JP2010029068A - 内部標準ｄｎａの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ＰＣＲ反応の確認をハイブリダイゼーション法により確認するのに好適に用いられる内部標準ＤＮＡの製造方法の提供。とくに、目的ＤＮＡ用プライマーで増幅でき、かつ目的ＤＮＡ用プローブにハイブリダイズしない内部標準ＤＮＡの効率的な製造方法の提供。
【解決手段】検出対象菌由来の目的ＤＮＡを増幅するＰＣＲ反応の反応溶液に添加され、前記目的ＤＮＡを増幅する目的ＤＮＡ用プライマーによって増幅される内部標準ＤＮＡの製造方法であって、所定の条件を満たす内部標準候補ＤＮＡをデータベース検索により選択し、該内部標準候補ＤＮＡの５’末端領域及び３’末端領域の配列を、置換プライマーを用いたＰＣＲ法により、それぞれ前記目的ＤＮＡ用プライマーの順方向プライマー２１配列及び逆方向プライマー２２の相補的配列と同じ配列にすることを特徴とする内部標準ＤＮＡの製造方法。
【選択図】図３

Description

本発明はいわゆる内部標準ＤＮＡの製造方法に関するものである。

ＤＮＡの増幅手段として広くＰＣＲ法が利用されており、ＰＣＲ反応が確実に行われていることを確認するために反応溶液中に内部標準を添加する手法が知られている。例えば、ＰＣＲの反応溶液に内部標準ＤＮＡ及びそれを増幅するプライマーを添加しておき、ＰＣＲ反応後に内部標準ＤＮＡの増幅を確認することで、ＰＣＲ反応が正しく行われたことを確認することができる。内部標準ＤＮＡの増幅の確認は、例えば、増幅産物について電気泳動法を行い、所定の位置に内部標準ＤＮＡを示すバンドを確認することにより行われる。または、例えば、内部標準ＤＮＡとハイブリダイズする内部標準用プローブを配置したＤＮＡマイクロアレイを用い、内部標準ＤＮＡとプローブとのハイブリダイゼーションを蛍光で確認することにより行われる。

上記のように、内部標準ＤＮＡはＰＣＲ反応に供せられる溶液に添加され、反応が適当に行われたことを確認するためのポジティブコントロールとして用いられる。具体的には、感染症の原因菌を特定するために、検体（例えば尿や血液）から調製されたＤＮＡ溶液について、原因菌の１６ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡを増幅するプライマーを用いてＰＣＲ反応を行う。この際、内部標準ＤＮＡと内部標準用プライマー（内部標準ＤＮＡを特異的に増幅させるプライマー）を加えておき、ＰＣＲ反応を行う。そして、ＰＣＲ反応後の溶液について、内部標準用プローブ（内部標準ＤＮＡに特異的に結合するプローブ）を固定したＤＮＡマイクロアレイを用いてハイブリダイゼーション反応を行うと、適当にＰＣＲ反応が行われていれば、内部標準ＤＮＡと内部標準用プローブが反応し、蛍光を発する。したがって、たとえ原因菌の判定がネガティブでも、ＰＣＲ反応は正しく行われていたことを確認できる。

感染症の原因菌特定のためのＤＮＡマイクロアレイとして、感染症起炎菌検出用ＤＮＡマイクロアレイが、例えば特許文献１に開示されている。このＤＮＡマイクロアレイは、原因菌を検出するために、原因菌の１６ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡに特異的に結合する塩基配列を持つプローブと内部標準用プローブとを基盤に固定したものである。各原因菌をターゲットとするプローブは、例えば１６ｓ ｒＲＮＡをコーディングしているゲノム部分より設計され、当該原因菌に対し非常に特異性が高く、十分なハイブリダイゼーション感度が期待できるように設計されている。

また、内部標準ＤＮＡは、ポジティブコントロールとしてだけでなく、未知試料に含まれる目的の塩基配列を有するＤＮＡを調べるためにも用いられる。例えば、患者等から採取された検体に、既知量の内部標準ＤＮＡを添加し、目的ＤＮＡの増幅反応と同時に内部標準ＤＮＡも増幅して、この内部標準ＤＮＡの増幅率から目的ＤＮＡの増幅率を推定する手法などが挙げられる。添加する内部標準ＤＮＡとして目的ＤＮＡのサイズに近いものを選択すれば、目的ＤＮＡの濃度を定量することも可能である。特に、内部標準ＤＮＡを段階的に希釈してＰＣＲ反応を行うことにより、より正確に定量することができる。また、増幅産物中の濃度比較は、電気泳動によりバンドの濃さを比較しても行うことができるが、ＤＮＡマイクロアレイを用いて蛍光発色を比較する方が多数のサンプルを一括に測定できるため好ましいと考えられる。

しかし、ＰＣＲ法による内部標準ＤＮＡを用いた目的ＤＮＡの定量分析方法においては、目的ＤＮＡと内部標準ＤＮＡの増幅効率の違いや不確定性により、定量性や再現性の信頼性が低くなる場合がある。つまり、内部標準ＤＮＡを増幅するためには内部標準用プライマーが反応溶液中に添加されるが、それらのハイブリダイゼーション効率と、目的ＤＮＡと目的ＤＮＡ用プライマーとのハイブリダイゼーション効率が異なるため、内部標準ＤＮＡと目的ＤＮＡの増幅効率に差異が生じてしまい、正確な定量に影響を来たす理由となる。ＰＣＲ反応は指数的に増幅反応が進むため、それぞれのハイブリダイゼーション効率の差が僅かな場合であっても、定量誤差は大きくなってしまう。

その定量誤差を少なくするために、特許文献２では、内部標準ＤＮＡの５’末端及び３’末端を目的ＤＮＡの塩基配列と共通の配列とすることで、目的ＤＮＡ用プライマーを用いて内部標準ＤＮＡを増幅できるようにしている。また、このように内部標準ＤＮＡを設計することで、ハイブリダイゼーション効率の差を少なくすることができる。さらに、内部標準用プライマーを添加する必要がなくなる。

特開２００４−３１３１８１号公報 特許第３３３１１７８号明細書

以上のように、内部標準ＤＮＡを用いて目的ＤＮＡを定量する場合、内部標準ＤＮＡの５’末端及び３’末端を目的ＤＮＡの塩基配列と共通の配列とし、目的ＤＮＡ用プライマーを用いて増幅できるように内部標準ＤＮＡを設計することが望ましい。しかし、特許文献２では、特定の目的ＤＮＡの定量に用いる特定の内部標準ＤＮＡのみ開示されているにすぎず、また、とくに内部標準ＤＮＡの製造方法は述べられていない。また、ＤＮＡマイクロアレイを用いてハイブリダイゼーション法により確認や定量を行う場合に有用な内部標準ＤＮＡについては記載がない。

したがって、本発明の目的は、ＰＣＲ反応の確認をハイブリダイゼーション法により確認するのに好適に用いられる内部標準ＤＮＡの製造方法を提供することである。とくに、目的ＤＮＡ用プライマーで増幅でき、かつ目的ＤＮＡ用プローブにハイブリダイズしない内部標準ＤＮＡの効率的な製造方法を提供することを目的とする。

本発明に係る内部標準ＤＮＡの製造方法は、
検出対象菌由来の目的ＤＮＡを増幅するＰＣＲ反応の反応溶液に添加され、前記目的ＤＮＡを増幅する目的ＤＮＡ用プライマーによって増幅される内部標準ＤＮＡの製造方法であって、
下記条件を満たす内部標準候補ＤＮＡをデータベース検索により選択し、
該内部標準候補ＤＮＡの５’末端領域及び３’末端領域の配列を、置換プライマーを用いたＰＣＲ法により、それぞれ前記目的ＤＮＡ用プライマーの順方向プライマー配列及び逆方向プライマーの相補的配列と同じ配列にすることを特徴とする。
条件（Ａ）；前記順方向プライマーと所定の相同性を有する領域（以下、条件Ａの領域と略す）を一部に有する配列。
条件（Ｂ）；前記逆方向プライマーの相補的配列と所定の相同性を有する領域（以下、条件Ｂの領域と略す）を一部に有する配列。
条件（Ｃ）；前記条件Ａの領域は５'末端側にあり、前記条件Ｂの領域は３'末端側にある配列。
条件（Ｄ）；前記条件Ａの領域と前記条件Ｂの領域の間の配列は、前記目的ＤＮＡの塩基数と同程度であり、前記検出対象菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列と相同性が低い。

本発明によれば、ＰＣＲ反応の確認をハイブリダイゼーション法により確認するのに好適に用いられる内部標準ＤＮＡを容易に製造することができる。

本明細書において、目的ＤＮＡとは、ＰＣＲ反応によって増幅の対象となるＤＮＡのことであり、検出対象の菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ中の１領域の配列を有するＤＮＡである。また、目的ＤＮＡ用プライマーとは、その目的ＤＮＡを増幅するのに用いるプライマーのことである。以下の説明は、特に限定することを意図したものではないが、例えば、微生物や細菌の検出は、その菌を含む被検試料（尿や血液）から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、その菌に特異的な配列から設計したプライマー（目的ＤＮＡ用プライマー）を用い、ＰＣＲ反応により目的ＤＮＡを増幅することで行われる。具体的には、例えば、感染症起炎菌の検出は、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡからその起炎菌に特異的なプライマーを設計し、患者などから採取した被検試料（例えば尿や血液）に含まれるＤＮＡを基にＰＣＲ反応を行い、目的ＤＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡの一部）の増幅を確認することにより行われる。検出対象とする菌が複数種の場合は、それらの菌の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を基にして、その菌すべてに特異的なプライマーを作製する。

上述のように、一般的に、その起炎菌に特異的なプライマーは、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ部分から設計される。図１に、例えば起炎菌から抽出したＤＮＡ中の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ（１１）と、目的ＤＮＡ用プライマーによって増幅されるＤＮＡ（目的ＤＮＡ）（１２）の位置関係を表す概略図を示す。また、図２において、目的ＤＮＡ（１２）を増幅する目的ＤＮＡ用プライマー（２１、２２）を示す。目的ＤＮＡ用プライマーのうち、順方向にＤＮＡ合成を進めるプライマーが順方向プライマー（２１）であり、逆方向にＤＮＡ合成を進めるプライマーが逆方向プライマー（２２）である。また、図３にＰＣＲ反応の増幅対象となる目的ＤＮＡを示す。本明細書では、目的ＤＮＡのうち、順方向プライマー（２１）が結合する部分に相当する目的ＤＮＡ部分を目的ＤＮＡの５’末端領域（３１）といい、逆方向プライマー（２２）が結合する部分に相当する目的ＤＮＡ部分を目的ＤＮＡの３’末端領域（３３）という。また、目的ＤＮＡの５’末端領域（３１）と目的ＤＮＡの３’末端領域（３３）の間の目的ＤＮＡ部分を目的ＤＮＡの中央領域（３２）という。

目的ＤＮＡを有するＤＮＡは、特に限定されるものではないが、例えば、血液などの生体試料から適切な方法で抽出することにより調製することができる。目的ＤＮＡの増幅の有無は、特に限定されるものではないが、例えば目的ＤＮＡに特異的に結合する目的ＤＮＡ用プローブが固定化されたＤＮＡマイクロアレイを用い、ハイブリダイゼーション反応で陽性の標識シグナルを示すか否かにより確認される。

次に、本発明に係る製造方法により作製される内部標準ＤＮＡについて説明する。

図４は、本発明により製造される内部標準ＤＮＡを示す概念図である。図４（ａ）において、（４１）は内部標準ＤＮＡの５’末端領域であり、（４２）は３’末端領域である。５’末端領域と３’末端領域の間の領域を中央領域（４３）と称す。また、５’末端領域は、目的ＤＮＡ用プライマーのうち順方向プライマーが付着する部分に相当する領域であり、３’末端領域は逆方向プライマーが付着する部分に相当する領域である。ここで、内部標準ＤＮＡの５’末端領域の配列は、順方向プライマー配列と同じ配列であり、内部標準ＤＮＡの３’末端領域の配列は、逆方向プライマーの相補的配列と同じ配列である。このため、内部標準ＤＮＡは、前記順方向プライマーと前記逆方向プライマーにより増幅される。つまり、この内部標準ＤＮＡは、目的ＤＮＡ用プライマーと用いてＰＣＲ反応により目的ＤＮＡを増幅する際に、同時に増幅される。また、内部標準ＤＮＡは、検出対象菌の１６ｓ ｒＲＮＡ配列との相同性が低い配列となっている。また、内部標準ＤＮＡの配列の長さは、目的ＤＮＡの長さと近いほど良い。

上記特徴を持つ内部標準ＤＮＡは、ＰＣＲ法の実施時に、目的ＤＮＡ用プライマーで増幅することができ、ＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーション反応時に、原因菌検出用のプローブと反応することなく、内部標準ＤＮＡ検出プローブで検出することができる。上記内部標準ＤＮＡ検出プローブの輝度を測定することで、ＰＣＲの増幅検定を行うことが可能となる。また、内部標準ＤＮＡ検出プローブの測定輝度と原因菌検出用プローブ輝度を比較することで、定量性を向上させることが可能となる。このように内部標準ＤＮＡを設計することで、目的ＤＮＡ用プライマーで内部標準ＤＮＡを増幅することができ、かつ、ハイブリダイゼーション反応の際にも内部標準ＤＮＡが目的ＤＮＡ用プローブと結合することがない。

ここで、本発明に係る内部標準ＤＮＡの製造方法は、
検出対象菌由来の目的ＤＮＡを増幅するＰＣＲ反応の反応溶液に添加され、前記目的ＤＮＡを増幅する目的ＤＮＡ用プライマーによって増幅される内部標準ＤＮＡの製造方法であって、
下記条件を満たす内部標準候補ＤＮＡをデータベース検索により選択し、
該内部標準候補ＤＮＡの５’末端領域及び３’末端領域の配列を、置換プライマーを用いたＰＣＲ法により、それぞれ前記目的ＤＮＡ用プライマーの順方向プライマー配列及び逆方向プライマーの相補的配列と同じ配列にすることを特徴とする。
条件（Ａ）；前記順方向プライマーと所定の相同性を有する領域（以下、条件Ａの領域と略す）を一部に有する配列。
条件（Ｂ）；前記逆方向プライマーの相補的配列と所定の相同性を有する領域（以下、条件Ｂの領域と略す）を一部に有する配列。
条件（Ｃ）；前記条件Ａの領域は５'末端側にあり、前記条件Ｂの領域は３'末端側にある配列。
条件（Ｄ）；前記条件Ａの領域と前記条件Ｂの領域の間の配列は、前記目的ＤＮＡの塩基数と同程度であり、前記検出対象菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列と相同性が低い。

以下、本発明に係る内部標準ＤＮＡの製造方法について説明する。

図５は、本発明に係る製造方法による内部標準ＤＮＡの製造手順を示すフローチャートである。本発明に係る内部標準ＤＮＡの製造方法は、主に、内部標準ＤＮＡの鋳型になる内部標準候補ＤＮＡを選択する工程と、選択した内部標準候補ＤＮＡのミスマッチ部位をＰＣＲ法により置換する工程とに分けられる。以下、内部標準候補ＤＮＡの選択とミスマッチ部位の配列置換工程について詳細に説明する。

（内部標準候補ＤＮＡの選択）
遺伝子配列の解析は一部で進められており、これらの既に解析された遺伝子配列の情報はデータベースに登録されて、共通に利用可能なように提供されている。一般の研究者はこのようなデータベースにアクセスすることにより遺伝子配列の情報が利用できる。このような遺伝子配列のデータベースとしては、特に限定されるものではないが、例えば、米国におけるＧｅｎＢａｎｋ、欧州におけるＥＭＢＬ、日本国における国立遺伝学研究所などの遺伝子データベースがある。

本発明では、まず、データベース検索により内部標準候補ＤＮＡを選択し、選択した内部標準候補ＤＮＡに変異を導入して、目的ＤＮＡ用プライマーで増幅可能な内部標準ＤＮＡを作製する。この内部標準候補ＤＮＡは、以下の配列を検索することにより行う。
・条件（Ａ）；順方向プライマーと所定の相同性を有する領域（以下、条件Ａの領域と略す）を一部に有する配列。
・条件（Ｂ）；逆方向プライマーの相補鎖と所定の相同性を有する領域（以下、条件Ｂの領域と略す）を一部に有する配列。
・条件（Ｃ）；条件Ａの領域は５'末端側であり、条件Ｂの領域は３'末端側である。
・条件（Ｄ）；条件Ａの領域と条件Ｂの領域の間の配列は、目的ＤＮＡの塩基数と同程度であり、検出対象の菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列と相同性が低い。

このような内部標準候補ＤＮＡの選択は、例えば以下の方法で行うことができる。なお、以下の選択方法は例であり、上記条件（Ａ）〜（Ｄ）を満たす配列データを選択する方法を以下の選択方法に限定するものではない。

まず、所定の検索を実行するたびに、ユーザーは、データベースを一つ選択し、検索するファイルを選択し、相同性などのスコア等の各種パラメータを指定する。検索するファイルとしては、複数の生物種の遺伝子情報を選択してもよいし、一種類の生物種の遺伝子情報を選択してもよい。

次に、選択したデータファイルを用いて、順方向プライマーと所定の相同性を有する配列を一部に有する配列データを検索する。これにより、順方向プライマーと相同性を有する配列を検索することが可能となる。ここで、相同性のスコアとしては、５０％以上に設定することが好ましく、７０％以上に設定することがより好ましく、８０％以上に設定することがさらに好ましい。そして、この順方向プライマーの検索においてヒットした配列を有するＤＮＡ情報を選択する（ＤＮＡ情報（１））。

次に、ＤＮＡ情報（１）を用いて、逆方向プライマーの相補鎖と相同性を有する領域を一部に有する配列データを検索する。これにより、逆方向プライマーの相補的配列と相同性を有する配列を検索することが可能となる。ここで、相同性のスコアとしては、５０％以上に設定することが好ましく、７０％以上に設定することがより好ましく、８０％以上に設定することがさらに好ましい。そして、この逆方向プライマーの検索においてヒットした配列を有するＤＮＡ情報を選択する（ＤＮＡ情報（２））。

次に、ＤＮＡ情報（２）において、条件Ａの領域が５'末端側にあり、条件Ｂの領域が３'末端側にある配列データを選択する。また、さらに、条件Ａの領域から条件Ｂまでの塩基数が目的ＤＮＡの塩基数と同程度の配列データを選択する（それらの配列データの情報をＤＮＡ情報（３）とする）。同程度とは、特に限定されるものではないが、それらの差が５０塩基以下であることが好ましく、２０塩基以下であることがより好ましく、１０塩基以下であることがさらに好ましい。

次に、ＤＮＡ方法（３）において、条件Ａの領域と条件Ｂの領域の間の配列が、検出対象菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列と相同性が低いものを選択し、内部標準候補ＤＮＡとする。例えば、相同性のスコアとしては、５０％以下が好ましく、２０％以下がより好ましく、１０％以下がさらに好ましい。なお、検出対象菌が複数種の場合、「検出対象菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列」は、検出対象菌全ての１６Ｓ ｒＲＮＡ配列に相同性が高い配列である。該「検出対象菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列」は、検出対象菌全ての１６Ｓ ｒＲＮＡ配列に８０％以上の相同性を有することが好ましく、より好ましくは９０％以上である。

なお、検索の順序は特に制限されるものではない。

また、内部標準候補ＤＮＡとしては、ミスマッチ部位の塩基数の少ない上位のものを選択することが好ましい。このときの選択条件として、ミスマッチ部位の塩基数が少なければ少ないほど良い。後述の配列置換工程でミスマッチ部位を正しい配列に置換するが、置換工程を減らすためには、選択基準として、対応する順方向・逆方向プライマーの合計塩基数の５０％以上の相同性を確保していることが望ましい。また、５’末端側と３’末端側のミスマッチ数の差が、５塩基以下であることが好ましい。

また、選択する内部標準ＤＮＡのＴｍ値は、目的用ＤＮＡのＴｍ値と同程度であることが好ましい。具体的には、それらのＴｍ値の差は、５℃以下が好ましく、３℃以下がより好ましい。

また、内部標準ＤＮＡはＰＣＲ溶液に添加されるものであるが、ＰＣＲ反応後にハイブリダイゼーション法で目的用ＤＮＡを検出する場合は、内部標準ＤＮＡが目的ＤＮＡ用プローブと反応しないことが必要である。このような内部標準ＤＮＡを作製する場合、選択すべき内部標準候補ＤＮＡとしては、条件Ａの領域と条件Ｂの領域の間の配列が目的ＤＮＡ用プローブとハイブリダイズする配列を有しない必要がある。したがって、前記条件（Ａ）〜（Ｄ）に加えて、条件（Ｅ）；条件Ａの領域と条件Ｂの領域の間に、目的ＤＮＡ用プローブとハイブリダイズする配列を有しない配列、を加えることが好ましい。ハイブリダイズする配列を有しないことを確認するためには、例えば、目的ＤＮＡ用プローブの配列が、内部標準候補ＤＮＡの配列中に存在しないこと、及び目的用プローブの配列において１または数塩基置換させた配列が存在しないことをＤＮＡデータで確認すればよい。また、その際、データ上に表される配列との相補鎖にハイブリダイズしないことも確認すればよい。具体的には、目的用プローブが２０塩基のオリゴヌクレオチドである場合、この配列と、内部標準候補ＤＮＡの配列とが、８５％以下の相同性を有すると、３塩基以上の違いがあるため、互いにミスマッチ配列となりハイブリダイズしない。相同性の条件は、ハイブリダイゼーション反応の条件に基づいて決定することができる。
なお、「目的ＤＮＡ用プローブ」とは、検出対象菌のＤＮＡに特異的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを含むプローブである。前記目的ＤＮＡ用プローブの長さとしては、例えば、１０〜２００ヌクレオチドのものが用いられ、２０〜１００ヌクレオチドが好ましく、より好ましくは４０〜８０ヌクレオチドが用いられる。また、目的ＤＮＡ用プローブは、１つのみの場合もあるし、複数用いられる場合がある。複数用いられる場合は、その全ての目的ＤＮＡ用プローブにハイブリダイズしないような内部標準候補ＤＮＡを選択する。

（ミスマッチ部位の配列置換工程）
次に、選択した内部標準候補ＤＮＡを有する生物種からＤＮＡを抽出する。ＤＮＡの抽出は従来公知の方法で行うことができ、特に限定されるものではない。

次に、目的ＤＮＡ用プライマーと内部標準候補ＤＮＡとのミスマッチ部位を置換プライマーを用いたＰＣＲ反応を用いて正しい塩基に置換する。

図６に示すように、複数箇所のミスマッチ部位が存在する場合、まず一つ目の領域を置換する第１の置換プライマーによってＰＣＲ増幅を行い、内部標準候補ＤＮＡのミスマッチ部位を第１のプライマーと相補配列に変換する。同様に、前記置換処理で得られた配列を二つ目の領域を置換する第２の置換プライマーによってＰＣＲ増幅を行い、ミスマッチ部位を第２のプライマーと相補配列に変換する。これらの処理をミスマッチ部位がなくなるまで繰り返すことによって、内部標準候補ＤＮＡのすべてのミスマッチ部位が解消され、目的ＤＮＡ用プライマーと相補配列を持つ内部標準ＤＮＡが得られる。

（実施形態１）
以下、本発明の実施形態について説明するが、特に以下の実施形態に制限されるものではない。

「内部標準候補ＤＮＡの選択」
まず、内部標準候補ＤＮＡの選択について説明する。

例えば、図５に示すように、大量の塩基配列が登録された配列データベースを用いて、順方向プライマーと相同性を有する配列を一部に有する配列を検索する（５０１）。また、例えば、上記相同性検索のプログラムにはＳＳＥＡＲＣＨ、上記配列データベースとしてＮＣＢＩからシロイヌナズナのミトコンドリアに関するデータセット（”Ａ ｔｈａｌｉａｎａ”，“ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ”で検索）を抽出したデータセット用いることができる。上記相同性検索の結果リストは、内部標準候補ＤＮＡの選択時の条件として用いる。

次に、上記配列データベースに対して、逆方向プライマーの相補鎖と相同性を有する配列を一部に有する配列を検索する（５０２）。この相同性検索結果リストも同様に、内部標準候補ＤＮＡの選択時の条件として用いる。

次に、検出対象となる原因菌全ての１６ｓ ｒＲＮＡ配列と比較して相同性の高い配列を使って、上記配列データベースの条件Ａの領域と条件Ｂの領域の間の配列に対して相同性を調べる（５０３）。

次に、内部標準候補ＤＮＡの選択を行う（５０４）。ここで、５０１、５０２、５０３の結果リストを用いて、以下の条件をすべて満たす候補ＤＮＡを選択する。

（１）５’末端側に順方向プライマーと相同性が高い領域を有する。
（２）３’末端側に逆方向プライマーと相同性が高い領域を有する。
（３）検出対象菌の１６ｓ ｒＲＮＡと、条件Ａの領域と条件Ｂの領域の間の配列との相同性が低い。
（４）条件Ａの領域と条件Ｂの領域の間の塩基数と、目的ＤＮＡとの塩基数との差が５０塩基以内である。

上記（１）（２）の条件は５０１、５０２の相同性検索の結果リストから、ミスマッチ部位の塩基数の少ない上位のものを選択する。このときの選択条件として、ミスマッチ塩基数が少なければ少ないほど良い。後に示す処理でミスマッチ配列を正しい配列に置換できるが、配列の置換工程を減らすためには、（１）及び（２）の両者の配列の選択基準として、対応する順方向・逆方向プライマーの合計塩基数の５０％以上の相同性を確保していることが望ましい。上記（３）の条件は、３０３の相同性検索の結果リストにあがらなかった（ＳＳＥＡＲＣＨ検索でヒットしなかった）ものを選択する。順方向・逆方向のプライマーに挟まれた中央領域の配列の長さ・Ｔｍ値と１６ｓ ｒＲＮＡ配列の長さ・Ｔｍ値が同程度であればなお良い。上記（１）〜（４）すべての条件を満たす配列が、内部標準候補ＤＮＡとなる。

上記条件を用い、内部標準候補ＤＮＡとして選択されたＤＮＡデータ（Ｘ９８３０１とする）と、順方向・逆方向プライマーのアライメントの状況を図７に示す。

「配列置換工程」
次に、内部標準候補ＤＮＡのミスマッチ部位の配列置換処理について、具体的な手順を示す。まず、内部標準候補ＤＮＡのミスマッチの１領域を置換するプライマーを設計する（５０５）（図５参照）。ミスマッチ領域１箇所のみを１６ｓ ｒＲＮＡのプライマー配列と同じものにし、それ以外のミスマッチ領域は内部標準候補ＤＮＡと同じ配列にしておく。ＰＣＲ増幅の成功率を考慮して、１度に置換するミスマッチ領域の長さは２塩基以下に抑えることが望ましい。次に、上記プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、１領域の配列を置換した内部標準候補ＤＮＡを得る（５０６）。上記５０５、５０６の処理をミスマッチ領域が無くなるまで繰り返す（５０７）。以上の処理を行うことで、内部標準ＤＮＡが完成する（５０８）。

図８は、Ｘ９８３０１の順方向プライマーの領域について、ミスマッチ領域の配列置換処理を行った例である。ミスマッチ領域を１領域ずつ置換するプライマーを設計して、４回のＰＣＲ増幅によって１６ｓ ｒＲＮＡ増幅プライマーと同じ配列を持つ内部標準ＤＮＡに置換している。

図１５はＤＮＡデータＸ９８３０１を基に、上記内部標準ＤＮＡの製造方法によって作製した内部標準ＤＮＡ配列である。Ｘ９８３０１の１０３１番目から２７３９番目までの配列で、５’末端と３’末端がそれぞれ順方向プライマー、逆方向プライマーの相補的配列と同じ配列に置き換わっている。

図９は、配列データベースの検索を行う方法が適用される情報処理装置の構成を示すブロック図である。データベースの検索システムは、外部記憶装置９０１、中央処理装置（ＣＰＵ）９０２、メモリ９０３、入出力装置９０４から構成される装置に実装される。外部記憶装置９０１は、本発明を実現するプログラムや、ハイブリダイゼーション反応の結果、輝度レベルを保持する。中央処理装置（ＣＰＵ）９０２は本発明を実現するプログラムを実行したり、すべての装置の制御を行ったりする。メモリ９０３は中央処理装置（ＣＰＵ）９０２が使用するプログラム、及びサブルーチンや配列データ等のデータを一時的に記録する。入出力装置９０４は、ユーザーとのインタラクションを行う。多くの場合、プログラム実行のトリガーはこの入出力装置を介してユーザーが出す。また、ユーザーの結果確認、プログラムのパラメータ制御は、この入出力装置を介して行う。

ここでのＣＰＵ９０２には、遺伝子データベースとしての外部記憶装置９０１が接続され、外部記憶装置９０１により遺伝子情報の配列データが蓄積されているＣＤ−ＲＯＭまたはハードディスクなどの記憶媒体から、遺伝子配列データを得ることができる。そして、相同性を検索する配列について相同性検索を行う。また、ＣＰＵ９０２は、他の遺伝子データベースとしてネットワークを介してデータベースに接続することもできる。この場合は、データベースから遺伝子データベースの情報を得て、相同性検索を行う。

図１０はＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーション反応の結果を撮像する蛍光画像撮像装置の構成例を示した図である。蛍光画像撮像装置は図７で示した情報処理装置１００１、ＣＭＯＳセンサ１００４を内蔵し蛍光フィルター１００５を付属する撮像装置１００３、ＤＮＡマイクロアレイの励起光源１００６、ＤＮＡマイクロアレイ１００７を支持するＤＮＡマイクロアレイ支持基盤１００８、外部からの光を遮断する暗箱１００２で構成される。ＣＭＯＳセンサ１００４にはＲＧＢカラーフィルタが装着されている。ハイブリダイゼーション反応を行ったマイクロアレイ１００７を励起光源１００６で励起し、発せられた蛍光を蛍光フィルター１００５を通じて撮像装置１００３で撮像する。Ｃｙ３蛍光色素を用いた場合、励起光源１００６は波長５３２ｎｍのレーザを用いる。撮像装置１００３はＵＳＢケーブルで接続された情報処理装置１００１の入出力装置から操作する。

図１１はＤＮＡマイクロアレイ上のハイブリダイゼーションの様子を示した図である。生体内でほとんどの場合、ＤＮＡは２重らせん構造をしていて、その２本鎖の間の結合は塩基間の水素結合で実現されている。一方、ＲＮＡは１本鎖で存在する場合が多い。塩基の種類はＤＮＡの場合はＡＴＧＣの４種類、ＲＮＡの場合はＡＵＧＣの４種類であり、それぞれ水素結合ができる塩基対はＡ−Ｔ（Ｕ）、Ｇ−Ｃのペアとなっている。一般にハイブリダイゼーション反応とは、１本鎖状態の核酸分子同士がその中にある部分塩基配列を介して部分的に結合する状態をいう。。

次に図１２を用いてＤＮＡマイクロアレイを用いる操作手順全般について説明する。１２０１の“サンプル”とは対象としている核酸（目的ＤＮＡ）が含まれているはずの液体や個体である。例えば感染症の原因菌の特定をするために本発明を適用した場合、ヒト、家畜等の動物由来の血液、喀痰、胃液、膣分泌物、口腔内粘液等の体液、尿及び糞便のような排出物等細菌が存在すると思われるあらゆる物がサンプルとなる。また、食中毒、汚染の対象となる食品、飲料水及び温泉水のような環境中の水等、細菌による汚染が引き起こされる可能性のある媒体がサンプルとして用いられることもある。さらに、輸出入時における検疫等の動植物も検体としてその対象となる。１２０２の“内部標準ＤＮＡ”は本発明による内部標準ＤＮＡ製造方法を用いて作製されたものである。

次に、１２０３の“生化学的増幅”方法を用いて１２０１のサンプルに含まれる目的ＤＮＡ、１２０２の内部標準ＤＮＡを同時に増幅する。例えば感染症の原因菌の特定をするために本発明を適用した場合、１６ｓ ｒＲＮＡ検出用に設計されたＰＣＲ反応用プライマーを目的ＤＮＡ用プライマーとして用いてＰＣＲ法によって目的ＤＮＡや内部標準ＤＮＡを増幅することができる。あるいはＰＣＲ増幅物を元にさらにＰＣＲ反応等を行って調整したりする。また、ＰＣＲ以外のＬＡＭＰ法などの増幅方法により調整してもよい。

その後で、増幅された目的ＤＮＡや内部標準ＤＮＡに、可視化のために各種標識法により標識する。この標識物質としては、通常Ｃｙ３， Ｃｙ５， Ｒｏｄａｍｉｎなどの蛍光物質が用いられる。また、１２０３の生化学的増幅の実験手順の中で、標識分子を混入することもある。

そして、標識分子が付加された核酸は、１２０５のＤＮＡマイクロアレイとハイブリダイゼーション反応（１２０６）を行う。この様子は、図１１に示した通りである。例えば感染症の原因菌の特定をするために本発明を適用した場合、１２０５のＤＮＡマイクロアレイは、原因菌に特異的な塩基配列を持つ目的ＤＮＡ用プローブと、内部標準ＤＮＡに特異的な塩基配列を持つプローブを基板に固定したものとなる。各菌のプローブの設計は、例えば１６ｓ ｒＲＮＡをコーディングしているゲノム部分より、当該菌に対し非常に特異性が高く、十分かつそれぞれのプローブ塩基配列で“出来るだけ”ばらつきのないハイブリダイゼーション感度が期待できるように行う。１２０５のＤＮＡマイクロアレイのプローブを固定する担体（基板）は、ガラス基板、プラスチック基板、シリコンウェハー等の平面基板が考えられる。また、凹凸のある三次元構造体、ビーズのような球状のもの、棒状、紐状、糸状のもの等を用いても、本発明の実施形態、効果には影響ない。

通常、前記基板の表面はプローブＤＮＡの固定化が可能なように処理したものが使用される。特に、表面に化学反応が可能となるように官能基を導入した物は、ハイブリダイゼーション反応の過程でプローブが安定に結合している為に、再現性の点で好ましい形態である。固定化方法は、例えば、マレイミド基とチオール（−ＳＨ）基との組合わせを用いる例が挙げられる。即ち核酸プローブの末端にチオール（−ＳＨ）基を結合させておき、固相表面がマレイミド基を有するように処理しておくことで、固相表面に供給された核酸プローブのチオール基と固相表面のマレイミド基とが反応して核酸プローブを固定化する。マレイミド基の導入方法としては、まず、ガラス基板にアミノシランカップリング剤を反応させ、次にそのアミノ基とＥＭＣＳ試薬（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：Ｄｏｊｉｎ社製）との反応によりマレイミド基を導入する。ＤＮＡへのＳＨ基の導入は、ＤＮＡ自動合成機上５’−Ｔｈｉｏｌ−ＭｏｄｉｆｉｅｒＣ６（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いる事により行なうことができる。固定化に利用する官能基の組合わせとしては、上記したチオール基とマレイミド基の組合わせ以外にも、例えばエポキシ基（固相上）とアミノ基（核酸プローブ末端）の組合わせ等が挙げられる。また、各種シランカップリング剤による表面処理も有効であり、該シランカップリング剤により導入された官能基と反応可能な官能基を導入したオリゴヌクレオチドが用いられる。さらに、官能基を有する樹脂をコーティングする方法も利用可能である。

ハイブリダイゼーション反応を行った後、１２０５のＤＮＡマイクロアレイの表面を洗浄し、プローブと結合していない核酸を剥がした後で、（通常は）乾燥し、１２０６の蛍光量を測定する。そして、ＤＮＡマイクロアレイの基板に励起光を照射し、センサで蛍光画像を撮像（１２０７）する。得られたＤＮＡマイクロアレイ蛍光画像（１２０８）のプローブ蛍光強度を算出する。

次に、図１３を用いて感染症の菌を特定するＤＮＡマイクロアレイの原理を示す。図１３で示したＤＮＡマイクロアレイは、例えば、黄色ブドウ球菌を特定する目的で作られていると仮定する。

左の列は、黄色ブドウ球菌野生株由来の処理系列であり、右の列は大腸菌野生株由来の処理系列である。例えば、左は黄色ブドウ球菌に感染した患者の血液を処理する流れで、右は大腸菌に感染した患者の血液を処理する流れだと考えてよい。

どちらも基本的には同じ処理を行う。つまり、まず初めに例えば菌感染患者の血液や、痰などからＤＮＡを抽出する。この際に、一般的には、患者の体細胞由来の人間のＤＮＡも含まれる可能性がある。

抽出されたＤＮＡが少ない場合、ＰＣＲ法などの方法で増幅を行う。この際に蛍光物質もしくは蛍光物質を結合させることができる物質を標識として混入させるのが一般的である。

増幅をしない場合は、抽出されたＤＮＡを用いて、相補鎖を作りながら蛍光物質もしくは蛍光物質を結合させることができる物質を標識として混入させる、または、そのまま直接抽出されたＤＮＡに蛍光物質もしくは蛍光物質を結合させることができる物質を標識として付加させる。

通常、ＰＣＲ増幅を行う場合、感染症の菌特定目的であれば、いわゆる１６ｓ ｒＲＮＡといわれるリボゾームＲＮＡを構成する塩基配列の部分を増幅するのが一般的である。この場合、左の黄色ブドウ球菌のＰＣＲプライマーと右の大腸菌のＰＣＲプライマーはほとんど同じものを使うこととなる。より具体的には、どんな菌の１６ｓ ｒＲＮＡをコーディングしている部分でも増幅させることができるプライマーセットを用いて、マルチプレックスＰＣＲを行う。本発明によって作成された内部標準ＤＮＡも上記プライマーセットを用いてマルチプレックスＰＣＲによって増幅される。

黄色ブドウ球菌を判定する目的のために設計されたＤＮＡマイクロアレイが正しく動作するならば、左のハイブリ溶液では、スポットがポジティブに反応し、右のハイブリ溶液では、スポットがネガティブに反応する。

これと全く同じように、大腸菌の存在を判定する目的のために設計されたＤＮＡマイクロアレイが正しく動作するならば、左のハイブリ溶液では、スポットがネガティブに反応し、右のハイブリ溶液では、スポットがポジティブに反応する。もちろん、いろんな菌に対してそれぞれ特異的に反応する数種類のスポットを同時に並べたＤＮＡマイクロアレイを用いて、感染菌の判定を行ってもかまわない。

また、内部標準ＤＮＡ検出プローブのスポットは、内部標準ＤＮＡが存在するため、菌の存在に関わらずポジティブに反応する。ただし、マルチプレックスＰＣＲが何らかの原因で失敗していた場合や、ハイブリダイゼーション反応そのものが失敗していた場合はネガティブに反応する。この特性によって、ＰＣＲ増幅検定を行うことができる。さらに、内部標準ＤＮＡの投入量と、内部標準ＤＮＡ用プローブのスポット輝度から、どの程度の内部標準ＤＮＡを投入すれば、どの程度の輝度が得られるかを求めることができる。内部標準ＤＮＡとサンプルを比較することで、サンプルの定量性を高めることができる。

（実施形態２）
以下、図１３を用いて説明した操作の流れを感染症の原因菌特定の目的を想定した具体的操作として説明する。なお、生物種類判定方法は、以下に述べる感染症の原因菌特定に限ったものではなく、ＭＨＣなどの人間の体質判定や、癌などの疾病に関わるＤＮＡ、ＲＮＡの解析に用いてもよい。

＜目的ＤＮＡ用プローブの準備＞
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ菌検出用Ｐｒｏｂｅとして表１に示す核酸配列（Ｉ−ｎ）（ｎは数字）を設計した。

具体的には、１６ｓ ｒＲＮＡをコーディングしているゲノム部分より、目的ＤＮＡ用プローブとして、以下に示したプローブ塩基配列を選んだ。これらのプローブ塩基配列群は、当該菌に対し非常に特異性が高く、十分かつそれぞれのプローブ塩基配列で“出来るだけ”ばらつきのないハイブリダイゼーション感度が期待できるように設計されている。

表１中に示した目的ＤＮＡ用プローブは、ＤＮＡマイクロアレイに固定するための官能基として、合成後、定法に従って目的ＤＮＡ用プローブの５’末端にチオール基を導入した。官能基の導入後、精製し、凍結乾燥した。凍結乾燥した目的ＤＮＡ用プローブは、−３０℃の冷凍庫に保存した。

黄色ブドウ球菌（Ａ−ｎ）、表皮ブドウ球菌（Ｂ−ｎ）、大腸菌（Ｃ−ｎ）、肺炎桿菌（Ｄ−ｎ）、緑膿菌（Ｅ−ｎ）、セラチア菌（Ｆ−ｎ）、肺炎連鎖球菌（Ｇ−ｎ）、インフルエンザ菌（Ｈ−ｎ）、及びエンテロコッカス・フェカリス菌（Ｊ−ｎ）（ｎは数字）についても同様な手法により、目的ＤＮＡ用プローブとして、以下の表に示すプローブセットを設計した。

＜内部標準ＤＮＡ用プローブの準備＞
内部標準ＤＮＡ用プローブについても同様な手法により以下に示すプローブを設計した。

＜目的ＤＮＡ用ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ の準備＞
起炎菌検出用の為の目的ＤＮＡ用プライマーとして、表１２に示す核酸配列を設計した。具体的には、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ菌１６ｓ ｒＲＮＡをコーディングしているゲノム部分を特異的に増幅するプライマーセット、つまり約１５００塩基長の１６ｓ ｒＲＮＡコーディング領域の両端部分で、特異的な融解温度をできるだけ揃えたプライマーを設計した。なお、変異株や、ゲノム上に複数存在する１６ｓ ｒＲＮＡコーディング領域も同時に増幅できるように複数種類のプライマーを設計した。なお、これらのプライマーを用いれば、本発明による内部標準ＤＮＡも増幅可能である。

表１２中に示したプライマーは、合成後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、順方向プライマー３種、逆方向プライマー３種を混合し、それぞれのプライマー濃度が、最終濃度１０ ｐｍｏｌ／μｌ となるようにＴＥ緩衝液に溶解した。

＜Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ（モデル検体）の抽出＞
（微生物の培養 ＆ Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ 抽出の前処理）
まず、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ 標準株を、定法に従って培養した。この微生物培養液を１．５ｍｌ容量のマイクロチューブに１．０ｍｌ（ＯＤ６００＝０．７）採取し、遠心分離で菌体を回収した（８５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）。上精を捨てた後、Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐ．Ｈ． ８．０、２５ｍＭ ＥＤＴＡ）３００μｌを加え、ミキサーを用いて再縣濁した。再縣濁した菌液は、再度、遠心分離で菌体を回収した（８５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）。上精を捨てた後、回収された菌体に、以下の酵素溶液を加え、ミキサーを用いて再縣濁した。
Lysozyme 50 μl (20 mg/ml in Enzyme Buffer)
N-Acetylmuramidase SG 50 μl (0.2 mg/ml in Enzyme Buffer)

次に、酵素溶液を加え再縣濁した菌液を、３７℃のインキュベーター内で３０分間静置し、細胞壁の溶解処理を行った。

（Ｇｅｎｏｍｅ抽出）
以下に示す微生物のＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡ抽出は、核酸精製キット（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ -Ｇｅｎｏｍｅ−：ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて行った。

具体的には、まず、前処理で細胞壁を溶解した微生物縣濁液に溶解・吸着液７５０μｌと磁性ビーズ４０μｌを加え、チューブミキサーを用いて、１０分間激しく攪拌した（ステップ１）。

次に、分離用スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ Ｔｒａｐｐｅｒ）にマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた（ステップ２）。

次に、洗浄液 ９００ μｌ を加え、ミキサーで５ｓｅｃ程度攪拌して再縣濁を行った（ステップ３）。

次に、分離用スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ Ｔｒａｐｐｅｒ）にマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた（ステップ４）。

ステップ３、４を繰り返して２度目の洗浄（ステップ５）を行った後、７０％エタノール ９００ μｌ を加え、ミキサーで５ｓｅｃ程度攪拌して再縣濁した（ステップ６）。

次に、分離用スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ Ｔｒａｐｐｅｒ）にマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた（ステップ７）。

ステップ６、７を繰り返して７０％エタノールによる２度目の洗浄（ステップ８）を行った後、回収された磁性粒子に純水 １００ μｌ を加え、チューブミキサーで１０分間攪拌を行った。

次に分離用スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ Ｔｒａｐｐｅｒ）にマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブ壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を新しいチューブに回収した。

（回収したＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡの検査）
回収された微生物（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ 株）のＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡは、定法に従って、アガロース電気泳動と２６０／２８０ｎｍの吸光度測定を行い、その品質（低分子核酸の混入量、分解の程度）と回収量を検定した。

本実施例では、約１０μｇのＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡ が回収され、Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡのデグラデーションやｒＲＮＡの混入は認められなかった。

回収したＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡは、最終濃度５０ｎｇ／μｌとなるようにＴＥ緩衝液に溶解し、以下の実施例に使用した。

＜ＤＮＡマイクロアレイの作製＞
［１］ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板（サイズ：２５ｍｍｘ７５ｍｍｘ１ｍｍ、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリ のラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中で浸した後、２０分間超音波洗浄を行った。続いて基板を取り出し、軽く純水ですすいだ後、超純水中で２０分超音波洗浄をおこなった。次に８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間基板を浸した。再び純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡチップ用の石英ガラス基板を用意した。

［２］表面処理
シランカップリング剤ＫＢＭ−６０３（信越シリコーン社製）を、１％の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、先に洗浄したガラス基板をシランカップリング剤水溶液に浸し、２０分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に乾燥した基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。次いで同仁化学研究所社製のＮ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ）（以下ＥＭＣＳと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒中に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。ベークの終了したガラス基板を放冷し、調製したＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この処理により、シランカップリング剤によって表面に導入されたアミノ基とＥＭＣＳのスクシイミド基が反応し、ガラス基板表面にマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、先述のＭＣＳを溶解した混合溶媒を用いて洗浄し、さらにエタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。

［３］プローブＤＮＡ
作製した目的ＤＮＡ用プローブと内部標準ＤＮＡ用プローブを純水に溶解し、それぞれ、最終濃度（インク溶解時）１０μＭとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。

［４］ＢＪプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板への結合
グリセリン７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、アセチレノールＥＨ（川研ファインケミカル社製）１．０ｗｔ％を含む水溶液を用意した。続いて、先に用意した目的ＤＮＡ用プローブ（表１〜表１０）の６０種類と内部標準ＤＮＡ用プローブ１種類の計６１種類のプローブを上記の混合溶媒に規定濃度なるように溶解した。得られたＤＮＡプローブ溶液をバブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＦ−８５０ キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。

なお、ここで用いたバブルジェットプリンターは平板への印刷が可能なように改造を施したものである。またこのバブルジェットプリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約５ピコリットルのＤＮＡ溶液を約１２０マイクロメートルピッチでスポッティングすることが可能となっている。

続いて、この改造バブルジェットプリンターを用いて、１枚のガラス基板に対して、印字操作を行い、アレイを作製した。印字が確実に行われていることを確認した後、３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基とプローブ末端のチオール基とを反応させた。

［５］洗浄
３０分間の反応後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により表面に残ったＤＮＡ溶液を洗い流し、ガラス基板表面にプローブ（一本鎖ＤＮＡ）が固定したＤＮＡマイクロアレイを得た。

＜検体の増幅と標識化（ＰＣＲ増幅＆蛍光標識の取り込み）＞
検体となる微生物の目的ＤＮＡの増幅、および、標識化反応を以下に示す。Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡとは、先の操作で改修したＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ 株のＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡである。Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘとは、表１２に記載の３種類の順方向プライマーを含むプライマー溶液である。
Premix PCR 試薬（TAKARA ExTaq） 25μl
Template Genome DNA 2μl (100ng)
内部標準DNA 2μl (100ng)
Forward Primer mix 2μl (20pmol/tube each)
Reverse Primer mix 2μl (20pmol/tube each)
Cy-3 dUTP (1mM) 2μl (2nmol/tube)
H₂0 15μl
Total 50μl

上記組成の反応液を以下のプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行った。
（１）95℃ 10 min.
（２）92℃ 45 sec.
（３）55℃ 45 sec.
（４）72℃ 45 sec.
（５）72℃ 10 min.
（２）から（４）を３５サイクル行った。
反応終了後、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いてＰｒｉｍｅｒを除去した後、増幅産物の定量を行い、標識化検体とした。

＜ハイブリダイゼーション＞
＜ＤＮＡマイクロアレイの作製＞で作製したＤＮＡマイクロアレイと＜検体の増幅と標識化（ＰＣＲ増幅＆蛍光標識の取り込み）＞で作製した標識化検体を用いて検出反応を行った。
（ＤＮＡマイクロアレイのブロッキング）
ＢＳＡ（牛血清アルブミンＦｒａｃｔｉｏｎ Ｖ：Ｓｉｇｍａ社製）を１ｗｔ％となるように１００ｍＭ ＮａＣｌ ／ １０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒに溶解し、この溶液に＜ＤＮＡマイクロアレイの作製＞で作製したＤＮＡマイクロアレイを室温で２時間浸し、ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、０．１ｗｔ％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２ｘＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ ３００ｍＭ 、Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ （ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｄｉｈｙｄｒａｔｅ， Ｃ₆Ｈ₅Ｎａ₃・２Ｈ₂Ｏ） ３０ｍＭ、ｐ．Ｈ． ７．０）で洗浄を行った後、純水でリンスしてからスピンドライ装置で水切りを行った。

（ハイブリダイゼーション）
水切りしたＤＮＡマイクロアレイをハイブリダイゼーション装置（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ． Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎ）にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション溶液、条件でハイブリダイゼーション反応を行った。

＜ハイブリダイゼーション溶液＞
6 x SSPE / 10% Form amide / Target (PCR Products 全量)
(6xSSPE: NaCl 900mM、NaH₂PO₄・H₂O 60mM、EDTA 6mM、p.H. 7.4)

＜ハイブリダイゼーション条件＞
65 ℃ 3min → 92℃ 2min → 45℃ 3hr → Wash 2ｘSSC / 0.1% SDS at 25℃ → Wash 2 x SSC at 20℃ → (Rinse with H₂O : Manual) → Spin dry

＜微生物の検出（蛍光測定）＞
ハイブリダイゼーション反応終了後のＤＮＡマイクロアレイを図７の装置を用いて蛍光画像の撮像を行った。この結果得られたＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ由来の蛍光画像を図１１に示す。ここでプローブのスポットについて蛍光輝度を数値化することで、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅの存在の有無を判定する。

ＤＮＡ中の１６ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡと、目的ＤＮＡ用プライマーによって増幅される目的ＤＮＡの位置関係を表す概略図 目的ＤＮＡと目的ＤＮＡ用プライマーの位置関係を表す概略図。 ＰＣＲ反応の増幅対象となる目的ＤＮＡを表す概略図。 本発明に係る製造方法により作製される内部標準ＤＮＡを表す概略図。 本発明の内部標準ＤＮＡ製造方法の流れを示した図である。 本発明の内部標準候補ＤＮＡの配列置換方法の概要を説明するための図である。 内部標準候補ＤＮＡの順方向・逆方向プライマーとのアライメントを示した図である。 内部標準候補ＤＮＡの配列置換例を説明するための図である。 本発明を実現するための情報処理装置の構成を示すブロック図である。 ＤＮＡマイクロアレイの蛍光画像撮像装置の構成を示した図である。 ＤＮＡマイクロアレイ上のハイブリダイゼーションの様子を示した図である。 ＤＮＡマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーション反応実験の実験手順全般について説明するための図である。 感染症の菌を特定するＤＮＡマイクロアレイの原理を説明するための図である。 ＤＮＡマイクロアレイ蛍光画像を示した図である。 本発明によって作成された内部標準ＤＮＡの配列を示した図である。

符号の説明

１１ １６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
１２ 目的ＤＮＡ
１３ ＤＮＡ
２１ 順方向プライマー（目的ＤＮＡ用プライマー）
２２ 逆方向プライマー（目的ＤＮＡ用プライマー）
３１ 目的ＤＮＡ の５’末端領域
３２ 目的ＤＮＡの中央領域
３３ 目的ＤＮＡの３’末端領域
４１ 内部標準ＤＮＡの５’末端領域
４２ 内部標準ＤＮＡの中央領域
４３ 内部標準ＤＮＡの３’末端領域
４４ 順方向プライマー（目的ＤＮＡ用プライマー）
４５ 逆方向プライマー（目的ＤＮＡ用プライマー）

Claims (2)

1. 検出対象菌由来の目的ＤＮＡを増幅するＰＣＲ反応の反応溶液に添加され、前記目的ＤＮＡを増幅する目的ＤＮＡ用プライマーによって増幅される内部標準ＤＮＡの製造方法であって、
   下記条件を満たす内部標準候補ＤＮＡをデータベース検索により選択し、
   該内部標準候補ＤＮＡの５’末端領域及び３’末端領域の配列を、置換プライマーを用いたＰＣＲ法により、それぞれ前記目的ＤＮＡ用プライマーの順方向プライマー配列及び逆方向プライマーの相補的配列と同じ配列にすることを特徴とする内部標準ＤＮＡの製造方法。
   条件（Ａ）；前記順方向プライマーと所定の相同性を有する領域（以下、条件Ａの領域と略す）を一部に有する配列。
   条件（Ｂ）；前記逆方向プライマーの相補的配列と所定の相同性を有する領域（以下、条件Ｂの領域と略す）を一部に有する配列。
   条件（Ｃ）；前記条件Ａの領域は５'末端側にあり、前記条件Ｂの領域は３'末端側にある配列。
   条件（Ｄ）；前記条件Ａの領域と前記条件Ｂの領域の間の配列は、前記目的ＤＮＡの塩基数と同程度であり、前記検出対象菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列と相同性が低い。
2. 前記内部標準候補ＤＮＡは、さらに、条件（Ｅ）を満たすことを特徴とする請求項１に記載の内部標準ＤＮＡの製造方法。
   条件（Ｅ）；前記条件Ａの領域と前記条件Ｂの領域の間に、前記目的ＤＮＡとハイブリダイズする目的ＤＮＡ用プローブと相同性を有する配列が存在しない配列。