JP2008528043A - 抗ｔ細胞および自己免疫疾患の自己抗原治療 - Google Patents

Abstract

本発明は、新たに発症した哺乳動物のＩ型糖尿病または前Ｉ型糖尿病性の哺乳動物の新しい治療方法であって、（ａ）前記哺乳動物に抗Ｔ細胞治療剤を投与し、（ｂ）自己抗原および任意の粘膜抗原を含む組成物を投与することを含み、（ａ）と（ｂ）の投与を同時または逐次に行う治療方法に関する。抗ＣＤ３抗体、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）自己抗原、免疫調整性サイトカインからなる混合物を用いた治療が例示されている。イヌのＧＡＤ配列も示されている。

Description

（発明の分野）
本発明は哺乳動物の自己免疫疾患の治療に関する。より具体的には、本発明は、哺乳動物の新たに発症したＩ型糖尿病に関する新たな治療方法および診断方法に関する。

（発明の背景）
Ｉ型糖尿病またはインシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、主としてグルコース代謝の自己免疫障害である。糖尿病合併症は、寿命を縮め生活の質を低下させる。この例としては、アテローム性心疾患、壊疽、脳梗塞や、糖尿病性網膜障害、神経障害および腎症が挙げられる。糖尿病性神経障害の症状は、末梢の感覚欠損（ピンや針／手根管症候群）から、膀胱や腸の機能障害にいたる自律性の神経障害におよぶ。Ｉ型糖尿病はまた、糖尿病性の末期腎臓病の結果である腎臓透析の患者の多くに関連している。心筋梗塞、アンギナや脳梗塞の罹患率は、非糖尿病性患者より２〜３倍高く、Ｉ型糖尿病性の患者の寿命は短い。

Ｉ型糖尿病は、実は臨床的な発症以前に始まっている。膵臓のβ細胞の破壊が繰り返されるとこの糖尿病が始まる。この細胞は通常、インシュリンを生産する。グルコースに対するインシュリン応答の低下がこの時期に観測されるが、この時、ランゲルハンス島のβ細胞が大量に（＞９０％）破壊されている。この疾病の早期やそれ以降では、Ｉ型糖尿病は、特徴的にマクロファージやリンパ球（ヘルパーおよびキラー）による膵島の浸潤を引き起こす。このマクロファージ浸潤は、小リンパ球の浸潤を引き起こすと考えられている。疾患初期のマクロファージの関与を抑える薬の可能性については医師の理解があるものの、今のところ安全な治療法は見つかっていない。現在の治療には、日々頻繁にインシュリン注射を行うことが含まれる。しかし、これも低血糖性ショックなどの副作用を引き起こす場合がある。糖尿病の治療においては、血糖レベルをコントロールし通常のレベルに維持することが重要である。

真性糖尿病はヒトに限られるのでなく、イヌやネコで最も多く見られる内分泌障害の一つで、その罹患率や死亡率も高い。糖尿病の動物は、感染感受性の上昇や創傷治癒の低下などヒトの糖尿病について述べたものと同じ問題を抱えている。また、ヒトＩ型糖尿病と同様なインシュリン生産の低下は、脂肪分解を促進して中程度の高脂質血症を引き起こし、最終的にはアテローム性動脈硬化症を引き起こす。糖尿病合併症のいくつかは動物に特異的なようで、たとえばイヌでは急速に白内障匙が悪化し盲目となるが、ネコでは神経障害が早く進み、下肢の脱力および歩行障害の問題を引き起こす。

ヒトと動物の両方で血糖の管理が重要となるが、血糖の管理には頻繁な検査やインシュリン投与が必要で、ヒトを衰弱させるとともに、コンパニオン動物では現実的ではない。その結果、 糖尿病の動物の場合、インシュリン投与中でも血糖管理は行われず、このため病気の動物の死亡率も高い（非特許文献１）。現在動物にとりうる治療法としては、毎日のインシュリン投与と膵島の移植ぐらいである。後者の成功率は変動し、毎日免疫抑制が必要でコストがかさみ、またそれ自体毒性がある（非特許文献２）。 糖尿病のイヌを、ウシまたはブタのインシュリンで長期間治療するとかなり大きな反応を引き起こして抗体が相同インシュリンと交差反応することとなり、この結果糖尿病の管理が難しくなる（非特許文献３）。

イヌの糖尿病性疾患の免疫病原もまたヒトのＩ型糖尿病とよく似ており、たとえば、障害は主に自己反応性のリンパ球により引き起こされている。自発性真性糖尿病のイヌの膵臓の組織病理学的・免疫細胞化学的研究の結果、膵臓の大きな損傷、インシュリン産生β細胞が大幅に減少または欠損していることが明らかとなったが、α細胞とδ細胞は維持されていた。また、インスリン炎障害部位には、浸潤性の単核球、主にリンパ球が見られたが、膵島に対する液性自己免疫の証拠は見出されなかった（非特許文献４）。またヒト疾患と同様に、Ｔ細胞の応答は、ＧＡＤ、インシュリンおよびＩＡ−２などの自己抗原に向けられているようである。ウイルス感染に暴露した場合に起こる自己免疫が膵島のβ細胞を攻撃するようにさせる分子模倣の可能性については多くの推測がなされている。ロタウイルスなどのウイルスによるＴ細胞の活性化や食事タンパクが、ＩＡ−２によるロタウイルス−ＧＡＤへの分子模倣により、β−細胞の自己免疫を引き起こしたり悪化させたりすることがある（非特許文献５）。ＧＡＤやＩＡ−２、インシュリンなどに対するいろいろな糖尿病自己抗原の抗体を用いて、罹患性の高い動物をスクリーニングで特定できる可能性がある。

Ｉ型糖尿病の進行を逆転するために、いろいろな治療法が開発されている。一過性のＴ細胞欠乏およびＣＤ３／Ｔ細胞レセプター複合体の抗原的な変調による免疫応答を抑えるために、抗ＣＤ３モノクロナール抗体（ｍＡｂ）が使用されている。本格的に糖尿病が発症した後７日以内に、抗ＣＤ３・ｍＡｂを成人ＮＯＤ雌マウス（Ｉ型糖尿病のモデル）に投与したところ、ほとんどのマウスにおいて、４ヶ月を超える疾患の緩解期が得られた。この免疫抑制は、β−細胞関連抗原に特異的であった（非特許文献６）。しかし、治療後のマウスの糖尿病発症が、４ヶ月かけて徐々に増加しており、４ヶ月以降の完全な分析も行なわれていない。数週間の治療の後にインスリン炎が再発することがあり、抗ＣＤ３抗体による保護のみでは、疾患の治療または逆転に不十分であったようである。また、ヒトの試験において、非活性化抗ＣＤ３・ｍＡｂを用いた治療により、治療群の１２人の患者のうち９人で、１年後にインシュリン生産の維持または改良が見られた。しかし、最大の効果、たとえばインシュリン要求性の低下と糖化ヘモグロビンレベルの低下は、１２ヶ月ではなく６ヶ月で観察された。また、１２人の患者のうち１年以上持続して応答を示したのは、たった二人であり（Ｐ＝０．０１）、治療の追加が必要であることが示された。（非特許文献７）。

経口免疫寛容とは、タンパク抗原の経口投与が、その抗原が全身を攻撃してもそれに対する末梢の免疫応答を消失させるプロセスである。哺乳動物におけるこのような調整システムの基礎は、病原体に対する保護的な粘膜抗体の応答と新たに遭遇する食品タンパクに対する潜在的に有害なアレルギー反応とのバランスをとることである。経口免疫寛容はまた、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）のような誘発性自己抗原が見出されて以来、糖尿病などの自己免疫疾患の予防や治療において有望な治療方法であると考えられている。

植物を、臨床で使用する哺乳動物抗原タンパクの生産における発現システムまたは「バイオリアクター」として利用することは、スケールアップによる生産能力の増強がほとんど無限に可能であるなど、いろいろ特徴のある長所を有する。植物は真核生物であるため、機能的な遺伝子組換タンパクの生産に必要な、ジスルフィド結合や折りたたみの形成などの転写後や翻訳後の改変が可能となる。タンパクの単離はコストがかさみ、いかなる生産システムも経済的に成り立たなくなる。遺伝子組換植物を経口寛容に用いる実用的な利点として、この植物発現システムが、タンパクを徹底的に精製することなく効果的に供給できるシステムとなりうることがあげられる。このような植物組成物は、免疫応答を変え経口寛容を増強する可能性のある他の化合物、タンパク、レクチンおよび他の成分を含んでいる。また、植物生産ワクチンに対する免疫応答の増強は、植物発現遺伝子組換タンパクの胃腸での分解に対する安定性の増加を示しているようであり、これらの特徴をあわせると、植物が経口免疫寛容の理想的な発現・供給システムとなる。

特許文献１には、遺伝子組換植物において製造した糖尿病関連β細胞自己抗原を利用した経口免疫寛容方法が開示されている。このような遺伝子組換植物組織を投与することで、非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）のマウスを糖尿病から守ることが可能である。

要約すると、Ｉ型糖尿病のメカニズムの理解に関して、この３０年間に大幅な進歩が見られたが、この疾患を治療し逆転させる新しいかつ効果の高い治療法の開発が、ヒトおよび動物の両方において、今なお求められている。
米国特許第６，３３８，８５０号明細書 Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｎ．Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｏｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｃａｔ．Ｃｌｉｎ Ｔｅｃｈ Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍ Ｐｒａｃｔ ２００２ Ｍａｙ；１７（２）：６５−９ Ｓａｌｇａｄｏ Ｄ、Ｒｅｕｓｃｈ Ｃ、Ｓｐｉｅｓｓ Ｂ、Ｄｉａｂｅｔｉｃ ｃａｒｔａｒａｃｔｓ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｄｏｇｓ ａｎｄ ｃａｔｓ．Ｓｃｈｗｅｉｚ Ａｒｃｈ Ｔｉｅｒｈｅｉｌｋｄ ２０００ Ｊｕｎ；１４２：３４９−５３ Ｄａｖｉｓｏｎ Ｕ、Ｒｉｓｔｉｃ ＪＭ、Ｈｅｒｒｔａｇｅ ＭＥ、Ｒａｍｓｅｙ ＩＫ、Ｃａｔｃｈｐｏｌｅ Ｂ、Ａｎｔｉ−ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｄｏｇｓ ｗｉｔｈ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｕｒｒｉｎｇ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ、Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ ２００３ Ｊａｎ １０；９１（ｌ）：５３−６０ Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ｒ、Ｆｅｌｄｍａｎ ＥＣ、Ｓｈｉｅｎｖｏｌｄ ＦＬ、Ｍｉｎｔｚ ＤＨ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｃａｎｉｎｅ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ：ｅｔｉｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｉｓｌｅｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、Ｊ Ａｍ Ｖｅｔ Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃ １９８８ Ｎｏｖ ｌ；１９３：１０５０−５ Ｈｏｎｅｙｍａｎ ＭＣ、Ｓｔｏｎｅ ＮＬ、Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＬＣ、Ｔ−Ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｕｔｔｏａｎｔｉｇｅｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ＩＡ−２：ｐｏｔｅｎｓｉａｌ ｆｏｒ ｍｉｍｉｃｒｙ ｗｉｔｈ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｔｎａｌ ａｇｅｎｔｓ、Ｍｏｌ Ｍｅｄ １９９８ ４：２３１−９ Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ Ｌ、Ｔｈｅｒｖｅｔ Ｅ、Ｐｒｉｍｏ Ｊ、Ｂａｃｈ ＪＦ、Ａｎｔｉ−ＣＤ３ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｏｖｅｒｔ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｎｏｎ−ｏｂｅｓｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｍｉｃｅ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９４ ９１：１２３−７ Ｈｅｒｏｌｄ ＫＣ、Ｈａｇｏｐｉａｎ Ｗ、Ａｕｇｅｒ ＪＡ、Ｐｏｕｍｉａｎ−Ｒｕｉｚ Ｅ、Ｔａｙｌｏｒ Ｌ、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ Ｄ、Ｇｉｔｅｌｍａｎ ＳＥ、Ｈａｒｌａｎ ＤＭ、Ｘｕ Ｄ、Ｚｉｖｉｎ ＲＡ、Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ ＪＡ、Ａｎｔｉ−ＣＤ３ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｎｅｗ−ｏｎｓｅｔ ｔｙｐｅ１ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００２ Ｍａｙ ３０；３４６：１６９２−８

（発明の概要）
本発明は、抗Ｔ細胞治療と経口免疫寛容とを組み合わせると、単独で行う治療より、自己免疫疾患の治療、特にＩ型糖尿病の治療において効果が増すという発見に基づいている。
本発明のある側面においては、Ｉ型糖尿病などの自己免疫疾患を発症した哺乳動物に治療効果のある治療法、また現在行われている治療法の欠点の一部を克服することのできる治療法が提供される。本発明の他の側面において、改良されたＩ型糖尿病の代替治療法や治療方法が提供される。これらのまたこれ以外の目的は、新たに発症したＩ型糖尿病の治療方法、あるいはＩ型糖尿病を発症する差し迫ったリスクを有するヒトの新しい予防治療方法である本発明により達成される。

本方法は、抗Ｔ細胞治療と免疫寛容を複合したもので、Ｉ型糖尿病を発症する差し迫ったリスクをもつ（すなわち、前糖尿病状態の）哺乳動物、または新たにＩ型糖尿病を発症した哺乳動物に投与するためのものである。本発明の実施様態において、本方法を同時にまたは逐次に行うことができる。逐次治療では、哺乳動物はまず抗Ｔ細胞治療を施され、次いで症状のない状態を維持するため、免疫寛容治療を施される。本発明の方法は、他の既知の糖尿病治療法のいずれと組み合わせて使用してもよい。

本発明はまた、哺乳動物の新たに発症したＩ型糖尿病の診断方法に関する。このような診断は、たとえばグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）に対する抗体をＩ型糖尿病発症の指標として検出する。したがって、いろいろな形態のＧＡＤ抗体を、本方法で用いることができる。あるいは、たとえば、それだけに限定するものではないが、ＧＡＤ６５などの新たな形のＧＡＤに対する新しい遺伝子配列や新しい抗体を、本発明で用いてもよい。さらに、上記のＧＡＤ６５が、イヌのＧＡＤ６５や、イヌＧＡＤ６５をコードする植物コドン最適化遺伝子であってもよい。

本発明の一側面は、Ｉ型糖尿病の治療方法であり、この方法では、抗Ｔ細胞抗体と、一つ以上の自己抗原と一つ以上の免疫調整性サイトカインを含む組成物を哺乳動物に投与する。投与は同時でも逐次でもよい。この治療方法は、他の既知のＩ型糖尿病治療法と併用してもよい。また、この治療方法を、Ｉ型糖尿病を発症する差し迫ったリスクを持つ哺乳動物に用いてもよい。

本発明の方法は、抗Ｔ細胞治療を自己抗原と一緒に用いることを含む。しかし、本発明の他の側面においては、この自己抗原部分の治療は単独で行ってもよく、免疫調整性サイトカインなどの粘膜抗原とともに行ってもよい。

本発明のいずれの側面においても、抗Ｔ細胞治療と自己抗原の併用を同時に行ってもよいし逐次に行ってもよい。当業者にとって、同時治療とは、抗Ｔ細胞治療剤の投与と自己抗原の投与の併用、あるいは、抗Ｔ細胞治療剤の投与と自己抗原の投与の併用とそれに続く更なる自己抗原の投与を意味する。当業者には公知のように、同時型の投与は、異なる投与期間であってもよく、さらに自己抗原治療剤の投与を、異なる期間実施してもよい。

本発明の一側面は、哺乳動物のＩ型糖尿病、またはＩ型糖尿病を発症する差し迫ったリスクを持つ哺乳動物の治療法であり、抗Ｔ細胞治療と自己抗原治療を併用する。このような場合、両治療は同時でも逐次でもよく、また、異なる間隔でこれらを併用してもよい。

本発明のある側面は、哺乳動物のＩ型糖尿病、またはＩ型糖尿病を発症する差し迫ったリスクを持つ哺乳動物の治療方法であって、
（ａ）前記哺乳動物に抗Ｔ細胞治療剤を投与することと、
（ｂ）有効免疫抑制量の少なくとも一つの自己抗原を含む組成物を投与することと
を含み、（ａ）と（ｂ）の投与が同時にまたは逐次に行われる治療法である。
本発明のいくつかの側面において、必要に応じて（ｂ）の投与をさらに数日、数週間、数ヶ月、または数年、継続することもできる。

本発明の他の一つの側面は、哺乳動物のＩ型糖尿病、またはＩ型糖尿病を発症する差し迫ったリスクを持つ哺乳動物の治療方法であって、
（ａ） 前記哺乳動物に抗Ｔ細胞治療剤を投与することと、
（ｂ）有効免疫抑制量の少なくとも一つの自己抗原を含む組成物を投与することと
を含み、（ａ）と（ｂ）の投与が同時にまたは逐次に行い、あるいは（ａ）の投与を（ｂ）に先立って行い、あるいは（ａ）と（ｂ）の投与を同時に行い次いで（ｂ）の投与を長期間行う治療方法である。

本発明の他の側面は、哺乳動物のＩ型糖尿病、またはＩ型糖尿病を発症する差し迫ったリスクを持つ哺乳動物の治療方法であって、
（ａ） 前記哺乳動物に抗Ｔ細胞治療剤を投与することと、
（ｂ） 有効免疫抑制量の少なくとも一つの自己抗原と少なくとも一つの粘膜抗原とを含む組成物を投与することと
を含み、上記の（ａ）と（ｂ）の投与が同時または逐次に行われる治療方法である。

いくつかの側面において、（ａ）と（ｂ）の投与が同時にまたは逐次に行われ、あるいは（ａ）の投与が（ｂ）に先立って行われ、あるいは（ａ）と（ｂ）の投与が同時に行われ次いで（ｂ）の投与がさらに実施される。

本発明のさらに他の側面は、哺乳動物のＩ型糖尿病、またはＩ型糖尿病を発症する差し迫ったリスクを持つ哺乳動物の治療方法であって、
（ａ）有効免疫抑制量の抗Ｔ細胞抗体を上記哺乳動物に投与することと、
（ｂ）有効免疫抑制量の少なくとも一つの自己抗原と少なくとも一つの免疫調整性サイトカインを投与することと
を含み、上記の（ａ）と（ｂ）の投与が同時または逐次に行われる治療方法である。

いくつかの側面において、（ａ）と（ｂ）の投与が同時にまたは逐次に行われ、あるいは（ａ）の投与が（ｂ）に先立って行われ、あるいは（ａ）と（ｂ）の投与が同時に行われ、次いで（ｂ）の投与がさらに実施される。

本発明の他の側面は、哺乳動物のＩ型糖尿病、またはＩ型糖尿病を発症する差し迫ったリスクを持つ哺乳動物の治療方法であって、
（ａ）有効免疫抑制量の抗Ｔ細胞抗体を上記哺乳動物に投与することと、
（ｂ）有効免疫抑制量の、少なくとも一つの自己抗原と一つの免疫調整性サイトカインを含む遺伝子組換植物材料を上記哺乳動物に投与することと
を含み、上記の（ａ）と（ｂ）の投与が同時に行われる治療方法である。
いくつかの側面において、（ｂ）をさらに投与してもよい。

本発明の他の側面は、哺乳動物のＩ型糖尿病、またはＩ型糖尿病を発症する差し迫ったリスクを持つ哺乳動物の治療方法であって、
（ａ）有効免疫抑制量の抗Ｔ細胞抗体を上記哺乳動物に投与することと、
（ｂ）有効免疫抑制量の、少なくとも一つの自己抗原と一つの免疫調整性サイトカインを含む遺伝子組換植物材料を上記哺乳動物に投与することと
を含み、上記の（ａ）の投与をまず行い、ついで（ｂ）の投与を行う治療方法である。

本発明の他の側面は、哺乳動物のＩ型糖尿病、またはＩ型糖尿病を発症する差し迫ったリスクを持つ哺乳動物の治療方法であって、
（ａ）有効免疫抑制量の抗ＣＤ３モノクロナール抗体を上記哺乳動物に投与することと、
（ｂ）有効免疫抑制量の、ＧＡＤアイソフォームとＩＬ−４とを両方を含む遺伝子組換植物材料を上記哺乳動物に投与することと
を含み、上記（ａ）と（ｂ）の投与が同時に行われる治療方法である。

本発明の他の側面は、哺乳動物のＩ型糖尿病の治療方法であって、
（ａ）有効免疫抑制量の抗ＣＤ３モノクロナール抗体を上記哺乳動物に投与することと、
（ｂ）有効免疫抑制量の、ＧＡＤアイソフォームとＩＬ−４とを両方を含む遺伝子組換植物材料を上記哺乳動物に投与することと
を含み、上記の（ａ）の投与をまず行い、ついで（ｂ）の投与を行う治療方法である。

本発明の他の側面は、ヒトまたは動物のＩ型糖尿病の逆転方法であって、
−治療有効量の抗ＣＤ３モノクロナール抗体を上記ヒトまたは動物に投与することと、
−治療有効量の、一つ以上のＧＡＤ自己抗原とＩＬ−４とを含む遺伝子組換植物材料を投与することと
を含み、上記モノクロナール抗体が、まず上記のヒトまたは動物に投与される治療法である。

本発明の他の側面は、ヒトまたは動物のＩ型糖尿病の逆転方法であって、
−治療有効量の抗ＣＤＳモノクロナール抗体を上記ヒトまたは動物に投与することと、
−治療有効量の、一つ以上のＧＡＤ自己抗原とＩＬ−４を含む遺伝子組換植物材料を投与することと
を含み、上記モノクロナール抗体と上記遺伝子組換植物材料が、同時に上記ヒトまたは動物に投与される治療方法である。

本発明のさらに他の側面は、抗ＣＤ３抗体と、少なくとも一つの自己抗原と一つの免疫調整性サイトカインを含む製剤との混合物からなる組成物である。

本発明のさらに他の側面は、抗ＣＤ３抗体と少なくとも一つの自己抗原と一つの免疫調整性サイトカインを含む遺伝子組換植物材料の混合物からなる組成物である。

本発明のさらに他の側面は、上記の哺乳動物からのサンプル中の抗ＧＡＤ抗体を検出する哺乳動物のＩ型糖尿病の診断方法である。この検出は、哺乳動物のＩ型糖尿病の発症あるいは発症リスクの指標となる。本発明のいくつかの側面において、本方法にイヌのＧＡＤ６５を使用してもよい。

本発明のさらに他の側面は、新規のＧＡＤ６５配列であり、この配列は植物の形質転換に用いることができる。いくつかの側面において、この配列は、配列番号４に示されるイヌＧＡＤ６５配列である。さらにいくつかの側面において、この配列は、配列番号５に示される最適化されたＧＡＤ６５配列である。

本発明のさらに他の側面は、新しいＩＬ４配列で、この配列は植物の形質転換に用いることができる。いくつかの側面において、この配列は植物での発現に最適化されたイヌＩＬ４配列であり、配列番号２や配列番号７で示される。

本発明の他の側面は、植物細胞の形質転換用のベクターである。いくつかの側面において、これらのベクターは、配列番号１、配列番号３および配列番号６なる群より選択される配列を有する。

本発明のさらに他の側面は、抗Ｔ細胞抗体、自己抗原および任意の粘膜抗原を含む組成物の、哺乳動物のＩ型糖尿病治療用の医薬の製造における使用である。

本発明の他の特徴や利点は、下記の詳細な説明で明らかとなろう。本発明の実施様態を示す詳細な説明や特定の実施例を以下に説明のために提供するが、この詳細な説明により、当業者には本発明の精神や範囲内での多くの修正や変更が明らかになるであろう。

本発明は、本明細書および添付図面により明確に理解されるが、これらは単に説明のために提供されるものであり、本発明の請求範囲を限定するものではない。

（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、自己免疫疾患の新しい治療方法に関し、特に哺乳動物のＩ型糖尿病の治療方法に関する。本方法は、抗Ｔ細胞治療と哺乳動物の免疫寛容とが組み合わされた併用療法である。この併用療法は、同時または逐次に実施してもよい。抗Ｔ細胞治療と免疫寛容の組み合わせは、それぞれ単独の治療に比べ効果に優り、特にＩ型糖尿病の治療に適する。本発明の方法を用いれば、長期間糖尿病の再発がなかったため、本方法が糖尿病の長期治療に有効であり、また症状を逆転することも可能であることがわかった。

本発明の方法は、哺乳動物の新たに発症したＩ型糖尿病の治療に有用である。本発明の方法はまた、Ｉ型糖尿病を発症する差し迫ったリスクを有する哺乳動物、たとえば自己免疫により膵島細胞機能の低下した哺乳動物でインシュリン治療を必要としないものの治療に有用である。この点で、このような哺乳動物は、前糖尿病状態と考えられる。本方法を哺乳動物のＩ型糖尿病の治療に用いてもよい。

本発明の方法と他のＩ型糖尿病の治療方法とを併用してもよいことは、当業者の理解するところである。

定義
本明細書に記載のように、Ｉ型糖尿病は一般に自己免疫性疾患とされ、文献中では、Ｉ型ＤＭや、インシュリン依存性糖尿病、ＩＤＤ、インシュリン依存性真性糖尿病、ＩＤＤＭ、小児糖尿病、小児真性糖尿病、小児発症性糖尿病、小児発症性真性糖尿病、小児期糖尿病、小児期真性糖尿病、若年発症性糖尿病、若年発症性真性糖尿病、自己免疫性真性糖尿病などと表記されている。

本明細書において、自己抗原とは、いくつかの個体において免疫応答を刺激する天然のタンパクまたはペプチドをいう。このような個体に自己抗原を投与すると、この自己抗原は、免疫寛容を引き起こすか、このタンパクまたはペプチドへの哺乳動物の免疫応答を抑制する。

本明細書において、粘膜アジュバントとは、粘膜経由あるいは粘膜表面、または腸に関連するリンパ組織で作用して抗原性応答を高める免疫性物質である。本明細書に記載の粘膜アジュバントは、免疫系の細胞より放出され、免疫性応答を表すにあたり細胞内メディエーターとして作用する、サイトカインやインターロイキンなどの調整タンパク類のいくつかである免疫調整性サイトカインであってもよい。サイトカインは、リンパ球、他の免疫性細胞または実質細胞が活性化されて放出され、単一のあるいは複数の特定抗原に対する危険な自己免疫応答を、変更・減衰・消去させるものであってもよい。

本明細書のＧＡＤ（グルタミン酸脱炭酸酵素）には、各種のＧＡＤアイソフォーム、自己抗体により認識される一個以上のＧＡＤエピトープ（抗原決定基）を有するＧＡＤポリペプチドが含まれる。

本明細書において使用する用語「遺伝子組換植物材料」は、植物が発現する自己抗原および粘膜アジュバントを含有する遺伝子組換植物材料ならいずれでもよい。この植物材料としては、植物組織、植物の一部（たとえば、葉、塊茎、茎など）、植物細胞培養物（たとえば植物懸濁培養物や植物カルス培養物）、植物抽出物、植物スラリーや、これらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。この植物材料は、「生」で供給されてもよいし、所望の遺伝子組換タンパクが含まれるなら何らかの加工後に供給されてもよい。本発明の用途に合致する植物材料の加工方法の例は、たとえばＷＯ２００２０８３０７２、ＷＯ２００４０９８５３０、およびＷＯ２００４０９８５３３に記載されている（これらの開示内容は引用によりここに援用される）。

本明細書において、「哺乳動物」とは乳腺を有する温血動物をいう。好ましい哺乳動物のグループはヒトおよびそのコンパニオン動物からなるグループである。たとえば、このグループにはヒトやイヌ、ネコ、ウマが含まれる。好ましくはイヌとネコであり、より好ましくはヒトである。

抗Ｔ細胞治療
本方法においては、哺乳動物にＴ細胞欠乏を引き起こすために、抗Ｔ細胞治療が実施される。この抗Ｔ細胞治療では、Ｔ細胞を標的とする何らかの免疫抑制剤を使用する。いくつかの側面においては、たとえばＴ細胞の表面抗原を標的とするモノクロナール抗体およびポリクローナル抗体、あるいはその代替としてシクロスポリン、メトトレキセート、アザチオプリンなどの薬剤が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。

本発明のいくつかの側面においては、当業者によく理解されているように、適当な抗体が、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２、抗ＣＤ４、抗ＣＤ７、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ２８、α４β１インテグリン、α４β７インテグリンおよび他のＴ細胞表面抗原から選択されるが、これらに限定されるわけではない。上記の抗体などの選ばれたＴ細胞除去剤を、それを必要とする哺乳動物に投与する。この抗体を用いる治療は、最大で１０日間実施される。当業者によって理解されるように、この治療期間は変更可能である。たとえば、この期間を約５〜７日としてもよい。

このＴ細胞除去剤を、静脈注射により投与し、投与量を体重１ｋｇ当たり約１０μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇとしてもよい。投与量は、この範囲中のどの範囲であってもよく、たとえば、体重１ｋｇ当たり１０μｇ／ｋｇ〜約２０μｇ／ｋｇ；体重１ｋｇ当たり２０μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇ；体重１ｋｇ当たり３０μｇ／ｋｇ〜約４０μｇ／ｋｇ；体重１ｋｇ当たり４０μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ；体重１ｋｇ当たり５０μｇ／ｋｇ〜約６０μｇ／ｋｇ；体重１ｋｇ当たり６０μｇ／ｋｇ〜約７０μｇ／ｋｇ；体重１ｋｇ当たり７０μｇ／ｋｇ〜約８０μｇ／ｋｇ；体重１ｋｇ当たり８０μｇ／ｋｇ〜約９０μｇ／ｋｇ；あるいは体重１ｋｇ当たり９０μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇでもよいが、これらに限定されるわけではない。また当業者によって理解されるように、投与範囲が上記範囲から外れていてもよく、哺乳動物の種類によってはこの範囲に限定されるわけではなく、末梢血で測定して循環Ｔ細胞が実質的になくなる投与量とする。好ましいＴ細胞除去剤の投与量は、循環Ｔ細胞表面のモノクロナール抗体を検出してから決定される。抗体治療への応答は、血糖レベルを測定して決定する。コントロールされたレベルや正常の範囲の血糖値を示す哺乳動物は、治療に応答していると考えられる。

本発明のある代表的な実施様態においては、抗Ｔ細胞治療は、抗ＣＤ３モノクロナール抗体の約５日〜約７日間の投与によって効果的に達成されるが、これに限定されるわけではない。

免疫寛容
本発明の方法は、免疫寛容も含んでいる。哺乳動物に一つ以上の自己抗原を投与して、また任意によりさらに一つ以上の粘膜アジュバントを投与して、免疫寛容を達成する。粘膜アジュバントを用いる場合、この自己抗原と任意の粘膜アジュバントを一緒に投与してもよい。免疫寛容は、抗Ｔ細胞治療と同時に実施しても、抗Ｔ細胞治療後に実施してもよい。また、抗Ｔ細胞治療と経口寛容治療を同時に実施した後に、免疫寛容治療を行ってもよい。すなわち、上記自己抗原や任意の粘膜抗原は、必要に応じた時期に投与することができる。したがって、抗Ｔ細胞治療の施与期間を大幅に超える長期間、治療を必要とする哺乳動物に自己抗原を投与してもよい。いくつかの側面において、継続投与が必要な場合、投与期間がその哺乳動物の寿命に相当することもある。

抗Ｔ細胞治療終了後に投与する場合、経口での免疫寛容治療を最大約４週間延期してもよい。本発明のいくつかの側面において、この免疫寛容は、粘膜免疫寛容であり、自己抗原と粘膜アジュバントは粘膜表面から同時に投与される。本発明のいくつかの側面において、この好ましい粘膜免疫寛容は、経口により引き起こされる。

選ばれる自己抗原は、自己免疫疾患をになうトリガ抗原である。Ｉ型糖尿病の場合、自己抗原は、種特異性あるいは種非特異性のＧＡＤ（グルタミン酸脱炭酸酵素）アイソフォームおよびＧＡＤポリペプチドからなる群より選択される。ＧＡＤアイソフォームは当業者に周知であり、たとえばＧＡＤ６５やＧＡＤ６７であるが、これらに限定されるわけではない。他の自己抗原として、インシュリンおよび有害な自己免疫応答を引き起こしうるβ細胞タンパクからなる群より選択してもよい。利用可能な自己抗原の投与量は、約７〜８μｇ／２５ｇｍマウスであることがわかった。したがって、本発明の方法に用いる自己抗原の量は、哺乳動物では、最大約３００μｇ／ｋｇであり、この範囲内ならいずれでもよい。したがって、適当な量としては、たとえば約１μｇ／ｋｇ〜１０００μｇ／ｋｇ；１０μｇ／ｋｇ〜８００μｇ／ｋｇ；約５０μｇ／ｋｇ〜７００μｇ／ｋｇ；約１００μｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇ；または約２００μｇ／ｋｇ〜４００μｇ／ｋｇであるが、これに限定されるわけではない。なお、当業者が理解するように、投与量は哺乳動物に応じて変更してもよい。

また当業者が理解するように、本発明において用いるＧＡＤ配列は、たとえばヒト、ネコ、イヌの配列のいずれかであるが、これらに限定されるわけではない。ヒトの配列は、Ｂｕｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｔｗｏ ｈｕｍａｎ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｚｙｌａｓｅｓ、６５−ｋＤａ ＧＡＤ ａｎｄ ６７−ｄＤａ ＧＡＤ ａｒｅ ｅａｃｈ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｇｅｎｅ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：２１１５−２１１９に開示されている（これらの開示内容はすべて、引用によりここに援用される）。ネコのＧＡＤ配列は、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７、Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｃＤＮＡ：ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ７：２７６８−２７７２に開示されている（これらの開示内容はすべて、引用によりここに援用される）。本発明に使用するイヌの配列は、天然のイヌＧＡＤ６５配列（配列番号４）および植物での発現のために最適化されたポリヒスチジン精製用タグを有するイヌＧＡＤ６５配列（配列番号５）を含んでいてもよい。

本発明において用いられるＧＡＤペプチド配列は、自動装置を用いた化学合成で、あるいは当業者に周知のＤＮＡ組換技術を用いたペプチド合成機を使用して核酸配列を発現させて得ることができる。本発明のＧＡＤペプチドは、タンパク化学において周知の技術を用いる化学合成、たとえば固相合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ａｓｓｏｃ ８５：２１４９−２１５４（１９６４））または均一溶液合成（Ｈｏｕｂｅｎｗｅｙｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８７）、（Ｅｄ． Ｅ．Ｗａｎｓｃｈ） Ｖｏｌ １５、ｐｔｓ．Ｉ ａｎｄ ＩＩ、Ｔｈｉｅｍｅ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）を用いて合成できる。遺伝子組換発現のよるタンパクの生産技術は当業者に周知であり、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、（１９８９）またはその最新版に記載されている。

本発明に係わるイヌのＧＡＤ核酸配列には、変異体をコードする配列やそれに相当する配列に対して相補的な配列や抗補的な配列も含まれる。当業者にとって、このような相補的核酸配列や抗補的核酸配列を決めることは容易なことである。緊縮条件下で記核酸分子の一つとハイブリダイズする拡散配列も、本発明の一部となる。本明細書中の「緊縮条件」とは、当業者になじみのある変数であり、このような変数は、たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｊ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、または Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ、ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの最新版に開示されている。当業者なら、本発明に係わるＢＣＳＰペプチドをコードする核酸の相同体を容易に見つけることとなろう。これらの分子の発現を、細胞やライブラリー中でスクリーニングして、その関連する核酸分子を単離してその配列を決定する。

本明細書中の核酸分子は、縮退した核酸も含んでいる場合があることに注意を要する。遺伝暗号の縮退のため、異なるＤＮＡ配列でも同一ペプチドの翻訳という結果となる。いろいろなヌクレオチドをうまく選択することで、本発明のペプチドまたはその機能的な類似体の産生を支配する配列を得ることができると考えられている。したがって、退行性のヌクレオチド置換も、本発明の範囲に含まれる。

遺伝暗号の縮退や置換の保存あるいは半保存を許容するなら、配列番号２、４、５、および７のヌクレオチドと同じヌクレオチドを、約４０％〜約８０％、さらに好ましくは約８０％〜約９０％、さらに好ましくは約９０％〜約９９％の量で含む配列は、「実質的に配列番号２、４、５、および７に記載の」配列に含まれる。配列番号２、４、５、および７に記載の配列と実質的に同一の配列とは、機能的には、標準的なあるいは厳密度の低いハイブリダイゼーション条件において配列番号２、４、５、および７の補体を含む核酸セグメントとハイブリッド形成できる配列と定義してもよい。好ましい標準的なハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知であろう。

当業者に明らかなように、本発明の核酸分子は、一本鎖および二本鎖の核酸、プラスミド（類）、ウイルス性核酸（類）、プラスミド（類）、バクテリアＤＮＡ、裸の／自由ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。本発明のペプチドを少なくとも一つコードする核酸配列を含むウイルス性核酸を、ウイルス性ベクターと呼んでよい。

本発明はまた、内部に配列番号２、４、５、および７の本発明の核酸配列やその機能的類似体を含む発現ベクターを含んでいる。原核性または真核性の宿主細胞内に存在する、本発明のペプチドをコードする核酸配列を運搬し発現できる発現ベクターおよびその機能的類似体、たとえばポックスウイルス、アデノウイルス、アルファウイルスやレンチウイルスなどの遺伝子組換えウイルスのいずれをも使用可能である。本発明はまた、本発明のペプチドまたはその機能的類似体を発現するためにこのようなベクターで形質転換、形質移入、または感染された宿主細胞を含む。このような宿主細胞としては、本発明の核酸が導入および／または移入可能な活性細胞ならどのようなものも含む。

任意により自己抗原とともに用いる粘膜アジュバントは、免疫調整性サイトカイン、たとえばインターロイキン類（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８）から選ばれるが、これに限定されるわけではない。当業者により理解されるように、活性化によりリンパ球、他の免疫性細胞または実質細胞から放出され、複数の特定抗原に対する有害な自己免疫応答を、変化・減少・排除できるサイトカインはいずれも、本発明において使用可能である。本発明のいくつかの側面において使用されるサイトカインは、いろいろな種を起源とするＩＬ４であってよく、たとえばヒト（Ｙｏｋｏｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５８９４−５８９８、これらの開示内容はすべて、引用によりここに援用される）、およびイヌ（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：２０６１−２０６５、これらの開示内容はすべて、引用によりここに援用される）であってよいが、これに限定されるわけではない。このような側面に適するイヌのＩＬ−４配列を、配列番号２および配列番号７に示す。いずれも、植物での発現のために最適化されている。上述のＧＡＤのように、本明細書のＩＬ−４配列は、いろいろな形態を含み、細胞への移入のためにいろいろなコンストラクトに導入してもよい。本発明において用いられるサイトカイの量としては、マウスの場合、約１〜２μｇ／２５ｇｍが適当である。したがって、哺乳動物の場合、本方法での使用量は、最大で約５００μｇ／ｋｇであり、この範囲内なら、たとえば約０．５μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ；約１．０μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ；および 約１０．０ μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇのいずれでもよい。当業者なら、本発明において使用する投与量を容易に決めることができるだろう。

この自己抗原と任意に使用される粘膜アジュバントは、組成物として一緒に投与することができる。この組成物は、単独で投与してもよくまた少なくとも一つの他の薬剤、たとえば安定化化合物とともに投与してもよく、また、生体適合性の医薬品担体、たとえば生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロースや水と混合して投与してもよい。この組成物は、そのまま対象に投与してもよく、他の試薬や薬剤とともに投与してもよい。本発明の医薬組成物を、複数のルートを経由して投与してもよい。経口投与を行う場合、当技術分野で周知の薬学的に許容される担体を用いて、経口投与および粘膜投与用の医薬組成物を製剤してもよい。このような担体を使用することで、この医薬組成物を患者が飲みこめるような錠剤、丸薬、糖衣丸、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などに製剤することができる。経口用途の製剤は、活性化合物を固形の賦形剤と混合し、任意選択によりその混合物を粉砕し、必要なら適当な助剤を添加後、その粒状混合物を処理して、錠剤または糖衣丸コアとすることで製造される。好ましい賦形剤は、炭水化物またはタンパクの賦形剤であり、その例としては、乳糖、スクロース、マンニトール、またはソルビトールなどの糖類；トウモロコシデンプン、コムギ、コメ、ジャガイモなど；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース類；アラビアゴムおよびトラガタントゴムなどのガム類；およびゼラチンやコラーゲンなどのタンパク類が挙げられる。必要なら、崩壊剤または溶解剤を加えてもよく、その例としては、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、アルギン酸、またはこれらのナトリウム塩などの塩が挙げられる。

経口で使用可能な製剤としては、ゼラチン製のカプセル、ゼラチン製の軟質密閉カプセル、グリセロールまたはソルビトールなどの塗布剤が挙げられる。このようなカプセルは、有効成分とともに、賦形剤、乳糖やデンプンなどの結合剤、タルクやステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、必要に応じて安定化剤を含んでいてもよい。軟質カプセルの場合、活性化合物を安定化剤とともにあるいは安定化剤なしで、脂肪油、液体または液体ポリエチレングリコールなどの適当な液体に、溶解・分散してもよい。

非経口投与（静脈内および筋肉内）に適した製剤は水溶液であってもよく、好ましくは、生理学的に好ましい緩衝剤、たとえばハンクス液、リンゲル液、または生理学的な緩衝生理食塩水などの溶液である。注射用水性懸濁液には、懸濁液の粘度を上げる物質を添加してもよく、たとえば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、または デキストランが挙げられる。また、活性化合物懸濁液は、適当な油性の注射用懸濁液として製造してもよい。好ましい親油性溶媒や媒体としては、ゴマ油などの脂肪油、オレイン酸エチルやトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル類やリポソームが挙げられる。非脂質性のポリカチオン性アミノポリマーを薬剤放出のために用いてもよい。高濃度溶液の調整のために、任意選択により、この懸濁液に適当な安定化剤または化合物の溶解度を上昇させる薬品を加えてもよい。局所投与や経鼻投与のために、対象のバリアに適した浸透剤を製剤に添加してもよい。このような浸透剤は当技術分野で周知である。

本発明の医薬組成物は、当技術分野で周知の方法で、たとえば、従来の混合、溶解、粒状化、糖衣丸製造、湿式粉砕、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥工程により製造される。この医薬組成物は塩として提供されてもよく、いろいろな酸、たとえば、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などで製造されるが、これらの酸に限定されるわけではない。塩は、フリーの塩基型に比べ、水溶液や他のプロトン性溶媒中での溶解性が高い。

本医薬組成物は、生分解性マイクロスフェアーとして提供されてもよい（Ｓｉｎｈａ ｅｔａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ９０（２００３）２６１−２８０、これらの開示内容は、引用によりここに援用される）。

本発明のある実施様態において、免疫寛容を、経口免疫寛容法で行ってもよく、その際自己抗原や粘膜アジュバントは食用植物材料に含めて投与される。このような材料は、植物内で発現し植物中でタンパク生産する必要な配列を有する遺伝子組換植物により製造される。植物中でのＧＡＤ自己抗原の発現は、ＵＳ６，３３８，８５０に開示されている（これらの開示内容はすべて、引用によりここに援用される）。自己抗原や粘膜アジュバントは、下記文献に記載のように、遺伝子組換植物で生産可能である。Ｍａ Ｓ、Ｈｕａｎｇ Ｙ、Ｙｉｎ Ｚ、 Ｍｅｎａｓｓａ Ｒ、Ｂｒａｎｄｌｅ ＪＥ、Ｊｅｖｎｉｋａｒ ＡＭ、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒａｌ ｔｏｒｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｓ ｗｉｔｈ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｏｘｙｌａｓｅ（ＧＡＤ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ２００４ Ａｐｒ １３； １０１（１５）： ５６８０−５、およびＭａ ＳＷ、Ｚｈａｏ ＤＬ、Ｙｉｎ ＺＱ、Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ｒ、Ｓｉｎｇｈ Ｂ、Ｑｉｎ ＨＹ、Ｓｔｉｌｌｅｒ ＣＲ、Ｊｅｖｎｉｋａｒ ＡＭ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｆｅｄ ｔｏ ｍｉｃｅ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １９９７ Ｊｕｌ； ３（７）：７９３−６（これらの開示内容はすべて、引用によりここに援用される）。

本明細書においては、代表例として、自己抗原を発現する遺伝子組換植物は、たとえばヒトＧＡＤなどのある選ばれた自己抗原をコードするｃＤＮＡを発現ベクターに導入し、アグロバクテリウム媒介での移入により遺伝子組換植物を作成するが、これに限定されるわけではない（実施例Ａ）。この例の場合、ジャガイモの植物を使用する。遺伝子組換デンプン塊茎が、異種のタンパク生産のためのバイオマスの安価な供給源となるためである。所望の抗原を発現する遺伝子組換植物は、植物抽出物をウエスタンブロット法で調べ、既知の方法により、発現した抗原を適当な特定の抗体を用いて検出して、同定することができる。寛容が望ましい抗原が異種の二量体構造をとる場合、植物組織を、それぞれあるタンパク鎖と異なるマーカー遺伝子に対応するＤＮＡを持つ二種のベクターで連続して転換し、その植物が成熟した抗原を生成させるか、あるいは各分子鎖の対応するＤＮＡを別々の植物に導入し、これらの「単一鎖」植物の他花受粉法により、成熟した抗原を産生する雑種を作ってもよい。

発現した抗原を含む遺伝子組換植物材料は、対象に対して有効量を経口的にあるいは経腸的に投与してもよい。遺伝子組換操作のための植物は食用植物でも非食用植物でもよい。非食用植物種を哺乳動物の抗原の生産に用いる場合、その抗原を植物組織から抽出し、標準的な方法で精製した後、経口あるいは経腸で投与する。

必要に応じてこの遺伝子組換植物材料を哺乳動物に投与してもよい。対象を特定の哺乳動物の抗原に対する経口寛容に導くために、上述のように、発現した抗原を含む遺伝子組換植物組織を、有効量、経口または経腸で投与してもよい。一方、非食用遺伝子組換植物を哺乳動物の抗原の生産に用いる場合、その抗原を植物組織から抽出し、標準的な方法で精製した後、経口または経腸で投与する。この場合、単一回投与、複数回投与、または寿命期間内連続投与であってもよい。本発明で用いられる植物の好ましい例としては、ジャガイモ、トマト、アルファルファ、カノーラ、コメ、タバコ、トウモロコシ、藻類、サフラワー，コケ、蘚苔植物が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。

治療効果を出すために、発現された自己抗原と粘膜アジュバントを併用する場合、その量は、使用する植物により異なるが、重量基準で、最大約１ｍｇ／ｋｇから、最大約１０００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲である。ある場合には、この量は最大約１ｍｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇである。当業者が理解するように、発現される自己抗原や粘膜アジュバントの量は変動する。このため、この量は、上記の１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇの範囲内の小範囲、たとえば（特に限定されないが）１ｍｇ／ｋｇ〜５００ ｍｇ／ｋｇ；１ｍｇ／ｋｇ〜２５０ｍｇ／ｋｇ；１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ；１ｍｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ；１ｍｇ／ｋｇ〜７５ｍｇ／ｋｇ；１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ；および１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇから選ばれ、また、これらの範囲内の小範囲であってもよい。もちろん、この量は１０００ｍｇ／ｋｇを超えてもよく、また逆に１ｍｇ／ｋｇ未満でもよい。当業者が理解するように、本発明においてこの量は種特異的である。

様々な方法で植物中の自己抗原やサイトカインの生産を検出することが可能であり、
たとえば、ヒトや他の種の交差反応性モノクロナール抗体を用いてフローサイトメトリーによるウエスタンブロット分析やＥＬＩＳＡ分析を行うことができる（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＬＧ、Ｃａｓｔｅｌｒｕｉｚ Ｙ、Ｊａｃｏｂｓｅｎ Ｓ、Ａａｓｔｅｄ Ｂ、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｉｍａｌ ｓｐｃｉｅｓ、Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２００２ ８８：１１１−２２）。

本発明はまた、Ｔ細胞免疫抑制剤、少なくとも一つの自己抗原、および任意選択による少なくとも一つの粘膜アジュバントを含む混合物からなる治療用組成物を含む。たとえば本発明において、ＧＡＤアイソフォーム、抗ＣＤ３モノクロナール抗体、およびＩＬ−４を含む組成物が挙げられるが、これに限定されるわけではない。同様に本発明において、ＧＡＤ６５および／またはＧＡＤ６７、抗ＣＤ３モノクロナール抗体、およびＩＬ−４および／またはＩＬ−１０を含む組成物が挙げられるが、これに限定されるわけではない。このような組成物は経口または非経口投与用に製剤化してもよい。

また当業者が理解するように、いろいろな実施様態で説明した本発明の方法を、Ｉ型糖尿病の公知の治療方法や現在使用されている治療方法とともに使用してもよい。このような治療としてインシュリン治療が挙げられるが、これに限定されるわけではない。

本発明はまた、Ｉ型糖尿病の早期検出に抗ＧＡＤ６５抗体を使用する。この点で、哺乳動物の血清中の抗ＧＡＤ６５抗体の存在量を測定して糖尿病のリスクの指標としてもよく、Ｉ型糖尿病の初期段階での診断に用いてもよい。さらなるいくつかの側面において、これらの方法を非糖尿病性動物の糖尿病の早期リスクアセスメントに用いてもよい。これらの側面において、様々なタイプの抗ＧＡＤ６５抗体、たとえば新規のイヌ抗体を使用することができる。

以上、本発明を一般的に説明した。以下具体的な実施例をもとに、本発明を詳細に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、その範囲を限定するものではない。状況に応じて形態を変化させたり等価物で置き換えたりすることも可能である。具体的な用語が使用されているが、これらの用語は説明を目的とするものであり、限定を目的とするものではない。

（実施例Ａ）
糖尿病性雌ＮＯＤマウスの血中グルコースレベルに及ぼすコントロール植物の給餌とＧＡＤ／ＩＬ−４植物の給餌の効果
糖尿病性雌ＮＯＤマウスは、尿グルコース陽性と血液検査により同定した。血中グルコースが二日間連続して１６ｍｍｏｌ／ｌを超えるマウスを選択し、抗体治療に用いた。これらのマウスには毎日インシュリンを投与し、血中グルコースレベルが約１４ｍｍｏｌ／ｌ未満となるようにした。マウスのいくつかは、毎日二回、インシュリンを投与した。マウスを安定化させた後、特定の抗ＣＤ３・ｍＡｂ（５μｇ）ＩＶを尾静脈注射により６日間（ｄ１−６）投与した。３週間以内に血糖値が２０ｍｍｏｌ／ｌ未満（連続二日間）とならないマウスは除いた。８５％を超えるマウスがこの条件を満たした。抗ＣＤ３・ｍＡｂ治療の後２〜３週間、マウスに、特定のコントロール植物性飼料（ベクターなし、ＬＮタバコ）またはＧＡＤ−ＩＬ４植物性飼料を与え、その血糖値を毎日調べた。すべてのマウスにおいて、インシュリン投与を３週間までに停止した。各治療群には１０匹のマウスを割り当てた。表示の値は、グルコース（ｍｍｏｌ／ｌ）対試験日（図１）である。初日は、抗ＣＤ３治療の開始日である。一匹のＧＡＤ／ＩＬ４マウスは、後期に一過性の過血糖症を示した。一匹のＧＡＤ／ＩＬ−４マウスは、技術的な問題の結果、死亡した（インシュリンＯＤのよる低血糖症）。

糖尿病性雌ＮＯＤマウスの過血糖症に至る時間を示すカプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ）生存率分析
図１の糖尿病性雌ＮＯＤマウスを血液検査により追跡した。これらのマウスには、比較用植物性飼料（ベクターなし、ＬＮタバコ）またはＧＡＤ−ＩＬ４植物性飼料を与えた。一匹のＧＡＤ／ＩＬ−４マウスは技術的問題のため死亡した（インシュリンＯＤによる 低血糖症）が、治療不良とはみなさなかった（削除）。生存とは、過血糖症（二日間連続してグルコース＞１２ｍｍｏｌ／ｌ）に至るまでの時間が４０日以上であることをさす。
４０日を選んだのは、ほとんどのマウスで、この期間中に初期の血中グルコースレベルの変動（図１）が収まるためである。分析結果を図２に示す。

給餌後の血中グルコースレベル
抗ＣＤ３治療後、その効果を特定の間隔で比較するため、ベースラインのマウス血中グルコースレベル、４０日目および６０日目の血中グルコースレベルを測定した（図３）。４０日目のグルコースレベルに差があるものの（ｐ＝００３）、６０日目と同様に、その差は有意であるとは言えなかった（ｐ＝０１）。ただし、ベースラインのマウスはインシュリンで処理されていたが、抗ＣＤ３抗体で治療を始めるときには、ベースラインに関係なく、比較群とＧＡＤ−ＩＬ４群間に差はない。４０日目と６０日目に設定したのは、両方の群を評価するにあたり、十分なマウスが存在していたためである（ベースラインおよび４０日目ではｎ＝１０、６０日目ではｎ＝６〜７）。

自己抗原を発現する遺伝子組換植物の産生
ジャガイモ中でのヒトＧＡＤの発現：５^’配列または３^’配列を表す、ヒトＧＡＤの一部をコードしている二種のｃＤＮＡクローンを用いた。これら二つのクローンの重複配列は７０ｎｔ以下である。完全なヒトＧＡＤ配列は、一連のＤＮＡ操作により産生した。ＰＣＲによりヒトＧＡＤのＮ端末を改変して、ＮｃｏＩ（ＣＣＡＴＧＧ）制限酵素認識位置を翻訳開始位置の一部として含むようにした。ポリＡ尾部を含む天然の３’非翻訳配列は、完全に除去した。改変したヒトＧＡＤ配列を、ＧＵＳ遺伝子に代えてプラスミドベクターＰＴＲＬ−ＧＵＳに導入した。このプラスミドＰＴＲＬ−ＧＵ３は、５’非翻訳ＴＥＶリーダー配列、ＧＵＳ遺伝子およびＮＯＳ−ターミネーターに結合したダブルエンハンサ配列（Ｅｈｎ−３５Ｓ）を有するＣａＭＶ−３５Ｓプロモーターからなる。この５^’−Ｅｈｎ３５Ｓ−ＴＥＶ５^’非翻訳リーダーヒトＧＡＤ−ＮＯＳターミネーターからなる新たな発現カセットは、ＨｉｎｄＩＩＩで切断され、バイナリーベクターのｐＢＩＮ１９に挿入される。得られたコンストラクトｐＳＭ２１５は、はアグロバクテリウムに移され、ジャガイモへの転換は、リーフディスク法で行った（Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ、（１９８５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ．２２７、ｐｐ．１２２９−１２３１）。形質転換したリーフディスクの新植物への再生は、Ｈｏｒｓｃｈらの方法により行った。形質転換物の一次スクリーニングは、カナマイシンを含むＭＳＯ培地上でのカルス成形により行った。

植物内での自己抗原の発現を試験する方法は、詳細にＭａ Ｓ、Ｈｕａｎｇ Ｙ、Ｙｉｎ Ｚ、Ｍｅｎａｓｓａ Ｒ、Ｂｒａｎｄｌｅ ＪＥ、Ｊｅｖｎｉｋａｒ ＡＭ、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒａｌ ｔｏｒｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｓ ｗｉｔｈ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｏｘｙｌａｓｅ（ＧＡＤ）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ２００４ Ａｐｒ １３；１０１（１５）：５６８０−５、およびＭａ ＳＷ、Ｚｈａｏ ＤＬ、Ｙｉｎ ＺＱ、Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ｒ、Ｓｉｎｇｈ Ｂ、Ｑｉｎ ＨＹ、Ｓｔｉｌｌｅｒ ＣＲ、Ｊｅｖｎｉｋａｒ ＡＭに開示されている（これらの開示内容はすべて、引用によりここに援用される）。当業者はこれらの方法で本発明を実施することが可能である。

（実施例Ｂ）
抗ＣＤ３効果を示すＮＯＤマウスモデルへの抗ＣＤ３とＧＡＤ／ＩＬ−４の連続供給、およびＴｈ１／Ｔｈ２・Ｔ細胞サブセットへのＧＡＤ／ＩＬ−４の連続供給
複数の雌ＮＯＤマウスに糖尿病を自発的に発症させ、インシュリンで血糖の管理を行った。マウスには毎日、抗ＣＤ３・ｍＡｂ（５μｇ）を６日間投与し、血糖が正常になればインシュリン投与は中止した。マウスには、経口的にＧＡＤ／ＩＬ−４、植物コントロール飼料、または通常のマウス飼料を４週間与えた（ｎ＝３）。マウスを安楽死させ、その血清中の抗ＧＡＤ・ＩｇＧ１を、Ｔｈ２活性の指標として測定した。ＧＡＤ／ＩＬ−４マウスが最も高いレベルの抗ＧＡＤ・ＩｇＧ１抗体（ｐ＝０１）を示し、抗ＣＤ３・ｍＡｂとＧＡＤ／ＩＬ−４の併用の効果がＴヘルパー細胞サブセットのＴｈ２ゆがみ（ｓｋｅｗｉｎｇ）と関連することを示唆した。

抗ＣＤ３と逐次ＧＡＤ／ＩＬ−４投与の糖尿病の養子免疫伝達を防止する効果
複数の雌ＮＯＤマウスに糖尿病を自発的に発症させ、インシュリンで血糖の管理を行った。マウスには毎日、ＣＤ３・ｍＡｂ（５μｇ）を６日間投与し、血糖が正常になればインシュリン投与は中止した。マウスには、経口的にＧＡＤ／ＩＬ−４、植物コントロース飼料、または通常のマウス飼料を４週間与えた（ｎ＝３）。また、これらのマウスは、図１のマウスとおなじである。マウスを安楽死させ、各グループのマウスから脾臓細胞を取り出し、糖尿病性ＮＯＤマウスから最近取り出した糖尿病誘発性の脾臓細胞と混合した。飼育マウスの細胞（１×１０^７）と糖尿病誘発性の脾臓細胞（１×１０^７）を混合し、ＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスに静脈注射した。注射を受けたマウスの糖尿病発症状況を尿検査で追跡し、血清検査で確認し （＞１４ｍｍｏｌ／ｌ、２日間）、試験を終了した。経口的にＧＡＤ／ＩＬ−４を摂取したマウスでは、植物コントロールと比べ、糖尿病発症への平均時間が長くなり（ｐ＝０．１）、抗ＣＤ３・ｍＡｂと逐次ＧＡＤ／ＩＬ−４投与の効果が調節Ｔｈ２ヘルパー細胞サブセットの誘導と関連することを示唆した（図５）。

ＧＡＤ６５抗体の増加とヒト以外の糖尿病またはマウスの糖尿病との関連性
最近インシュリン依存性自己免疫糖尿病を発症したイヌの血清中の抗ＧＡＤ６５（総）抗体の存在を、ＥＬＩＳＡを用いて分析した。その結果、非糖尿病性の通常のイヌでは抗体が検出されなかったため、抗ＧＡＤ抗体の存在は糖尿病と強い関連があるといえる（図６）。このデータは、イヌ糖尿病におけるＧＡＤ６５の関連を示唆し、また、非糖尿病性イヌ中の抗ＧＡＤ６５抗体の早期検出が糖尿病のリスクを予測し、ＴＨ２サブセットの揺らぎ（ｓｋｅｗｉｎｇ）をモニターするのに使えることを示す。

イヌＧＡＤ６５の遺伝子組換タバコ植物中での発現
カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターとノパリン合成酵素遺伝子からのポリアデニル化シグナルの管理下にあるイヌＧＡＤ６５配列全体をコードする配列を持つ植物発現ベクターを作成し、アグロバクテリウム媒介の転換法によりタバコ植物に導入した。転換と選択の結果、遺伝子組換タバコ植物を得た。イヌＧＡＤ６５・ＤＮＡのタバコの核ゲノムへの導入は、イヌＧＡＤ６５に特異的なプライマー（非表示）を用いてＰＣＲ（ポリマラーゼ連鎖反応）により行った。導入されたイヌＧＡＤ６５のタンパクレベルでの発現は、ウエスタンブロット分析により決定した。図７に示すように、イヌＧＡＤ６５で形質転換したタバコ植物から得た全葉抽出物をウエスタンブロットした際、抗ＧＡＤ抗体は、予想された分子量（６５ｋＤａ）を持つ独自のバンドを与えた。一方、ベクター陰性のイヌＧＡＤで形質転換したタバコ植物の葉の抽出物をウエスタンブロット分析したところ、同じバンドは検出されなかった。マウスＧＡＤ６７は、サイズコントロールで示され、抗ＧＡＤ抗体で検出される。

植物細胞培養物由来の遺伝子組換えイヌＩＬ−４の生物活性
植物由来ｒｃＩＬ−４の生物活性は、ｃＩＬ−４依存性の細胞系（図８Ａ、８Ｂ）のＴＦ−１を用いた生体外バイオアッセイにより決定した。ＴＦ−１細胞は、イヌＩＬ−４に応答して増殖する因子依存性ヒト赤白血症細胞系である。アッセイを行うにあたり、６×ヒスチジン・タグ付きｒｃＩＬ−４を、遺伝子組換タバコの葉の組織より、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを用いたクロマトグラフィーにより精製して、ＴＦ−１細胞の増殖を誘起するのに用いた。なお、その作用を市販のｒｃＩＬ−４標準試薬と比較した。その結果、植物由来のｒｃＩＬ−４は、ＴＦ−１細胞を投与量依存的に培地（ＲＰＭＩ１６４０）上で増殖させ、その作用はｒｃＩＬ−４標準試薬とほぼ同等であった。また、植物ｒｃＩＬ−４を抗ｃＩＬ−４・ｍＡｂとともに共培養すると、ＴＦ−１細胞の増殖を刺激する能力が低下した。これらの結果を総合すると、この植物由来のｒｃＩＬ−４が生物的機能的な信頼性を有するといえる。

（実施例Ｃ）
懸濁培養でのイヌＧＡＤ６５とイヌＩＬ−４の発現
タバコ細胞中での発現のための双子葉植物バイナリーコンストラクト
アグロバクテリウム媒介の植物形質転換用の双子葉植物バイナリーベクター、ｐＤＡＢ２４５７（配列番号１）を、プラスミドｐＤＡＢ７７１、ｐＤＡＢ７７３およびｐＤＡＢ２４０７をもとに作成した。ｐＤＡＢ７７１（図９Ａ）は、ニコチナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）オスモチン遺伝子の５^’ＵＴＲ （Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． １９： ５７７−５８８ （１９９２）；特許出願ＵＳ２００５１０２７１３）とニコチナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）オスモチン遺伝子の３^’ＵＴＲｓ からなるキメラ３^’非翻訳領域 （Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． １９：５７７−５８８ （１９９２）；特許出願ＵＳ２００５１０２７１３ ）と、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）プラスミドＴｉ １５９５５ ＯＲＦ２４（ジーンバンク受入番号 Ｘ００４９３）とに融合したＷＯ９７／４８８１９に記載のキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶ）を含んでいる。ＣｓＶＭＶプロモーターとＯＲＦ２４の３^’ＵＴＲの間には、目的遺伝子を挿入するのに使われる特有の部位ＮｃｏＩおよびＳａｃＩが存在する。ｐＤＡＢ７７３（図９Ｂ）は、ＲＢ７マトリックス付着領域（ＭＡＲ）（ＵＳ５，７７３，６８９；ＵＳ５，７７３，６９５；ＵＳ６，２３９，３２８、ＷＯ９４／０７９０２、およびＷＯ９７／２７２０７）と転写ユニットを有し、この中で、植物選択マーカーであるホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）（米国特許５，８７９，９０３；５，６３７，４８９；５，２７６，２６８；および５，２７３，８９４）が、ＡｔＵｂｉ１０プロモーターにより転写開始され （Ｐｌａｎｔ Ｊ． １９９７ １１（５）：１０１７； Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９９３ ２１（５）：８９５； Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９５ １３９（２）：９２１）、下流のＡｔｕＯＲＦ１の３^’ＵＴＲにより終了される（ＵＳ５４２８１４７；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９８３ ２：３３５；ジーンバンク受入番号 Ｘ００４９３）。ＲＢ７・ＭＡＲ遺伝子と植物ＡｔＵｂｉ１０プロモーター間に存在する独自のＮｏｔＩ部位は、ＣｓＶＭＶプロモーター、目的遺伝子、およびＯＲＦ２４の３^’ＵＴＲを含む遺伝子断片をクローニングするのに使用される。 塩基性バイナリーベクターｐＤＡＢ２４０７（図９Ｃ）は、目的遺伝子とアグロバクテリウムのバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ境界間の選択可能なマーカー発現カセットとのＡｇｅ１／ＡｇｅＩライゲーションを可能とする。

ＩＬ−４双子葉植物バイナリーベクターｐＤＡＢ２４５７（図９Ｄ）は、小胞体（ＥＲ）を標的とする（天然の）ＥＲ保持シグナルを有するイヌ・インターロイキン−４タンパクをコードしている（配列番号２、表Ｂ）。より具体的には、この植物転写ユニットは、Ｔ−ＤＮＡ境界Ｂ／ＲＢ７ ＭＡＲ ｖ３／ＣｓＶＭＶ プロモーターｖ２− Ｎｔ Ｏｓｍ ５^’ＵＴＲ ｖ３／ＩＬ−４ ｖ２−ＫＤＥＬ／Ｎｔ Ｏｓｍ ３^’ＵＴＲ ｖ３−Ａｔｕ ＯＲＦ２４ ３^’ＵＴＲ ｖ２：：ＡｔＵｂｉ１０プロモーター ｖ２／ＰＡＴ ｖ３／ＡｔｕＯＲＦ１ ３^’ＵＴＲ ｖ３：：Ｔ−ＤＮＡ境界Ａを有する。ＤＡＳＰＩＣＯ１３中に含まれるこの化学合成によるＩＬ−４遺伝子は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のブルースクリプトベクター中のＰＩＣＯＳＣＲＩＰＴより得た。ＰＣＲにより遺伝子を改変した。改変した遺伝子には、６ヒスチジンタグのついたＩＬ−４遺伝子とＥＲ保持シグナル（ＫＤＥＬ）が含まれている。次いで、ＮｃｏＩ／ＳａｃＩフラグメントをｐＤＡＢ７７１プラスミドに、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位で導入し、中間体ベクターｐＤＡＢ２４５５（図９Ｅ）を得た。ＩＬ４ ｖ２−ＫＤＥＬ／ＯＲＦ２４ ３^’ＵＴＲを含むＣｓＶＭＶプロモーター発現カセットをＮｏｔＩでｐＤＡＢ２４５５より除去し、ｐＤＡＢ７７３のＮｏｔＩ部位であり、ＲＢ７ ＭＡＲｖ３遺伝子の下流でかつ中間体ベクターｐＤＡＢ２４５６中に植物転写ユニット（ＰＴＵ）を形成するＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２／ＰＡＴ ｖ３／ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ選択可能なマーカーカセットの上流に連結した（図９Ｆ）。ＡｇｅＩ消化により、このＰＴＵ成分をｐＤＡＢ２４５６より切り取り、ｐＤＡＢ２４０７のＡｇｅＩ部位に逆向きに連結した。この結果、ＰＴＵカセットがＴ−ＤＮＡ境界ＡおよびＢにより区切られた最終の双子葉植物バイナリーベクターｐＤＡＢ２４５７を得た。

Ｇａｔｅｗａｙ^ＴＭ双子葉植物バイナリーコンストラクト
ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＧａｔｅｗａｙ^ＴＭＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いて、タバコ細胞中でｃＧＡＤ６５を発現するベクターを作成した。デスチネーションベクターとドナーベクターは共に、以下のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＧａｔｅｗａｙ^ＴＭＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙプロトコルにしたがって作成した。デスチネーションベクターｐＤＡＢ３７３６（図９Ｇ）とドナーベクターｐＤＡＢ３７４１（図８）を、ｃＧＡＤ６５バイナリーコンストラクトの作成に用いた。

デスチネーションベクターｐＤＡＢ３７３６は、ｐＤＡＢ２４０７に由来し、ａｔｔＲ部位を含み、これは、エントリークローンとＬＲクロナーゼ反応で再結合して発現クローンを生成する（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇａｔｅｗａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。また、これはバイナリーベクターの境界Ａと境界Ｂのコピーを複数個有している。境界領域内には、ＲＢ７マトリックス付着領域（ＭＡＲ）とＧａｔｅｗａｙ^ＴＭクローニング部位のａｔｔＲ１とａｔｔＲ２とが存在する。エントリーベクターｐＤＡＢ３７３１（図９Ｈ）はａｔｔＬ部位をもち、これは部位を持たない遺伝子断片をクローニングして、エントリークローンを作成するのに用いられる（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇａｔｅｗａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。ｐＤＡＢ３９３１は、ＣｓＶＭＶ ｖ２プロモーターとＯＲＦ２４ ３’ＵＴＲ ｖ１カセットを含む。プロモーターとＵＴＲの間には、ＮｃｏＩ部位およびＳａｃＩ部位があり、ここで目的の遺伝子が挿入される。このカセットは、Ｇａｔｅｗａｙ^ＴＭクローニング部位のａｔｔＬ１とａｔｔＬ２で連結される。

Ｇａｔｅｗａｙ^ＴＭＧＡＤ６５バイナリーベクター、ｐＤＡＢ３７４８（図９；配列番号３ 表Ｃ）は、ＰＴＵ カセット： Ｔ−ＤＮＡ 境界Ｂ：：ＲＢ７ ＭＡＲ ｖ３：：ＣｓＶＭＶ プロモーター ｖ２／ｃＧＡＤ ｖ２／Ａｔｕ ＯＲＦ２４ ３’ＵＴＲ ｖ２：：ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２／ＰＡＴ ｖ３／Ａｔｕ ＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ３：：複数のＴ−ＤＮＡ境界Ａを持つ。この植物での発現に最適化された化学合成ｃＧＡＤ６５遺伝子（天然ｃＧＡＤ６５：配列番号４；改変ｃＧＡＤ６５：配列番号５）は、ＮｃｏＩとＳａｃＩとを用いてｐＤＡＳＰＩＣＯ２７から切除した。このｃＧＡＤ６５フラグメントをｐＤＡＢ３９３１のＮｃｏＩ／ＳａｃＩ部位に挿入して、エントリークローンｐＤＡＢ３７４１を得た。ｐＤＡＢ３７４１は、ＬＲクロナーゼを用いてｐＤＡＢ３７３６に導入し、ｐＤＡＢ３７４８を得た。

コメ細胞での発現のための単子葉植物コンストラクト
コメの形質転換は、精製したＤＮＡ断片を用いて行った。ベクター主鎖から発現カセットの精製ができるように、発現カセットをＦｓｐＩ部位で連結した。ｐＤＡＢ２４５３中の発現カセット（図９Ｋ；配列番号６、表Ｆ）は、ＮｃｏＩ部位を取り除いたトウモロコシユビキチン遺伝子のプロモーター（ＺｍＵｂｉ１ ｖ２； Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９４ ２６（３） １００７； 米国特許第５，６１４，３９９号）とトウモロコシパーオキシダーゼ遺伝子の３^’ＵＴＲ領域（ＺｍＰｅｒ５ ３^’ＵＴＲ ｖ２； 米国特許第６，６９９，９８４号）からなる。ｐＤＡＢ２４５３中の選択可能なマーカー遺伝子カセットは、コメ・アクチン遺伝子プロモーター（ＯｓＡｃｔ１ ｖ２； Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ １９９１ ２３１：１５０； ジーンバンク受入番号Ｓ４４２２１およびＸ６３８３０）を連結したＰＡＴ遺伝子（上述）であり、トウモロコシリパーゼ遺伝子（ＺｍＬｉｐ ３^’ＵＴＲ ｖ２； ジーンバンク受入番号Ｌ３５９１３）から、Ｓａｄ部位と３^’ＵＴＲを除くように修飾されている。この化学的に合成されたＩＬ−４遺伝子は、ＤＡＳＰＩＣＯ１３に含まれ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のブルースクリプトベクター中のＰＩＣＯＳＣＲＩＰＴから得られる。遺伝子をＰＣＲで改変し、６ヒスチジンタグの連結したＩＬ−４遺伝子を得た（配列番号７、表６）。ついで、ＰＣＲ産生物からのＮｃｏＩ／ＳａｃＩフラグメントを、ｐＤＡＢ４００５（図９Ｌ）にＮｃｏＩおよびＳａｃＩ部位で挿入し、中間体ベクターｐＤＡＢ２４５１（図９Ｍ）を得た。ＩＬ４ ｖ２−ＫＤＥＬ／ＺｍＰｅｒ５ ３^’ＵＴＲを含むＺｍＵｂｉ１プロモーター発現カセットをＮｏｔＩでｐＤＡＢ２４５１から除き、ｐＤＡＢ８５０４のＮｏｔＩ部位（図９Ｎ）でＯｓＡｃｔ１ プロモーター ｖ２／ＰＡＴ ｖ３／ＺｍＬｉｐ ３^’ＵＴＲ ｖ２ 選択可能マーカーカセットの上流で貼り付け、ｐＤＡＢ２４５３中に植物転写ユニット（ＰＴＵ）を形成した。ＦｓｅＩ消化を用いてＰＴＵ成分をｐＤＡＢ２４５３から切り取り、コメ形質転換試験用に精製した。

ｃＩＬ−４遺伝子を含むｐＤＡＢ２４５３で形質転換したＴ−３０９コメの懸濁液の産生
コメの形質転換に用いた出発材料は、液体ＡＡ培地中のＴ３０９コメ懸濁液細胞（ＡＡ Ｃｕｓｔｏｍ Ｍｉｘ ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＬＬＣ、カタログ番号：ＣＭ０２４）であり、体積８ｍｌの沈降した細胞と２８ｍｌの順化培地（懸濁培養より回収した培地）と８０ｍｌの新鮮なＡＡ細胞培地とを、３．５日ごとに５００ｍｌのフラスコで植え継いだものである。このフラスコは、ロータリーシェーカー上で２８℃、１２５ｒｐｍに維持した。ホイスカー^ＴＭ試験は、体積９ｍｌの沈降した細胞と２７ｍｌの順化培地とを８０ｍｌの新鮮なＡＡ液体培地に投入して開始した。二個の５００ｍｌフラスコをロータリーシェーカーで１２５ｒｐｍ、２８℃で２４時間振盪した後に処理に用いた。

処理の日に、順化培地を抜き取って、０．２５Ｍのソルビトールと０．２５Ｍのマンニトールを含む７２ｍｌのＡＡ液体培地に交換して３０分間、細胞に浸透圧前処理を行った。浸透圧処理の後、二個のフラスコを、滅菌した２５０ｍｌのＩＥＣ遠心ボトル（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号：０５−４３３Ｂ）に投入した。細胞が沈降した後、浸透圧培地を除き、ボトルの底に約５０ｍｌの沈降細胞および培地を残した。浸透圧培地は保存し、後述の回収の際に利用した。

８１００μｌの新たに調整した５％ホイスカー懸濁液（Ｓｉｌａｒ ＳＣ−９、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｏｒｐ、Ｇｒｅｅｒ、ＳＣ）と１７０μｇのプラスミドＤＮＡのｐＤＡＳ２４５３を添加して、ホイスカリングを行った。このボトルを、改良型塗料ミキサー（Ｒｅｄ Ｄｅｖｉｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏ．，ミネアポリス、ＭＮ）に入れ、高速で１０秒間攪拌した。その後、細胞を順化培地とともに１Ｌのフラスコに入れ、２０８ｍｌの新鮮なＡＡ液体培地を追加した。細胞をロータリーシェーカー上で１２５ｒｐｍ、２８℃で２時間回復させた。

回収の後、細胞懸濁液を１ｍｌずつ、滅菌した５５ｍｍのＮｏ．４円形ろ紙（Ｗａｔｍａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｎｏｎａｌ Ｌｔｄ．）上に、均等に塗布し、半固形ＡＡ培地 （ＡＡカスタムミックス、ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ カタログ番号：ＣＭ０２４、および２．５ｇ／Ｌのゲルライト、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号：Ｇ１９１０）の入った６０×２０ｍｍのペトリ皿に入れ、暗所にて２８℃で３日間培養した。三日後、細胞の付着したろ紙を、新鮮な半固形Ｄ２［−］Ｐ培地（Ｎ６塩、カタログ番号：Ｃ１４１６、ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭＳ／Ｎ６ビタミン、１ｇ／Ｌのトリプトファン、３０ｇ／Ｌのスクロース、５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、２５ｇ／Ｌのゲルライト、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号：Ｇ１９１０、および３０ｍｇ／Ｌのハービエース、Ｍｅｉｊｉ、東京、日本）に移し、暗所にて２８℃で２週間培養した。ろ紙は、分離株が見えるようになるまで、二週間ごとに新鮮なＤ２［−］Ｐ培地に移しかえた。カルスは、５ｍｇ／Ｌのハービエースを含む半固形ＡＡ培地に移し、２週間ごとに植え継いだ。選択した事象に関する発現の分析を行った。

ｃＩＬ−４遺伝子を含むｐＤＡＢ２４５７で形質転換した遺伝子組換ニコチナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）の産生
形質転換に先立つ４日前に、２ｍｌのＮＴ−１培養物または１ｍｌの沈降細胞を４０ｍｌのＮＴ−１ Ｂ培地に添加して、１週齢のＮＴ−１培養物を、新鮮な培地に植え継いだ。植え継いだ懸濁液は、暗所で２５±１℃に維持し、シェーカーにて１２５ｒｐｍで攪拌した。

目的の発現ベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の５０％グリセロール株を用い、直接２０〜５００μｌのバクテリアを５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含む３０ｍｌのＹＥＰ液体に添加して、液体培養を開始した。バクテリア培養物は、２８℃の暗所内の培養シェーカー中で１５０〜２００ｒｐｍにて培養した。

４ミリリットルのタバコ懸濁液を、１０枚の１００×２５ｍｍのペトリ皿に移した。１００μｌのＯＤ_６００が１５±０２のアグロバクテリウム懸濁液を９枚の皿に入れ、一枚の皿を未処理のコントロールとした。これらの皿を、振り混ぜ、パラフィルムで覆い、暗所で２５±１℃で振盪せずに培養した。

この共培養の後、液体をすべて除き、細胞を８ｍｌのＮＴＣ培地（５００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含むＮＴ−１培地、オートクレーブ滅菌後に添加）に再分散させた。１ミリリットルの懸濁液を、ＮＴＣ＋Ｂ１０培地（１０ｍｇ／ｌのビアラホスを添加した８ｇ／ｌのＴＣ寒天で固化したＮＴＣ培地、オートクレーブ滅菌後に添加）を含む８枚のペトリ皿（１００×２５ｍｍ）にそれぞれに添加した。選択用のペトリ皿は、パラフィルムで覆われたもの覆われてないもののいずれも、暗所で２８℃に維持した。覆う前に濡れのひどいペトリ皿中の液体は除去した。２〜６週間後、死んだ形質転換していない細胞からなる面上に、形質転換物と思われるものが、小さなカルス塊として出現した。これらを集め、新鮮なＮＴＣ＋Ｂ１０培地に移した。これらの皿は、覆いを除いたまま、暗所で２８±１℃で培養した。形質転換物と思われるもの一部は分析用に用いた。

カルスサンプルの抽出
ウエスタン分析のために、カルスサンプルを直接、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル塗布用緩衝剤で抽出した。２００マイクロリットルの２×レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）サンプル緩衝剤（ＤＴＴを還元剤とする）を２００μｌのカルス組織に添加した。各チューブに 二個のスチール製ＢＢ（デージー、４．５ｍｍ）を加え、そのチューブを２分間、クレスコ組織粉砕機で処理した。９５℃で５〜１０分間加熱後、このチューブを微小遠心機で１０分間遠心分離した。このサンプルをウエスタン分析用ゲルに塗布した。

遺伝子組換カルスのウエスタン分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルは、上述のように、細胞抽出物として、または塗布用緩衝剤（４× Ｌａｅｍｌｌｉ サンプル緩衝剤、ＤＴＴ入り）を加え５分間加熱（９０〜１００℃）して得た。ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％ビス−トリスゲル）の泳動は、ＭＥＳ展開緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：ＮＰ０００２−０２）を用いて行った。複数の分子量標準物（それぞれ、シーブルー・プラス２、マジックマークＸＰシーブルー・プラス２；カタログ番号：それぞれＬＣ５９２５およびＬＣ５６０２）と適当な量のサンプルを塗布した。ゲルの泳動は、２００Ｖで３０〜４５分間行った。膜（０．２μｍのニトロセルロース膜；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：ＬＣ２０００）とパッドは、１０〜３０分間、１０％メタノールトランスファーバッファー（ＮｕＰＡＧＥトランスファーバッファー、カタログ番号：ＮＰ０００６）に浸漬した。

メーカーの指示通りにブロットモジュールを組み立て、ブロットを３０Ｖで約１時間、転写した。転写後、膜は水洗し、ブロック溶液（ウエスタンブリーズブロッカー／希釈剤、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号：ＷＢ７０５０）中で少なくとも３０分間室温で攪拌して、ブロックした。このブロットを、少なくとも１時間、ブロック溶液中で一次抗体とともに培養した。この膜を三回、それぞれ５分間、洗浄液（ウエスタンブリーズ洗浄液、カタログ番号：ＷＢ７００３）中で洗浄した。二次抗体での処理も同様に行った。ただし、培養は少なくとも３０分間行った。この膜を三度それぞれ５分間、洗浄液で洗浄し、さらに水で二度２分間、洗浄してから、基質を添加した。

ＩＬ−４のウエスタンブロットでは、標準試薬が、遺伝子組換えイヌＩＬ−４（Ｒ＆Ｄシステム、カタログ番号：７５４−ＣＬ）；一次抗体（１μｇ／ｍｌに希釈）が、抗−イヌＩＬ−４抗体（Ｒ＆Ｄシステム、カタログ番号：ＡＦ７５４）；二次抗体が、ＨＲＰ共役ウサギ抗−ヤギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ａ５４２０）１：５０００希釈、であった。ウエスタン免疫検出は、ウエスタンブリーズ・キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：ＷＢ７０５０）と、検出用のピアス・スーパーシグナル・ウエスト・ピコ・ルミノール・エンハンサおよび安定酸化物等量混合物溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号：３４０８０）を用いて行った。遺伝子組換カルス中のＩＬ−４の発現を調べるために、ブロットをＸ線フィルムに露出した。

ＧＡＤ６５のウエスタンブロットでは、標準として、ｒｈＧＡＤ６５（Ｄｉａｍｙｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号：１０−６５７０２−０１）；一次抗体として、抗ＧＡＤ６５（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｇ１１６６）１：２０００希釈；二次抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ ＡＰ（ＫＰＬ、カタログ番号：０７５−１８０６）１：１０００希釈を用いた。ウエスタン免疫検出は、ウエスタンブリーズ・キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：ＷＢ７０５０）と、検出用のＮＢＴ／ＢＣＩＰホスファターゼ基質（ＫＰＬ、カタログ番号：５０−８１−０８）を用いて行った。遺伝子組換カルス中でのＧＡＤ６５の発現を調べるため、ブロットと基質とを５〜１０分間接触させた。

ウエスタン分析の結果、イヌｃＩＬ−４が、コメとタバコ細胞の両方で発現されることが明らかとなった（図１０および図１１）。この遺伝子組換ｃＩＬ−４は、ｃＩＬ−４参照用タンパクと比べ大きな分子量を有するため、 翻訳後に修飾されたようである。細胞質を標的とするイヌＧＡＤ６は、タバコ細胞で発現される（図１２）。この遺伝子組換タンパクの分子量は、参照用ｃＧＡＤ６５とほぼ同じか大きかった。ウエスタンブロットには、分解産品も見られた。

ｃＩＬ−４のキャラクタリゼーション
遺伝子組換タバコカルスからタンパクを抽出して、遺伝子組換ｃＩＬ−４のキャラクタリゼーションを行った。組織を液体窒素中で破砕し、約１０体積／重量（ｍｌ／ｇ組織）の２×ＰＢＳＴ（Ｓｉｇｍａ Ｐ３５６３）、１Ｍの尿素、１０％のグリセロール、２ｍＭのイミダゾール，１ｍＭのＰＭＳＦ、および１％のロテアーゼカクテル阻害剤（ＳｉｇｍａＰ９５９９）を加えた。懸濁液は４℃で３０分間攪拌した。遠心分離と濾過での清澄化の後、この溶液をハイトラップニッケルカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ １７−５２４７−０１）にかけ、約２時間２５ｍＬ／ｍｉｎで循環させた。このカラムを、２×ＰＢＳＴ、４０ｍＭのイミダゾール溶液（ｐＨ８．４）で洗浄し、吸着されたタンパクを、２０ｍＭのＮａＨＰＯ_４、５００ｍＭのＮａＣｌ、および５００ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．４）で溶出した。ウエスタンブロット分析におけるｃＩＬ−４を含むフラクションを混合し、１００ｍｌのスペローズ６の１６／５０サイジングカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ １７−０４８９−０１）にかけた。タンパクをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で溶出し、インビトロＩＬ−４活性アッセイで分析した。フラクション中のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、溶出した主なタンパクバンドは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析して、ＩＬ−４であるかどうか確認した（データ非表示）。

遺伝子組換タバコカルスで作られたｃＩＬ−４は、上記のように精製した。ハイトラップニッケルカラムのクロマト図を図１３に示す。なお、これらの画分はさらに精製するために保持した。スペローズ６カラムから溶出したこれらの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、ｃＩＬ−４に相当する大きなタンパクバンド（矢印）が、ウエスタンブロットおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により、検出された。

以上、本発明の好ましい実施様態を詳細に記載したが、当業者であれば、本発明の精神および添付クレームの範囲から逸脱せずに変更可能であることを理解されるであろう。

図１は、糖尿病性雌ＮＯＤマウスの血中グルコースレベルに及ぼす、コントロール植物とＧＡＤ／ＩＬ−４植物の給餌の影響を示す。 図２は、図１の糖尿病性雌ＮＯＤマウスの過血糖症発症までの時間を示すカプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ）生存率分析の結果を示す。 図３は、ベースラインと抗ＣＤ３治療の４０日目および６０日目との給餌後血中グルコースレベルを示す。 図４は、ＧＡＤ／ＩＬ−４給餌マウスとコントロール給餌マウスとで比較した抗ＧＡＤ・ＩｇＧ１のレベルを示す。 図５は、ＧＡＤ／ＩＬ−４給餌マウスとコントロール給餌マウスとで比較した糖尿病発症の平均遅延時間を示す。 図６は、健康なイヌと抗ＧＡＤ・ＥＬＩＳＡにより新たに糖尿病と診断されたイヌとの血清抗ＧＡＤ６５抗体のレベルを示す。 図７は、遺伝子組換タバコ植物中でのイヌＧＡＤ６５タンパクの発現のウエスタンブロット分析を示す図である。遺伝子組換タバコ葉組織由来の全タンパク抽出物（４０μｇ／レーン）をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分画し、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜にブロットし、抗ＧＡＤ抗体で検出した。１〜５レーンがイヌＧＡＤ６５遺伝子組換タバコライン；ＷＴ、野生型タバコ；ＧＡＤ６７、ポジティブコントロールとして使用。左の数字は、タンパク分子量マーカーの位置を示す。 図８Ａは、植物ｒｃＩＬ−４が容量依存的に、ＴＦ−１細胞による３Ｈ−チミジンの吸収を刺激することを示す。植物ｒｃＩＬ−４を抗イヌＩＬ−４抗体（Ａｂ）とともに前培養すると、増殖中のＴＦ−１細胞を刺激する能力が減少する。 図８Ｂは、市販のｒｃＩＬ−４標準サンプルを用いて与えた刺激に応答するＴＦ−１細胞による３Ｈ−チミジンの吸収を示す。 図９Ａ〜図９Ｎは、細胞形質転換に用いた各種のプラスミドコンストラクトである。図９Ａ、ｐＤＡＢ７７１；図９Ｂ、ｐＤＡＢ７７３。 図９Ａ〜図９Ｎは、細胞形質転換に用いた各種のプラスミドコンストラクトである。図９Ｃ、ｐＤＡＢ２４０７；図９Ｄ、ｐＤＡＢ２４５７。 図９Ａ〜図９Ｎは、細胞形質転換に用いた各種のプラスミドコンストラクトである。図９Ｅ、ｐＤＡＢ２４５５；図９Ｆ、ｐＤＡＢ２４５６。 図９Ａ〜図９Ｎは、細胞形質転換に用いた各種のプラスミドコンストラクトである。図９Ｇ、ｐＤＡＢ３７３６；図９Ｈ、ｐＤＡＢ３７４１。 図９Ａ〜図９Ｎは、細胞形質転換に用いた各種のプラスミドコンストラクトである。図９Ｉ、ｐＤＡＢ３７３１；図９Ｊ、ｐＤＡＢ３７４８。 図９Ａ〜図９Ｎは、細胞形質転換に用いた各種のプラスミドコンストラクトである。図９Ｋ、ｐＤＡＢ２４５３；図９Ｌ、ｐＤＡＢ４００５。 図９Ａ〜図９Ｎは、細胞形質転換に用いた各種のプラスミドコンストラクトである。図９Ｍ、ｐＤＡＢ２４５１；図９Ｎ、ｐＤＡＢ８５０４。 図１０は、遺伝子組換タバコ中でのＩＬ−４の発現のウエスタンブロットの図である。カルスは、ＳＤＳゲル塗布用の溶液で抽出し、９５℃で加熱した。ゲルおよびウエスタンブロットは、実施例の章に記載のように実施した。 図１１は、遺伝子組換コメ中でのＩＬ−４の発現のウエスタンブロットを示す。カルスは、ＳＤＳゲル塗布用の溶液で抽出し、９５℃で加熱した。ゲルおよびウエスタンブロットは、実施例の章に記載のように実施した。 図１２は、ＮＴ−１カルス内で発現されたｃＧＡＤ６５サンプルのウエスタン分析を示す。カルスは、ＳＤＳゲル塗布用の溶液で抽出し、９５℃で加熱した。矢印は、遺伝子組換え標準サンプルｒｈＧＡＤ６５を示す。１レーン、分子量マーカー；２レーン、ｒｈＧＡＤ６５標準；３レーン、非遺伝子組換カルス；４〜１３レーン、それぞれｃＧＡＤ６５遺伝子組換体。 図１３は、ＩＬ−４の精製を示す。遺伝子組換タバコカルス中に生成したｃＩＬ−４は、上述のように精製した。ハイトラップニッケルカラムでのクロマト図を示した。この画分は、さらに精製するため保持した。スペローズ６カラムから溶離したこの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析したところ、大きなタンパクバンド（矢印）が認められ、これはウエスタンブロットとＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によればｃＩＬ−４に相当する。

Claims (70)

1. 哺乳動物における新たに発症したＩ型糖尿病または前Ｉ型糖尿病性の哺乳動物の治療方法であって、
   （ａ）該哺乳動物に抗Ｔ細胞治療剤を投与することと、
   （ｂ）任意の粘膜抗原を含む自己抗原組成物を投与することと
   を含み、（ａ）と（ｂ）とが同時または逐次に投与される、方法。
2. 前記抗Ｔ細胞治療剤がＴ細胞を標的とする免疫抑制剤である、請求項１に記載の方法。
3. 前記免疫抑制剤が、Ｔ細胞表面抗原を標的とするモノクロナール抗体、Ｔ細胞表面抗原を標的とするポリクローナル抗体、シクロスポリン、メトトレキセート、アザチオプリンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
4. 前記免疫抑制剤が、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２、抗ＣＤ４、抗ＣＤ７、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ２８、抗α４β１インテグリン、抗α４β７インテグリン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるモノクロナール抗体である、請求項３に記載の方法。
5. 前記免疫抑制剤が、抗ＣＤ３モノクロナール抗体である、請求項４に記載の方法。
6. 前記自己抗原が、ＧＡＤアイソフォーム、ＧＡＤポリペプチド、インシュリン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
7. 前記自己抗原が、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、およびこれらの混合物からなる群より選択されるＧＡＤアイソフォームである、請求項６に記載の方法。
8. 前記粘膜抗原が免疫調整性サイトカインである、請求項１に記載の方法。
9. 前記免疫調整性サイトカインがインターロイキンである、請求項８に記載の方法。
10. 前記インターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
11. 前記インターロイキンがＩＬ−４である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記インターロイキンがＩＬ−１０である、請求項１０に記載の方法。
13. 前記免疫抑制剤が、静脈注射により前記哺乳動物に最大約１０日間投与される、請求項２に記載の方法。
14. 前記免疫抑制剤が、静脈注射により前記哺乳動物に最大約５〜７日間投与される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記免疫抑制剤が、体重１ｋｇ当たり最大約１０μｇ／ｋｇ〜最大約１００μｇ／ｋｇ量で投与される、請求項１３に記載の方法。
16. 前記自己抗原および任意の粘膜抗原組成物が、経口的に、粘膜表面に、または非経口的に投与される、請求項１または１０に記載の方法。
17. 前記自己抗原および任意の粘膜抗原組成物が、遺伝子組換植物材料中で提供される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記遺伝子組換植物材料が、ジャガイモ、トマト、アルファルファ、キャノーラ、コメ、タバコ、トウモロコシ、藻類、サフラワー、コケ、および蘚苔植物からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記遺伝子組換植物材料が、植物組織、植物葉、植物塊茎、植物茎、植物抽出物、植物スラリー、植物細胞培養物、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
20. 前記組成物が経口的に投与される、請求項１７に記載の方法。
21. 前記自己抗原および任意の粘膜抗原が、最大約１ｍｇ／ｋｇ〜最大約１０００ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１６に記載の方法。
22. 前記自己抗原および任意の粘膜抗原が、約１０００ｍｇ／ｋｇを超える量で投与される、請求項１６に記載の方法。
23. 前記自己抗原および任意の粘膜抗原が、最大約１ｍｇ／ｋｇ〜最大約１００ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項２１に記載の方法。
24. （ａ）と（ｂ）とが同時に投与される、請求項１に記載の方法。
25. （ａ）と（ｂ）とが逐次的に投与される、請求項１に記載の方法。
26. （ａ）と（ｂ）とが同時に投与され、さらに（ｂ）が投与される、請求項１に記載の方法。
27. 前記更なる（ｂ）の投与が長期間行われる、請求項２６に記載の方法。
28. 前記長期間が最長で前記哺乳動物のほぼ一生に及ぶ、請求項２７に記載の方法。
29. 前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
30. 前記哺乳動物が、イヌ、ネコ、およびウマからなる群より選択されるコンパニオン動物である、請求項１に記載の方法。
31. 前記ヒトが新たに発症したＩ型糖尿病を有する、請求項２９に記載の方法。
32. 前記ヒトが前Ｉ型糖尿病である、請求項２９に記載の方法。
33. 哺乳動物におけるＩ型糖尿病の治療方法、または前Ｉ型糖尿病性の哺乳動物の治療方法であって、
    （ａ）有効投与量の抗Ｔ細胞抗体を該哺乳動物に投与することと、
    （ｂ）有効投与量の自己抗原を該哺乳動物に投与することと
    を含み、（ａ）および（ｂ）が同時もしくは逐次に有効な期間投与されるか、または（ａ）および（ｂ）が同時に投与され、さらに（ｂ）が長期間継続して投与される、方法。
34. ヒトにおけるＩ型糖尿病の治療方法または前Ｉ型糖尿病性のヒトの治療方法であって、
    （ａ）有効免疫抑制量の抗Ｔ細胞抗体を該ヒトに投与することと、
    （ｂ）免疫有効量の遺伝子組換植物材料を該哺乳動物に投与することと
    を含み、該遺伝子組換植物材料が、少なくとも一つの自己抗原および任意の少なくとも一つの免疫調整性サイトカインを含有し、（ａ）および（ｂ）の該投与を同時にまたは逐次に行う、方法。
35. 前記抗Ｔ細胞抗体がポリクローナル抗体である、請求項３４に記載の方法。
36. 前記抗Ｔ細胞抗体がモノクロナール抗体である、請求項３４に記載の方法。
37. 前記モノクロナール抗体が、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２、抗ＣＤ４、抗ＣＤ７、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ２８、抗α４β１インテグリン、抗α４β７インテグリン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
38. 前記モノクロナール抗体が、抗ＣＤ３モノクロナール抗体である、請求項３７に記載の方法。
39. 前記自己抗原が、ＧＡＤアイソフォーム、ＧＡＤポリペプチド、インシュリン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
40. 前記自己抗原が、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、およびこれらの混合物からなる群より選択されるＧＡＤアイソフォームである、請求項３９に記載の方法。
41. 前記免疫調整性サイトカインがインターロイキンである、請求項３４、３７、または３９に記載の方法。
42. 前記インターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。
43. 前記インターロイキンがＩＬ−４である、請求項４２に記載の方法。
44. 前記インターロイキンがＩＬ−１０である、請求項４２に記載の方法。
45. 前記遺伝子組換植物材料が経口的にまたは粘膜の表面に投与される、請求項４１に記載の方法。
46. 前記遺伝子組換植物材料が、体重１ｋｇ当たり最大約１０μｇ／ｋｇ〜最大約１００μｇ／ｋｇの前記抗Ｔ細胞抗体が供給されるように投与される、請求項４５に記載の方法。
47. 前記遺伝子組換植物材料が、最大約１ｍｇ／ｋｇ〜最大約１０００ｍｇ／ｋｇの自己抗原および任意の免疫調整性サイトカインを供給する、請求項４６に記載の方法。
48. （ａ）と（ｂ）とが同時に投与される、請求項３４に記載の方法。
49. （ａ）と（ｂ）とが逐次的に投与される、請求項３４に記載の方法。
50. （ａ）と（ｂ）とが同時に投与され、さらに（ｂ）の投与が行われる、請求項３４に記載の方法。
51. 前記さらなる（ｂ）の投与が長時間行われる、請求項５０に記載の方法。
52. 前記長期間が最長でその哺乳動物のほぼ一生に及ぶ、請求項５１に記載の方法。
53. ヒトまたはコンパニオン動物のＩ型糖尿病の逆転方法であって、
    （ａ）治療有効量の抗ＣＤ３モノクロナール抗体を該ヒトまたは動物に投与することと、
    （ｂ）治療有効量の一つ以上のＧＡＤ自己抗原を含む遺伝子組換植物材料をＩＬ−４とともに投与することと
    を含み、（ａ）が最初に該ヒトまたは動物に対して投与される、方法。
54. （ａ）と（ｂ）とが、同時に投与される、請求項５３に記載の方法。
55. （ｂ）がさらに長時間投与される、請求項５３に記載の方法。
56. 植物での発現に最適化されたＩＬ−４ヌクレオチド配列。
57. 前記最適化がヒスチジンタグの付加である、請求項５６に記載の配列。
58. 前記最適化が、ＥＲ保持シグナルおよびヒスチジンタグの付加である、請求項５６に記載の配列。
59. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号２と配列番号７からなる群より選択される、請求項５６に記載の配列。
60. 前記配列がイヌの配列である、請求項５６に記載の配列。
61. 配列番号４のイヌＧＡＤ６５ヌクレオチド配列。
62. 前記配列がさらに植物での発現に最適化されている、請求項６１に記載のヌクレオチド配列。
63. 前記最適化配列が配列番号５で表される、請求項６２に記載のヌクレオチド配列。
64. 配列番号１、配列番号３および配列番号６からなる群より選択される、細胞形質転換用のベクター。
65. ｐＤＡＢ７７１、ｐＤＡＢ７７３、ＰＤＡＢ２４０７、ｐＤＡＢ２４５７、ｐＤＡＢ２４５５、ｐＤＡＢ２４５６、ｐＤＡＢ３７３６、ｐＤＡＢ３７４１、ｐＤＡＢ３７３１、ｐＤＡＢ３７４８、ｐＤＡＢ２４５３、ｐＤＡＢ４００５、ｐＤＡＢ２４５１およびｐＤＡＢ８５０４からなる群より選択される、ベクター。
66. 抗ＣＤ３抗体と、少なくとも一つの自己抗原および一つの免疫調整性サイトカインを含む製剤との混合物を含む、組成物。
67. 抗ＣＤ３抗体と、少なくとも一つの自己抗原および一つの免疫調整性サイトカインを含む遺伝子組換植物材料との混合物を含む、組成物。
68. 抗Ｔ細胞抗体、自己抗原、および任意の粘膜抗原を含む組成物の、哺乳動物におけるＩ型糖尿病治療のための医薬の製造における、使用。
69. 哺乳動物のＩ型糖尿病の診断方法であって、該哺乳動物からのサンプル中の抗ＧＡＤ抗体の存在を検出する工程を包含し、そのような検出が、哺乳動物におえｋるＩ型糖尿病の発症または発症のリスクの早期指標である、方法。
70. 前記抗ＧＡＤ抗体がイヌの抗体である、請求項６９に記載の方法。

Images