JP2010142236A - 神経増殖因子の活性を調節するペプチド及び関連分子 - Google Patents
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Abstract
【課題】ＮＧＦ（神経増殖因子）が原因因子として関連している疾病又は疾患に対する治療薬又は予防薬として使用することができる生物学的に活性なペプチド及びポリペプチドを提供する。
【解決手段】ＮＧＦ活性を調節し、痛みを管理するのに有用な、ＮＧＦへの新規結合剤、または、ＮＧＦ結合ペプチド。１又は複数のＦｃドメインに連結された上記ペプチドを有する薬理学的に活性な修飾ポリペプチド。および、前記修飾ポリペプチドを含有する組成物の治療的有効量を投与することを含む、ＮＧＦ活性に関連する疾病又は疾患を治療又は予防する方法。
【選択図】なし
【解決手段】ＮＧＦ活性を調節し、痛みを管理するのに有用な、ＮＧＦへの新規結合剤、または、ＮＧＦ結合ペプチド。１又は複数のＦｃドメインに連結された上記ペプチドを有する薬理学的に活性な修飾ポリペプチド。および、前記修飾ポリペプチドを含有する組成物の治療的有効量を投与することを含む、ＮＧＦ活性に関連する疾病又は疾患を治療又は予防する方法。
【選択図】なし
Description
米国内だけで、２００万人を超える人々が、毎日、慢性的な痛みに苦しんでいる（Ｔ．Ｍ． Ｊｅｓｓｅｌｌ ＆ Ｄ．Ｄ． Ｋｅｌｌｙ， Ｐａｉｎ ａｎｄ Ａｎａｌｇｅｓｉａ ｉｎ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＯＦ ＮＥＵＲＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ， ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｅ．Ｒ． Ｋａｎｄｅｌ， Ｊ．Ｈ． Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｔ．Ｍ． Ｊｅｓｓｅｌｌ， ｅｄ．，（１９９１））。残念なことに、現在の痛みの治療は効果が不十分で、多くは衰弱的な副作用や危険な副作用も引き起こす。例えば、アスピリン、イブプロフェン、及びインドメタシンなどの非ステロイド性の抗炎症薬（「ＮＳＡＩＤ」）は、炎症性の痛みに対して適度な効果を示すが、これらは腎臓の毒素でもあり、高用量では、胃腸の炎症、潰瘍、出血、及び意識の混濁を引き起こす傾向がある。オピオイドによる治療を受けた患者は、意識の混濁を経験することが多く、長期にわたるオピオイドの使用は、耐性と依存性を伴う。リドカインやミクセリチンなどの局所麻酔薬は、同時に痛みを抑え、正常な感覚を喪失させる。
痛みとは、環境から受取られ、神経系によって伝達され、判断されるシグナルに基づく知覚である（総説として、Ｍｉｌｌａｎ， Ｍ． Ｊ． ， Ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｉｎ： ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｒｅｖｉｅｗ． Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ５７： １−１６４（１９９９）を参照）。熱や接触などの侵害刺激は、皮膚内の特殊な感覚受容体を誘発して、シグナルを中枢神経系（「ＣＮＳ」）に送る。このプロセスは、侵害受容と称されており、これを媒介する末梢感覚神経が侵害受容器である。侵害受容器からのシグナルの強度とＣＮＳによるこのシグナルの抽出及び精緻化に応じて、ヒトは侵害刺激を痛みとして認識する場合もあるし、認識しない場合もある。痛みの知覚が刺激の強度へと適切に較正されると、痛みは、その本来の保護的役割を果たす。しかし、ある種の組織損傷は、ヒトの痛みの閾値が低下しているために、比較的非侵害性の刺激が極めて強い痛みとして知覚されてしまう痛覚過敏又は侵害受容亢進として知られている現象を引き起こす。炎症及び神経損傷は何れも、痛覚過敏を誘発することができる。このため、日焼け、骨関節炎、大腸炎、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病（慢性関節リウマチ及び狼瘡を含む）などの炎症性症状に苦しむヒトは、しばしば、痛覚の亢進を経験する。同様に、外傷、手術、切断、膿瘍、灼熱痛、膠原血管病、脱髄疾患、三叉神経痛、癌、慢性アルコール依存症、発作、視床痛症候群、糖尿病、ヘルペス感染症、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素及び化学療法は、ひどい痛みをもたらす神経損傷を引き起こす。
正常な状態及び痛覚過敏の状態下で痛覚受容器が外部シグナルを伝達する機序についての理解が進んだため、痛覚閾値の低下を阻害し、これによって体験される痛みの量を低下させるために、痛覚過敏への関与が推定されるプロセスを標的とすることが可能である。
神経栄養因子は、生理的な痛みと病理的な痛みの伝達において重要な役割を果たすことが示されている。神経増殖因子（ＮＧＦ）は、特に重要であると思われる（総説として、ＭｃＭａｈｏｎ， Ｓ．Ｂ．， ＮＧＦ ａｓ ａ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐａｉｎ， Ｐｈｉｌ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ ３５１：４３１−４０ （１９９６）； ａｎｄ Ａｐｆｅｌ， Ｓ．Ｃ．， Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｐａｉｎ， Ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｉｎ １６： Ｓ７−ＳＬＬ （２０００）を参照）。ＮＧＦの局所投与及び全身投与は何れも、痛覚過敏と異痛症を引き起こすことが示されている（Ｌｅｗｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｎｄ ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＮＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ６： １９０３−１９１２ （１９９４））。ヒトにＮＧＦを静脈内注入すると全身的な筋肉痛が生じるのに対して、局所投与すると、全身的な効果に加えて、注射部位に痛覚過敏と異痛症が誘発される（Ａｐｆｅｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｎｅｒｖｅ， ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５１：６９５−７０２（１９９８））。痛みが主要な特徴である症状に内在性のＮＧＦが関与していることを示す一連の証拠も少なからず存在する。例えば、末梢神経傷害から少なくとも２ヵ月間にわたって、ＮＧＦはＤＲＧのシュワン細胞中で上方制御され、関節炎の様々なモデルに罹患した動物の関節中でレベルが増加することが報告されている（例えば、Ａｌｏｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｓｙｎｏｖｉｕｍ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｍｉｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ． Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ９： １４９−１５５（１９９３））。ヒトでは、リウマチ又はその他の種類の関節炎の患者から得た滑液中のＮＧＦレベルが上昇する（例えば、Ａｌｏｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ３５：３５１−３５５（１９９２））。さらに、ＮＧＦ機能を拮抗すると、神経障害性及び慢性炎症性の痛みのモデルで、痛覚過敏と異痛症が抑制されることが示されている。例えば、神経障害性の痛みのモデル（例えば、神経幹又は脊髄神経の結紮）では、ＮＧＦに対する中和抗体を全身注入すると、異痛症及び痛覚過敏がともに抑制される（Ｒａｍｅｒ， Ｍ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔ ｓｅｎｓｏｒｙ ｇａｎｇｌｉａ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｏｒ ｄｉｓｔａｌ ｐａｉｎｆｕｌ ｓｃｉａｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ａｎｔｉ−ＮＧＦ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １１：８３７−８４６（１９９９）； ａｎｄ Ｒｏ， Ｌ． Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＮＧＦ ａｎｄ ａｎｔｉ−ＮＧＦ ｏｎ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ ｉｎ ｒａｔｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｃｉａｔｉｃ ｎｅｒｖｅ． Ｐａｉｎ ７９： ２６５−２７４ （１９９９））。
Ｔ．Ｍ． Ｊｅｓｓｅｌｌ ＆ Ｄ．Ｄ． Ｋｅｌｌｙ， Ｐａｉｎ ａｎｄ Ａｎａｌｇｅｓｉａ ｉｎ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＯＦ ＮＥＵＲＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ， ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｅ．Ｒ． Ｋａｎｄｅｌ， Ｊ．Ｈ． Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｔ．Ｍ． Ｊｅｓｓｅｌｌ， ｅｄ．，（１９９１）
Ｍｉｌｌａｎ， Ｍ． Ｊ． ， Ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｉｎ： ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｒｅｖｉｅｗ． Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ５７： １−１６４（１９９９）
ＭｃＭａｈｏｎ， Ｓ．Ｂ．， ＮＧＦ ａｓ ａ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐａｉｎ， Ｐｈｉｌ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ ３５１：４３１−４０ （１９９６）
Ａｐｆｅｌ， Ｓ．Ｃ．， Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｐａｉｎ， Ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｉｎ １６： Ｓ７−ＳＬＬ （２０００）
Ｌｅｗｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｎｄ ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＮＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ６： １９０３−１９１２ （１９９４）
Ａｐｆｅｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｎｅｒｖｅ， ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ５１：６９５−７０２（１９９８）
Ａｌｏｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｓｙｎｏｖｉｕｍ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｍｉｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ． Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ９： １４９−１５５（１９９３）
Ａｌｏｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ３５：３５１−３５５（１９９２）
Ｒａｍｅｒ， Ｍ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔ ｓｅｎｓｏｒｙ ｇａｎｇｌｉａ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｏｒ ｄｉｓｔａｌ ｐａｉｎｆｕｌ ｓｃｉａｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ａｎｔｉ−ＮＧＦ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １１：８３７−８４６（１９９９）
Ｒｏ， Ｌ． Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＮＧＦ ａｎｄ ａｎｔｉ−ＮＧＦ ｏｎ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ ｉｎ ｒａｔｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｃｉａｔｉｃ ｎｅｒｖｅ． Ｐａｉｎ ７９： ２６５−２７４ （１９９９）
明らかに、痛みに対する安全で有効な新規治療が必要とされている。ＮＧＦ活性を調節し、痛みを管理するのに有用な、ＮＧＦへの新規結合剤を提供することが本発明の目的である。本発明のこのような結合剤は、ＮＧＦ結合ペプチド及びＮＧＦ結合修飾ペプチド（すなわち、抗体のＦｃ部分など他の分子に融合されたペプチドであり、このペプチド成分はＮＧＦに特異的に結合する。）の形態を採る。
本発明は、神経増殖因子（ＮＧＦ）に結合し、その活性を調節する新規物質に関する。
本発明において、ＮＧＦ活性の修飾物質は、以下の式：
ａ１ａ２ａ３Ｃａ５ａ６ａ７ａ８ａ９ａ１０ａ１１ＬＱＳＣａ１６ａ１７ａ１８（配列番号２７６）：
（式中、
ａ１、ａ２、ａ３、ａ５、ａ６、ａ８及びａ１８は、それぞれ独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり、
ａ７は、中性の疎水性アミノ酸残基又は極性の疎水性アミノ酸残基であり、
ａ９は、中性の疎水性アミノ酸残基又は極性の疎水性アミノ酸残基であり、
ａ１０は、中性の疎水性アミノ酸残基、中性の極性アミノ酸残基又は塩基性のアミノ酸残基であり、
ａ１１は、中性の疎水性アミノ酸残基、中性の極性アミノ酸残基又は塩基性のアミノ酸残基であり、
ａ１６は、中性の疎水性アミノ酸残基であり、
ａ１７は、中性の疎水性アミノ酸残基又は極性の疎水性アミノ酸残基である。）
のアミノ酸配列又は生理的に許容されるその塩を有する。
ａ１ａ２ａ３Ｃａ５ａ６ａ７ａ８ａ９ａ１０ａ１１ＬＱＳＣａ１６ａ１７ａ１８（配列番号２７６）：
（式中、
ａ１、ａ２、ａ３、ａ５、ａ６、ａ８及びａ１８は、それぞれ独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり、
ａ７は、中性の疎水性アミノ酸残基又は極性の疎水性アミノ酸残基であり、
ａ９は、中性の疎水性アミノ酸残基又は極性の疎水性アミノ酸残基であり、
ａ１０は、中性の疎水性アミノ酸残基、中性の極性アミノ酸残基又は塩基性のアミノ酸残基であり、
ａ１１は、中性の疎水性アミノ酸残基、中性の極性アミノ酸残基又は塩基性のアミノ酸残基であり、
ａ１６は、中性の疎水性アミノ酸残基であり、
ａ１７は、中性の疎水性アミノ酸残基又は極性の疎水性アミノ酸残基である。）
のアミノ酸配列又は生理的に許容されるその塩を有する。
式：ｂ１ｂ２ｂ３ＣＷｂ６ｂ７ｂ８ｂ９ＧＣｂ１２ｂ１３ｂ１４（配列番号：２７４）
（式中、
ｂ１、ｂ２、ｂ３、ｂ８、ｂ９、ｂ１３及びｂ１４は、それぞれ独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり、
ｂ６は、中性の疎水性アミノ酸残基であり、
ｂ７は、極性の疎水性アミノ酸残基であり、
ｂ１２は、中性の疎水性アミノ酸残基又は酸性のアミノ酸残基である。）
のアミノ酸配列又は生理的に許容されるその塩を有する、ＮＧＦ活性を調節するペプチドも本発明に属する。
（式中、
ｂ１、ｂ２、ｂ３、ｂ８、ｂ９、ｂ１３及びｂ１４は、それぞれ独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり、
ｂ６は、中性の疎水性アミノ酸残基であり、
ｂ７は、極性の疎水性アミノ酸残基であり、
ｂ１２は、中性の疎水性アミノ酸残基又は酸性のアミノ酸残基である。）
のアミノ酸配列又は生理的に許容されるその塩を有する、ＮＧＦ活性を調節するペプチドも本発明に属する。
さらに、式：
ｃ１ｃ２ＱＣｃ５ｃ６Ｓｃ８ｃ９ＧＣｃ１２ｃ１３ｃ１４ｃ１５ｃ１６
（式中、
ｃ１、ｃ５、ｃ８、ｃ９、ｃ１３及びｃ１４は、それぞれ独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり、
ｃ２は、中性の疎水性アミノ酸残基であり、
ｃ６は、中性の疎水性アミノ酸残基又は極性の疎水性アミノ酸残基であり、
ｃ１２は、中性の疎水性アミノ酸残基又は酸性のアミノ酸残基である。）
の化合物又は生理的に許容されるその塩も本発明に属する。
ｃ１ｃ２ＱＣｃ５ｃ６Ｓｃ８ｃ９ＧＣｃ１２ｃ１３ｃ１４ｃ１５ｃ１６
（式中、
ｃ１、ｃ５、ｃ８、ｃ９、ｃ１３及びｃ１４は、それぞれ独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり、
ｃ２は、中性の疎水性アミノ酸残基であり、
ｃ６は、中性の疎水性アミノ酸残基又は極性の疎水性アミノ酸残基であり、
ｃ１２は、中性の疎水性アミノ酸残基又は酸性のアミノ酸残基である。）
の化合物又は生理的に許容されるその塩も本発明に属する。
さらに、
式：
ｄ１ｄ２ｄ３ｄ４ｄ５ｄ６ｄ７ＰＰｄ１０ｄ１１ｄ１２ｄ１３ｄ１４ｄ１５Ｐｄ１７ｄ１８ｄ１９ｄ２０ｄ２１ｄ２２ｄ２３ｄ２４
（式中、
ｄ１は、Ｗ、Ｙ、Ｑ又はＥであり；
ｄ２は、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｓ又はＱであり；
ｄ３は、Ｗ、Ｆ、Ｇ、Ｓ又はＱであり；
ｄ４は、Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ又はＫであり；
ｄ５は、Ｖ、Ｗ、Ｇ又はＲであり；
ｄ６は、Ｍ、Ｓ、Ｙ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｋ又はＲであり；
ｄ７は、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｗ、Ｑ又はＨであり；
ｄ１０は、Ｄ又はＥであり；
ｄ１１は、Ｖ又はＩであり；
ｄ１２は、Ｖ、Ｌ、Ｆ又はＹであり、
ｄ１３は、Ｖ、Ｌ、Ｇ、Ｑ又はＥであり、
ｄ１４は、Ｑ、Ｄ又はＥであり；
ｄ１５は、Ｗ又はＣであり；
ｄ１７は、Ｗ、Ｙ又はＱであり；
ｄ１８は、Ｖ、Ｔ、Ｑ、Ｎ又はＫであり；
ｄ１９は、Ａ、Ｌ又はＰであり；
ｄ２０は、Ｐ、Ｑ、Ｒ又はＨであり、
ｄ２１は、Ｖ、Ｉ、Ｗ、Ｄであり、
ｄ２２は、Ａ、Ｉ、Ｓ、Ｑ又はＤであり；
ｄ２３は、Ｌであり又は存在しない、
ｄ２４は、Ｅであり又は存在しない。）
のアミノ酸配列又は生理的に許容されるその塩を有する、ＮＧＦ活性を調節するペプチドも本発明に属する。
式：
ｄ１ｄ２ｄ３ｄ４ｄ５ｄ６ｄ７ＰＰｄ１０ｄ１１ｄ１２ｄ１３ｄ１４ｄ１５Ｐｄ１７ｄ１８ｄ１９ｄ２０ｄ２１ｄ２２ｄ２３ｄ２４
（式中、
ｄ１は、Ｗ、Ｙ、Ｑ又はＥであり；
ｄ２は、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｓ又はＱであり；
ｄ３は、Ｗ、Ｆ、Ｇ、Ｓ又はＱであり；
ｄ４は、Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ又はＫであり；
ｄ５は、Ｖ、Ｗ、Ｇ又はＲであり；
ｄ６は、Ｍ、Ｓ、Ｙ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｋ又はＲであり；
ｄ７は、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｗ、Ｑ又はＨであり；
ｄ１０は、Ｄ又はＥであり；
ｄ１１は、Ｖ又はＩであり；
ｄ１２は、Ｖ、Ｌ、Ｆ又はＹであり、
ｄ１３は、Ｖ、Ｌ、Ｇ、Ｑ又はＥであり、
ｄ１４は、Ｑ、Ｄ又はＥであり；
ｄ１５は、Ｗ又はＣであり；
ｄ１７は、Ｗ、Ｙ又はＱであり；
ｄ１８は、Ｖ、Ｔ、Ｑ、Ｎ又はＫであり；
ｄ１９は、Ａ、Ｌ又はＰであり；
ｄ２０は、Ｐ、Ｑ、Ｒ又はＨであり、
ｄ２１は、Ｖ、Ｉ、Ｗ、Ｄであり、
ｄ２２は、Ａ、Ｉ、Ｓ、Ｑ又はＤであり；
ｄ２３は、Ｌであり又は存在しない、
ｄ２４は、Ｅであり又は存在しない。）
のアミノ酸配列又は生理的に許容されるその塩を有する、ＮＧＦ活性を調節するペプチドも本発明に属する。
本発明の別の側面は、式：
式：ｆ１ｆ２ｆ３ｆ４ｆ５ｆ６ｆ７ｆ８ｆ９ｆ１０ｆ１１Ｌｆ１３ＥＱＹＦｆ１８Ｌｆ２０ＰＰＧ２４ｆ２５ｆ２６
（式中、
ｆ１−ｆ６、ｆ８、ｆ９、ｆ１１、ｆ１８、ｆ２４、ｆ２５及びｆ２６は、それぞれ独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり、
ｆ７、ｆ１０及びｆ１３は、それぞれ独立に、中性の疎水性アミノ酸残基又は極性の疎水性アミノ酸残基であり、
ｆ２０は、Ｔ、Ｍ又はＩである。）
のアミノ酸配列又は生理的に許容されるその塩を有する、ＮＧＦ活性を調節するペプチドである。
式：ｆ１ｆ２ｆ３ｆ４ｆ５ｆ６ｆ７ｆ８ｆ９ｆ１０ｆ１１Ｌｆ１３ＥＱＹＦｆ１８Ｌｆ２０ＰＰＧ２４ｆ２５ｆ２６
（式中、
ｆ１−ｆ６、ｆ８、ｆ９、ｆ１１、ｆ１８、ｆ２４、ｆ２５及びｆ２６は、それぞれ独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり、
ｆ７、ｆ１０及びｆ１３は、それぞれ独立に、中性の疎水性アミノ酸残基又は極性の疎水性アミノ酸残基であり、
ｆ２０は、Ｔ、Ｍ又はＩである。）
のアミノ酸配列又は生理的に許容されるその塩を有する、ＮＧＦ活性を調節するペプチドである。
さらに、式：
ｈ１ｈ２ｈ３ｈ４ｈ５ｈ６ＬＧｈ９ｈ１０ｈ１１Ｌｈ１３ＹＦｈ１６Ｌｈ１８ＰＰＧｈ２２ｈ２３ｈ２４
（式中、
ｈ１−ｈ６、ｈ９、ｈ１１、ｈ２３、及びｈ２４は、それぞれ独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり、
ｈ１０及びｈ１３は、それぞれ独立に、中性の疎水性アミノ酸残基又は極性の疎水性アミノ酸残基であり、
ｈ１６は、極性の疎水性アミノ酸残基又は塩基性のアミノ酸残基であり、
ｈ１８は、中性の疎水性アミノ酸残基であり、
ｈ２２は、中性の極性アミノ酸残基である。）
のアミノ酸配列又は生理的に許容されるその塩を有する、ＮＧＦ活性を調節するペプチドも本発明に属する。
ｈ１ｈ２ｈ３ｈ４ｈ５ｈ６ＬＧｈ９ｈ１０ｈ１１Ｌｈ１３ＹＦｈ１６Ｌｈ１８ＰＰＧｈ２２ｈ２３ｈ２４
（式中、
ｈ１−ｈ６、ｈ９、ｈ１１、ｈ２３、及びｈ２４は、それぞれ独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり、
ｈ１０及びｈ１３は、それぞれ独立に、中性の疎水性アミノ酸残基又は極性の疎水性アミノ酸残基であり、
ｈ１６は、極性の疎水性アミノ酸残基又は塩基性のアミノ酸残基であり、
ｈ１８は、中性の疎水性アミノ酸残基であり、
ｈ２２は、中性の極性アミノ酸残基である。）
のアミノ酸配列又は生理的に許容されるその塩を有する、ＮＧＦ活性を調節するペプチドも本発明に属する。
本発明の別の側面には、
ｉ．配列番号１ないし配列番号５８、
ｉｉ．配列番号２０２ないし配列番号２８０、
ｉｉｉ．（ｉ）又は（ｉｉ）の類縁体、
ｉｖ．（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の誘導体、
ｖ．（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）の多量体、
ｖｉ．（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）又は（ｖ）の生理的に許容される塩、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＮＧＦ活性を阻害することができる、薬理学的に活性なペプチド（Ｐ）も含まれる。
ｉ．配列番号１ないし配列番号５８、
ｉｉ．配列番号２０２ないし配列番号２８０、
ｉｉｉ．（ｉ）又は（ｉｉ）の類縁体、
ｉｖ．（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の誘導体、
ｖ．（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）の多量体、
ｖｉ．（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）又は（ｖ）の生理的に許容される塩、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＮＧＦ活性を阻害することができる、薬理学的に活性なペプチド（Ｐ）も含まれる。
本発明の別の側面には、
式：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ
（式中、
Ｆ１は、ビヒクル（好ましくは、Ｆｃドメイン）であり、
Ｘ１とＸ２は、それぞれ独立に、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４から選択され、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、それぞれ独立に、リンカーであり、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ独立に、０又は１であり（但し、ａとｂのうち少なくとも１つは１である）、
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は、それぞれ独立に、
ｉ．配列番号１ないし配列番号５８、
ｉｉ．配列番号２０２ないし配列番号２８０、
ｉｉｉ．（ｉ）又は（ｉｉ）の類縁体、
ｉｖ．（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の誘導体、及び
ｖ．（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）の生理的に許容される塩、
からなる群から選択される薬理学的に活性なペプチドの配列である。）
の、ＮＧＦ活性を調節することができる修飾ペプチドが含まれる。
式：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ
（式中、
Ｆ１は、ビヒクル（好ましくは、Ｆｃドメイン）であり、
Ｘ１とＸ２は、それぞれ独立に、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４から選択され、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、それぞれ独立に、リンカーであり、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ独立に、０又は１であり（但し、ａとｂのうち少なくとも１つは１である）、
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は、それぞれ独立に、
ｉ．配列番号１ないし配列番号５８、
ｉｉ．配列番号２０２ないし配列番号２８０、
ｉｉｉ．（ｉ）又は（ｉｉ）の類縁体、
ｉｖ．（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の誘導体、及び
ｖ．（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）の生理的に許容される塩、
からなる群から選択される薬理学的に活性なペプチドの配列である。）
の、ＮＧＦ活性を調節することができる修飾ペプチドが含まれる。
本発明のペプチド及び修飾ペプチドは、標準的な合成法、組換えＤＮＡ技術又はペプチド及び融合タンパク質を調製する他のあらゆる方法によって調製し得る。
非ペプチド部分を含む本発明の修飾ペプチドは、適用可能な場合、標準的なペプチド化学反応に加え、標準的な有機化学反応によって合成し得る。
本発明のペプチド及び修飾ペプチドは、神経障害又は炎症に起因する慢性的な疼痛状態の処置に関して治療的な価値があり、偏頭痛、喘息、急迫性尿失禁（すなわち、過活動膀胱）、乾癬、及び癌（特に、膵臓癌及び悪性黒色腫）など（これらに限定されない）、ＮＧＦが原因因子として関連する他の疾病を治療するために使用することもできる。
本発明のペプチド及び修飾ペプチドは、適切な医薬担体物質と調合し、これを必要としているヒト（又は他の哺乳動物）などの患者に有効量を投与することによって、治療又は予防の目的で使用することもできる。
その他の有用なペプチド及び修飾ペプチドは、本発明に開示されているペプチド及び修飾ペプチドのアミノ酸を保存的に修飾することによって得ることができる。保存的な修飾は、このような修飾が加えられたペプチド又は修飾ペプチドと同様の機能的、物理的、科学的特性を有するペプチド及び修飾ペプチドを与えるであろう。
本発明のさらなる側面及び利点は、以下に記載されている発明の詳細な説明を検討することによって明らかとなるであろう。
本明細書を通じて用いられる用語は、特定の事例において特段の断りがなければ、以下のように定義される。
アミノ酸残基は、アミノ酸の完全な表記、以下の図に記されている標準的な３文字コード又は標準的な一文字コードという３通りに表記される。
「含む」という用語は、ペプチド又は修飾ペプチドが、当該配列のＮ末端又はＣ末端の一方又は双方にアミノ酸がさらに付加されてもよいことを意味する。もちろん、付加されるこれらのアミノ酸は、ペプチド又は修飾ペプチドの活性を著しく妨害してはならない。
修飾は、主として、治療用ペプチド及びタンパク質がタンパク分解酵素に曝露されるのを遮断して、治療用分子の安定性、循環時間及び生物学的活性を増加させることによって、治療用ペプチド及びタンパク質を保護することができる。タンパク質の修飾と融合タンパク質について記載する総説は、「Ｆｒａｎｃｉｓ， Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｖｏｌｕｍｅ ３， ｐａｇｅｓ ４−１０， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｍｅｄｉｓｃｒｉｐｔ， Ｌｏｎｄｏｎ （１９９２）」であり、参照により本明細書に組込まれる。
１つの有用なタンパク質修飾は、抗体の「Ｆｃ」ドメインと組み合わせることである。抗体は、「Ｆａｂ」として知られ、抗原を結合する可変ドメインと、「Ｆｃ」として知られ、補体活性化及び食細胞による攻撃といったエフェクター機能に関連する定常ドメインという機能的に独立な２つの部分を備えている。Ｆｃドメインの血清半減期は長いが、Ｆａｂの血清半減期は短い。Ｃａｐｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌｕｍｅ ３３７， ｐａｇｅｓ ５２５−３１ （１９８９）。治療用タンパク質とともに構築されると、Ｆｃドメインは、半減期を長期化させ、あるいは、Ｆｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体結合などの機能を取り込ませることができ、胎盤通過などの機能さえ取り込ませ得ることがある。
本明細書において使用される「ネイティブＦｃ」という用語は、完全な抗体を化学的又は酵素的に消化することによって得られる抗原非結合性断片の配列を有する分子又は配列を表す。ネイティブＦｃの取得源となる元の免疫グロブリンは、ヒト由来のものであることが好ましく、任意の免疫グロブリンであり得るが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましい。ネイティブＦｃドメインは、共有（すなわち、ジスルフィド結合）及び非共有結合によって連結され、二量体又は多量体の形態を与えることができる単量体ポリペプチドから構成される。ネイティブＦｃ分子のモノマーサブユニット間に存在する分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に応じて、１ないし４の範囲にわたる。ネイティブＦｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から得られるジスルフィド結合された二量体である。「Ｅｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， Ｖｏｌｕｍｅ １０， ｐａｇｅｓ ４０７１−４０７９（１９８２）」を参照されたい。
「Ｆｃバリアント」という用語は、ネイティブＦｃから修飾されているが、サルベージ受容体（ｓａｌｖａｇｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であるＦｃＲｎに対する結合部位をなお有している分子又は配列を表す。国際出願公開ＷＯ ９７／３４６３１及びＷＯ ９６／３２４７８は、Ｆｃバリアントの一例及びサルベージ受容体との相互作用について記載しており、参照により本明細書に組込まれる。このように、「Ｆｃバリアント」という用語には、ヒト以外のネイティブＦｃからヒト化された分子又は配列が含まれる。さらに、ネイティブＦｃは、本発明の融合分子に不要な構造的機能又は生物学的活性を与えるという理由により、除去できる部位を有している。このように、「Ｆｃバリアント」という用語には、（１）ジスルフィド結合の形成、（２）特定の宿主細胞との不適合性、（３）特定の宿主細胞で発現した際のＮ末端の不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合又は（７）抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ；ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、に影響を与え又は関与する１又は複数のネイティブＦｃ部位又は残基が欠如した分子又は配列が含まれる。Ｆｃバリアントは、以下でさらに詳述されている。
「Ｆｃドメイン」という用語及び「Ｆｃ」という用語には、上記定義のとおり、ネイティブＦｃとＦｃバリアントの分子及び配列が包含されるものとする。
公開された国際特許出願ＷＯ ００／２４７８２は、生物学的に活性なペプチドに連結されたＦｃ抗体ドメインを有する融合タンパク質及び薬剤としてのそれらの使用を記載している。Ｆｃドメインをペプチドに連結させると、このような連結を行わなければインビボで急速に分解されるペプチドの半減期を増加することが開示されている。ペプチドは、ファージディスプレイ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング又は化学的ペプチドスクリーニングによって選択することができる。具体的な例としては、とりわけ、ＴＰＯ（巨核球増殖及び分化因子）のペプチド模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）並びにＴＮＦ−α、ＩＬ−１及びＶＥＧＦのペプチド阻害剤から作製されるＦｃ融合生成物がある。
「誘導体化する」及び「誘導体」又は「誘導体化された」という用語には、それぞれ、（１）ペプチド又は修飾ペプチドが、環状部分、例えば修飾ペプチド内にシステイン残基間の架橋、を有する；（２）ペプチド又は修飾ペプチドが、架橋され又は架橋部位を有する、例えばペプチド又は修飾ペプチドがシステイン残基を有しており、このため、培養時に又はインビボで架橋された二量体を形成する；（３）１又は複数のペプチド結合が非ペプチド結合に置換されている；（４）Ｎ末端が−ＮＲＲ１、ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ、スクシンイミド基又は置換された若しくは置換されていないベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（式中、Ｒ及びＲ１及び環置換基は、以下に定義されているとおりである。）；（５）Ｃ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ２又は−ＮＲ３Ｒ４に置換されている（式中、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、以下に定義されているとおりである。）；（６）選択した側鎖又は末端残基と反応することができる物質を用いた処理によって各アミノ酸成分が修飾されている、ペプチド又は修飾ペプチドを与える方法及び得られたペプチド又は修飾ペプチドが含まれる。誘導体は、本明細書の以下にさらに記載されている。
「ＮＧＦ」という用語は、神経増殖因子を意味する。
タンパク質リガンドとその受容体との相互作用は、比較的大きな接触部分で起こることが多い。しかし、ヒト成長ホルモンとその受容体について示されたところによれば、接触部分に位置する数個の重要な残基のみが結合エネルギーの大部分に寄与している。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌｕｍｅ ２６７， ｐａｇｅｓ ３８３−３８６（１９９５）。タンパク質リガンドの大部分は、単に、結合エピトープを正しいトポロジーで提示するか、結合とは無関係の機能を果たしているにすぎない。このため、「ペプチド」長のみを有する分子が、ある巨大なタンパク質リガンドの受容体分子に結合することが可能である。このようなペプチドは、巨大なタンパク質リガンド（「ペプチドアゴニスト」）の生物活性を模倣し又は、拮抗的な結合を通じて、巨大タンパク質リガンド（「ペプチドアンタゴニスト」）の生物活性を阻害し得る。
本明細書において一般的に使用される「ペプチド」という用語は、５ないし５０個のアミノ酸の分子を表し、５ないし２０個のアミノ酸の分子が好ましく、６ないし１５個のアミノ酸の分子が最も好ましい。
ファージディスプレイペプチドライブラリーは、ペプチドアゴニスト及びペプチドアンタゴニストを同定する強力な方法として登場した。例えば、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌｕｍｅ ２４９， ｐａｇｅ ３８６（１９９０）； Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌｕｍｅ ２４９， ｐａｇｅ ４０４ （１９９０）；１９９３年６月２９日に付与された米国特許第５，２２３，４０９号；１９９８年３月３１日に付与された米国特許第５，７３３，７３１号；１９９６年３月１２日に付与された米国特許第５，４９８，５３０号；１９９５年７月１１日に付与された米国特許第５，４３２，０１８号；１９９４年８月１６日に付与された米国特許第５，３３８，６６５号；１９９９年７月１３日に付与された米国特許第５，９２２，５４５号；１９９６年１２月１９日に公開されたＷＯ ９６／４０９８７；１９９８年４月１６日に公開されたＷＯ ９８／１５８３３を参照されたい（それぞれ、参考文献として本明細書に援用する）。このようなライブラリーでは、繊維状ファージのコートタンパク質との融合によって、ランダムなペプチド配列がディスプレイされている。典型的には、ディスプレイされたペプチドは、抗体が固定された受容体の細胞外ドメインに対してアフィニティー溶出される。保持されたファージは、アフィニティー精製と再増殖を連続的に繰り返すことによって濃縮することができる。最も優れた結合ペプチドの配列を決定して、１又は複数の構造的に関連したペプチドのファミリー内で重要な残基を同定することができる。例えば、２つの別個のファミリーが同定されたＣｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌｕｍｅ ２７６， ｐａｇｅｓ １６９６−１６９９（１９９７）を参照されたい。ペプチド配列は、アラニンスキャニング又はＤＮＡレベルでの突然変異誘発によって、何れの残基を安全に置換できるかについても示唆し得る。最も優れた結合物質の配列をさらに最適化するために、突然変異誘発ライブラリーを作製して、スクリーニングすることもできる。Ｌｏｗｍａｎ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ．， Ｖｏｌｕｍｅ ２６， ｐａｇｅｓ ４０１−４２４（１９９７）。
タンパク質−タンパク質相互作用の構造解析は、巨大なタンパク質リガンドの結合活性を模倣するペプチドを推測するために使用することもできる。このような分析では、そこからペプチドをデザインすることができる巨大なタンパク質リガンドの不可欠な残基の正体と相対的な配向性が、結晶構造から示唆され得る。例えば、Ｔａｋａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｖｏｌｕｍｅ １５， ｐａｇｅｓ １２６６−１２７０ （１９９７）を参照されたい。これらの分析法は、受容体タンパク質とファージディスプレイによって選択されたペプチドとの相互作用を調べるために使用される場合もあり、これにより、結合親和性を増加させるためにペプチドのさらなる修飾が推定され得る。
ペプチドの研究では、ファージディスプレイと同等の他の方法が存在する。ペプチドライブラリーは、ｌａｃレプレッサーのカルボキシ末端に融合して、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させることができる。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を利用した別の方法は、ペプチドグリカン結合リポタンパク質（ＰＡＬ；ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）との融合によって、細胞の外膜上へのディスプレイを可能とする。以降、これらの方法及び関連する方法を「Ｅ．コリディスプレイ」と総称する。別の方法では、ランダムＲＮＡの翻訳がリボソーム放出の前に停止され、それらに随伴するＲＮＡがまだ付着した状態のポリペプチドのライブラリーが得られる。以降、この方法及び関連する方法を「リボソームディスプレイ」と総称する。さらに別の方法では、ペプチドのＲＮＡへの化学的結合を使用する。例えば、「Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， Ｖｏｌｕｍｅ ９４， ｐａｇｅｓ １２２９７−１２３０３（１９９７）」を参照されたい。以降、これらの方法及び関連する方法を「ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング」と総称する。ポリエチレンの棒又は溶媒透過性の樹脂などの安定な非生体物質上にペプチドが固定化されている、化学的に生成されたペプチドライブラリーも開発されている。化学的に生成された別のペプチドライブラリーは、ガラススライド上に固定化されたペプチドをスキャンするためにフォトリソグラフィーを使用する。以降、これらの方法及び関連する方法を「化学的−ペプチドスクリーニング」と総称する。化学的−ペプチドスクリーニングは、Ｄアミノ酸や他の非天然類縁体、並びに非ペプチド要素が使用できる点で、有利な場合がある。生物学的な方法及び化学的な方法は何れも、「Ｗｅｌｌｓ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， Ｖｏｌｕｍｅ ３， ｐａｇｅｓ ３５５−３６２（１９９２）」に総説されている。
理論的には、ファージディスプレイや上述した他の方法を用いて、任意のタンパク質のペプチド模倣体を発見することができる。これらの方法は、エピトープマッピング、タンパク質−タンパク質相互作用に不可欠なアミノ酸の同定に使用されてきた他、新規治療薬を発見するための第一歩として使用されてきた。例えば、「Ｃｏｒｔｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｖｏｌｕｍｅ ７， ｐａｇｅｓ ６１６−６２１（１９９６）」を参照されたい。ペプチドライブラリーは、現在、エピトープマッピングなどの免疫学的研究において最も頻繁に使用されている。Ｋｒｅｅｇｅｒ， Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ， Ｖｏｌｕｍｅ １０， Ｎｕｍｂｅｒ １３， ｐａｇｅｓ １９−２０ （１９９６）。ペプチドは、多くの場合、治療剤そのものというより、治療剤を開発する際の「リード化合物」とみなされている。他の多くのタンパク質と同様、それらは、腎臓によるろ過、細網内皮系の細胞によるクリアランス機構又はタンパク分解によって、インビボで迅速に除去されるであろう。「Ｆｒａｎｃｉｓ， Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ， Ｖｏｌｕｍｅ ３， ｐａｇｅｓ ４−１１ （１９９２）」を参照されたい。その結果、同定されたペプチドは、薬物標的を確認するために又は、化学的ライブラリースクリーニングでは容易に若しくは迅速に同定されない可能性がある有機的修飾ペプチドを設計するための足がかりとして使用されることが多い。Ｌｏｗｍａｎ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ． ， Ｖｏｌｕｍｅ ２６， ｐａｇｅｓ ４０１−４２４ （１９９７）； Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ． Ｔｏｄａｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ３， ｐａｇｅｓ ３７０−３７８ （１９９８）。
「薬理学的に活性な」という用語は、このように記載される物質が、医学的パラメータ又は病状（例えば、痛み）に影響を与える活性を有することが実証されていることを意味する。本発明において、この用語は、典型的には、ＮＧＦによって誘導され又はＮＧＦによって媒介される疾病又は異常な医学的症状又は疾患を表し、より具体的には、痛みの拮抗を表す。
「アンタゴニスト」及び「阻害剤」という用語は、当該関連するタンパク質の生物活性を遮断し又は何らかの方法で妨害する分子を表す。本発明の好ましい「アンタゴニスト」又は「阻害剤」は、ＮＧＦ活性のインビトロアッセイにおいて、２０ｎＭ以下のＩＣ５０で、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦを阻害する分子である。本発明のさらに好ましい「アンタゴニスト」又は「阻害剤」は、ＮＧＦ活性のインビトロアッセイにおいて、１ｎＭ以下のＩＣ５０で、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦを阻害する分子である。最も本発明の好ましい「アンタゴニスト」又は「阻害剤」は、ＮＧＦ活性のインビトロアッセイにおいて、２０ｎＭ以下のＩＣ５０で、ＮＧＦに結合してＮＧＦを阻害し、且つ少なくとも１つの一般的に受容されている神経の痛みのインビボ動物モデルで測定した場合に、痛みを抑制し、軽減し又は消失させる分子である。
さらに、本発明の修飾ペプチドの生理的に許容される塩も本発明に包含される。「生理的に許容される塩」とは、薬剤として許容される（すなわち、温血動物の治療に有用である）ことが知られた又は後に見出された任意の塩を意味する。
幾つかの具体例としては、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、塩化水素及び臭化水素などのハロゲン化水素、硫酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、及びシュウ酸塩がある。
修飾ペプチドの構造
総説。 本発明の修飾ペプチドに関しては、ペプチド部分は、ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端を介してビヒクル（すなわち、Ｆｃドメイン）に付着させることができる。このため、得られるビヒクル−ペプチド複合物は、以下の式によって記載することができる。
総説。 本発明の修飾ペプチドに関しては、ペプチド部分は、ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端を介してビヒクル（すなわち、Ｆｃドメイン）に付着させることができる。このため、得られるビヒクル−ペプチド複合物は、以下の式によって記載することができる。
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ （Ｉ）
（式中、
Ｆ１は、ビヒクル（好ましくは、Ｆｃドメイン）であり、
Ｘ１とＸ２は、それぞれ独立に、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４から選択され、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、それぞれ独立に、リンカーであり、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ独立に、０又は１であり（但し、ａとｂのうち少なくとも１つは１である）、
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は、それぞれ独立に、
ｉ．配列番号１ないし配列番号５８（配列番号１及び配列番号５８を含む）、
ｉｉ．配列番号２０２ないし配列番号２８０（配列番号２０２及び配列番号２８０を含む）、
ｉｉｉ．（ｉ）又は（ｉｉ）の類縁体、及び
ｉｖ．（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の誘導体
からなる群から選択される薬理学的に活性なペプチドである。）
（式中、
Ｆ１は、ビヒクル（好ましくは、Ｆｃドメイン）であり、
Ｘ１とＸ２は、それぞれ独立に、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４から選択され、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、それぞれ独立に、リンカーであり、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ独立に、０又は１であり（但し、ａとｂのうち少なくとも１つは１である）、
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は、それぞれ独立に、
ｉ．配列番号１ないし配列番号５８（配列番号１及び配列番号５８を含む）、
ｉｉ．配列番号２０２ないし配列番号２８０（配列番号２０２及び配列番号２８０を含む）、
ｉｉｉ．（ｉ）又は（ｉｉ）の類縁体、及び
ｉｖ．（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の誘導体
からなる群から選択される薬理学的に活性なペプチドである。）
式Ｉの修飾ペプチドは、式：
Ｘ１−Ｆ１ （ＩＩ）
（式中、Ｆ１はＦｃドメインであり、Ｘ１のＣ末端に付着している。）、
Ｆ１−Ｘ２ （ＩＩＩ）
（式中、Ｆ１はＦｃドメインであり、Ｘ２のＮ末端に付着している。）、及び
Ｆ１−（Ｌ）ｃ−Ｐ （ＩＶ）
（式中、Ｆ１はＦｃドメインであり、−（Ｌ）ｃ−ＰのＮ末端に付着している。）
の好ましい実施形態を含む。
Ｘ１−Ｆ１ （ＩＩ）
（式中、Ｆ１はＦｃドメインであり、Ｘ１のＣ末端に付着している。）、
Ｆ１−Ｘ２ （ＩＩＩ）
（式中、Ｆ１はＦｃドメインであり、Ｘ２のＮ末端に付着している。）、及び
Ｆ１−（Ｌ）ｃ−Ｐ （ＩＶ）
（式中、Ｆ１はＦｃドメインであり、−（Ｌ）ｃ−ＰのＮ末端に付着している。）
の好ましい実施形態を含む。
ペプチド（Ｐ）及び式（Ｉ）−（ＩＶ）によって表される修飾ペプチドに加えて、インビトロ及び／又はインビボでの抗ＮＧＦ活性が実質的に等しい、このようなペプチド及び修飾ペプチドの断片（すなわち、「サブシーケンス（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）」）、類縁体、及び誘導体も本発明の一部を構成するものとし、本明細書に開示されているペプチド（Ｐ）のうち任意のものの単量体又は多量体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
「類縁体」という用語は、ペプチド（Ｐ）又は（Ｉ）−（ＩＶ）で記された修飾ペプチドのアミノ酸配列の直線配列から得られた１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を表し、且つ本明細書に具体的に開示されている少なくとも１つの類似ペプチド又は修飾ペプチドに比べて、インビトロ及び／又はインビボ抗ＮＧＦ活性が実質的に等しい分子を意味するものとする。
本発明において、「実質的に相同な」配列とは、本分野で一般的に利用されている（例えば、ＧＡＰプログラム）及び／又は本明細書中に論述されている何れかのアラインメント法によって測定した場合に、Ｐ領域外では配列の相違がさらに顕著であるとしても、少なくとも１０アミノ酸を有するＰの何れかの領域にわたっては、少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一である。
％配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸の位置の類似性を比較して、２つの各配列の最適なアラインメントを与えるために一般的に使用される標準的な方法によって決定することができる。このような方法には、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ． Ｍ．， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ １， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ． Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ． Ｇ．， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１； ａｎｄ Ｃａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．， ４８：１０７３ （１９８８）」に記載されている方法が含まれるが、これらに限定されるものではない。同一性と類似性を決定する方法も、公開されて入手可能なコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性と類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法としては、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．， １２： ３８７ （１９８４）； Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５： ４０３−４１０ （１９９０））などのＧＣＧプログラムパッケージが含まれるが、これらに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）やその他の入手先（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ， Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ ２０８９４； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ）から公開されており、入手することができる。同一性を決定するために、周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用することもできる。
２つのアミノ酸配列を並列させるためのアラインメントスキームの中には、２つの配列の極めて短い領域のみをマッチングさせることがあり得るが、この並列された小さな領域は、２つの完全長の配列間に有意な関係が存在しない場合でも、極めて高い配列同一性を与えることがある。同一性及び／又は類似性を決定するための好ましい方法は、調べる配列間で最も大きな合致度を与えるように設計されている。例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いると、各アミノ酸の合致度が最適となるように（このアルゴリズムによって決定される、「合致したスパン（ｍａｔｃｈｅｄ ｓｐａｎ）」）、％配列同一性を決定すべき２つのポリペプチドが並列される。ギャップオープニングペナルティー（平均ダイアゴナルの３倍として計算される。「平均ダイアゴナル」とは、使用している比較マトリックスのダイアゴナルの平均であり、「ダイアゴナル」とは、ある比較マトリックスが、各アミノ酸の完全な合致に対して与えるスコア又は数である）及びギャップ伸長ペナルティー（通常、ギャップオープニングペナルティーの１／１０）、並びにＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ ６２などの比較マトリックスが、前記アルゴリズムとともに使用される。標準的な比較マトリックス（ＰＡＭ ２５０比較マトリックスについては、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｖｏｌ． ５， ｓｕｐｐ． ３ （１９７８）を参照；ＢＬＯＳＵＭ ６２比較マトリックスについては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ． ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ， ８９ ： １０９１５−１０９１９（１９９２）を参照）も、前記アルゴリズムによって使用される。ポリペプチド配列を比較するための好ましいパラメータとしては、以下のものが含まれる。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４８：４４３−４５３（１９７０）；
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）に記載のＢＬＯＳＵＭ ６２；
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長ペナルティー：４
類似度の閾値：０
ＧＰＡプログラムは、上記パラメータを用いると有用である。上記パラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを用いたポリペプチド比較（エンドギャップに対するペナルティーは与えない）の初期設定パラメータである。
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）に記載のＢＬＯＳＵＭ ６２；
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長ペナルティー：４
類似度の閾値：０
ＧＰＡプログラムは、上記パラメータを用いると有用である。上記パラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを用いたポリペプチド比較（エンドギャップに対するペナルティーは与えない）の初期設定パラメータである。
核酸分子配列を比較するための好ましいパラメータには、以下のものが含まれる。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．， ４８：４４３−４５３（１９７０）；
比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップ長ペナルティー：３
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．， ４８：４４３−４５３（１９７０）；
比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップ長ペナルティー：３
ＧＡＰプログラムは、上記パラメータを用いても有用である。上記パラメータは、核酸分子を比較するための初期設定パラメータである。
Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ９， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ， １９９７に記載されているものなどの、その他の典型的なアルゴリズム、ギャップオープニングペナルティー、ギャップ伸長ペナルティー、比較マトリックス、類似度の閾値などを使用してもよい。具体的に行うべき選択は当業者にとって自明であり、ＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク質対タンパク質、タンパク質対ＤＮＡなどの具体的に行われる比較や、さらに、実際の配列対の間で比較が行われるか（このケースでは、ＧＡＰ又はＢｅｓｔＦｉｔが一般に好ましい）、ある配列と巨大な配列データベースとの間で比較が行われるか（このケースでは、ＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴＡが好ましい）どうかに依存するであろう。
ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの公知のコンピュータプログラムを用いると、（一方若しくは両方の配列の全長に沿って又は一方若しくは両方の配列の所定の部分に沿って）それぞれのアミノ酸の合致度が最適になるように２つのポリペプチドが並列される。前記プログラムは、「初期設定」オープニングペナルティーと「初期設定」ギャップペナルティー、及びＰＡＭ２５０などのスコアリングマトリックスを与える。標準的なスコアリングマトリックスは、コンピュータプログラムとともに使用することができる。Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｖｏｌｕｍｅ ５， ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３ （１９７８）を参照。次いで、％同一性を以下のように計算することができる。
本発明の類縁体ポリペプチドは、典型的には、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を有するであろう。一般に、保存的なアミノ酸の変化は、ポリペプチドの構造及び／又は機能を擾乱する可能性が最も少なく、あるアミノ酸を構造及び／又は機能が似通った別のアミノ酸（例えば、サイズ、電荷及び／又は形状が類似した側鎖を有するアミノ酸）に置換するのが一般的であると認められている。これらの置換の性質は、当業者に周知であり、典型的なアミノ酸置換が表１と２にまとめられている。
所望のアミノ酸置換（保存的であると、非保存的であると否とを問わない）は、このような置換が望ましい場合に、当業者によって決定することができる。例えば、ペプチド配列の重要な残基を同定し又は本明細書に記載されているペプチド若しくはビヒクル−ペプチド分子（先述した式を参照）の親和性を増加若しくは減少させるために、アミノ酸置換を使用することができる。
一部の実施形態では、保存的なアミノ酸置換に、生物系内での合成ではなく化学的なペプチド合成によって通例取り込まれる非天然アミノ酸残基も包含される。
前節に記したように、天然の残基は、配列の修飾に有用であり得る共通な側鎖特性に基づいてクラスに分割することができる。例えば、非保存的置換では、これらのクラスの１つに属するメンバーを、別のクラスに属するメンバーと交換することがある。このような置換された残基は、ヒトでない相同分子種と相同なペプチドの領域中や、あるいは前記分子の非相同領域中に導入することができる。さらに、鎖の配向性に影響を与える目的で、Ｐ又はＧを用いた修飾を施すこともできる。
このような修飾を施す場合には、アミノ酸のヒドロパシー指標を検討することがある。各アミノ酸には、それらの疎水性と電荷特性に基づいて、以下のように、ヒドロパシー指標が割り振られる。これらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。
タンパク質に対して相互作用的な生物機能を付与する上でのヒドロパシーアミノ酸指標の重要性は、本分野において理解されている。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５７：１０５−１３１（１９８２）。ある種のアミノ酸は、類似のヒドロパシー指標又はスコアを有する他のアミノ酸と置換することができ、類似の生物活性をなお保持し得ることが知られている。ヒドロパシー指標に基づいて変化を与える際には、そのヒドロパシー指標が±２以内にあるアミノ酸の置換が好ましく、ヒドロパシー指標が±１以内にあるアミノ酸の置換が特に好ましく、ヒドロパシー指標が±０．５以内にあるアミノ酸の置換がさらにとりわけ好ましい。
親水性に基づいて、類似のアミノ酸の置換を効果的に行うことができることも、本分野において理解されている。その隣接するアミノ酸の親水性によって支配される、タンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性及び抗原性と相関する、すなわち、タンパク質の生物特性と相関する。
以下の親水性値が、アミノ酸残基に割り振られている。アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変化を与える際には、その親水性値が±２以内にあるアミノ酸の置換が好ましく、親水性値が±１以内にあるアミノ酸の置換が特に好ましく、親水性値が±０．５以内にあるアミノ酸の置換がさらにとりわけ好ましい。親水性を基礎として、一次アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。これらの領域は、「エピトープのコア領域（ｅｐｉｔｏｐｉｃ ｃｏｒｅ ｒｅｇｉｏｎｓ）」とも称される。
当業者であれば、周知の技術を用いて、本明細書に記載されているペプチド及び修飾ペプチドの適切な類縁体を決定することが可能であろう。活性を破壊せずに変化させ得る分子の適切な領域を同定するために、当業者は、活性に重要でないと思われている領域を標的とすることができる。このような他の類似のペプチドに対して保存されていないペプチドの領域中の変化は、ペプチドの生物活性及び／又は構造に悪影響を与える可能性がより低いと思われることが理解されるであろう。当業者であれば、比較的保存された領域でさえ、活性を保持しながら、天然の残基を化学的に類似のアミノ酸に置換し得ること（保存的アミノ酸残基の置換）も知悉しているであろう。従って、生物活性又は構造にとって重要な可能性がある領域でさえ、生物活性を破壊せずに又はペプチド構造に悪影響を与えずに、保存的アミノ酸置換を行えることがある。
さらに、当業者であれば、構造−機能研究を吟味して、活性又は構造にとって重要である類似ペプチドの残基を同定することができる。このような比較に照らして、類似ペプチド中の活性又は構造にとって重要なアミノ酸残基に対応するペプチド中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者であれば、本発明のペプチド又は修飾ペプチドの、このような予測された重要なアミノ酸残基に対して、化学的に類似のアミノ酸置換を選択することができるであろう。
当業者であれば、類似のペプチド又はポリペプチド中のその構造に関して、三次元構造やアミノ酸配列を分析することも可能である。その情報に照らして、当業者であれば、その三次元構造について、ペプチド又はポリペプチドのアミノ酸残基のアラインメントを予想し得るであろう。当業者であれば、タンパク質の表面上に存在すると予測されたアミノ酸残基に対して大きな変化を与えないことを選択するであろう。このような残基は、他の分子との重要な相互作用に関わっている可能性があるからである。さらに、当業者であれば、各所望のアミノ酸残基に単一のアミノ酸置換を含有する試験類縁体を作製することができるであろう。次いで、前記類縁体は、当業者に公知の活性アッセイを用いてスクリーニングすることができる。このようなデータは、適切な類縁体についての情報を集めるために使用することができる。例えば、あるアミノ酸残基に対する変化が、活性を破壊し、望ましくない程度まで活性を減少させ又は不適切な活性を生ぜしめることが発見された場合には、このような変化を有する類縁体は回避されるであろう。換言すれば、このような定型的な実験から集められた情報に基づいて、当業者は、単独で使用した場合又は他の変異と併用した場合にさらなる置換を回避すべきであるアミノ酸を容易に決定することができる。
数多くの科学的著作が、二次構造を予測するために力を注いできた。「Ｍｏｕｌｔ Ｊ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ７（４）：４２２−４２７（１９９６）， Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １３（２）：２２２−２４５（１９７４）； Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １１３（２）：２１１−２２２（１９７４）； Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． Ｒｅｌａｔ． Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４７：４５−１４８（１９７８）； Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４７：２５１−２７６及びＣｈｏｕ ｅｔ ａｌ． ， Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ．， ２６： ３６７−３８４（１９７９）」を参照されたい。
さらに、現在では、二次構造の予測を補助するために、コンピュータプログラムを利用することができる。二次構造を予測する１つの方法は、相同性モデリングに基づいている。例えば、３０％を超える配列同一性又は４０％を超える類似性を有する２つのポリペプチド又はタンパク質は、類似の構造的トポロジーを有することが多い。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の充実により、ポリペプチド又はタンパク質の構造内に存在すると思われるフォールディングの数など、二次構造の予測可能性が向上している。「Ｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．， ２７（１）：２４４−２４７（１９９９）」を参照されたい。あるポリペプチド又はタンパク質中に存在するフォールディングの数は限られており、一定数以上の構造が一度決定されれば、構造の予測精度は劇的に向上すると予想されることが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ７（３）：３６９−３７６（１９９７））。
さらに、現在では、二次構造の予測を補助するために、コンピュータプログラムを利用することができる。二次構造を予測する１つの方法は、相同性モデリングに基づいている。例えば、３０％を超える配列同一性又は４０％を超える類似性を有する２つのポリペプチド又はタンパク質は、類似の構造的トポロジーを有することが多い。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の充実により、ポリペプチド又はタンパク質の構造内に存在すると思われるフォールディングの数など、二次構造の予測可能性が向上している。「Ｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．， ２７（１）：２４４−２４７（１９９９）」を参照されたい。あるポリペプチド又はタンパク質中に存在するフォールディングの数は限られており、一定数以上の構造が一度決定されれば、構造の予測精度は劇的に向上すると予想されることが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ７（３）：３６９−３７６（１９９７））。
二次構造を予測する方法としては、さらに、「ネジきり（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ， Ｄ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ７（３）：３７７−８７（１９９７）； Ｓｉｐｐｌ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ４（１）：１５−９（１９９６））、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍ．， １８３：１４６−１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８４（１３）：４３５５−８（１９８７））、及び「進化的連関（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｍｅ、上記、及びＢｒｅｎｎｅｒ、上記を参照）が挙げられる。
本発明に含まれるペプチドと修飾ペプチド断片（すなわち、サブシーケンス）は、完全長配列より短いが、抗ＮＧＦ活性に関して、インビトロ及び／又はインビボで実質的に同一の生物活性を有しており、アミノ末端、カルボキシ末端、及び／又は内部が切断されている断片である。
本発明のペプチド及び修飾ペプチド類縁体、断片及び誘導体は、本明細書に具体的に開示されているペプチド及び修飾ペプチドが有用である用途（すなわち、インビトロ及び／又はインビボでのＮＧＦ活性のアンタゴニスト）と同一の用途について有用である。
ペプチド。本発明とともに使用されるペプチドは、上記のように、ＮＧＦの活性を調節する（例えば、増加又は減少させる）ペプチドである。ファージディスプレイは、特に、下表３に列記されているペプチド（配列番号１−２９）を作製する上で有用であった。Ｎ末端にメチオニン残基を発現させ得る、これらの各ペプチドのメチオニル成熟（ＭＥＴ−１）型も有用である（配列番号３０−５８）。本発明の特に好ましいペプチドは、下表５に列記されているアフィニティー成熟ペプチド（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）である（配列番号２０２−２８０）。
ビヒクル。本明細書において使用される「ビヒクル」という用語は、治療用タンパク質の分解を抑え、及び／又は半減期を増加させ、毒性を軽減し、免疫原性を減少させ又は生物活性を増加させる分子を表す。本発明において、好ましいビヒクルには、Ｆｃドメインが含まれる。本発明の１つの側面では、アミノ酸残基の１つのＮ末端、Ｃ末端、及び／又は側鎖を介してペプチドに付着した少なくとも１つのビヒクル（Ｆ１）が存在する必要がある。例えば、各末端にＦｃドメイン（Ｆｃ）を設けるなど、複数のビヒクルを使用してもよい。
Ｆｃドメインは、ペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合させてもよいし、あるいはＮ末端とＣ末端の両方に融合させてもよい。対象とされる基質（すなわち、ＮＧＦ）への結合が維持されている限り、本発明に従って、ネイティブＦｃは、Ｆｃ類縁体を形成するために、大規模に修飾を加えてもよい。例えば、ＷＯ ９７／３４６３１号及びＷＯ ９６／３２４７８号を参照されたい。このようなＦｃバリアントでは、本発明の融合分子が必要としない構造的な特徴又は機能的な活性を与えるネイティブＦｃの部位を１つ以上除去してもよい。これらの部位は、例えば、残基を置換若しくは欠失させ、前記部位に残基を挿入し又は前記部位を含有する部分を切断することによって除去することができる。挿入又は置換された残基は、ペプチド模倣体又はＤアミノ酸などの改変アミノ酸とすることもできる。Ｆｃバリアントは、数多くの理由によって、望ましいものとなることがあり、それらのうち幾つかは以下に記載されている。典型的なＦｃバリアントには、以下の分子及び配列が含まれる。
１．ジスルフィド結合の形成に関与する部位が除去される。このような除去によって、本発明の分子を生成するために使用される宿主細胞中に存在する他のシステイン含有タンパク質との反応を回避し得る。この目的のために、Ｎ末端に存在するシステイン含有セグメントを末端切断し又はシステイン残基を欠失させ若しくは他のアミノ酸（例えば、アラニル又はセリル）と置換させることができる。
２．選択した細胞との適合性を向上させるためにネイティブＦｃが修飾される。例えば、典型的なネイティブＦｃのＮ末端に近いＰＡ配列（プロリンイミノペプチダーゼなどのＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の消化酵素によって認識され得る。）を除去することができる。特に、分子がＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞中で組換えによって発現されている場合には、Ｎ末端にメチオニン残基を付加することもできる。配列番号６０のＦｃドメイン（図２）は、このようなＦｃバリアントの１つである。このようなＦｃバリアントは、本発明の幾つかの実施形態、とりわけ、以下の式を有する実施形態において好ましい。
Ｆｃ−Ｐ （Ｖ）
（式中、Ｆｃドメインは、ペプチドのＮ末端に付着している。）
Ｆｃ−（Ｘ２） （ＶＩ）
（式中、Ｆｃドメインは、修飾ペプチドのリンカー−ペプチド要素（Ｘ２）のＮ末端に付着している。）
最も好ましくは、
Ｆｃ−（Ｌ）ｃ−Ｐ （ＶＩＩ）
（式中、Ｆｃドメインは修飾ペプチドのリンカー−ペプチド要素（Ｘ２）のＮ末端に付着しており、（Ｘ２）は式−（Ｌ）ｃ−Ｐを有する。）
（式中、Ｆｃドメインは、ペプチドのＮ末端に付着している。）
Ｆｃ−（Ｘ２） （ＶＩ）
（式中、Ｆｃドメインは、修飾ペプチドのリンカー−ペプチド要素（Ｘ２）のＮ末端に付着している。）
最も好ましくは、
Ｆｃ−（Ｌ）ｃ−Ｐ （ＶＩＩ）
（式中、Ｆｃドメインは修飾ペプチドのリンカー−ペプチド要素（Ｘ２）のＮ末端に付着しており、（Ｘ２）は式−（Ｌ）ｃ−Ｐを有する。）
本発明の実施形態には、以下の式の修飾ペプチドも含まれる。
Ｐ−Ｆｃ （ＶＩＩＩ）
（式中、Ｆｃドメインは、ペプチドのＣ末端に付着している。）
（Ｘ１）−Ｆｃ （ＩＸ）
（式中、Ｆｃドメインは、ペプチド−リンカー要素（Ｘ１）のＣ末端に付着している。）
Ｐ−（Ｌ）ｃ−Ｆｃ （Ｘ）
（式中、Ｆｃドメインはリンカー−ペプチド要素（Ｘ２）のＣ末端に付着しており、（Ｘ２）は式Ｐ−（Ｌ）ｃを有する。）
式（ＶＩＩＩ）−（Ｘ）の修飾ペプチドについて、好ましいビヒクルは、配列番号６０に示されたＦｃドメインが配列番号６０の１位に示されているメチオニン残基を欠いたＦｃバリアントである。
（式中、Ｆｃドメインは、ペプチドのＣ末端に付着している。）
（Ｘ１）−Ｆｃ （ＩＸ）
（式中、Ｆｃドメインは、ペプチド−リンカー要素（Ｘ１）のＣ末端に付着している。）
Ｐ−（Ｌ）ｃ−Ｆｃ （Ｘ）
（式中、Ｆｃドメインはリンカー−ペプチド要素（Ｘ２）のＣ末端に付着しており、（Ｘ２）は式Ｐ−（Ｌ）ｃを有する。）
式（ＶＩＩＩ）−（Ｘ）の修飾ペプチドについて、好ましいビヒクルは、配列番号６０に示されたＦｃドメインが配列番号６０の１位に示されているメチオニン残基を欠いたＦｃバリアントである。
３．選択した宿主細胞中で発現したときのＮ末端の不均一性を抑えるために、ネイティブＦｃのＮ末端の一部が除去される。この目的のために、Ｎ末端に存在する最初の２０個のアミノ酸残基のうち何れか、とりわけ、１、２、３、４及び５位に存在するアミノ酸残基を除去することができる。特に、本発明のペプチド又は修飾ペプチドのリンカー−ペプチド要素のＮ末端にビヒクル（Ｆ１）が付着されている場合には、このようなＦｃバリアントは、本発明の幾つかの実施形態において好ましい。
４．１又は複数のグリコシル化部位が除去される。通例グリコシル化されている残基（例えば、アスパラギン）は、細胞溶解性の応答を与えることがある。このような残基は、欠失させるか又はグリコシル化されない残基（例えば、アラニン）と置換することができる。
５．補体との相互作用に関与する部位（Ｃ１ｑ結合部位など）が除去される。例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を欠失させ又は置換することができる。本発明の分子に関して、補体の動員が有利でないことがあり得るので、このようなＦｃバリアントを用いて回避することができる。
６．サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合に影響を与える部位が取り除かれる。ネイティブＦｃは、本発明の融合分子にとって不要である、ある種の白血球と相互作用するための部位を有している可能性があり、取り除くことができる。
７．ＡＤＣＣ部位が除去される。ＡＤＣＣ部位は本分野において公知であり、例えば、ＩｇＧ１中のＡＤＣＣ部位に関して、「Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， Ｖｏｌｕｍｅ ２９ Ｎｕｍｂｅｒ ５， ｐａｇｅｓ ６３３−６３９（１９９２）」を参照されたい。これらの部位も、本発明の修飾ペプチド（融合産物）にとって必要でないため、取り除いてもよい。
８．ネイティブＦｃが非ヒト抗体に由来する場合、ネイティブＦｃはヒト化することができる。典型的には、ネイティブＦｃをヒト化するために、非ヒトネイティブＦｃ中の選択された残基は、ヒトのネイティブＦｃ中に本来存在する残基に置換されるであろう。抗体をヒト化するための技術は、本分野において周知である。
本発明のペプチド又は修飾ペプチドとその実質的な相同体との間について、末端以外の、Ｐ領域中の６個以内の残基が異なることが好ましい。より好ましくは、本発明によって想定される実質的な相同体は、本発明のペプチド又は修飾ペプチドのＰ領域の末端以外の任意の部位に、最大約６つのアミノ酸置換、挿入又は欠失を有する分子を含む。最も好ましくは、ペプチド又は修飾ペプチドとその実質的な相同体との配列の相違、特に前記Ｐ領域中の配列の相違は、「保存的な修飾」の形態である。
リンカー。任意の「リンカー」基が、必要に応じて使用される。リンカーが存在する場合、リンカーは主としてスペーサーとしての役割を果たすので、その化学的構造は重要でない。リンカーは、好ましくは、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸から構成される。このため、好ましい実施形態において、リンカーは、２０の天然アミノ酸から選択され、ペプチド結合によって連結された１ないし２０個のアミノ酸から構成される。当業者であれば理解できるように、これらのアミノ酸のうち幾つかはグリコシル化されていてもよい。より好ましい実施形態において、前記１ないし２０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリジンから選択される。さらに好ましくは、リンカーは、グリシンおよびアラニンなどの立体的に妨害されない大半のアミノ酸から構成される。
このように、好ましいリンカーは、ポリグリシン、特に（Ｇｌｙ）４（配列番号２８４）、（Ｇｌｙ）５（配列番号２８５）、（Ｇｌｙ）７（配列番号２８６）並びにポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）及びポリアラニンである。リンカーの他の具体例は、以下のとおりである。
（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４ （配列番号１２３）；
（Ｇｌｙ）３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）２ （配列番号１２４）；
（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４ （配列番号１２５）；及び
ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ （配列番号１２６）
上記命名法を説明すると、例えば、（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを意味する。ＧｌｙとＡｌａの組み合わせも好ましい。ここに示されたリンカーは、典型例にすぎない。本発明の範囲に属するリンカーは、さらにもっと長いものであってもよく、他の残基を含んでもよい。
（Ｇｌｙ）３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）２ （配列番号１２４）；
（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４ （配列番号１２５）；及び
ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ （配列番号１２６）
上記命名法を説明すると、例えば、（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを意味する。ＧｌｙとＡｌａの組み合わせも好ましい。ここに示されたリンカーは、典型例にすぎない。本発明の範囲に属するリンカーは、さらにもっと長いものであってもよく、他の残基を含んでもよい。
非ペプチドリンカーも可能である。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｓ＝２−２０）などのアルキルリンカーが、使用可能である。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６）、低級アシル、ハロゲン（例えば，Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなど、立体障害のない任意の基によってさらに置換されてもよい。典型的な非ペプチドリンカーは、ＰＥＧリンカーである。
（式中、ｎは、リンカーの分子量が１００ないし５０００キロダルトン（ｋＤ）、好ましくは１００ないし５００ｋＤとなるようにする。）。ペプチドリンカーは、上記と同一の様式で、誘導体を形成するために改変してもよい。
誘導体。本発明のペプチド又は修飾ペプチドの誘導体も想定される。このような誘導体は、前記ペプチド又は修飾ペプチドの溶解度、吸収、生物学的半減期などを向上させる可能性がある。あるいは、この成分は、ペプチド又は修飾ペプチドの望ましくない何らかの副作用などを除去し又は軽減する可能性がある。典型的な誘導体としては、以下のペプチド又は修飾ペプチドが挙げられる。
１．ペプチド若しくは修飾ペプチド又はそれらの一部分が環状である。例えば、前記ペプチド又は修飾ペプチドのペプチド部分は、２以上のＣｙｓ残基を（例えば、リンカー中に）含有するように修飾することができ、ジスルフィド結合の形成によって環状化することができるであろう。環状化された誘導体の調製に関する参考文献の引用に関しては、ＷＯ ００／２４７８２号を参照されたい。
２．ペプチド又は修飾ペプチドが架橋される又は分子間架橋を与えることができる。例えば、ペプチド又修飾ペプチドのペプチド部分は、１つのＣｙｓ残基を含有するように修飾することができ、これにより、同様の分子と分子間ジスルフィド結合を形成することができる。修飾ペプチドは、以下に示されている分子におけるように、そのＣ末端を介して架橋させることもできる。
３．１又は複数のペプチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］連結（結合）が、非ペプチド連結に置換される。典型的な非ペプチド連結は、−ＣＨ２−カルバメート［−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］、ホスフェート、−ＣＨ２−スルホンアミド［−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−］、尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］、−ＣＨ２−二級アミン及びアルキル化されたペプチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−（式中、Ｒ６は低級アルキル）］である。
４．Ｎ末端が誘導体化される。典型的には、Ｎ末端は、アシル化されるか又は置換されたアミンに修飾することができる。典型的なＮ末端誘導体基には、−ＮＲＲ１（−ＮＨ２以外）、ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１、スクシンイミド又はベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（ＣＢＺ−ＮＨ−）が含まれる（式中、ＲとＲ１は、それぞれ独立して、水素又は低級アルキルであり、フェニル環は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、クロロ及びブロモからなる群から選択される１ないし３個の置換基で置換されてもよい。）。
５．遊離のＣ末端が誘導体化される。典型的にはＣ末端がエステル化又はアミド化される。例えば、配列番号１ないし５８のうち何れかを有する本発明の修飾ペプチドのＣ末端に（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２）２を付加するために、本分野において記載されている方法を使用し得る。同様に、配列番号１ないし５８の何れかを有する本発明の修飾ペプチドのＣ末端にＮＨ２を付加するために、本分野において記載されている方法を使用し得る。典型的なＣ末端誘導基には、例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２（式中、Ｒ２は、低級アルコキシである。）又は−ＮＲ３Ｒ４（Ｒ３とＲ４は、独立に、水素又はＣ１−Ｃ８アルキル（好ましくはＣ１−Ｃ４アルキル）である。）が含まれる。
６．ジスルフィド結合が、他の架橋成分（例えば、アルキレン）、より好ましくはジスルフィド基より安定な架橋成分で置き換えられる。例えば、「Ｂｈａｔｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌｕｍｅ ３９， ｐａｇｅｓ ３８１４−３８１９（１９９６）； Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ Ａｍ． Ｐｅｐ． Ｓｙｍｐ．， ｐａｇｅｓ ３５７−３５９ （１９９３）」を参照されたい。
二官能性物質（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｇｅｎｔ）による誘導体化は、ペプチド若しくは修飾ペプチド又はそれらの機能的な誘導体を水に不溶性の支持体マトリックスに又は他の高分子ビヒクルに架橋させるのに有用である。一般に使用される架橋剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）のようなジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドが含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］−プロピオイミデートなどの誘導化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体を与える。あるいは、米国特許第３，９６９，２８７号；第３，６９１，０１６号；第４，１９５，１２８号；第４，２４７，６４２号；第４，２２９，５３７号、及び第４，３３０，４４０号に記載されている、臭化シアンによって活性化された炭水化物のような水に不溶性の反応性マトリックスや反応性基質が、タンパク質の固定化のために使用される。
炭水化物（オリゴ糖）基は、都合よく、タンパク質中のグリコシル化部位であることが知られている部位に付着させ得る。一般に、Ｏ−結合型のオリゴ糖はセリン（Ｓｅｒ）又はスレオニン（Ｔｈｒ）残基に付着されているのに対して、Ｎ−結合型のオリゴ糖はアスペラギン残基が配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸であり得る）の一部であるときには、アスパラギン（Ａｓｎ）残基に付着されている。Ｘは、好ましくは、プロリン以外の１９種の天然アミノ酸の１つである。それぞれのタイプに見出されるＮ−結合型及びＯ−結合型オリゴ糖の構造と糖残基は様々である。両方に一般に見出される糖の１つのタイプは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸と称される）である。シアル酸は、通常、Ｎ−連結型とＯ−連結型の両オリゴ糖の末端基であり、その負電荷により、グリコシル化された修飾ペプチドに酸性特性を付与し得る。このような部位は、本発明の修飾ペプチドのリンカー中に取り込ませることができ（例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳなどの哺乳類細胞中において）、ポリペプチド修飾ペプチドを組換え的に産生させる間に、細胞によってグリコシル化されることが好ましい。しかし、本分野において公知の合成または半合成手法によって、このような部位をさらにグリコシル化することもできる。
他の考えられる修飾には、プロリン及びリジンの水酸化、セリン又はスレオニン残基の水酸基のリン酸化、Ｃｙｓ中の硫黄原子の酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化が含まれる。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ｐａｇｅｓ ７９−８６（１９８３）。
修飾ペプチドの総合的な安定性を増加させることができる又は身体中での循環時間を増加させることができる少なくとも１つの成分を付着させることによるペプチドの化学的修飾も想定される。本発明において共有結合されたビヒクルとして有用な成分も、この目的のために使用し得る。このような成分の例には、ポリエチレングリオール（ＰＥＧ）、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリプロリンが含まれる。例えば、「Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ， Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ Ａｄｄｕｃｔｓ， Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇｓ， Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ， ｅｄｓ．， Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ｐａｇｅｓ ３６７−３８３ （１９８１）； Ｎｅｗｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｖｏｌｕｍｅ ４， ｐａｇｅｓ １８５−１８９（１９８２）」を参照されたい。使用できる可能性がある他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−トリオキソカンである。ＰＥＧ成分が好ましい。
本発明のペプチド及び修飾ペプチドは、ＤＮＡレベルで変化させることもできる。修飾ペプチドの何れかの部分のＤＮＡ配列を、選択された宿主細胞との適合性がさらに優れたコドンに変化させ得る。好ましい宿主細胞であるＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の場合、最適化されたコドンは本分野において公知である。選択された宿主細胞中でのＤＮＡのプロセッシングを補助し得る、制限部位を除去し又はサイレントな制限部位を含めるためにコドンを置換させてもよい。ビヒクル、リンカー及びペプチドＤＮＡ配列は、先述した配列変化のうち何れかが含められるように修飾させることができる。
作製の方法
本発明の修飾ペプチドは、通例、組換えＤＮＡ技術を用いて、形質転換された宿主細胞中で作製することができる。このようにするために、ペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子を調製する。このようなＤＮＡ分子を調製する方法は、本分野において周知である。
組換えＤＮＡ技術の一般的な原理に関する参考資料としては、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ， Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｉｎｃ．， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， Ｃａｌｉｆ． （１９８７）； Ｄａｒｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ． Ｙ．（１９８６）； Ｌｅｗｉｎ， Ｇｅｎｅｓ ＩＩ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．（１９８５）； Ｏｌｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ： Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２ｋ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｅｒｋｅｌｅｙ， Ｃａｌｉｆ． （１９８１）； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ．， （１９８７，１９９２）が挙げられる。これらの文献は、その中に引用されている文献も含め、参照により全体を本明細書に組込む。
本発明の修飾ペプチドは、通例、組換えＤＮＡ技術を用いて、形質転換された宿主細胞中で作製することができる。このようにするために、ペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子を調製する。このようなＤＮＡ分子を調製する方法は、本分野において周知である。
組換えＤＮＡ技術の一般的な原理に関する参考資料としては、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ， Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｉｎｃ．， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， Ｃａｌｉｆ． （１９８７）； Ｄａｒｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ． Ｙ．（１９８６）； Ｌｅｗｉｎ， Ｇｅｎｅｓ ＩＩ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．（１９８５）； Ｏｌｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ： Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２ｋ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｅｒｋｅｌｅｙ， Ｃａｌｉｆ． （１９８１）； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ．， （１９８７，１９９２）が挙げられる。これらの文献は、その中に引用されている文献も含め、参照により全体を本明細書に組込む。
例えば、ペプチドをコードする配列は、適切な制限酵素を用いてＤＮＡから切り出すことができる。あるいは、ＤＮＡ分子は、ホスホラミデート法などの化学的合成技術を用いて合成することができる。これらの技術の組み合わせも使用することができる。
本発明には、適切な宿主中で前記ペプチド又は修飾ペプチドを発現することができるベクターも含まれる。該ベクターは、適切な発現調節配列に作動可能に連結されたペプチド又は修飾ペプチドをコードするＤＮＡ分子を備える。ＤＮＡ分子がベクター中に挿入される前又は後の何れかに、この作動可能な連結を実施する方法は周知である。発現調節配列には、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、及び転写又は翻訳の調節に関与するその他のシグナルが含まれる。
このようにして得られた、その上にＤＮＡ分子を有するベクターは、適切な宿主を形質転換するために使用される。この形質転換は、本分野において周知の方法を用いて実施し得る。
利用可能な周知の数多くの宿主細胞のうち任意のものを、本発明を実施する際に使用し得る。特定の宿主の選択は、本分野で認められている数多くの因子に依存する。これらには、例えば、選択した発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によってコードされるペプチドの毒性、形質転換の割合、ペプチド又は修飾ペプチドの回収の容易さ、発現特性、生物学的安全性、及び費用などがある。あるＤＮＡ配列を発現させるのに、全ての宿主が同様に効果的であるとは限らないことを理解しながら、これらの因子の釣り合いを取らなければならない。
これらの一般的なガイドラインの中では、有用な微生物宿主には、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（Ｅ．ｃｏｌｉなど）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）の属から得られる細菌、及びハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、リノスポリジウム（Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属から得られる酵母並びに他の真菌が含まれる。最も好ましい宿主は、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の種、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の様々な系統（例えば、ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ番号３３６９４）、ＤＨ５α、ＤＨ１０及びＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ番号５３３３８））、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。
本分野では、数多くの適切な哺乳類宿主細胞も公知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９から、多くが入手可能である。例として、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ番号ＣＬＬ６１）、ＣＨＯ−ＤＨＦＲ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９７：４２１６−４２２０（１９８０））、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３又は２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）又は３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ９２）などの哺乳類細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。適切な哺乳類宿主細胞の選択と、形質転換、培養、増幅、スクリーニング及び生成物の産生と精製法は、本分野において公知である。他の適切な哺乳類細胞株は、サルのＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０）及びＣＯＳ−７細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）並びにＣＶ−１細胞株（ＡＴＣＣ細胞株ＣＣＬ７０）である。さらなる典型的な哺乳類細胞株には、霊長類の細胞株やげっ歯類の細胞株（形質転換された細胞株を含む）が含まれる。通常の二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養から得られた細胞系統、及び一次外植片も適切である。候補細胞は、選択遺伝子が欠損した遺伝子型であってもよく、あるいは優性に作用する選択遺伝子を含有していてもよい。他の適切な哺乳類細胞には、マウスの神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓに由来する３Ｔ３株、Ｂａｌｂ−ｃ又はＮＩＨマウス、ＢＨＫ又はＨａｋハムスター細胞株が含まれ、これらはＡＴＣＣから入手できる（これらに限定されるものではない。）。これらの各細胞株は、タンパク質発現の分野における当業者にとって公知であり、当業者が入手可能なものである。
本発明のポリペプチドを発現させるために、当業者に公知である酵母細胞の多数の系統を宿主細胞として利用することもできる。好ましい酵母細胞には、例えば、サッカロミセス・セレビシアエ（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）及びピヒア・パストーリス（ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が含まれる。
さらに、所望であれば、本発明の方法では、昆虫細胞系を利用することもできる。このような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １４： ８１０−８１７（１９９３）； Ｌｕｃｋｌｏｗ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ４： ５６４−５７２（１９９３） ；及びＬｕｃｋｌｏｗ ｅｔ ａｌ． （Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６７： ４５６６−４５７９ （１９９３）に記載されている。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９とＨＩ５である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａ）。本発明のペプチド及び修飾ペプチドを発現させるためにトランスジェニック動物を使用することもできる。例えば、トランスジェニックミルク産生動物（例えば、ウシ又はヤギ）を使用して、動物のミルク中にペプチド又は修飾ペプチドを得ることができる。本発明のペプチド及び修飾ペプチドを作製するために植物を使用することもできるが、一般に、植物中で起こるグリコシル化は、哺乳類細胞中で産生されるものとは異なっており、ヒトの治療に使用するには適していないグリコシル化産物が得られることがある。
形質転換された宿主を培養し、単一クローンの単離体を精製する。所望の修飾ペプチドが発現されるように、慣用の発酵条件下で宿主細胞を培養され得る。このような発酵条件は本分野において周知である。宿主細胞中で機能する任意のプロモーターを、遺伝子発現を調節するために使用することができる。本発明の修飾ペプチド又は少なくともそのペプチド部分が分泌されることが好ましい。修飾ペプチド又はそのペプチド部分が分泌されれば、本分野において周知の方法によって、ペプチドを培地から精製することができる。
修飾ペプチド又はそのペプチド部分が不溶性の封入体として細菌宿主中で発現されれば、修飾ペプチド又はそのペプチド部分は、本分野で公知の方法に従って、宿主細胞から採取することができる。例えば、洗浄され凍結された封入体の可溶化は、溶かした封入体にカオトロピック剤や還元剤を含有する緩衝液を添加することによって行うことができる。可溶化混合物は、リフォールディング緩衝液中に希釈して、正しいタンパク質のコンフォメーションとジスルフィド結合を形成させることが好ましい。可溶化混合物を添加する直前に、酸化還元試薬をリフォールディング緩衝液に添加してもよい。リフォールディング溶液は、粒状物を除去するためにフィルターシステムを通過させた後、低温（約５℃）の限外ろ過（ＵＦ）によって濃縮してもよい。低分子量の溶質を除去するために、低温での透析ろ過（ＤＦ；ｄｉａｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行ってもよい。一般的に、宿主細胞の不純物、生成物の凝集物、ミスフォールディングした不純物の大半を除去するために、酸性ｐＨでの沈殿と清澄が行われる。残余の宿主細胞不純物と生成物の凝集物は、例えば、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ ｍｅｄｉａ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム、及び／又はＣｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅレジン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）などの陽イオン交換クロマトグラフィーによって除去することができる。
前記修飾ペプチド又は少なくともそのペプチド部分は、合成法によって作製することもできる。例えば、固相合成技術を使用することができる。適切な技術は本分野において周知であり、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｃｈｅｍ． Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ， ｐａｇｅｓ ３３５−３６１ （Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ ａｎｄ Ｐａｎａｙｏｔｉｓ ｅｄｉｔｏｒｓ） （１９７３）； Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， Ｖｏｌｕｍｅ ８５， ｐａｇｅ ２１４９ （１９６３）； Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ．， Ｖｏｌｕｍｅ １０， ｐａｇｅｓ ３９４−４１４ （１９８５）； Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （１９６９）；米国特許第３，９４１，７６３号； Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （３ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ｖｏｌｕｍｅ ２， ｐａｇｅｓ １０５−２５３ （１９７６）；及びＥｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ｖｏｌｕｍｅ ２， ｐａｇｅｓ ２５７−５２７（１９７６）に記載されているものが含まれる。固相合成は、コスト効率に優れているため、個々のペプチドを作製するための好ましい技術である。非ペプチド基を含有する修飾ペプチドは、周知の有機化学技術によって合成することができる。
医薬組成物
総論。本発明は、例えば、痛み（炎症性の痛み及びこれに伴う痛覚過敏や異痛症、神経障害性の痛み及びこれに伴う痛覚過敏や異痛症、糖尿病性神経障害の痛み、灼熱痛、交感神経によって維持される痛み、除神経後症候群、急性の痛み、緊張性頭痛、偏頭痛、歯痛、外傷からの痛み、手術の痛み、切断又は膿瘍から生じる痛み、灼熱痛、脱髄疾患、並びに三叉神経痛が含まれるが、これらに限定されない）の予防又は治療における、本発明のペプチド及び／又は修飾ペプチドの医薬組成物を使用する方法も提供する。本発明のペプチド及び修飾ペプチドは、喘息、強迫性尿失禁（すなわち、過活動膀胱）、乾癬、癌（特に、膵臓癌及び悪性黒色腫）、慢性アルコール依存症、発作、視床痛症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、トキシン及び化学療法、一般的な頭痛、偏頭痛、群発性頭痛、混合血管性（ｍｉｘｅｄ−ｖａｓｃｕｌａｒ）及び非血管性症候群、一般的な炎症、関節炎、リウマチ性疾患、狼瘡、骨関節炎、炎症性大腸疾患、炎症性眼疾患、炎症性又は不安定膀胱疾患、乾癬、炎症性要素を伴う皮膚病、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症症状、喘息、上皮組織の損傷又は機能障害、単純ヘルペス、呼吸、泌尿生殖器、胃腸又は血管領域における臓器の運動性の障害、創傷、火傷、アレルギー性の皮膚反応、掻痒、白斑、一般的な胃腸疾患、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運動性又はアレルギー性鼻炎又は気管支疾患など（これらに限定されない）、ＮＧＦが原因因子として関連する他の疾病の予防又は治療において治療的価値を有する。
総論。本発明は、例えば、痛み（炎症性の痛み及びこれに伴う痛覚過敏や異痛症、神経障害性の痛み及びこれに伴う痛覚過敏や異痛症、糖尿病性神経障害の痛み、灼熱痛、交感神経によって維持される痛み、除神経後症候群、急性の痛み、緊張性頭痛、偏頭痛、歯痛、外傷からの痛み、手術の痛み、切断又は膿瘍から生じる痛み、灼熱痛、脱髄疾患、並びに三叉神経痛が含まれるが、これらに限定されない）の予防又は治療における、本発明のペプチド及び／又は修飾ペプチドの医薬組成物を使用する方法も提供する。本発明のペプチド及び修飾ペプチドは、喘息、強迫性尿失禁（すなわち、過活動膀胱）、乾癬、癌（特に、膵臓癌及び悪性黒色腫）、慢性アルコール依存症、発作、視床痛症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、トキシン及び化学療法、一般的な頭痛、偏頭痛、群発性頭痛、混合血管性（ｍｉｘｅｄ−ｖａｓｃｕｌａｒ）及び非血管性症候群、一般的な炎症、関節炎、リウマチ性疾患、狼瘡、骨関節炎、炎症性大腸疾患、炎症性眼疾患、炎症性又は不安定膀胱疾患、乾癬、炎症性要素を伴う皮膚病、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症症状、喘息、上皮組織の損傷又は機能障害、単純ヘルペス、呼吸、泌尿生殖器、胃腸又は血管領域における臓器の運動性の障害、創傷、火傷、アレルギー性の皮膚反応、掻痒、白斑、一般的な胃腸疾患、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運動性又はアレルギー性鼻炎又は気管支疾患など（これらに限定されない）、ＮＧＦが原因因子として関連する他の疾病の予防又は治療において治療的価値を有する。
本発明は、上に列記された同じ疾病の予防又は治療のための本発明のペプチド及び／又は修飾ペプチドの使用も提供する。
従って、本発明は、上記疾患のうち任意の１つなど、疾患を治療するための医薬の製造における、本発明のペプチド及び／又は修飾ペプチドの１又は複数の使用にも関する。
このような医薬組成物又は医薬は、注射による投与又は経口、経肺、経鼻、経皮又はその他の形態の投与用とすることができる。一般に、本発明は、薬剤として許容される希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又は担体とともに、本発明のペプチド又は修飾ペプチドの有効量（痛み又は本明細書に記載されているその他の医学的症状のうち任意のものを予防し、改善し又は消失させるのに有効な量）を含む医薬組成物を包含する。このような組成物は、様々な緩衝液内容物（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤、界面活性剤及び可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０）などの添加物、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、チメロソール（Ｔｈｉｍｅｒｏｓｏｌ）、ベンジルアルコール）及びバルク物質（例えば、ラクトース、マニトール）；ポリ乳酸、ポリグリコール酸等のポリマー性修飾ペプチドの粒子状調製物又はリポソーム中への前記物質の取り込みが含まれる。ヒアルロン酸も使用することができ、これは、循環中における持続を促進させる効果を有することがある。このような組成物は、本発明のタンパク質と誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度、及びインビボクリアランスの速度に影響を与える可能性がある。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， ｐａｇｅｓ １４３５−１７１２（１９９０）（参考文献として、本明細書に援用される）を参照されたい。前記組成物は、液体の形態で調製してもよいし、あるいは、乾燥した粉末（凍結乾燥された形態など）として調製してもよい。インプラント可能な持続的放出調合物も、経皮調合物などとして、想定される。
経口投薬剤形。本発明への使用が想定されるのは、固形の経口投薬剤形であり、これらは、参照により本明細書に組込まれる上記Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの第８９章に総説されている。固形の投薬剤形には、錠剤、カプセル、丸薬、トローチ又はトローチ剤、カプセル（ｃａｃｈｅｔ）又は小丸薬（ｐｅｌｌｅｔ）が含まれる。本発明の組成物を調合するために、リポソーム又はプロテイノイド封入も使用し得る（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号に報告されたプロテイノイドミクロスフェアを参照）。リポソーム封入を使用することもでき、リポソームは様々なポリマーで誘導体化してもよい（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号を参照）。可能な固形投薬剤形は、Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ｋ．， Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓの第１０章、編集Ｇ． Ｓ． Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃ． Ｔ． Ｒｈｏｄｅｓ （１９７９）に記載されており、本明細書に参照により組込む。一般に、前記調合物は、本発明の修飾ペプチドの他に、胃環境から保護して、腸内で修飾ペプチドを放出させ得る不活性成分を含む。
本発明のペプチド又は修飾ペプチド自体の経口投薬剤形も、具体的に想定される。この点に関して、必要であれば、ペプチド又は修飾ペプチドは、経口送達が効果的となるように、化学的に修飾を施してもよい。本発明の修飾ペプチドの吸収を強化するための担体として、Ｎ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸ナトリウム（ＳＮＡＣ）などの修飾された脂肪族アミノ酸の塩を使用することも可能である。「Ｏｒａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」と題された米国特許第５，７９２，４５１号を参照されたい。
本発明のペプチド又は修飾ペプチドは、粒径が約１ミリメートルの顆粒又は小丸薬の形態の微細な多成分粒子（ｍｕｌｔｉｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ）として、前記調合物中に加えることができる。カプセル投与用の前記物質の調合物は、粉末、軽度に圧縮されたプラグ、あるいは錠剤とすることも可能であろう。治療薬は、圧縮によって調製することができる。
着色剤及び着香剤は、すべて加えることができる。例えば、ペプチド若しくは修飾ペプチド又はそれらの誘導体を調合した後（例えば、リポソーム又はミクロスフェア封入によって）、さらに、着色剤や着香剤を含有する冷凍飲料などの食品中に含有させてもよい。
不活性物質を用いて、本発明のペプチド又は修飾ペプチドの容量を希釈し又は増加させてもよい。これらの希釈剤には、炭水化物、特に、マニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストラン及びデンプンが含まれ得るであろう。三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムなど、ある種の無機塩も、充填剤として使用することができる。市販の希釈剤を幾つか挙げると、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ １５００、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ及びＡｖｉｃｅｌｌがある。
固形投薬剤形の前記治療薬の調合物には、崩壊剤を加えてもよい。崩壊剤として使用される物質には、デンプン（デンプンを基本とした市販の崩壊剤Ｅｘｐｌｏｔａｂを含む）が含まれるがこれに限定されない。デンプングリコール酸ナトリウム、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン（ｕｌｔｒａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸性カルボキシメチルセルロース（ａｃｉｄ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、海綿（ｎａｔｕｒａｌ ｓｐｏｎｇｅ）及びベントナイトも使用し得る。崩壊剤の別の形態は、不溶性の陽イオン交換樹脂である。粉末ゴム（ｐｏｗｄｅｒｅｄ ｇｕｍ）を崩壊剤及び結合剤として使用してもよく、これらには、寒天、Ｋａｒａｙａ又はトラガカントなどの粉末ゴムが含まれ得る。アルギン酸及びそのナトリウム塩も、崩壊剤として有用である。
医薬組成物の成分を互いに固定して硬質錠剤を形成させるために、結合剤を使用してもよく、結合剤には、アカシア、トラガカント、デンプン及びゼラチンなどの天然産物から得られる物質が含まれる。他の結合剤には、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が含まれる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）とヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）はともに、治療薬を粒状化するためにアルコール溶液中で使用することができるであろう。
調合プロセス中の付着を抑えるために、抗摩擦剤を前記調合物中に加えてもよい。治療薬とダイ壁の間の層として、潤滑剤を使用することができ、これらには、ステアリン酸（そのマグネシウム塩とカルシウム塩を含む）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油及び蝋が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ ４０００及び６０００などの可溶性潤滑剤を使用することもできる。
調合時における修飾ペプチドの流動特性を改善し、圧縮時の再配置を補助し得る流動促進剤を加えてもよいであろう。このような流動促進剤には、デンプン、タルク、発熱性シリカ（ｐｙｒｏｇｅｎｉｃ ｓｉｌｉｃａ）及び水和したアルミノケイ酸塩が含まれ得る。
水性環境中への本発明のペプチド又は修飾ペプチドの溶解を補助するために、湿潤剤として、界面活性剤を添加してもよいであろう。このような界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチル・スルホコハク酸ナトリウム及びジオクチル・スルホン酸ナトリウムなどの陰イオン性界面活性剤が含まれ得る。陽イオン性界面活性剤を使用してもよく、塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウムが含まれ得る。前記調合物中に界面活性剤として加えることができる可能性のある非イオン性界面活性剤を列記すると、ラウロマクロゴール ４００、ステアリン酸ポリオキシル ４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルビン酸４０、６０、６５及び８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースがある。これらの界面活性剤は、調合剤中に単独で存在させてもよいし、あるいは様々な比率で混合物として存在させてもよい。
ペプチド又は修飾ペプチドの取り込みを増大させるために、調合物中に添加物を加えてもよい。この特性を有する可能性がある添加物には、例えば、オレイン酸、リノール酸及びリノレン酸などの様々な脂肪酸が含まれる。
制御放出調合物が望ましいこともある。本発明のペプチド又は修飾ペプチドは、拡散又は浸出機構（例えば、ゴム）の何れかによって放出を可能とする不活性マトリックス中に取り込ませることができる。ゆっくりと変性するマトリックス、例えば、アルギネート又は多糖も、調合物中に取り込ませ得る。本発明のペプチド又は修飾ペプチドを制御放出する別の形式は、Ｏｒｏｓ治療システム（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．）を基礎とする方法によるものである。すなわち、水を入らせることができ、浸透圧効果によって単一の小さな開口部から薬物を押し出すことができる半透膜中に、薬物が封入される。腸溶コーティングの中にも、遅延放出効果を有するものがある。
これ以外のコーティングを前記調合物に対して使用してもよい。これらには、コーティングパン中に塗布し得る様々な糖が含まれる。前記治療剤は、フィルムでコートされた錠剤の中に与えることも可能であり、この事例で使用される物質は、２つのグループに分けられる。第一のグループは非腸溶性物質であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ−エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロビドン及びポリエチレングリコールが含まれる。第二のグループは、フタル酸の一般的なエステルである腸溶物質からなる。
最適なフィルムコーティングを与えるために、物質の混合物を使用することもできる。フィルムコーティングは、パンコーティング装置（ｐａｎ ｃｏａｔｅｒ）中で、流動床中で又は圧縮コーティングによって実施することができる。
経肺送達剤形。本明細書では、本発明による医薬組成物の経肺送達も想定される。前記ペプチド又は修飾ペプチド（又はそれらの誘導体）は、吸入によって哺乳類の肺に達し、肺上皮内壁から血流へ浸透する。この点に関して参考となり得る大分子の経肺送達に関する報告には、Ａｄｊｅｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａ．Ｒｅｓ．， Ｖｏｌｕｍｅ ７，ｐａｇｅｓ ５６５−５６９（１９９０）， Ａｄｊｅｉ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ， Ｖｏｌｕｍｅ ６３， ｐａｇｅｓ １３５−１４４（１９９０）（酢酸ロイプロリド）； Ｂｒａｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， Ｖｏｌｕｍｅ １３ （ｓｕｐｐｌ．５），ｓ１４３−１４６（１９８９）（エンドセリン−１）；Ｈｕｂｂａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．， Ｖｏｌｕｍｅ ３， ｐａｇｅｓ ２０６−１２（１９８９）（αｌ−アンチトリプシン）；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．， Ｖｏｌｕｍｅ ８４， ｐａｇｅｓ １１４５〜１１４６（１９８９）（αｌ−プロテイナーゼ）、Ｏｓｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， “Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”， Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｒｅｓｐ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＩＩ、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ， Ｃｏｌｏｒａｄｏ（１９９０）（組換えヒト成長ホルモン）、Ｄｅｂｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， Ｖｏｌｕｍｅ １４０、ｐａｇｅｓ ３４８２−３４８８（１９８８）（インターフェロン−γ及び腫瘍壊死因子α）、及び米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）が含まれる。
治療用製品を経肺送達するために設計された、当業者には公知であるネブライザー、定量噴霧式吸入器、及び粉末吸入器などの多岐にわたる機械装置（これらに限定されない）が本発明を実施する際に使用されることが想定される。本発明を実施するのに適した市販の装置のいくつかの具体例は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、Ｉｎｃ（ミズーリ州セントルイス）製のＵｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー、Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（コロラド州エングルウッド）製のＡｃｏｒｎＩＩネブライザー、Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．（ノースカロライナ州リサーチトライアングルパーク）製のＶｅｎｔｏｌｉｎ定量式噴霧吸入器、及びＦｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．（マサチューセッツ州ベッドフォード）製のＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器である。
このような装置では全て、前述のペプチド及び修飾ペプチドの投薬に適した調合物を使用することが必要である。一般に、それぞれの調合物は使用する装置の種類毎に固有であり、治療に有用な希釈剤、補助剤及び／又は担体に加えて適切な噴霧剤の使用を伴ってもよい。
本発明のペプチド又は修飾ペプチドを遠位の肺に最も効果的に送達するためには、平均粒径１０マイクロメータ（μｍ）又はミクロン未満、最も好ましくは０．５から５μｍの範囲の粒状物形態に調製することが最も有利であろう。
これら肺用組成物のための薬剤として許容される担体には、トレハロース、マニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース及びソルビトールなどの炭水化物が含まれる。調合物に使用するその他の成分には、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ及びＤＯＰＣを含めることができる。天然又は合成界面活性剤を使用してもよい。（タンパク質又は類縁体の誘導体化に使用することは別として）ＰＥＧを使用してもよい。シクロデキストランなどのデキストラン、胆汁酸塩、セルロース及びセルロース誘導体も使用してもよい。例えば、緩衝調合物中に、アミノ酸を使用してもよい。
さらに、リポソーム、マイクロカプセル又はミクロスフェア、包接複合体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）又はその他の種類の担体の使用も想定される。
ジェット型又は超音波型の何れかのネブライザーで使用するのに適した調合物には一般に、溶液１ミリリットル（ｍｌ）当たり生物活性タンパク質約０．１から２５ミリグラム（ｍｇ）の濃度で水に溶解した前述の修飾ペプチドが含まれる。前記調合物には、（例えば、ペプチドを安定化し、浸透圧を調節するための）緩衝液及び単糖を含めることもできる。ネブライザー調合物には、エアロゾルを形成するときの溶液の噴霧化によって引き起こされるタンパク質の表面誘導性の凝集を軽減又は抑制するために、界面活性剤を含めることもできる。
定量噴霧吸入器装置で使用する調合物には一般に、界面活性剤を利用して噴射剤中に懸濁させた前述の修飾ペプチドを含有する超微粒子粉末が含まれる。噴射剤は、この目的のために使用される任意の慣用材料、例えば、クロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン又はハイドロカーボンとすることができ、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール及び１，１，１，２−テトラフルオロエタン又はそれらの組み合わせが含まれる。適切な界面活性剤には、トリオレイン酸ソルビタン及び大豆レシチンが含まれる。オレイン酸も、界面活性剤として使用することができる。
粉末吸入装置から投薬するための調合物には、前述の修飾ペプチドを含有する超微粒子粉末が含まれ、ラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロース又はキシリトールなどのバルク剤を、前記装置からの粉末の投与を容易にする量、例えば、調合物の５０から９０重量％で含めることもできる。
経鼻送達剤形。前記ペプチド及び修飾ペプチドの経鼻送達も想定される。経鼻送達によって、鼻に治療用製品を投与した後、肺に該製品を沈着させる必要なく、本発明の修飾ペプチドを直接血流へと通過させることが可能である。経鼻送達用の調合物には、デキストラン又はシクロデキストランを有するものが含まれる。その他の粘膜からの輸送を介した送達も想定される。
投与量。関連する疾病又は疾患の治療法に必要な投薬計画は、治療薬の作用を変更する様々な要素、例えば、年齢、症状、体重、性別及び患者の食事状態、治療する症状の重症度、投与期間、及びその他の臨床要素を考慮して、主治医によって決定されるであろう。一般的に、毎日の投与計画は、体重１キログラム（ｋｇ）当たり修飾ペプチド１．０−１００００マイクログラム（μｇ）の範囲、好ましくは体重１キログラム当たり１．０−１０００μｇ、最も好ましくは体重１キログラム当たり１．０〜１５０μｇとすべきである。
(実施例)
本発明のペプチド及び修飾ペプチドは以下に説明したように調製することができる。これらの実施例には、本発明の好ましい実施形態が含まれるが、単に例示するだけにすぎず、それらに限定することを意図するものではない。
本発明のペプチド及び修飾ペプチドは以下に説明したように調製することができる。これらの実施例には、本発明の好ましい実施形態が含まれるが、単に例示するだけにすぎず、それらに限定することを意図するものではない。
ペプチドファージディスプレイによるＮＧＦ阻害ペプチドの同定
１．ＮＧＦコーティング磁気ビーズの調製
Ａ．ＮＧＦタンパク質のビオチン化。ヒト組換えＮＧＦは、ＥＺ−ｌｉｎｋ−Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を使用し、製造者の指示に従ってビオチン化した。該ビオチン化ＮＧＦタンパク質をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で透析して、溶液から遊離の浮遊ビオチンを除去した。該ビオチン化ＮＧＦタンパク質溶液をＩｍｍｕｎｏｐｕｒｅ固定モノメリックアビジンカラム（Ｐｉｅｃｅ、イリノイ州ロックフォード）に通過させ、未結合のビオチン又は結合の弱いビオチンをすべて除去した。該ビオチン化ＮＧＦタンパク質含有溶液は、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎユニット（Ａｍｉｃｏｎ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を使用して濃縮し、最終タンパク質濃度はＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｓ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して測定した。精製濃縮したビオチン化ＮＧＦは、ＤＲＧ神経をベースとしたＮＧＦ中和バイオアッセイ（詳細は以下の実施例３を参照）において、及びＳＣＧ神経をベースとした中和アッセイ（ここでは説明せず）においても十分な活性を有することが示された。
１．ＮＧＦコーティング磁気ビーズの調製
Ａ．ＮＧＦタンパク質のビオチン化。ヒト組換えＮＧＦは、ＥＺ−ｌｉｎｋ−Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を使用し、製造者の指示に従ってビオチン化した。該ビオチン化ＮＧＦタンパク質をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で透析して、溶液から遊離の浮遊ビオチンを除去した。該ビオチン化ＮＧＦタンパク質溶液をＩｍｍｕｎｏｐｕｒｅ固定モノメリックアビジンカラム（Ｐｉｅｃｅ、イリノイ州ロックフォード）に通過させ、未結合のビオチン又は結合の弱いビオチンをすべて除去した。該ビオチン化ＮＧＦタンパク質含有溶液は、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎユニット（Ａｍｉｃｏｎ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を使用して濃縮し、最終タンパク質濃度はＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｓ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して測定した。精製濃縮したビオチン化ＮＧＦは、ＤＲＧ神経をベースとしたＮＧＦ中和バイオアッセイ（詳細は以下の実施例３を参照）において、及びＳＣＧ神経をベースとした中和アッセイ（ここでは説明せず）においても十分な活性を有することが示された。
Ｂ．磁気ビーズへのＮＧＦ固定。前記ビオチン化ＮＧＦタンパク質は、メーカーから購入したビーズストック１００ミリリットル（ｍｌ）当たりビオチン化ＮＧＦタンパク質２ミリグラム（ｍｇ）の濃度でストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄ（Ｄｙｎａｌ、ニューヨーク州レイクサクセス）に固定した。磁石を使用してビーズを試験管の片側へ引き寄せ、液体をピペットで取り除くことによって、ビーズをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄して、ＰＢＳに再懸濁した。ビオチン化ＮＧＦタンパク質を洗浄したビーズに上記濃度で添加し、回転させながら室温で１時間インキュベートした。次にＮＧＦコーティングビーズにＢＳＡを最終濃度１％まで添加することによってブロックし、回転させながら４℃で一晩インキュベートした。その後、得られたＮＧＦコーティングビーズをＰＢＳＴ（すなわち、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で５回洗浄し、選択処理を行った。
Ｃ．陰性選択用ビーズの調製
陰性選択用にも、さらにビーズを調製した。それぞれのパニング条件に対して、メーカーから購入したビーズストック２５０マイクロリットル（μｌ）に、ビオチン化ＮＧＦとのインキュベート段階を省くこと以外の前記処理（前記の１．Ａ．項）を行った。最後の洗浄段階で、ビーズを５０ｍｌずつ５群に分割した。
陰性選択用にも、さらにビーズを調製した。それぞれのパニング条件に対して、メーカーから購入したビーズストック２５０マイクロリットル（μｌ）に、ビオチン化ＮＧＦとのインキュベート段階を省くこと以外の前記処理（前記の１．Ａ．項）を行った。最後の洗浄段階で、ビーズを５０ｍｌずつ５群に分割した。
２．ＮＧＦ結合ファージの選択
Ａ．全体的方針。３種類の繊維状ファージライブラリー、ＴＮ８−ＩＸ（５ｘ１０９個の独立した形質転換体）、ＴＮ１２−Ｉ（１．４ｘ１０９個の独立した形質転換体）及びＬｉｎｅａｒ（２．３ｘ１０９個の独立した形質転換体）（Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．,マサチューセッツ州ケンブリッジ）を使用して、ＮＧＦ結合ファージを選択した。各ライブラリーについて、抗体溶出（２．Ｄ．項）、受容体溶出（２．Ｅ．項）及びビーズ溶出（２．Ｆ．項）を行った。したがって、９種類の異なるパニング条件を実施した（抗体溶出法を使用したＴＮ８−ＩＸ、受容体溶出法を使用したＴＮ８−ＩＸ、ビーズ溶出法を使用したＴＮ８−ＩＸ、抗体溶出法を使用したＴＮ１２−Ｉ、受容体溶出法を使用したＴＮ１２−Ｉ、ビーズ溶出法を使用したＴＮ１２−Ｉ、抗体溶出法を使用したＬｉｎｅａｒ、受容体溶出法を使用したＬｉｎｅａｒ、ビーズ溶出法を使用したＬｉｎｅａｒ）。各条件について、選択を３回実施した。
Ａ．全体的方針。３種類の繊維状ファージライブラリー、ＴＮ８−ＩＸ（５ｘ１０９個の独立した形質転換体）、ＴＮ１２−Ｉ（１．４ｘ１０９個の独立した形質転換体）及びＬｉｎｅａｒ（２．３ｘ１０９個の独立した形質転換体）（Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．,マサチューセッツ州ケンブリッジ）を使用して、ＮＧＦ結合ファージを選択した。各ライブラリーについて、抗体溶出（２．Ｄ．項）、受容体溶出（２．Ｅ．項）及びビーズ溶出（２．Ｆ．項）を行った。したがって、９種類の異なるパニング条件を実施した（抗体溶出法を使用したＴＮ８−ＩＸ、受容体溶出法を使用したＴＮ８−ＩＸ、ビーズ溶出法を使用したＴＮ８−ＩＸ、抗体溶出法を使用したＴＮ１２−Ｉ、受容体溶出法を使用したＴＮ１２−Ｉ、ビーズ溶出法を使用したＴＮ１２−Ｉ、抗体溶出法を使用したＬｉｎｅａｒ、受容体溶出法を使用したＬｉｎｅａｒ、ビーズ溶出法を使用したＬｉｎｅａｒ）。各条件について、選択を３回実施した。
Ｂ．陰性選択。各パニング条件について、ＴＮ８−ＩＸ及びＴＮ１２−Ｉライブラリー（ＴＮ８−ＩＸは５ｘ１０１１ｐｆｕ、ＴＮ１２−Ｉは１．４ｘ１０１１ｐｆｕ）では約１００個のランダムライブラリー相当物、Ｌｉｎｅａｒライブラリー（２．３ｘ１０１０ｐｆｕ）では約１０個のランダムライブラリー相当物をライブラリーストックから小分けし、ＰＢＳＴで３００μｌに希釈した。最終洗浄後、陰性選択用に調製したビーズ（１．Ｂ．項）の第１の分取試料５０μｌから液体を除去し、３００μｌに希釈したライブラリーストックを該ビーズに添加した。得られた混合物を室温で回転しながら１０分間インキュベートした。磁石を使用してファージ上清を抜き取り、もう１つの陰性選択工程用の第２の分取試料５０μｌに添加した。このようにして、５回の陰性選択工程を実施した。
Ｃ．ＮＧＦタンパク質コーティングビーズを使用した選択。
最後の陰性選択工程（前記の１．Ｂ．項）後のファージ上清を、最終洗浄工程後（前記の１．Ａ．項）のＮＧＦコーティングビーズに添加した。この混合物を回転しながら室温で１時間から２時間インキュベートし、特異的なファージを標的タンパク質に結合させた。上清を廃棄した後、ビーズをＰＢＳＴで７回洗浄した。
Ｄ．結合したファージの抗体溶出。最終洗浄工程後（前記の２．Ｃ．項）、１０μＭモノクローナル抗ヒト神経増殖因子−βクローン２５６２３．１（カタログ番号Ｎ−３２７９、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）１００μｌを添加することによって、磁気ビーズから結合したファージを溶出した。回転しながら室温で１時間インキュベートした後、溶出したファージを含有する液体を抜き取り、他の試験管に移した。ＭｉｎＡ塩溶液（６０ｍＭ Ｋ２ＨＰ０４、３３ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、７．６ｍＭ （ＮＨ４）ＳＯ４及び１．７ｍＭ クエン酸ナトリウム）９００マイクロリットルを添加し、最終量を１ｍｌとした。
Ｅ．結合ファージの受容体（ｔｒｋＡ）溶出。
最終洗浄工程後（前記の２．Ｃ．項）、１００μＭの可溶性ＮＧＦ受容体、ｔｒｋＡ（Ｉｇ様細胞外サブドメイン、アミノ酸２８０〜３８４）１００μｌを添加することによって、磁気ビーズから結合したファージを溶出した。回転しながら室温で１時間インキュベートした後、溶出したファージを含有する液体を抜き取り、他の試験管に移した。ＭｉｎＡ塩溶液（６０ｍＭ Ｋ２ＨＰ０４、３３ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、７．６ｍＭ （ＮＨ４）ＳＯ４及び１．７ｍＭ クエン酸ナトリウム）９００マイクロリットルを添加し、最終量を１ｍｌとした。
Ｆ．ビーズ溶出。最終洗浄後、液体を抜き取り（２．Ｃ．項）、ＭｉｎＡ塩溶液１ｍｌを該ビーズに添加した。感染させるため、このビーズ混合物を濃縮細菌試料に直接添加した（以下の３．Ａ．項及び３．Ｂ．項）。
３．増幅
Ａ．播種細胞の調製。新鮮なＥ．コリ（ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’）は、テトラサイクリン１２．５μｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地でＯＤ６００＝０．５になるまで培養した。パニング条件それぞれについて、この培養物２０ｍｌを氷上で冷却して、遠心した。細菌ペレットをＭｉｎＡ塩溶液１ｍｌに再懸濁した。
Ａ．播種細胞の調製。新鮮なＥ．コリ（ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’）は、テトラサイクリン１２．５μｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地でＯＤ６００＝０．５になるまで培養した。パニング条件それぞれについて、この培養物２０ｍｌを氷上で冷却して、遠心した。細菌ペレットをＭｉｎＡ塩溶液１ｍｌに再懸濁した。
Ｂ．形質導入。異なる溶出方法（前記の２．Ｄ．項及び２．Ｅ．項）の混合物それぞれを濃縮細菌試料（３．Ａ．項）に添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。ＮＺＣＹＭ培地（２ＸＮＺＣＹＭ、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）２ミリリットルを各混合物に添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含有する大きなＮＺＣＹＭ寒天プレートに得られた溶液４ｍｌを播種し、３７℃で一晩インキュベートした。
Ｃ．ファージ回収。大きなＮＺＣＹＭ寒天プレートで一晩増殖させた細菌／ファージ混合物（３．Ｂ．項）それぞれをＬＢ培地３５ｍｌに掻き取り、該寒天プレートをさらにＬＢ培地３５ｍｌで洗浄した。ＬＢ培地中に得られた細菌／ファージ混合物を遠心して、細菌を除去した。該ファージ上清５０ミリリットルを新しい試験管に移し、ＰＥＧ溶液（２０％ ＰＥＧ８０００、３．５Ｍ 酢酸アンモニウム）１２．５ｍｌを添加し、氷上で２時間インキュベートして、ファージを沈殿させた。沈殿したファージを遠心し、ファージ再懸濁緩衝液（２５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ）６ｍｌに再懸濁した。残存する細菌を遠心除去し、もう一度ＰＥＧ溶液１．５ｍｌを添加することによってファージを沈殿化させ、このファージ溶液をさらに精製した。遠心工程の後、ファージペレットをＰＢＳ４００ｍｌに再懸濁した。この溶液に最後の遠心を行い、残存する一切の細菌残渣を除去した。得られたファージ調製物は、標準的プラーク形成アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｍａｎｉａｔｉｓ他、３版）によって力価測定した。
４．選択及び増幅の繰り返し。
２回目は、１回目（３．Ｃ．項）で増幅したファージ（１０１０ｐｆｕ）を投入ファージとして使用して、選択及び増幅工程（２項及び３項）を実施した。次に、２回目で増幅したファージ（１０１０ｐｆｕ）を投入ファージとして使用して、３回目の選択及び増幅（２項及び３項）を実施した。３回目の溶出段階（２．Ｄ．項、２．Ｅ．項、及び２．Ｆ．）の後、溶出ファージの少量画分をプラーク形成アッセイとして播種した（３．Ｃ．項）。個々のプラークを採取し、各ウェルにＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）１００μｌを含有する９６ウェルマイクロタイタープレートに播種した。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｏｂｒ， ＮＹ（１９８９）。これらのマスタープレートを４℃で一晩インキュベートして、ファージをＴＥ緩衝液に溶出させた。
５．クローン分析（ファージＥＬＩＳＡ及び配列決定）
ファージクローンは、ファージＥＬＩＳＡ及び従来の配列決定方法によって分析した。該配列は、これら２種類のアッセイから得られた結果を合わせたものに基づいて分類した。
ファージクローンは、ファージＥＬＩＳＡ及び従来の配列決定方法によって分析した。該配列は、これら２種類のアッセイから得られた結果を合わせたものに基づいて分類した。
Ａ．ファージＥＬＩＳＡ。ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’培養物を、ＯＤ６００が０．５に達するまで培養した。この培養物３０マイクロリットルを９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートの各ウェルに分注した。（４項の）溶出ファージ１０マイクロリットルを各ウェルに添加し、室温で１５分間細菌に感染させた。１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地１３０マイクロリットルを各ウェルに添加した。次に、該マイクロタイタープレートを振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。組換えＮＧＦタンパク質（１ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液）を９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ）に４℃で一晩コーティングした。対照として、純粋なストレプトアビジンを２μｇ／ｍｌのＰＢＳに溶かして、別のＭａｘｉｓｏｒｐプレートにコーティングした。翌日、タンパク質をコーティングしたＭａｘｉｓｏｒｐプレートの液体を廃棄し、５％ミルク溶液３００ｍｌ中において、４℃で一晩（あるいは、室温で１時間）各ウェルをブロックした。ミルク溶液を廃棄し、ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した。最終洗浄工程後、タンパク質をコートしたＭａｘｉｓｏｒｐプレートの各ウェルにＰＢＳＴ−４％ミルク５０μｌを添加した。９６ウェルマイクロタイタープレートの一晩培養液それぞれ５０μｌをＮＧＦコーティングプレート及び対照ストレプトアビジンコーティングプレートの対応するウェルに移した。２種類のプレート内の混合物１００μｌを室温で１時間インキュベートした。Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートの液体を廃棄し、ウェルをＰＢＳＴで５回洗浄した。ＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を１：７５００に希釈し、該希釈溶液１００μｌをＭａｘｉｓｏｒｐプレートの各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。この液体を再度廃棄し、ウェルをＰＢＳＴで７回洗浄した。発色反応を起こすためにＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ）１００マイクロリットルを各ウェルに添加し、５Ｎ Ｈ２ＳＯ４溶液５０μｌで反応を停止させた。ＯＤ４５０は、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取った。
Ｂ．ファージクローンの配列決定。各ファージクローンについて、配列決定用鋳型はＰＣＲ法によって調製した。以下のオリゴヌクレオチド対、第１プライマー、５’−ＣＧＧＣＧＣＡＡＣＴＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＡＧＣＴＧ−３’（配列番号１２７）及び第２プライマー、５’−ＣＡＴＧＴＡＣＣＧＴＡＡＣＡＣＴＧＡＧＴＴＴＣＧＴＣ−３’（配列番号１２８）を使用して、約５００塩基対の断片を増幅した。以下の混合物を各クローンのために調製した。
サーモサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、カリフォルニア州フォスターシティー）を使用して、以下の行程、９４℃５分、（９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃４５秒）ｘ３０回、７２℃７分、４℃まで冷却を実施した。各反応のＰＣＲ生成物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造者のプロトコールに従って精製した。精製した生成物は、１０ｘアガロースゲル添加色素１μｌを混合したＰＣＲ反応液それぞれ１０μｌを１％アガロースゲルで泳動することによって調べた。次にＡＢＩ３７７シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を使用し、製造者が推薦するプロトコールに従って、残存する生成物の配列を決定した。
６．ペプチド配列のランク付けとコンセンサス配列
Ａ．配列のランク付け。ファージクローンは、ファージＥＬＩＳＡ及びＤＮＡ配列決定から得られた結果を合わせてランク付けした。何回も生じるペプチド配列は、改変用候補と見なした。さらに、ペプチドをコード化するヌクレオチド配列（５．Ｂ．項）それぞれをＥＬＩＳＡデータと対比させた。対応するストレプトアビジンコーティングウェルで生じたＯＤ４５０値よりもＮＧＦコーティングウェルで生じたＯＤ４５０値の方が高いファージクローンによって発現したペプチドも、改変用と見なした。これらの基準に基づいて改変用に選択された各ペプチド配列（配列番号１〜２９）のモノマーは、実施例２で説明したようにヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にインフレームで融合させた（すなわち、修飾ペプチド）。
Ａ．配列のランク付け。ファージクローンは、ファージＥＬＩＳＡ及びＤＮＡ配列決定から得られた結果を合わせてランク付けした。何回も生じるペプチド配列は、改変用候補と見なした。さらに、ペプチドをコード化するヌクレオチド配列（５．Ｂ．項）それぞれをＥＬＩＳＡデータと対比させた。対応するストレプトアビジンコーティングウェルで生じたＯＤ４５０値よりもＮＧＦコーティングウェルで生じたＯＤ４５０値の方が高いファージクローンによって発現したペプチドも、改変用と見なした。これらの基準に基づいて改変用に選択された各ペプチド配列（配列番号１〜２９）のモノマーは、実施例２で説明したようにヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にインフレームで融合させた（すなわち、修飾ペプチド）。
Ｂ．コンセンサス配列の決定。ＴＮ８−ＩＸライブラリーから、２種類の異なるコンセンサス配列を決定した。ＸＣＷＦ／ＷＳ／ＴＥＥＧＣＸＸＸ（配列番号２７４）、及びＸＬ／ＦＱＣＸＦ／ＹＳＸＸＧＣＰＸＸ（配列番号２７５）である。下線を引いた「コアアミノ酸配列」は、それぞれの位置で最も生じる頻度が高いアミノ酸を決定することによって得られた。コア配列に隣接した２個のシステインはＴＮ８−ＩＸライブラリーにおいて固定されたアミノ酸であった。固定システインがその後に続くＬＱＳモチーフ：ＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＬＱＳＣＸＸＸ（配列番号２７６）は、ＴＮ１２−Ｉライブラリーの多くの配列に見いだされた。しかし、Ｌｉｎｅａｒライブラリーから得られた配列には、高度に保存されたモチーフは見いだされなかった。
ペプチド−Ｆｃ融合生成物の構築
前記のように選択した候補ペプチド配列を使用して、各ペプチドのモノマーがヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にインフレームで融合させた融合タンパク質を構築した。修飾ペプチドは、それぞれ、表３に示したオリゴヌクレオチド（「ｏｌｉｇｏ」）対をアニーリングして、前記ペプチドと、前記ペプチドに応じて、ＮｄｅＩからＸｈｏＩ断片としてグリシン残基５個、ロイシン残基１個及びグルタミン酸残基１個を含むリンカーとをコードする二本鎖を作製することによって構築した。ヒトＦｃ遺伝子を含有し、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩでも消化したベクター（ｐＡＭＧ２１−ＦｃＮ−末端、以下にさらに説明する）にこれらの二本鎖を連結した。得られた連結混合物をＥ．コリ細胞２５９６株にエレクトロポレーションすることによって形質転換した（ＧＭ２２１、以下にさらに説明する）。クローンが組換えタンパク質生成物を産生し、正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合物を保持する能力をスクリーニングした。このような単一クローンを修飾ペプチド（すなわち、Ｆｃ−ペプチド融合生成物）それぞれについて選択した。試料ＮＧＦ−Ｃ１２からＮＧＦ−Ｃ１８までのペプチド部分は、前述の分析に基づいたコンセンサス配列であった。
前記のように選択した候補ペプチド配列を使用して、各ペプチドのモノマーがヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にインフレームで融合させた融合タンパク質を構築した。修飾ペプチドは、それぞれ、表３に示したオリゴヌクレオチド（「ｏｌｉｇｏ」）対をアニーリングして、前記ペプチドと、前記ペプチドに応じて、ＮｄｅＩからＸｈｏＩ断片としてグリシン残基５個、ロイシン残基１個及びグルタミン酸残基１個を含むリンカーとをコードする二本鎖を作製することによって構築した。ヒトＦｃ遺伝子を含有し、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩでも消化したベクター（ｐＡＭＧ２１−ＦｃＮ−末端、以下にさらに説明する）にこれらの二本鎖を連結した。得られた連結混合物をＥ．コリ細胞２５９６株にエレクトロポレーションすることによって形質転換した（ＧＭ２２１、以下にさらに説明する）。クローンが組換えタンパク質生成物を産生し、正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合物を保持する能力をスクリーニングした。このような単一クローンを修飾ペプチド（すなわち、Ｆｃ−ペプチド融合生成物）それぞれについて選択した。試料ＮＧＦ−Ｃ１２からＮＧＦ−Ｃ１８までのペプチド部分は、前述の分析に基づいたコンセンサス配列であった。
ｐＡＭＧ２１−Ｆｃ Ｎ末端ベクターの構築
ｐＡＭＧ２１
発現プラスミドｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ番号９８１１３）は、発現ベクターｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ番号６９５７６）及び米国特許第４，７１０，４７３号に記載された発現ベクター系から、国際特許出願第ＷＯ ００／２４７８２号（１００〜１０３ページに渡る実施例２の部分並びに図１７Ａ及び１７Ｂを参照）に記載された方法に従って得た。
ｐＡＭＧ２１
発現プラスミドｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ番号９８１１３）は、発現ベクターｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ番号６９５７６）及び米国特許第４，７１０，４７３号に記載された発現ベクター系から、国際特許出願第ＷＯ ００／２４７８２号（１００〜１０３ページに渡る実施例２の部分並びに図１７Ａ及び１７Ｂを参照）に記載された方法に従って得た。
Ｆｃ Ｎ末端ベクター
発現プラスミドｐＡＭＧ２１のＮｄｅＩとＢａｍＨＩ制限部位の間に挿入されたｐＡＭＧ２１−Ｆｃ Ｎ末端ベクターのＤＮＡ配列を図３に示す。上鎖、配列番号６１、下鎖、配列番号６２。
発現プラスミドｐＡＭＧ２１のＮｄｅＩとＢａｍＨＩ制限部位の間に挿入されたｐＡＭＧ２１−Ｆｃ Ｎ末端ベクターのＤＮＡ配列を図３に示す。上鎖、配列番号６１、下鎖、配列番号６２。
前記のベクター中にスプライシングさせ、Ｆｃペプチド融合生成物として発現させるために作製された３０個のペプチド（配列番号１〜２９）をコードするＤＮＡ配列が、配列番号６３から９１までによって示される。これらのＤＮＡ配列には、Ｍｅｔ−１のコドンが含まれる（この特性は任意選択である）。
これらのＤＮＡ配列によってコードされた、すなわちＮ末端にメチオニン残基を備えて発現した対応する「メチオニン成熟」ペプチドの配列が配列番号９２から１２０までに示されている。
これらの修飾ペプチドをＦｃへのＮ末端融合物として作製し、そのうちいくつかは、Ｃ末端融合生成物としても作製した。Ｃ末端融合生成物を作製するために使用したベクターを以下に示す。
Ｆｃ Ｃ末端ベクター
発現プラスミドｐＡＭＧ２１のＮｄｅＩとＢａｍＨＩ制限部位の間に挿入されたｐＡＭＧ２１−Ｆｃ Ｃ末端ベクターのＤＮＡ配列を図４に示す。上鎖、配列番号１２１、下鎖、配列番号１２２。
発現プラスミドｐＡＭＧ２１のＮｄｅＩとＢａｍＨＩ制限部位の間に挿入されたｐＡＭＧ２１−Ｆｃ Ｃ末端ベクターのＤＮＡ配列を図４に示す。上鎖、配列番号１２１、下鎖、配列番号１２２。
ＧＭ２２１（＃２５９６）。Ｆｃ−ペプチド融合タンパク質を発現するために使用した宿主＃２５９６株は、初期ｅｂｇ領域の温度感受性ラムダリプレッサーｃＩ８５７ｓ７及び後期ｅｂｇ領域のｌａｃＩＱリプレッサーの両方を含むように改変したＥ．コリ Ｋ−１２株である。これら２種類のリプレッサー遺伝子が存在するおかげで、様々な発現系でこの宿主を使用することが可能であるが、該リプレッサーはｌｕｘＰＲからの発現には関係がない。その構築に関する詳細は、ＷＯ ００／２７３７８２（その中の実施例２を参照のこと）に見いだされる。
Ｅ．コリ中での発現。ｐＡＭＧ２１−Ｆｃ融合構築物それぞれのＥ．コリ ＧＭ２２１における培養は、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地中において、３７℃で行った（前述のＳａｍｂｒｏｏｋらの参考文献で引用したＴａｒｔｏｆ ａｎｄ Ｈｏｂｂｓ、「プラスミド及びコスミドクローン増殖用の改変培地」（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ｇｒｏｗｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ａｎｄ ｃｏｓｍｉｄ ｃｌｏｎｅｓ））Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ Ｆｏｃｕｓ、Ｖｏｌｕｍｅ９、ｐａｇｅ１２、１９８７参照）。合成された自動誘導物質Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−ＤＬ−ホモセリンラクトンを最終濃度１ミリリットル当たり２０ナノグラム（ｎｇ／ｍｌ）で培地に添加すると、ｌｕｘＰＲプロモーターからの遺伝子生成物発現の誘導が実現した。培養物を３７℃でさらに６時間インキュベートした。次に、顕微鏡で細菌培養物中の封入体の存在について調べ、遠心によって収集した。光屈折性封入体が誘導培地で認められたことは、Ｆｃ融合物がおそらくＥ．コリの不溶性画分で産生されていることを示唆している。細胞ペレットは、１０％のβ−メルカプトエタノールを含有するＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液に再懸濁することによって直接溶解し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。いずれの場合でも、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にクーマジーで強く染色される適切な分子量のバンドが認められた。
精製。細胞は、高圧ホモゲナイズ（１４０００ＰＳＩで２回通過させる）を使用して水中で破壊し（１／１０）、封入体は遠心によって（Ｊ−６Ｂ遠心器によって、４０００ＲＰＭで１時間）収集した。封入体は、６Ｍ グアニジン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．５の中で、１／１０比で１時間可溶化した。Ｆｃに融合させた直線ペプチドの場合は、可溶化混合物を２Ｍ 尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１６０ｍＭ アルギニン、２ｍＭシステイン、ｐＨ８．５で２５倍に希釈した。この酸化を４℃で２日間続け、ジスルフィド結合化合物（すなわち、Ｆｃ−ペプチドホモダイマー）を形成させた。Ｆｃに融合した環状ペプチドの場合は、同様の方法に、以下の３種類の折りたたみ条件、（１）２Ｍ 尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１６０ｍＭ アルギニン、４ｍＭ システイン、１ｍＭ シスタミン、ｐＨ８．５、（２）４Ｍ 尿素、２０％ グリセロール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１６０ｍＭ アルギニン、２ｍＭ システイン、ｐＨ８．５、及び（３）４Ｍ 尿素、２０％グリセロール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１６０ｍＭ アルギニン、４ｍＭ システイン、１ｍＭ シスタミン、ｐＨ８．５を加えた。リフォールディングしたタンパク質を１．５Ｍ 尿素、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０で透析した。この混合物のｐＨを酢酸でｐＨ５まで下げた。沈殿物を遠心によって除去し、融合生成物それぞれの等電点に応じて上清のｐＨを５から６．５に調節した。該タンパク質を濾過し、２０ｍＭ ＮａＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化し、構築物それぞれについてｐＨを決定したＳＰ−セファロースＨＰカラムに４℃で添加した。該タンパク質は、カラムの２０倍量の同緩衝液で５０ｍＭ ＮａＣｌから５００ｍＭ ＮａＣｌの直線勾配を使用して溶出した。ピークを集め、濾過した。
修飾ペプチドのインビトロにおけるＮＧＦ阻害活性
実施例２で調製した修飾ペプチド（Ｆｃ融合生成物）のＮＧＦ活性阻害剤（すなわち、ＮＧＦ「中和」）としての効果は、各修飾ペプチドがＮＧＦによるバニロイド受容体１（ＶＲ１）発現の誘導をブロックする能力を測定することによって調べた。
実施例２で調製した修飾ペプチド（Ｆｃ融合生成物）のＮＧＦ活性阻害剤（すなわち、ＮＧＦ「中和」）としての効果は、各修飾ペプチドがＮＧＦによるバニロイド受容体１（ＶＲ１）発現の誘導をブロックする能力を測定することによって調べた。
後根神経節神経細胞培養。一定期間妊娠し、最後に麻酔を行ったスプラーグ−ドーリーラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、マサチューセッツ州ウィルミントン）の子宮から外科的に取り出した胎齢１９日（Ｅ１９）のラットの全脊髄部分から後根神神経節（ＤＲＧ）を無菌条件下で１つずつ切断した。５％熱不活性化ウマ血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含有する氷冷Ｌ−１５培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、ニューヨーク州グランドアイランド）にＤＲＧを収集し、疎性結合組織及び血管を除去した。該ＤＲＧはＣａ２＋及びＭｇ２＋を含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）、ｐＨ７．４（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で２回洗浄した。次に、パパイン分離系（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．ニュージャージー州フリーホールド）を使用して該ＤＲＧを単一細胞懸濁液に分離した。簡単に説明すると、Ｅａｒｌｅ‘ｓ緩衝塩類溶液（ＥＢＳＳ）に溶かしたパパイン２０Ｕ／ｍｌを含有する消化溶液中でＤＲＧを３７℃で５０分間インキュベートした。細胞は、ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２、１：１、１ｍｇ／ｍｌ オボムコイド阻害剤及び１ｍｇ／ｍｌオボアルブミン、並びに０．００５％のデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮＡ分解酵素）からなる分離培地でファイアーポリッシュパスツールピペットによって磨砕して分離した。分離した細胞は、２００ｘｇ、５分間でペレットにして、１ｍｇ／ｍｌ オボムコイド阻害剤、１ｍｇ／ｍｌ オボアルブミン及び０．００５％のＤＮＡ分解酵素を含有するＥＢＳＳに再懸濁した。細胞懸濁液は、１０ｍｇ／ｍｌ オボムコイド阻害剤、１０ｍｇ／ｍｌ オボアルブミンを含有する勾配溶液において２００ｘｇで６分間遠心することによって細胞残渣を除去し、次に８８μｍのナイロンメッシュ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ペンシルバニア州ピッツバーグ）で濾過して凝集を除去した。細胞数は血球計数計で測定し、細胞は完全培地に入れて、１００μｇ／ｍｌ ポリオルニチン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）及び１μｇ／ｍｌ マウスラミニン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）でコーティングした９６ウェルプレートに１０ｘ１０３細胞／ウェルで接種した。該完全培地は、基礎培地（ＭＥＭ）及びＨａｍ’ｓ Ｆ１２、１：１、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、及び１０％熱不活性化ウマ血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）から構成された。培養は、３７℃、５％ＣＯ２及び湿度１００％で維持した。非神経細胞の増殖を制御するために、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（７５μＭ）及びウリジン（１８０μＭ）を培地中に含めた。
ＮＧＦ及び抗ＮＧＦによる処理。播種して２時間後、細胞を濃度１０ｎｇ／ｍｌ（０．３８ｎＭ）の組換えヒトβ−ＮＧＦ又は組換えラットβ−ＮＧＦで処理した。系列希釈した抗ＮＧＦ抗体（Ｒ＆Ｂ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を含む陽性対照を各培養プレートに添加した。（実施例２の）修飾ペプチドは、３．１６倍系列希釈を使用して１０段階の濃度を添加した。試料は全て、培地に添加する前に完全培地で希釈した。インキュベーションは、ＶＲ１発現を測定する前に４０時間行った。
ＤＲＧ神経におけるＶＲ１発現の測定。培養物は、Ｈａｎｋ’ｓ緩衝塩類溶液に溶かした４％パラホルムアルデヒド溶液で１５分間固定し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）でブロックし、Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）に溶かした０．２５％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（Ｓｉｇｍａ）を用いて、室温で１時間、透過処理を施した。培養物は０．１％のＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）を含有するＴＢＳで１回洗浄し、ウサギ抗ＶＲ１ＩｇＧ（Ａｍｇｅｎ製）とともに、室温で１時間及び１時間半インキュベートし、その後Ｅｕ標識抗ウサギ第２抗体（Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ、フィンランド、Ｔｕｒｋｕ）とともに、室温で１時間インキュベートした。各抗体とのインキュベートが終了した後、ＴＢＳ洗浄（ゆっくり振盪しながら５分間３回）を行った。増強溶液（１５０μｌ／ウェル、Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ）を該培養物に添加した。次に蛍光シグナルを時間分割型蛍光計（Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ）で測定した。修飾ペプチドで処理した試料におけるＶＲ１発現は、０−１０００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦで測定した標準曲線と比較して決定した。ＤＲＧ神経におけるＶＲ１発現に対するＮＧＦの（可能な最大阻害値に対する）％阻害効果は、ＮＧＦ処理していない対照と比較することによって決定した。表４に結果を示す。実施例１、６項、段落Ａで同定したペプチドのサンプリングの効果も、前述と同様の方法で測定した（データは示さず）。
「＋」は、濃度１８μＭ以下の修飾ペプチドで認められるＮＧＦ誘導活性の阻害が少なくとも５０％であることを示す。
「−」は、少なくとも１８μＭの修飾ペプチドで認められるＮＧＦ誘導活性の阻害が５０％未満であることを示す。
「ｎ／ａ」は、適用しなかったことを意味する。
ペプチドがＦｃのＣ末端に結合させたことを表す「Ｃ末端」がなければ、このようなペプチドはＦｃのＮ末端に結合している。
「−」は、少なくとも１８μＭの修飾ペプチドで認められるＮＧＦ誘導活性の阻害が５０％未満であることを示す。
「ｎ／ａ」は、適用しなかったことを意味する。
ペプチドがＦｃのＣ末端に結合させたことを表す「Ｃ末端」がなければ、このようなペプチドはＦｃのＮ末端に結合している。
ＮＧＦ活性を調節することができる他のペプチドの同定
Ｉ．第２の抗ＮＧＦペプチドライブラリーの構築
Ａ．エレクトロコンピテントＥ．コリ細胞。Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ′エレクトロポレーションコンピテント細胞は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州ラホーヤ）から購入した（カタログ番号２００１５８）。
Ｂ．ｐＣＥＳ１ベクターの改変。ＰＣＲ反応は、Ｅｘｔｅｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、インディアナ州インディアナポリス）で、鋳型はｐＣＥＳ１ベクター（ＴａｒｇｅｔＱｕｅｓｔ Ｉｎｃ．、現Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州ケンブリッジ）１μｇを使用して実施した。ＰＣＲ混合物の容量は１００μｌであり、１ｘＰＣＲ緩衝液、２００ｎＭの各プライマー、
Ｉ．第２の抗ＮＧＦペプチドライブラリーの構築
Ａ．エレクトロコンピテントＥ．コリ細胞。Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ′エレクトロポレーションコンピテント細胞は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州ラホーヤ）から購入した（カタログ番号２００１５８）。
Ｂ．ｐＣＥＳ１ベクターの改変。ＰＣＲ反応は、Ｅｘｔｅｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、インディアナ州インディアナポリス）で、鋳型はｐＣＥＳ１ベクター（ＴａｒｇｅｔＱｕｅｓｔ Ｉｎｃ．、現Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州ケンブリッジ）１μｇを使用して実施した。ＰＣＲ混合物の容量は１００μｌであり、１ｘＰＣＲ緩衝液、２００ｎＭの各プライマー、
ベクターをＥ．コリ細胞にトランスフェクトし、３７℃で一晩インキュベートした。孤立した単一コロニーを選択し、プラスミドはＱｉａｇｅｎ Ｓｐｉｎカラムで精製した。正確に挿入されたかどうかはＤＮＡ配列決定によって確認した。
Ｃ．ベクターＤＮＡの調製。改変ｐＣＥＳ１ベクターＤＮＡ（前記、Ｉ．Ｂ．項）１マイクログラムは、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（ＢＩｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｓ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して、２５００Ｖ、２５μＦ、及び２００オームに設定して、エレクトロコンピテントＸＬ１−Ｂｌｕｅ Ｅ．コリ（Ｉ．Ａ．項）４０μｌに形質転換した。次に、形質転換した細菌試料は、ＳＯＣ（２％トリプトン、０．５％酵母抽出液、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ グルコース、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）９６０μｌを含有する試験管にすぐに移し、この培養物を振盪しながら３７℃で１時間増殖させた。次に、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及び２％グルコースを補給した２ｘＹＴ寒天（２ｘＹＴＡＧＴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）のプレートに前記細胞を広げ、３７℃で一晩インキュベートした。配列決定によって単一コロニーを確認し、これを使用して２ｘＹＴＡＧＴ培地２リットルに接種し、３７℃で一晩振盪した。プラスミドベクターＤＮＡはＱｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉキットで製造者のプロトコールに従って精製した。
Ｄ．ベクターＤＮＡの消化。全体で約１１００マイクログラムのベクターＤＮＡを２つのバッチで消化した。ベクターＤＮＡ８００マイクログラム（Ｉ．Ｃ．項）は、１ｘＮＥＢ緩衝液２、ＡｐａＬＩ１０００単位及びＸｈｏＩ１０００単位を含有する反応液１５００μｌ中において、３７℃で一晩消化した。残りのベクターＤＮＡ３００マイクログラム（Ｉ．Ｃ．項）は、１ｘＮＥＢ緩衝液２、ＡｐａＬＩの２３００単位及びＸｈｏＩの３００単位を含有する反応液５００μｌ中において、３７℃で一晩消化した。両制限酵素消化反応液を３７℃で一晩インキュベートし、予め作製した０．８％アガロースゲル（Ｅｍｂｉ Ｔｅｃ、カリフォルニア州サンディエゴ）で分析した。直線化したベクターＤＮＡはゲルから切り出して、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）で製造者の指示に従って抽出した。
Ｅ．ライブラリーオリゴヌクレオチドの調製。６種類のライブラリーオリゴヌクレオチド（固定２種類、ドープ４種類）は、以前の操作で得られた配列に基づいて設計した。２種類の固定ライブラリーオリゴヌクレオチドは、
Ｅ．ライブラリーオリゴヌクレオチドの調製。６種類のライブラリーオリゴヌクレオチド（固定２種類、ドープ４種類）は、以前の操作で得られた配列に基づいて設計した。２種類の固定ライブラリーオリゴヌクレオチドは、
ＰＣＲ反応用に、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲシステムキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．）を使用した。各ＰＣＲ反応の量は、２４００μｌで、半量はライブラリーオリゴヌクレオチド１ｎＭ、もう半量はライブラリーヌクレオチド１０ｎＭ、１ＸＰＣＲ緩衝液、それぞれのプライマー、
Ｆ．ライブラリーオリゴヌクレオチドの消化。反応液２４００μｌ（Ｉ．Ｅ．項）から得られたＰＣＲ生成物それぞれは、１ｘＮＥＢ緩衝液２、ＡｐａＬＩ２５００単位及びＸｈｏＩ２５０単位を含有する反応液５００μｌ中において、３７℃で一晩消化した。消化したＤＮＡは、既製の３％アガロースゲル（Ｅｍｂｉ Ｔｅｃ）で分離した。各反応から得られた目的のＤＮＡバンドをゲルから切り出して、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットで抽出した。
Ｇ．ベクターとライブラリーオリゴヌクレオチドとの連結。直線化ベクター（Ｉ．Ｄ．項）及び各消化ＰＣＲ生成物（Ｉ．Ｆ．項）を２つのバッチにおいてモル比１：５で連結した。第１のバッチでは、１ｘＮＥＢ連結緩衝液及びＴ４ＤＮＡリガーゼ２００００単位を含有する反応液８００μｌに１種類の固定ライブラリーオリゴヌクレオチド及び３種類のドープライブラリーオリゴヌクレオチドを含め、１６℃で一晩連結し、第２のバッチでは、１ｘＮＥＢ連結緩衝液及びＴ４ＤＮＡリガーゼ２００００単位を含有する反応液４００μｌに２種類の固定ライブラリーオリゴヌクレオチド及び１種類のドープライブラリーオリゴヌクレオチドを含め、１６℃で一晩連結した。連結生成物は、６５℃で２０分間インキュベートして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを不活性化し、ＮｏｔＩ１００単位で３７℃において２時間さらにインキュベートしてベクターの自己連結を最小限に抑えた。次に、連結生成物を標準的なフェノール／クロロホルム抽出によって精製し（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｍａｎｉａｔｉｓ他、３版）、水１００μｌに再懸濁した。
Ｈ．エレクトロポレーション形質転換。ライブラリーそれぞれについて、エレクトロポレーション反応を１０回実施した。各形質転換のために、連結されたベクターＤＮＡ（Ｉ．Ｇ．項）１０μｌ及びＸＬ１−ＢＬＵＥ ＭＲ’細胞（Ｉ．Ａ．項）３００μｌを０．２−ｃｍキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｓ）内で混合した。得られた混合物をＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩで、２５００Ｖ、２５μＦ、２００オームに設定してパルスした。１０回のエレクトロポレーション反応によって得られた形質転換細菌を一緒にして、ＳＯＣ３０ｍｌを含有するフラスコに移して、３７℃で１時間インキュベートした。次に、該細胞を２ｘＹＴＡＧＴ４００ｍｌに添加し、振盪しながら３７℃で５時間増殖させた。次に該細胞を４℃、４０００ｒｐｍで１５分間遠心した。次に、１５％グリセロールを含有する２ｘＹＴブロス１２ｍｌ中に、細胞ペレット再懸濁し、−８０℃で保存した。これがライブラリー用の第１ストックである。力価によって、ライブラリーの大きさは、固定ライブラリー及びドープライブラリーそれぞれについて、２．５ｘ１０９（ライブラリー番号９３）、２．５ｘ１０９（ライブラリー番号５９）、５．０ｘ１０９（ライブラリー番号７２）、８．０ｘ１０９（ライブラリー番号９５）、８．５ｘ１０９（ライブラリー番号３９）独立形質転換体、及び１．５ｘ１０９（ライブラリー番号６３）独立形質転換体であることが示された。
ＩＩ．ライブラリーの増幅。
Ａ．ライブラリーの第２ストックの作製。第１のライブラリー細胞ストック（Ｉ．Ｈ．項）を使用して、開始ＯＤ６００が０．１に等しくなるように、（両固定ライブラリー９３及び５９については）２ｘＹＴＡＧＴ培地１７００ｍｌ、（ドープライブラリー、７２、９５、３９及び６３についてはそれぞれ）１８００ｍｌ、２７００ｍｌ、３０００ｍｌ、１０００ｍｌに接種した。ＯＤ６００が０．５になるまで数時間、３７℃で振盪しながら培養物を増殖させた。各ライブラリーから一定量の１０分の１ずつを取り出して、他のフラスコで３７℃でさらに２時間増殖させた。これら継代培養物を（Ｂｅｃｋｍａｎ ＪＡ−１４ローターを使用して）、４℃、４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、（各ライブラリーの）細菌ペレットを、１５％グリセロールを含有する２ｘＹＴ培地９．５ｍｌに再懸濁して、−８０℃で保存した。
Ｂ．ファージの誘導。一定量のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）をＯＤ６００＝０．５（ＩＩ．Ａ．項）の残存細菌培養物に添加し、最終濃度を３ｘ１０９ｐｆｕ／ｍｌにした。該ヘルパーファージを３７℃で振盪せずに３０分、ゆっくり振盪して３０分細菌に感染させた。感染細胞を４℃、５０００ｘｇで１５分間遠心した。細胞ペレットを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、４０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む同量の（ＩＩ．Ａ．項）２ＹＴ培養液（２ｘＹＴＡＫＴ）に再懸濁した。３０℃で一晩振盪して、ファージミド産生を起こさせた。
Ｃ．ファージの収集。細菌培養物（ＩＩ．Ｂ．項）を４℃、５０００ｒｐｍで１５分間遠心した。上清を新しい瓶に移し、０．２倍量の２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ ＮａＣｌを添加し、氷上で１時間インキュベートしてファージミドを沈殿させた。沈殿したファージミドを、４℃、１００００ｒｐｍで３０分間遠心して、冷却したＰＢＳ１００ｍｌで注意深く再懸濁した。残存する細菌を、４℃、４０００ｒｐｍで１０分間遠心除去し、０．２倍量の２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ ＮａＣｌを添加してファージミドを沈殿化することによって、該ファージ溶液をさらに精製した。４℃、１００００ｒｐｍで３０分間ファージミドを遠心して、冷ＰＢＳ１８ｍを使用してファージミドペレットを再懸濁した。−８０℃で保存するために、６０％のグリセロール溶液６ミリリットルを該ファージミド溶液に添加した。ファージミドの力価は、標準的方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｍａｎｉａｔｉｓ他、３版参照）によって測定した。
ＩＩＩ．ヒトＮＧＦ結合ファージの選択
Ａ．ヒトＮＧＦのビオチン化。ＥＺ−Ｌｉｎｋ−Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を使用し、製造者の指示に従って、１ｍｇのヒトＮＧＦをビオチン化した。
Ａ．ヒトＮＧＦのビオチン化。ＥＺ−Ｌｉｎｋ−Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を使用し、製造者の指示に従って、１ｍｇのヒトＮＧＦをビオチン化した。
Ｂ．ＮＧＦの磁気ビーズへの固定。
ビオチン化ＮＧＦ（ＩＩＩ．Ａ．項）は、製造業者のビーズストック１００μｌ当たりＮＧＦ２００ｎｇの濃度でＤｙｎａｂｅａｄ Ｍ−２８０ ストレプトアビジン（ＤＹＮＡＬ、ニューヨーク州レイクサクセス）に固定した。磁石を使用して該ビーズを試験管の片側へ引き寄せた後、液体をピペットで取り除き、該ビーズをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。該ビオチン化ＮＧＦタンパク質を前記濃度で洗浄したビーズに添加し、回転させながら室温で１時間インキュベートした。次に該ＮＧＦコーティングビーズにＢＳＡを最終濃度２％まで添加し、回転させながら４℃で一晩インキュベートすることによってブロックした。次の項で説明した選択処理を行う前に、得られたＮＧＦコーティングビーズをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で２回洗浄した。
Ｃ．ＮＧＦコーティングビーズを使用した選択
約１０００倍のライブラリー相当のファージミド（ＩＩ．Ｃ．項）は、２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ１ｍｌで１時間ブロックした。ブロックしたファージミド試料に、盲検ビーズ（ＩＩＩ．Ｂ．項と同じビーズであるが、ＮＧＦコーティングされていない）を加えることによって２種類の陰性選択段階を行い、この混合物を回転しながら室温で１５分間インキュベートした。ファージミドを含有する上清は磁石を使用して採取し、盲検ビーズを含む第２の試験管に移し、この混合物を回転させながら室温で１５分間インキュベートした。ファージミドを含有する上清は磁石を使用して採取し、ＮＧＦコーティングビーズ（ＩＩＩ．Ｂ．項）を含む新しい試験管に移し、この混合物を回転させながら室温で１時間インキュベートした。該上清を廃棄した後、ファージミド結合ビーズを２％ミルク−ＰＢＳで１０回、２％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０回、ＰＢＳＴで１０回、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、（ライブラリー７２、９５、３９）のファージミドを、１００ｍＭのトリエチルアミン溶液（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）１ｍｌ中に、回転子上で１０分間溶出させた。ファージミド含有溶液のｐＨは、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）０．５ｍｌを添加することによって中和した。（ライブラリー９３、５９、６３）のファージミドは、１００ｎＭ、１０００ｎＭ、１００ｍＭのＴＥＡで順次溶出した。得られたファージミドを使用して、新たに増殖させたＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’細菌（ＯＤ６００＝約０．５）５ｍｌに３７℃で振盪させずに３０分間、ゆっくり振盪して３０分間感染させた。感染したＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’細胞全てを２ｘＹＴＡＧ大プレートに播種し、３０℃で一晩インキュベートした。
約１０００倍のライブラリー相当のファージミド（ＩＩ．Ｃ．項）は、２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ１ｍｌで１時間ブロックした。ブロックしたファージミド試料に、盲検ビーズ（ＩＩＩ．Ｂ．項と同じビーズであるが、ＮＧＦコーティングされていない）を加えることによって２種類の陰性選択段階を行い、この混合物を回転しながら室温で１５分間インキュベートした。ファージミドを含有する上清は磁石を使用して採取し、盲検ビーズを含む第２の試験管に移し、この混合物を回転させながら室温で１５分間インキュベートした。ファージミドを含有する上清は磁石を使用して採取し、ＮＧＦコーティングビーズ（ＩＩＩ．Ｂ．項）を含む新しい試験管に移し、この混合物を回転させながら室温で１時間インキュベートした。該上清を廃棄した後、ファージミド結合ビーズを２％ミルク−ＰＢＳで１０回、２％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０回、ＰＢＳＴで１０回、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、（ライブラリー７２、９５、３９）のファージミドを、１００ｍＭのトリエチルアミン溶液（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）１ｍｌ中に、回転子上で１０分間溶出させた。ファージミド含有溶液のｐＨは、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）０．５ｍｌを添加することによって中和した。（ライブラリー９３、５９、６３）のファージミドは、１００ｎＭ、１０００ｎＭ、１００ｍＭのＴＥＡで順次溶出した。得られたファージミドを使用して、新たに増殖させたＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’細菌（ＯＤ６００＝約０．５）５ｍｌに３７℃で振盪させずに３０分間、ゆっくり振盪して３０分間感染させた。感染したＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’細胞全てを２ｘＹＴＡＧ大プレートに播種し、３０℃で一晩インキュベートした。
Ｄ．ファージの誘導及び収穫。２ｘＹＴＡＧＴ培地の一定量１０ｍｌを該プレート（ＩＩＩ．Ｃ．項）に添加し、ＸＬ１−ＢＬＵＥ ＭＲＦ’細胞を再懸濁した。全ＸＬ１−ＢＬＵＥ ＭＲＦ’細胞を試験管に収集し、これらの細胞の一定量２５０μｌを２ｘＹＴＡＧＴ２５ｍｌに添加し、ＯＤ６００が０．５に等しくなるまで３７℃で増殖させた。Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを３ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度になるまで添加し、３７℃で振盪せずに３０分間、ゆっくり振盪して３０分間インキュベートした。該細胞を４℃、５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、２５ｍｌの２ｘＹＴＡＫで再懸濁した。該細菌を振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。誘導したファージミドを収穫し、ＩＩ．Ｃ．項で説明したように精製した。
Ｅ．２回目の選択。２回目の選択は、以下に記載されている事項を除き、ＩＩＩ．Ｂ．項及びＩＩＩ．Ｃ．項で概略したように実施した。ＩＩＩ．Ｄ．項から得られた約１００倍のライブラリー相当のファージミドを投入ファージミドとして使用した。
Ｆ．３回目の選択。３回目の選択は、以下に記載されている事項を除き、ＩＩＩ．Ｂ．項及びＩＩＩ．Ｃ．項で概略したように実施した。ＩＩＩ．Ｅ．項から得られた約１０倍のライブラリー相当のファージミドを投入ファージミドとして使用した。ビオチン化ＮＧＦ（ＩＩＩ．Ａ．項）２０ｎｇのみを使用してＤｙｎａｂｅａｄ Ｍ−２８０ストレプトアビジンをコーティングした。ファージ結合ビーズを２％ミルク−ＰＢＳで１０回、２％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０回、ＰＢＳＴで１０回洗浄し、最後の洗浄では、ＰＢＳＴ中において室温で３０分インキュベートを行った。該ビーズをＰＢＳで２回洗浄した。
Ｇ．４回目の選択。４回目の選択は、以下に記載されている事項を除き、ＩＩＩ．Ｂ．項及びＩＩＩ．Ｃ．項で概略したように実施した。３．Ｆ．項から得られた約１倍のライブラリー相当のファージミドを投入ファージミドとして使用した。ビオチン化ＮＧＦ（ＩＩＩ．Ａ．項）２ナノグラムのみを使用してＤｙｎａｂｅａｄ Ｍ−２８０ストレプトアビジンをコーティングした。該ファージ結合ビーズは、３回目と同様にした。
ＩＶ．クローン分析
Ａ．マスタープレートの調製。２回目の選択のコロニー１個を採取し、ウェル当たり２ｘＹＴＡＧＴ１２０μｌを含有する９６ウェルプレートに接種した。該９６ウェルプレートを振盪機中にて３０℃で一晩インキュベートした。ウェル当たり６０％グリセロール４０マイクロリットルを添加し、−８０℃で保存した。
Ａ．マスタープレートの調製。２回目の選択のコロニー１個を採取し、ウェル当たり２ｘＹＴＡＧＴ１２０μｌを含有する９６ウェルプレートに接種した。該９６ウェルプレートを振盪機中にて３０℃で一晩インキュベートした。ウェル当たり６０％グリセロール４０マイクロリットルを添加し、−８０℃で保存した。
Ｂ．ファージミドディープウェルＥＬＩＳＡ。マスタープレートの細胞（ＩＶ．Ａ．項）一定量約２０μｌを、ウェル当たり２ｘＹＴＡＧＴ５００μｌを含有する新しいＣｏｓｔａｒ（登録商標）９６ウェル２ミリリットルアッセイブロック（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、ニューヨーク州コーニング、カタログ番号３９６０）に接種し、ＯＤ６００が約０．５に等しくなるまでこの新しいプレートの細胞を３７℃で増殖させた。Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（１．５ｘ１０１０ｃｆｕ／ｍｌ）を含有する２ｘＹＴＡＧＴ４０マイクロリットルを各ウェルに添加し、該９６ウェルプレートを３７℃で振盪せずに３０分、ゆっくり振盪してさらに３０分インキュベートした。４℃、２０００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ ＣＳ−６Ｒ卓上遠心器）で該プレートを１０分間遠心した。上清をウェルから除去し、各細胞ペレットはウェル当たり２ｘＹＴＡＫＴ５００μｌを使用して再懸濁した。プレートは、ファージミドを発現させるために３０℃で一晩インキュベートした。
ヒトＮＧＦを５μｇ／ｍｌの濃度で１ｘＰＢＳに溶かして、４℃で一晩９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（ＮＵＮＣ）にコーティングした。対照として、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を別のＭａｘｉｓｏｒｐプレートに５μｇ／ｍｌでコーティングした。
翌日、４℃、２０００ｒｐｍで一晩培養した細胞を１０分間遠心した。各ウェルの上清２０マイクロリットルは、該上清を１：２から１：１０の範囲に希釈するために、ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を含有する新しい９６ウェルプレートに移した。得られた混合物を室温で振盪しながら１時間インキュベートし、ファージミドをブロックした。その間に、ＮＧＦコーティングプレートをウェル当たり２％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液２００μｌ中において、室温で振盪しながら１時間ブロックした。ＢＳＡ溶液を廃棄し、各ウェルをＰＢＳ溶液で３回洗浄した。最終洗浄段階後、ブロックしたファージミド溶液１００μｌをＮＧＦコーティングプレート並びに対照プレートの各ウェルに添加し、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。液体を廃棄し、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した。５０００倍に希釈したＨＲＰ複合抗Ｍ１３ｍＡｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）１００マイクロリットルをＮＧＦコーティングプレート及び対照プレートの各ウェルに添加し、これらのプレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。液体を再度廃棄し、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した。ＬｕｍｉＧＬＯ化学ルミネセンス基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メリーランド州ゲーザースバーグ）１００マイクロリットルをウェルに添加し、各ウェルをＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ ＤＬＲｅａｒｌｙ機（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、マサチューセッツ州フランクリン）で読み取った。
Ｃ．ファージクローンの配列決定。ＰＣＲ反応は、鋳型としてマスタープレート（ＩＶ．Ａ．項）の各ウェルの細菌１μｌを使用して実施した。ＰＣＲ混合物それぞれの量は５０μｌであり、１ｘＰＣＲ緩衝液、プライマー、５’−ＧＴＴＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＣ−３’（配列番号２８１）及び５’−ＧＴＡＣＣＧＴＡＡＣＡＣＴＧＡＧＴＴＴＣＧ−３’（配列番号２８２）それぞれ３００ｎＭ、２００μＭ ｄＮＴＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２並びに２．５単位のｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含めた。ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｍｅｎ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を使用して、以下の行程、９４℃５分、（９４℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃９０秒）を４０回、７２℃１０分、４℃まで冷却を実施した。ＰＣＲ生成物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ９６ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）で製造者の指示に従って精製した。精製ＰＣＲ生成物全ては、プライマー５’−ＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ−３’（配列番号２８３）によって、ＡＢＩ３７００シークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用し、製造者の指示に従って配列決定した。
Ｖ．配列のランク付け。ヌクレオチド配列（ＩＶ．Ｃ項）から翻訳したペプチド配列をＥＬＩＳＡデータに関連づけた。改変用と見なしたペプチドは、対応するＢＳＡコーティングウェルで生じたＯＤ４５０値よりもＮＧＦコーティングウェルにおけるＯＤ４５０値の方が高いファージクローンによって発現したものである。複数回生じる配列によってコードされたペプチド配列も、改変用と見なした。この基準によって、ライブラリー９３からは上位２個のペプチド、ライブラリー７２から上位９個のペプチド、ライブラリー３９からは上位１７個のペプチド、ライブラリー９５からは上位１１個のペプチド、ライブラリー５９からは上位６個、及びライブラリー６３からは上位１０個のペプチドを改変用に選択した。
親和性成熟集団から選択した候補ペプチドを使用して、各ペプチドのモノマーがヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にインフレームで融合した融合タンパク質を構築した。ペプチドをＦｃのＮ末端に融合させるために、構築物はオリゴヌクレオチド（「ｏｌｉｇｏ」）対をアニーリングして、該ペプチドと、該ペプチドに応じて、ＮｄｅＩからＸｈｏＩ断片としてグリシン残基５個、ロイシン残基１個及びグルタミン酸残基１個を含むリンカーとをコード化する二本鎖を作製した。ヒトＦｃ遺伝子を含有し、またＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化したベクター（ｐＡＭＧ２１−Ｆｃ Ｎ−末端、前述）にこれらの二本鎖分子を連結することによって作製した。得られた連結混合物をＥ．コリ２５９６細胞株にエレクトロポレーションすることによって形質転換した（ＧＭ２２１、以下にさらに説明する）。クローンが組換えタンパク質生成物を産生し、正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合物を保持する能力をスクリーニングした。このような単一のクローンを表５に示した修飾ペプチド（すなわち、Ｆｃ−ペプチド融合生成物）それぞれについて選択した。ペプチドをＦｃのＣ末端に融合するために、構築物はオリゴヌクレオチド（「ｏｌｉｇｏ」）対をアニーリングして、グリシン残基５個、アラニン１個及びグルタミン残基１個、該ペプチド、それに続いてＡｐａＬＩからＸｈｏＩ断片としてロイシン残基１個及びグルタミン酸残基１個をコード化する二本鎖を作製することによって構築した。ヒトＦｃ遺伝子を含有し、またＡｐａＬＩ及びＸｈｏＩで消化したベクター（ｐＡＭＧ２１−Ｆｃ Ｃ−末端、前述）にこれらの二本鎖分子を連結した。得られた連結混合物を前述のように形質転換し、スクリーニングした。切断型の選択ペプチドは、鋳型として親構築物を使用したＰＣＲによって作製した。所望する配列をコード化するＰＣＲ生成物は、ＢｓｒＧＩからＢａｍＨＩ断片、ＮｃｏＩからＢｓｒＧＩ断片又はＮｄｅＩからＢｓｒＧＩ断片として親構築物に連結した。得られた連結混合物を前述のように形質転換し、スクリーニングした。
得られた修飾ペプチドのＤＲＧ中和アッセイ（方法については前記参照）における試験結果を表５に示す。親和性成熟集団から選択したペプチドの効果は、同様の方法でＤＲＧ中和アッセイによって測定した。
「＋」は、濃度２０μＭ以下の修飾ペプチドで認められるＮＧＦ誘導活性の阻害が少なくとも５０％であることを示す。
「−」は、少なくとも２０μＭの修飾ペプチドで認められるＮＧＦ誘導活性の阻害が５０％未満であることを示す。
「ｎ／ａ」は、適用しなかったことを意味する。
＊（Ｌ）−（Ｐ）融合物がＦｃドメイン（配列番号６０）のＣ末端に結合させたことを表す「Ｃ末端」がなければ、（Ｌ）−（Ｐ）融合物はＦｃドメインＮ末端（メチオニンを欠失した配列番号６０）のＮ末端に結合させた。
「−」は、少なくとも２０μＭの修飾ペプチドで認められるＮＧＦ誘導活性の阻害が５０％未満であることを示す。
「ｎ／ａ」は、適用しなかったことを意味する。
＊（Ｌ）−（Ｐ）融合物がＦｃドメイン（配列番号６０）のＣ末端に結合させたことを表す「Ｃ末端」がなければ、（Ｌ）−（Ｐ）融合物はＦｃドメインＮ末端（メチオニンを欠失した配列番号６０）のＮ末端に結合させた。
ラット疼痛モデルにおける抗ＮＧＦ成熟修飾ペプチドの抗侵害受容活性
Ａ．神経因性疼痛モデル。雄のスプラーグ−ドーリーラット（２００ｇ）をイソフルラン吸入麻酔で麻酔して、Ｋｉｍ ａｎｄ Ｃｈｕｎｇ（Ｋｉｍ、Ｓ．Ｈ．．Ｃｈｕｎｇ、Ｊ．Ｍ．「分節脊髄神経連結によって作製したラットの末梢神経障害実験モデル（Ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｓｅｇｍｅｎｔａｌ ｓｐｉｎａｌ ｎｅｒｖｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ．）」Ｐａｉｎ ５０：３５５−３６３、（１９９２））によって最初に報告されたように、後根神経節末梢側で座骨神経に入る前に左腰髄をＬ５及びＬ６のレベルで強く結紮した（４−０絹縫合糸）。切り口を縫合し、ラットを回復させた。この方法では、ワイヤーメッシュ製観察用ケージから足裏（足蹠の中間）表面に垂直に（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ型刺激毛によって４．０から１４８．１ｍＮの範囲の）段階的刺激を加え、（神経傷害と同側の）処置した足が回避する圧力を記録することによって評価を行ったところ、後肢左足において機械的（触覚）アロディニア（異痛症）が生じた。足の回避閾値（ＰＷＴ）は、刺激強度を連続的に増加及び減少させることによって測定し、回避データはＣｈａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｃｈａｐｌａｎ、Ｓ．Ｒ．， Ｂａｃｈ、Ｆ．Ｗ．,Ｐｏｇｒｅｌ， Ｊ．Ｗ．Ｃｈｕｎｇ，Ｊ．Ｍ．， Ｙａｋｓｈ， Ｔ．Ｌ．， Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔａｃｔｉｌｅ ａｌｌｏｄｙｎｉａ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｐａｗ．， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ、５３：５５−６３（１９９４））に記載されているように、ディクソンのノンパラメトリック検定を使用して分析した。
Ａ．神経因性疼痛モデル。雄のスプラーグ−ドーリーラット（２００ｇ）をイソフルラン吸入麻酔で麻酔して、Ｋｉｍ ａｎｄ Ｃｈｕｎｇ（Ｋｉｍ、Ｓ．Ｈ．．Ｃｈｕｎｇ、Ｊ．Ｍ．「分節脊髄神経連結によって作製したラットの末梢神経障害実験モデル（Ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｓｅｇｍｅｎｔａｌ ｓｐｉｎａｌ ｎｅｒｖｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ．）」Ｐａｉｎ ５０：３５５−３６３、（１９９２））によって最初に報告されたように、後根神経節末梢側で座骨神経に入る前に左腰髄をＬ５及びＬ６のレベルで強く結紮した（４−０絹縫合糸）。切り口を縫合し、ラットを回復させた。この方法では、ワイヤーメッシュ製観察用ケージから足裏（足蹠の中間）表面に垂直に（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ型刺激毛によって４．０から１４８．１ｍＮの範囲の）段階的刺激を加え、（神経傷害と同側の）処置した足が回避する圧力を記録することによって評価を行ったところ、後肢左足において機械的（触覚）アロディニア（異痛症）が生じた。足の回避閾値（ＰＷＴ）は、刺激強度を連続的に増加及び減少させることによって測定し、回避データはＣｈａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｃｈａｐｌａｎ、Ｓ．Ｒ．， Ｂａｃｈ、Ｆ．Ｗ．,Ｐｏｇｒｅｌ， Ｊ．Ｗ．Ｃｈｕｎｇ，Ｊ．Ｍ．， Ｙａｋｓｈ， Ｔ．Ｌ．， Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔａｃｔｉｌｅ ａｌｌｏｄｙｎｉａ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｐａｗ．， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ、５３：５５−６３（１９９４））に記載されているように、ディクソンのノンパラメトリック検定を使用して分析した。
正常なラット及び疑似処置ラット（神経は分離したが、結紮はしない）は、少なくとも１４８．１ｍＮ（１５ｇ相当）の圧力でも応答を示さず抵抗した。脊髄神経を結紮したラットは、処置した足では４．０ｍＮ（０．４１ｇ相当）といった少ない圧力であっても応答した。運動機能障害（例えば、足を引きずったり、垂れ下がったりする）を示さず、ＰＷＴが３９．２ｍＮ（４．０ｇに相当）未満の場合のみ、そのラットをこの研究に加えた。術後少なくとも７日経ってから、インビトロで２０ｎＭ以下の濃度でＮＧＦ誘導活性を少なくとも５０％阻害することが既に認められている成熟修飾ペプチド（表５において「＋」で示した成熟修飾ペプチド）でラットを処理した。一般的に、ラットは成熟修飾ペプチド又は対照希釈液（ＰＢＳ）６０ｍｇ／ｋｇのスクリーニング用量でｓ．ｃ．注射によって１回処理し、ＰＷＴをその後毎日７日間測定した（図５）。
Ｂ．ＣＦＡ炎症疼痛モデル。雄のスプラーグ−ドーリーラット（２００ｇ）をイソフルラン吸入麻酔で軽く麻酔して、後肢左足にフロインド完全アジュバント（ＣＦＡ）０．１５ｍｌを注射した。この方法では、ワイヤーメッシュ製観察用ケージから足裏（足蹠の中間）表面に垂直に（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ型刺激毛によって４．０から１４８．１ｍＮの範囲の）段階的刺激を加え、処置した足が回避する圧力を記録することによって評価を行ったところ、後肢左足において機械的（触覚）アロディニア（異痛症）が生じた。ＰＷＴは、刺激強度を連続的に増加及び減少させることによって測定し、Ｃｈａｐｌａｎ他（１９９４）が記載したようにディクソンのノンパラメトリック検定を使用して回避データを分析した。運動機能障害（例えば、足を引きずったり、垂れ下がったりする）又は皮膚破裂を示さず、ＰＷＴが３９．２ｍＮ（４．０ｇ相当）未満の場合のみ、そのラットはこの研究に含めた。
ＣＦＡ注射後少なくとも７日経ってから、既にインビトロで２０ｎＭ以下の濃度でＮＧＦ誘導活性を少なくとも５０％阻害することが認められた成熟修飾ペプチド（表５において「＋」で示した成熟修飾ペプチド）で処理した。一般的に、ラットは成熟修飾ペプチド又は対照希釈液（ＰＢＳ）６０ｍｇ／ｋｇのスクリーニング用量でｓ．ｃ．注射によって１回処理し、ＰＷＴはその後毎日７日間測定した。平均足回避閾値（ＰＷＴ）は、以下の式、％ＭＰＥ＝１００＊（処理ラットのＰＷＴ−対照ラットのＰＷＴ）／（１５−対照ラットのＰＷＴ）を使用した可能な最大効果のパーセント（％ＭＰＥ）に変換した。したがって、１５ｇ（１４８．１ｍＮ）のカットオフ値は、ＭＰＥの１００％に相当し、対照応答は０％ＭＰＥに相当する。
スクリーニング用量６０ｍｇ／ｋｇでは、ある種の修飾ペプチドは１回ｓ．ｃ．注射すると３日又は４日位内に抗侵害受容性効果が生じた（図６）。活性のある修飾ペプチドの識別可能な効果は一般的に、注射後５日目と６日目の間に減退した。
Claims (157)
- 式：ａ１ａ２ａ３Ｃａ５ａ６ａ７ａ８ａ９ａ１０ａ１１ＬＱＳＣａ１６ａ１７ａ１８（配列番号２７６）
（式中、
ａ１、ａ２、ａ３、ａ５、ａ６、ａ８、及びａ１８は、それぞれ独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり、
ａ７は、中性の疎水性アミノ酸残基又は極性の疎水性アミノ酸残基であり、
ａ９は、中性の疎水性アミノ酸残基又は極性の疎水性アミノ酸残基であり、
ａ１０は、中性の疎水性アミノ酸残基、中性の極性アミノ酸残基又は塩基性のアミノ酸残基であり、
ａ１１は、中性の疎水性アミノ酸残基、中性の極性アミノ酸残基又は塩基性のアミノ酸残基であり、
ａ１６は、中性の疎水性アミノ酸残基であり、
ａ１７は、中性の疎水性アミノ酸残基又は極性の疎水性アミノ酸残基である。）
のアミノ酸配列又は生理的に許容されるその塩を有し、ＮＧＦ活性を調節することができるペプチド。 - ａ１が、Ｌ、Ｐ、Ｗ、Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ｎ、Ｒ又はＨであり、
ａ２が、Ｌ、Ｗ、Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ｄ又はＲであり、
ａ３が、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｙ、Ｄ又はＥであり、
ａ５が、Ａ、Ｌ、Ｇ、Ｄ、Ｅ又はＫであり、
ａ６が、Ａ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｎ、Ｅ、Ｋ又はＨであり、
ａ７が、Ｌ、Ｐ、Ｙ又はＮであり、
ａ８が、Ａ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｇ、Ｑ又はＤであり、
ａ９が、Ｐ、Ｍ、Ｔ、Ｇ又はＳであり、
ａ１０が、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｈ、Ｇ又はＳであり、
ａ１１が、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｔ、Ｎ又はＫであり、
ａ１６が、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｍ又はＦであり、
ａ１７が、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｗ又はＮであり、
ａ１８が、Ｆ、Ｗ又はＹである、請求項１に記載のペプチド。 - ａ１が、Ｗであり、
ａ２が、Ｄであり、
ａ６が、Ｆであり、
ａ１０が、Ａであり、
ａ１１が、Ｋであり、
ａ１６が、Ｆである、請求項２に記載のペプチド。 - ａ１−ａ１８がＷＤＭＣＨＦＳＨＡＡＫＬＱＳＣＦＰＨ（配列番号２７３）である、請求項３に記載のペプチド。
- 請求項１から４に記載の少なくとも１つのペプチドと少なくとも１つのビヒクルとを含み、ＮＧＦ活性を調節することができる、修飾ペプチド。
- 前記ビヒクルが、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール、脂質、コレステロール基、炭水化物及びオリゴ糖からなる群から選択される、請求項５に記載の修飾ペプチド。
- 環状である、請求項１、２、３又は４に記載のペプチド。
- 請求項１、２、３又は４に記載のペプチドの二量体又は多量体。
- 式：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ及びその多量体
（式中、
Ｆ１は、ビヒクルであり、
Ｘ１とＸ２は、それぞれ独立に、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３、及び
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４、
から選択される
（式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の一以上は、それぞれ独立に、請求項１、２、３又は４に記載のペプチドを含み、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、それぞれ独立に、リンカーであり、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ独立に、０又は１である（但し、ａとｂのうち少なくとも１つは１である。）。）。）
又は生理的に許容されるその塩を有し、ＮＧＦ活性を調節することができる修飾ペプチド。 - Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の一以上が、それぞれ独立に、配列番号２７３に示されているペプチドを有する、請求項９に記載の修飾ペプチド。
- 式：Ｘ１−Ｆ１若しくはＦ１−Ｘ２又は生理的に許容されるその塩の請求項９に記載の修飾ペプチド
- 式：Ｆ−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１又は生理的に許容されるその塩の請求項９に記載の修飾ペプチド。
- 式：Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２又は生理的に許容されるその塩の請求項９に記載の修飾ペプチド。
- 式：Ｐ１−（Ｌ１）ｃ−Ｆ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２又は生理的に許容されるその塩の請求項９に記載の修飾ペプチド。
- Ｆ１がＦｃドメイン又はその断片である、請求項９、１０、１１、１２、１３又は１４に記載の修飾ペプチド。
- Ｆ１が配列番号６０のアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の修飾ペプチド。
- 請求項１、５、９、１４又は１６に記載のペプチド又は修飾ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項１７のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項１８の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 前記細胞が原核細胞である、請求項１９に記載の宿主細胞。
- 前記細胞がＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項２０に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項１９に記載の宿主細胞。
- 式：ｂ１ｂ２ｂ３ＣＷｂ６ｂ７ｂ８ｂ９ＧＣｂ１２ｂ１３ｂ１４（配列番号２７４）
（式中、
ｂ１、ｂ２、ｂ３、ｂ８、ｂ９、ｂ１３及びｂ１４は、それぞれ独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり、
ｂ６は、中性の疎水性アミノ酸残基であり、
ｂ７は、極性の疎水性アミノ酸残基であり、
ｂ１２は、中性の疎水性アミノ酸残基又は酸性のアミノ酸残基である。）
のアミノ酸配列又は生理的に許容されるその塩を有し、ＮＧＦ活性を調節することができるペプチド。 - ｂ１が、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ、Ｔ、Ｙ又はＥであり、
ｂ２が、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ｑ又はＨであり、
ｂ３が、Ｗ、Ｍ、Ｇ、Ｑ又はＥであり、
ｂ６が、Ｆ又はＷであり、
ｂ７が、Ｔ又はＳであり、
ｂ８が、Ａ、Ｐ、Ｗ、Ｓ、Ｅ又はＤであり、
ｂ９が、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｅ又はＫであり、
ｂ１２が、Ｖ、Ｉ、Ｐ、Ｄ又はＥである、請求項２３に記載のペプチド。 - ｂ１が、Ｌ又はＩであり、
ｂ２が、Ｑ又はＨであり、
ｂ３が、Ｇ又はＭであり、
ｂ６が、Ｆ又はＷであり、
ｂ７が、Ｔ又はＳであり、
ｂ８が、Ｅ又はＤであり、
ｂ９が、Ｅ又はＫであり、
ｂ１２が、Ｖ又はＥであり、
ｂ１３が、Ｖ、Ｗ又はＹであり、
ｂ１４が、Ｐ、Ｓ又はＱである、請求項２３に記載のペプチド。 - ＩＨＧＣＷＦＴＥＥＧＣＶＷＱ（配列番号２７７）及びＬＱＭＣＷＦＴＥＫＧＣＥＶＰ（配列番号２７８）又は生理的に許容されるそれらの塩からなる群から選択され、ＮＧＦ活性を調節することができるペプチド。
- 少なくとも１つの請求項２３、２４又は２５に記載のペプチドと少なくとも１つのビヒクルとを含み、ＮＧＦ活性を調節することができる組成物。
- 前記ビヒクルが、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール、脂質、コレステロール基、炭水化物及びオリゴ糖からなる群から選択される、請求項２７に記載の組成物。
- 環状である、請求項２３、２４又は２５に記載のペプチド。
- 請求項２３、２４又は２５に記載のペプチドの二量体又は多量体。
- 式：（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ及びその多量体
（式中、
Ｆ１は、ビヒクルであり、
Ｘ１とＸ２は、それぞれ独立に、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３、及び
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４
から選択される
（式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の一以上は、それぞれ独立に、請求項２３、２４又は２５に記載のペプチドを含み、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、それぞれ独立に、リンカーであり、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ独立に、０又は１である（但し、ａとｂのうち少なくとも１つは１である。）。）。）
又は生理的に許容されるその塩を有し、前記ペプチドがＮＧＦ活性を調節することができる、組成物。 - Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の一以上が、それぞれ独立に、配列番号２７７及び２７８からなる群から選択されるペプチドを有する、請求項３１に記載の組成物。
- 式：Ｘ１−Ｆ１若しくはＦ１−Ｘ２又は生理的に許容されるその塩の請求項３１に記載の組成物。
- 式：Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１又は生理的に許容されるその塩の請求項３１に記載の組成物。
- 式：Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２又は生理的に許容されるその塩の請求項３１に記載の組成物。
- 式：Ｐ１−（Ｌ１）ｃ−Ｆ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２又は生理的に許容されるその塩の請求項３１に記載の組成物。
- Ｆ１がＦｃドメイン又はその断片である、請求項３１に記載の組成物。
- Ｆ１が配列番号６０のアミノ酸配列又はその断片を有する、請求項３１に記載のた組成物。
- 請求項２３、２７、３１、３６又は３８に記載のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項３９のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項４０の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 前記細胞が原核細胞である、請求項４１に記載の宿主細胞。
- 前記細胞がＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項４２に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項４１に記載の宿主細胞。
- 式：ｃ１ｃ２ＱＣｃ５ｃ６Ｓｃ８ｃ９ＧＣｃ１２ｃ１３ｃ１４ｃ１５ｃ１６
（式中、
ｃ１、ｃ５、ｃ８、ｃ９、ｃ１３及びｃ１４は、それぞれ独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり、
ｃ２は、中性の疎水性アミノ酸残基であり、
ｃ６は、中性の疎水性アミノ酸残基又は極性の疎水性アミノ酸残基であり、
ｃ１２は、中性の疎水性アミノ酸残基又は酸性のアミノ酸残基である。）
のアミノ酸配列又は生理的に許容されるその塩を有し、ＮＧＦ活性を調節することができるペプチド。 - ｃ１が、Ｖ、Ｉ、Ｔ、Ｙ、Ｎ又はＫであり、
ｃ２が、Ｌ、Ｍ又はＦであり、
ｃ５が、Ｓ、Ｑ又はＥであり、
ｃ６が、Ｌ、Ｆ、Ｗ又はＹであり、
ｃ８が、Ｗ、Ｍ、Ｔ、Ｇ、Ｓ又はＮであり、
ｃ９が、Ａ、Ｖ、Ｇ、Ｓ又はＥであり、
ｃ１２が、Ｌ、Ｐ、Ｇ、Ｄ又はＥであり、
ｃ１３が、Ｋ、Ｉ、Ｌ、Ｙ又はＱであり、
ｃ１４が、Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｍ又はＱである、請求項４５に記載のペプチド。 - ｃ１が、Ｋ又はＴであり、
ｃ２が、Ｌ又はＦであり、
ｃ５が、Ｅ又はＱであり、
ｃ６が、Ｌ，Ｆ又はＹであり、
ｃ８が、Ｔであり、
ｃ９が、Ｓ又はＡであり、
ｃ１２が、Ｐ又はＬであり、
ｃ１５が、Ｌであり又は存在しない、
ｃ１６が、Ｅであり又は存在しない、請求項４６に記載のペプチド。 - 配列番号２０８，２０９、２２４、２３３、２３４、２４１、２４６、２７９及び２８０又は生理的に許容されるそれらの塩からなる群から選択され、ＮＧＦ活性を調節することができるペプチド。
- 請求項４５、４６、４７又は４８に記載の少なくとも１つのペプチドと少なくとも１つのビヒクルとを含み、ＮＧＦ活性を調節することができる、組成物。
- 前記ビヒクルが、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール、脂質、コレステロール基、炭水化物及びオリゴ糖からなる群から選択される、請求項４９に記載の組成物。
- 環状である、請求項４５、４６、４７又は４８に記載のペプチド。
- 請求項４５、４６、４７又は４８に記載のペプチドの二量体又は多量体。
- 式：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ及びその多量体
（式中、
Ｆ１は、ビヒクルであり、
Ｘ１とＸ２は、それぞれ独立に、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３、及び
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４、
から選択される
（式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の一以上は、それぞれ独立に、請求項４５、４６、４７又は４８に記載のペプチドを含み、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、それぞれ独立に、リンカーであり、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ独立に、０又は１である（但し、ａとｂのうち少なくとも１つは１である。）。）。）
又は生理的に許容されるその塩を有し、前記ペプチドがＮＧＦ活性を調節することができる、組成物。 - Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の一以上が、それぞれ独立に、配列番号２０８、２０９、２２４、２３３、２３４、２４１、２４６、２７９及び２８０からなる群から選択されるペプチドを有する、請求項５３に記載の組成物。
- 式：Ｘ１−Ｆ１若しくはＦ１−Ｘ２又は生理的に許容されるその塩の請求項５３に記載の組成物。
- 式：Ｆ−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１又は生理的に許容されるその塩の請求項５３に記載の組成物。
- 式：Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２又は生理的に許容されるその塩の請求項５３に記載の組成物。
- 式：Ｐ１−（Ｌ１）ｃ−Ｆ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２又は生理的に許容されるその塩の請求項５３に記載の組成物。
- Ｆ１がＦｃドメイン又はその断片である、請求項５３に記載の組成物。
- Ｆ１が配列番号６０のアミノ酸配列又はその断片を有する、請求項５３に記載の組成物。
- 請求項４５、４７、４９、５３又は５６に記載のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項６１のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項６２の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 前記細胞が原核細胞である、請求項６３に記載の宿主細胞。
- 前記細胞がＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項６４に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項６３に記載の宿主細胞。
- 式：
ｄ１ｄ２ｄ３ｄ４ｄ５ｄ６ｄ７ＰＰｄ１０ｄ１１ｄ１２ｄ１３ｄ１４ｄ１５Ｐｄ１７ｄ１８ｄ１９ｄ２０ｄ２１ｄ２２ｄ２３ｄ２４
（式中、
ｄ１が、Ｗ、Ｙ、Ｑ又はＥであり、
ｄ２が、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｓ又はＱであり、
ｄ３が、Ｗ、Ｆ、Ｇ、Ｓ又はＱであり、
ｄ４が、Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ又はＫであり、
ｄ５が、Ｖ、Ｗ、Ｇ又はＲであり、
ｄ６が、Ｍ、Ｓ、Ｙ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｋ又はＲであり、
ｄ７が、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｗ、Ｑ又はＨであり、
ｄ１０が、Ｄ又はＥであり、
ｄ１１が、Ｖ又はＩであり、
ｄ１２が、Ｖ、Ｌ、Ｆ又はＹであり、
ｄ１３が、Ｖ、Ｌ、Ｇ、Ｑ又はＥであり、
ｄ１４が、Ｑ、Ｄ又はＥであり、
ｄ１５が、Ｗ又はＣであり、
ｄ１７が、Ｗ、Ｙ又はＱであり、
ｄ１８が、Ｖ、Ｔ、Ｑ、Ｎ又はＫであり、
ｄ１９が、Ａ、Ｌ又はＰであり、
ｄ２０が、Ｐ、Ｑ、Ｒ又はＨであり、
ｄ２１が、Ｖ、Ｉ、Ｗ、又はＤであり、
ｄ２２が、Ａ、Ｉ、Ｓ、Ｑ又はＤであり、
ｄ２３が、Ｌであり又は存在しない、
ｄ２４が、Ｅであり又は存在しない。）
のアミノ酸配列又は生理的に許容されるその塩を有し、ＮＧＦ活性を調節することができるペプチド。 - ｄ１が、Ｑ又はＹであり、
ｄ２が、Ｌであり、
ｄ３が、Ｗ又はＤであり、
ｄ４が、Ｄ、Ｅ又はＫであり、
ｄ５が、Ｖ、Ｗ又はＧであり、
ｄ６が、Ｑ、Ｋ又はＲであり、
ｄ７が、Ｗ又はＬであり、
ｄ１０が、Ｅ又はＤであり、
ｄ１１が、Ｖ又はＩであり、
ｄ１２が、Ｖ、Ｌ又はＦであり、
ｄ１３が、Ｖ、Ｌ又はＧであり、
ｄ１４が、Ｑ、Ｄ又はＥであり、
ｄ１５が、Ｗ又はＣであり、
ｄ１７が、Ｗ又はＹであり、
ｄ１８が、Ｑ、Ｋ又はＮであり、
ｄ１９が、Ｐ、Ｖ又はＬであり、
ｄ２０が、Ｐ又はＳであり、
ｄ２１が、Ｖであり、
ｄ２２が、Ｑ又はＤであり、
ｄ２３が、Ｌであり又は存在しない、
ｄ２４が、Ｅであり又は存在しない、請求項６７に記載のペプチド。 - 配列番号２０３，２２８、２４０、２４７及び２６６又は生理的に許容されるそれらの塩からなる群から選択され、ＮＧＦ活性を調節することができるペプチド。
- 請求項６７、６８又は６９に記載の少なくとも１つのペプチドと少なくとも１つのビヒクルとを含み、ＮＧＦ活性を調節することができる、組成物。
- 前記ビヒクルが、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール、脂質、コレステロール基、炭水化物及びオリゴ糖からなる群から選択される、請求項７０に記載の組成物。
- 環状である、請求項６７、６８又は６９に記載のペプチド。
- 請求項６７、６８又は６９に記載のペプチドの二量体又は多量体。
- 式：（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ及びそれらの多量体
（式中、
Ｆ１は、ビヒクルであり、
Ｘ１とＸ２は、それぞれ独立に、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３、及び
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４、
から選択される
（式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の一以上は、それぞれ独立に、請求項６７、６８又は６９に記載のペプチドを含み、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、それぞれ独立に、リンカーであり、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ独立に、０又は１である（但し、ａとｂのうち少なくとも１つは１である。）。）。）
又は生理的に許容されるその塩を有し、前記ペプチドがＮＧＦ活性を調節することができる、組成物。 - Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の一以上が、それぞれ独立に、配列番号２０３、２２８、２４０、２４７及び２６６からなる群から選択されるペプチドを有する、請求項７３に記載の組成物。
- 式：Ｘ１−Ｆ１若しくはＦ１−Ｘ２又は生理的に許容されるその塩の請求項７３に記載の組成物。
- 式：Ｆ−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１又は生理的に許容されるその塩の請求項７３に記載の組成物。
- 式：Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２又は生理的に許容されるその塩の請求項７３に記載の組成物。
- 式：Ｐ１−（Ｌ１）ｃ−Ｆ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２又は生理的に許容されるその塩の請求項７３に記載の組成物。
- Ｆ１がＦｃドメイン又はその断片である、請求項７３に記載の組成物。
- Ｆ１が配列番号６０のアミノ酸配列又はその断片を有する、請求項７３に記載の組成物。
- 請求項６７、６８又は６９に記載のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項８２のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項８３の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 前記細胞が原核細胞である、請求項８４に記載の宿主細胞。
- 前記細胞がＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項８５に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項８４に記載の宿主細胞。
- 式：ｆ１ｆ２ｆ３ｆ４ｆ５ｆ６ｆ７ｆ８ｆ９ｆ１０ｆ１１Ｌｆ１３ＥＱＹＦｆ１８Ｌｆ２０ＰＰＧｆ２４ｆ２５ｆ２６
（式中、
ｆ１−ｆ６、ｆ８、ｆ９、ｆ１１、ｆ１８、ｆ２４、ｆ２５及びｆ２６は、それぞれ独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり、
ｆ７、ｆ１０及びｆ１３は、それぞれ独立に、中性の疎水性アミノ酸残基又は極性の疎水性アミノ酸残基であり、
ｆ２０は、Ｔ、Ｍ又はＩである。）
のアミノ酸配列又は生理的に許容されるその塩を有し、ＮＧＦ活性を調節することができるペプチド。 - ｆ１が、Ａであり又は存在しない、
ｆ２が、Ｑであり又は存在しない、
ｆ３が、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｑ又はＮであり、
ｆ４が、Ａ、Ｉ、Ｐ、Ｔ、Ｇ又はＱであり、
ｆ５が、Ｍ、Ｇ、Ｅ又はＤであり、
ｆ６が、Ｗ又はＨであり、
ｆ７が、Ｌ、Ｐ又はＭであり、
ｆ８が、Ｇ、Ｌ、Ｒ又はＳであり、
ｆ９が、Ａ、Ｑ、Ｄ又はＥであり、
ｆ１０が、Ｌ、Ｎ又はＭであり、
ｆ１１が、Ｐ、Ｒ又はＳであり、
ｆ１３が、Ｌ、Ｆ又はＹであり、
ｆ１８が、Ａ、Ｑ、Ｅ又はＲであり、
ｆ２０が、Ｔ、Ｍ又はＩであり、
ｆ２４が、Ｌ、Ｉ、Ｖ又はＹであり、
ｆ２５が、Ｌであり又は存在しない、
ｆ２６が、Ｅであり又は存在しない、請求項８８に記載のペプチド。 - ｆ１が、Ａであり又は存在しない、
ｆ２が、Ｑであり又は存在しない、
ｆ３が、Ｍ、Ｑ又はＮであり、
ｆ４が、Ｉ、Ｐ、Ｔ又はＧであり、
ｆ５が、Ｍ、Ｇ又はＤであり、
ｆ６が、Ｗ又はＨであり、
ｆ７が、Ｌ又はＰであり、
ｆ８が、Ｇ、Ｌ又はＳであり、
ｆ９が、Ａ、Ｑ又はＤであり、
ｆ１０が、Ｌ、Ｎ又はＭであり、
ｆ１１が、Ｐ、Ｒ又はＳであり、
ｆ１３が、Ｌ又はＦであり、
ｆ１８が、Ａ、Ｑ又はＥであり、
ｆ２０が、Ｔ、Ｍ又はＩであり、
ｆ２４が、Ｌ、Ｉ又はＶであり、
ｆ２５が、Ｌであり又は存在しない、
ｆ２６が、Ｅであり又は存在しない、請求項８９に記載のペプチド。 - 配列番号２１０，２３０、２３２、２３６、２３９及び２５１又は生理的に許容されるそれらの塩からなる群から選択され、ＮＧＦ活性を調節することができるペプチド。
- 少なくとも１つの請求項８８、８９、９０又は９１に記載のペプチドと少なくとも１つのビヒクルとを含み、ＮＧＦ活性を調節することができる修飾ペプチド。
- 前記ビヒクルが、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール、脂質、コレステロール基、炭水化物及びオリゴ糖からなる群から選択される、請求項９２に記載の組成物。
- 環状である、請求項８８、８９、９０又は９１に記載のペプチド。
- 請求項８８、８９、９０又は９１に記載のペプチドの二量体又は多量体。
- 式：（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ及びその多量体
（式中、
Ｆ１は、ビヒクルであり、
Ｘ１とＸ２は、それぞれ独立に、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３、及び
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４から選択される
（式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の一以上は、それぞれ独立に、請求項８８、８９、９０又は９１に記載のペプチドを含み、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、それぞれ独立に、リンカーであり、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ独立に、０又は１である（但し、ａとｂのうち少なくとも１つは１である。）。）。）
又は生理的に許容されるその塩を有し、前記ペプチドがＮＧＦ活性を調節することができる、組成物。 - Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の一以上が、それぞれ独立に、配列番号２１０、２３０、２３２、２３６、２３９及び２５１からなる群から選択されるペプチドを有する、請求項９６に記載の組成物。
- 式：Ｘ１−Ｆ１若しくはＦ１−Ｘ２又は生理的に許容されるその塩の請求項９６に記載の組成物。
- 式：Ｆ−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１又は生理的に許容されるその塩の請求項９６に記載の組成物。
- 式：Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２又は生理的に許容されるその塩の請求項９６に記載の組成物。
- 式：Ｐ１−（Ｌ１）ｃ−Ｆ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２又は生理的に許容されるその塩の請求項９６に記載の組成物。
- Ｆ１がＦｃドメイン又はその断片である、請求項９６に記載の組成物。
- Ｆ１が配列番号６０のアミノ酸配列又はその断片を有する、請求項９６に記載の組成物。
- 請求項８８、８９、９０又は９１に記載のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項１０４のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項１０５の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 前記細胞が原核細胞である、請求項１０６に記載の宿主細胞。
- 前記細胞がＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項１０７に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項１０６に記載の宿主細胞。
- 式：ｈ１ｈ２ｈ３ｈ４ｈ５ｈ６ＬＧｈ９ｈ１０ｈ１１Ｌｈ１３ＹＦｈ１６Ｌｈ１８ＰＰＧｈ２２ｈ２３ｈ２４
（式中、
ｈ１−ｈ６、ｈ９、ｈ１１、ｈ２３及びｈ２４は、それぞれ独立に、存在しないか又はアミノ酸残基であり、
ｈ１０及びｈ１３は、それぞれ独立に、中性の疎水性アミノ酸残基又は極性の疎水性アミノ酸残基であり、
ｈ１６は、極性の疎水性アミノ酸残基又は塩基性のアミノ酸残基であり、
ｈ１８は、中性の疎水性アミノ酸残基であり、
ｈ２２は、中性の極性アミノ酸残基である。）
のアミノ酸配列又は生理的に許容されるその塩を有し、ＮＧＦ活性を調節することができるペプチド。 - ｈ１が、Ａであり又は存在しない、
ｈ２が、Ｑであり又は存在しない、
ｈ３が、Ｖ、Ｇ、Ｐであり又は存在しない、
ｈ４が、Ｖ、Ｔ、Ｓ、Ｋであり又は存在しない、
ｈ５が、Ｓ、Ｅ、Ｑ又はＤであり、
ｈ６が、Ｑ、Ｎ，Ｋ又はＭであり、
ｈ９が、Ｓ、Ｇ、Ｑ又はＤであり、
ｈ１０が、Ｗ、Ｙ又はＦであり、
ｈ１１が、Ａ、Ｌ又はＭであり、
ｈ１３が、Ｑ、Ｎ又はＹであり、
ｈ１６が、Ｋ、Ｈ、Ｓ又はＲであり、
ｈ１８が、Ａ、Ｖ、Ｌ又はＩであり、
ｈ２２が、Ｓ、Ｔ又はＧであり、
ｈ２３が、Ｌであり又は存在しない、
ｈ２４が、Ｅであり又は存在しない、請求項１１０に記載のペプチド。 - ｈ１が、Ａであり又は存在しない、
ｈ２が、Ｑであり又は存在しない、
ｈ３が、Ｐであり又は存在しない、
ｈ４が、Ｔであり又は存在しない、
ｈ５が、Ｅ又はＤであり、
ｈ６が、Ｑ又はＮであり、
ｈ９が、Ｅ又はＤであり、
ｈ１０が、Ｗ又はＹであり、
ｈ１１が、Ｌ又はＭであり、
ｈ１３が、Ｑ又はＮであり、
ｈ１６が、Ｋ又はＲであり、
ｈ１８が、Ｖ又はＬであり、
ｈ２２が、Ｓ又はＴであり、
ｈ２３が、Ｌであり又は存在しない、
ｈ２４が、Ｅであり又は存在しない、請求項１１１に記載のペプチド。 - 配列番号２０２，２１１、２１９、２２１、２３１、２３７及び２７２又は生理的に許容されるそれらの塩からなる群から選択され、ＮＧＦ活性を調節することができるペプチド。
- 少なくとも１つの請求項１１０、１１１、１１２又は１１３に記載のペプチドと少なくとも１つのビヒクルとを含み、前記ペプチドがＮＧＦ活性を調節することができる、組成物。
- 前記ビヒクルが、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール、脂質、コレステロール基、炭水化物及びオリゴ糖からなる群から選択される、請求項１１４に記載の組成物。
- 環状である、請求項１１０、１１１、１１２又は１１３に記載のペプチド。
- 請求項１１０、１１１、１１２又は１１３に記載のペプチドの二量体又は多量体。
- 式：（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ及びその多量体
（式中、
Ｆ１は、ビヒクルであり、
Ｘ１とＸ２は、それぞれ独立に、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３、及び
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４
から選択される
（式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の一以上は、それぞれ独立に、請求項１１０、１１１、１１２又は１１３に記載のペプチドを含み、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、それぞれ独立に、リンカーであり、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ独立に、０又は１である（但し、ａとｂのうち少なくとも１つは１である。）。）。）
又は生理的に許容されるその塩を有し、前記ペプチドがＮＧＦ活性を調節することができる、組成物。 - Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の一以上が、それぞれ独立に、配列番号２０２、２１１、２１９、２２１、２３１、２３７及び２７２からなる群から選択されるペプチドを有する、請求項１１８の組成物。
- 式：Ｘ１−Ｆ１若しくはＦ１−Ｘ２又は生理的に許容されるその塩の請求項１１８に記載の組成物。
- 式：Ｆ−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１又は生理的に許容されるその塩の請求項１１８に記載の組成物。
- 式：Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２又は生理的に許容されるその塩の請求項１１８に記載の組成物。
- 式：Ｐ１−（Ｌ１）ｃ−Ｆ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２又は生理的に許容されるその塩の請求項１１８に記載の組成物。
- Ｆ１がＦｃドメイン又はその断片である、請求項１１８に記載の組成物。
- Ｆ１が配列番号６０のアミノ酸配列又はその断片を有する、請求項１１８に記載の組成物。
- 請求項１１０、１１１、１１２又は１１３に記載のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項１２６のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項１２７の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 前記細胞が原核細胞である、請求項１２８に記載の宿主細胞。
- 前記細胞がＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項１２９に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項１２８に記載の宿主細胞。
- 式：（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ
（式中、
Ｆ１は、Ｆｃドメインであり、
Ｘ１とＸ２は、それぞれ独立に、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４から選択され、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、それぞれ独立に、リンカーであり、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ独立に、０又は１であり（但し、ａとｂのうち少なくとも１つは１である）、
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は、それぞれ独立に、
ｉ．配列番号１ないし配列番号５８、
ｉｉ．配列番号２０２ないし配列番号２８０、
ｉｉｉ．（ｉ）又は（ｉｉ）の類縁体、及び
ｉｖ．（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の誘導体
からなる群から選択される配列である。）
のアミノ酸配列を有し、ＮＧＦ活性を調節することができる組成物。 - 式：Ｆ−Ｌ−Ｐ
（式中、
Ｆは、Ｆｃドメインであり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｐは、
ｉ．配列番号８、１０、２３及び２４、
ｉｉ．（ｉ）の類縁体、及び
ｉｉｉ．（ｉ）又は（ｉｉ）の誘導体
からなる群から選択される。）
のアミノ酸配列を有し、ＮＧＦ活性を調節することができる、請求項１３２に記載の組成物。 - ヒト又は動物の患者に、請求項１、５、９、１４、１６、２３、２７、３１、３６、３８、４５、４８、４９、５１、５３、５６、５８、６７、６８、７０、７２、７４、７７、７９、８８、８９、９０、９２、９４、９６、９７、９９、１０１、１１０、１１１、１１２、１１４、１１６、１１７、１１８、１２１、１２３、１３２又は１３３に記載の組成物の治療的有効量を投与することを含む、ＮＧＦ活性に関連する疾病又は疾患を治療又は予防する方法。
- 前記疾病又は疾患が、神経の痛み、有痛性糖尿病性神経障害、ヘルペス後の神経痛、炎症性の痛み、偏頭痛、喘息、過活動膀胱、乾癬及び癌からなる群から選択される、請求項１３４に記載の方法。
- 前記疾病又は疾患が痛みである、請求項１３４の方法。
- ヒト又は動物の患者に、請求項１、５、９、１４、１６、２３、２７、３１、３６、３８、４５、４８、４９、５１、５３、５６、５８、６７、６８、７０、７２、７４、７７、７９、８８、８９、９０、９２、９４、９６、９７、９９、１０１、１１０、１１１、１１２、１１４、１１６、１１７、１１８、１２１、１２３、１３２又は１３３に記載の組成物の治療的有効量を投与することを含む、痛みを調節する又は鎮痛を促進する方法。
- 前記疾病又は疾患が、急性の痛み、歯痛、外傷からの痛み、手術の痛み、切断もしくは膿瘍から生じる痛み、灼熱痛、脱髄疾患、三叉神経痛、癌、慢性アルコール依存症、発作、視床痛症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、トキシン及び化学療法、一般的な頭痛、偏頭痛、群発性頭痛、混合血管性及び非血管性症候群、緊張性頭痛、一般的な炎症、関節炎、リウマチ性疾患、狼瘡、骨関節炎、炎症性大腸疾患、炎症性眼疾患、炎症性もしくは不安定膀胱疾患、乾癬、炎症性要素を伴う皮膚病、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症症状、炎症性の痛み及びこれに伴う痛覚過敏及び異痛症、神経障害性の痛み及びこれに伴う痛覚過敏及び異痛症、糖尿病性神経障害の痛み、灼熱痛、交感神経によって維持される痛み、除神経後症候群、喘息、上皮組織の損傷もしくは機能障害、単純ヘルペス、ヘルペス後の神経痛、呼吸、泌尿生殖器、胃腸もしくは血管領域における臓器の運動性の障害、創傷、火傷、アレルギー性の皮膚反応、掻痒、白斑、一般的な胃腸疾患、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運動性もしくはアレルギー性鼻炎又は気管支疾患からなる群から選択され、請求項１、５、９、１４、１６、２３、２７、３１、３６、３８、４５、４８、４９、５１、５３、５６、５８、６７、６８、７０、７２、７４、７７、７９、８８、８９、９０、９２、９４、９６、９７、９９、１０１、１１０、１１１、１１２、１１４、１１６、１１７、１１８、１２１、１２３、１３２又は１３３に記載の化合物を投与する工程を含む、請求項１３４に記載の方法。
- 請求項１、５、９、１４、１６、２３、２７、３１、３６、３８、４５、４８、４９、５１、５３、５６、５８、６７、６８、７０、７２、７４、７７、７９、８８、８９、９０、９２、９４、９６、９７、９９、１０１、１１０、１１１、１１２、１１４、１１６、１１７、１１８、１２１、１２３、１３２又は１３３に記載の化合物と、薬剤として許容される希釈剤又は担体とを含む医薬組成物。
- 急性の痛み、炎症性の痛み、神経障害性の痛み、歯痛、外傷からの痛み、手術の痛み、切断もしくは膿瘍から生じる痛み、灼熱痛、脱髄疾患、三叉神経痛、癌、慢性アルコール依存症、発作、視床痛症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、トキシン及び化学療法、一般的な頭痛、偏頭痛、群発性頭痛、混合血管性及び非血管性症候群、緊張性頭痛、一般的な炎症、関節炎、リウマチ性疾患、狼瘡、骨関節炎、炎症性大腸疾患、炎症性眼疾患、炎症性もしくは不安定膀胱疾患、乾癬、炎症性要素を伴う皮膚病、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、慢性炎症症状、炎症性の痛み及びこれに伴う痛覚過敏や異痛症、神経障害性の痛み及びこれに伴う痛覚過敏や異痛症、糖尿病性神経障害の痛み、灼熱痛、交感神経によって維持される痛み、除神経後症候群、喘息、上皮組織の損傷又は機能障害、単純ヘルペス、ヘルペス後の神経痛、呼吸、泌尿生殖器、胃腸もしくは血管領域における臓器の運動性の障害、創傷、火傷、アレルギー性の皮膚反応、掻痒、白斑、一般的な胃腸疾患、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運動性もしくはアレルギー性鼻炎又は気管支疾患からなる群から選択される疾病又は疾患の治療用医薬を製造するための、請求項１、５、９、１４、１６、２３、２７、３１、３６、３８、４５、４８、４９、５１、５３、５６、５８、６７、６８、７０、７２、７４、７７、７９、８８、８９、９０、９２、９４、９６、９７、９９、１０１、１１０、１１１、１１２、１１４、１１６、１１７、１１８、１２１、１２３、１３２又は１３３に記載の化合物の使用。
- ｉ．配列番号８、１０，２３又は２４；
ｉｉ．（ｉ）の類縁体；及び
ｉｉｉ．（ｉ）又は（ｉｉ）の生理的に許容される塩
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＮＧＦ活性を調節することができるペプチド。 - 少なくとも１つの請求項１４１に記載のペプチドと少なくとも１つのビヒクルとを含み、ＮＧＦ活性を調節することができる、組成物。
- 前記ビヒクルが、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール、脂質、コレステロール基、炭水化物及びオリゴ糖からなる群から選択される、請求項１４２に記載の組成物。
- 環状である、請求項１４１に記載のペプチド。
- 請求項１４１に記載のペプチドの二量体又は多量体。
- 式：（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ及びその多量体
（式中、
Ｆ１は、ビヒクルであり、
Ｘ１とＸ２は、それぞれ独立に、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３、及び
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４
から選択される
（式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の一以上は、それぞれ独立に、請求項１４１に記載のペプチドを含み、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、それぞれ独立に、リンカーであり、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ独立に、０又は１である（但し、ａとｂのうち少なくとも１つは１である。）。）。）
又は生理的に許容されるその塩を有し、前記ペプチドがＮＧＦ活性を調節することができる組成物。 - 式：Ｘ１−Ｆ１若しくはＦ１−Ｘ２又は生理的に許容されるその塩の請求項１４６に記載の組成物。
- 式：Ｆ−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１又は生理的に許容されるその塩の請求項１４６に記載の組成物。
- 式：Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２又は生理的に許容されるその塩の請求項１４６に記載の組成物。
- 式：Ｐ１−（Ｌ１）ｃ−Ｆ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２又は生理的に許容されるその塩の請求項１４６に記載の組成物。
- Ｆ１がＦｃドメイン又はその断片である、請求項１４６、１４７、１４８、１４９又は１５０に記載の組成物。
- 請求項１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０又は１５１に記載のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項３９のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項１５３の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 前記細胞が原核細胞である、請求項１５４に記載の宿主細胞。
- 前記細胞がＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項１５５に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項１５４に記載の宿主細胞。
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