JP2010256309A - コンジュゲートパッドおよび体外診断薬 - Google Patents

Abstract

【課題】抗原と標識抗体の結合させる機能の低下なしに、液の流動性を高め、検査時間を短縮できるコンジュゲートパッドを提供する。
【解決手段】目付けが３０〜２００ｇ／ｍ^２、吸水速度が０．３〜３ｃｍ／秒、吸水倍率が１〜５の範囲である合成繊維不織布からなることを特徴とする体外診断薬に使用されるコンジュゲートパッド。
【選択図】なし

Description

本発明は、体外診断薬に使用されるコンジュゲートパッドおよびそれを用いた体外診断薬に関するものであり、特に、ラテラルフロー法の簡易検査薬に使用されるコンジュゲートパッドに関する。

体外診断薬、特に、簡易検査薬が使用される検査においては、抗原抗体反応を用いる免疫学的な検査が採られることが一般的である。
その方法としては、ラテラルフロー式メンブレンアッセイ法が一般的であり、被測定物を含む溶液を、被測定物に対する検出用物質が塗布された膜に垂直方向に通過させることで、呈色により検出あるいは定量測定を行う。

つまり、被測定物を含む溶液を滴下するサンプルパッドと呼ばれる受液部、サンプルパッドから供給された液を検出部に保持されるように反応させるコンジュゲートパッド、コンジュゲートパッドから液を垂直方向に流すメンブレン膜、液を吸い取り保持する吸液パッドから構成される。このような診断薬吸収体の性能試験をするために用いる検査キットの構成例を図１に示す。

具体的には、酵素、貴金属コロイド、着色ラテックス、色素などの呈色識別物質で抗体を標識した標識抗体液を、あらかじめコンジュゲートパッドに含浸および乾燥させておき、血液、尿、痰、鼻汁、細胞などの検体を含んだ検査液をサンプルパッドからコンジュゲートパッドに展開させ、抗原と標識抗体とを反応させながら、メンブレン膜に流し、予め抗原を捕捉する抗抗体を塗布したメンブレン上の検出部に捕捉、呈色することで、呈色程度を目視あるいは光学的な変化として測定し、検査液中の抗原の定性測定または定量測定を行う。

上記の検査方法を応用することで、ウイルス感染の有無、妊娠の判定、疾病の確認などを簡易且つ迅速に検査・診断することができ、また、そのための器具及びさまざまな簡易体外診断薬が開発され市販されている。
このような検査・診断においては、コンジュゲートパッドとしての機能は、標識抗体の含浸性、および、検体液をサンプルパッドから受け取り標識抗体と結びつけメンブレン膜に流す液流れ性が必要になる。

コンジュゲートパッドとしては、従来、吸水紙、ろ紙、ガラス繊維不織布、合成繊維不織布、再生セルロース不織布などが使用されている（例えば、特許文献１、特許文献２等参照）。しかし、これらはコンジュゲートパッドとしての機能は十分とは言えず、さらに優れた機能を有するコンジュゲートパッドが求められている。

特に、簡易な体外診断では、判定までの時間を短くすることが要望されている。例えばインフルエンザの判定などでは、検診後、検査を開始するため、結果が出るまでに１５〜２０分程度を要する。したがって、一度患者を待合室に戻し、結果が判明してから再度検診するため、時間だけでなく、医者にも負担がかかる。

そのため、検体液、吸水パッド、メンブレン膜など各種の部材で、検査時間短縮の検討がなされている。しかしながら、コンジュゲートパッドに関しては、判定時間への影響が少ないと考えられており、サンプルパッドからの吸い上げが重視されているため、親水性材料のガラス繊維不織布、再生セルロース不織布、濾紙などが使用されているのが現状である。

一方、サンプルパッドからの吸い上げを改良するために、コンジュゲートパッドの親水性を上げると、サンプルパッドからの吸い上げは早くなるが、メンブレン膜への移行が遅くなるだけでなく、標識抗体のリリース性が不十分となり、呈色にも影響することになる。また、比較的吸液速度の早いガラス繊維不織布は、割れやすく、取り扱い性の点や皮膚障害などの点も問題にされている。

以上のように、現在、検査時間の短縮を目指した簡易診断薬用のコンジュゲートパッドとして、満足できるものは提案されていないのが現状である。

特許３３０４２１４号公報 特開２００６−１９４７８５号公報

本発明は、抗原と標識抗体を結合する機能が低下することなく、液の流動性を高めることで、検査時間を短縮できるコンジュゲートパッドを提供することを目的とする。更に詳しくは、特定範囲の保液性を有する極細不織布を使用することで、毛細管現象により液の流動性を高め、且つ、残液が少ない構成とすることで、サンプルパッドからメンブレン膜に短時間で検体液を受け渡せるコンジュゲートパッドを提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために検討した結果、保液の少ない極細の合成繊維不織布を使用することで、毛細管現象により検査液を吸い取り、メンブレン膜に素早く受け渡せることに着目し、特定範囲の目付け、吸水速度、吸水倍率の合成繊維不織布をコンジュゲートパッドにすることで、正確かつ短時間の検査が可能となることを見出し、本発明をなすに至った。

即ち、本発明は下記の通りである。
１．目付けが３０〜２００ｇ／ｍ^２、吸水速度が０．３〜３ｃｍ／秒、吸水倍率が１〜５の範囲である合成繊維不織布からなることを特徴とする体外診断薬に使用されるコンジュゲートパッド。

２．前記合成繊維不織布の平均繊維径が０．５〜３．０μｍであって、空孔率が６０〜８５％であることを特徴とする上記１に記載のコンジュゲートパッド。
３．上記１または２に記載されているコンジュゲートパッドに、標識抗体が含浸されてなることを特徴とする体外診断薬。

本発明のコンジュゲートパッドは、毛細管現象を利用し、特定の目付け、吸水速度、吸水倍率にすることで、検体液と標識抗体との結合およびメンブレン膜への移動が迅速に行われ、少量の検体液でも正確かつ短時間で検査あるいは評価ができるものである。

診断薬用吸収体の性能試験をするために用いる検査キットの一例を概略的に示す図である（なお、上は側面図、下は平面図である）。

以下、本発明について詳述する。
体外診断薬用コンジュゲートパッドにおいて、親液性が強いとメンブレン膜にリリースし難くなり、検査時間が長くなる。また、標識抗体との結びつきが強すぎると、検体液が流れてきても標識抗体のリリース性（色抜け性）が不十分となり、検出部での呈色濃度が低くなってしまい、検査が曖昧になる。保液量が多くなると、検査液および標識抗体が残るため、検査液や標識抗体量を増やす必要があるだけでなく、検査液と標識抗体の結びつきの点でも問題になる。

上記のような問題に鑑み、本発明のコンジュゲートパッドは、特定の目付け、吸水速度、吸収倍率を有することで、サンプルパッドからの吸い上げ、メンブレン膜へのリリース性を満足し、検査残液も残りにくいという優れた特徴を有する。

本発明において、コンジュゲートパッドの目付けは、３０〜２００ｇ／ｍ^２である。目付けは、コンジュゲートパッドの大きさや検体液量、検査種類等により適宜変えることができるが、目付けが３０ｇ／ｍ^２未満であると、標識抗体を付着させる加工時に問題になるだけでなく、取り扱いの点でも好ましくない。また、目付けが２００ｇ／ｍ^２を超えると、検査液の吸収量が大きくなるため好ましくない。目付けは、好ましくは５０〜１５０ｇ／ｍ^２である。

コンジュゲートパッドの吸水速度は、ＪＩＳ−Ｌ１９０７で規定されるバイレッグ吸水法により、コンジュゲートパッドが検査液の流れる方向に合わせて、１０ｃｍの高さまで要する時間を測定し、評価を行う。本発明においては、吸水速度が０．３〜３ｃｍ／秒であることが検査時間短縮のために必要である。０．３ｃｍ／秒未満であると、検査液のメンブレン膜への移行が遅くなりすぎ、メンブレン膜上での検査液の流れも遅くなり、検査時間が遅くなり好ましくない。また、３ｃｍ／秒を超えると、検査種類にもよるが、標識抗体と検査液との結びつきが不十分になりやすく、また、メンブレン膜上の移動が律速となるため、検査時間短縮の効果が少なくなるため好ましくない。吸水速度は、好ましくは１〜２ｃｍ／秒である。

コンジュゲートパッドの吸水倍率は１〜５であり、好ましくは２〜３である。コンジュゲートパッドの吸水倍率が１未満であると、サンプルパッドからの吸い上げが不十分になりやすく、標識抗体の含浸も難しくなり、好ましくない。また、５を超えると、検査液および標識抗体が残るため、検査液や標識抗体量を増やす必要があるだけでなく、検査液と標識抗体の結びつきの点でも問題になり好ましくない。

本発明のコンジュゲートパッドは、合成繊維不織布で構成されており、好ましくは、平均繊維径が０．５〜３．０μｍ、より好ましくは０．５〜２．０μｍであって、空孔率が６０〜８５％である極細繊維からなる合成繊維不織布が好ましい。

本発明のコンジュゲートパッドの吸水速度および吸水倍率を達成するためには、毛細管現象で吸い上げる必要がある。平均繊維径が３．０μｍより大きい場合や、空隙率が８５％を超えると、毛細管現象が見られず、吸水速度が上がらず、サンプルパッドからの吸い上げが不十分になる傾向がある。また、繊維径が０．５μｍを下回る場合は、検査液の固形物により詰まる可能性や機械強度が弱くなる傾向がある。空孔率が６０％を下回る場合も、固形物のつまりや標識抗体の含浸性の点で問題となる傾向がある。

合成繊維としては、上記コンジュゲートパッドの物性を満足すれば限定されないが、例えば、ポリオレフィン系、ポリエステル系、ポリアミド系、アクリル系等が挙げられ、これらの一種又は二種以上を用いてもよい。不織布の製法としては、スパンボンド法、メルトブロー法、フラッシュスパン法、抄造法などが挙げられ、更に、それぞれの方法を組み合わせた不織布、例えば、スパンボンド／メルトブロー／スパンボンド（ＳＭＳ）などや、上記不織布を熱処理やバインダーによる接着によって複合しても良い。

本発明のコンジュゲートパッドのサイズについては、必要な物性を満足すれば限定されないが、例えば、液流れ方向については、検体液からの結びつき性や検査時間を考慮すると、長さ３〜１５ｍｍ程度であることが好ましい。巾（液流れに対し垂直）方向については、メンブレン膜やサンプルパッドの巾より小さければ問題はない。巾が広すぎると、メンブレン膜の裏面に検査液が裏回りしまう可能性がある。

上記合成繊維不織布の親水性、撥水性、吸水倍率をコントロールするため、各種薬剤や粉体を、抗体抗原反応や標識抗体との結びつきに影響しない範囲で含有させても良い。例えば、界面活性剤、撥水剤、繊維を固定するための樹脂、抗菌剤、防腐剤、酸化防止剤などを含有させることができる。

本発明において、使用される希釈検体液、検査キット形状、サンプルパッド、吸水パッド、メンブレン膜、標準抗体、呈色識別物質は、公知のものが使用でき、限定されるものでない。また、希釈検体液は、標識抗体の他に、薄め液、各種界面活性剤、塩分等を添加する場合もあり、滴下前に、検体採取時の固形物や標準抗体に含まれるコンタミ成分等を除去するため、ガラス繊維や濾紙フィルターなどで濾過して使用しても良い。

以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
まず、本発明の実施例の評価に使用される部材、検査液等について説明する。

（ａ）抗体固定化メンブレン膜
ニトロセルロースメンブレン膜（ポアサイズ６０μｍ）上に、マウス抗インフルエンザＡ型ウィルス抗体液を、巾２ｍｍの線状になるように塗布して乾燥を行い、マリアリムＡＦＢ−１５２１およびトリス塩酸緩衝液によりブロッキングし、抗体固定化メンブレン膜を得た。得られた抗体固定化メンブレン膜を、巾５ｍｍ、長さ３０ｍｍになるようにサンプリングした。抗体固定化位置は流れ方向に垂直となり、長さ２０ｍｍの位置になった。

（ｂ）標識抗体
およそ６０ｎｍの金コロイドと、上記抗体固定化メンブレン膜に使用した抗体とは別のエピトープを認識する抗体を、ホウ酸緩衝液（ＰＨ９．０）中で混合した後、ＢＳＡ１０％水溶液を添加してブロッキングを行った後、遠心分離により標識抗体を得た。

（ｃ）発色用希釈検査液
上記標識抗体を、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、１％スクロースおよび０．２ＢＳＡを含むＰＢＳに混合し、Ａ型インフルエンザ精製抗原（Ｋｉｔａｋｙｕｓｙｕ／１５９／９３株由来）を含む希釈検体液（ウィルスをＴＣＩＤ５０／ｔｅｓｔ単位で１×１０^６の濃度）を添加し、調整した。

（ｄ）コンジュゲートパッドへの標識抗体含浸
コンジュゲートパッド（５ｍｍ×５ｍｍ）に上記（ｂ）の標識抗体を１０μｌを含浸し、凍結乾燥を実施し、標識抗体を含浸したコンジュゲートパッドを得た。

（ｅ）性能試験をするために用いる検査キット
図１に示すような、台紙５の上にメンブレン膜１を貼り付け、メンブレン膜の端部にコンジュゲートパッド２を置き、もう一方の端部に吸水パッド４（５ｍｍ巾、長さ２０ｍｍ、メンブレン膜との重なり５ｍｍ：Ｎｏ５２６（アドバンテック社製））を置いた。コンジュゲートパッド２に重なるようにサンプルパッド３（５ｍｍ巾、長さ１５ｍｍ、コンジュゲートパッドの重なり５ｍｍ：ベンリーゼＮＥ１０７（旭化成社製））を配置し、最後に透明なテープで上部から台紙を覆うように貼り付けて固定した。

測定方法、評価方法等は下記の通りである。
（１）厚み（ｍｍ）
ピーコック厚み計を用いて、接圧２０ｇ／ｃｍ^２の条件で測定を実施した。

（２）目付け（ｇ／ｍ^２）
０．５ｍ^２以上の面積の不織布を、１０５℃で一定重量になるまで乾燥し、２０℃、６５％ＲＨの恒温室に１６時間以上放置後、その重量を測定し、不織布の単位面積当たりの重量（ｇ／ｍ^２）を求めた。

（３）空孔率
上記（１）および（２）で測定した厚み、目付けおよび使用した各素材の比重より、下記式で算出した。
空孔率（％）＝｛１−目付け（ｇ／ｍ^２）／比重（ｇ／ｃｍ^３）／厚み（ｍｍ）／１０００｝｝×１００

（４）吸水倍率
吸収体を、２０℃、６５％ＲＨに制御された室内に１５時間放置して調湿し、１０ｃｍ角に切断したサンプルを秤量した（Ｗ１（ｇ）とする）。次いで、線径０．５ｍｍ、１０メッシュの金網上にサンプルを置き、金網ごと２０℃の水中へ３０秒浸漬した。その後、サンプルを金網上で水平に保ったまま空中で１０分間放置して水切りを行い、再度、秤量し（Ｗ２（ｇ）とする）、下記式で吸水倍率を求めた。
吸水倍率＝（Ｗ２−Ｗ１）／Ｗ１

（５）吸水速度
ＪＩＳ−Ｌ１９０７で規定されるバイレッグ吸水法により、コンジュゲートパッドが検査液の流れる方向に合わせて、１０ｃｍの高さまで要する時間を測定し、評価を行った。
試料は、２００ｍｍ（長さ）×２５ｍｍ（巾）とし、２０℃、６５％ＲＨに制御された室内に１５時間放置し調湿した後、測定を実施した。
吸水速度（ｃｍ／秒）＝１０ｃｍ／（１０ｃｍ高さ到達時間（秒））

（６）コンジュゲートパッドの色抜け性及び呈色終了時間
上記の部材および検査液を使用し、発色性の指標および検査時間を、以下の方法で評価を行った。上記（ｅ）の検査キットを使用し、サンプルパッドに発色用希釈検査液を抗体液塗布面に３滴（９０μｌ相当）滴下し、コンジュゲートパッドの色抜け性および抗体固定化メンブレン膜の塗布部での呈色までの時間を測定した。

（色抜け性）
滴下後、３分後の状態および塗布部で規定の呈色濃度になった際の色抜け性を下記の基準で評価した。
○：白色（標識抗体未処理の状態）又は殆ど着色がない状態
△：着色が薄くなっているか、あるいは、部分的に着色がわかる
×：着色が殆ど薄くなっていない

（呈色終了時間）
抗体固定化メンブレン膜の塗布部の呈色が一定濃度（限度見本との比較）以上になるまでの時間（分）を測定した。

［実施例１〜３］
メルトブロー方式を用いて、表１に示す物性の不織布を作成した。
この不織布をコンジュゲートパッドとして用いて検査キットを作成し、コンジュゲートパッドの色抜け性と呈色時間について評価を行った。その結果を表２に示す。

［比較例１及び２］
メルトブロー方式を用いて、表１に示す物性の不織布を作成した。実施例１と同様に評価を行った結果を表２に示す。

［比較例３］
スパンボンド方式で製造した「エルタス」Ｅ０５１００（旭化成せんい社製）を用いた。表１にその物性を示す。実施例１と同様に評価を行った結果を表２に示す。

［比較例４］
湿式スパンボンド方式で製造された「ベンリーゼ」ＮＥ１０７（旭化成せんい社製）を用いた。表１にその物性を示す。実施例１と同様に評価を行った結果を表２に示す。

［比較例５］
ガラス繊維濾紙ＢＦ／Ａ（ワットマン社製）を用いた。表１にその物性を示す。実施例１と同様に評価を行った結果を表２に示す。

本発明（実施例１〜３）のコンジュゲートパッドは、コンジュゲートパッドからの色抜け性が良好であった。つまり、標識抗体のリリース性も適正であり、コンジュゲートパッド内での検査液の残液が少ないことが判る。その結果、従来品（比較例５）と比較して、検査時間が大幅に短縮できることが判る。

比較例１では、吸水速度が遅いため、コンジュゲートパッド内での移行速度が遅く、呈色終了時間が遅いことがわかる。
比較例２では、空孔率が小さいため、毛細管現象が起こりにくく、サンプルパッドからの吸い上げも不十分となり、コンジュゲートパッドからの色抜け性および呈色終了時間とも不十分であった。

比較例３では、繊維径が太く、毛細管現象が発生しないため、吸水速度が遅く、サンプルパッドからの吸い上げも不十分となり、コンジュゲートパッドからの色抜け性および呈色終了時間とも不十分であった。
比較例４では、吸収倍率が高く、メンブレン膜への移行が遅く、検査液の残液も多くなってしまうため、不十分な結果であった。

本発明のコンジュゲートパッドは、毛細管現象を利用し、特定の目付け、吸水速度、吸水倍率にすることで、検体液と標識抗体との結びつけおよびメンブレン膜に移動を迅速に行い、正確かつ検査時間短縮に寄与できるものであり、各種のラテラルフロー方式の検査キットに使用することが可能となる。

１ メンブレン膜
1a 塗布部（呈色箇所）
２ コンジュゲートパッド
３ サンプルパッド
４ 吸水パッド
５ 台紙

Claims (3)

1. 目付けが３０〜２００ｇ／ｍ^２、吸水速度が０．３〜３ｃｍ／秒、吸水倍率が１〜５の範囲である合成繊維不織布からなることを特徴とする体外診断薬に使用されるコンジュゲートパッド。
2. 前記合成繊維不織布の平均繊維径が０．５〜３．０μｍであって、空孔率が６０〜８５％であることを特徴とする請求項１に記載のコンジュゲートパッド。
3. 請求項１または２に記載されているコンジュゲートパッドに、標識抗体が含浸されてなることを特徴とする体外診断薬。

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