JP2009082105A - 塩化セシウムおよび臭化エチジウム含有溶液から核酸を単離する方法 - Google Patents
塩化セシウムおよび臭化エチジウム含有溶液から核酸を単離する方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法による核酸精製において、遠心後に分離した核酸溶液中の高濃度の塩化セシウムおよび臭化エチジウムを迅速かつ同時に除去して、核酸を単離取得する方法を提供する。
【解決手段】（１）塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液を、１種または２種以上のＡｇ＋型ゼオライトと接触させる工程、および
（２）Ａｇ＋型ゼオライトの非吸着画分を採取する工程
を有する、塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液から核酸を単離取得する方法。
【選択図】なし
【解決手段】（１）塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液を、１種または２種以上のＡｇ＋型ゼオライトと接触させる工程、および
（２）Ａｇ＋型ゼオライトの非吸着画分を採取する工程
を有する、塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液から核酸を単離取得する方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、塩化セシウムおよび臭化エチジウムを含む溶液から核酸を選択的且つ高収率に単離取得する方法に関する。より詳細には、本発明は塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法を用いて回収された核酸含有溶液から、塩化セシウムおよび臭化エチジウムを同時に除去して、選択的かつ収率良く核酸を単離取得する方法に関する。
塩化セシウム-臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法は核酸を精製する方法の一つであり、ミトコンドリアＤＮＡの分離精製、培養細胞への遺伝子導入用ベクターの精製など、特に高純度のＤＮＡを必要とする際に使用される方法である。この方法は、ＤＮＡインターカレーターである臭化エチジウムが結合したＤＮＡは、塩基間の広がりによるＤＮＡ鎖の巻き戻し効果によって密度が低下することを利用したものである。すなわち、ＤＮＡ鎖にニック（切れ目）が入っている環状ＤＮＡや直鎖状ＤＮＡ（リラックス型ＤＮＡ）では巻き戻しの構造的制約がないのに対し、完全閉環状のスーパーコイル型ＤＮＡでは構造的な制約から巻き戻しに制限があり、結果としてスーパーコイル型ＤＮＡとリラックス型ＤＮＡとで、密度の差ができることを利用して、ＤＮＡを分離するものである。
塩化セシウム-臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法では、遠心終了後の分離ＤＮＡ溶液に高濃度の塩化セシウムと臭化エチジウムが含まれているため、ＤＮＡを単離取得するためには、これらの塩化セシウムと臭化エチジウムを除去する必要がある。従来この目的で、塩化セシウムの除去には透析法または希釈とエタノール沈殿法が、また臭化エチジウムの除去には溶媒抽出法が汎用されている（非特許文献１）。
しかしながら、かかる方法は、除去対象物（塩化セシウムまたは臭化エチジウム）に応じて異なる方法を採用する必要があり、煩雑であるとともに、複数の処理によってＤＮＡの収率が低下するという問題がある。また、上記方法では溶媒抽出に伴って臭化エチジウムを含む有機廃液が生じるため、発ガン性物質を含む有機廃液の処理が必要となるという問題が発生する。
一方で、ゲルろ過担体を充填した脱塩カラムを用いたゲルろ過法を利用して塩化セシウムと臭化エチジウムをプラスミド溶液から分離する方法も報告されている（非特許文献２）。しかし、この方法では塩化セシウムと臭化エチジウムはゲルろ過担体に安定的に吸着されている訳ではないため、溶離液の調製法によってはプラスミドと塩化セシウム、臭化エチジウムが完全に分離できない場合や、使用済みカラムに対する意図しない溶液の添加等で容易に臭化エチジウムが溶出してくる危険があるという問題がある。
T, Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook, Large scale isolation of plasmid DNA, Molecular Cloning: a laboratory manual, p86-95, Cold Spring Harbor Laboratry, Cold Spring Harbor. NY(1982) Rapid Separation of DNA from Ethidium Bromide and Cesium Chloride in Ultracentrifuge Gradients by a Desalting Column, Chang, N. S., BioTechniques vol.14, No.3, p342-346, 1993
T, Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook, Large scale isolation of plasmid DNA, Molecular Cloning: a laboratory manual, p86-95, Cold Spring Harbor Laboratry, Cold Spring Harbor. NY(1982) Rapid Separation of DNA from Ethidium Bromide and Cesium Chloride in Ultracentrifuge Gradients by a Desalting Column, Chang, N. S., BioTechniques vol.14, No.3, p342-346, 1993
本発明は、かかる従来の問題を解決することを目的とするものである。より詳しくは、本発明は、例えば塩化セシウム-臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法で得られる、塩化セシウムおよび臭化エチジウムを含有する核酸溶液から、核酸の吸着によるロスを抑制しながら、塩化セシウムおよび臭化エチジウムを同時に除去して、選択的かつ高収率に核酸を単離取得できる方法を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねていたところ、ゼオライト、特にＡｇ＋型ゼオライトを用いることにより、塩化セシウムと臭化エチジウムを含む核酸溶液から、塩化セシウムと臭化エチジウムを同時に効率よく除去でき、しかも核酸を殆どロスなく収率よく分離回収することができることを見出した。
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の構成を有するものである。
（Ｉ）臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液から核酸を単離取得する方法
（I-1）塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液から核酸を単離取得する方法であって、
（１）塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液を１種または２種以上のＡｇ＋型ゼオライトと接触させる工程、および
（２）Ａｇ＋型ゼオライトの非吸着画分を採取回収する工程
を有する、上記方法。
（I-2）上記で使用するＡｇ＋型ゼオライトが、陽イオン交換容量が総計で少なくとも０.８９ｍｅｑ／ｇ、交換性陽イオンのうちＡｇ＋交換率が総計で少なくとも５５％、および臭化エチジウム吸着量が総計で少なくとも８.５ｍｇ／ｇであることを特徴とするものである、（I-1）に記載する方法。
（I-3）上記Ａｇ＋型ゼオライトが、モルデナイト、クリノプチロライト、フェリエライト、Ａ型ゼオライト、Ｘ型ゼオライト、Ｙ型ゼオライト、およびＭＦＩ型合成ゼオライトからなる群から選択される少なくとも１種である、（I-1）または（I-2）のいずれかに記載する方法。
（I-4）上記Ａｇ＋型ゼオライトが、モルデナイト、クリノプチロライト、天然フェリエライト、Ｙ型ゼオライト、および合成ＭＦＩ型ゼオライトからなる群から選択される少なくとも１種である、（I-1）または（I-2）のいずれかに記載する方法。
（I-5）上記Ａｇ＋型ゼオライトが、モルデナイト、クリノプチロライト、天然フェリエライト、Ｙ型ゼオライト、および合成ＭＦＩ型ゼオライトからなる群から選択される少なくとも１種と、Ａ型ゼオライト、Ｘ型ゼオライト、および合成フェリエライトからなる群から選択される少なくとも１種との混合物である、（I-1）または（I-2）のいずれかに記載する方法。
（I-6）塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液が、塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法で分離回収された核酸溶液である、（I-1）乃至（I-5）のいずれかに記載する方法。
（I-1）塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液から核酸を単離取得する方法であって、
（１）塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液を１種または２種以上のＡｇ＋型ゼオライトと接触させる工程、および
（２）Ａｇ＋型ゼオライトの非吸着画分を採取回収する工程
を有する、上記方法。
（I-2）上記で使用するＡｇ＋型ゼオライトが、陽イオン交換容量が総計で少なくとも０.８９ｍｅｑ／ｇ、交換性陽イオンのうちＡｇ＋交換率が総計で少なくとも５５％、および臭化エチジウム吸着量が総計で少なくとも８.５ｍｇ／ｇであることを特徴とするものである、（I-1）に記載する方法。
（I-3）上記Ａｇ＋型ゼオライトが、モルデナイト、クリノプチロライト、フェリエライト、Ａ型ゼオライト、Ｘ型ゼオライト、Ｙ型ゼオライト、およびＭＦＩ型合成ゼオライトからなる群から選択される少なくとも１種である、（I-1）または（I-2）のいずれかに記載する方法。
（I-4）上記Ａｇ＋型ゼオライトが、モルデナイト、クリノプチロライト、天然フェリエライト、Ｙ型ゼオライト、および合成ＭＦＩ型ゼオライトからなる群から選択される少なくとも１種である、（I-1）または（I-2）のいずれかに記載する方法。
（I-5）上記Ａｇ＋型ゼオライトが、モルデナイト、クリノプチロライト、天然フェリエライト、Ｙ型ゼオライト、および合成ＭＦＩ型ゼオライトからなる群から選択される少なくとも１種と、Ａ型ゼオライト、Ｘ型ゼオライト、および合成フェリエライトからなる群から選択される少なくとも１種との混合物である、（I-1）または（I-2）のいずれかに記載する方法。
（I-6）塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液が、塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法で分離回収された核酸溶液である、（I-1）乃至（I-5）のいずれかに記載する方法。
（II）Ａｇ ＋ 型ゼオライトの、塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液から核酸を単離するための使用
（II-1）Ａｇ＋型ゼオライトの、塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液から核酸を単離取得するための使用。
（II-2）上記Ａｇ＋型ゼオライトが、陽イオン交換容量が総計で少なくとも０.８９ｍｅｑ／ｇ、交換性陽イオンのうちＡｇ＋交換率が総計で少なくとも５５％、および臭化エチジウム吸着量が総計で少なくとも８.５ｍｇ／ｇであることを特徴とするものである、（II-1）に記載する使用。
（II-3）上記Ａｇ＋型ゼオライトが、モルデナイト、クリノプチロライト、フェリエライト、Ａ型ゼオライト、Ｘ型ゼオライト、Ｙ型ゼオライト、および合成ＭＦＩ型ゼオライトからなる群から選択される少なくとも１種である、（II-1）または（II-2）のいずれかに記載する使用。
（II-4）上記Ａｇ＋型ゼオライトが、モルデナイト、クリノプチロライト、天然フェリエライト、Ｙ型ゼオライト、および合成ＭＦＩ型ゼオライトからなる群から選択される少なくとも１種である、（II-1）または（II-2）のいずれかに記載する使用。
（II-5）上記Ａｇ＋型ゼオライトが、モルデナイト、クリノプチロライト、天然フェリエライト、Ｙ型ゼオライト、および合成ＭＦＩ型ゼオライトからなる群から選択される少なくとも１種と、Ａ型ゼオライト、Ｘ型ゼオライト、および合成フェリエライトからなる群から選択される少なくとも１種との混合物である、（II-1）または（II-2）のいずれかに記載する使用。
（II-6）塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液が、塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法で分離回収された核酸溶液である、（II-1）乃至（II-5）のいずれかに記載する使用。
（II-1）Ａｇ＋型ゼオライトの、塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液から核酸を単離取得するための使用。
（II-2）上記Ａｇ＋型ゼオライトが、陽イオン交換容量が総計で少なくとも０.８９ｍｅｑ／ｇ、交換性陽イオンのうちＡｇ＋交換率が総計で少なくとも５５％、および臭化エチジウム吸着量が総計で少なくとも８.５ｍｇ／ｇであることを特徴とするものである、（II-1）に記載する使用。
（II-3）上記Ａｇ＋型ゼオライトが、モルデナイト、クリノプチロライト、フェリエライト、Ａ型ゼオライト、Ｘ型ゼオライト、Ｙ型ゼオライト、および合成ＭＦＩ型ゼオライトからなる群から選択される少なくとも１種である、（II-1）または（II-2）のいずれかに記載する使用。
（II-4）上記Ａｇ＋型ゼオライトが、モルデナイト、クリノプチロライト、天然フェリエライト、Ｙ型ゼオライト、および合成ＭＦＩ型ゼオライトからなる群から選択される少なくとも１種である、（II-1）または（II-2）のいずれかに記載する使用。
（II-5）上記Ａｇ＋型ゼオライトが、モルデナイト、クリノプチロライト、天然フェリエライト、Ｙ型ゼオライト、および合成ＭＦＩ型ゼオライトからなる群から選択される少なくとも１種と、Ａ型ゼオライト、Ｘ型ゼオライト、および合成フェリエライトからなる群から選択される少なくとも１種との混合物である、（II-1）または（II-2）のいずれかに記載する使用。
（II-6）塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液が、塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法で分離回収された核酸溶液である、（II-1）乃至（II-5）のいずれかに記載する使用。
本発明の方法によれば、Ａｇ＋型ゼオライトを用いることで、塩化セシウムと臭化エチジウムを１ステップで同時に除去することができる。また本発明の方法によれば、分離取得対象である核酸を、特異的または非特異的な吸着などによって著しくロスするということなく、収率よく回収することができる。このため、本発明の方法は、塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法で得られるような、塩化セシウムおよび臭化エチジウムを含む核酸含有溶液の中から、核酸を、選択的且つ高収率に、単離回収する方法として有用である。
本発明が対象とする核酸には、２−デオキシリボースをもつデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と、リボースをもつリボ核酸（ＲＮＡ）の両方が含まれる。好ましくはＤＮＡである。ここでＤＮＡには、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖という１本鎖のＤＮＡも含まれる。またその長さも特に制限されない。従って、本発明において核酸とは、特に言及しない限り、ゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ(正鎖)並びに当該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ(相補鎖)、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。また核酸の由来も特に制限されず、大腸菌や枯草菌などの原核生物に由来する核酸、酵母などの菌類、昆虫、植物およびヒトを含む動物などの真核生物に由来する核酸のいずれをも対象とすることができる。
本発明で用いるＡｇ＋型ゼオライトとは、ゼオライト中の交換可能な陽イオン（交換性陽イオン）の一部、または全部を銀イオン（Ａｇ＋）で置き換えたものを意味する。Ａｇ＋型ゼオライトの陽イオン交換容量のうちＡｇ＋が占める割合（Ａｇ＋交換率）として、制限されないが、好ましくは５５％以上（５５〜１００％）を挙げることができる。当該Ａｇ＋交換率として、より好ましくは５９％以上（５９〜１００％）、さらに好ましくは７０％以上（７０〜１００％）、特に好ましくは８０％以上（８０〜１００％）である。
また本発明で用いるＡｇ＋型ゼオライトとしては、制限されないが、好ましくは陽イオン交換容量が少なくとも０.８９ｍｅｑ／ｇであるもの、特に０.８９〜７ｍｅｑ／ｇであるものを挙げることができる。より好ましくは陽イオン交換容量が１〜７ｍｅｑ／ｇ、さらに好ましくは２〜７ｍｅｑ／ｇのＡｇ＋型ゼオライトである。
かかる陽イオン交換容量の測定方法は公知であり、例えば非特許文献「天然ゼオライトの簡易塩基交換容量測定法、粘土科学、20巻、p.78-82、1980年」に記載される方法に従って測定することができる。具体的には、一定重量のゼオライト試料をはかり取り、１００倍量の１Ｍ酢酸アンモニウム溶液に浸漬して８０℃で約１６時間保持した後、ゼオライト試料と溶液を遠心操作等によって固液分離し、その後、ゼオライト試料を１Ｍ ＫＣｌ溶液に浸漬して溶出してきたアンモニアを水蒸気蒸留したのち滴定法等によって測定することによって、陽イオン交換容量を求めることができる。
なお、前述するＡｇ＋型ゼオライトのＡｇ＋保持量は、上記陽イオン交換容量の測定法と同様に非特許文献「天然ゼオライトの簡易塩基交換容量測定法、粘土科学、20巻、p.78-82、1980年」に記載される方法に従って測定することができる。具体的には、一定重量のＡｇ＋型ゼオライト試料をはかり取り、１００倍量の１Ｍ硝酸アンモニウム溶液に浸漬して８０℃で約１６時間保持した後、ゼオライト試料と溶液を遠心操作等によって固液分離し、その後溶液中に溶出してきた銀イオン（Ａｇ＋）をフレーム式原子吸光光度法によって求めることができる。当該Ａｇ＋型ゼオライトのＡｇ＋交換率は、Ａｇ＋型ゼオライトの陽イオン交換容量のうちＡｇ＋が占める割合（Ａｇ＋交換率）を計算することによって求めることができる。
さらに本発明で用いるＡｇ＋型ゼオライトは、制限はされないが、好ましくは臭化エチジウム吸着量が少なくとも８.５ｍｇ／ｇであるものである。好ましくは臭化エチジウム吸着量が８.５〜３０ｍｇ／ｇ、より好ましく８.９〜３０ｍｇ／ｇ、特に好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｇのＡｇ＋型ゼオライトである。Ａｇ＋型ゼオライトの臭化エチジウム吸着量は、各ゼオライトの臭化エチジウムに対する吸着等温線をラングミュアの吸着式に当てはめて求めることができる。具体的な測定方法は、実施例２に記載する通りである。なお、吸着等温線が「上に凸にならなかった場合」、当該Ａｇ＋型ゼオライトは、臭化エチジウム吸着用途には使用不適と判断される。
本発明の方法は、塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液から、核酸を単離取得することを特徴とするものであって、
（１）塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液をＡｇ＋型ゼオライトと接触させる工程、および
（２）当該Ａｇ＋型ゼオライトの非吸着画分を採取する工程
を実施することによって行うことができる。
（１）塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液をＡｇ＋型ゼオライトと接触させる工程、および
（２）当該Ａｇ＋型ゼオライトの非吸着画分を採取する工程
を実施することによって行うことができる。
ここでＡｇ＋型ゼオライトは、１種を単独で使用してもよいし、また２種以上を任意に組み合わせて使用することができる。１種を単独で使用する場合、前述する陽イオン交換容量、Ａｇ＋交換率、および臭化エチジウム吸着量が、上記の範囲にあるＡｇ＋型ゼオライトを好適に使用することができる。また２種以上のＡｇ＋型ゼオライトを任意に組み合わせて使用する場合、個々のＡｇ＋型ゼオライトの陽イオン交換容量、Ａｇ＋交換率、および臭化エチジウム吸着量に関わらず、使用する２種以上のＡｇ＋型ゼオライトの陽イオン交換容量、Ａｇ＋交換率、および臭化エチジウム吸着量の総計が上記範囲に含まれていればよい。
本発明において好適に使用されるＡｇ＋型ゼオライトとして、制限はされないものの、好ましくはモルデナイト、クリノプチロライト、フェリエライト、Ａ型ゼオライト、Ｘ型ゼオライト、Ｙ型ゼオライト、およびＭＦＩ型ゼオライトを挙げることができる。これらは１種単独で使用してもよいし、また２種以上を任意に組み合わせて使用することもできる。１種単独または２種以上を組み合わせて使用する場合、好ましいＡｇ＋型ゼオライトとしては、モルデナイト、クリノプチロライト、天然フェリエライト、Ｙ型ゼオライト、およびＭＦＩ型ゼオライトを挙げることができる。また上記Ａ型ゼオライト、Ｘ型ゼオライトおよび合成フェリエライトは、臭化エチジウム吸着量が比較的少ないため、モルデナイト、クリノプチロライト、天然フェリエライト、Ｙ型ゼオライト、およびＭＦＩ型ゼオライトからなる群から選択される少なくとも１種のＡｇ＋型ゼオライトと組み合わせて使用することが好ましい。
なお、これらのＡｇ＋型ゼオライトは、いずれも交換性陽イオンのうち５９％以上が銀イオン（Ａｇ＋）に交換されているゼオライトである。
また本発明の方法が対象とする塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液としては、制限はされないが、塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法によって回収される塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液である。塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法とは、臭化エチジウムが二本鎖ＤＮＡの塩基間にインターカレートする性質を利用し、直鎖状ＤＮＡ（ニックの入ったプラスミドＤＮＡを含む）と閉環状ＤＮＡ（スーパーコイルプラスミドＤＮＡ）とで臭化エチジウムの結合量が違うことから生じる塩化セシウム密度勾配中での浮遊密度の差を利用して、両者を分離する平衡密度勾配法である。塩化セシウム密度勾配中での超遠心により、閉環状ＤＮＡ（スーパーコイルプラスミドＤＮＡ）を、直鎖状ＤＮＡから分離することができる。所望の核酸含有溶液は、ＵＶ光源下で採取することができるが、当該溶液中には塩化セシウムおよび臭化エチジウムが含まれているため、これらを除去して所望の核酸を単離取得する必要がある。本発明の方法は、この目的のために好適に使用することができる。
具体的には、本発明の方法は、塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法によって回収される塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液を、前述するＡｇ＋型ゼオライトと接触状態におく方法であれば特に制限されない。制限はされないが、その例として下記に説明する（１）カラム充填法、および（２）直接添加法を挙げることができる。
（１）カラム充填法
Ａｇ＋型ゼオライトを充填したカラムを用いる方法である。当該方法は、具体的には、Ａｇ＋型ゼオライトを充填したカラムに、塩化セシウムおよび臭化エチジウムを含む核酸含有溶液を通液することによって行うことができる。かかる方法により、当該核酸含有溶液から塩化セシウム（塩化物イオン、セシウム）および臭化エチジウムを同時に効率よく除去して、核酸をほとんどロスすることなく単離回収することができる。
Ａｇ＋型ゼオライトを充填したカラムを用いる方法である。当該方法は、具体的には、Ａｇ＋型ゼオライトを充填したカラムに、塩化セシウムおよび臭化エチジウムを含む核酸含有溶液を通液することによって行うことができる。かかる方法により、当該核酸含有溶液から塩化セシウム（塩化物イオン、セシウム）および臭化エチジウムを同時に効率よく除去して、核酸をほとんどロスすることなく単離回収することができる。
この場合、Ａｇ＋型ゼオライトを充填したカラムは、核酸含有溶液を通液する前にあらかじめ超純水で洗浄して平衡化しておくことが好ましい。かかるカラムに、上記核酸含有溶液を通液すると、塩化セシウム（塩化物イオン、セシウム）および臭化エチジウムがカラム（Ａｇ＋型ゼオライト）に吸着または捕捉され、核酸が非吸着画分として溶出される。溶出された核酸含有溶液は、そのまま使用してもよいし、またさらにフェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿などの精製処理に供してもよい。
（２）直接添加法
かかる方法は、Ａｇ＋型ゼオライトを、塩化セシウムおよび臭化エチジウムを含む核酸含有溶液に直接添加し、穏やかに攪拌することによって行うことができる。この場合、Ａｇ＋型ゼオライトの非吸着画分は、その後、遠心分離して上清を採取するか、濾紙、または樹脂フィルターによって不溶画分をろ過清澄することによって取得することができる。かかる方法により、当該核酸含有溶液から、塩化セシウム（塩化物イオン、セシウム）および臭化エチジウムを同時に効率よく除去して、核酸をほとんどロスすることなく、単離回収することができる。斯くして回収した核酸含有溶液は、そのまま使用してもよいし、またさらにフェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿などの精製処理に供してもよい。
かかる方法は、Ａｇ＋型ゼオライトを、塩化セシウムおよび臭化エチジウムを含む核酸含有溶液に直接添加し、穏やかに攪拌することによって行うことができる。この場合、Ａｇ＋型ゼオライトの非吸着画分は、その後、遠心分離して上清を採取するか、濾紙、または樹脂フィルターによって不溶画分をろ過清澄することによって取得することができる。かかる方法により、当該核酸含有溶液から、塩化セシウム（塩化物イオン、セシウム）および臭化エチジウムを同時に効率よく除去して、核酸をほとんどロスすることなく、単離回収することができる。斯くして回収した核酸含有溶液は、そのまま使用してもよいし、またさらにフェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿などの精製処理に供してもよい。
以下、調製例および実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、特に記載のない限り「部」とは「重量部」を、「％」とは「重量％」を意味するものとする。
調製例１ Ａｇ＋型ゼオライトの調製
下記実施例で使用するＡｇ＋型ゼオライトは、次の方法で調製した。
下記実施例で使用するＡｇ＋型ゼオライトは、次の方法で調製した。
天然ゼオライト（表１）は、粒径が４５μｍ以下となるよう原石を遊星ボールミルにて粉砕し、超純水で十分に洗浄した。合成ゼオライト（表１）は、Ｎａ型のものについてはそのまま、それ以外の交換性陽イオンを保持させたものについては重量比で１００倍量の１Ｍ ＮａＣｌ溶液に浸漬し、８０℃で約１６時間保持してＮａ型とした後、十分に超純水で洗浄した。これらのゼオライト試料を、重量比で１０倍量の１Ｍ硝酸銀溶液に浸漬して８０℃で約１６時間保持した後、超純水で十分に洗浄し、１１０℃で乾燥させた。
（１）陽イオン交換容量の測定
使用したＡｇ＋型ゼオライト（調製前のＡｇ＋型ゼオライト）の陽イオン交換容量を、以下の方法に従って測定した。まず各ゼオライト試料を約０．５ｇはかり取り、これを５０ｍｌの１Ｍ酢酸アンモニウムに浸漬して８０℃で約１６時間保持したのち、遠心操作によってゼオライトと酢酸アンモニウム溶液を分離した。続いて前記ゼオライトを８０％メタノール含有水溶液で洗浄後、１００ｍｌの１Ｍ ＫＣｌ溶液に浸漬して１時間保持した。その後、溶液中に溶出してきたアンモニウムイオンの量を水蒸気蒸留した後に滴定によって求め、陽イオン交換容量を算出した。
使用したＡｇ＋型ゼオライト（調製前のＡｇ＋型ゼオライト）の陽イオン交換容量を、以下の方法に従って測定した。まず各ゼオライト試料を約０．５ｇはかり取り、これを５０ｍｌの１Ｍ酢酸アンモニウムに浸漬して８０℃で約１６時間保持したのち、遠心操作によってゼオライトと酢酸アンモニウム溶液を分離した。続いて前記ゼオライトを８０％メタノール含有水溶液で洗浄後、１００ｍｌの１Ｍ ＫＣｌ溶液に浸漬して１時間保持した。その後、溶液中に溶出してきたアンモニウムイオンの量を水蒸気蒸留した後に滴定によって求め、陽イオン交換容量を算出した。
（２）Ａｇ＋含有量の測定
調製後のＡｇ＋型ゼオライトのＡｇ＋含有量は、以下の方法に従って測定した。まずＡｇ＋型ゼオライトを約０．２ｇはかり取り、これを２０ｍｌの１Ｍ硝酸アンモニウムに浸漬して８０℃で約１６時間保持したのち、遠心操作によってゼオライトと硝酸アンモニウム溶液を分離した。その後、硝酸アンモニウム溶液中に含まれる銀イオン（Ａｇ＋）をフレーム式原子吸光光度法で測定し、Ａｇ＋型ゼオライト中のＡｇ＋含有量を算出した。
調製後のＡｇ＋型ゼオライトのＡｇ＋含有量は、以下の方法に従って測定した。まずＡｇ＋型ゼオライトを約０．２ｇはかり取り、これを２０ｍｌの１Ｍ硝酸アンモニウムに浸漬して８０℃で約１６時間保持したのち、遠心操作によってゼオライトと硝酸アンモニウム溶液を分離した。その後、硝酸アンモニウム溶液中に含まれる銀イオン（Ａｇ＋）をフレーム式原子吸光光度法で測定し、Ａｇ＋型ゼオライト中のＡｇ＋含有量を算出した。
各Ａｇ＋型ゼオライト試料の陽イオン交換容量およびＡｇ＋含有量、ならびにこれらから算出されるＡｇ＋交換率を表１に示す。
実施例１ Ａｇ＋型ゼオライトによる塩化セシウム（ＣｓＣｌ）の除去
ゼオライトの陽イオン交換容量を１ｍｅｑ／ｇとし、これが全てＡｇ＋イオンで交換されていると仮定すると、平衡密度勾配遠心で使用する４．４５Ｍの塩化セシウムを０．２ｍｌ処理しようとする場合、０．８９ｇのＡｇ＋型ゼオライトが必要となる。そこで、実際にＡｇ＋型ゼオライトで高濃度塩化セシウムが除去可能かどうかを検証するため、高濃度塩化セシウムを含有する模擬溶液を用いて、Ａｇ＋型ゼオライトによる塩化セシウム除去実験を行った。
ゼオライトの陽イオン交換容量を１ｍｅｑ／ｇとし、これが全てＡｇ＋イオンで交換されていると仮定すると、平衡密度勾配遠心で使用する４．４５Ｍの塩化セシウムを０．２ｍｌ処理しようとする場合、０．８９ｇのＡｇ＋型ゼオライトが必要となる。そこで、実際にＡｇ＋型ゼオライトで高濃度塩化セシウムが除去可能かどうかを検証するため、高濃度塩化セシウムを含有する模擬溶液を用いて、Ａｇ＋型ゼオライトによる塩化セシウム除去実験を行った。
具体的には、平衡密度勾配遠心に用いる４．４５Ｍ塩化セシウム溶液を作製し、これを０．２ｍｌとって超純水で１０倍に希釈したものに対してＡｇ＋型ゼオライト（天然モルデナイト１（島根県産）（陽イオン交換容量：１．３７ｍｅｑ／ｇ、Ａｇ＋含有量：０．８１ｍｅｑ／ｇ、Ａｇ＋交換率５９．１％）を０〜１．２ｇの割合で加えた時の溶液中のセシウム濃度および塩化物イオン濃度を測定した。なお、セシウム濃度は誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）にて、また塩化物イオン濃度はイオンクロマトグラフで測定した。結果を表２に示す。
表２に示すように、上記試験の結果、Ａｇ＋型ゼオライトを０．８ｇの割合で添加した時点でセシウムおよび塩化物イオンの濃度はほぼゼロとなり、セシウムと塩化物イオンが除去されることがわかった。
またＡｇ＋型ゼオライトとして、上記で使用した天然モルデナイト１（島根県産）に代えて、天然モルデナイト２（島根県産）、天然モルデナイト３（宮城県産）、天然フェリエライト（島根県産）、天然クリノプチロライト１（島根県産）、天然クリノプチロライト２（北海道産）、天然クリノプチロライト３（秋田県産）、合成Ａ型ゼオライト、合成Ｘ型ゼオライト、合成Ｙ型ゼオライト、合成モルデナイト、合成フェリエライト、および合成ＭＦＩ型ゼオライトの各Ａｇ＋型ゼオライト（１ｇ）についても、上記と同様にして、セシウムと塩化物イオンの除去効果を調べた。これらのＡｇ＋型ゼオライトのセシウムと塩化物イオンの除去効果を、１ｇのＡｇ＋型ゼオライトを加えた時の残存セシウム濃度および塩化物イオン濃度としてそれぞれ表３に示す。
これらの結果からわかるように、いずれのＡｇ＋型ゼオライトもセシウムと塩化物イオンをほぼ１００％の割合で除去することが可能であった。
上記塩化セシウムの除去原理は、制限されないが、溶液中のＣｓ＋がＡｇ＋型ゼオライト中のＡｇ＋と交換することによってゼオライト中に除去され、溶出してきたＡｇ＋が溶液中の塩化物イオン（Ｃｌ−）と反応することによって不溶性の塩化銀（ＡｇＣｌ）を生成し、溶液から除去されるものと考えられる。
実施例２ Ａｇ＋型ゼオライトによる臭化エチジウムの除去
Ａｇ＋型ゼオライトによる臭化エチジウム除去性能を評価するため、ラングミュアの吸着理論式を用いてＡｇ＋型ゼオライト（天然モルデナイト１（島根県産））の臭化エチジウム飽和吸着量を求めた。具体的には、ゼオライトを０．１１ｇ、０．１２ｇ、０．１３ｇ、・・・というように０．０１ｇ間隔で０．１１ｇから０．３０ｇまではかり取り、そこに１．２ｍｇ／ｍｌ濃度の臭化エチジウム溶液を３ｍｌ加えて撹拌した。その後、遠心操作によってゼオライトを溶液から分離し、溶液部分の臭化エチジウム濃度を分光光度計で２８５ｎｍの吸光度を測定することにより算出した。このようにして得たデータを、横軸を吸着処理後の残存臭化エチジウム濃度（平衡濃度）、縦軸をゼオライトに吸着された臭化エチジウム量としてプロットし、得られた「等温吸着線」をラングミュアの吸着理論式で近似することによって飽和吸着量を算出した。天然モルデナイト１（島根県産）の等温吸着線を図１に示す。この結果、臭化エチジウム飽和吸着量は２６．７ｍｇ／ｇと算出された（参考文献：「化学セミナー１6 吸着の化学」、近藤精一、石川達雄、安部郁夫 丸善 東京 1991年）。
Ａｇ＋型ゼオライトによる臭化エチジウム除去性能を評価するため、ラングミュアの吸着理論式を用いてＡｇ＋型ゼオライト（天然モルデナイト１（島根県産））の臭化エチジウム飽和吸着量を求めた。具体的には、ゼオライトを０．１１ｇ、０．１２ｇ、０．１３ｇ、・・・というように０．０１ｇ間隔で０．１１ｇから０．３０ｇまではかり取り、そこに１．２ｍｇ／ｍｌ濃度の臭化エチジウム溶液を３ｍｌ加えて撹拌した。その後、遠心操作によってゼオライトを溶液から分離し、溶液部分の臭化エチジウム濃度を分光光度計で２８５ｎｍの吸光度を測定することにより算出した。このようにして得たデータを、横軸を吸着処理後の残存臭化エチジウム濃度（平衡濃度）、縦軸をゼオライトに吸着された臭化エチジウム量としてプロットし、得られた「等温吸着線」をラングミュアの吸着理論式で近似することによって飽和吸着量を算出した。天然モルデナイト１（島根県産）の等温吸着線を図１に示す。この結果、臭化エチジウム飽和吸着量は２６．７ｍｇ／ｇと算出された（参考文献：「化学セミナー１6 吸着の化学」、近藤精一、石川達雄、安部郁夫 丸善 東京 1991年）。
また、平衡密度勾配遠心に用いる臭化エチジウム溶液中に含まれる臭化エチジウム濃度は０．８ｍｇ／ｍｌ、処理量は０．２ｍｌであるので、除去すべき臭化エチジウムの絶対量は０．１６ｍｇとなる。そこで、この臭化エチジウムを１ｇのゼオライトで除去した場合の臭化エチジウム平衡濃度（溶液中に残存する臭化エチジウムの濃度）を図１より求めた。その結果、臭化エチジウム平衡濃度は０．００７６ｍｇ／Ｌとなり、原液の約１／１０００００の濃度にまで除去できることがわかった。
上記天然モルデナイト１（島根県産）に代えて、天然モルデナイト２（島根県産）、天然モルデナイト３（宮城産）、天然フェリエライト（島根県産）、天然クリノプチロライト１（島根県産）、天然クリノプチロライト２（北海道産）、天然クリノプチロライト３（秋田県産）、合成Ａ型ゼオライト、合成Ｘ型ゼオライト、合成Ｙ型ゼオライト、合成モルデナイト、合成フェリエライト、および合成ＭＦＩ型ゼオライトといった表１記載のＡｇ＋型ゼオライトについても、上記と同様にして、等温吸着線、臭化エチジウム飽和吸着量、および吸着処理後の臭化エチジウム平衡濃度を求めた。結果を図２〜１３および表４に示す。なお、この表４で臭化エチジウム飽和吸着量が０ｍｇ／ｇとなっているものは、等温吸着線が「上に凸」とならなかったためにラングミュア式が適用できなかったものである（合成Ａ型ゼオライト、合成Ｘ型ゼオライト、合成フェリエライト）。
実施例３
本発明の目的は精製した核酸（ここではプラスミドＤＮＡ）の回収であるため、用いるゼオライトは核酸を吸着しないものである必要がある。そこで各種の天然ゼオライトおよび合成ゼオライトの核酸吸着能を比較した。具体的には、塩化セシウムと臭化エチジウムの双方が溶液から除去されたと仮定して、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（ストラタジーン社）１μｇと２ｍｇのＡｇ+型ゼオライト（表１参照）を１００μｌの超純水に縣濁し、５分間保持した後、遠心操作によって溶液とゼオライトを分離し、溶液部分のプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋の存在をアガロース電気泳動にて確認した。
本発明の目的は精製した核酸（ここではプラスミドＤＮＡ）の回収であるため、用いるゼオライトは核酸を吸着しないものである必要がある。そこで各種の天然ゼオライトおよび合成ゼオライトの核酸吸着能を比較した。具体的には、塩化セシウムと臭化エチジウムの双方が溶液から除去されたと仮定して、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（ストラタジーン社）１μｇと２ｍｇのＡｇ+型ゼオライト（表１参照）を１００μｌの超純水に縣濁し、５分間保持した後、遠心操作によって溶液とゼオライトを分離し、溶液部分のプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋の存在をアガロース電気泳動にて確認した。
結果を図１４に示す。図１４に示すように、実施例で用いたＡｇ＋型ゼオライト全てにおいて、核酸（ＤＮＡ）の非特異的な吸着がないことが確認された。
以上の実施例１〜３の結果から、モルデナイト、クリノプチロライト、フェリエライトから選択される天然ゼオライト、ならびにモルデナイト、Ｙ型ゼオライト、ＭＦＩ型ゼオライトから選択される合成ゼオライトによれば、これらは単独で用いても塩化セシウムおよび臭化エチジウムを効率よく除去しながら、ＤＮＡを、特異的または非特異的吸着によるロスなく単離回収することができることが判明した。また、Ａ型ゼオライト、Ｘ型ゼオライト、およびフェリエライトから選択される合成ゼオライトの場合でも、これらを臭化エチジウム吸着能を持つ上記ゼオライトと組み合わせることによって同様の効果を得ることが可能である。
実施例４
実施例２に示される臭化エチジウム吸着性のない合成Ａ型ゼオライト、合成Ｘ型ゼオライト、合成フェリエライトは、陽イオン交換容量が大きくＡｇ＋供給源としては優れている。そこで、これらのゼオライトを、臭化エチジウム吸着性には優れるが陽イオン交換容量またはＡｇ＋交換率が低いためにＡｇ＋供給量が少ない他のゼオライトと組み合わせることによって、塩化セシウム、臭化エチジウムの双方をより少ないゼオライト量で効率よく除去することが可能となる。以下は、Ａｇ＋型天然モルデナイトによる塩化セシウム、臭化エチジウム除去実験において、Ａｇ＋型合成Ａ型ゼオライト、Ａｇ＋型合成Ｘ型ゼオライト、Ａｇ＋型合成フェリエライトを同時に添加した時の塩化セシウムおよび臭化エチジウム除去効果について検証したものである。
実施例２に示される臭化エチジウム吸着性のない合成Ａ型ゼオライト、合成Ｘ型ゼオライト、合成フェリエライトは、陽イオン交換容量が大きくＡｇ＋供給源としては優れている。そこで、これらのゼオライトを、臭化エチジウム吸着性には優れるが陽イオン交換容量またはＡｇ＋交換率が低いためにＡｇ＋供給量が少ない他のゼオライトと組み合わせることによって、塩化セシウム、臭化エチジウムの双方をより少ないゼオライト量で効率よく除去することが可能となる。以下は、Ａｇ＋型天然モルデナイトによる塩化セシウム、臭化エチジウム除去実験において、Ａｇ＋型合成Ａ型ゼオライト、Ａｇ＋型合成Ｘ型ゼオライト、Ａｇ＋型合成フェリエライトを同時に添加した時の塩化セシウムおよび臭化エチジウム除去効果について検証したものである。
平衡密度勾配遠心に用いる４．４５Ｍ塩化セシウムと０．８ｍｇ／ｇ臭化エチジウムの混合溶液を作製し、これを０．２ｍｌとって超純水で１０倍に希釈したものに対して、表１記載のＡｇ＋型天然モルデナイト１（島根県産）を０から０．８ｇの割合で加え、よく撹拌した後に遠心操作によってゼオライトと溶液とを分離し、溶液中のセシウム濃度、塩化物イオン濃度および臭化エチジウム濃度を測定した。次に、上記Ａｇ＋型天然モルデナイト１（島根県産）添加時に表１記載のＡｇ＋型合成Ａ型ゼオライト、Ａｇ＋型合成Ｘ型ゼオライト、Ａｇ＋型合成フェリエライトをそれぞれ０．１ｇ同時に添加し、同様に測定した。なお、セシウム濃度は誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）にて、塩化物イオン濃度はイオンクロマトグラフにて、臭化エチジウム濃度は分光光度計で２８５ｎｍの吸光度を測定することで算出した。結果について、セシウムの除去効果を図１５に、塩化物イオンの除去効果を図１６に、臭化エチジウムの除去効果を図１７に示す。セシウム、塩化物イオンの除去効果は、Ａｇ＋型合成Ａ型ゼオライト、Ａｇ＋型合成Ｘ型ゼオライトまたはＡｇ＋型合成フェリエライトの添加によって大きくなっており、Ａｇ＋型合成Ａ型ゼオライト、Ａｇ＋型合成Ｘ型ゼオライトの添加の場合、塩化セシウムの除去に必要なゼオライトの総量が０．８ｇから０．６ｇへ、Ａｇ＋型合成フェリエライトの添加の場合、０．８ｇから０．７ｇへ減少していることがわかる（天然モルデナイト添加量＋０．１ｇ）。
また、臭化エチジウム除去効果については、天然モルデナイト１（島根県産）のみの場合とＡｇ＋型合成Ａ型ゼオライト、Ａｇ＋型合成Ｘ型ゼオライト、Ａｇ＋型合成フェリエライトを添加した場合で差はなく、十分除去されていることがわかる。以上のことから、Ａｇ＋供給量の少ない他のＡｇ＋型ゼオライトに、Ａｇ＋型合成Ａ型ゼオライト、Ａｇ＋型合成Ｘ型ゼオライト、またはＡｇ＋型合成フェリエライトを少量添加することは、塩化セシウムおよび臭化エチジウムの除去に必要なゼオライトの総量を減少させることができ、この意味で効果的であることが示された。
処理すべき塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法によって回収される塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液は、４．４５Ｍ塩化セシウム、０．８ｍｇ／ｇ臭化エチジウムである。処理量は１回当たり０．２ｍｌ程度なので、これを１ｇのゼオライトで処理しようとする場合、陽イオン交換容量０．８９ｍｅｑ／ｇ、臭化エチジウム吸着量０．１６ｍｇ／ｇの性能が必要となる。これを満たすゼオライトは、天然ゼオライトは上記７種全て（モルデナイト、クリノプチロライト、フェリエライト）、合成ゼオライトではＹ型ゼオライト、モルデナイト、およびＭＦＩ型ゼオライトの３種である。さらに、この中で核酸吸着性のないゼオライトは、天然ゼオライト（モルデナイト、クリノプチロライト、フェリエライト）は全て、合成ゼオライトではＡ型ゼオライト、Ｘ型ゼオライト、Ｙ型ゼオライト、モルデナイト、フェリエライト、ＭＦＩ型ゼオライトの６種である。
Claims (6)
- 塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液から核酸を単離取得する方法であって、
(１)塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液を、１種または２種以上のＡｇ＋型ゼオライトと接触させる工程、および
(２) Ａｇ＋型ゼオライトの非吸着画分を採取回収する工程
を有する、上記方法。 - 上記で使用するＡｇ＋型ゼオライトが、陽イオン交換容量が総計で少なくとも０.８９ｍｅｑ／ｇ、交換性陽イオンのうちＡｇ＋交換率が総計で少なくとも５５％、および臭化エチジウム吸着量が総計で少なくとも８.５ｍｇ／ｇであることを特徴とするものである、請求項１に記載する方法。
- 上記Ａｇ＋型ゼオライトが、モルデナイト、クリノプチロライト、フェリエライト、Ａ型ゼオライト、Ｘ型ゼオライト、Ｙ型ゼオライト、およびＭＦＩ型ゼオライトからなる群から選択される少なくとも１種のゼオライトである、請求項１または２に記載する方法。
- 上記Ａｇ＋型ゼオライトが、モルデナイト、クリノプチロライト、天然フェリエライト、Ｙ型ゼオライト、および合成ＭＦＩ型ゼオライトからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１または２に記載する方法。
- 上記Ａｇ＋型ゼオライトが、モルデナイト、クリノプチロライト、天然フェリエライト、Ｙ型ゼオライト、および合成ＭＦＩ型ゼオライトからなる群から選択される少なくとも１種と、Ａ型ゼオライト、Ｘ型ゼオライト、および合成フェリエライトからなる群から選択される少なくとも１種との混合物である、請求項１または２に記載する方法。
- 塩化セシウム、臭化エチジウムおよび核酸を含有する溶液が、塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法で分離回収された核酸溶液である、請求項１乃至５のいずれかに記載する方法。
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|---|---|---|---|---|
| WO2023095704A1 (ja) * | 2021-11-25 | 2023-06-01 | 富士フイルム株式会社 | 核酸検査方法および検査キット |
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2007
- 2007-10-02 JP JP2007258865A patent/JP2009082105A/ja active Pending
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