JP2010509207A - クロロフィルａ及びクロリンｅ６の製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、クロロフィルａ及びクロリンｅ６の製造方法に関する。本発明は、破砕されていないインタクトクロレラ細胞そのものを利用してクロロフィルａを抽出し、これからクロリンｅ６を製造して、本発明で採択しているクロレラ細胞の前処理過程によって高い含量比率のクロロフィルａを得ることができ、これから高い収率でクロリンｅ６を製造することができる。また、本発明の方法は、比較的簡単な工程によって行われて、クロリンｅ６の大量生産に適している。
【選択図】図３ｃ

Description

本発明は、クロロフィルａ及びクロリンｅ６の製造方法に関する。

クロリンｅ６は、癌の光線力学的治療(photodynamic therapy)に利用される光敏感性物質である。

米国特許第５，３３０，７４１号は、クロリンｅ６を製造する方法を開示する。この特許の方法によると、バイオマスを、クロロフィルａを抽出するためにアセトンで２〜３回処理する。次いで、バイオマスをろ過または遠心分離して、抽出物を蒸発させ、クロロフィル分子からマグネシウムイオンを除去してフィチルエステル基を加水分解するために酸を処理する。同時に、エステル化するためにメチルアルコールを添加して、反応マス(Reaction mass)を水で処理し、フェオホルビドα誘導体をクロロメチレンで抽出して、抽出物を中和して、水で洗浄し、蒸発させて、アルミナ上でクロマトグラフィーする。次いで、メチルフェオホルビドαをクロロメチレンとメタノールとの混合物から結晶化して、得られたフェオホルビドα誘導体を、酸素が存在するピリジン−ジエチルエーテル−ｎ−プロパノール内で強い無機塩基と反応させ、反応マスを水で処理する。水層をｐＨ４となるまで酸性化して、不安定なクロリンをクロロメチレンで抽出し、抽出物を蒸発させて、不安定なクロリンをテトラヒドロフランに再び溶解し、溶液を蒸発させて、このような過程を、７００ｎｍにおける吸光度増加が止まるまで繰り返す。得られたｐｕｒｐｕｒｉｎｅ１８をテトラヒドロフランに溶解して、ジアゾメタンでエステル化し、ｐｕｒｐｕｒｉｎｅ１８メチルエステルをピリジン存在下でクロロメチレン中のリシン水溶液と混合して、混合物を室温で１２時間攪拌する。溶媒を高真空状態で除去した後、得られた粗(crude)生成物を逆相高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)で精製して、溶媒を凍結乾燥(lyophilisation)で除去する。ＰＳを、ＰＤＴ用注射液(Injection solution)を得るためにホスフェート緩衝溶液に溶解して、０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液を添加し、０．１Ｎ ＨＣｌを使用してｐＨを生理的値のｐＨ ７．３５に調節して、溶液を微細気孔フィルターを通過させてろ過する。

しかし、前記方法は、低い再現性、手間(高真空、結晶化、カラムクロマトグラフィー及びＨＰＬＣの使用、リシンとの長い反応時間)、及び毒性が高くて可燃性の試薬(ジアゾメタン、ピリジン、メタノール、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル)を使用する問題点があって、医薬または食品産業分野に不適である。

大韓民国特許出願公開第２００４−００２５９１１号の方法によると、スピルリナバイオマスを、クロロフィルａが完全に抽出されるまでアセトンで処理し、バイオマスをろ過あるいは遠心分離する。抽出物を、クロロフィル分子からマグネシウムイオンを除去するために酸で処理し、抽出物を中和して、沈殿されたフェオフィチンａをろ過した後、粗フェオフィチン１ｇに対して６〜１６ｍｌのアセトン、０．６〜６ｍｌのヘキサン及び５〜１０ｍｌの濃い塩酸から構成された塩酸−アセトン−ヘキサン混合物を使用して、フェオフィチンａを加水分解する。次いで、混合物を４０〜６０℃に加熱しながら２０分〜１時間攪拌した後、ヘキサン(６〜１６ｍｌ)を加えて、有機層をアセトンと塩酸の混合物(２〜１０：１)で洗浄し、水層をヘキサンで洗浄した後、フェオホルビドａをろ過して、水で洗浄し、アセトン−水混合物で再結晶して、重量が一定になるまで空気中で乾燥する。その後、フェオホルビドａをアセトンに溶解させて、０．０５〜１．００％濃度の無機強塩基水溶液を加えて、３０〜６０℃で５〜３０分間攪拌し、１〜５０％濃度の無機強塩基水溶液をさらに加えた後、混合物を４０〜６０℃で２０〜９０分間加熱して、薄い塩酸で中和し、クロリンｅ６沈殿を遠心分離して、酸反応が消えるまで蒸留水で洗浄し、５５〜８０％クロリンｅ６を得る。

上記の方法も同様に、過程が複雑で、食品及び医薬に適用できない試薬を使用する問題点がある。

本明細書全体にかけて多数の特許文献及び論文が参照されて、その引用が表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

本発明者らは、緑藻類に属するクロレラから高い収率でクロリン(chlorin)ｅ６を製造し、且つ、比較的簡単な工程で大量生産に適した方式によりクロリンｅ６が製造できる方法を開発するために鋭意研究した結果、クロレラの独特な前処理過程などの効率的な製造プロトコールを開発することにより、本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、クロロフィルａの製造方法を提供することにある。

また、本発明の他の目的は、クロリンｅ６の製造方法を提供することにある。

本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。

本発明の一様態によると、本発明は、破砕されていないインタクト(intact)クロレラに有機溶媒を処理する段階を含むクロロフィルａの製造方法を提供する。

本発明者らは、効率的にクロリンｅ６を製造するために、まずクロロフィルａを効率的に製造できる方法を開発しようとし、このような目的のために、出発物質として適したクロレラを選別した。

従来の通常的な方法によると、クロレラからクロロフィルａを抽出する場合、まずクロレラ細胞を破砕して、この破砕物(Cell lysate)からクロロフィルａを抽出した。しかし本発明者らは、従来のこのような通念から外れ、破砕されていないインタクトクロレラを利用して、非常に高い収率でクロロフィルａを製造することに成功した。このような成功的なクロロフィルａの抽出は、従来の技術からは想到できないもので、非常に驚くべき結果である。

本明細書において、用語‘インタクトクロレラ’は、破砕しなかったクロレラを意味する。用語‘インタクトクロレラ’は、当業界で通常的に使用される用語‘生クロレラ(Live chlorella)’と同一な意味を有する。通常的に、細胞内にある物質を抽出または分離する場合、細胞破砕過程(例えば、超音波粉砕)が必ず伴われる。しかし、本発明では、破砕されていないクロレラそのものを利用する。

このように破砕されていないクロレラ細胞そのものを利用すると、クロロフィルａの抽出効率が高いだけではなく、細胞破砕過程で発生するクロロフィルａの酸化などのような問題点も防ぐことができる。

本発明の方法で利用できる有機溶媒は、当業界に公知の様々な有機溶媒を含む。例えば、（ｉ）炭素数１〜４の無水または含水低級アルコール(メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなど)、（ｉｉ）前記低級アルコールと水との混合溶媒、（ｉｉｉ）アセトン、（ｉｖ）エチルアセテート、（ｖ）クロロホルム、（ｖｉ）ブチルアセテート、（ｖｉｉ）１，３−ブチレングリコール、（ｖｉｉｉ）ヘキサン、及び（ｉｘ）ジエチルエーテルが有機溶媒として利用できる。好ましくは、本発明に利用される有機溶媒は、メタノールまたはエタノールであり、より好ましくは、エタノールである。

本発明で利用されるクロレラとしては、通常のいかなるクロレラでも可能であり、好ましくは、海水クロレラである。より好ましくは、本発明で利用されるクロレラは、Chlorella ellipsoidea, Chlorella minutissima, Chlorella vulgaris, Chlorella fusca, Chlorella zofingiensis, Chlorella stigmataphora, Chlorella vulgarisまたはChlorella pyrenoidosaであり、最も好ましくは、Chlorella ellipsoideaである。

本発明の他の様態によると、本発明は、（ａ）クロレラに３０〜８０％エタノールを処理して、クロレラからクロロフィルａ以外の他の成分を除去する段階と、（ｂ）前記クロレラに９０〜１００％エタノールを処理して、クロロフィルａを抽出しクロロフィルａ抽出液を得る段階と、を含むクロロフィルａの製造方法を提供する。

本発明のまた他の様態によると、本発明は、（ａ）クロレラに８０〜１００％エタノールを処理し、クロロフィルａを抽出する段階と、（ｂ）前記抽出液にジオキサンを添加し、クロロフィルａの沈殿を誘導する段階と、を含むクロロフィルａの製造方法を提供する。

本発明者らは、クロリンｅ６の前駆物質としてクロロフィルａをクロレラから効率的に製造できる方法を開発するために鋭意研究した結果、高い収率及び精製度でクロロフィルａが製造できる二つのプロトコールを開発した。

クロロフィルａ−プロトコールＡ
クロロフィルａ−プロトコールＡは、相対的低濃度のエタノールを利用して、クロレラからクロロフィルａ以外の他の成分を除去して、相対的高濃度のエタノールを利用して、クロロフィルａを抽出する過程からなっている。

本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用されるクロレラは、破砕されていないクロレラ細胞である。本発明において、音波破砕(sonication)などによって破砕されていないものとして、クロレラ細胞そのものを利用して行うことが好ましい。一般に、細胞破砕物(Cell lysate)に有機溶媒を処理してクロロフィルａを抽出するが、本発明の好ましい具現例によると、破砕されていないクロレラ細胞そのものを利用する。このように破砕されていないクロレラ細胞そのものを利用すると、クロロフィルａの抽出効率が高いだけではなく、細胞破砕過程で発生するクロロフィルａの酸化などのような問題点も防ぐことができる。

本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用されるクロレラは、海水クロレラであり、より好ましくは、Chlorella ellipsoidea, Chlorella minutissima, Chlorella vulgaris, Chlorella fusca, Chlorella zofingiensis, Chlorella stigmataphora, Chlorella vulgarisまたはChlorella pyrenoidosaであり、最も好ましくは、Chlorella ellipsoideaである。

本発明の最も大きい特徴の一つは、クロレラからクロロフィルａを抽出する前に、クロレラからクロロフィルａ以外の他の成分を除去する前処理過程を行うことである。このような前処理過程は、高い純度(含量比率)でクロロフィルａを抽出できるようにする。

前記不純物除去過程は、クロレラに３０〜８０％エタノールを処理して行われる。エタノールを利用した理由は、第一、エタノールが、不純物を除去するに最も優れた効率を示すためであり、第二、最終的に製造されるクロリンｅ６が食品に利用されることを予想すると、人体に無害なエタノールを利用することが好ましいからである。前記過程で利用されるエタノールは、３０〜８０％の濃度を有する。もし３０％未満のエタノールを利用すると、不純物の除去効率が非常に低くなり、８０％超過のエタノールを利用すると、不純物以外にクロロフィルａも除去され、クロロフィルａの抽出効率が大きく減少される問題点がある。

好ましくは、段階（ａ）におけるエタノールの濃度は、３０〜６８％、より好ましくは、５０〜６５％、さらに好ましくは、５８〜６２％、最も好ましくは約６０％である。

段階（ａ）は、少なくとも１回行って、好ましくは２〜７回、より好ましくは３〜６回、最も好ましくは５〜６回行う。段階（ａ）を反復的に行う場合、例えば、クロレラをエタノールに懸濁させて、遠心分離してクロレラを沈殿させる方式でクロレラの不純物を除去する。

前記不純物を除去するための前処理過程を経たクロレラに９０〜１００％エタノールを処理してクロロフィルａを抽出し、クロロフィルａ抽出液を得る。この過程で、エタノールの濃度が９０％未満であると、抽出効率が大きく減少される問題点がある。

好ましくは、段階（ｂ）におけるエタノールの濃度は、９５〜１００％、より好ましくは、９８〜１００％、最も好ましくは約１００％である。

プロトコールＡのクロロフィルａの製造方法のクロロフィルａに対する収率は、５〜１５％、好ましくは、６〜１２％、より好ましくは７〜９％である。収率は、使用されたクロレラの乾燥重量１ｇに対する、得られたクロロフィルａの重量比の百分率で計算される。

プロトコールＡのクロロフィルａ精製度は、７０〜９０％、好ましくは、７０〜８５％、より好ましくは７２〜８０％である。

クロロフィルａ−プロトコールＢ
クロロフィルａ−プロトコールＢは、高濃度のエタノール及びジオキサンを利用する方法であって、このプロトコールによると、上述のプロトコールＡにおける不純物の除去過程が省かれて、簡単な工程によって高い収率でクロロフィルａを製造することができる。

クロロフィルａ−プロトコールＢに利用されるクロレラに対する内容は、上述のプロトコールＡと同様である。

クロロフィルａ−プロトコールＢの第１の段階は、８０〜１００％エタノールを利用して、クロレラからクロロフィルａを抽出する段階である。この過程で、エタノールの濃度が８０％未満であると、抽出効率が大きく減少する問題点がある。好ましくは、段階（ａ）におけるエタノールの濃度は、９０〜１００％、より好ましくは、９８〜１００％、最も好ましくは約１００％である。

クロロフィルａ−プロトコールＢの第２の段階は、ジオキサンを利用してクロロフィルａを沈殿させる段階である。この段階を通じて、クロロフィルａを沈殿させて固相のクロロフィルａを得ることができるだけではなく、クロロフィルａの精製度を高めることができる。使用されるジオキサンの量は、特に制限されないが、クロロフィルａ抽出液１Ｌに対して、好ましくは５０〜２５０ｍｌ、より好ましくは、１００〜２００ｍｌ、最も好ましくは１２０〜１６０ｍｌを添加することが好ましい。この場合、使用されるジオキサンは、１００％のジオキサンである。

本発明の好ましい具現例によると、ジオキサンを添加した後、追加的に水を抽出液に添加する。水の使用量は、特に制限されないが、クロロフィルａ抽出液１Ｌに対して、好ましくは５０〜２５０ｍｌ、より好ましくは、１００〜２００ｍｌ、最も好ましくは１２０〜１６０ｍｌを添加することが好ましい。

本発明の好ましい具現例によると、段階（ｂ）以後に、段階（ｂ）の反応物を−１０℃以下で低温処理し、クロロフィルａの沈殿がさらによくなされるようにする。より好ましくは、−１５℃〜−３０℃、最も好ましくは、−１８℃〜−２５℃で低温処理する。

プロトコールＢのクロロフィルａの製造方法のクロロフィルａに対する収率は、３〜１５％、好ましくは、４〜１０％、より好ましくは４〜６％である。プロトコールＢのクロロフィルａ精製度は、７０〜９８％、好ましくは、７５〜９５％、より好ましくは８０〜９０％である。

本発明の他の様態によると、（ａ）上述の方法により得られたクロロフィルａに酸を処理し、クロロフィルａからマグネシウムイオンを除去することにより、フェオフィチン(pheophytin)ａを得る段階と、（ｂ）前記フェオフィチンａに塩基を処理してクロリンｅ６を得る段階とを含むクロリンｅ６の製造方法を提供する。

本発明者らは、緑藻類に属するクロレラから高い収率でクロリンｅ６を製造し、且つ、比較的簡単な工程で大量生産に適した方式によってクロリンｅ６を製造できる方法を開発するために研究して、その結果、効率的な製造過程を開発した。

本発明のクロリンｅ６の製造方法は、上述の二つのクロロフィルａの製造方法により得られたクロロフィルａを利用してクロリンｅ６を製造する過程である。

より詳細には、クロロフィルａ−プロトコールＡにより製造されたクロロフィルａを出発物質とする場合、本発明の方法は、（ａ）クロレラに３０〜６８％エタノールを処理して、クロレラからクロロフィルａ以外の他の成分を除去する段階と、（ｂ）前記クロレラに８０〜１００％エタノールを処理してクロロフィルａを抽出し、クロロフィルａ抽出液を得る段階と、（ｃ）前記クロロフィルａ抽出液に酸を処理し、クロロフィルａからマグネシウムイオンを除去することにより、フェオフィチンａを得る段階と、（ｄ）前記フェオフィチンａに塩基を処理し、クロリンｅ６を得る段階とを含む。

より詳細には、クロロフィルａ−プロトコールＢにより製造されたクロロフィルａを出発物質とする場合、本発明の方法は、（ａ）クロレラに８０〜１００％エタノールを処理して、クロロフィルａを抽出段階と、（ｂ）前記抽出液にジオキサンを添加してクロロフィルａの沈殿を誘導する段階、（ｃ）前記クロロフィルａに酸を処理し、クロロフィルａからマグネシウムイオンを除去することにより、フェオフィチンａを得る段階と、（ｄ）前記フェオフィチンａに塩基を処理し、クロリンｅ６を得る段階とを含む。

一方、本発明のクロリンｅ６の製造方法は、基本的に酸を利用したフェオフィチンａの製造段階、及び塩基を利用したクロリンｅ６の製造段階を含むが、より具体的には、大きく二つのプロトコールに分けられる。

クロリンｅ６−プロトコールＡ
クロリンｅ６−プロトコールＡは、フェオフィチンａからクロリンｅ６を製造するにおいて、エタノール溶媒下で行うことを特徴とする。

クロリンｅ６−プロトコールＡによると、クロロフィルａ抽出液に酸を処理して、クロロフィルａからマグネシウムイオンを除去することにより、フェオフィチンａを得る。クロロフィルａ及びフェオフィチンａの化学式は、下記化学式１及び２のようである。

クロロフィルａに酸を処理すると、化学式１からマグネシウムイオンが除去されて、フェオフィチンａが製造される。好ましくは、段階（ａ）は、クロロフィルａ抽出物に酸を処理して、クロロフィルａ抽出液のｐＨを１〜５となるように調節して行う。この場合、ｐＨ５を超過すると、マグネシウムイオン除去率が大きく減少する問題点がある。より好ましくは、段階（ａ）における反応物のｐＨは、１〜３であり、最も好ましくは、２〜３である。

段階（ａ）で利用される酸としては、当業界に公知の多様な酸を利用することができるが、好ましくは、無機酸、より好ましくは、硫酸及び塩酸であり、最も好ましくは、塩酸である。

前記過程で製造された前記フェオフィチンａに塩基を処理して、最終的に化学式３のクロリンｅ６を得る。

本発明の好ましい具現例によると、段階（ｂ）は、フェオフィチンａに塩基性溶液を処理して、ｐＨ１１〜１６、より好ましくは、ｐＨ１３〜１４になるように調節して行う。段階（ｂ）で利用される塩基としては、当業界に公知の多様な塩基を利用することができるが、好ましくは、無機塩基であり、最も好ましくはＮａＯＨである。

本発明の好ましい具現例によると、前記段階（ｂ）、即ちクロリンｅ６を得る段階は、エタノール溶媒下で行われる。

本発明の好ましい具現例によると、段階（ａ）の反応結果物を冷凍室に保管して沈殿を誘導する。

フェオフィチンａは、通常的に沈殿物形態に得られる。エタノール溶媒を利用してクロリンｅ６を製造する場合、フェオフィチンａ沈殿物は、エタノール溶媒に直接的によく溶解されない。したがって、フェオフィチンａ沈殿物をエタノール溶媒に溶解する前に、フェオフィチンａ沈殿物をアセトンで溶解することが好ましい。次いで、アセトン溶解物からアセトンを除去(例えば、蒸発により)した後、フェオフィチンａにエタノールを添加してフェオフィチンａを溶解し、次いで塩基と反応してクロリンｅ６を製造する。

本発明の好ましい具現例によると、クロリンｅ６−プロトコールＡは、（ａ）上述の方法により得られたクロロフィルａに酸を処理し、クロロフィルａからマグネシウムイオンを除去することにより、フェオフィチンａ沈殿物を得る段階と、（ｂ−１）フェオフィチンａ沈殿物にアセトン溶媒を添加しフェオフィチンａ溶液を得て、次いでアセトン溶媒を除去する段階と、（ｂ−２）残存のフェオフィチンａにエタノールを添加して、フェオフィチンａ溶液を得る段階と、（ｂ−３）前記フェオフィチンａ溶液に塩基を処理し、クロリンｅ６を得る段階とを含む。

本発明の好ましい具現例によると、前記段階（ｂ）以後に、段階（ｂ）の反応結果物を中和させる段階をさらに含む。この場合、多様な塩基を利用して中和させることができ、例えば、ＨＣｌを利用して中和することができる。

クロリンｅ６を製造した後、適した塩形態を有するように、クロリンｅ６を塩で処理することができる。例えば、ＮａＨＣＯ₃またはＮＨ₄ＣＯ₃のような塩を処理し、クロリンｅ６の−ＣＯＯＨグループにナトリウムまたはアンモニウムが結合されたクロリンｅ６の塩を得ることができる。

クロリンｅ６−プロトコールＡのクロリンｅ６に対する精製度は、８０〜９９％、好ましくは、８５〜９９％、より好ましくは、９３〜９８％である。クロリンｅ６に対する収率は、クロレラを出発物質とする場合、３〜１０％、好ましくは３〜８％、より好ましくは４〜６％である。 収率は、使用されたクロレラの乾燥重量１ｇに対する、得られたクロリンｅ６の重量比の百分率で計算される。

クロリンｅ６−プロトコールＢ
クロリンｅ６−プロトコールＢは、フェオフィチンａからクロリンｅ６を製造するにおいて、アセトン溶媒下で行うことを特徴とする。

クロリンｅ６−プロトコールＢにおいて、段階（ａ）に対する説明は、クロリンｅ６−プロトコールＡと同様である。また、クロリンｅ６−プロトコールＢにおいて、段階（ｂ）も、アセトン溶媒下でフェオフィチンａに塩基を処理することを除いては、基本的にクロリンｅ６−プロトコールＡと同一である。

クロリンｅ６−プロトコールＢによると、段階（ａ）で形成されたフェオフィチンａ沈殿物をアセトン溶媒に溶解した後、このフェオフィチンａ溶液に直接塩基を処理してクロリンｅ６を製造する。

本発明の好ましい具現例によると、クロリンｅ６−プロトコールＢは、（ａ）上述の方法により得られたクロロフィルａに酸を処理し、クロロフィルａからマグネシウムイオンを除去することにより、フェオフィチンａ沈殿物を得る段階と、（ｂ−１）フェオフィチンａ沈殿物にアセトン溶媒を添加し、フェオフィチンａ溶液を得る段階と、（ｂ−２）前記フェオフィチンａ溶液に塩基を処理し、クロリンｅ６を得る段階とを含む。

クロリンｅ６−プロトコールＢによると、塩基としてＮａＯＨを利用すると、最終的に製造されるクロリンｅ６がナトリウム塩形態を有するようになる。クロリンｅ６−プロトコールＡによると、クロリンｅ６の塩を得るために別途の処理をしなければならないが、プロトコールＢは、このような過程が省かれる。

クロリンｅ６−プロトコールＢは、プロトコールＡより短縮された工程を通じて効率的にクロリンｅ６を製造する。また、クロリンｅ６−プロトコールＢは、プロトコールＡより短縮された工程からなっているが、最終的に製造されたクロリンｅ６の精製度は、プロトコールＡより大きい。

クロリンｅ６−プロトコールＢのクロリンｅ６に対する精製度は、９０〜９９．９９％、好ましくは９２〜９９．９５％、より好ましくは９５〜９９．９０％、最も好ましくは９９．０〜９９．９０％である。クロリンｅ６に対する収率は、クロレラを出発物質とする場合、２〜８％、好ましくは、３〜８％、より好ましくは、３〜５％である。

本発明の特徴及び利点(advantages)を要約すると以下のようである。
（ｉ）本発明は、破砕されていないクロレラ細胞そのものを利用してクロロフィルａを抽出し、これからクロリンｅ６を製造する。
（ｉｉ）本発明で採択しているクロレラ細胞の前処理過程によって高い含量比率のクロロフィルａを得ることができ、これから高い収率でクロリンｅ６を製造することができる。
（ｉｉｉ）本発明の方法は、比較的簡単な工程によって行われて、クロリンｅ６の大量生産に適している。

粉砕クロレラを利用し、クロロフィルａに対してエタノール抽出した結果を示すＨＰＬＣ(High pressure liquid chromatography)クロマトグラムであり、図１ａは３０分間抽出した結果である。矢印は、クロロフィルａに該当するピークである。 粉砕クロレラを利用し、クロロフィルａに対してエタノール抽出した結果を示すＨＰＬＣ(High pressure liquid chromatography)クロマトグラムである。図１ｂは１時間３０分間抽出した結果である。矢印は、クロロフィルａに該当するピークである。 粉砕クロレラを利用し、クロロフィルａに対してエタノール抽出した結果を示すＨＰＬＣ(High pressure liquid chromatography)クロマトグラムである。図１ｃは３時間抽出した結果である。矢印は、クロロフィルａに該当するピークである。 粉砕されていないインタクトクロレラを利用し、クロロフィルａに対してエタノール抽出した結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。図１ｄは３０分間抽出した結果である。矢印は、クロロフィルａに該当するピークである 粉砕されていないインタクトクロレラを利用し、クロロフィルａに対してエタノール抽出した結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。図１ｅは、１時間３０分間抽出した結果である。矢印は、クロロフィルａに該当するピークである 図１ｆは、粉砕されていないインタクトクロレラを利用し、クロロフィルａに対してエタノール抽出した結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。図１ｆは３時間抽出した結果である。矢印は、クロロフィルａに該当するピークである 粉砕されていないインタクトクロレラに含まれている成分を分析したＨＰＬＣクロマトグラムである。矢印は、クロロフィルａに該当するピークである。 クロレラを６０％エタノールで洗浄し、クロロフィルａ以外の他の成分を除去した結果を示すＨＰＬＣ分析結果である。図２ｂは、６０％エタノールによる反復的な洗浄において、１回目の分析結果である。ＨＰＬＣ分析は、洗浄結果形成された上澄み液に対するものである。 クロレラを６０％エタノールで洗浄し、クロロフィルａ以外の他の成分を除去した結果を示すＨＰＬＣ分析結果である。図２ｃは、６０％エタノールによる反復的な洗浄において、２回目の分析結果である。ＨＰＬＣ分析は、洗浄結果形成された上澄み液に対するものである。 クロレラを６０％エタノールで洗浄し、クロロフィルａ以外の他の成分を除去した結果を示すＨＰＬＣ分析結果である。図２ｄは、６０％エタノールによる反復的な洗浄において、３回目の分析結果である。ＨＰＬＣ分析は、洗浄結果形成された上澄み液に対するものである。 クロレラを６０％エタノールで洗浄し、クロロフィルａ以外の他の成分を除去した結果を示すＨＰＬＣ分析結果である。図２ｅは、６０％エタノールによる反復的な洗浄において、４回目の分析結果である。ＨＰＬＣ分析は、洗浄結果形成された上澄み液に対するものである。 クロレラを６０％エタノールで洗浄し、クロロフィルａ以外の他の成分を除去した結果を示すＨＰＬＣ分析結果である。図２ｆは、６０％エタノールによる反復的な洗浄において、５回目の分析結果である。ＨＰＬＣ分析は、洗浄結果形成された上澄み液に対するものである。 クロレラを６０％エタノールで洗浄し、クロロフィルａ以外の他の成分を除去した結果を示すＨＰＬＣ分析結果である。図２ｇは、６０％エタノールによる反復的な洗浄において、６回目の分析結果である。ＨＰＬＣ分析は、洗浄結果形成された上澄み液に対するものである。 １００％エタノールでクロロフィルａを抽出した結果を示すＨＰＬＣ分析結果である。矢印は、クロロフィルａに該当するピークである。 ジオキサンを利用するクロロフィルａの製造方法によって製造されたクロロフィルａに対するＨＰＬＣクロマトグラムである。矢印は、クロロフィルａに該当するピークである。 本発明によって形成されたフェオフィチン(pheophytin)ａに対するＨＰＬＣクロマトグラムである。矢印は、フェオフィチンａに該当するピークである。 本発明のプロトコールＡによって製造されたクロリンｅ６に対するＨＰＬＣクロマトグラムである。矢印は、クロリンｅ６に該当するピークである。 本発明のプロトコールＢによって製造されたクロリンｅ６に対するＨＰＬＣクロマトグラムである。矢印は、クロリンｅ６に該当するピークである。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。

実施例１：出発物質として適したクロレラの選択
最終的にクロリンｅ６を得るための出発物質として、超音波粉砕クロレラ及び超音波粉砕しなかったインタクト(intact)クロレラ[海水クロレラ、chlorella ellipsoidea、Chlorland co, Ltd]の２種の試料を用意した。次いで、超音波粉砕クロレラ及びインタクトクロレラのクロロフィルａ及び他の成分がどのくらい含有されているか確認した。超音波粉砕クロレラ及び海水クロレラをそれぞれ１０ｇずつ取って、エタノールを１００ｍｌ添加して３０分間、１時間３０分間、３時間及び１２時間攪拌した後、ろ過して、抽出溶液を得た。抽出溶液に対してＨＰＬＣ分析を行って、ＨＰＬＣは、ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰカラム付きＨＰＬＣシステム(Dong-il Shimadzu Corp.)を利用して実施し、注入量は２０μｌ、流速は、１ｍｌ/ｍｉｎとした。referenceとしては、Ｆｌｕｋａ会社のクロロフィルａを使用した。図１ａ〜１ｆにおいて、滞留時間(retention time)約１９．５分に該当するピークがクロロフィルａに該当するものである。

図１ａ〜１ｆから分かるように、インタクトクロレラを利用する場合、超音波粉砕されたクロレラを利用する場合に比べ、約２０倍程度のクロロフィルａを得ることができる。したがって、超音波粉砕されたクロレラよりはインタクトクロレラを利用することが、クロロフィルａ収率を高めて、結果としてより多いクロリンｅ６が得られることが分かる。クロレラを超音波粉砕して得た粉砕物を利用したエタノール抽出よりは、クロレラそのものを利用したエタノール抽出が、クロロフィルａの抽出効率にさらに優れるという驚くべき事実を見出した。このような新規発見は、クロロフィル精製過程を短縮できる利点を提供するだけではなく、超音波破砕過程でクロロフィルａが酸化される問題点を回避することができるため、非常に重要なことである。

実施例２：クロレラからクロロフィルａの収得
プロトコールＡ
Ａ−１：クロレラからクロロフィルａ以外の他の不純物の除去
まず海水クロレラ(Chlorella ellipsoidea、Chlorland co, Ltd)から塩分を除去するために、蒸留水で洗浄した後、５０００ｒｐｍで遠心分離して、クロレラを沈殿させた。次いで、沈殿物を蒸留水で再懸濁し、再び遠心分離を行った。蒸留水による洗浄過程を５回行った後、沈殿物を少量取って、ＨＰＬＣでクロロフィルａ及び他の成分がどのくらい含有されているか確認した。ＨＰＬＣは、ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰカラム付きＨＰＬＣシステム(Dong-il Shimadzu Corp.)を利用して実施し、注入量は２０μｌ、流速は、１ｍｌ/ｍｉｎとした。referenceとしては、Ｆｌｕｋａ会社のクロロフィルａを使用した。ＨＰＬＣ結果は、図２ａに示されている。

図２ａから確認できるように、滞留時間(retention time)約９．７分でクロロフィルａに該当するピークが観察されて、滞留時間２．５〜７．５分で他の各種成分に該当するピークが観察された。

海水の除去されたクロレラ(破砕されていないクロレラ細胞そのもの)１００ｇに６０％エタノール３００ｍｌを添加して洗浄し、５０００ｒｐｍで遠心分離してクロレラを沈殿させ、滞留時間２．５〜７．５分にある不純物を除去した。このようなエタノール洗浄過程を６回繰り返して行った。図２ｂ〜図２ｇは、エタノール洗浄過程において、遠心分離した後、形成された上澄み液に対するＨＰＬＣ結果である。

図２ｂ〜図２ｇから確認できるように、滞留時間２．５〜７．５分で表れる不純物が、６０％エタノール洗浄過程で多量除去されていることが分かる。

一方、８０％以上の濃度のエタノールを利用して洗浄過程を行うと、クロロフィルａが抽出されて、洗浄、即ち不純物の除去ができなかった。また、２０％、４０％及び５０％濃度のエタノールを利用して洗浄過程を行ったが、不純物の除去率が６０％エタノールには及ばなかった。

したがって、６０％エタノールが最も好ましい洗浄溶液であることが分かる。即ち、６０％エタノールは、クロレラからクロロフィルａを抽出することなく、クロレラ細胞に含まれているクロロフィルａ以外の他の成分を効果的に抽出し、洗浄されたクロレラにクロロフィルａが相対的に高い含量で含まれるようにする。

Ａ−２：不純物の除去されたクロレラからクロロフィルａの抽出Ｉ
前記不純物の除去されたクロレラ１００ｇに１００％エタノール１Ｌを添加して、３時間攪拌しクロロフィルａを抽出した。抽出過程で利用されたクロレラは、音波破砕などにより破砕されなかったもので、クロレラ細胞そのものを利用して抽出を行った。一般に、細胞破砕物に有機溶媒を処理してクロロフィルａを抽出するが、本実施例では、破砕されていないクロレラ細胞そのものを利用した。抽出結果は、図２ｈに示されている。

図２ｈから分かるように、滞留時間約８．４分でクロロフィルａに該当するピークが観察されて、図２ａで観察された滞留時間２．５〜７．５分の不純物が相当量除去されていることが分かった。また、ＨＰＬＣクロマトグラムによりクロロフィルａの含量(即ち、精製度)が７６．９２％であることを確認することができた。一方、プロトコールＡのクロロフィルａに対する収率は、７．８９％であった。

プロトコールＢ
まず海水クロレラ(Chlorella ellipsoidea、Chlorland co, Ltd)から塩分を除去するために、蒸留水で洗浄した後、５０００ｒｐｍで遠心分離して、クロレラを沈殿させた。次いで、沈殿物を蒸留水で再懸濁し、再び遠心分離を行った。蒸留水による洗浄過程を５回行った後、沈殿物を少量取って、ＨＰＬＣによりクロロフィルａ及び他の成分がどのくらい含有されているか確認した。ＨＰＬＣは、ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰカラム付きＨＰＬＣシステム(Dong-il Shimadzu Corp.)を利用して実施し、注入量は２０μｌ、流速は、１ｍｌ/ｍｉｎとした。referenceとしては、Ｆｌｕｋａ会社のクロロフィルａを使用した。海水の除去されたクロレラ(破砕されていないクロレラ細胞そのもの)１００ｇに１００％エタノール５００ｍｌを添加して、５０００ｒｐｍで遠心分離してクロレラを沈殿させ、上澄み液クロロフィル抽出溶液のみをろ過した。前記クロロフィル抽出物にジオキサン７０ｍｌ及び蒸留水７０ｍｌを添加した後、５時間以上−２０℃冷凍室に保管して沈殿を誘導した。次いで、沈殿物をろ過して水で洗浄し、クロロフィルａを得た。次いで、下記のクロリンｅ６製造のために、１００％エタノールに前記沈殿物を溶解した。

図２ｉから確認できるように、滞留時間約４．３分でクロロフィルａに該当する主ピークが観察されて、他のピークはほとんど生成されなかった。また、ＨＰＬＣクロマトグラムでクロロフィルａの含量(即ち、精製度)が８４．９３％であることを確認することができた。一方、プロトコールＢのクロロフィルａに対する収率は、４．２６％であった。

実験結果、ジオキサンを利用する場合は、より短縮された工程を通じて、高い収率でクロロフィルａを得ることができることが分かる。

実施例３：クロロフィルａからクロリンｅ６の製造
実施例３−１：フェオフィチン(pheophytin)ａの生成
実施例２のプロトコールＡから得られたクロロフィルａを含むエタノール抽出物１Ｌ当たり５〜１０ｍｌの１Ｎ ＨＣｌを処理して、抽出物のｐＨを２〜３になるように調節し、３時間攪拌してクロロフィルａからマグネシウムイオンを除去することにより、フェオフィチンａを得た(図３ａ)。次いで、黒色のフェオフィチンａ溶液を−２３℃冷凍室に３〜６時間保管して沈殿を形成し、ろ過した。

実施例３−２：クロリンｅ６の生成
プロトコールＡ
前記実施例３−１のフェオフィチンａ沈殿物をアセトンで溶かした後、アセトンを蒸発(evaporation)で除去した。次いで、１００％エタノール１Ｌにフェオフィチンａを溶解して、これに１Ｎ ＮａＯＨ ５〜１０ｍｌを添加し、フェオフィチンａ溶液を含むろ過液のｐＨを１３〜１４に調節して、１２時間攪拌して、フェオフィチンａからクロリンｅ６を形成させた。その後、反応結果物に１Ｎ ＨＣｌを添加して中和し、ろ過した後、エタノールを完全に除去した(図３ｂ)。図３ｂのグラフから確認できるように、滞留時間約４．９８７分でクロリンｅ６に該当するピークが観察されて、クロリンｅ６の含量(精製度)は、９７．６６％であった。

最終的にクロレラ１０００ｇから４８．６ｇのクロリンｅ６が得られた(収率：４．８６％)。

また、クロリンｅ６の塩形態を製造するために、ＮａＨＣＯ₃またはＮＨ₄ＨＣＯ₃ ３当量を氷水に溶解した後、クロリンｅ６に添加して、水をろ過した後、凍結乾燥して、塩形態のクロリンｅ６を製造した。

プロトコールＢ
前記実施例３−１のフェオフィチンａ沈殿物を１Ｌのアセトンに溶かした後、１Ｎ ＮａＯＨ水溶液５〜１０ｍｌを加えｐＨを１３〜１４に調節して、１２時間攪拌し、フェオフィチンａからクロリンｅ６を形成させた。生成されたクロリンｅ６のＮａ塩の沈殿物をろ過した後、アセトン及びヘキサンで順に洗浄した後、少量の水に溶解させて、水溶性膜フィルターを利用してクロリンｅ６溶液をろ過した後、凍結乾燥し、最終クロリンｅ６ Ｎａ塩を得た(図３ｃ)。最終クロリンｅ６ Ｎａ塩は、粉末形態を示した。最終Ｎａ塩クロリンｅ６の収率は、クロレラ１０Ｌ処理時(遠心分離後１〜１．５ｋｇ)、２５〜３０ｇであって、２．５〜３．０％である。また、クロリンｅ６に対する精製度は、９９．８３％であった。

プロトコールＢによると、ＮａＯＨ処理によるクロリンｅ６の生成過程により、クロリンｅ６のＮａ塩が直接形成される。このような側面でもプロトコールＡと大きい差がある。

以上詳細に説明したように、本発明は、破砕されていないインタクトクロレラ細胞そのものを利用してクロロフィルａを抽出し、これからクロリンｅ６を製造して、本発明で採択しているクロレラ細胞の前処理過程によって高い含量比率のクロロフィルａを得ることができ、これから高い収率でクロリンｅ６を製造することができる。また、本発明の方法は、比較的簡単な工程によって行われて、クロリンｅ６の大量生産に適している。

以上、本発明の特定な部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。

Claims (28)

1. 破砕されていないインタクト(intact)クロレラに有機溶媒を処理する段階を含むクロロフィルａの製造方法。
2. 前記クロレラは、海水クロレラであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記有機溶媒は、エタノールであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
4. （ａ）クロレラに３０〜８０％エタノールを処理して、クロレラからクロロフィルａ以外の他の成分を除去する段階と、
   （ｂ）前記クロレラに９０〜１００％エタノールを処理して、クロロフィルａを抽出しクロロフィルａ抽出液を得る段階と、
   を含むクロロフィルａの製造方法。
5. （ａ）クロレラに８０〜１００％エタノールを処理し、クロロフィルａを抽出する段階と、
   （ｂ）前記抽出液にジオキサンを添加し、クロロフィルａの沈殿を誘導する段階と、
   を含むクロロフィルａの製造方法。
6. （ａ）請求項４または５に記載の方法により得られたクロロフィルａに酸を処理し、クロロフィルａからマグネシウムイオンを除去することにより、フェオフィチン(pheophytin)ａを得る段階と、
   （ｂ）前記フェオフィチンａに塩基を処理してクロリンｅ６を得る段階と、
   を含むクロリンｅ６の製造方法。
7. 前記クロレラは、破砕されていないインタクト(intact)細胞であることを特徴とする、請求項４または５に記載の方法。
8. 前記クロレラは、海水クロレラであることを特徴とする、請求項４または５に記載の方法。
9. 前記段階（ａ）におけるエタノールの濃度は、５０〜６５％であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
10. 前記段階（ａ）におけるエタノールの濃度は、５８〜６２％であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
11. 前記段階（ａ）は、３〜６回繰り返して行うことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
12. 前記段階（ｂ）におけるエタノールの濃度は、９８〜１００％であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
13. 前記段階（ａ）におけるエタノールの濃度は、９０〜１００％であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
14. 前記段階（ａ）におけるエタノールの濃度は、９８〜１００％であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
15. 前記段階（ｂ）は、ジオキサンを添加した後、追加的に水を抽出液に添加することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
16. 前記方法は、段階（ｂ）以後に、段階（ｂ）の反応物を−１０℃以下で低温処理することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
17. 前記方法のクロロフィルａに対する収率は、７〜９％であり、精製度は、７２〜８０％であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
18. 前記方法のクロロフィルａに対する収率は、４〜６％であり、精製度は、８０〜９０％であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
19. 前記段階（ａ）は、前記クロロフィルａ抽出液に酸を処理し、クロロフィルａ抽出液のｐＨを１〜５になるように調節して行うことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
20. 前記ｐＨは、１〜３であることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
21. 前記段階（ｂ）は、フェオフィチンａに塩基性溶液を処理し、ｐＨ１１〜１６になるように調節して行うことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
22. 前記ｐＨは、１３〜１４であることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
23. 前記段階（ｂ）以後に、段階（ｂ）の反応結果物を中和させる段階をさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
24. 前記段階（ｂ）は、エタノール溶媒下で行うことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
25. 前記段階（ｂ）は、アセトン溶媒下で行うことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
26. 前記方法は、
    （ａ）請求項４または５に記載の方法により得られたクロロフィルａに酸を処理し、クロロフィルａからマグネシウムイオンを除去することにより、フェオフィチンａ沈殿物を得る段階と、
    （ｂ−１）フェオフィチンａ沈殿物にアセトン溶媒を添加し、フェオフィチンａ溶液を得る段階と、
    （ｂ−２）前記フェオフィチンａ溶液に塩基を処理し、クロリンｅ６を得る段階と、
    を含むことを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
27. 前記方法のクロリンｅ６に対する精製度は、９３〜９８％であり、クロリンｅ６に対する収率は、４〜６％であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
28. 前記方法のクロリンｅ６に対する精製度は、９５〜９９．９％であり、クロリンｅ６に対する収率は、３〜５％であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。

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