・排出する操作には、長い時間を要してしまう。特に、吸引操作においては、核酸抽出器具内外の圧力差は、最大でも１気圧未満となり吸引力が制約されることから所要時間が長く、核酸抽出全工程の所要時間が長い期間となってしまっていた。

本発明の目的は、核酸を含有する試料から、高い核酸回収効率と精製度で迅速に核酸抽出を行うことが可能な核酸抽出装置及び方法を実現することに関する。

本発明は、第１の容器と第２の容器とを孔で連通し、この孔内に核酸捕捉部を配置し、第１の容器部内及び第２の容器部内のいずれか一方を加圧すると共に、他方を減圧して、試料溶液を核酸捕捉部を介して往復移動させる。

本発明により、核酸を含有する試料から、高い核酸回収効率と精製度で迅速に核酸を抽出することが可能となる。

以下、本発明の実施形態について、図面を参照して説明する。

図1は、本発明の一実施形態である核酸抽出装置に使用される核酸抽出器具（核酸抽出容器）の概略構成図である。そして、図２は、図１におけるA−A線に沿った断面図であり、図３は図１におけるB−B線に沿った断面図である。

図1〜３において、本発明の一実施形態における核酸抽出器具１１は、上部に第１開口部１４、第２開口部１２を有する２つの容器１３、１５が、容器下部で核酸結合用の固相１６を挿入した通路１７により連結されたものである。

つまり、核酸抽出器具１１は、第１開口部１４を有する第一容器１５と、第２開口部１２を有する第２容器１３とが、固相１６が挿入された連絡通路１７を有する隔壁板１８で隔てられ、開口部１２、１４の外周に円板状のリブ１９を備えている。

第１開口部１４及び第２開口部１２には加減圧機器が脱着可能であり、加減圧機器が接続した状態においては第１容器１５及び第２容器１３の気密が保持される構造である。第１容器１５及び第２容器１３には、第１開口部１４及び第２開口部１２を通じて、溶液を分注、或いは吸引する為のピペットチップ等が挿入可能である。

固相１６は、その側面が連絡通路１７の内壁に密着する状態で挿入されており、連絡通路１７を通過する溶液は固相１６内部を通過する。リブ１９は核酸抽出器具１１をスタンド等に保持し、且つ、核酸抽出器具１１と加減圧機器の接続における接触面積を維持し気密性を向上させるための構造である。

次に、本発明の核酸抽出器具１１により、溶液を固相に対して、往復して通過させる方法を図４を参照して説明する。

図４の（Ａ）に示すように、核酸抽出器具１１は、リブ１９を介して、スタンド４１に保持される。そして、溶液は第１開口部１４を通じて、第１容器１５に、搬入用ピペットチップ４２により搬入される。

次に、図４の（Ｂ）に示すように、第１容器１５内及び第２容器１３内の圧力を各々制御する為の加減圧機器４３が第１開口部１４及び第２開口部１２に接続部材４４を介して密着される。ぞして、図４の（Ｃ）に示すように、第１開口部１４に密着した加減圧機器４３によって第１容器１５内が加圧されるとともに、第２開口部１２に密着した減圧機器４３により第２容器１３内が減圧され、溶液が第１容器１５から第２容器１３へと連絡通路１７を通して移動する。

次いで、図４の（Ｂ）に示すように、第１開口部１４に密着した加減圧機器４３によって第１容器１５内が減圧されるとともに、第２開口部１２に密着した加減圧機器４３により第２容器１３内が加圧され、溶液が第２容器１３から第１容器１５内へと連絡通路１７を通して移動する。

同様にして、溶液を第１容器１５から第２容器１３へと連絡通路１７を通して移動させる動作を適切な回数行なった後、加減圧機器４３が第１開口部１４及び第２開口部１２から外される。その後、図４の（Ｄ）に示すように、第２容器１３に移動した溶液は、第２開口部１２を通じて第２容器１３に挿入された搬出用ピペットチップ４５により吸引され、器具１１外へ搬出される。

なお、第１容器１５においては、容器内の溶液を第２容器１３に移動させる際に、溶液が連絡通路１７に集中するように、連絡通路１７に通じる容器１５の開口部分を最底部に位置するように配慮する。また、第２容器１３においては、連絡通路１７に通じる開口部分を、第１容器１５の開口部分と同じか若しくはより低く、且つ、第２容器１３の最底部よりも高く位置するように配慮する。

これにより、第１容器１５の溶液は、第１容器１５に残留することなく効率的に第２容器１３へ連絡通路１７を通じて移動させられる。そして、第２容器１３に移動した溶液は、第２容器１３に挿入し、先端部を第２容器１３の最低部に接地させたピペットチップ４５により吸引され、第２容器１３に残留することなく効率的に器具外へ搬出される。

即ち、第２容器１３或いは第１容器１５から搬入された溶液は、最終的に全量が第２容器１３へ移動させられ、第２開口部１２を通じて第２容器１３に挿入したピペットチップ４５により吸引され全量が器具１１外へ搬出される。

以上の構造を有するような核酸抽出器具１１としては、図１に示した例の他に、図５〜図７に示す構成のものも考えられる。

つまり、図５に示すように、固相１６が、第１容器１５の最底部に固定化され、連絡通路１７の中心軸が、円筒又は角柱状の容器１５の中心軸方向に延び、溶液が上記中心軸方向に連絡通路１７を移動するような形状とすることもできる。

また、図６に示すように、第１容器１５び第２容器１３が、隔壁板を共有することなく独立した容器形状であり、連絡通路１７で互いに連結されるような形状のものを使用することができる。この場合は、連絡通路１７の中心軸は、図１の例と同様に、円筒又は角柱状の容器１５の中心軸とほぼ垂直な方向に延びる。

また、図７に示すように、配管状の第１容器１５と第２容器１３とから構成され、固相１６が第１容器１５の先端部（底部）に固定化され、この第１容器１５は第２容器１３内に収容される構成となっている。

つまり、第１容器１５と第２容器１３とは接続部２０を介して脱着可能であり、第１容器１５内の溶液は、第１容器１５に接続した加減圧機器により第１容器１５内の陰圧を保持した状態で第１容器１５を第２容器１３から離脱させ、第１容器１５を所定位置に移動させることができる。そして、加減圧機器により第１容器１５内を加圧することにより溶液を第１容器１５から所定位置へと移動させることができる。即ち、この形態において第１容器１５は溶液を容器外へ搬出する為のピペットチップ等の器具としての機能を兼ね備えるものである。

次に、本発明の核酸抽出器具１１を用いた核酸抽出工程を図８を用いて説明する。
図８のステップＳ１において、核酸を含む試料とカオトロピック物質、及び、必要に応じて試料から核酸の遊離を促進する物質、核酸とシリカ含有固相の結合を促進する物質を混合する。

そして、混合液を核酸抽出器具１１の第１容器１５に搬入し、加減圧機器を接続して、混合液を移動させて核酸を固相に結合させ、加減圧機器を外して、第２容器１３に移動した混合液を核酸抽出器具１１外へ搬出する（ステップＳ２〜Ｓ４）。

続いて、固相１６の不純物を除去する為の洗浄液を核酸抽出器具１１の第１容器１５に搬入し、加減圧機器を接続して、混合液を移動させて固相１６の不純物を除去し、加減圧機器を外して、第２容器１３に移動した洗浄液を核酸抽出器具外へ搬出する（ステップＳ５〜７）。

次に、固相１６から核酸を溶離する為の溶液を核酸抽出器具１１の第１容器１５に搬入し、加減圧機器を接続して、混合液を移動させて核酸を固相１６から溶離させ、加減圧機器を外して、第２容器１３に移動したに溶液を精製核酸溶液として回収する（ステップＳ８〜１０）。

次に、本発明の核酸抽出器具を用いた核酸抽出装置の概略構成について、図９〜図１３を参照して説明する。

図９は、本発明の核酸抽出装置の概略平面図である。図９において、核酸抽出装置１００は、レール１０１に溶液搬入ユニット１０２と加減圧ユニット１０３とが保持されている。溶液搬入ユニット１０２はレール１０１に沿ったＹ軸方向に移動可能に取り付けられ、加減圧ユニット１０３はＹ軸方向とＺ軸方向にも移動可能に取り付けられている。

また、Ｘ軸方向に移動可能なアーム１０４には溶液搬出ユニット１０５がアーム１０４に沿ったＹ軸方向、及びＺ軸方向に移動可能に取り付けられている。本体架台の作業面１０６には、核酸抽出器具１１を保持する為のスタンド１０７と、未使用の分注チップラック１０８と、試薬ボトル１０９と、試薬プライミングにおける試薬受け１１０と、混合液と洗浄液の廃液受け１１１と、使用済み分注チップ受け１１２とが配置される。

図１０は、溶液搬入ユニット１０２の概略説明図である。図１０において、溶液搬入ユニット１０２は、溶液を吐出するためのノズル２０１と、このノズル２０１を保持する為のノズルホルダ２０６と、試薬を吸引するためのポンプ２０３と、試薬を切り替えるための切替弁２０４と、切替弁２０４とノズル２０１とを連絡する配管２０２と、切替弁２０４と各試薬を連絡する配管２０５とを備える。

溶液搬入ユニット１０２は、レール１０１のＹ軸方向に沿って試薬受け上部に移動して、切替弁２０４を作動して所定の試薬を選択して一定量をプライミングし、軸方向に沿ってスタンド１０７に保持された所定の核酸抽出器具１１の上部に移動し、所定量の試薬をノズル２０１から吐出して核酸抽出器具１１内に搬入する。

図１１は、加減圧ユニット１０３の概略説明図である。図１１において、加減圧ユニット１０３は、加減圧機器４３であるシリンジ３０３及び３０４と核酸抽出器具１１の開口部１２、１４とを接続する為の接続部材３０１と、シリンジ３０３及び３０４と接続部材３０１とを連絡する配管３０２と、接続部材３０１を保持する為の接続部ホルダ３０５とを備えている。

加減圧ユニット１０３は、レール１０１のＹ軸方向に沿って移動し、スタンド１０７に保持された所定の核酸抽出器具１１の上部に移動し、Ｚ軸下方向に移動し、接続部材３０１を核酸抽出器具１１に密着させ、シリンジ３０３、３０４により所定の圧力で各容器１３、１５内を加圧または減圧し、溶液の移動が完了したら、Ｚ軸上方向に移動し、接続部材３０１を核酸抽出器具１１から外す。

図１２は、溶液搬出ユニット１０５の概略説明図である。図１２において、溶液搬出ユニット１０５は、チップ４５に接続される接続部４０１と、接続部４０１を保持する為の接続部ホルダ４０４と、溶液を吸排するためのシリンジ４０３と、接続部４０１とシリンジ４０３とを連絡する配管４０２とを備える。

溶液搬出ユニット１０５は、Ｘ、Ｙ軸方向に沿って分注チップラック１０８上の所定の位置に移動し、Ｚ軸下方向に移動して分注チップを接続部４０１に圧入して接続する。そして、Ｚ軸上方向に分注チップを引き上げて、スタンド１０７に保持された所定の核酸抽出器具１１の上部にＸ、Ｙ軸方向にそって移動し、Ｚ軸下方向に分注チップを核酸抽出器具１１内に挿入する。続いて、核酸抽出器具１１内の溶液を吸引し、Ｚ軸上方向に分注チップを引き上げて、廃液受け１１２の上部にＸ、Ｙ軸方向に沿って移動し、Ｚ軸下方向に分注チップを廃液受け１１２内に挿入し、溶液を排出する。

次に、Ｚ軸上方向に分注チップ引き上げて、使用済み分注チップ受け１１３の上部にＸ、Ｙ軸方向に沿って移動し、Ｚ軸下方向に分注チップを使用済み分注チップ受け１１３内に挿入する。そして、Ｘ軸方向に沿って移動して分注チップ受け１１３内部に設けられたＵ字溝に接続部４０１を挿入し、Ｚ軸上方向に移動して、Ｕ字溝に分注チップ上部開口部を引っ掛ける状態として分注チップを接続部４０１から外して分注チップ受け１１３に廃棄する。

図１３は、本発明による核酸抽出装置の電気系の概略ブロックダイヤグラムである。図１３において、動作制御部としてのパーソナルコンピュータ（ＰＣ）５００には、操作条件等を入力する為の操作パネルとキーボード５０１と、入力情報や作動状況を表示する為の表示装置（ＣＲＴ）５０２と、装置の各機構部を制御する機構制御部５０３とが接続される。

機構制御部５０３は、溶液を吐出するためのポンプ２０３、試薬種類を切り替えるための切替弁２０４、ノズルホルダ２０６をＹ軸方向に移動させる為のモータ５０４、シリンジ３０３及び３０４により加減圧を行うためのピストン駆動用のモータ５０５及び５０６を制御する。また、機構制御部５０３は、接側部ホルダ３０５をＹ軸方向移動させる為のモータ５０７、接続部ホルダ３０５をＺ軸方向に移動させる為のモータ５０８、シリンジ４０３により溶液を吸排するためのピストン駆動用モータ５０９、溶液搬出ユニット１０５を保持するアーム１０４をＸ軸方向移動させる為のモータ５１０、接続部ホルダ４０４をＹ軸方向移動させる為のモータ５１１、接続部ホルダ４０４をＺ軸方向に移動させる為のモータ５１２を制御する。

核酸抽出装置の各部は、所定のプログラムに基づき、ＰＣからの指令に従って動作する。
ここで、核酸を含有する試料としては、全血、血清、血漿、喀痰、尿、唾液、精液等の組織、細胞、細菌、ウイルス等を含有する体液が使用できる。また、培養細胞、培養細菌、或いは粗精製状態の核酸等が使用できる。

また、カオトロピック物質としては、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン等が使用できる。カオトロピック物質は、試料からの核酸遊離、及び固相と核酸の結合を促進させる物質である。

試料からの核酸遊離は、超音波や攪拌等による物理的な方法、或いは、界面活性剤やタンパク質変性剤等による化学的な方法、或いは、タンパク質分解酵素などによる生化学的な方法、及び、それらを組み合わせた方法によっても促進される。

また、シリカ含有固相と核酸の結合は、有機溶媒の混合によっても促進される。有機溶媒としては、脂肪族アルコール、脂肪族エーテル、脂肪族エステル、脂肪族ケトンの中から選ばれた化合物の１種または２種以上を組み合わせたものを使用できる。脂肪族アルコールとしては、メタノール、エタノール、２−プロパノール、２−ブタノール、ポリエチレングリコール等を使用できる。脂肪族エーテルとしては、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、プロピレングリコールジメチルエーテル、プロピレングリコールジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等を使用できる。

また、脂肪族エステルとしては、乳酸エチル、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート等を使用できる。脂肪族ケトンとしては、アセトン、ヒドロキシアセトン、メチルケトン等を使用できる。

また、固相としては、ガラス粒子、シリカ粒子、ガラス繊維、シリカ繊維、モノリス型シリカ等のシリカを含有する物質、或いは、表面に水酸基等の親水基を有する有機高分子で、内部に複数の連続する通液孔を有する形状が使用できる。また、固相を連絡通路の内壁に密着する状態で挿入し、連絡通路を通過する溶液が固相内部を通過するようにする為に、連絡通路の内壁と固相の側面の間にシール性を有する接続部材を介しても良い。

また、移動する溶液の通液抵抗によって固相が連絡通路から流出することを防止する為に、連絡通路内に挿入した固相の両端に通液性を有する保持部材を挿入しても良い。

また、加減圧機器としては、各容器に対して、移動させる溶液量と同等以上の容積を有するシリンジ或いはポンプ等を使用することができる。なお、加減圧機器と核酸抽出器具の接続においては、加減圧機器と核酸抽出器具に隔てられる空間の気密性を維持する為に、接続部分にシール性を有する接続部材を介することが好ましい。

洗浄液は、シリカ含有固相と核酸の結合を維持し、且つ、シリカ含有固相に結合した不純物を除去し得るものであり、例えば、エタノールまたはジエチレングリコールジメチルエーテルにカオトロピック物質、界面活性剤、緩衝材等を添加した溶液、或いは、エタノールまたはジエチレングリコールジメチルエーテルの水溶液を使用できる。

固相に結合した核酸を溶離する為の溶出液としては、シリカ含有固相から核酸を溶離し得るものであり、例えば、ヌクレアーゼフリーの水、またはヌクレアーゼフリーの低塩濃度の緩衝液を使用できる。また、溶出液には、後述する核酸分析反応に施す為の分析反応用試薬を含有させても良い。例えば、後述する核酸分析反応としてＰＣＲを実施する場合は、ＰＣＲ用試薬（緩衝液、プライマー、酵素、等）を含有する溶出液を使用することが可能であり、この場合は、溶出液から直ちにＰＣＲ反応を開始することができる。

次に、本発明の効果について行なった検証実験について説明する。
ここで、上記検証実験にて使用する試料、試薬、器具について説明する。
１．試料
健常人ヒト血液（抗凝固剤；ＥＤＴＡ・２Ｎａ添加）
２．試薬
２．１カオトロピック溶液
５．５Ｍグアニジン塩酸塩、８０ｍＭＭＥＳ、４７ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ、２０％（ｖ／ｖ）ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、１％（ｖ／ｖ）ディスホーム
２．２酵素溶液、２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
２．３有機溶媒
ジエチレングリコールジメチルエーテル
２．４洗浄液Ａ
９５０ｍＭグアニジン塩酸塩、１４ｍＭＭＥＳ、８ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ、４％（ｖ／ｖ）ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、３０％（ｖ／ｖ）ジエチレングリコールジメチルエーテル、
２．５洗浄液Ｂ
５５％（ｖ／ｖ）エタノール、１４ｍＭ酢酸カリウム、１１ｍＭ酢酸
２．６溶出液、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
３．核酸抽出器具
３．１固相
固相としては、モノリス型シリカ（直径４ｍｍ、長さ２ｍｍ、通液孔径１５μｍ）を用いた。

３．２本発明の核酸抽出器具
本発明の核酸抽出器具としては、図１に示す形状において、各容器の容積を約１ｍｌ、連絡通路を直径４ｍｍ、長さ２ｍｍとして、ポリプロピレン樹脂により作製し、固相を連絡通路に圧入して固定化したものを用いた。

３．３本発明とは異なる他の方法による核酸抽出器具（チップ型核酸抽出器具）
他の方法における核酸抽出器具としては、容器の溶液を約１ｍｌ、固相を保持する先端部の直径を４ｍｍとして、ポリプロピレン樹脂により作製し、固相を先端部に圧入して固定化したチップ型核酸抽出器具を用いた。尚、チップ型核酸抽出器具は、開口部に加減圧機器を接続して、溶液を吸排することにより、溶液を固相に通過させる。
３．４加減圧機器
加減圧機器としては、シリンジ（容積２．５ｍｌ）を用いた。また、核酸抽出器具とシリンジの接続は、各々の接続部形状を考慮したシリコン樹脂製の接続部材を用いた。尚、本発明の核酸抽出器具に対しては２本のシリンジと２個の接続部材を、チップ型核酸抽出器具に対しては１本のシリンジと１個の接続部材を用いる。

本発明の核酸抽出器具による核酸抽出方法を次に示す。
（１）全血０．２ｍｌに酵素溶液０．０２ｍｌとカオトロピック溶液０．２４ｍｌを添加し混合する。

（２）５０℃で２０分間インキュベートする。

（３）有機溶媒０．２ｍｌを添加し混合する。

（４）混合液を核酸抽出器具内に搬入する。

（５）核酸抽出器具に加減圧機器を接続して、混合液を各容器を４．５往復移動させる。

（６）混合液を核酸抽出器具外に搬出する。

（７）洗浄液Ａ１．０ｍｌを核酸抽出器具内に搬入する。

（８）核酸抽出器具に加減圧機器を接続して、混合液を他方容器へと移動させる。

（９）洗浄液を核酸抽出器具外に搬出する。

（１０）洗浄液Ａ１．０ｍｌを核酸抽出器具内に搬入する。

（１１）核酸抽出器具に加減圧機器を接続して、混合液を他方容器へと移動させる。

（１２）洗浄液を核酸抽出器具外に搬出する。

（１３）洗浄液Ｂ１．０ｍｌを核酸抽出器具内に搬入する。

（１４）核酸抽出器具に加減圧機器を接続して、混合液を他方容器へと移動させる。

（１５）洗浄液を核酸抽出器具外に搬出する。

（１６）洗浄液Ｂ１．０ｍｌを核酸抽出器具内に搬入する。

（１７）核酸抽出器具に加減圧機器を接続して、混合液を他方容器へと移動させる。

（１８）洗浄液を核酸抽出器具外に搬出する。

（１９）溶出液０．２ｍｌを核酸抽出器具内に搬入する。

（２０）核酸抽出器具に加減圧機器を接続して、溶出液を各容器を４．５往復移動させる。

（２１）溶出液を核酸抽出器具外に搬出し、精製核酸溶液として回収する。

次に、本発明とは異なる方法であり、比較のための一例における核酸抽出器具の核酸抽出方法１（吸引・吐出による往復通液）を説明する。

（１）全血０．２ｍｌに酵素溶液０．０２ｍｌとカオトロピック溶液０．２４ｍｌを添加し混合する。

（２）５０℃で２０分間インキュベートする。

（３）有機溶媒０．２ｍｌを添加し混合する。

（４）チップ型核酸抽出器具内に上部開口部から混合液を搬入し、加減圧機器を接続し、器具内の混合液を吐出し、４回吸引吐出を行う。（４．５往復吸引吐出）
（５）混合液を廃棄する。

（６）器具内に上部開口部から洗浄液Ａ１．０ｍｌを搬入し、吐出する。

（７）洗浄液を廃棄する。

（８）器具内に上部開口部から洗浄液Ａ１．０ｍｌを搬入し、吐出する。

（９）洗浄液を廃棄する。

（１０）器具内に上部開口部から洗浄液Ｂ１．０ｍｌを搬入し、吐出する。

（１１）洗浄液を廃棄する。

（１２）器具内に上部開口部から洗浄液Ｂ１．０ｍｌを搬入し、吐出する。

（１３）洗浄液を廃棄する。

（１４）器具内に上部開口部から溶出液０．２ｍｌを搬入し、加減圧機器を接続し、器具内の溶出液を吐出し、４回吸引吐出を行う。（４．５往復吸引吐出）
（１５）溶出液を精製核酸溶液として回収する。

次に、本発明とは異なる方法であり、比較のための他の例における核酸抽出器具の核酸抽出方法２（吐出による一方向通液）を説明する。

（２）５０℃で２０分間インキュベートする。

（３）有機溶媒０．２ｍｌを添加し混合する。

（４）チップ型核酸抽出器具内に上部開口部から混合液を搬入し、加減圧機器を接続し、器具内の混合液を吐出する。（１方向吐出）
（５）混合液を廃棄する。

（７）洗浄液を廃棄する。

（９）洗浄液を廃棄する。

（１１）洗浄液を廃棄する。

（１３）洗浄液を廃棄する。

（１４）器具内に上部開口部から溶出液０．２ｍｌを搬入し、加減圧機器を接続し、器具内の溶出液を吐出する。（１方向吐出）
（１５）溶出液を精製核酸溶液として回収する。

次に、検証実験において精製した核酸の評価方法を説明する。
１．核酸濃度と純度の定量
核酸溶液は、分光光度計により２６０ｎｍの吸光度を測定し、５０μｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液の２６０ｎｍの吸光度を１として算出した。また、核酸純度は、分光光度計により２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度を測定し、その比（Ａ２６０／Ａ２８０）の値とした。
２．核酸抽出の所要時間測定
試料に酵素溶液とカオトロピック溶液を添加してインキュベートした後に、有機溶媒を添加して混合液を調製した状態を測定開始点として、核酸溶液を得るまでの所要時間を測定した。

本発明の核酸抽出器具による核酸抽出方法と、本発明とは異なる方法の核酸抽出器具による核酸抽出方法１及び２を比較した実験結果を図１４に示す。

本発明による方法は、他の方法１と比較すると、核酸の濃度と純度は同等以上となり、核酸抽出の所要時間は、本発明が８分に対し他の方法1は１６分必要であり、１／２の短縮となった。この所要時間の差異は、通液抵抗の大きい混合液を固相に対して往復して通液させる時間に主に起因する。

本発明方法は、溶液を固相に対して往復して通液させる際、溶液の各両端に陽圧と陰圧を同時に作用させて圧力差を発生させるため、溶液の移動速度が増加する。一方、他の方法１は、溶液を固相に対して往復して通液させる際、溶液の一端に陽圧または陰圧のみを作用させるため圧力差が小さく、特に、陰圧のみを作用させる場合は、圧力差は最大でも１気圧未満となることから吸引力が制約され、溶液の移動速度が低下するためである。

次に、本発明による方法と他の方法２とを比較すると、本発明は、核酸の濃度は２．６倍の増加、純度は同等以上となり、核酸抽出の所要時間は、他の方法２が５分であるため、本発明は、他の方法２の１．６倍の延長となった。本発明による方法は、試料とカオトロピック物資とを含む混合液、及び、溶出液を固相に対して往復して通液させることにより、核酸と固相の結合効率、及び、溶出効率を向上させて核酸回収効率を向上させている。

一方、他の方法２は、各溶液を固相に対して一方向でしか通液させていないため、所要時間を短縮できるものの、結合効率と溶出効率が低下して核酸回収効率が低下する。

また、本発明の方法は、容器と加減圧機器に隔てられて閉鎖容器で溶液の往復移動を行う為、溶液の移動にともなって発生する飛沫溶液等を外部に流出させることなく、外部環境を汚染する危険を低減している。

一方、他の方法１及び２においては、溶液を核酸抽出器具内部から外部へと吐出する際に、飛沫溶液が発生して外部環境を汚染する危険が高まる。

以上のように、本発明の一実施形態によれば、核酸抽出器具１１を、それぞれ開口部を有する２つの容器部１３、１５を形成し、これら容器１３、１５とを底部において、連通する連絡通路１７を形成し、この連絡通路１７に核酸を捕捉する固相１６を配置する。そして、容器１３又は１５の一方に試料液を収容し、加減圧機器４３を用いて、容器１３、１５の一方を加圧すると共に他方を減圧することを繰り返すことにより、試料液の固相への往復通過を密閉した容器内で迅速に行なっている。

したがって、密閉した器具内で、核酸を含有する試料から、高い核酸回収効率と精製度で迅速に核酸抽出を行うことが可能な核酸抽出装置、核酸抽出方法及びこれに用いられる核酸抽出器具を実現することができる。

本発明の一実施形態である核酸抽出装置に使用される核酸抽出器具の概略構成図である。図１のＡ−Ａ線に沿った断面図である。図１のＢ−Ｂ線に沿った断面図である。核酸抽出器具による核酸抽出の動作説明図である。本発明の核酸抽出器具のその他の例を示す図である。本発明の核酸抽出器具のさらに他の例を示す図である。本発明の核酸抽出器具のさらに他の例を示す図である。本発明の核酸抽出工程を示す図である。本発明の核酸抽出装置を示す図である。核酸抽出装置の溶液搬入ユニットの概略構成図である。核酸抽出装置の加減圧ユニットの概略構成図である。核酸抽出装置の溶液搬出ユニットの概略構成図である。核酸抽出装置の電気系のブロックダイヤグラムを示す図である。本発明による方法と本発明とは異なる方法との検証実験結果を示す表である。

符号の説明

１１核酸抽出器具
１２第２開口部
１３第２容器
１４第１開口部
１５第１容器
１６固相
１７連絡通路
１８隔壁板
１９リブ
２０接続部
４１スタンド
４２搬入用ピペットチップ
４３加減圧機器
４４接続部材
４５搬出用ピペットチップ
１００核酸抽出装置
１０１レール
１０２溶液搬入ユニット
１０３加減圧ユニット
１０４アーム
１０５溶液搬出ユニット
１０６作業面
１０７スタンド
１０８分注チップラック
１０９試薬ボトル
１１０試薬受け
１１１廃液受け
１１２分注チップ受け
２０１ノズル
２０２、３０２配管
２０３ポンプ
２０４切替弁
２０５、４０２配管
２０６ノズルホルダ
３０１接続部材
３０３、３０４シリンジ
３０５、４０４接続部ホルダ
４０１接続部
４０３シリンジ
５００ＰＣ
５０１キーボード
５０２ＣＲＴ
５０３機構制御部
５０４〜５１２モータ

Claims

試料溶液から核酸を抽出する核酸抽出装置において、
試料溶液の核酸を捕捉する捕捉手段と、
上記捕捉手段を介して互いに連通する第１の容器部及び第２の容器部を有する核酸抽出器具と、
上記核酸抽出器具に、溶液を搬入、搬出する手段と、
上記核酸抽出手段の第１の容器部内及び第２の容器部内のいずれか一方を加圧すると共に、他方を減圧する加減圧手段と、
を備えることを特徴とする核酸抽出装置。
請求項１記載の核酸抽出装置において、上記加減圧手段は、上記第１の容器部に接続される第１のシリンジポンプと、上記第２の容器に接続される第２のシリンジポンプとを有することを特徴とする核酸抽出装置。
請求項１記載の核酸抽出装置において、上記搬入搬出手段は、上記核酸抽出手段に試料溶液を搬入し、上記加減圧手段による上記加減圧動作後に、上記核酸抽出手段内の溶液を搬出し、上記核酸抽出手段に洗浄液を搬入し、上記加減圧手段による上記加減圧動作後に、上記核酸抽出手段内の洗浄液を搬出し、上記核酸抽出手段に溶出液を搬入し、上記加減圧手段による上記加減圧動作後に、上記核酸抽出手段内の溶出液を搬出することを特徴とする核酸抽出装置。
試料溶液から核酸を抽出する核酸抽出方法において、
試料溶液の核酸を捕捉する捕捉手段を介して互いに連通する第１の容器部及び第２の容器部の一方に試料溶液を搬入し、
上記第１の容器部内及び第２の容器部内のいずれか一方を加圧すると共に、他方を減圧して、上記試料溶液を上記捕捉手段を介して、上記第１の容器部内と第２の容器部内との間を往復移動させて、試料溶液の核酸を上記捕捉手段に捕捉し、
上記捕捉手段により捕捉された核酸を抽出することを特徴とする核酸抽出方法。
請求項４記載の核酸抽出方法において、上記捕捉手段に核酸を捕捉させた後、上記第１の容器部及び第２の容器部の一方に洗浄液を搬入し、上記第１の容器部内及び第２の容器部内のいずれか一方を加圧すると共に他方を減圧する加減圧動作を行い、上記洗浄液を上記捕捉手段を介して、上記第１の容器部内と第２の容器部内との間を移動させ、上記第１の容器部及び第２の容器部核酸抽出手段内の洗浄液を搬出し、上記第１の容器部及び第２の容器部の一方に溶出液を搬入し、上記加減圧動作後に、上記第１の容器部及び第２の容器部核酸抽出手段内の溶出液を搬出し、核酸を抽出することを特徴とする核酸抽出方法。
試料溶液から核酸を抽出するための核酸抽出器具において、
一つの容器を第１の開口部を有する第１の容器部と第２の開口部を有する第２の容器部とに分割し、上記第１の容器部と第２の容器部とを互いに連通する連通孔が形成された隔壁と、
上記隔壁に形成された連通孔内に配置される核酸捕捉手段と、
を備えることを特徴とする核酸抽出器具。
請求項６記載の核酸抽出器具において、上記連通孔は、上記第１の容器部及び第２の容器部の底部に対応する位置に形成されていることを特徴とする核酸抽出器具。
請求項６記載の核酸抽出器具において、上記第１の容器部の底部は、上記第２の容器部の底部に向かって傾斜していることを特徴とする核酸抽出器具。
請求項８記載の核酸抽出器具において、上記第１の容器部及び第２の容器部の開口部には、円板状のリブが形成されていることを特徴とする核酸抽出器具。
試料溶液から核酸を抽出するための核酸抽出器具において、
一つの容器を第１の開口部を有する第１の容器部と第２の開口部を有する第２の容器部とに分割する隔壁と、
核酸捕捉手段と、
を備え、上記第１の容器部の底部に、上記第１の容器部と第２の容器部とを互いに連通する連通孔が形成され、この連通孔内に上記核酸捕捉手段が配置されていることを特徴とする核酸抽出器具。
請求項１０記載の核酸抽出器具において、上記第１の容器部及び第２の容器部の開口部には、円板状のリブが形成されていることを特徴とする核酸抽出器具。
試料溶液から核酸を抽出するための核酸抽出器具において、
開口部を有する第１の容器と、
開口部を有する第２の容器と、
核酸捕捉手段と、
を備え、上記第１の容器と第２の容器とを互いに連通する連通孔が形成され、この連通孔内に上記核酸捕捉手段が配置されていることを特徴とする核酸抽出器具。
請求項１２記載の核酸抽出器具において、上記第１の容器及び第２の容器の開口部には、円板状のリブが形成されていることを特徴とする核酸抽出器具。
試料溶液から核酸を抽出するための核酸抽出器具において、
核酸捕捉手段と、
上記核酸捕捉手段が配置される孔が底部に形成され、第１の開口部を有する第１の容器と、
上記第１の容器を内部に収容し、第２の開口部を有する第２の容器と、
を備えることを特徴とする核酸抽出器具。
請求項１４記載の核酸抽出器具において、上記第１の容器及び第２の容器の開口部には、円板状のリブが形成されていることを特徴とする核酸抽出器具。