JP2010262104A - 走査型共焦点顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明は、走査型共焦点顕微鏡に関し、表示される画像内の輝度差が大きいような試料を１つの画像で確実に観察することを目的とする。
【解決手段】 第１の光および前記第１の光より強度の大きい第２の光を出力可能な光源と、往路にて前記光源からの前記第１の光または復路にて第２の光を前記試料に照射して前記試料をスキャンする走査手段と、前記スキャンによる前記試料からの光を検出する光検出手段と、前記光検出手段で検出された光に基づいて複数のピクセルからなる画像を取得し取得された画像を画像処理する画像処理手段とを備え、前記画像処理手段は、前記第２の光の試料への照射により取得された第２の画像のピクセルが所定輝度以上のピクセルか否かを判断する判断手段と、前記第２の画像の所定輝度以上のピクセルの輝度値を前記第１の光の試料への照射により取得された第１の画像の対応するピクセルの輝度値に基づいて補正する補正手段とを有していることを特徴とする。
【選択図】 図４

Description

本発明は、走査型共焦点顕微鏡に関する。

走査型共焦点顕微鏡は、試料に点状照明し、例えば試料からの蛍光を共焦点絞り上に集光させた後、共焦点絞りを通過する光の強度を光検出器で検出することにより試料の表面情報を取得している。また、走査型共焦点顕微鏡では、点状照明を種々の方法によって試料面上を走査することにより、試料の広い範囲の表面情報を取得することができる。

このような走査型共焦点顕微鏡において、表示される画像内の輝度差が大きいような場合、すなわち明るい部分と暗い部分との差が大きい試料を観察している場合には、画像上で飽和しないように検出感度を調整する必要がある。その際の調整は、明るい部分を基準に行うしかなく、そうすると、暗い部分のデータにはノイズが多く含まれてしまうため、一般的には、対数アンプ（γ特性）を用いて明るい部分を圧縮しかつ暗い部分を明るくして光検出ダイナミックレンジの拡大を行い、全体のコントラストを下げる調整を行っている。また、暗い部分の見易さを向上させるために、ＬＵＴ（ルックアップテーブル）を用いる技術も開示されている。

しかしながら、表示される画像内の輝度差が大きいような試料を観察する場合、対数アンプを用いると暗部のゲインが大きくなっているため、明るくはなっていても回路のノイズが大きく付加されてしまい、もとよりＳ／Ｎが悪化してしまう。また、ＬＵＴを用いるのは単に見た目の明るさを調節したにすぎず、Ａ／Ｄ変換時に決まってしまったＳ／Ｎを改善する作用はなく、結果として雑音の少ない良質の画像が得られない。このようなことから、その場合には、光検出ダイナミックレンジの拡大は試料暗部の光検出信号のＳ／Ｎを劣化させずに行うことが重要であると言える。

特開２００６−８７０３６号公報

一方、表示される画像内の輝度差が大きいような試料を観察する場合、比較的強度の弱い光を照射して取得された画像と、比較的強度の強い光を照射して取得された画像との２つの画像から試料を観察することが試みられている。しかしながら、この場合には、２つの画像により試料を観察する必要があるため、２つの画像の対応関係をつけるために多大な時間が必要になり、また、試料を確実に観察することが困難であるという問題があった。

本発明は、かかる従来の問題を解決するためになされたもので、表示される画像内の輝度差が大きいような試料を１つの画像で確実に観察することができる走査型共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。

第１の発明の走査型共焦点顕微鏡は、第１の光および前記第１の光より強度の大きい第２の光を出力可能な光源と、往路にて前記光源からの前記第１の光または復路にて第２の光を前記試料に照射して前記試料をスキャンする走査手段と、前記スキャンによる前記試料からの光を検出する光検出手段と、前記光検出手段で検出された光に基づいて複数のピクセルからなる画像を取得し取得された画像を画像処理する画像処理手段とを備え、前記画像処理手段は、前記第２の光の試料への照射により取得された第２の画像のピクセルが所定輝度以上のピクセルか否かを判断する判断手段と、前記第２の画像の所定輝度以上のピクセルの輝度値を前記第１の光の試料への照射により取得された第１の画像の対応するピクセルの輝度値に基づいて補正する補正手段とを有していることを特徴とする。

第２の発明の走査型共焦点顕微鏡は、第１の発明の走査型共焦点顕微鏡において、前記所定輝度は、前記光検出手段の飽和輝度であることを特徴とする。

第３の発明の走査型共焦点顕微鏡は、第１または第２の発明の走査型共焦点顕微鏡において、前記補正手段は、前記第１の画像の前記対応するピクセルの輝度値に、前記第２の光の強度を前記第１の光の強度で除した値を乗算して、前記第２の画像のピクセルの輝度値を補正することを特徴とする。

第４の発明の走査型共焦点顕微鏡は、第１ないし第３のいずれか１の発明の走査型共焦点顕微鏡において、前記走査手段は、前記試料の同一部分を往復スキャンすることを特徴とする。

第５の発明の走査型共焦点顕微鏡は、第４の発明の走査型共焦点顕微鏡において、前記走査手段は、往路において前記第１の光により前記試料をスキャンし、復路において前記第２の光により前記試料をスキャンすることを特徴とする。

本発明の走査型共焦点顕微鏡では、表示される画像内の輝度差が大きいような試料を１つの画像で確実に観察することができる。

本発明の走査型共焦点顕微鏡の一実施形態を示す説明図である。 図１の走査型共焦点顕微鏡における光検出器の出力と相対位置との関係を示す説明図である。 図１の走査型共焦点顕微鏡の制御部を示す説明図である。 図１の走査型共焦点顕微鏡の動作を示す説明図である。 図１の走査型共焦点顕微鏡で行われる往復スキャンを説明する説明図である。 通常の走査型共焦点顕微鏡で行われる往復スキャンを説明する説明図である。 レーザパワーの弱い光でスキャンした時に得られた試料の画像を概略的に示す説明図である。 図７の画像の具体例を示す説明図である。 レーザパワーの強い光でスキャンした時に得られた試料の画像を概略的に示す説明図である。 図９の画像の具体例を示す説明図である。 光検出器に入力される光の強度と出力値との関係を示す説明図である。 第１の画像の輝度値をＲ倍した状態を示す説明図である。 第２の画像を補正した状態を示す説明図である。 図１３のピクセルの輝度を示す説明図である。 図１３の画像の具体例を示す説明図である。

以下、本発明の実施形態を図面を用いて詳細に説明する。

図１は、本発明の走査型共焦点顕微鏡の一実施形態を示している。

この走査型共焦点顕微鏡は、照明光学系１１、走査光学系１３、結像光学系１５、ステージ１６、検出光学系１７、制御部１９、モニタ２１を有している。

照明光学系１１は、レーザ光源２３、反射鏡２５を有している。走査光学系１３は、２次元走査機構２７、スキャナレンズ２９を有している。２次元走査機構２７は、第１の光スキャナ３１、第２の光スキャナ３３を有している(例えば、レゾナントスキャナやガルバノスキャナ)。結像光学系１５は、第２対物レンズ３５、第１対物レンズ３７を有している。ステージ１６は、試料Ｓを載置する試料台３８を有している。試料台３８は上下左右方向に微動可能とされている。検出光学系１７は、ビームスプリッタ３９、結像レンズ４１、共焦点絞り４３、光検出器４５を有している。

この走査型共焦点顕微鏡では、レーザ光源２３から出射した光が、ビームスプリッタ３９を透過した後、２次元走査機構２７に入射する。２次元走査機構２７は、第１の光スキャナ３１と第２の光スキャナ３３とにより光束を２次元に走査し、スキャナレンズ２９へと導く。スキャナレンズ２９からの光束は、第２対物レンズ３５を介して第１対物レンズ３７に導かれる。第１対物レンズ３７に入射した光束は、集束光となって試料Ｓの表面上を走査する。

試料Ｓの表面で反射した光は、第１対物レンズ３７から２次元走査機構２７を介してビームスプリッタ３９に導入され、ビームスプリッタ３９によって反射される。反射した光は結像レンズ４１により共焦点絞り４３のピンホール４３ａ上に集光する。ピンホール４３ａにより試料Ｓの集光点以外からの反射光をカットし、ピンホール４３ａを通過する光だけを光検出器４５によって検出する。

この走査型共焦点顕微鏡では、第１対物レンズ３７による集光位置は、共焦点絞り４３のピンホール４３ａと光学的に共役な位置にあり、試料Ｓが第１対物レンズ３７による集光位置にある場合は、試料Ｓからの反射光がピンホール４３ａ上で集光してピンホール４３ａを通過する。試料Ｓが第１対物レンズ３７による集光位置からずれた位置にある場合は、試料Ｓからの反射光はピンホール４３ａ上に集光せず、ピンホール４３ａを通過しない。

この走査型共焦点顕微鏡では、図２に示すように、試料Ｓが第１対物レンズ３７の集光位置Ｚ₀にある場合に光検出器４５の出力は最大となる。そして、この位置から第１対物レンズ３７と試料Ｓの相対位置が離れるに従い光検出器４５の出力は急激に低下する。この特性により、２次元走査機構２７によって集光点を２次元走査し、光検出器４５の出力を２次元走査機構２７に同期して画像化すれば、試料Ｓのある特定の高さの部分のみが画像化され、試料Ｓを光学的にスライスした画像（共焦点画像）が得られる。

図３は、上述した走査型共焦点顕微鏡の制御部１９の構成を示すブロック図である。

制御部１９は、顕微鏡制御部４７、画像処理部４９、ＣＰＵ５１を有している。

顕微鏡制御部４７は、レーザ光源２３、２次元走査機構２７、ステージ１６等に接続されている。そして、入力部５３からの走査の開始、停止等の入力により、レーザ光源２３、２次元走査機構２７、ステージ１６等を制御する。

画像処理部４９は、光検出器４５で光電変換された信号と２次元走査機構２７からのタイミング信号とを受け取り画像化する。そして、画像をモニタ２１に表示することで試料Ｓの表面情報を得ることができるようにする。

この実施形態では、光検出器４５として、光電子増倍管（Photo Multiplier Tube）のような電気信号を電子レベルで増幅する機能を有したものを採用している。そのようなものを光検出器４５として採用したのは、電気回路の増幅ではできない高Ｓ／Ｎの増幅が行えるからである。なお、光検出器４５として光電子増倍管以外のもの、例えばＡＰＤ（アバランシェ・フォト・ダイオード）等を採用しても良い。

図４は、上述した走査型共焦点顕微鏡の動作を示すフローチャートである。

ステップＳ１：入力部５３からの走査の開始信号が入力されると、制御部１９のＣＰＵ５１は、先ず、試料Ｓの画像データを取得する。

画像データの取得は、２次元走査機構２７を走査して試料Ｓをスキャンすることにより行われる。図５は、試料Ｓを概略的に示すもので、小さい四角で示す領域Ｐが画像データの１ピクセルに対応する領域である。この実施形態では、１ラインＬの領域がそれぞれ往復スキャンされる。

通常の往復スキャンでは、図６に示すように、往路において１ラインＬのスキャンが行われ、復路においてラインを変えて次のラインＬのスキャンが行われる。そして、光検出器４５により各領域Ｐ毎に輝度が順次検出され試料Ｓの画像データが取得される。

一方、この実施形態では、図５に示すように、往路(細線Ｒ１で示す)および復路(太線Ｒ２で示す)において１ラインＬのスキャンが行われる。なお、図５において往路Ｒ１と復路Ｒ２とを異ならせて表示しているが、実際には、同一ラインＬの中央位置がスキャンされる。そして、光検出器４５により各領域Ｐ毎に輝度が順次検出され試料Ｓの画像データが取得される。試料Ｓの画像データは、往路Ｒ１の画像データと復路Ｒ２の画像データとして別々に取得される。また、往復スキャンは、光検出器４５のゲインを変えることなく、往路をレーザパワーの弱い光でスキャンし、復路をレーザパワーの強い光でスキャンすることにより行われる。すなわち、往路Ｒ１から復路Ｒ２になる変換点Ｃ１では、ＣＰＵ５１によりレーザ光源２３が制御され、レーザパワーの光が弱い光から強い光に変更される。逆に、復路Ｒ２から往路Ｒ１になる変換点Ｃ２では、レーザパワーの光が強い光から強い光に変更される。

このように、往路Ｒ１をレーザパワーの弱い光でスキャンすることにより、試料Ｓの蛍光が復路Ｒ２まで残ることがなくなり検出精度を向上することができる。また、同一ラインＬの往路Ｒ１をレーザパワーの弱い光でスキャンし、復路Ｒ２をレーザパワーの強い光でスキャンすることにより、レーザパワーの異なる画像データを短い時間間隔で取得することが可能になり、試料Ｓの状態が時間に伴い変化する所謂ライブセルにも対応することができる。

ステップＳ２：往路Ｒ１のスキャンで得られた画像データから第１の画像Ｇ１を作成し、復路Ｒ２のスキャンで得られた画像データから第２の画像Ｇ２を作成する。第１の画像Ｇ１は、レーザパワーの弱い往路のスキャンで得られた画像のため、図７に示すように全体的に輝度値が低くなっている。なお、図７は図５の概略的な試料Ｓに対応する観念的な画像であり、実際の画像は、例えば図８に示すような画像Ｇ１’になる。第２の画像Ｇ２は、レーザパワーの強い復路のスキャンで得られた画像のため、図９に示すように全体的に輝度値が高くなっている。なお、図９は図５の概略的な試料Ｓに対応する観念的な画像であり、実際の画像は、例えば図１０に示すような画像Ｇ２’になる。

ステップＳ３：ＣＰＵ５１は、第２の画像Ｇ２に飽和状態のピクセルＨがあるか否かを判断する。すなわち、第２の画像Ｇ２は、レーザパワーの強い復路Ｒ２のスキャンで得られた画像であるため、図９に示すように全体的に輝度値が高くなっており、光検出器４５の飽和点の輝度値に対応する輝度値のピクセルＨが比較的多く存在する。従って、このようなピクセルＨを第２の画像Ｇ２にそのまま残すと実際の試料Ｓの画像と異なった画像になり良質な画像を得ることができない。

図１１は、光検出器４５に入力される光の強度と光検出器４５から出力される出力値との関係を示している。直線ａはレーザパワーが弱い場合を、直線ｂ−ｂ’はレーザパワーが強い場合を示している。光検出器４５のゲインが同じである場合には、入力される光の強度が微弱な部分の出力値ＡはＳ／Ｎが悪くなる。また、レーザパワーの強度が大きい場合には、光検出器４５に入力される光の強度が大きくなり所定の出力値Ｍａｘで飽和状態になる。従って、直線ｂ−ｂ’の波線の部分ｂ’の正確な出力値を知ることができない。

ステップＳ４：第２の画像Ｇ２に飽和状態のピクセルＨがある場合には、第１の画像Ｇ１の対応するピクセルの輝度値に基づいて、第２の画像Ｇ２のピクセルの輝度値を補正する。ＣＰＵ５１は、先ず、第２の画像Ｇ２に飽和状態のピクセルＨがある場合には、その飽和状態のピクセルＨに対応するピクセルを第１の画像Ｇ１のピクセルから抽出する。そして、抽出されたピクセルの輝度値に基づいて第２の画像Ｇ２のピクセルの輝度値を補正する。

例えば、光検出器４５のゲインが同じである場合には、照射するレーザパワーの強度に略比例して、試料Ｓの同一領域Ｐから光検出器４５に入力される光の強度が増大する。従って、図５に示すように往路Ｒ１のスキャンに使用されるレーザパワーの弱い光の強度をＩ１とし、復路Ｒ２のスキャンに使用されるレーザパワーの強い光の強度をＩ２とすると、復路のスキャンでは往路のスキャンに比較して、Ｉ２をＩ１で除したＩ＝Ｉ２／Ｉ１倍の強度の光が光検出器４５に入力されることになる。そこで、この実施形態では、第１の画像Ｇ１から抽出されたピクセルの輝度値に、復路のスキャン光の強度Ｉ２を往路のスキャン光の強度Ｉ１で除した値Ｉ(パワー比率)を乗算して、第２の画像Ｇ２の飽和状態のピクセルＨの輝度値を補正する。これにより、飽和状態のピクセルＨの輝度値を実際の輝度値に近い値に確実に補正することができる。

すなわち、図１１の直線ｂ−ｂ’に示すようにレーザパワーの強度が大きい場合には、光検出器４５に入力される光の強度が大きくなり所定の出力値で飽和状態になっていた。しかしながら、図１２に示すように直線ａ上の例えば点ｄの出力値ＤをＩ倍し、直線ｂの延長上の点ｄ’とすることにより、図１１で飽和状態になっていた波線ｂ’部分の輝度値を確実に求めることができる。

図１３は、第２の画像Ｇ２を第１の画像Ｇ１により補正した補正画像Ｇ３を示している。この補正画像Ｇ３では、図１４に示すように飽和状態のピクセルＨ(図のＶ１を四角で囲った領域)の輝度値が補正されている。図１４では、復路でスキャンした画像データの各ピクセルの輝度値がＶ２(ｉ，ｊ)で表示されている。そして、復路でスキャンした画像データのピクセルの輝度値Ｖ２(ｉ，ｊ)が飽和状態の値である場合には、そのピクセルの輝度値が往路のスキャンで取得した画像データの輝度値をＩ倍した輝度値であるＶ１(ｉ，ｊ)に補正されている。なお、図１３は図５の概略的な試料Ｓに対応する観念的な画像であり、実際の画像は、例えば図１５に示すような画像Ｇ３’になる。この画像Ｇ３’では、図８および図１０に示した画像Ｇ１’、Ｇ２’に比較して、光検出ダイナミックレンジが拡大された画像になっている。

ステップＳ５：ステップＳ４で画像が補正された場合には、補正画像Ｇ３をモニタ２１に出力する。観察者はモニタ２１に表示される画像Ｇ３を見て、あるいは、この画像Ｇ３を印刷することにより試料Ｓを観察することが可能になる。なお、ステップＳ３で第２の画像Ｇ２に飽和状態のピクセルがない場合には、第２の画像Ｇ２がモニタ２１に出力される。

上述した走査型共焦点顕微鏡では、レーザパワーの強い復路のスキャンで得られた第２の画像Ｇ２に飽和状態のピクセルＨがあるか否かを判断し、その飽和状態のピクセルＨを、レーザパワーの弱い往路のスキャンで得られた第１の画像Ｇ１の対応するピクセルの輝度値を用いて補正するようにしたので、表示される画像内の輝度差が大きいような試料Ｓを１つの画像で確実に観察することができる。
(実施形態の補足事項)
以上、本発明を上述した実施形態によって説明してきたが、本発明の技術的範囲は上述した実施形態に限定されるものではなく、例えば、以下のような形態でも良い。

(１)上述した実施形態では、復路のスキャン光の強度Ｉ２を往路のスキャン光の強度Ｉ１で除した値であるＩの具体的な値について特に限定しなかったが、例えば、Ｉを２のべき乗にすることにより、往路のスキャンで取得した画像データの輝度値をＩ倍する時にビットシフト演算のみにより画像データを補正することが可能になり、補正を高速で行うことができる。

(２)上述した実施形態では、第２の画像Ｇ２のピクセルが飽和している場合に、第１の画像Ｇ１のピクセルを使用して補正した例について説明したが、第１の画像Ｇ１のピクセルの輝度値を使用するか否かを閾値により選択するようにしても良い。例えばショットノイズが多い場合には、上限と下限を設定し、その範囲内であれば第１の画像Ｇ１のピクセルの輝度値を使用するようにしても良い。

(３)上述した実施形態では、補正される第２の画像Ｇ２のピクセルの輝度値を光検出器４５の飽和輝度に設定した例について説明したが、飽和輝度より低い値に設定するようにしても良い。

１１…照明光学系、１３…走査光学系、１５…結像光学系、１６…ステージ、１７…検出光学系、１９…制御部、２１…モニタ、２３…レーザ光源、２７…２次元走査機構、Ｓ…試料。

Claims (5)

1. 第１の光および前記第１の光より強度の大きい第２の光を出力可能な光源と、
   往路にて前記光源からの前記第１の光または復路にて第２の光を前記試料に照射して前記試料をスキャンする走査手段と、
   前記スキャンによる前記試料からの光を検出する光検出手段と、
   前記光検出手段で検出された光に基づいて複数のピクセルからなる画像を取得し取得された画像を画像処理する画像処理手段とを備え、
   前記画像処理手段は、
   前記第２の光の試料への照射により取得された第２の画像のピクセルが所定輝度以上のピクセルか否かを判断する判断手段と、
   前記第２の画像の所定輝度以上のピクセルの輝度値を前記第１の光の試料への照射により取得された第１の画像の対応するピクセルの輝度値に基づいて補正する補正手段と、
   を有していることを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。
2. 請求項１記載の走査型共焦点顕微鏡において、
   前記所定輝度は、前記光検出手段の飽和輝度であることを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。
3. 請求項１または請求項２記載の走査型共焦点顕微鏡において、
   前記補正手段は、前記第１の画像の前記対応するピクセルの輝度値に、前記第２の光の強度を前記第１の光の強度で除した値を乗算して、前記第２の画像のピクセルの輝度値を補正することを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。
4. 請求項１ないし請求項３のいずれか１項記載の走査型共焦点顕微鏡において、
   前記走査手段は、前記試料の同一部分を往復スキャンすることを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。
5. 請求項４記載の走査型共焦点顕微鏡において、
   前記走査手段は、往路において前記第１の光により前記試料をスキャンし、復路において前記第２の光により前記試料をスキャンすることを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。