JP2010142223A - エタノール測定方法及びエタノール測定用キット - Google Patents
エタノール測定方法及びエタノール測定用キット Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010142223A JP2010142223A JP2009283806A JP2009283806A JP2010142223A JP 2010142223 A JP2010142223 A JP 2010142223A JP 2009283806 A JP2009283806 A JP 2009283806A JP 2009283806 A JP2009283806 A JP 2009283806A JP 2010142223 A JP2010142223 A JP 2010142223A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ethanol
- liquid
- kit
- measurement method
- measurement
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 299
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 6
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims abstract description 19
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 108010060806 Photosystem II Protein Complex Proteins 0.000 claims abstract description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 52
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 13
- -1 fatty acid ester Chemical class 0.000 claims description 10
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 8
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 8
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 8
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 8
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 claims description 6
- 238000004040 coloring Methods 0.000 abstract description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 95
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229910018072 Al 2 O 3 Inorganic materials 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 2
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 2
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- DZNJMLVCIZGWSC-UHFFFAOYSA-N 3',6'-bis(diethylamino)spiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(N(CC)CC)C=C1OC1=CC(N(CC)CC)=CC=C21 DZNJMLVCIZGWSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000089 Cyclic olefin copolymer Polymers 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001252 Pd alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 244000195452 Wasabia japonica Species 0.000 description 1
- 235000000760 Wasabia japonica Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000002485 combustion reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000005314 correlation function Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- VBJGJHBYWREJQD-UHFFFAOYSA-M sodium;dihydrogen phosphate;dihydrate Chemical compound O.O.[Na+].OP(O)([O-])=O VBJGJHBYWREJQD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
【課題】簡易、迅速に且つ正確にエタノールを測定することができ、低濃度でも安定性および定量性があるエタノール測定技術を提供することを目的とする。
【解決手段】エタノール含有試料を、酸素、水及びアルコールオキシダーゼの存在下に酵素反応させることにより過酸化水素を発生させ、該過酸化水素と、４−アミノアンチピリン、フェノールを、ペルオキシダーゼの存在下に酵素反応させることにより赤色キノン色素を発色させるエタノール測定方法及び上述したエタノール測定方法をより簡易、迅速に実施するためのエタノール測定キットにより解決する。
【選択図】図１
【解決手段】エタノール含有試料を、酸素、水及びアルコールオキシダーゼの存在下に酵素反応させることにより過酸化水素を発生させ、該過酸化水素と、４−アミノアンチピリン、フェノールを、ペルオキシダーゼの存在下に酵素反応させることにより赤色キノン色素を発色させるエタノール測定方法及び上述したエタノール測定方法をより簡易、迅速に実施するためのエタノール測定キットにより解決する。
【選択図】図１
Description
本発明は、低濃度のエタノールを測定するためのエタノール測定方法及びエタノール測定キットに関する。
エタノールの分析は、従来からガスクロマトグラフィー（ＧＣ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの分析機器が使用されている。しかしながら、ＧＣは、測定成分をガス化する過程でブレが生じやすいため、低濃度のエタノールを分析する場合は、定量性がなく安定性に欠ける。また、ＨＰＬＣは溶媒を用いるため、低濃度のエタノールがさらに希釈されることになり、やはり定量性がなく安定性に欠ける。
そこで、低濃度アルコール類の定量について、種々の提案がなされている。例えば、特開２００９−１２８１６０号公報には、シクロオレフィンポリマーなどの飽和含水率２質量％以下のマトリックスポリマー中に、ローダミンＢベースなどのアルコールの存在または非存在に応じて可逆的結合変化し、アルコール存在下で発色および／または発光する色素が分散している薄膜からなるアルコールセンサにより、感度でアルコールを測定することができると記載されている（特許文献１）。
特開２００２−２７７３９２号公報には、入射光を波長１８０〜２２０ｎｍ付近で反射光と透過光に分離する波長特性をもち、反射光と透過光のうち波長２００ｎｍを含む光を測定光として選択するように配置され、測定用光路を形成するミラーを備えた微量イソプロピルアルコール測定装置が、そのミラーの波長特性と試料水中の水の吸収とから、微量ＩＰＡの濃度測定に必要な波長域の光を選択的かつ効率良く利用することができると記載されている（特許文献２）。
また、特開平９−１５１８５号公報には、１０〜４０μｍのＦｅ−Ｐｄ合金線に、Ｐｔブラック−Ａｌ2 Ｏ3 又はＰｄＯ−Ａｌ2 Ｏ3 或いはＰｔ・ブラックＰｄＯ−Ａｌ2 Ｏ3 の触媒を電着してなり、メチルアルコール用には１４０〜１６０℃を、また、エチルアルコール用には１５０〜２００℃を設定温度とする接触燃焼式低濃度用アルコールセンサが開示されている（特許文献３）。
これまで低濃度のエタノール分析は、分析装置の検出感度を向上させる方向に注力されている傾向にあるが、分析装置を用いてエタノールを分析する場合、サンプル数が多くなればなるほど時間も手間もかかり、例えば土壌からエタノール発酵性酵母をスクリーニングする場合などはサンプル数が膨大な数になるため、作業効率が極めて悪い。また、例えば飲酒運転の検問など屋外でアルコール濃度を測定する場合はその場で結果が判定することができなければならないため、分析装置を用いることはできない。
このような事情から、より簡易かつ迅速に且つ正確にエタノールを測定する方法の開発が望まれていた。
本発明は、かかる課題を解決するためになされたものであり、簡易かつ迅速に且つ正確にエタノールを測定することができ、低濃度でも安定性および定量性があるエタノール測定技術を提供することを目的とする。
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、アルコールオキシダーゼの作用でエタノールから過酸化水素を生成させ、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の作用でキノン系色素を生成させ、これを比色定量するエタノールの測定方法が、簡易かつ迅速に且つ正確にエタノールを測定することができ、低濃度でも安定性および定量性に優れているとの知見を得た。
本発明はかかる知見に基づきなされたものであり、エタノール含有試料を、酸素、水及びアルコールオキシダーゼの存在下に酵素反応させることにより過酸化水素を発生させ、該過酸化水素と、４−アミノアンチピリン及びフェノールを、ペルオキシダーゼの存在下に酵素反応させることにより赤色キノン色素を発色させる、エタノール測定方法を提供するものである。
本発明はまた、アルコールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び４−アミノアンチピリンを含有する溶液からなるＡ液及びリン酸緩衝液及びフェノールを含有する溶液からなるＢ液を備えた、エタノール測定用キットを提供するものである。
本発明に係るエタノール測定方法及びエタノール測定用キットによれば、酵素反応を利用してエタノールを比色定量することができるため、試料中のエタノール濃度が０．００１重量％程度の、ガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーでは測定困難なほど低濃度の場合でも、正確にエタノールの定性分析及び定量分析を実施することが可能となる。また、大掛かりな装置を必要とせず、エタノール含有試料を添加してから数秒で結果が判明するため、簡易かつ迅速を必要とする検査においても極めて有用である。
本発明の実施形態に係るエタノール測定方法について説明する。図１は本実施形態に係るエタノール測定方法の測定原理を説明するための図である。エタノール含有試料を、酸素、水及びアルコールオキシダーゼの存在下で酵素反応させると、過酸化水素と酢酸が生成する。次いで、該過酸化水素、４−アミノアンチピリン、フェノールをペルオキシダーゼの存在下で酵素反応させると、赤色キノン色素が発色する。この発色した赤色キノン色素を比色定量することにより、エタノールを定性的、定量的に測定することができる。
本実施形態のエタノール測定方法を実施する際は、アルコールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び４−アミノアンチピリンを含有する溶液（以下、「Ａ液」という）と、リン酸緩衝液及びフェノールを含有する溶液（以下、「Ｂ液」という）を調製し、Ａ液とＢ液を混合した溶液にエタノール含有試料を添加して比色定量を行うことができる。
本実施形態において、アルコールオキシダーゼはエタノールを酵素的に分解して過酸化水素を発生させるために使用されるものである。アルコールオキシダーゼは、約９．０Ｕ／ｍｌになるように調製したものをＡ液に対して０．０００１〜１重量％含有させることが好ましい。
本実施形態において、ペルオキシダーゼは過酸化水素を水素受容体として種々の基質の酸化反応を触媒する酵素として使用されるものである。ペルオキシダーゼは、例えば、西洋ワサビ、牛乳、酵母、白血球、赤血球などから得られるものがあるが、西洋ワサビ由来のものが好ましい。ペルオキシダーゼは、約０．０５Ｕ／ｍｌになるように調製したものをＡ液に対して０．０００１〜１重量％含有させることが好ましい。
本実施形態において、４−アミノアンチピリンはフェノールとともに発色試薬として使用されるものである。ペルオキシダーゼは、約０．０５Ｕ／Ｌになるように調製したものをＡ液に対して０．０００１〜１重量％含有させることが好ましい。
Ａ液は、アルコールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び４−アミノアンチピリンを上記の範囲で水等に溶解して調製することができる。
本実施形態において、リン酸緩衝液はｐＨ５．５〜８．０、約７０ｍｍｏｌになるように調製することが好ましい。
本実施形態において、フェノールは４−アミノアンチピリンとともに発色試薬として使用されるものである。フェノールは、約５．３ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製することが好ましい。
Ｂ液は、上記リン酸緩衝液中でフェノールが約５．３ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加することで調製することができる。
上述したＡ液及びＢ液は、エタノールを測定する際に混合され、その混合液にエタノール含有試料を添加する。Ａ液とＢ液の割合はエタノール含有試料中に含まれるエタノール濃度や発色の度合いに応じて適宜設定されるものであるが、例えば重量比で１：５〜５：１の範囲で変更することができる。なお、Ａ液にエタノール含有試料を添加した後にＢ液と混合してもよく、Ｂ液にエタノール含有試料を添加した後にＡ液と混合してもよい。さらに、エタノール含有試料にＡ液とＢ液の混合液を添加してもよく、エタノール含有試料にＡ液を添加した後にＢ液を添加しても、エタノール含有試料にＢ液を添加した後にＡ液を添加してもよい。
エタノール含有試料の添加量はエタノール含有試料中に含まれるエタノール濃度や発色の度合いに応じて適宜設定されるものであるが、例えば、０．０１〜１０００μｌ程度でよい。そして、エタノール含有試料に、酸素、水及びアルコールオキシダーゼが反応して過酸化水素と酢酸が発生し、次いで、該過酸化水素と４−アミノアンチピリン、フェノール及びペルオキシダーゼが反応し、赤色キノン色素が発色する。
なお、エタノール含有試料が赤色又は赤色に近い色を有している場合は、エタノール含有試料を希釈するか、ブランクを準備し、酵素反応前後の発色の差を求めることにより、比色定量が可能である。
本実施形態において「エタノール含有試料」とは、エタノールを測定する気体、液体又は固体のサンプルを意味し、本実施形態のエタノール測定方法の測定対象となるものである。エタノール含有試料は測定対象によりその形態が異なるため特に制限はないが、例えば、アルコール発酵液、唾液、糖液、食品、化粧品などを挙げることができる。
実施形態に係るエタノール測定方法の検出限界は０．００１％（w/w）であり、ガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーの検出限界である５％（w/w）を大幅に上回るものである。
定性分析を行う場合は、赤色キノン色素の発色の有無を肉眼で観察すればよい。赤色キノン色素の発色が認められた場合は、試料中にエタノールが存在していることを示し、赤色キノン色素の発色が認められない場合は、試料中にエタノールが存在しないことを示す。
定量分析を行う場合は、赤色キノン色素を発色した溶液の吸光度を吸光度計等で測定し、予め作成した検量線と対比することで、エタノール含有量を定量することができる。また、赤色キノン色素を発色した溶液の発色の程度を予め作成した比色表と対比することで、エタノール含有量を定量することもできる。
本実施形態のエタノール測定方法はアルコールオキシダーゼの作用でエタノールから過酸化水素を生成させる工程と、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の作用でキノン系色素を生成させる工程を有するが、酵素は基質特異性を有しているため、酵素反応の各工程は同一の系で反応を行っても測定結果に影響を及ぼすことはない。もちろん、各工程を別々の系で実施することもできる。
但し、本実施形態のエタノール測定方法は検出感度が高いため、空気中に存在するエタノールがＡ液又はＢ液に溶解して酵素反応を引き起こし、赤色キノン色素を発色する場合がある。そのため、本実施形態のエタノール測定方法は揮発したアルコールが存在しない雰囲気中で実施することが好ましい。
揮発したアルコールが存在する雰囲気中で本実施形態のエタノール測定方法を実施する場合は、前記Ａ液及び／又はＢ液に、さらに界面活性剤を添加することが好ましい。Ａ液及び／又はＢ液に界面活性剤を添加することで、空気中に存在するエタノールが反応系に溶解するのを防止することができるため、より正確にエタノールを測定することが可能となる。
前記界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類であることが好ましい。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類はソルビタン脂肪酸エステルにポリオキシエチレンを付加したもので、ポリオキシエチレンの付加モル数、ソルビタン脂肪酸エステルの構成脂肪酸種及びエステル化度の組み合わせにより様々な性質を設定することが可能である。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類の具体例としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（商標）、Ｔｗｅｅｎ４０（商標）、Ｔｗｅｅｎ６０（商標）、Ｔｗｅｅｎ８０（商標）、ＴｒｉｔｏｎＸ（商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）等が挙げられる。
界面活性剤の添加量は、Ａ液に添加する場合は、Ａ液に対して０．０００１〜０．１重量％であることが好ましく、Ｂ液に添加する場合は、Ｂ液に対して０．００１〜０．１重量％であることが好ましい。
本発明はまた、上述したエタノール測定方法をより簡易かつ迅速に実施するためのエタノール測定キットを提供するものである。
本実施形態のエタノール測定用キットは、下記のＡ液及びＢ液を備えている。
（Ａ液）アルコールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び４−アミノアンチピリンを含有する溶液
（Ｂ液）リン酸緩衝液及びフェノールを含有する溶液
（Ａ液）アルコールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び４−アミノアンチピリンを含有する溶液
（Ｂ液）リン酸緩衝液及びフェノールを含有する溶液
Ａ液及びＢ液の組成及び添加量等については先述したエタノール測定方法において使用されるＡ液及びＢ液と同様である。
本実施形態のエタノール測定用キットは、Ａ液及び／又はＢ液に、さらに界面活性剤を含有していることが好ましい。Ａ液及び／又はＢ液に界面活性剤を含有することで、空気中に存在するエタノールが反応系に溶解するのを防止することができるため、より正確にエタノールを測定することが可能となる。界面活性剤の具体例等については先述したエタノール測定方法において使用される界面活性剤と同様である。
本実施形態のエタノール測定用キットは、エタノール濃度に応じて色分けされた比色表を備えていることが好ましい。比色表を用いれば、吸光光度計を使用できない状況下（例えば屋外など）でもエタノール含有量を定量することができる。
１．供試試薬
以下の組成からなるＡ液及びＢ液を調製した。なお、調製後は５℃で保存した。
以下の組成からなるＡ液及びＢ液を調製した。なお、調製後は５℃で保存した。
（１）Ａ液の調製
酵素力価１０００Ｕ/ｍｌのアルコールオキシダーゼ（Pichea pastoris由来、SIGUMA社製）９００μl、酵素力価５０，０００Ｕ/gのペルオキシダーゼ（わさび由来、オリエンタル酵母社製）１ｍｇ、４−アミノアンチピリン１ｍｇを１Ｌ容メスフラスコに入れ、蒸留水で１Ｌになるように定容することにより、Ａ液を調製した。
酵素力価１０００Ｕ/ｍｌのアルコールオキシダーゼ（Pichea pastoris由来、SIGUMA社製）９００μl、酵素力価５０，０００Ｕ/gのペルオキシダーゼ（わさび由来、オリエンタル酵母社製）１ｍｇ、４−アミノアンチピリン１ｍｇを１Ｌ容メスフラスコに入れ、蒸留水で１Ｌになるように定容することにより、Ａ液を調製した。
（２）Ｂ液の調製
リン酸二水素ナトリウム（二水和物）（Sodium Dihydrogen Phosphate, NaH2PO4・2H2O, M.W 156.01（国産化学株式会社製））１０．９５ｇを１Ｌ容メスフラスコに定容し７０ｍｍｏｌリン酸二水素ナトリウム溶液を調製した。また、リン酸水素二ナトリウム（１２水和物）（di- sodium Hydorogen Phosphate, Na2HPO4・12H2O, M.W 358.14（国産化学株式会社製））２５．０ｇを１Ｌ容メスフラスコに定容し７０ｍｍｏｌリン酸水素二ナトリウム溶液を調製した。そして、リン酸二水素ナトリウム溶液：リン酸水素二ナトリウム溶液を４：６の割合で混合しｐＨを７．１に調整し、７０ｍｍｏｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）を得た。
リン酸二水素ナトリウム（二水和物）（Sodium Dihydrogen Phosphate, NaH2PO4・2H2O, M.W 156.01（国産化学株式会社製））１０．９５ｇを１Ｌ容メスフラスコに定容し７０ｍｍｏｌリン酸二水素ナトリウム溶液を調製した。また、リン酸水素二ナトリウム（１２水和物）（di- sodium Hydorogen Phosphate, Na2HPO4・12H2O, M.W 358.14（国産化学株式会社製））２５．０ｇを１Ｌ容メスフラスコに定容し７０ｍｍｏｌリン酸水素二ナトリウム溶液を調製した。そして、リン酸二水素ナトリウム溶液：リン酸水素二ナトリウム溶液を４：６の割合で混合しｐＨを７．１に調整し、７０ｍｍｏｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）を得た。
次に、破砕結晶フェノール（Ground Crystals、和光純薬社製）０．５ｇ（５．３ｍｍｏｌ／Ｌ相当）を上記７０ｍｍｏｌリン酸緩衝液に溶解し、１Ｌ容メスフラスコに定容することにより、Ｂ液を調製した。
さらに、Ｔｗｅｅｎ８０（商標）をＢ液１００ｍｌに対して０．２ｍｌの割合で添加した。
２．エタノールの測定
使用前にＡ液５００μＬとＢ液５００μＬをエッペンドルフチューブに入れて混合した。その際、空気中に揮発しているエタノールの混入に留意した。これに、エタノール含有試料としてエタノール溶液を調製したものをサンプルとして約２０μl採取し、Ａ液とＢ液の混合液が入ったエッペンドルフチューブに添加した。そして、数秒後、発色したサンプルの吸光度（５１５ｎｍ）を吸光度計（日本分光社製）で測定し、相関関数を算出した。結果を図２に示す。
使用前にＡ液５００μＬとＢ液５００μＬをエッペンドルフチューブに入れて混合した。その際、空気中に揮発しているエタノールの混入に留意した。これに、エタノール含有試料としてエタノール溶液を調製したものをサンプルとして約２０μl採取し、Ａ液とＢ液の混合液が入ったエッペンドルフチューブに添加した。そして、数秒後、発色したサンプルの吸光度（５１５ｎｍ）を吸光度計（日本分光社製）で測定し、相関関数を算出した。結果を図２に示す。
図２は、吸光度とエタノール濃度の標準曲線を示したものである。図２に示すように、エタノール濃度と吸光度（５１５ｎｍ）はｙ＝０．９０１４ｘ＋０．０１３２の直線性があり、吸光度とエタノール濃度は高い相関性を示すことが判明した。
また、界面活性剤の一種であるＴｗｅｅｎ８０（商標）を添加することで、空中に飛散しているエタノールの吸着による発色が起きなくなることも確認した。
Claims (7)
- エタノール含有試料を、酸素、水及びアルコールオキシダーゼの存在下に酵素反応させることにより過酸化水素を発生させ、
該過酸化水素と、４−アミノアンチピリン及びフェノールを、ペルオキシダーゼの存在下に酵素反応させることにより赤色キノン色素を発色させる、
エタノール測定方法。 - 前記エタノール含有試料を酵素反応させる前に、界面活性剤を添加する、請求項１に記載のエタノール測定方法。
- 前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類である、請求項２に記載のエタノール測定方法。
- 下記Ａ液及びＢ液を備えた、エタノール測定用キット。
（Ａ液）アルコールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び４−アミノアンチピリンを含有する溶液
（Ｂ液）リン酸緩衝液及びフェノールを含有する溶液 - 前記Ａ液及び／又は前記Ｂ液が、界面活性剤を含有する、請求項４に記載のエタノール測定用キット。
- 前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類である、請求項５に記載のエタノール測定用キット。
- さらに、エタノール濃度に応じて色分けされた比色表を備えた、請求項４〜６のいずれか１項に記載のエタノール測定用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009283806A JP5692627B2 (ja) | 2009-12-15 | 2009-12-15 | エタノール測定用キット及びそれを用いるエタノール測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009283806A JP5692627B2 (ja) | 2009-12-15 | 2009-12-15 | エタノール測定用キット及びそれを用いるエタノール測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2010142223A true JP2010142223A (ja) | 2010-07-01 |
| JP5692627B2 JP5692627B2 (ja) | 2015-04-01 |
Family
ID=42563312
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009283806A Expired - Fee Related JP5692627B2 (ja) | 2009-12-15 | 2009-12-15 | エタノール測定用キット及びそれを用いるエタノール測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5692627B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103267758A (zh) * | 2013-05-17 | 2013-08-28 | 浙江东方基因生物制品有限公司 | 用于测试唾液中酒精含量的干化学法快速诊断试剂条及其制备方法 |
| CN114414514A (zh) * | 2022-01-20 | 2022-04-29 | 中山大学 | 一种锰类普鲁士蓝纳米酶的制备方法及其在酒精浓度检测中的应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH034799A (ja) * | 1989-06-02 | 1991-01-10 | Nok Corp | アルコール検出試験紙 |
| JPH05260994A (ja) * | 1991-11-15 | 1993-10-12 | Miles Inc | ペルオキシド−ペルオキシダーゼ試験系を使用する唾液中の被検体の検出法 |
| JP2002340838A (ja) * | 2001-05-15 | 2002-11-27 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | アルコール測定方法、並びにそれに用いる試薬系キット及びバイオセンサ |
-
2009
- 2009-12-15 JP JP2009283806A patent/JP5692627B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH034799A (ja) * | 1989-06-02 | 1991-01-10 | Nok Corp | アルコール検出試験紙 |
| JPH05260994A (ja) * | 1991-11-15 | 1993-10-12 | Miles Inc | ペルオキシド−ペルオキシダーゼ試験系を使用する唾液中の被検体の検出法 |
| JP2002340838A (ja) * | 2001-05-15 | 2002-11-27 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | アルコール測定方法、並びにそれに用いる試薬系キット及びバイオセンサ |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6014014235; Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ５６５, 2006, ｐ．２４０-２４９ * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103267758A (zh) * | 2013-05-17 | 2013-08-28 | 浙江东方基因生物制品有限公司 | 用于测试唾液中酒精含量的干化学法快速诊断试剂条及其制备方法 |
| CN103267758B (zh) * | 2013-05-17 | 2015-05-13 | 浙江东方基因生物制品有限公司 | 用于测试唾液中酒精含量的干化学法快速诊断试剂条及其制备方法 |
| CN114414514A (zh) * | 2022-01-20 | 2022-04-29 | 中山大学 | 一种锰类普鲁士蓝纳米酶的制备方法及其在酒精浓度检测中的应用 |
| CN114414514B (zh) * | 2022-01-20 | 2023-12-22 | 中山大学 | 一种锰类普鲁士蓝纳米酶的制备方法及其在酒精浓度检测中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5692627B2 (ja) | 2015-04-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ramos et al. | Enhanced chemiluminescence biosensor for the determination of phenolic compounds and hydrogen peroxide | |
| Moreira et al. | based enzymatic platform coupled to screen printed graphene-modified electrode for the fast neonatal screening of phenylketonuria | |
| Zhou et al. | An OliGreen-responsive fluorescence sensor for sensitive detection of organophosphorus pesticide based on its specific selectivity towards T-Hg2+-T DNA structure | |
| JP7186211B2 (ja) | 液体試料中の特定の分析物を検出するための装置および方法、並びに前記装置の使用 | |
| Mendez et al. | A fluorometric method for the determination of triglycerides in nanomolar quantities | |
| CN115611734B (zh) | 一种比率型多巴胺荧光探针及其通过动力学高选择测定多巴胺的应用 | |
| JP5692627B2 (ja) | エタノール測定用キット及びそれを用いるエタノール測定方法 | |
| Wang et al. | Ultrasensitive and rapid detection of organophosphates using a dual-signal naked-eye hydrogel sensor based on acetylcholinesterase inhibition | |
| CN110343740A (zh) | 一种高灵敏的乳酸测定方法及乳酸检测试剂盒 | |
| Li et al. | Immobilized enzymatic fluorescence capillary biosensor for determination of sulfated bile acid in urine | |
| US20100221699A1 (en) | Amine-n-oxide redox indicators for fluorimetric determination of analytes | |
| CN103630518B (zh) | 一种用硫化氢的荧光探针检测硫化氢合成酶活性的新方法及其应用 | |
| Svensson et al. | Investigation and evaluation of a method for determination of ethanol with the SIRE® Biosensor P100, using alcohol dehydrogenase as recognition element | |
| Li et al. | Determination of various alcohols based on a new immobilized enzyme fluorescence capillary analysis | |
| Yu et al. | Employment of bromophenol red and bovine serum albumin as luminol signal co-enhancer in chemiluminescent detection of sequence-specific DNA | |
| RU2401429C2 (ru) | Способ выявления различия между кровью и контрольным раствором, содержащими одинаковое анализируемое вещество | |
| CN107356544B (zh) | 一种脂肪酶检测试剂盒 | |
| CN109187465A (zh) | 一种用碳点催化h2o2-tmb反应产物荧光测定so32-的方法 | |
| Li et al. | A novel analysis method for lactate dehydrogenase activity in serum samples based on fluorescence capillary analysis | |
| US20090120808A1 (en) | Device for Detecting Methanol Concentration and the Method Thereof | |
| Kayamori et al. | Enzymatic method for assaying uric acid in serum with a new tetrazolium salt produces water-soluble formazan dye | |
| Demarche et al. | Dynamic measurement of oxidase activity based on oxygen consumption in open systems | |
| US20080064024A1 (en) | Methods and apparatus for enzyme inhibitors analysis | |
| JP6125423B2 (ja) | 油劣化の判定方法およびこれを用いる装置 | |
| JPH1118798A (ja) | コレステロールの定量方法及び定量用試薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20121030 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140402 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140530 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20141202 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20141210 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150122 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5692627 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |