JP2008201699A

JP2008201699A - 医薬組成物

Info

Publication number: JP2008201699A
Application number: JP2007038409A
Authority: JP
Inventors: Keiji Hasumi; 惠司蓮見; Naoko Nishimura; 直子西村; Masayuki Takai; 雅之高井
Original assignee: Tokyo University of Agriculture and Technology NUC; Tokyo University of Agriculture; TMS Co Ltd
Current assignee: Tokyo University of Agriculture and Technology NUC; Tokyo University of Agriculture; TMS Co Ltd
Priority date: 2007-02-19
Filing date: 2007-02-19
Publication date: 2008-09-04

Abstract

【課題】抗癌剤又は抗炎症剤として有用な不活性型前駆体血漿ヒアルロナン結合タンパク質の自己活性化阻害剤の提供。
【解決手段】例えば、放線菌の培養液から単離・精製することができるサーファクチンＣ、イソハロバシリン、イチュリン、又糸状菌の培養液から単離・精製することができるビカベリン等やその他の市販されている容易に入手することことができる化合物で、不活性型前駆体血漿ヒアルロナン結合タンパク質の自己活性化阻害活性を示す化合物を有効成分とする。
【選択図】なし

Description

本発明は、医薬組成物及び不活性型前駆体血漿ヒアルロナン結合タンパク質の自己活性化阻害剤に関する。

癌細胞はその悪性化に伴って、周囲の組織へと浸潤し、さらには他の臓器へと転移して二次腫瘍を形成する。この浸潤・転移の過程は非常に複雑であり様々な因子がその制御に関わるが、このうち基底膜や血管壁の分解は浸潤・転移の過程の中でも重要なステップである。このステップにおいて中心的な役割を果たすのが、血漿中に存在する一連のセリンプロテアーゼやそのインヒビターであり、中でも組織線溶にはウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）が重要な役割を担っている。

ｕ−ＰＡによって生じたプラスミンは細胞外マトリックスを直接の基質とするマトリックスメタロプロテアーゼ前駆体（ｐｒｏ−ＭＭＰｓ）を活性化し、このことによって組織線溶が生じる［非特許文献１］。これら一連のプロテアーゼ活性と癌の浸潤・転移能との関わりについてはこれまで多くの報告がなされており［非特許文献２］、これらの酵素活性、あるいはそのレセプターとの相互作用を阻害することによる転移阻害剤の研究が行われている。ｕ−ＰＡは多くのセリンプロテアーゼがそうであるように、血中では不活性型前駆体として存在し、何らかの要因によって活性化し線溶反応を引き起こす。近年、ｕ−ＰＡの活性化の引き金となる酵素として、血漿中からプロウロキナーゼ活性化能を有する新規セリンプロテアーゼが発見された。

ＰＨＢＰ（plasma hyaluronan binding protein）は、１９９４年に三浦らによって、ヒアルロン酸に特異的に結合するタンパク質として血漿中から発見された［非特許文献３］。ＰＨＢＰは主として肝臓で翻訳されたのち、Ｎ末端のシグナルペプチドが切断され、酵素活性を持たない不活性型前駆体ｐｒｏ−ＰＨＢＰとして血中に分泌される［非特許文献４］。Ｐｒｏ−ＰＨＢＰは、３つのＥＧＦ様ドメインと、１つのクリングルドメイン、さらにセリンプロテアーゼ様ドメインを有する、５３７アミノ酸残基からなる分子量７０ｋＤａの一本鎖型の前駆体である［非特許文献５］。正常血中ではこの不活性型前駆体のみが存在し、活性型ＰＨＢＰはマウスの肝障害時、あるいは肝切除の場合にのみ検出されている［非特許文献６］。

ＰＨＢＰの生理的な役割は未だ不明な点が多いが、in vitroにおいてフィブリン、フィブロネクチンの切断［非特許文献６］やｐｒｏ−ｕ−ＰＡをｕ−ＰＡへと変換するプロウロキナーゼ活性化能を有することが報告されており［非特許文献７］、さらに、ＰＨＢＰの細胞表面の局在に伴い、線溶が促進されることも明らかにされている［非特許文献８］。

また、ＰＨＢＰには、Ｍａｒｂｕｒｇ症と名付けられた５１１番目のアミノ酸がＧからＥに置換された遺伝子多型が報告されており、このアミノ酸置換をもつ患者では、ＰＨＢＰ依存性のｕ−ＰＡ活性が正常と比較して５０−８０％減少しており、ｕ−ＰＡ依存性のプラスミン生成量の減少も見られる［非特許文献９］。さらにＭａｒｂｕｒｇ症が動脈硬化の進行に関与していること、Ｍａｒｂｕｒｇ症患者の頚動脈血管壁にＰＨＢＰが高発現していることも報告されている［非特許文献１０］。これらの知見はＰＨＢＰが線溶系の最上流に位置し、血栓の溶解反応や炎症反応、さらには癌の浸潤・転移の際に生じる一連の組織線溶にも関わる重要なタンパク質の一つであることを示している。

Ｐｒｏ−ＰＨＢＰからＰＨＢＰへの変換を触媒する酵素の存在は、現在までに報告されておらず、自己活性化によって変換されると考えられている［非特許文献１１，１２］。自己触媒作用によりＡｒｇ２９０−Ｉｌｅ２９１の間が切断され、活性型２本鎖分子（３つのＥＧＦドメインとクリングルドメインを含む５０ｋＤａの重鎖：Ｐｈｅ１−Ａｒｇ２９０およびセリンプロテアーゼドメインを含む２７ｋＤａの軽鎖：Ｉｌｅ２９１−Ｐｈｅ５３７）が生じ、さらなる自己開裂によって、失活型４本鎖分子となる。その後もさらなる自己開裂によって断片化が進行する［非特許文献５］。

ＰＨＢＰの自己活性化機構は、凝固系因子ＦａｃｔｏｒＸＩＩに類似しており、その自己開裂は、ポリ−Ｌ−リジンやヘパリン、デキストラン硫酸といった電荷物質によって促進される［非特許文献５，１１］。また線溶促進化合物plactin D、生体内ポリアミンの一つであるスペルミジンによっても、自己活性化が促進されることが明らかとされた［非特許文献８］。

しかし、これらの活性化促進因子がどのようなメカニズムで（ｐｒｏ−）ＰＨＢＰに結合し作用を及ぼしているのかは不明であり、前述したようにｐｒｏ−ＰＨＢＰの自己活性化機構、およびその生理的役割は不明な点が多い。また活性型二本鎖ＰＨＢＰの阻害剤としては、内因性阻害因子としてＣ−１インヒビターやａ２−アンチプラスミンが報告されており、また一般的なセリンプロテアーゼ阻害剤によって阻害されるが［非特許文献１２］、これらはいずれもＰＨＢＰ特異的なものではなく、また自己活性化に対する特異性も有していない。

図中、ｕＰＡは、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターであり、ｕＰＡＲは、ｕＰＡレセプターであり、ＰＬＧは、プラスミノーゲンであり、ＰＭは、プラスミンである。

そこで、ｐｒｏ−ＰＨＢＰの自己活性化を特異的に抑制する化合物の開発が望まれていた。
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本発明者は、上記課題を解決するために鋭意努力し、本発明の化合物が、ｐｒｏ−ＰＨＢＰの自己活性化を特異的に抑制することを見出し、本発明を完成させた。

したがって、本発明は、下記：
下記式：

（式中、ＸがＧｌｕでありそしてＹがＬｅｕであるか、又はＸがＧｌｎでありそしてＹがＩｌｅであり、Ｒ_１は、ｉ−ドデシル又はａ−ドデシルである。）、

（式中、Ｚは、Ａｓｐであり、Ｒ_２は、ａ−トリデシルである。）、

で示される化合物を有効成分として含む、医薬組成物、
抗癌剤又は抗炎症剤である、上記１に記載の医薬組成物、
不活性型前駆体血漿ヒアルロナン結合タンパク質の自己活性化に関連する疾患の治療剤である、上記２に記載の医薬組成物、及び
下記式：

で示される化合物を含む、不活性型前駆体血漿ヒアルロナン結合タンパク質の自己活性化阻害剤に関する。

式（１）の化合物（ＸがＧｌｕでありそしてＹがＬｅｕである）は、サーファクチンＣ（Surfactin C）呼ばれ、従来公知の方法によって放線菌の培養液から単離・精製することができる。より具体的には、培養液を菌体とろ液に分離し、菌体をアセトンで抽出する。アセトンを留去し、ろ液とあわせたのち、塩酸にてpH３に調整し、酢酸エチルにて抽出する。酢酸エチル相に硫酸ナトリウムを加えて脱水後、減圧乾固し、褐色油状物質を得る。これをシリカゲルカラムに供し、ヘキサン：アセトン＝８：２で洗浄した後、ヘキサン：アセトン＝６：４で溶出した画分を減圧乾固し、の褐色物質を得る。これをアセトンに溶解し、ＨＰＬＣに供し、アセトニトリル：０．１％リン酸水（８：２）で展開する。活性画分を減圧濃縮後、酸性条件化にて酢酸エチル抽出をし、減圧乾固する。

式（１）の化合物（ＸがＧｌｎでありそしてＹがＩｌｅである）は、イソハロバシリンと呼ばれ、従来公知の方法によって放線菌の培養液から単離・精製することができる。より具体的には、培養液を遠心分離し、その上清にリン酸カルシウム緩衝液を加え、pH８．０とした後、カラムクロマトグラフィーに供する。カラムをリン酸カリウム緩衝液で洗浄後、活性画分をメタノールで溶出する。これを減圧濃縮し、pHを３．０に調整し、ブタノールで抽出する。ブタノール層を濃縮して得られた油状物質をシリカゲルクロマトグラフィーに供し、ジクロロメタン、ジクロロメタン：酢酸エチル（１：１）、酢酸エチルで順次洗浄した後、酢酸エチル：メタノール（４：１）で溶出する。得られた油状物質をＨＰＬＣに供し、メタノール：０．１％リン酸水（９５：５）で展開し、活性画分を酢酸エチルで抽出し、白色粉末状物質を得る。

式（２）の化合物は、イチュリン（Iturin)とも呼ばれ、従来公知の方法によって放線菌の培養液から単離・精製することができる。より具体的には、培養液を遠心分離し、菌体をアセトンで抽出する。アセトンを留去し、ろ液とあわせたのち、１M塩酸にてpH３に調整し、酢酸エチルにて抽出する。酢酸エチル相に硫酸ナトリウムを加えて脱水後、減圧乾固し、褐色油状物質を得る。これをシリカゲルカラムに供し、酢酸エチルで洗浄後、酢酸エチル：メタノール（１：１）で溶出させ、活性画分を集め減圧濃縮する。得られた油状物質をＨＰＬＣに供し、メタノール：０．１％リン酸水（８０：２０）で展開し、活性画分を酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧乾固を行い、淡黄色粉末状物質を得る。

式（３）の化合物は、ビカベリン（bikaverin）とも呼ばれる。ビカベリンは、赤色の色素リコペルシン（lycopersin）として１９４９年にKreitmanらによってF. lycopersiciとF. vasinfectumの培養液から発見された化合物である。ビカベリンは、従来公知の方法によって糸状菌の培養液から単離・精製することができる。より具体的には、液体培地を含む三角フラスコに、Talaromyces wortmannii IFO7238株を植菌し、前培養液を得る。液体培地に前培養液を播種し、培養する。培養終了後、上清をとり除き、沈殿物をクロロホルムで抽出する。減圧濾過で不溶物を取り除き、乾固させる。乾固物をクロロホルム：メタノール＝９：１の混合溶媒に溶解して、ＨＰＬＣで精製する。

式（４）〜式（１４）の化合物は、すべて市販されており、容易に入手することができる。

本発明で不活性型前駆体血漿ヒアルロナン結合タンパク質の自己活性化に関連する疾患とは、活性型血漿ヒアルロナン結合タンパク質の存在に起因して生じる病態をいい、たとえば、癌や炎症を挙げることができる。本発明の医薬は、癌や炎症の予防剤又は治療剤として用いることができる。

本発明の結晶の投与形態は、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤又はシロップ剤等による経口投与、或いは、注射剤又は座剤等による非経口投与であり得る。更に、本発明の結晶は、粉末、溶液又は懸濁液の形態として経肺投与することもできる。これらのための製剤は賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤などの添加剤を用いて周知の方法で製造される。

本発明の医薬組成物の使用量は症状、年齢、投与方法等によって異なるが、例えば経口投与の場合には、成人に対して１日あたり、下限として０．１ｍｇ（好ましくは、１ｍｇ、更に好ましくは、５ｍｇ）、上限として、１０００ｍｇ（好ましくは、１００ｍｇ、更に好ましくは、５０ｍｇ）を１回または数回に分けて、症状に応じて投与することが望ましい。静脈内投与の場合には、成人に対して１日当たり、下限として０．０１ｍｇ（好ましくは０．１ｍｇ）、上限として、１００ｍｇ（好ましくは１０ｍｇ）を１回または数回に分けて、症状に応じて投与することが望ましい。

本発明の医薬組成物は、Ｐｒｏ−ＰＨＢＰの自己活性化を抑制することにより、副作用が少なく、炎症反応や癌の浸潤・転移の際の組織線溶を抑制する効果という効果を奏する。

以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

サーファクチンＣの調製
[液体培地]
組成は以下の通りである。
グルコース 1％
コーンスターチ 3％
ペプトン 0.5％
酵母エキス 0.5％
重炭酸カルシウム 0.2％
消泡剤ＣＢ442 0.01% (w/v)
これを水酸化ナトリウムにてpH７．０に調整した。本培地１００mlを５００ml容三角フラスコにいれ、１２１℃、１５分間オートクレーブした。これに保存用斜面培地よりＡ９１８４株を植菌し、ロータリーシェーカーにて１８０rpm、２８℃、３日間、前培養した。この前培養液１mlを上記培地１００mlを含む５００ml容三角フラスコに接種し、前培養と同様の条件で、６日間培養した。

２．５Ｌの培養液を菌体とろ液に分離し、菌体を５００mlのアセトンで３回抽出した。アセトンを留去し、ろ液とあわせたのち、１M塩酸にてpH３に調整し、酢酸エチルにて等量で１回、半量で２回抽出した。酢酸エチル相に硫酸ナトリウムを加えて脱水後、減圧乾固し、５．８ｇの褐色油状物質を得た。これをシリカゲルカラムに供し、ヘキサン：アセトン＝８：２で洗浄した後、ヘキサン：アセトン＝６：４、５Ｌで溶出した画分を減圧乾固し、１．８４ｇの褐色物質を得た。これをアセトンに溶解し、うち３６０mgをＨＰＬＣに供し、アセトニトリル：０．１％リン酸水（８：２）で展開した。活性画分を減圧濃縮後、酸性条件化にて酢酸エチル抽出をし、減圧乾固した。

イソハロバシリンの調製
培地組成
グルコース 1％
大豆ミール 1％
コーンスターチ 3％
ポリペプトン 0.5％
酵母エキス 0.5％
重炭酸カルシウム 0.2％
消泡剤ＣＢ442 0.01% (w/v)
これを水酸化ナトリウムにてpH７．０に調整した。本培地１００mlを５００ml容坂口フラスコにいれ、１２１℃、１５分間オートクレーブした。これに保存用斜面培地よりＡ９１８４株を植菌し、１８０rpm、２８℃、３日間、往復振とう培養し、これを前培養とした。この前培養液１mlを上記培地１００mlを含む５００ml容坂口フラスコに接種し、前培養と同様の条件で、４日間培養した。

培養４日目の培養液を遠心分離し、その上清６Ｌを１Mリン酸カルシウム緩衝液（pH８．０）を加え、pH８．０とした後、アンバーライトＸＡＤ−７によるカラムクロマトグラフィーに供した。カラムを１０mMのリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）で洗浄後、活性画分を３Ｌのメタノールで溶出した。これを減圧濃縮し、水で容量を２００mlとした後、塩酸でpH３．０に調整し、ブタノールで３回抽出を行った。ブタノール層を濃縮して得られた油状物質４．７６ｇをシリカゲルクロマトグラフィーに供し、ジクロロメタン、ジクロロメタン：酢酸エチル（１：１）、酢酸エチルで順次洗浄した後、酢酸エチル：メタノール（４：１）で溶出した。得られた油状物質をＨＰＬＣに供し、メタノール：０．１％リン酸水（９５：５）で展開し、１４．５分に活性画分を認めた。これを酢酸エチルで抽出し、白色粉末状物質を１７８．４mgを得た。

イチュリンの調製
培地組成
グルコース 1％
大豆ミール 1％
コーンスターチ 3％
ポリペプトン 0.5％
酵母エキス 0.5％
重炭酸カルシウム 0.2％
消泡剤ＣＢ442 0.01% (w/v)
これを水酸化ナトリウムにてｐＨ７．０に調整した。本培地１００mlを５００ml容坂口フラスコにいれ、１２１℃、１５分間オートクレーブした。これに保存用斜面培地よりＡ９１８４株を植菌し、１８０rpm、２８℃、３日間、往復振とう培養し、これを前培養とした。この前培養液１mlを上記培地１００mlを含む５００ml容坂口フラスコに接種し、前培養と同様の条件で、４日間培養した。

培養４日目の培養液５Ｌを遠心分離し、菌体を５００mlのアセトンで３回抽出した。アセトンを留去し、ろ液とあわせたのち、１M塩酸にてpH３に調整し、酢酸エチルにて等量で１回、半量で２回抽出した。酢酸エチル相に硫酸ナトリウムを加えて脱水後、減圧乾固し、５．８ｇの褐色油状物質を得た。これをシリカゲルカラムに供し、酢酸エチルで洗浄後、酢酸エチル：メタノール（１：１）で溶出させ、活性画分を集め減圧濃縮した。得られた油状物質をＨＰＬＣに供し、メタノール：０．１％リン酸水（８０：２０）で展開し、活性画分を酢酸エチルで抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧乾固を行い、淡黄色粉末状物質を得た。

ビカベリンの調製
［液体培地］
培地の組成は下記のとおりである。
グルコース３．５％
コーンスターチ１％
大豆ミール２％
ポリペプトン０．５％
肉エキス０．５％
酵母エキス０．３％
ＮａＣｌ_２０．２％
Ｋ_２ＨＰＯ_４０．０５％
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．００５％
百分率は、全てw/vで示した。
さらに、消泡剤であるＣＢ４４２を０．１％（v/v）加えた。
なお、ｐＨは５ＮＨＣｌで５．８に調整した。

上記の液体培地１００ｍｌを含む５００ｍｌ容三角フラスコに、Talaromyces wortmannii IFO7238株を保存用斜面培地より植菌し、２５℃、１８０rpmで３日間培養し、前培養液を得た。上記の液体培地１００ｍｌを含む５００ｍｌ容三角フラスコ５０本に、前培養液を終濃度％となるように播種し、２５℃、１８０rpmで５日間培養した（計５Ｌ）。培養終了後、減圧濾過によって上清をとり除き、沈殿物をクロロホルム３Ｌで抽出した。減圧濾過で不溶物を取り除き、乾固させた。乾固物をクロロホルム：メタノール＝９：１の混合溶媒に溶解して、ＨＰＬＣで精製した。

ＨＰＬＣは、JASCO MD-2010 Plus Multiwavelength Detecter, JASCO AS-2055 Plus Intelligent Sampler, JASCO PU-2087 Plus Intelligent Prep. Pump, JASCO MV-2080-32 Dynamic Mixer, GL Sciences MODEL 556 LC COLUMN OVEN, Inertsil PREP-ODS C18 column (250mm×30mm, GL Science）を用いた。移動層には、クロロホルム：メタノール：水＝５：１０：４０．１％トリフルオロ酢酸（Ａ）とクロロホルム：メタノール＝５：１０：０．１％トリフルオロ酢酸（Ｂ）の直線勾配を用い、２５ｍｌ／分で流した（勾配比；０％Ｂ［０分］、５０％Ｂ［１５分］）。８．８分の活性ピークを分取した。

５Ｌの培養液から、４０ｍｇのビカベリンが得られた。

Ｐｒｏ−ＰＨＢＰの精製およびＰＨＢＰの調製
Ｐｒｏ−ＰＨＢＰは、Etscheidらの方法［Biol. Chem. 381, 1223-1231(2000)］にしたがい、６Ｍウレア存在下において、二段階の陰イオンカラムクロマトグラフィーに付した。ビシコニン酸（ＢＣＡ）法によりタンパク定量を行った後、使用時まで−８０℃で保存し、凍結融解後は４℃で保存し一週間以内に使用した。活性型二本鎖ＰＨＢＰは、０．２ｍＭｐｒｏ−ＰＨＢＰをprocessing buffer（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．０（２５℃），０．１５ＭＮａＣｌ，１０ｍＭＣａＣｌ_２、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で３７℃，２０分間インキュベーションすることにより調製した。

Pro-PHBP自己活性化および酵素活性測定法
以下に示す自己活性化および酵素活性は、いずれも丸底９６ウェルプレートを用いて５０ｍｌのSubstrate buffer（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４（２５℃），７５ｍＭＮａＣｌ，５ｍＭＣａＣｌ_２，０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中、３７℃で測定した。４０５ｎｍの吸収波長を６０分間連続的に測定し、遊離するｐ−ニトロアニリンを定量した。酵素（前駆体）、合成発色基質および評価系に添加するｐｒｏ−ＰＨＢＰ自己活性化促進因子の濃度は以下に示すとおりである。

（１）活性化促進因子によるｐｒｏ−ＰＨＢＰ自己活性化：
Ｐｒｏ−ＰＨＢＰ５ｎＭ，スペクトロザイムＴＨ０．１ｍＭ，自己活性化促進因子として以下のいずれかを添加
（ｉ）スペルミジントリヒドロクロリド５ｍＭ；
（ii）プラクチンＤ３０ｍｇ／ｍｌ；
（iii）ヘパリン０．５ｍｇ／ｍｌ；
（iv）ヒストン２Ａ０．５ｍｇ／ｍｌ；
（２）ｐｒｏ−ＰＨＢＰ単独の自己活性化：
Ｐｒｏ−ＰＨＢＰ２０ｎＭ，スペクトロザイムＴＨ０．１ｍＭ；
（３）ＰＨＢＰのアミド分解活性：
ＰＨＢＰ２ｎＭ，スペクトロザイムＴＨ０．１ｍＭ；
（４）トリプシン活性測定：
トリプシン１ｎＭ，Ｂｚ−Ａｒｇ−ｐＮＡ５０ｍＭ；
（５）ウロキナーゼ活性測定：
ウロキナーゼ３ｎＭ，スペクトロザイムＵＫ０．１ｍＭ；
（６）プラスミン活性測定：
プラスミン５０ｎＭ，ＶＬＫ−ｐＮＡ０．１ｍＭ；
（７）トロンビン活性測定：
トロンビン４０ｎＭ，スペクトロザイムＴＨ０．１ｍＭ；
（８）ＦＸａ活性測定：
ＦＸａ０．１ｎＭ，スペクトロザイムＦＸａ０．１ｍＭ；
（９）ｐｒｏ−ウロキナーゼ活性化測定：
ｐｒｏ−ｕ−ＰＡ２０ｎＭ，ＰＨＢＰ０．２ｎＭ，スペクトロザイムＵＫ０．１ｍＭ。
それぞれの測定はいずれもトリプリケートで行った。

スクリーニング方法
東京農工大学発酵学研究室保有の糸状菌または放線菌由来の培養抽出液の１７１０サンプルを探索源とした。一次スクリーニングとしてサンプル添加量５％を反応液に加え、上述の方法でスペルミジンを活性化促進因子として用い、ｐｒｏ−ＰＨＢＰ自己活性化阻害活性を測定した。

機器分析
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳは、マトリックスとしてａ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸を用い、ＶｏｙａｇｅｒＤＥＳＴＲ（Perseptive Biosystems）により測定した。
ＵＶスペクトルは、溶媒にエタノールを用い、５０ｍｇ／ｍｌ濃度にて３２０型自記分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ）により測定した。ＩＲスペクトルはＪＩＲ−ＷＩＮＳＰＥＣ５０フーリエ変換赤外分光光度計（日本電子）を用い、ＮａＣｌ法により測定した。
ＮＭＲスペクトルは溶媒にジメチルスルホキシド−ｄ６（ＭＥＲＣＫ）：クロロホルム−ｄ１（ＭＥＲＣＫ）＝１：１の混合溶媒を用い、Ａｌｐｈａ−６００スペクトロメーター（日本電子株式会社）（１Ｈ，６００ＭＨｚ，１３Ｃ，１５０ＭＨｚ）により測定した。得られたデータはＡＬＩＣＥ２Ｖｅｒ．２．０５（日本電子データム株式会社）を用いて処理および解析を行った。

結果
活性物質の探索および同定
Ｐｒｏ−ＰＨＢＰ自己活性化阻害物質の新規スクリーニングを行った結果、バチルス属放線菌由来のスクリーニングサンプルが複数選択された。サーファクチンに代表される環状リポペプチドは、バチルス属放線菌の主要な二次代謝産物として良く知られており、界面活性作用を始めとした種々の生理活性作用が報告されている。そこでＨＰＬＣ分析によって選択されたスクリーニングサンプルのクロマトグラムを環状リポペプチドのうちイツリンＣ３と比較した結果、同一のピークが確認された（データは示さず）。これらの結果をもとに、研究室保有の環状リポペプチド化合物数種類についてｐｒｏ−ＰＨＢＰ自己活性化阻害作用を確認したところ、サーファクチンＣ，イソハロバチリン、イツリンＣ３の三種類の化合物に活性を認めたため、本サンプルに含まれる活性成分は環状リポペプチド化合物に由来するものと同定した。

環状リポペプチドのｐｒｏ−ＰＨＢＰ自己活性化に対する影響
活性評価を行った計７種類の環状リポペプチド化合物のうち、サーファクチンＣ，イソハロバシリン，イツリンＣ３の３種類にｐｒｏ−ＰＨＢＰ自己活性化阻害活性が認められた（図１）。このうちサーファクチンＣ，イソハロバシリンについては、０．１ｍＭではいずれも数％程度の阻害活性しか認められないにも関わらず、０．３ｍＭではそれぞれ９１％，６０％と高い阻害活性を示した。イツリンＣ３のみが濃度依存性を示し、０．０３ｍＭ−０．３ｍＭにおいて６−６５％阻害を示した。

そこでこれら３種の化合物について、ｐｒｏ−ＰＨＢＰ単独の自己活性化、ＰＨＢＰのアミド分解活性を評価した。

その結果、これら３種の環状リポペプチド化合物は、いずれもＰＨＢＰのアミド分解活性には、最大でも約６％程度とほとんど影響しなかった。またｐｒｏ−ＰＨＢＰ単独の自己活性化についても、いずれの化合物も０．１ｍＭで２３−２８％の阻害を示したが、高濃度においてもその阻害活性はイツリンＣ３の３２％が最大であり、スペルミジンの誘導する自己活性化と比較して大きな影響は与えなかった（図２Ａ，Ｂ）。

さらにスペルミジン同様、陽電荷物質であるプラクチンＤに対しては、３種類の環状リポペプチド化合物すべてが、活性化促進因子としてスペルミジンを用いた場合よりも低濃度から高い阻害活性を示した。０．０３−０．３ｍＭ濃度においてサーファクチンＣ，イソハロバシリン，イツリンＣ３の持つ阻害活性はそれぞれ２１−９０％，１９−１００％，３０−８４％であり、どの化合物についても濃度依存性が認められた。また同じく陽電荷物質であるヒストン２Ａに対しては、サーファクチンＣ，イソハロバシリンの２種が０．１ｍＭ濃度から６０％前後と比較的高い阻害活性を示したのに対し、イツリンＣ３については０．１−０．３ｍＭ濃度において１０−４３％程度の阻害活性しか示さなかった。

一方、陰電荷物質のひとつであるヘパリンに対しては、イツリンＣ３の処理によって最大でも２８％の阻害活性しか示さないのに対し、サーファクチンＣ，イソハロバシリンでは０．０３ｍＭにおいてもおよそ６０％という高い阻害活性を示した。

さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってイツリンＣ３によるｐｒｏ−ＰＨＢＰ自己活性化阻害作用を評価した結果、２０分間の反応によってコントロールで二本鎖ＰＨＢＰへの変換が十分に見られたが、０．３ｍＭのイツリンＣ３の処理によってその抑制が見られ、イツリンＣ３の有する阻害作用が、ｐｒｏ−ＰＨＢＰからＰＨＢＰへの変換を抑制する機構に基づくものであることが示された。

ビカベリンのｐｒｏ−ＰＨＢＰ自己活性化に対する影響
スペルミジン存在下においては、０．０７５−７．５μｇ／ｍｌのビカベリンの添加によって、４−９２％の自己活性化阻害が、また、スペルミジン非存在下においては、同濃度で３０−９８％の自己活性化阻害が認められた。

本発明の化合物は、ｐｒｏ−ＰＨＢＰの自己活性化に高い特異性を有し、ｐｒｏ−ＰＨＢＰからＰＨＢＰへの変換を抑制することができる。したがって、組織線溶を制御することができる薬剤の開発またｐｒｏ−ＰＨＢＰの自己活性化機構の解析のために有用である。

Pro-PHBPの自己活性化は、Pro-PHPB 5nM、基質（スペクトロザイムＴＨ）、およびスペルミジン5mM存在下において、各濃度の上記環状ポリペプチド化合物を添加し測定した。縦軸は、405nmでの吸光度である。すべての実験は３連で行った。（Ａ）Pro-PHBP自己活性化は、Pro-PHPB 20nMで行った。（Ｂ）PHBP活性測定は、PHPB 1nMで行った。いずれも、基質（スペクトロザイムＴＨ）0.1mM存在下において、各濃度の上記環状ポリペプチド化合物を添加し、測定した。縦軸は、405nmでの吸光度である。すべての実験は３連で行った。式（４）の化合物の結果を示す。Pro-PHBP自己活性化（黒三角）は、Pro-PHPB 5nM、スペルミジン5mM存在下で行った。PHBP活性測定（黒四角）は、PHPB 2nMで行った。いずれも、基質（スペクトロザイムＴＨ）0.1mM存在下において、各濃度の化合物を添加し測定した。縦軸は、405nmでの吸光度である。横軸は化合物の濃度（μg/ml）である。すべての実験は３連で行った。式（５）の化合物の結果を示す。Pro-PHBP自己活性化（黒三角）は、Pro-PHPB 5nM、スペルミジン5mM存在下で行った。PHBP活性測定（黒四角）は、PHPB 2nMで行った。いずれも、基質（スペクトロザイムＴＨ）0.1mM存在下において、各濃度の化合物を添加し測定した。縦軸は、405nmでの吸光度である。横軸は化合物の濃度（μg/ml）である。すべての実験は３連で行った。式（６）の化合物の結果を示す。Pro-PHBP自己活性化（黒三角）は、Pro-PHPB 5nM、スペルミジン5mM存在下で行った。PHBP活性測定（黒四角）は、PHPB 2nMで行った。いずれも、基質（スペクトロザイムＴＨ）0.1mM存在下において各濃度の化合物を添加し測定した。縦軸は、405nmでの吸光度である。横軸は化合物の濃度（μg/ml）である。すべての実験は３連で行った。式（７）の化合物の結果を示す。Pro-PHBP自己活性化（黒三角）は、Pro-PHPB 5nM、スペルミジン5mM存在下で行った。PHBP活性測定（黒四角）は、PHPB 2nMで行った。いずれも、基質（スペクトロザイムＴＨ）0.1mM存在下において各濃度の化合物を添加し測定した。縦軸は、405nmでの吸光度である。横軸は化合物の濃度（μg/ml）である。すべての実験は３連で行った。式（８）の化合物の結果を示す。Pro-PHBP自己活性化（黒三角）は、Pro-PHPB 5nM、スペルミジン5mM存在下で行った。PHBP活性測定（黒四角）は、PHPB 2nMで行った。いずれも、基質（スペクトロザイムＴＨ）0.1mM存在下において各濃度の化合物を添加し測定した。縦軸は、405nmでの吸光度である。横軸は化合物の濃度（μg/ml）である。すべての実験は３連で行った。式（９）の化合物の結果を示す。Pro-PHBP自己活性化（黒三角）は、Pro-PHPB 5nM、スペルミジン5mM存在下で行った。PHBP活性測定（黒四角）は、PHPB 2nMで行った。いずれも、基質（スペクトロザイムＴＨ）0.1mM存在下において各濃度の化合物を添加し測定した。縦軸は、405nmでの吸光度である。横軸は化合物の濃度（μg/ml）である。すべての実験は３連で行った。式（１０）の化合物の結果を示す。Pro-PHBP自己活性化（黒三角）は、Pro-PHPB 5nM、スペルミジン5mM存在下で行った。PHBP活性測定（黒四角）は、PHPB 2nMで行った。いずれも、基質（スペクトロザイムＴＨ）0.1mM存在下において各濃度の化合物を添加し測定した。縦軸は、405nmでの吸光度である。横軸は化合物の濃度（μg/ml）である。すべての実験は３連で行った。式（１１）の化合物の結果を示す。Pro-PHBP自己活性化（黒三角）は、Pro-PHPB 5nM、スペルミジン5mM存在下で行った。PHBP活性測定（黒四角）は、PHPB 2nMで行った。いずれも、基質（スペクトロザイムＴＨ）0.1mM存在下において各濃度の化合物を添加し測定した。縦軸は、405nmでの吸光度である。横軸は化合物の濃度（μg/ml）である。すべての実験は３連で行った。式（１２）の化合物の結果を示す。Pro-PHBP自己活性化（黒三角）は、Pro-PHPB 5nM、スペルミジン5mM存在下で行った。PHBP活性測定（黒四角）は、PHPB 2nMで行った。いずれも、基質（スペクトロザイムＴＨ）0.1mM存在下において各濃度の化合物を添加し測定した。縦軸は、405nmでの吸光度である。横軸は化合物の濃度（μg/ml）である。すべての実験は３連で行った。式（１３）の化合物の結果を示す。Pro-PHBP自己活性化（黒三角）は、Pro-PHPB 5nM、スペルミジン5mM存在下で行った。PHBP活性測定（黒四角）は、PHPB 2nMで行った。いずれも、基質（スペクトロザイムＴＨ）0.1mM存在下において各濃度の化合物を添加し測定した。縦軸は、405nmでの吸光度である。横軸は化合物の濃度（μg/ml）である。すべての実験は３連で行った。式（１４）の化合物の結果を示す。Pro-PHBP自己活性化（黒三角）は、Pro-PHPB 5nM、スペルミジン5mM存在下で行った。PHBP活性測定（黒四角）は、PHPB 2nMで行った。いずれも、基質（スペクトロザイムＴＨ）0.1mM存在下において各濃度の化合物を添加し測定した。縦軸は、405nmでの吸光度である。横軸は化合物の濃度（μg/ml）である。すべての実験は３連で行った。

Claims

下記式：

（式中、ＸがＧｌｕでありそしてＹがＬｅｕであるか、又はＸがＧｌｎでありそしてＹがＩｌｅであり、Ｒ_１は、ｉ−ドデシル又はａ−ドデシルである。）、

（式中、Ｚは、Ａｓｐであり、Ｒ_２は、ａ−トリデシルである。）、

で示される化合物を有効成分として含む、医薬組成物。
抗癌剤又は抗炎症剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
不活性型前駆体血漿ヒアルロナン結合タンパク質の自己活性化に関連する疾患の治療剤である、請求項２に記載の医薬組成物。
下記式：

（式中、ＸがＧｌｕでありそしてＹがＬｅｕであるか、又はＸがＧｌｎでありそしてＹがＩｌｅであり、Ｒ_１は、ｉ−ドデシル又はａ−ドデシルである。）、

（式中、Ｚは、Ａｓｐであり、Ｒ_２は、ａ−トリデシルである。）、

で示される化合物を含む、不活性型前駆体血漿ヒアルロナン結合タンパク質の自己活性化阻害剤。