JP2011120576A - リジン残基とプロリン残基とが共に水酸化されたコラーゲンを産生する形質転換体 - Google Patents

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Abstract

【課題】医薬品、工業製品、化粧品、食品等として商業的に一層価値がある高性能な多用途素材となるようなコラーゲン（具体的には例えば、３重ヘリックス構造が安定化され、且つ、線維形成能が高いコラーゲン）を見出し、見出された新規コラーゲンを取得するための方法等の開発が求められていた。
【解決手段】下記（１）〜（３）の全てのタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する外来遺伝子が微生物細胞内に導入されて得られることを特徴とする形質転換体等。
（１）リジン水酸化酵素
（２）プロリン水酸化酵素
（３）コラーゲン
【選択図】なし

Description

本発明は、リジン残基とプロリン残基とが共に水酸化されたコラーゲンを産生する形質転換体等に関する。
コラーゲンは、皮下組織、軟骨及び骨等に代表される様々な生体組織中に存在する結合組織に含まれるタンパク質である。コラーゲンは、引っ張り強度（tensile stress）が高く、それ故に、コラーゲンが含まれる生体組織は、機械的なストレスに対して高い強度を有している。
コラーゲンは、前記のような優れた物理的性質を有すると共に様々な生理活性を有しているので、色々な用途に用いられている。例えば、コラーゲンは、医薬品、工業製品、化粧品又は食品として用いられており、商業的に価値のある多用途素材であるといえる。
コラーゲンは、体内に存在するタンパク質のうちの約３０％を占めており、ほぼ全ての多細胞動物中に存在している。現在のところ、ヒトを含む高等動物では２０種類以上のタイプの異なるコラーゲンが存在することが知られており、異なるタイプのコラーゲンが異なる生体組織に特異的に含まれていることが知られている（例えば、非特許文献１〜３参照）。
代表的なコラーゲンとしては、例えば、ＴｙｐｅＩコラーゲン、ＴｙｐｅＩＩコラーゲン、及び、ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンを挙げることができる。ＴｙｐｅＩコラーゲンは、骨、及び、皮膚中に含まれる主要な線維状コラーゲンであり、２つのα１（Ｉ）鎖と１つのα２（Ｉ）鎖とからなるヘテロトリマー分子である。ＴｙｐｅＩＩコラーゲンは、軟骨に含まれるコラーゲンであり、３つの同じα１（ＩＩ）鎖からなるホモトリマー分子である。ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンは、皮膚及び筋肉組織中に含まれるコラーゲンであり、３つの同じα１（ＩＩＩ）鎖からなるホモトリマー分子である。尚、ＴｙｐｅＩコラーゲン、ＴｙｐｅＩＩコラーゲン、ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンは、例えば、非特許文献４、及び、非特許文献５に記載された方法によって、生体組織から精製される。
また、非特許文献６では、酵母細胞内でＴｙｐｅＩコラーゲン前躯体とプロリン水酸化酵素とを共発現させて、プロリン残基が水酸化されたＴｙｐｅＩコラーゲンを作製している。一方、特許文献１では、酵母細胞内でＴｙｐｅＩコラーゲン前躯体又はＴｙｐｅＩＩＩコラーゲン前躯体とプロリン水酸化酵素とを共発現させて、プロリン残基が水酸化されたＴｙｐｅＩコラーゲン又はＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンを作製している。
しかしながら、いずれもリジン残基は水酸化されていない。
谷原雅夫監修、コラーゲンの製造と応用展開、ISBN：978-4-7813-0071-3、シーエムシー出版 Volume Editors: Brinckmann, J., Notbohm, H., Muller, P.K. Collagen primer in Structure, Processing and Assembly, Topics in Current Chemistry Vol. 247, 2005 Gelse, K., Poschl, E., Aigner, T., Collagens−structure, function, and biosynthesis, Advanced Drug Delivery Reviews 55:1531-1546（2003） Miller et al.， Methods In Enzymology, 82:33-64（1982），アカデミックプレス（Academic Press） Byers et al.， Biochemistry 13:5243-5248（1974） P.David Toman et al., J. Biol. Chem., Vol.275, No.30, July28, p23303-23309（2000）
Kivirikko, Kari I., WO9738710（1997）
医薬品、工業製品、化粧品、食品等として商業的に一層価値がある高性能な多用途素材となるようなコラーゲン（具体的には例えば、３重ヘリックス構造が安定化され、且つ、線維形成能が高いコラーゲン）を見出し、見出された新規コラーゲンを取得するための方法等の開発が求められていた。
本発明者等は、かかる状況のもと鋭意検討した結果、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．下記（１）〜（３）の全てのタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する外来遺伝子が微生物細胞内に導入されて得られることを特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記すこともある。）
（１）リジン水酸化酵素
（２）プロリン水酸化酵素
（３）コラーゲン；
２．前項１記載の形質転換体が、前記（１）〜（３）の全てのタンパク質をその細胞内で共発現していることを特徴とする形質転換体；
３．前記リジン水酸化酵素が、リジルヒドロキシラーゼ１、リジルヒドロキシラーゼ２又はリジルヒドロキシラーゼ３から選択される少なくとも１種類のリジン水酸化酵素であることを特徴とする前項１又は２記載の形質転換体；
４．前記プロリン水酸化酵素が、プロリル−４−ヒドロキシラーゼのαサブユニット、及び、プロリル−４−ヒドロキシラーゼのβサブユニットからなる酵素であることを特徴とする前項１〜３記載のいずれかの前項記載の形質転換体；
５．前記プロリル−４−ヒドロキシラーゼのβサブユニットが酵母αファクターの分泌シグナルとの融合体であることを特徴とする請求項４記載の形質転換体；
６．前記プロリル−４−ヒドロキシラーゼのαサブユニットが、α１サブユニット、α２サブユニット又はα３サブユニットであることを特徴とする前項５又は６記載のいずれかの前項記載の形質転換体；
７．前記コラーゲンが、ＴｙｐｅＩ〜ＴｙｐｅＸＸＩＸコラーゲンから選択される少なくとも１種類のコラーゲンであることを特徴とする前項１〜６記載のいずれかの前項記載の形質転換体；
８．前記リジン水酸化酵素及び前記プロリン水酸化酵素のタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する外来遺伝子の少なくとも１つが、酵母由来のプロモーターの下流に連結されていることを特徴とする前項１又は２記載の形質転換体；
９．前記プロモーターが、アルコールオキシダーゼ１プロモーターであることを特徴とする前項８記載の形質転換体；
１０．前記微生物細胞が、真核生物細胞であることを特徴とする前項１〜９記載のいずれかの前項記載の形質転換体；
１１．前記真核生物細胞が、酵母細胞であることを特徴とする前項１０記載の形質転換体；
１２．前記酵母細胞が、メタノール資化性酵母細胞であることを特徴とする前項１１記載の形質転換体；
１３．前記メタノール資化性酵母細胞が、Komagataella pastorisであることを特徴とする前項１２記載の形質転換体；
１４．前項１〜１３記載のいずれかの請求項記載の形質転換体が産生して得られうることを特徴とするコラーゲン（以下、本発明コラーゲンと記すこともある。）；
１５．全リジン残基のうち１５％以上が水酸化されていることを特徴とする前項１４記載のコラーゲン；
１６．テロペプチド領域のリジン残基が水酸化されていることを特徴とする前項１４記載のコラーゲン
１７．微生物細胞内に、下記（１）〜（３）の全てのタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する外来遺伝子を導入する第一工程、第一工程で得られる形質転換体によってコラーゲンを産生させる第二工程、及び、第二工程で産生されたコラーゲンを回収することを特徴とするコラーゲンの取得方法（以下、本発明取得方法と記すこともある。）
（１）リジン水酸化酵素
（２）プロリン水酸化酵素
（３）コラーゲン；
１８．前項１７記載の取得方法により取得されたコラーゲン；
本発明により、医薬品、工業製品、化粧品、食品等として商業的に一層価値がある高性能な多用途素材となるようなコラーゲン（具体的には例えば、３重ヘリックス構造が安定化され、且つ、線維形成能が高いコラーゲン）、及び、当該コラーゲンを取得するための方法等が提供可能となる。
図１は、プロリル−４−ヒドロキシラーゼのα１サブユニット遺伝子、プロリル−４−ヒドロキシラーゼのβサブユニット遺伝子、及び、リジルヒドロキシラーゼ１遺伝子の導入プラスミドの作製工程の概略を示すフローチャートである。 図２は、プロリル−４−ヒドロキシラーゼのα１サブユニット遺伝子、プロリル−４−ヒドロキシラーゼのβサブユニット遺伝子、及び、リジルヒドロキシラーゼ２遺伝子の導入プラスミドの作製工程の概略を示すフローチャートである。 図３は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩ遺伝子の導入プラスミドの作製工程の概略を示すフローチャートである。 図４は、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１のサブユニット遺伝子、プロリル−４−ヒドロキシラーゼのβサブユニット遺伝子、及び、リジルヒドロキシラーゼ１遺伝子の導入プラスミドの構造を示す概略図である。 図５は、プロリル−４−ヒドロキシラーゼのα１サブユニット遺伝子、プロリル−４−ヒドロキシラーゼのβサブユニット遺伝子、及び、リジルヒドロキシラーゼ２遺伝子の導入プラスミドの構造を示す概略図である。 図６は、ＴＴ０６１２２６−１−３株、及び、ＴＴ０６１２２６−３−６株から精製したコラーゲンを示す電気泳動図である。レーンMは分子量マーカー、レーン１はＴＴ０６１２２６−１−３株から精製したコラーゲン、レーン２はＴＴ０６１２２６−３−６株から精製したコラーゲンの電気泳動図である。 図７は、精製コラーゲンのアミノ酸組成を示す表である。 図８は、コラーゲンの線維形成能を示すグラフである。 図９は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１遺伝子及びヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２遺伝子の導入プラスミドの作製工程の概略を示すフローチャートである。 図１０は、ＴＴ０８０４１７−１−８株、ＴＴ０８０７２４−１−１１株、及び、０６０７１３−１−３株から精製したコラーゲンを示す電気泳動図である。レーンMは分子量マーカー、レーン１は０６０７１３−１−３株から精製したコラーゲン、レーン２はＴＴ０８０４１７−１−８株から精製したコラーゲン、レーン３はＴＴ０８０７２４−１−１１株から精製したコラーゲンの電気泳動図である。 図１１は、精製コラーゲンのアミノ酸組成を示す表である。 図１２は、コラーゲンの線維形成能を示すグラフである。
本明細書に記載される発明は記載されている特定の方法論、プロトコール、及び、試薬に限定されず、可変であると考えられる。また、本明細書で用いる用語は単に特定の実施形態を記載するためのものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではないと考えられる。
特に断りの無い限り、本明細書で用いる全ての技術用語、及び、化学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者に共通に理解されているものと同じ意味を持つ。本発明を実施又は試験する上で、本明細書に記載されているものと同様又は同等の方法、及び、材料のいずれを用いてもよいが、以下、好ましい方法、装置、及び、材料を記載する。
本発明形質転換体は、下記（１）〜（３）の全てのタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する外来遺伝子が微生物細胞内に導入されて得られることを特徴とする。
（１）リジン水酸化酵素
（２）プロリン水酸化酵素
（３）コラーゲン
本発明形質転換体は、リジン残基とプロリン残基とが共に水酸化された安定性の高いコラーゲンを産生することができる。具体的には、リジルヒドロキシラーゼ１、プロリン水酸化酵素、及び、コラーゲンの遺伝子を有する形質転換体、並びに、リジルヒドロキシラーゼ３、プロリン水酸化酵素、及び、コラーゲンの遺伝子を有する形質転換体では、全リジン残基のうち１５％以上、および、全プロリン残基のうち４５％以上が水酸化されているコラーゲンを産生することができ、好ましくは全リジン残基のうち３０％以上、および、全プロリン残基のうち４５％以上が水酸化されているコラーゲンを産生することができ、より好ましくは全リジン残基のうち３７％以上、および、全プロリン残基のうち５０％以上が水酸化されているコラーゲンを産生することができる。リジルヒドロキシラーゼ２、プロリン水酸化酵素、及び、コラーゲンの遺伝子を有する形質転換体では、テロペプチド領域のリジン残基、及び、全プロリン残基のうち４５％以上が水酸化されているコラーゲンを産生することができる。本発明形質転換体を利用することにより、プロリンが４５％以上水酸化されたコラーゲンが得られるが、実用的に、安定な３重ラセン構造を形成するコラーゲンであればプロリン残基の水酸化率は特に限定されるわけではない。
リジン残基とプロリン残基の両者が共に水酸化されたコラーゲンは、３重ヘリックス構造が安定化され、且つ、線維形成能が高いコラーゲンであり、このため、医薬品、工業製品、化粧品、食品等として商業的に一層価値がある高性能な多用途素材となるようなコラーゲンということができる。
本発明形質転換体は、例えば、遺伝子導入に用いるプラスミドを構築し、構築した遺伝子導入プラスミドを用いて宿主細胞を形質転換することで作製することができる。本発明形質転換体は、通常の遺伝子工学的手法に従って調製すればよい。
前記の遺伝子工学的手法において、微生物細胞（即ち、宿主）・ベクター系としては特に限定されないが、例えば、宿主として細菌（例えば、Escherichia属、Bacillus属、Pseudomonas属）、ベクターとしてバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドを用いる宿主・ベクター系、又は、宿主として酵母（例えば、Komagataella属、Saccharomyces属、Hansenula属、Candida属、Ogataea属）、ベクターとしてエピソーム性プラスミド、ＡＲＳ−ＣＥＮ型プラスミド、染色体組み込み型プラスミドを用いる宿主・ベクター系、等を挙げることができる。遺伝子導入プラスミドの作製には、好ましくは宿主としてEscherichia属、ベクターとしてプラスミドを用いることができる。また、本発明形質転換体の作製には、好ましくは、宿主として酵母（例えば、Komagataella属、Saccharomyces属、Hansenula属、Candida属、Ogataea属）、ベクターとして染色体組み込み型プラスミドを用いることができる。
本発明形質転換体は、下記（１）〜（３）のすべてのタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する外来遺伝子を微生物細胞内に導入して作製される。
（１）リジン水酸化酵素
（２）プロリン水酸化酵素
（３）コラーゲン
前記外来遺伝子を導入する順序は特に限定はなく、前記（１）、（２）、（３）のいずれの外来遺伝子からでも良い。また２つ以上の外来遺伝子を同時に導入することもできる。
本発明における「リジン水酸化酵素」としては、例えば、リジルヒドロキシラーゼ１、リジルヒドロキシラーゼ２、リジルヒドロキシラーゼ３等を挙げることができる。
また、「リジン水酸化酵素」の由来は特に限定されないが、例えば、高等動物由来であることが好ましく、ヒト由来であることが更に好ましい。
リジルヒドロキシラーゼ１、リジルヒドロキシラーゼ２、及び、リジルヒドロキシラーゼ３は、ホモダイマーを形成する酵素である。リジルヒドロキシラーゼ１は、コラーゲンのらせん構造部分に存在するＧｌｙ−Ｘ−Ｙ繰り返し配列のＹ部位に位置するリジンのδ位を水酸化する。リジルヒドロキシラーゼ２は、テロペプチド領域に存在するＧｌｙ−Ｘ−Ｙ、Ｓｅｒ−Ｘ−Ｙ又はＡｌａ−Ｘ−Ｙ配列のＹ部位に位置するリジンのδ位を水酸化すると考えられている。またリジルヒドロキシラーゼ３は、コラーゲンのらせん構造部分に存在するＧｌｙ−Ｘ−Ｙ繰り返し配列のＹ部位に位置するリジンの水酸化活性に加えて、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性とグリコシルトランスフェラーゼ活性とを有する。
本発明形質転換体は、コラーゲンのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子、プロリン水酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子と共にリジン水酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子が導入されて得られるものであり、コラーゲンのリジン残基を効率よく水酸化する能力を有している。
本発明形質転換体の作製に用いられるリジン水酸化酵素をコードする塩基配列を有する外来遺伝子として、リジルヒドロキシラーゼ１、リジルヒドロキシラーゼ２、又は、リジルヒドロキシラーゼ３をコードする塩基配列を有する遺伝子を用いることができる。具体的には例えば、配列番号５２で示されるアミノ酸配列をコードしている塩基配列を有するリジルヒドロキシラーゼ１遺伝子、配列番号５４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するリジルヒドロキシラーゼ２遺伝子、及び、配列番号５６で示されるアミノ酸配列をコードしている塩基配列を有するリジルヒドロキシラーゼ３遺伝子を用いることができる。さらに、リジン水酸化酵素遺伝子の具体例として、例えば、配列番号５３で示される塩基配列を有するリジルヒドロキシラーゼ１遺伝子、配列番号５５で示される塩基配列を有するリジルヒドロキシラーゼ２遺伝子、及び、配列番号５７で示される塩基配列を有するリジルヒドロキシラーゼ３遺伝子を用いることができる。また、前記リジルヒドロキシラーゼ１をコードする塩基配列を有する遺伝子、前記リジルヒドロキシラーゼ２をコードする塩基配列を有する遺伝子、前記リジルヒドロキシラーゼ３をコードする塩基配列を有する遺伝子において、その塩基配列の一部の塩基の欠失、置換又は付加が人為的に導入されてなる遺伝子であってもよく、また、そのアミノ酸配列に欠失、置換又は付加がなされたリジン水酸化酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子であってもよい。即ち、コラーゲンのリジン残基を水酸化する活性を有するリジン水酸化酵素をコードする遺伝子であれば、本発明形質転換体の作製に好適に利用できる。
リジン水酸化酵素（例えば、リジルヒドロキシラーゼ）の発現を確認するには下記のようにすればよい。
リジルヒドロキシラーゼ等の検出は、例えば、免疫検出方法(イムノアッセイ)による方法が好ましい。様々な有用な免疫検出方法(イムノアッセイ)が、例えば、Ｔｏｗｂｉｎら（1979、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76，4350-4354）において記載されている。
イムノアッセイは、最も単純かつ簡単な確認方法であるといえる。イムノアッセイとしては特に限定されず、例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び、イムノビーズ捕捉アッセイ、或いは、ウェスタンブロッティング等を挙げることができる。好ましくは、ウェスタンブロッティング等が挙げられる。
得られた精製サンプル等の酵素サンプルを、免疫複合体の形成が可能な条件下で、抗体と接触させることにより、任意の抗原と抗体との免疫複合体を形成する。即ち、結合するのに十分長い時間、抗体と混合物とをインキュベートする。その後、サンプルに特異的に結合した抗体のみを検出すればよい。免疫複合体の検出は、通常、当該技術分野で標準的に使用される、放射活性、蛍光、生物学的又は酵素的なタグ若しくは標識を検出することにより行うことができる。
本発明における「プロリン水酸化酵素」としては、例えば、αサブユニット、及び、βサブユニットからなるプロリル−４−ヒドロキシラーゼを挙げることができる。
ここで「αサブユニット」としては、例えば、α１サブユニット、α２サブユニット、α３サブユニット等が挙げられ、好ましくは、α１サブユニットが挙げられる。
また、「プロリン水酸化酵素」の由来は特に限定されないが、例えば、高等動物由来であることが好ましく、ヒト由来であることが更に好ましい。
プロリル−４−ヒドロキシラーゼは、αサブユニットとβサブユニットとからなる酵素であり、高等動物由来のプロリン水酸化酵素はαサブユニット２個、βサブユニット２個からなるヘテロ４量体酵素である。前記αサブユニットは、プロリン残基の水酸化に関与する触媒部位を含有するサブユニットである。また、前記βサブユニットは、αサブユニットとの複合体の形成及び安定化に必要なサブユニットである。プロリル−４−ヒドロキシラーゼが機能するためには、αサブユニットとβサブユニットとの両方が必要である。
プロリル−４−ヒドロキシラーゼは、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ繰り返し配列のＹ部位にあるプロリン残基の４位を水酸化し、４−ヒドロキシプロリンにする酵素であるため、コラーゲンの合成過程に重要な酵素の一つである。ヒドロキシプロリンはコラーゲンの３重ラセン構造の安定性を向上させる。Ｙ部位にあるプロリン残基が適切に水酸化されることがコラーゲンの３重ラセン構造の安定化に重要である。
本発明形質転換体は、コラーゲンのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子、リジン水酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子と共にプロリン水酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子が導入されて得られるものであり、コラーゲンのプロリン残基を効率よく水酸化する能力を有している。
本発明形質転換体の作製に用いられるプロリン水酸化酵素をコードする塩基配列を有する外来遺伝子として、プロリル−４−ヒドロキシラーゼαサブユニットをコードする塩基配列を有する遺伝子、及び、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニットをコードする塩基配列を有する遺伝子を用いることができる。具体的には例えば、プロリル−４−ヒドロキシラーゼαサブユニットをコードする塩基配列を有する遺伝子としては、配列番号５８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子、配列番号６０で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプロリル−４−ヒドロキシラーゼα２サブユニット遺伝子、及び、配列番号６２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプロリル−４−ヒドロキシラーゼα３サブユニット遺伝子、また、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニットをコードする塩基配列を有する遺伝子としては、配列番号６４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子を用いることができる。さらに、プロリン水酸化酵素遺伝子をコードする塩基配列を有する遺伝子の具体例として、例えば、プロリル−４−ヒドロキシラーゼαサブユニットをコードする塩基配列を有する遺伝子では配列番号５９で示される塩基配列を有するプロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子、配列番号６１で示される塩基配列を有するプロリン−４−ヒドロキシラーゼα２サブユニット遺伝子、及び、配列番号６３で示される塩基配列を有するプロリル−４−ヒドロキシラーゼα３サブユニット遺伝子、また、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニットをコードする塩基配列を有する遺伝子では配列番号６５で示される塩基配列を有するプロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子を用いることができる。前記プロリル−４−ヒドロキシラーゼαサブユニットをコードする塩基配列を有する遺伝子、及び、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニットをコードする塩基配列を有する遺伝子において、その塩基配列の一部の塩基の欠失、置換又は付加が人為的に導入されてなる遺伝子であってもよく、また、そのアミノ酸配列のアミノ酸を欠失、置換又は付加がなされたプロリン水酸化酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子であってもよい。即ち、コラーゲンのプロリン残基を水酸化する活性を有するプロリン水酸化酵素遺伝子であれば本発明形質転換体の作製に好適に利用できる。本発明形質転換体では微生物細胞内でプロリン水酸化酵素が発現され、当該プロリン水酸化酵素によって、コラーゲン中のプロリン残基が水酸化される。
プロリン水酸化酵素（例えば、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ）の発現を確認するには下記のようにすればよい。
プロリル−４−ヒドロキシラーゼ等の検出は、例えば、免疫検出方法(イムノアッセイ)による方法が好ましい。様々な有用な免疫検出方法(イムノアッセイ)が、例えば、Ｔｏｗｂｉｎら（1979、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76，4350-4354）において記載されている。
イムノアッセイは、最も単純かつ簡単な確認方法であるといえる。イムノアッセイとしては特に限定されず、例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び、イムノビーズ捕捉アッセイ、或いは、ウェスタンブロッティング等を挙げることができる。好ましくは、ウェスタンブロッティング等が挙げられる。
得られた精製サンプル等の酵素サンプルを、免疫複合体の形成が可能な条件下で、抗体と接触させることにより、任意の抗原と抗体との免疫複合体を形成する。即ち、結合するのに十分長い時間、抗体と混合物とをインキュベートする。その後、サンプルに特異的に結合した抗体のみを検出すればよい。免疫複合体の検出は、通常、当該技術分野で標準的に使用される、放射活性、蛍光、生物学的又は酵素的なタグ若しくは標識を検出することにより行うことができる。
本発明における「コラーゲン」としては、例えば、ＴｙｐｅＩコラーゲン〜ＴｙｐｅＸＸＩＸコラーゲンから選択される少なくとも１種類のコラーゲン等を挙げることができる。好ましくは、線維形成型コラーゲン（Fibril-forming collagen：ＴｙｐｅＩコラーゲン、ＴｙｐｅＩＩコラーゲン、ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲン、ＴｙｐｅＶコラーゲン、ＴｙｐｅＸＩコラーゲン、ＴｙｐｅＸＸＩＶコラーゲン、ＴｙｐｅＸＸＶＩＩコラーゲン）、より好ましくは、ＴｙｐｅＩコラーゲン、ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲン等が挙げられる。 また、「コラーゲン」の由来は特に限定されないが、例えば、高等動物由来であることが好ましく、ヒト由来であることが更に好ましい。
ＴｙｐｅＩコラーゲンはα１（Ｉ）鎖２本とα２（Ｉ）鎖１本からなるヘテロ３量体であり、ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンはα１（ＩＩＩ）鎖３本からなるホモ３量体である。
本発明形質転換体は、リジン水酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子、プロリン水酸化酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子と共にコラーゲンのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子が導入されて得られるものであり、リジン残基及びプロリン残基が水酸化されたコラーゲンを産生することができる。
本発明形質転換体の作製に用いられるコラーゲンのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子としてＴｙｐｅＩコラーゲンをコードする塩基配列を有する遺伝子、及び、ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンをコードする塩基配列を有する遺伝子を用いることができる。具体的には例えば、ヒト由来のＴｙｐｅＩコラーゲンをコードする塩基配列を有する遺伝子としては、配列番号６６で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子及び配列番号６８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を用いることができ、ヒト由来のＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンをコードする塩基配列を有する遺伝子としては、配列番号７０で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を用いることができる。さらに、コラーゲン遺伝子の具体例として、例えば、ＴｙｐｅＩコラーゲンをコードする塩基配列を有する遺伝子としては、配列番号６７で示される塩基配列を有するＣＯＬ１Ａ１遺伝子及び配列番号６９で示される塩基配列を有するＣＯＬ１Ａ２遺伝子を用いることができ、また、ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンをコードする塩基配列を有する遺伝子としては配列番号７１で示される塩基配列を有する遺伝子を用いることができる。また、前記ＴｙｐｅＩコラーゲンをコードする塩基配列を有する遺伝子、及び、前記ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンをコードする塩基配列を有する遺伝子において、その塩基配列の一部の塩基の欠失、置換又は付加が人為的に導入されてなる遺伝子、部分的な塩基配列をコードする遺伝子であってもよい。また、そのアミノ酸配列のアミノ酸を欠失、置換又は付加がなされたコラーゲンをコードする塩基配列を有する遺伝子、部分的なアミノ酸配列をコードする遺伝子であってもよい。即ち、アミノ酸配列中にＧｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返し配列を有し、コラーゲン特有の３重ラセン構造を形成することができるＴｙｐｅＩコラーゲンをコードする塩基配列を有する遺伝子、及び、ＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンをコードする塩基配列を有する遺伝子であれば、本発明に好適に利用できる。
微生物細胞内で前記コラーゲンが発現され、微生物細胞内に共発現された、リジン水酸化酵素とプロリン水酸化酵素との両者によって、コラーゲン中のリジン残基とプロリン残基が水酸化されたコラーゲンが生産される。
前記（１）〜（３）の全てのタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する外来遺伝子を微生物細胞内に導入する方法としては、特に限定されず、例えば、リチウム法、スフェロプラスト法、エレクトロポレーション法等の公知の方法を用いることができる。また、微生物細胞内に導入された外来遺伝子は、プラスミドの形態のまま微生物細胞内に保持させてもよいし、また、微生物細胞内の染色体中に組み込んでもよい。
前記外来遺伝子を微生物細胞内に保持させる場合には、微生物細胞（即ち、宿主）としてサッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、カンジダ・ボイディニ（Candida Boidini）、オガタエア・ミヌタ（Ogataea minuta）を用いることができる。宿主としてサッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を用いる場合は、前記外来遺伝子を運ぶベクターとして、染色体組み込み型ベクター（ＹＩｐ型）、酵母内在性プラスミド２μｍ ＤＮＡ複製開始領域を有するベクター（ＹＥｐ型）、及び、染色体由来の自己複製領域を有するベクター（ＹＣｐ型）を用いることができる。これらのベクターは遺伝子導入用のプラスミドの構築を容易にするため大腸菌でも複製可能なシャトルベクターとなっているものを用いる方が望ましい。サッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）では、好ましくは、ＹＥｐ型プラスミドを用いることができる。宿主としてコマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、カンジダ・ボイディニ（Candida Boidini）、オガタエア・ミヌタ（Ogataea minuta）を用いる場合には、前記外来遺伝子を運ぶベクターとしては、染色体組み込み型ベクターを用いることができる。これらのベクターは遺伝子導入用のプラスミドの構築を容易にするため、通常、大腸菌でも複製可能なシャトルベクターとなっているものを用いる方が望ましい。具体的には、コマガタエラ・パストリスのベクターとして、ｐＡＯ８１５、ｐＰＩＣ９Ｋ、等が好適に利用できる。
染色体組み込み型のベクターを用い外来遺伝子を宿主細胞に導入する場合、外来遺伝子はベクターに組み込まれている相同領域で染色体上に組換えられることにより宿主細胞内で安定的に保持される。相同な塩基配列としては、特に限定されないが、例えば、アミノ酸又は核酸合成系遺伝子、ribosome ＤＮＡ、Ｔｙ因子（Transposon of Yeast element）等を挙げることができる。アミノ酸合成系遺伝子若しくは核酸合成系遺伝子が欠損している宿主を用いる場合には、前記相同な塩基配列により宿主の変異を補完することにより、形質転換体の選択マーカーとして使用することができる。
ベクターに組み込まれた外来遺伝子を微生物細胞に導入する場合、遺伝子の導入が起きたことの目印として選択マーカー遺伝子が用いられる。選択マーカー遺伝子は、通常、ベクターに外来遺伝子と共に組み込まれ、細胞内に導入されることにより、形質の変化を引き起こす遺伝子が用いられる。前記選択マーカー遺伝子としてはアミノ酸又は核酸合成系遺伝子、抗生物質耐性遺伝子等を用いることができる。前記アミノ酸又は核酸合成系遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、ＬＥＵ２、ＨＩＳ４、ＡＲＧ４、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＡＤＥ２等を挙げることができる。また、抗生物質耐性遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、ゼオシン、ブラストサイジンＳ、ジェネティシン、Ｇ４１８、クロラムフェニコール、ブレオマイシン等の抗生物質に対して耐性を付与する遺伝子等が挙げられる。
本発明形質転換体における好ましい態様の一つとしては、例えば、前記微生物細胞が、真核生物細胞であることを挙げることができる。ここで、真核生物細胞としては、例えば、酵母細胞等を挙げることができる。更に、酵母細胞としては、例えば、メタノール資化性酵母細胞等を挙げることができる。また更に、メタノール資化性酵母細胞としては、例えば、Komagataella pastoris等を挙げることができる。
前記（１）〜（３）の全てのタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する外来遺伝子は発現可能な構成でプロモーターの下流に組み込まれていることが望ましい。前記プロモーターとしては宿主細胞内で機能するプロモーターであれば特に限定はないが、特定の栄養源、基質によりその転写活性が誘導される誘導型プロモーターを好適に利用することができる。また、外来遺伝子の下流にターミネーターが存在することが好ましい。
前記プロモーターとしては、特に限定されないが、例えば、ガラクトース代謝酵素遺伝子（ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０）、抑制性酸性フォスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ５）、グリセリンアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＴＤ）、フォスフォグリセリン酸キナーゼ遺伝子（ＰＧＫ）、アルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＤＨ１、ＡＯＸ１、ＡＯＸ２、ＭＯＸ、ＡＯＤ１）、ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＦＤＨ１、ＦＭＤ１）、ジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子（ＤＡＳ）、ペルオキシソーム膜タンパク質合成遺伝子（ＰＥＲ３）、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＦＬＤ１）等の遺伝子のプロモーター等を用いることができる。また前記ターミネーターとしては転写終結活性を有するターミネーターであれば有効に利用できるが、例えば、アルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＬＤ１）のターミネーターを用いることができる。
本発明は、本発明形質転換体が産生して得られうることを特徴とするコラーゲン（本発明コラーゲン）を含む。本発明コラーゲンは、コラーゲンＴｙｐｅＩ〜ＴｙｐｅＸＸＩＶから選択される少なくとも１種類のコラーゲンである。リジルヒドロキシラーゼ１、プロリン水酸化酵素、及び、コラーゲンの遺伝子を有する本発明形質転換体、並びに、リジルヒドロキシラーゼ３、プロリン水酸化酵素、及び、コラーゲンの遺伝子を有する本発明形質転換体から得られる本発明コラーゲンは、全リジン残基のうち１５％以上、及び、全プロリン残基のうち４５％以上が水酸化されたコラーゲンであり、好ましくは全リジン残基のうち３０％以上、及び、全プロリン残基のうち４５％以上が水酸化されたコラーゲンであり、より好ましくは全リジン残基のうち３７％以上、及び、全プロリン残基のうち５０％以上が水酸化されたコラーゲンである。また、リジルヒドロキシラーゼ２、プロリン水酸化酵素、及び、コラーゲンの遺伝子を有する形質転換体から得られる本発明コラーゲンでは、テロペプチド領域のリジン残基、及び、全プロリン残基のうち４５％以上が水酸化されたコラーゲンを産生することができる。本発明形質転換体を利用することにより、プロリンが４５％以上水酸化された本発明コラーゲンが得られるが、実用的に、安定な３重ラセン構造を形成する本発明コラーゲンであればプロリン残基の水酸化率は特に限定されるわけではない。
尚、コラーゲン中のリジン残基、及び、プロリン残基の水酸化率は、公知のアミノ酸組成分析法により測定することができる。
また、コラーゲンの線維形成能は、例えば、以下のような方法により測定することができる。具体的には例えば、精製したコラーゲンを、塩濃度１×Ｄ−ＰＢＳ（−）、ｐＨ７．３〜７．４に再調整した後、３７℃に保温することにより、コラーゲン分子が再配向して溶液が白濁する。当該白濁現象をコラーゲンの線維形成能とみなすことができる。従って、当該性質を利用して、濃度０．０５％から０．２０％のコラーゲン溶液を、塩濃度１×Ｄ−ＰＢＳ（−）、ｐＨ７．３〜７．４で３７℃に保温し、そのときの吸光度を経時的に測定することにより、線維形成能を測定することができる。
本発明取得方法は、微生物細胞内に、前記（１）〜（３）の全てのタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する外来遺伝子を導入する第一工程、第一工程で得られる形質転換体によってコラーゲンを産生させる第二工程、及び、第二工程で産生されたコラーゲンを回収することを特徴とする。
（１）リジン水酸化酵素
（２）プロリン水酸化酵素
（３）コラーゲン
第一工程は、本発明形質転換体を説明するための記載において既に説明したので、ここでは、その詳細な説明を省略する。
第二工程は、通常の微生物学的手法に従って実施すればよい。
第一工程で得られる形質転換体の培養に用いられる培地は、通常、当該技術分野で既知の培地が好適に使用され、培養条件は通常の方法に準じて実施され得る。
前記「培地」としては、特に限定されず、合成培地及び天然培地のいずれの培地でも用いることができるが、液体培地を用いることが好ましい。
例えば、前記「合成培地」としては、炭素源（例えば、各種糖類、グリセロール、メタノール）、窒素源（例えば、尿素、アンモニウム塩又は硝酸塩）、微量栄養素（例えば、各種ビタミン、又はヌクレオチド）等の他、無機塩（例えば、Ｍｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、Ｃｏ、又はＣｕ等）を含有するものを用いることが好ましい。尚、炭素原の供給方法としては、高濃度の炭素源を適度に少量ずつ培地中に供給することにより、高濃度の炭素源によるコラーゲンの産生阻害を回避してもよい。
また、前記「天然培地」としては、ＹＰＤ液体培地（１％イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％バクトペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース）、ＹＰＭ液体培地を用いることが好ましい。
培地のｐＨは、特に限定されないが、中性若しくは弱塩基性、又は、弱酸性であることが好ましい。また、本発明形質転換体がメタノール資化性酵母細胞である場合には、メタノール含有培地を用いることが好ましい。この場合、メタノール濃度は０．０１〜５％程度であることが好ましい。
培養温度は、特に限定されないが、１５℃〜４３℃であることが好ましい。また、培養時間も特に限定されないが、１〜１０００時間程度であることが好ましく、培養は静置又は振盪、攪拌、通気下において、回分培養法、半回分培養法又は連続培養法により実施されることが好ましい。
尚、当該培養（本培養）に先立って前培養を行うことが好ましい。前培養用の培地としては、例えば、ＹＮＢ液体培地、ＹＰＤ液体培地等を用いることが好ましい。前培養の培養条件も特に限定されないが、培養時間は１０〜１００時間、培養温度は、例えば、本発明形質転換体が酵母である場合には、１５℃〜４５℃程度であることが好ましい。
コラーゲンを回収する工程は、通常の生化学的手法及びタンパク質工学的手法に従って実施すればよい。
第二工程で産生されたコラーゲンを回収するには、形質転換体が産生したコラーゲンを含む培養上清又は培養菌体からコラーゲンを精製すればよい。
精製方法としては、特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、分画法、イオン交換法、ゲル濾過法、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティカラムクロマトグラフィー等を用いることができる。
より簡便な精製方法としては、コラーゲンが備える特性、つまり三重らせん構造がタンパク質分解酵素に対して耐性を有することを利用した精製方法を挙げることができる。このような精製方法は、例えば、下記の（ａ）〜（ｅ）の工程を有することが好ましい。
（ａ）形質転換体をｐＨ緩衝溶液中で破砕する工程、
（ｂ）得られた破砕液にタンパク質分解酵素を添加して夾雑物を分解する工程、
（ｃ）分解された破砕液を遠心分離することにより、上清を回収する工程、
（ｄ）回収された上清を種々のｐＨ条件下で塩析する工程、
（ｅ）塩析により回収された沈殿を溶解して脱塩する工程、
このようにして、本発明取得方法により取得されたコラーゲンは、医薬品、工業製品、化粧品、食品等として商業的に一層価値がある高性能な多用途素材となるようなコラーゲン（具体的には例えば、３重ヘリックス構造が安定化され、且つ、線維形成能が高いコラーゲン）である。
以下、実施例を挙げてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
遺伝子のクローニング等においては「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBN O-471-50338-X等に記載されている方法に準じて、前記外来遺伝子をプラスミドにクローニングすることにより、本発明形質転換体の作製に用いる遺伝子導入プラスミドを得ることができる。遺伝子導入プラスミドの作製に用いられるプラスミドとしては、特に限定されないが、例えば、ｐＵＣ１１９（タカラバイオ社製）、ｐＴＶ１１８Ｎ（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１９（東洋紡社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ストラタジーン社製）、ｐＣＲ２．１‐ＴＯＰＯ（Invitrogen社製）、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯ（Invitrogen社製）等を用いることができる。以下に、クローニング等の工程の詳細を説明する。
実施例１ （遺伝子のクローニング）
（１−１） リジルヒドロキシラーゼ１遺伝子（ＰＬＯＤ１）のクローニング
ｃＤＮＡクローン（ID：3917351）を、Invitrogen社より購入した。下記オリゴヌクレオチド１、及び、２を合成した。前記ｃＤＮＡクローンを鋳型とし、下記オリゴヌクレオチド１、及び、２をプライマーとして用いたＰＣＲにより、ＰＬＯＤ１を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド１：CGTCATATGATGCGGCCCCTGCTGC（配列番号１）
(b)オリゴヌクレオチド２：ATCCTCGAGTTAGGGATCGACGAAGGAGAC（配列番号２）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のKOD-Plus-を用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus- ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・３３μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。また当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、５０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて２分間の伸長反応からなるサイクルを２５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約２０００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯプラスミドの「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high DH5α）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Invitrogen社製のTOPO TA cloning キットを用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム）寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＰＬＯＤ１−ＴＯＰＯと記す。
（１−２） リジルヒドロキシラーゼ２遺伝子（ＰＬＯＤ２）のクローニング
ｃＤＮＡクローン（ID：4994235）を、Invitrogen社より購入した。下記オリゴヌクレオチド３、及び、４を合成した。前記ｃＤＮＡクローンを鋳型とし、下記オリゴヌクレオチド３、及び、４をプライマーとして用いたＰＣＲにより、ＰＬＯＤ２を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド３：CGAGATCTGATGGGGGGATGCACGGT（配列番号３）
(b)オリゴヌクレオチド４：GCAGATCTCGTTAGGGATCTATAAATGACACTG（配列番号４）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のKOD-Plus-を用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus- ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・３３μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。また当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、５０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて２分間の伸長反応からなるサイクルを２５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約２０００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯプラスミドの「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high DH5α）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Invitrogen社製のTOPO TA cloning キットを用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム）寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＰＬＯＤ２−ＴＯＰＯと記す。
（１−３） ヒスチジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＨＩＳ４）のクローニング
ＮＣＢＩオンラインデータベースからＨＩＳ４（Accession No.X56180）の配列情報を入手した。当該配列情報に基づいて下記オリゴヌクレオチド５、及び、６を合成した。下記オリゴヌクレオチド５、及び、６をプライマーとし、ＡＴＣＣより入手したコマガタエラ パストリス ATCC76273のゲノムＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲにより、ＨＩＳ４をクローニングした。尚、前記ゲノムＤＮＡの精製は、QIAGEN Genomic-tip 100/G及びGenomic DNA Buffer Setを用いて行った。
(a)オリゴヌクレオチド５：GATCTCCTGATGACTGACTCACTGATAATA（配列番号５）
(b)オリゴヌクレオチド６：TAATTAAATAAGTCCCAGTTTCTCCATACG（配列番号６）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、Invitrogen社製のAccuPrime Pfx Polymeraseを用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(c)10×AccuPrime Pfx reaction mix ・・・５μｌ
(d)AccuPrime Pfx DNA polymerase（２．５Ｕ／μｌ） ・・・０．５μｌ
(e)滅菌蒸留水 ・・・４０．５μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。また当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて２．５分間の伸長反応からなるサイクルを３５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約２６００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミドの「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Inbitorgen社製のOne Shot TOP10F’ Chemically Compitent E.coli）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Invitrogen社製のZERO-BluntII TOPO PCR cloning キットを用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＨＩＳ４−ＴＯＰＯと記す。
（１−４） アルギノサクシネートリアーゼ遺伝子（ＡＲＧ４）のクローニング
ＮＣＢＩオンラインデータベースからＡＲＧ４（Accession No.AF321097）の配列情報を入手した。当該配列情報に基づいて下記オリゴヌクレオチド７、及び、８を合成した。下記オリゴヌクレオチド７、及び、８をプライマーとし、ＡＴＣＣより入手したコマガタエラ パストリス ATCC76273のゲノムＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲにより、ＡＲＧ４を増幅した。尚、前記ゲノムＤＮＡの精製は、QIAGEN Genomic-tip 100/G及びGenomic DNA Buffer Setを用いて行った。
(a)オリゴヌクレオチド７：ACGAAAATATGGTACCTGCCCTCAC（配列番号７）
(b)オリゴヌクレオチド８：GTTCTATCTACCCGAGGAAACCGATACATA（配列番号８）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、Invitrogen社製のAccuPrime Pfx Polymeraseを用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(c)10×AccuPrime Pfx reaction mix ・・・５μｌ
(d)AccuPrime Pfx DNA polymerase（２．５Ｕ／μｌ） ・・・０．５μｌ
(e)滅菌蒸留水 ・・・４０．５μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。また当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６５℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて２．５分間の伸長反応からなるサイクルを３５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約２２００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミドの「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Invitrogen社製のOne Shot TOP10F’ Chemically Compitent E.coli）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Invitrogen社製のZERO-BluntII TOPO PCR cloning キットを用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＡＲＧ４−ＴＯＰＯと記す。
（１−５） アルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーターのクローニング
ＮＣＢＩオンラインデータベースからＡＯＸ１（Accession No.E00913、及び、U96967）の配列情報を入手した。当該配列情報に基づいて下記オリゴヌクレオチド９、及び、１０を合成した。下記オリゴヌクレオチド９、及び、１０をプライマーとし、ＡＴＣＣより入手したコマガタエラ パストリス ATCC76273のゲノムＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲにより、ＡＯＸ１プロモーターをクローニングした。尚、前記ゲノムＤＮＡの精製は、QIAGEN Genomic-tip 100/G及びGenomic DNA Buffer Setを用いて行った。
(a)オリゴヌクレオチド９：AGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTT（配列番号９）
(b)オリゴヌクレオチド１０：ATCCACCACCTAGAACTAGGATATCAAAC（配列番号１０）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、Invitrogen社製のAccuPrime Pfx Polymeraseを用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(c)10×AccuPrime Pfx reaction mix ・・・５μｌ
(d)AccuPrime Pfx DNA polymerase（２．５Ｕ／μｌ） ・・・０．５μｌ
(e)滅菌蒸留水 ・・・４０．５μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６２℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１分間の伸長反応からなるサイクルを３５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約９４０ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミドの「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Invitrogen社製のOne Shot TOP10F’ Chemically Compitent E.coli）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Invitrogen社製のZERO-BluntII TOPO PCR cloning キットを用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＡＯＸ１Ｐｒｏ＋１５ａａ−ＴＯＰＯと記す。
（１−６） アルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＯＸ１）ターミネーターのクローニング
ＮＣＢＩオンラインデータベースからＡＯＸ１（Accession No.U96967）の配列情報を入手した。当該配列情報に基づいて下記オリゴヌクレオチド１１及び１２を合成した。下記オリゴヌクレオチド１１、及び、１２をプライマーとし、ＡＴＣＣより入手したコマガタエラ パストリス ATCC76273のゲノムＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲにより、ＡＯＸ１ターミネーターを増幅した。尚、前記ゲノムＤＮＡの精製は、QIAGEN Genomic-tip 100/G及びGenomic DNA Buffer Setを用いて行った。
(a)オリゴヌクレオチド１１：CCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTC（配列番号１１）
(b)オリゴヌクレオチド１２：GCACAAACGAACGTCTCACTTAAT（配列番号１２）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、Invitrogen社製のAccuPrime Pfx Polymeraseを用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(c)10×AccuPrime Pfx reaction mix ・・・５μｌ
(d)AccuPrime Pfx DNA polymerase（２．５Ｕ／μｌ） ・・・０．５μｌ
(e)滅菌蒸留水 ・・・４０．５μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて３０秒間の伸長反応からなるサイクルを３５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約３００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミドの「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Invitrogen社製のOne Shot TOP10F’ Chemically Compitent E.coli）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Invitrogen社製のZERO-BluntII TOPO PCR cloning キットを用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＡＯＸ１ｔｅｒｍ−ＴＯＰＯと記す。
（１−７） アルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＯＸ１）の３’側下流のノンコーディング領域のクローニング
Invitrogen社製のプラスミド（ｐＡＯ８１５）の配列情報から、ＡＯＸ１の３’側下流領域の配列情報を入手した。当該配列情報に基づいて下記オリゴヌクレオチド１３及び１４を合成した。下記オリゴヌクレオチド１３、及び、１４をプライマーとし、ＡＴＣＣより入手したコマガタエラ パストリス ATCC76273のゲノムＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲにより、ＡＯＸ１の３’側下流領域を増幅した。尚、前記ゲノムＤＮＡの精製は、QIAGEN Genomic-tip 100/G及びGenomic DNA Buffer Setを用いて行った。
(a)オリゴヌクレオチド１３：TCGAGTATCTATGATTGGAAGTATGGGAAT（配列番号１３）
(b)オリゴヌクレオチド１４：GATCTTGAGATAAATTTCACGTTTAAAATC（配列番号１４）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、Invitrogen社製のAccuPrime Pfx Polymeraseを用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(c)10×AccuPrime Pfx reaction mix ・・・５μｌ
(d)AccuPrime Pfx DNA polymerase（２．５Ｕ／μｌ） ・・・０．５μｌ
(e)滅菌蒸留水 ・・・４０．５μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、５８℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１．５分間の伸長反応からなるサイクルを３５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約７５０ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミドの「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Invitrogen社製のOne Shot TOP10F’ Chemically Compitent E.coli）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Invitrogen社製のZERO-BluntII TOPO PCR cloning キットを用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＡＯＸ１−３’−ＴＯＰＯと記す。
（１−８） αファクターシグナル配列のクローニング
ＮＣＢＩオンラインデータベースからサッカロマイセス セルビシエの性決定遺伝子であるαファクター（Accession No.J0134及びX01581）の配列情報を入手した。当該配列情報に基づいて下記オリゴヌクレオチド１５及びオリゴヌクレオチド１６を合成した。下記オリゴヌクレオチド１５及び１６をプライマーとし、ＮＢＲＣより入手したサッカロマイセス セルビシエ NBRC1136のゲノムＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲにより、αファクターをコードする遺伝子を増幅した。尚、前記ゲノムＤＮＡの精製は、QIAGEN Genomic-tip 100/G及びGenomic DNA Buffer Setを用いて行った。
(a)オリゴヌクレオチド１５：TCAAACAAGAAGATTACAAACTATCAATTTCA（配列番号１５）
(b)オリゴヌクレオチド１６：TTTGTTACATCTACACTGTTGTTATCAGTCG（配列番号１６）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のKOD-Plus-を用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus- ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・１μｌ（１Ｕ）
(g)滅菌蒸留水 ・・・３３μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１分間の伸長反応からなるサイクルを３５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約６００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミドの「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Invitrogen社製のOne Shot TOP10F’ Chemically Compitent E.coli）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Invitrogen社製のZERO-BluntII TOPO PCR cloning キットを用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐαｆａｃｔｏｒ−ＴＯＰＯと記す。
（１−９） ヒトＴｙｐｅIIIコラーゲン遺伝子のクローニング
ＮＣＢＩオンラインデータベースからヒトＴｙｐｅIIIコラーゲン（Accession No.NM000090）の配列情報を入手した。当該配列情報に基づいて下記オリゴヌクレオチド１７及び１８を合成した。５’末端にリン酸基を付加した後、下記オリゴヌクレオチド１７、及び、１８をプライマーとし、東洋紡より入手したHuman brain mRNAを鋳型として用いたＰＣＲにより、ヒトＴｙｐｅIIIコラーゲンをコードする遺伝子を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド１７：GGCTGAGTTTTATGACGGGC（配列番号１７）
(b)オリゴヌクレオチド１８：GACAAGATTAGAACAAGAGG（配列番号１８）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のKOD-Plus-を用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)ゲノムＤＮＡ溶液（１５ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD -plus- ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・３３μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、９８℃にて２０秒間の変性反応、５８℃にて１０秒間のアニーリング反応、及び、７４℃にて５分間の伸長反応からなる反応サイクルを３５回行った。
ｐＵＣ１８プラスミドを制限酵素ＳｍａＩにて切断しアルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high DH5α）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、東洋紡社製のLigation highを用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＵＣ１９−ＣＯＬ３Ａ１と記す。
（１−１０） ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１遺伝子のクローニング（ｐＢｌｕｅ−ＨｓＣＯＬ１Ａ１の構築）
下記オリゴヌクレオチド５２及び５３を合成した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡）を用いてオリゴヌクレオチドの５’末端にリン酸基を付加した後、下記オリゴヌクレオチド５２及び５３をプライマーとし、Human brain cDNA（東洋紡）を鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１をコードするＤＮＡを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド５２：CAGCCACAAAGAGTCTACATGTCTAGG（配列番号７２）
(b)オリゴヌクレオチド５３：AGGTTGGGATGGAGGGAGTT（配列番号７３）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ｃDＮＡ溶液 ・・・５μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD -plus-（東洋紡） ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・２９μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９８℃にて２０秒間の変性反応、５８℃にて１０秒間のアニーリング反応、及び、７４℃にて５分間の伸長反応からなる反応サイクルを３５回行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約４．５ｋｂのＤＮＡをMagExtractor PCR&Gel cleanup（東洋紡）を用いて精製した。
pBluescriptIIKS(+)プラスミド（Stratagene）を制限酵素EcoRVにて切断し、アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した後MagExtractor PCR&Gel cleanup（東洋紡）を用いて精製した。
前記約４．５ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation high（東洋紡）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、MagExtractor plasmid （東洋紡）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＢｌｕｅ−ＨｓＣＯＬ１Ａ１と記すこともある。）を精製することにより、ｐＢｌｕｅ−ＨｓＣＯＬ１Ａ１を得た。
（１−１１） ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２遺伝子のクローニング（ｐＵＣ１８−ＨｓＣＯＬ１Ａ２の構築）
Human Neonatal Dermal Fibroblasts由来のTotal RNAをCell Applications, Incより入手した。ReverTra Plus（東洋紡）を用いcDNAを合成した。下記オリゴヌクレオチド５４及び５５を合成した。下記オリゴヌクレオチド５４及び５５をプライマーとし、前記ｃDNAを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２をコードするＤＮＡを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド５４：GCCAAGCTTGCATGCTCAGCTTTGTGGATACGCGGAC（配列番号７４）
(b)オリゴヌクレオチド５５：CGGTACCCGGGGATCCTTATTTGAAACAGACTGGGCCAATGTCC（配列番号７５）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)ｃDＮＡ溶液 ・・・５μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD -plus-（東洋紡） ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・２９μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は反応溶液を９4℃にて２分間加熱した後、９８℃にて１０秒間の変性反応、６８℃にて６分間のアニーリング及び伸長反応からなる反応サイクルを３０回行った。増幅された約４．１ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分離した後、MagExtractor PCR&Gel cleanup（東洋紡）を用いてゲルから抽出・精製した。得られたDNAを制限酵素SphI及びBａmＨＩで切断した後、MagExtractor PCR&Gel cleanup（東洋紡）を用いて精製した。
pUC１８プラスミド（東洋紡）を制限酵素SphI及びBａmＨＩで切断した後、MagExtractor PCR&Gel cleanup（東洋紡）を用いて精製した。
前記約４．１ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation high（東洋紡）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、MagExtractor plasmid （東洋紡）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＵＣ１８−ＨｓＣＯＬ１Ａ２と記すこともある。）を精製することにより、ｐＵＣ１８−ＨｓＣＯＬ１Ａ２を得た。
実施例２ （遺伝子導入プラスミドの構築）
以下に、遺伝子導入プラスミドの具体的な作製方法を説明する。図１にプロリル−４−ヒドロキシラーゼのα１サブユニット遺伝子、プロリル−４−ヒドロキシラーゼのβサブユニット遺伝子、及び、リジルヒドロキシラーゼ１遺伝子の導入プラスミドの作製工程の概略のフローチャート、図２にプロリル−４−ヒドロキシラーゼのα１サブユニット遺伝子、プロリル−４−ヒドロキシラーゼのβサブユニット遺伝子、及び、リジルヒドロキシラーゼ２遺伝子の導入プラスミドの作製工程の概略のフローチャート、図３にヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩ遺伝子の導入プラスミド作製工程の概略のフローチャートを示す。また、遺伝子導入プラスミドの構造の理解を助けるために、図４に、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子、及び、リジルヒドロキシラーゼ１遺伝子導入プラスミドの構造を示し、図５に、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子、及び、リジルヒドロキシラーゼ２遺伝子導入プラスミドの構造を示す。
（２−１） ｐＳＮ００３の構築
オリゴヌクレオチド１９及び２０を合成した。当該オリゴヌクレオチド１９、及び、２０はＡＯＸ１ターミネーターの塩基配列と制限酵素サイトの塩基配列とからなるオリゴヌクレオチドである。下記オリゴヌクレオチド19、及び、20をプライマーとし、ｐＡＯＸ１ｔｅｒｍ−ＴＯＰＯを鋳型として用いたＰＣＲにより、二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド１９：TCGACTAGTTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAA（配列番号１９）
(b)オリゴヌクレオチド２０：AACTGCAGGCACAAACGAACGTCTCACTTA（配列番号２０）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のKOD-Plus-を用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus- ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・３３μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１分間の伸長反応からなるサイクルを２５回行い、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた二本鎖ＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｅＩ及びＰｓｔＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、ＡＯＸ１ターミネーターを含む約３００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
Stratagene社より購入したプラスミドpBluescriptII SK（＋）を制限酵素ＳｐｅＩ及びＰｓｔＩにて切断した後、当該プラスミドをアガロースゲル電気泳動にて、約３０００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high DH5α）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入された目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＳＮ００３と記す。
（２−２） ｐＳＮ００４の構築
ｐＡＯＸ１ｐｒｏ−ＴＯＰＯを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、ＡＯＸ１プロモーターを含む約１０００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
前記ｐＳＮ００３を制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉにて切断しアルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high DH5α）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＳＮ００４と記す。
（２−３） ｐＳＮ００５の構築
以下の塩基配列にて示される、互いに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド２１、及び、２２を合成した。
(a)オリゴヌクレオチド２１：TATTCGAAACGCATATGTGACCGGCAGACTAGTGG（配列番号２１）
(b)オリゴヌクレオチド２２：CCACTAGTCTGCCGGTCACATATGGGTTTCGAATA（配列番号２２）
前記オリゴヌクレオチド２１及び２２を下記組成に従って混ぜ合わせ、当該混合溶液を９８℃で５分間、５０℃にて５０分間、３７℃にて１時間保持した。
オリゴヌクレオチド２１（５０ｐｍｏｌ／μｌ） ５μｌ
オリゴヌクレオチド２２（５０ｐｍｏｌ／μｌ） ５μｌ
(a)Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１００ｍＭ） １０μｌ
(b)ＭｇＣｌ２ （１００ｍＭ） １０μｌ
(c)ジチオスレイトール（１０ｍＭ） １０μｌ
(d)滅菌蒸留水 ６０μｌ
前記オリゴヌクレオチド２１とオリゴヌクレオチド２２とがアニーリングした二本鎖ＤＮＡ断片を、制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ、及び、ＳｐｅＩにて切断した。その後、前記混合溶液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）にて抽出し、次いでエタノール沈殿を行うことによって、二本鎖ＤＮＡ断片（リンカー１）を精製した。
また、ｐＳＮ００４を制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ及びＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて約４３００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high DH5α）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＳＮ００５と記す。
（２−４） ｐＳＮ００６の構築
以下の塩基配列にて示される、互いに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド２３、及び、オリゴヌクレオチド２４を合成した。
(a)オリゴヌクレオチド２３：TATTCGAAACGCATATGGTACCGGCAGACTAGTGG（配列番号２３）
(b)オリゴヌクレオチド２４：CCACTAGTCGCCTAGGCGACATATGGTTTCGAATA（配列番号２４）
前記オリゴヌクレオチド２３及び２４を下記組成に従って混ぜ合わせ、当該混合溶液を９８℃で５分間、５０℃にて５０分間、３７℃にて１時間保持した。
(a)オリゴヌクレオチド２３（５０ｐｍｏｌ／μｌ） ５μｌ
(b)オリゴヌクレオチド２４（５０ｐｍｏｌ／μｌ） ５μｌ
(c)Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１００ｍＭ） １０μｌ
(d)ＭｇＣｌ２ （１００ｍＭ） １０μｌ
(e)ジチオスレイトール（１０ｍＭ） １０μｌ
(f)滅菌蒸留水 ６０μｌ
前記オリゴヌクレオチド２３とオリゴヌクレオチド２４とがアニーリングした二本鎖ＤＮＡ断片を、制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ、及び、ＳｐｅＩにて切断した。その後、前記混合溶液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）にて抽出し、次いでエタノール沈殿を行うことによって、二本鎖ＤＮＡ断片（リンカー２）を精製した。
また、ｐＳＮ００４を制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ及びＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて約４３００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high DH5α）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＳＮ００６と記す。
（２−５） ｐＳＮ００７の構築
以下の塩基配列にて示される、互いに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド２５、及び、２６を合成した。
(a)オリゴヌクレオチド２５：TATTCGAAACGACGCGTGTCAGCTAGCACTAGTGC（配列番号２５）
(b)オリゴヌクレオチド２６：GCACTAGTGCTAGCTGACACGCGTCGTTTCGAATA（配列番号２６）
前記オリゴヌクレオチド２５及び２６を下記組成に従って混ぜ合わせ、当該混合溶液を９８℃で５分間、５０℃にて５０分間、３７℃にて１時間保持した。
(a)オリゴヌクレオチド２５（５０ｐｍｏｌ／μｌ） ５μｌ
(b)オリゴヌクレオチド２６（５０ｐｍｏｌ／μｌ） ５μｌ
(c)Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１００ｍＭ） １０μｌ
(d)ＭｇＣｌ２ （１００ｍＭ） １０μｌ
(e)ジチオスレイトール（１０ｍＭ） １０μｌ
(f)滅菌蒸留水 ６０μｌ
前記オリゴヌクレオチド２５とオリゴヌクレオチド２６とがアニーリングした二本鎖ＤＮＡ断片を、制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ、及び、ＳｐｅＩにて切断した。その後、前記混合溶液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）にて抽出し、次いでエタノール沈殿を行うことによって、二本鎖ＤＮＡ断片（リンカー３）を精製した。
また、ｐＳＮ００４を制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ及びＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて約４３００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high DH5α）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＳＮ００７と記す。
（２−６） プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子、及び、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子の導入プラスミド（ｐＥＸＰ−Ａ−Ｐ４ＨＢｓｉｇ（−）Ａ１ｒｅｖ）の構築
（２−６−１） プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現コンストラクトを含むプラスミド（ｐＳＮ０１７）の構築
ヒトプロリル−4−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子のｃＤＮＡクローン(Clone ID:4797051)をInvitrogen社より購入した。オリゴヌクレオチド２７及び２８を合成した。当該オリゴヌクレオチド２７、及び、２８はプロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニットの塩基配列と制限酵素サイトの塩基配列とからなるオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド27、及び、28をプライマーとし、ｃＤＮＡクローンを鋳型として用いたＰＣＲにより、二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド２７：TATTCGAAACGATGATCTGGTATATATTAATTATA（配列番号２７）
(b)オリゴヌクレオチド２８：TTGCTAGCTCATTCCAATTCTGACAACGTACAAGG（配列番号２８）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては東洋紡社製のKOD-Plus-を用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus- ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・３３μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて２分間の伸長反応からなるサイクルを１０回、９４℃にて１５秒間の変性反応、及び、６８℃にて２分間のアニーリング、及び、伸長反応からなるサイクルを１５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた二本鎖ＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ、及び、ＮｈｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、目的のＤＮＡ断片を分離・精製した。
前記ｐＳＮ００７を制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ及びＮｈｅＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動にて、約４２００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high DH5α）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーの中から１０個のコロニーを無作為に選抜し、各コロニーを形成する大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＳＮ０１７と記す。
（２−６−２） ＡＲＧ４を含むプラスミド（ｐＳＮ０２３）の構築
制限酵素サイトを連結したＡＲＧ４をプラスミドにクローニングした。オリゴヌクレオチド２９及び３０を合成した。当該オリゴヌクレオチド２９、及び、３０はＡＲＧ４の塩基配列と制限酵素サイトの塩基配列とからなるオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド29、及び、30をプライマーとし、ｐＡＲＧ４−ＴＯＰＯを鋳型として用いたＰＣＲにより、二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド２９：AACTCGAGACGAAAATATGGTACCTGCCCT（配列番号２９）
(b)オリゴヌクレオチド３０：CCATCGATACAGAGGTATCATCCAATGATTCC（配列番号３０）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のKOD-Plus-を用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus- ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・３３μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて２分間の伸長反応からなるサイクルを１０回、９４℃にて１５秒間の変性反応、及び、６８℃にて２分間のアニーリング、及び、伸長反応からなるサイクルを１５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた二本鎖ＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩ、及び、ＣｌａＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、ＡＲＧ４を含む約２２００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
Stratagene社より購入したpBluescriptII SK（＋）を制限酵素ＸｈｏＩ、及び、ＣｌａＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動にて約３０００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌大腸菌（東洋紡社製のCompetent high DH5α）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＳＮ０２３と記す。
（２−６−３） ｐＳＮ０１５の構築
オリゴヌクレオチド３１及び３２を合成した。当該オリゴヌクレオチド３１、及び、３２はαファクターの塩基配列と制限酵素サイトの塩基配列とからなるオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド31、及び、32をプライマーとし、ｐαｆａｃｔｏｒ−ＴＯＰＯを鋳型として用いたＰＣＲにより、二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド３１：GGTTCGAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACT（配列番号３１）
(b)オリゴヌクレオチド３２：TCGACTAGTAGCTTCAGCCTCTCTTTTATCC（配列番号３２）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のKOD-Plus-を用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus- ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・３３μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１分間の伸長反応からなるサイクルを１０回、９４℃にて１５秒間の変性反応、及び、６８℃にて１分間のアニーリング、及び、伸長反応からなるサイクルを１５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた二本鎖ＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ、及び、ＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、目的とするＤＮＡ断片を分離・精製した。
前記ｐＳＮ００５を制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ、及び、ＳｐｅＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動にて約４２００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high DH5α）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＳＮ０１５と記す。
（２−６−４） αファクターシグナルを有するプロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット発現コンストラクトを含むプラスミド（ｐＳＮ０２０）の構築
ヒトプロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子のｃＤＮＡクローン(Clone ID:3848651)をInvitrogen社より購入した。また、オリゴヌクレオチド３３及び３４を合成した。当該オリゴヌクレオチド３３、及び、３４はプロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子の塩基配列と制限酵素サイトの塩基配列とからなるオリゴヌクレオチドである。
前記オリゴヌクレオチド３３及び３４をプライマーとし、ｃＤＮＡクローンを鋳型として用いたＰＣＲにより、二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド３３：TTACTAGTGACGCCCCCGAGGAGGA（配列番号３３）
(b)オリゴヌクレオチド３４：TTACTAGTTTACAGTTCATCTTTCACAGCTTTCTG（配列番号３４）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のKOD-Plus-を用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus- ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・３３μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて２分間の伸長反応からなるサイクルを１０回、９４℃にて１５秒間の変性反応、及び、６８℃にて２分間のアニーリング、及び、伸長反応からなるサイクルを１５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた二本鎖ＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、目的とするＤＮＡ断片を分離・精製した。
前記ｐＳＮ０１５を制限酵素ＳｐｅＩにて切断しアルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high JM109）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＳＮ０２０と記す。
（２−６−５） プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子導入プラスミド（ｐＥＸＰ−Ａ−Ｐ４ＨＢｓｉｇ（−）ｒｅｖ）の構築
オリゴヌクレオチド３５及び３６を合成した。当該オリゴヌクレオチド３５はＡＯＸ１プロモーターと制限酵素サイトの塩基配列、当該オリゴヌクレオチド３６はＡＯＸ１ターミネーターと制限酵素サイトの塩基配列とからなるオリゴヌクレオチドである。
前記オリゴヌクレオチド３５、及び、３６をプライマーとし、ｐＳＮ０２０を鋳型として用いたＰＣＲにより、二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド３５：AACCGCGGTCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAA（配列番号３５）
(b)オリゴヌクレオチド３６：AACCCGGGGCACAAACGAACGTCTCACTTAATCTT（配列番号３６）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のKOD-Plus-を用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus- ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・３３μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて３．５分間の伸長反応からなるサイクルを１０回、９４℃にて１５秒間の変性反応、及び、６８℃にて３．５分間のアニーリング、及び、伸長反応からなるサイクルを１５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた二本鎖ＤＮＡ断片を、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミドの「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high JM109）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Invitrogen社製のZERO-BluntII TOPO PCR cloning キットを用いた。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＰ４ＨＢｓｉｇ（−）ｒｅｖ−ＴＯＰＯと記す。
前記プラスミドを制限酵素ＳａｃＩＩ及びＣｆｒ９Ｉにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット発現コンストラクトのＤＮＡ断片を分離・精製した。
また、前記ｐＳＮ０２３を制限酵素ＳａｃＩＩ、及び、Ｃｆｒ９Ｉにて切断した後、アガロースゲル電気泳動にて約５２００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high JM109）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＥＸＰ−Ａ−Ｐ４ＨＢｓｉｇ（−）ｒｅｖと記す。
（２−６−６） プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現コンストラクトのｐＥＸＰ−Ａ−Ｐ４ＨＢｓｉｇ（−）ｒｅｖへの導入
オリゴヌクレオチド３７及び３６を合成した。当該オリゴヌクレオチド３７はＡＯＸ１プロモーターと制限酵素サイトの塩基配列、当該オリゴヌクレオチド３６はＡＯＸ１ターミネーターと制限酵素サイトの塩基配列とからなるオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド37、及び、36をプライマーとしｐＳＮ０１７を鋳型として用いたＰＣＲにより、二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド３７：AACCCGGGTCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAA（配列番号３７）
(b)オリゴヌクレオチド３６：AACCCGGGGCACAAACGAACGTCTCACTTAATCTT（配列番号３６）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のKOD-Plus-を用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus- ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・３３μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて３．５分間の伸長反応からなるサイクルを１０回、９４℃にて１５秒間の変性反応、及び、６８℃にて３．５分間のアニーリング、及び、伸長反応からなるサイクルを１５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた二本鎖ＤＮＡ断片を、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミドの「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high DH5α）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Invitrogen社製のZERO-BluntII TOPO PCR cloning キットを用いた。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＰ４ＨＡ１−ＳｍａＩ−ＴＯＰＯと記す。
前記プラスミドを制限酵素Ｃｆｒ９Ｉにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット発現コンストラクトのＤＮＡ断片を分離・精製した。
また、前記ｐＥＸＰ−Ａ−Ｐ４ＨＢｓｉｇ（−）ｒｅｖを制限酵素Ｃｆｒ９Ｉにて切断しアルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high JM109）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＥＸＰ−Ａ−Ｐ４ＨＢｓｉｇ（−）Ａ１ｒｅｖと記す。
（２−７） プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子、及び、リジルヒドロキシラーゼ１遺伝子導入プラスミド（ｐＥＸＰ−ＬＨ１（＋）−Ｐ４ＨＡＢ）の構築
プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子、及び、リジルヒドロキシラーゼ１遺伝子（ＰＬＯＤ１）が挿入されたｐＥＸＰ−ＬＨ１（＋）−Ｐ４ＨＡＢの作製方法を以下に示す。
（２−７−１） リジルヒドロキシラーゼ１発現コンストラクトを含むプラスミド（ｐＳＮ００６−ＰＬＯＤ１）の構築
リジルヒドロキシラーゼ１の後半部分をコードするＤＮＡ断片をｐＳＮ００６へ導入した。オリゴヌクレオチド３８及び３９を合成した。当該オリゴヌクレオチド３８、及び、３９はリジルヒドロキシラーゼ１の塩基配列と制限酵素サイトの塩基配列とからなるオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド３８及び３９をプライマーとし、ｐＰＬＯＤ１−ＴＯＰＯを鋳型として用いたＰＣＲにより、二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド３８：GACCTTCGAAACAGGCTGCACCGT（配列番号３８）
(b)オリゴヌクレオチド３９：CGACTAGTTTAGGGATCGACGAA（配列番号３９）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のKOD-Plus-を用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus- ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・３３μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１．５分間の伸長反応からなるサイクルを３５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた二本鎖ＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ、及び、ＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、目的とするＤＮＡ断片を分離・精製した。
プラスミドｐＳＮ００６を制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ、及び、ＳｐｅＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動にて、約４２００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high JM109）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＳＮ００６−ＰＬＯＤ１−ｂと記す。
次いで、リジルヒドロキシラーゼ１の前半部分をコードするＤＮＡ断片をｐＳＮ００６−ＰＬＯＤ１−ｂへ導入した。オリゴヌクレオチド４０及び４１を合成した。当該オリゴヌクレオチド４０、及び、４１はリジルヒドロキシラーゼ１の塩基配列と制限酵素サイトの塩基配列とからなるオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド４０及び４１をプライマーとし、ｐＰＬＯＤ１−ＴＯＰＯを鋳型として用いたＰＣＲにより、二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド４０：TATTCGAAACGATGCGGCCCCTGCTGCTAC（配列番号４０）
(b)オリゴヌクレオチド４１：CAGCCTGTTTCGAAGGTCCAGAAGCGCG（配列番号４１）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のKOD-Plus-を用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus- ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・３３μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１分間の伸長反応からなるサイクルを３５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた二本鎖ＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約８００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
ｐＳＮ００６−ＰＬＯＤ１−ｂを制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉにて切断した後、当該プラスミドをアルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high JM109）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＳＮ００６−ＰＬＯＤ１と記す。
（２−７−２） ｐＥＸＰ−ＬＨ１（＋）−Ｐ４ＨＡＢの構築
オリゴヌクレオチド４２及び４３を合成した。当該オリゴヌクレオチド４２はＡＯＸ１プロモーターと制限酵素サイトの塩基配列、当該オリゴヌクレオチド４３はＡＯＸ１ターミネーターと制限酵素サイトの塩基配列とからなるオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド４２、及び、オリゴヌクレオチド４３をプライマーとし、ｐＳＮ００６−ＰＬＯＤ１を鋳型として用いたＰＣＲにより、目的とする二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド４２：AAGGTACCTCTAACATCCAAAGACGAAAGGT（配列番号４２）
(b)オリゴヌクレオチド４３：AAGGTACCGCACAAACGAACGTCTCACTTA（配列番号４３）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のKOD-Plus-を用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus- ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・３３μｌ
ＰＣＲ反応は、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて３．５分間の伸長反応からなるサイクルを３５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた二本鎖ＤＮＡ断片を、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミドの「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high JM105）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Invitrogen社製のZero Blunt TOPO PCR Cloning キットを用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＰＬＯＤ１−ＴＯＰＯと記す。
前記プラスミドを制限酵素ＫｐｎＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、リジルヒドロキシラーゼ１発現コンストラクトのＤＮＡ断片を分離・精製した。
また、前記ｐＥＸＰ−Ａ−Ｐ４ＨＢｓｉｇ（−）Ａ１ｒｅｖを制限酵素ＫｐｎＩにて切断し、アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high DH5α）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。
精製したプラスミドを制限酵素ＢｌｎＩで切断し、アガロース電気泳動方によって、目的の断片が挿入されていることを確認した。リジルヒドロキシラーゼ１発現コンストラクトが選択マーカーＡＲＧ４遺伝子と同じ向きのプラスミドをｐＥＸＰ−ＬＨ１（＋）−Ｐ４ＨＡＢと記す。
（２−８） プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子、及び、リジルヒドロキシラーゼ２遺伝子発現プラスミド（ｐＥＸＰ−ＬＨ２（＋）−Ｐ４ＨＡＢ）の構築
プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子、及び、リジルヒドロキシラーゼ２遺伝子（ＰＬＯＤ２）、が挿入されたｐＥＸＰ−ＬＨ２（＋）−Ｐ４ＨＡＢの作製方法を以下に示す。
（２−８−１） リジルヒドロキシラーゼ２発現コンストラクトを含むプラスミド（ｐＳＮ００６−ＰＬＯＤ２）の構築
リジルヒドロキシラーゼ２をコードするＤＮＡ断片をｐＳＮ００６へ導入した。オリゴヌクレオチド４４及びオリゴヌクレオチド４５を合成した。当該オリゴヌクレオチド４４及び４５はリジルヒドロキシラーゼ２の塩基配列と制限酵素サイトの塩基配列とからなるオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド４４及びオリゴヌクレオチド４５をプライマーとし、ｐＰＬＯＤ２−ＴＯＰＯを鋳型として用いたＰＣＲにより、二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド４４：TATTCGAAACGATGGGGGGATGCACGGTG（配列番号４４）
(b)オリゴヌクレオチド４５：CGACTAGTTTAGGGATCTATAAATGACACTG（配列番号４５）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のKOD-Plus-を用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus- ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・３３μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて２．５分間の伸長反応からなるサイクルを３５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた二本鎖ＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ、及び、ＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約２３００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
プラスミドｐＳＮ００６を制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ、及び、ＳｐｅＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動にて、約４２００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high JM109）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＳＮ００６−ＰＬＯＤ２と記す。
（２−８−２） ｐＥＸＰ−ＬＨ２（＋）−Ｐ４ＨＡＢの構築
オリゴヌクレオチド４２及びオリゴヌクレオチド４３を合成した。当該オリゴヌクレオチド４２はＡＯＸ１プロモーターと制限酵素サイトの塩基配列、当該オリゴヌクレオチド４３はＡＯＸ１ターミネーターと制限酵素サイトの塩基配列とからなるオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド４２、及び、４３をプライマーとし、ｐＳＮ００６−ＰＬＯＤ２を鋳型として用いたＰＣＲにより、目的とする二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド４２：AAGGTACCTCTAACATCCAAAGACGAAAGGT（配列番号４２）
(b)オリゴヌクレオチド４３：AAGGTACCGCACAAACGAACGTCTCACTTA（配列番号４３）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のKOD-Plus-を用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus- ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・３３μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて３．５分間の伸長反応からなるサイクルを１０回、９４℃にて１５秒間の変性反応、及び、６８℃にて３．５分間のアニーリング、及び、伸長反応からなるサイクルを１５回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた二本鎖ＤＮＡ断片を、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミドの「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high DH5α）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Invitrogen社製のZero Blunt TOPO PCR Cloning キットを用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＰＬＯＤ２‐ＴＯＰＯと記す。
前記プラスミドを制限酵素ＫｐｎＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、リジルヒドロキシラーゼ２発現コンストラクトのＤＮＡ断片を分離・精製した。
また、前記ｐＥＸＰ−Ａ−Ｐ４ＨＢｓｉｇ（−）Ａ１ｒｅｖを制限酵素ＫｐｎＩにて切断し、アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high DH5α）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。
精製したプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＶで切断し、アガロース電気泳動方によって、目的の断片が挿入されていることを確認した。リジルヒドロキシラーゼ２発現コンストラクトが選択マーカーＡＲＧ４遺伝子と同じ向きのプラスミドをｐＥＸＰ−ＬＨ２（＋）−Ｐ４ＨＡＢと記す。
（２−９） ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩ遺伝子導入プラスミドの構築
（２−９−１） ｐＳＮ００１の構築
制限酵素サイトを連結したＨＩＳ４をプラスミドにクローニングした。オリゴヌクレオチド４６及び４７を合成した。当該オリゴヌクレオチド４６、及び、４７はＨＩＳ４の塩基配列と制限酵素サイトの塩基配列とからなるオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド４６、及び、４７を用いるとともに、鋳型としてｐＨＩＳ４−ＴＯＰＯを用いたＰＣＲにより、目的とする二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド４６：GGAAGCTTGATCTCCTGATGACTGACTCACTG（配列番号４６）
(b)オリゴヌクレオチド４７：CCCTGCAGTAATTAAATAAGTCCCAGTTTCTCCA（配列番号４７）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のKOD-Plus-を用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus- ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・３３μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて３分間の伸長反応からなるサイクルを５回、９４℃にて１５秒間の変性反応、及び、６８℃にて３分間のアニーリング、及び、伸長反応からなるサイクルを２０回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた二本鎖ＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、及び、ＰｓｔＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約２６００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
Stratagene社より購入したプラスミドpBluescriptII SK（＋）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動にて、約３０００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high DH5α）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＳＮ００１と記す。
前記プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を公知の方法にしたがって解析し、データベース上のＨＩＳ４の塩基配列と一致していることを確認した。
（２−９−２） ｐＳＮ００２の構築
オリゴヌクレオチド４８、及び、オリゴヌクレオチド４９を合成した。当該オリゴヌクレオチド４８及び４９はＡＯＸ１の３’下流のノンコーディング領域の塩基配列と制限酵素サイトの塩基配列とからなるオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド４８、及び、４９をプライマーとし、ｐＡＯＸ１−３’−ＴＯＰＯを鋳型として用いたＰＣＲにより、二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド４８：GCATCGATTCGAGTATCTATGATTGGAAGTATGG（配列番号４８）
(b)オリゴヌクレオチド４９：AAGGGCCCGATCTTGAGATAAATTTCACGTTTAAA（配列番号４９）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のKOD-Plus-を用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus- ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・３３μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１分間の伸長反応からなるサイクルを５回、９４℃にて１５秒間の変性反応、及び、６８℃にて１分間のアニーリング、及び、伸長反応からなるサイクルを２０回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた二本鎖ＤＮＡ断片を制限酵素ＡｐａＩ、及び、ＣｌａＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約７００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
プラスミドｐＳＮ００１を制限酵素ＡｐａＩ、及び、ＣｌａＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動にて、約５６００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high DH5α）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＳＮ００２と記す。
（２−９−３） ｐＥＸＨ００２の構築
ｐＳＮ００６を制限酵素ＰｓｔＩ、及び、Ｅｃｏ５２Ｉにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、ＡＯＸ１プロモーター・ターミネータ発現ユニットをコードする約１３００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
ｐＳＮ００２を制限酵素ＰｓｔＩ、及び、Ｅｃｏ５２Ｉにて切断した後、アガロースゲル電気泳動にて、約６３００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high DH5α）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＥＸＨ００２と記す。
（２−９−４） ｐＳＮ０２６の構築
オリゴヌクレオチド５０、及び、５１を合成した。尚、当該オリゴヌクレオチド５０、及び、５１はヒトコラーゲンＴｙｐｅIIIの塩基配列と制限酵素サイトの塩基配列とからなるオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド５０、及び、５１をプライマーとし、ｐＵＣ１９−ＣＯＬ３Ａ１を鋳型として用いたＰＣＲにより、二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド５０：TATTCGAAACGATGATGAGCTTTGTGCAAAAGGGG（配列番号５０）
(b)オリゴヌクレオチド５１：TTACTAGTTTATAAAAAGCAAACAGGGCCAACGT（配列番号５１）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のKOD-Plus-を用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus- ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・３３μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて５分間の伸長反応からなるサイクルを５回、９４℃にて１５秒間の変性反応、及び、６８℃にて５分間のアニーリング、及び、伸長反応からなるサイクルを２０回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた二本鎖ＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ、及び、ＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、ヒトＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンをコードする約４４００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
ｐＳＮ００６を制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ、及び、ＣｌａＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動にて、約４２００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high DH5α）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＳＮ０２６と記す。
（２−９−５） ｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ３Ａ１の構築
ｐＳＮ０２６を制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉ、及び、ＳｐｅＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により、約５３００ｂｐのヒトＴｙｐｅＩＩＩコラーゲンとＡＯＸ１プロモーターをコードするＤＮＡ断片を分離・精製した。
ｐＥＸＨ００２を制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉ、及び、ＳｐｅＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動にて、約６７００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high DH5α）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ３Ａ１と記す。
（２−１０） ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１遺伝子、及び、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２遺伝子導入プラスミド（ｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１）の作製
（２−１０−１） ｐＳＮ０２５の構築
オリゴヌクレオチド５６及び５７を合成した。当該オリゴヌクレオチド５６、及び、５７はヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１の塩基配列と制限酵素サイトの塩基配列とからなるオリゴヌクレオチドである。下記オリゴヌクレオチド５６、及び、５７をプライマーとし、ｐＢｌｕｅ−ＣＯＬ１Ａ１（実施例（１−１０）参照）を鋳型として用いたＰＣＲにより、二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド５６：TATTCGAAACGATGTTCAGCTTTGTGGACCTCCG（配列番号７６）
(b)オリゴヌクレオチド５７：TTACTAGTTTACAGGAAGCAGACAGGGCCAA（配列番号７７）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のKOD-Plus-を用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus- ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・３３μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９8℃にて２分間加熱した後、９８℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて５分間の伸長反応からなるサイクルを５回、９８℃にて１５秒間の変性反応、及び、６８℃にて５分間のアニーリング、及び、伸長反応からなるサイクルを２３回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた二本鎖ＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ、及び、ＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、ヒトＴｙｐｅＩα１をコードする約４４００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
ｐＳＮ００６（実施例（２−４）参照）を制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ、及び、ＳｐｅＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動にて、約４２００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high DH5α）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＳＮ０２5と記す。
（２−１０−２） ｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ１Ａ１の構築
ｐＳＮ０２５（実施例（２−１０−１）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ、ＳｓｐＩ及びＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約４．５ｋｂのＡＯＸ１プロモーター、及び、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１をコードするＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＥＸＨ００２（実施例（２−９−3）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ及びＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約７．５kbのＤＮＡを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
前記約４．５ｋｂのＤＮＡ及び前記約７．５ｋｂのＤＮＡをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からＡＯＸ１プロモーター、及び、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１をコードするＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下、ｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ１Ａ１と記すこともある。）を精製することにより、ｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ１Ａ１を得た。
（２−１０−３） ｐＳＮ０２９の構築
オリゴヌクレオチド５８及び５９を合成した。当該オリゴヌクレオチド５８、及び、５９はヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２の塩基配列と制限酵素サイトの塩基配列とからなるオリゴヌクレオチドである。下記オリゴヌクレオチド５８、及び、５９をプライマーとし、ｐＵＣ１８−ＣＯＬ１Ａ２（実施例（１−１１）参照）を鋳型として用いたＰＣＲにより、二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド５８：TATTCGAAACGATGCTCAGCTTTGTGGATACGCG（配列番号７８）
(b)オリゴヌクレオチド５９：TTACTAGTTTATTTGAAACAGACTGGGCCAATGTC（配列番号７９）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のKOD-Plus-を用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus- ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・３３μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９8℃にて２分間加熱した後、９８℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて５分間の伸長反応からなるサイクルを５回、９８℃にて１５秒間の変性反応、及び、６８℃にて５分間のアニーリング、及び、伸長反応からなるサイクルを２３回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた二本鎖ＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ、及び、ＳｐｅＩにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、ヒトＴｙｐｅＩα１をコードする約４１００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
ｐＳＮ００６（実施例（２−４）参照）を制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ、及び、ＳｐｅＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動にて、約４２００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記プラスミドとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high DH5α）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＳＮ０２９と記す。
（２−１０−４） ｐＨｓＣＯＬ１Ａ２ Ｅｘｐ ｕｎｉｔ−Ｅｃｏ５２Ｉの構築
下記オリゴヌクレオチド６０及び６１を合成した。下記オリゴヌクレオチド６０及び６１をプライマーとし、ｐＳＮ０２９（実施例（２−１０−３）参照）と命名されたプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド６０：AACGGCCGTCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAA（配列番号８０）
(b)オリゴヌクレオチド６１：AACGGCCGGCACAAACGAACGTCTCACTTAATCTT（配列番号８１）
反応溶液の組成を以下に示す。
(a)プラスミド溶液（１０ｎｇ／μｌ） ・・・１μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)ＭｇＳＯ４（２５ｍＭ） ・・・２μｌ
(d)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１．５μｌ
(e)10×PCR buffer for KOD-plus-（東洋紡） ・・・５μｌ
(f)KOD-plus- DNA polymerase（１Ｕ／μｌ、東洋紡） ・・・１μｌ
(g)滅菌蒸留水 ・・・３３μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は反応溶液を９４℃にて３分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて６分間の伸長反応からなるサイクルを５回、９４℃にて１５秒間の変性反応、並びに、６８℃にて６分間のアニーリング及び伸長反応からなるサイクルを１８回、その後、更に反応溶液を６８℃にて５分間保持する条件で行った。
前記ＰＣＲの結果得られた約５．４ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。前記約５．４ｋｂのDNAを、ｐＣＲ‐ＢｌｕｎｔＩＩ‐ＴＯＰＯプラスミド（Invitrogen）の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡製）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはZero-Blunt TOPO PCR cloning キット（Invitrogen）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐＨｓＣＯＬ１Ａ２ Ｅｘｐ ｕｎｉｔ−Ｅｃｏ５２Ｉと記すこともある。）を精製することにより、ｐＨｓＣＯＬ１Ａ２ Ｅｘｐ ｕｎｉｔ−Ｅｃｏ５２Ｉを得た。
（２−１０−５） ｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１の構築
ｐＨｓＣＯＬ１Ａ２ Ｅｘｐ ｕｎｉｔ−Ｅｃｏ５２Ｉ（実施例（２−１０−４）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉにて切断し、アガロースゲル電気泳動にて、約５．４ｋｂのヒトコラーゲンTyｐｅIα２発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAを分離し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてゲルから抽出・精製した。
ｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ１Ａ１（実施例（２−１０−２）参照）と命名されたプラスミドを制限酵素Ｅｃｏ５２Ｉにて切断し、アルカリフォスファターゼを用いて脱リン酸化した後、MinElute Reaction Cleanup Kit（QIAGEN）を用いて精製した。
前記約５．４ｋｂのＤＮＡ及び前記プラスミドをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（Competent high DH5α、東洋紡）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応にはLigation Kit ver2.1（タカラバイオ）を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、培養菌体からヒトコラーゲンTyｐｅIα２発現カセットの両端に制限酵素認識配列が付加されたDNAが挿入されたプラスミド（以下、ｐＥＸＰ-ＨＡ-ＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１と記すこともある。）を精製することにより、ｐＥＸＰ-ＨＡ-ＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１を得た。
実施例３ （抗リジルヒドロキシラーゼ１抗体の作製）
組換え大腸菌を用いてリジルヒドロキシラーゼ１を調製し、当該リジルヒドロキシラーゼ１を抗原として用いて抗リジルヒドロキシラーゼ１抗体を作製した。以下に、作製方法の詳細について説明する。
（３−１） 大腸菌用発現プラスミドの構築
ｐＰＬＯＤ１−ＴＯＰＯを制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動により、約２２００ｂｐのリジルヒドロキシラーゼ１をコードする二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
ｐＥＴ−１６ｂ（Novagen社製）を制限酵素ＮｄｅＩ、及び、ＸｈｏＩにて切断した後、アガロースゲル電気泳動にて、約５７００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片を分離・精製した。
前記二本鎖ＤＮＡ断片と前記ベクターとをライゲーションし、得られたライゲーション液を用いて大腸菌（東洋紡社製のCompetent high JM109）を形質転換した。尚、前記ライゲーション反応には、Takara Ligation Kit ver2.1を用いた。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上に、前記形質転換した大腸菌を接種して培養した。寒天培地上に形成されたコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、１７時間）。その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen社製）を用いて、培養菌体から目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを精製した。以下、当該プラスミドをｐＥＴ１６ｂ−ＰＬＯＤ１と記す。
次いで、前記ｐＥＴ１６ｂ−ＰＬＯＤ１を用いて大腸菌（タカラバイオ社製のBL21(DE3)Competent cells）を形質転換し、得られた形質転換体を抗原作製用大腸菌として用いた。
（３−２） リジルヒドロキシラーゼ１の発現確認
前記ｐＥＴ１６ｂ−ＰＬＯＤ１にて形質転換された大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する５ｍｌのＬＢ液体培地に接種して３７℃にて１７時間培養した。また、形質転換を行っていない大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））を５ｍｌのＬＢ培地に接種して３７℃にて１７時間培養した。
形質転換体の培養液を菌濁度（ＯＤ６００）＝０．１となるように５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する５０ｍｌのＬＢ液体培地に接種して３７℃にて９時間培養した。接種後３時間目に１５０μｌの０．１Ｍイソプロピル‐β‐チオガラクトピラノシドを添加した。また、形質転換を行っていない大腸菌の培養液を菌濁度（ＯＤ６００）＝０．１となるように５０ｍｌのＬＢ液体培地に接種して３７℃にて９時間培養した。接種後３時間目に１５０μｌの０．１Ｍイソプロピル‐β‐チオガラクトピラノシドを添加した。
２０ｍｌの各々の培養液を３０００ｒｐｍ、４℃にて1０分間遠心分離した。上清を廃棄した後、５ｍｌの滅菌蒸留水に沈殿を懸濁した。懸濁液を３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を廃棄した後、０．７ｍｌの２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に沈殿を懸濁した。
マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて懸濁液を破砕した。破砕は大腸菌用の破砕条件（ガラスビーズ０．１ｍｍΦ、２５００ｒｐｍ、１０分）にて行った。得られた破砕液を１３０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離した後、上清を回収した。
上清をLaemmli, U. K., Nature, （1970） 227, 680に記載の方法に準じてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した。電気泳動後のゲルをページブルー８３（コスモ・バイオ社製）にて染色した。
電気泳動の結果、ゲル上の約８０ｋＤａの位置に明瞭なバンドが存在した。リジルヒドロキシラーゼ１の分子量は８１．６ｋＤａであり、観察されたバンドの分子量はリジルヒドロキシラーゼ１に相当する大きさであった。また、形質転換の宿主に用いた大腸菌では約８０ｋＤａの位置にはバンドは存在しなかった。これらの結果から形質転換体でリジルヒドロキシラーゼ１が発現していることが確認された。
（３−３） ＰＬＯＤ１の精製
前記ｐＥＴ１６ｂ−ＰＬＯＤ１にて形質転換された大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する５ｍｌのＬＢ液体培地に接種して３７℃にて１７時間培養した。
培養液を菌濁度（ＯＤ６００）＝０．１となるように５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１００ｍｌのＬＢ液体培地に接種して３７℃にて９時間培養した。接種後３時間目に１５０μｌの０．１Ｍイソプロピル‐β‐チオガラクトピラノシドを添加した。
培養液を５０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離し、菌体を回収した。回収した菌体を０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で再懸濁し、再び５０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離して菌体を回収した。
ｐＥＴ１６ｂ−ＰＬＯＤ１にはＮ末端側にヒスチジンの１０残基繰り返し配列がらなるタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）が組み込まれており、ＰＬＯＤ１はＮ末端側にＨｉｓ−ｔａｇが融合したタンパク質として発現する。ＰＬＯＤ１の精製は、Ｈｉｓ−ｔａｇに対するアフィニティーカラム（Quiagen社製のNi-NTA Fast Start kit）を用いた。尚、ＰＬＯＤ1の精製は、変性条件下で行った。
得られたタンパク質を、Laemmli, U. K., Nature, (1970) 227, 680に記載の方法に準じてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した。電気泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルーＧ２５０染色液（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で染色した。
電気泳動の結果、ゲル上の約８０ｋＤａの位置に明瞭なバンドが確認された。検出されたバンドは単一であり、また、分子量もリジルヒドロキシラーゼ１に相当する大きさであった。
（３−４） 抗リジルヒドロキシラーゼ１抗体の作製
精製したＰＬＯＤ１を、公知の方法に従って、アジュバンドとともにウサギの皮下に免疫した。免疫後のウサギの血液中の抗体価を確認してから全採血し、公知の方法に従ってＩｇＧの精製を行なった。以下、精製後の得られた抗リジルヒドロキシラーゼ１抗体（ポリクローナル抗体）をＴＡＬ０６１０２５と記す。
実施例４ （リジルヒドロキシラーゼ１、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット、及び、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブニット発現酵母の作製）
（４−１） リジルヒドロキシラーゼ１遺伝子、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子、及び、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブニット遺伝子の酵母への導入
遺伝子導入プラスミドであるｐＥＸＰ−ＬＨ１（＋）−Ｐ４ＨＡＢを、酵母コマガタエラ パストリスＰＰＹ１２株（ＡＴＣＣより購入、ＡＴＣＣ２０４１６３）に導入し、相同的組換えにより染色体に組み込んだ。当該遺伝子導入方法を以下に説明する。
１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（イーストエキストラクト１ｇ、及び、バクトペプトン２ｇをイオン交換水に溶解し、全量を９０ｍｌとした後オートクレーブで滅菌し、当該培地と別途濾過滅菌した２０％グルコース１０ｍｌとを混合して作製）に酵母コマガタエラ パストリスＰＰＹ１２株を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６００）＝約１０となるまで培養した。８０ｍｌの培養液を氷上にて冷却した後、３０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離し菌体を沈殿させた。上清を取り除き、等量、１／２量、１／４量の氷冷滅菌蒸留水で順次洗菌した。その後、１／４量の氷冷１Ｍソルビトールに菌体を懸濁し、３０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離を行い、菌体を回収した。得られた菌体を氷冷１Ｍソルビトールに懸濁し、ＯＤ６００＝約１５０に調整した。
１０μｇのｐＥＸＰ−ＬＨ１（＋）−Ｐ４ＨＡＢを制限酵素Ｂｓｐ１４０７Ｉで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
菌体懸濁液１００μｌを滅菌試験管にとり、５μｌのＤＮＡ溶液と混合した。遺伝子導入装置（ＢＴＸ社製のＥＣＭ６３０）を酵母用の条件（１５００Ｖ／２ｍｍ、２５μＦ、並列抵抗値２００Ω）に設定し、電極付キュベットに前記混合液を移した後、装置にセットしてパルスを加えた。その後、電圧を与えた後の混合液に１ｍｌの１Ｍソルビトールを混合した。当該混合液２００μｌをＭＤ寒天培地（終濃度１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０−５％ビオチン、２％グルコース、０．００５％ヒスチジン、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養した。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換酵母として単離した。
（４−２） リジルヒドロキシラーゼ１遺伝子導入の確認
形質転換酵母の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い染色体上にリジルヒドロキシラーゼ１遺伝子が組み込まれていることを確認した。
ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーから少量の菌体を採り１０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。懸濁液に５μｌの２０００ｕ／μｌLyticase（シグマ社から購入）を加え、３０℃で２０分間保温した。その後、−８０℃で１０分間、９８℃で５分間保温した後、１２０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離した。上清を回収し染色体ＤＮＡ抽出液として用いた。
オリゴヌクレオチド４０及びオリゴヌクレオチド３９を合成した。尚、当該オリゴヌクレオチド４０は、リジルヒドロキシラーゼ１の５’末端、当該オリゴヌクレオチド３９は３’末端に位置するオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド４０及び３９をプライマーとし、染色体ＤＮＡ抽出液を鋳型として用いたＰＣＲにより、リジルヒドロキシラーゼ１遺伝子の二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド４０：TATTCGAAACGATGCGGCCCCTGCTGCTAC（配列番号４０）
(b)オリゴヌクレオチド３９：CGACTAGTTTAGGGATCGACGAA（配列番号３９）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のBlendTaqを用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)染色体ＤＮＡ抽出液 ・・・５μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１μｌ
(d)10×PCR buffer for BlendTaq ・・・５μｌ
(e)BlendTaq DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・０．５μｌ
(f)滅菌蒸留水 ・・・３２．５μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて４分間の伸長反応からなるサイクルを４０回行った。
ＰＣＲした溶液をアガロースゲル電気泳動した結果、ゲル上で明瞭な約２２００ｂｐの単一バンドが観察された。これによって、染色体上にリジルヒドロキシラーゼ１遺伝子が導入されていることが明らかになった。
（４−３） プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子導入の確認
形質転換酵母の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い染色体上にプロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子が組み込まれていることを確認した。
ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーから少量の菌体を採り１０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。懸濁液に５μｌの２０００ｕ／μｌLyticase（シグマ社から購入）を加え、３０℃で２０分間保温した。その後、−８０℃で１０分間、９８℃で５分間保温した後、１２０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離した。上清を回収し染色体ＤＮＡ抽出液として用いた。
オリゴヌクレオチド２７及びオリゴヌクレオチド２８を合成した。尚、当該オリゴヌクレオチド２７は、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子の５’末端、当該オリゴヌクレオチド２８は３’末端に位置するオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド２７及び２８をプライマーとし、染色体ＤＮＡ抽出液を鋳型として用いたＰＣＲにより、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子の二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド２７： TATTCGAAACGATGATCTGGTATATATTAATTATA（配列番号２７）
(b)オリゴヌクレオチド２８： TTGCTAGCTCATTCCAATTCTGACAACGTACAAGG（配列番号２８）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のBlendTaqを用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)染色体ＤＮＡ抽出液 ・・・５μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１μｌ
(d)10×PCR buffer for BlendTaq ・・・５μｌ
(e)BlendTaq DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・０．５μｌ
(f)滅菌蒸留水 ・・・３２．５μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて４分間の伸長反応からなるサイクルを４０回行った。
ＰＣＲした溶液をアガロースゲル電気泳動した結果、ゲル上で明瞭な約１６００ｂｐの単一バンドが観察された。これによって、染色体上にプロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子が導入されていることが明らかになった。
（４−４） プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子導入の確認
形質転換酵母の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い染色体上にプロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子が組み込まれていることを確認した。
ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーから少量の菌体を採り１０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。懸濁液に５μｌの２０００ｕ／μｌLyticase（シグマ社から購入）を加え、３０℃で２０分間保温した。その後、−８０℃で１０分間、９８℃で５分間保温した後、１２０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離した。上清を回収し染色体ＤＮＡ抽出液として用いた。
オリゴヌクレオチド３３及びオリゴヌクレオチド３４を合成した。尚、当該オリゴヌクレオチド３３は、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子の５’末端、当該オリゴヌクレオチド３４は３’末端に位置するオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド３３及び３４をプライマーとし、染色体ＤＮＡ抽出液を鋳型として用いたＰＣＲにより、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子の二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド３３：TTACTAGTGACGCCCCCGAGGAGGA（配列番号３３）
(b)オリゴヌクレオチド３４：TTACTAGTTTACAGTTCATCTTTCACAGCTTTCT（配列番号３４）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のBlendTaqを用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)染色体ＤＮＡ抽出液 ・・・５μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１μｌ
(d)10×PCR buffer for BlendTaq ・・・５μｌ
(e)BlendTaq DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・０．５μｌ
(f)滅菌蒸留水 ・・・３２．５μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて４分間の伸長反応からなるサイクルを４０回行った。
ＰＣＲした溶液をアガロースゲル電気泳動した結果、ゲル上で明瞭な約１５００ｂｐの単一バンドが観察された。これによって、染色体上にプロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子が導入されていることが明らかになった。
以上、４−２、４−３、及び、４−４の遺伝子導入の確認を行った結果、すべての遺伝子が導入された組換え酵母としてＴＴ０６１０１８−１−１３株が得られた。
（４−５） リジルヒドロキシラーゼ１の発現の確認
ＴＴ０６１０１８−１−１３株を、１００ｍｌのＢＭＧＹ培地（１％イーストエキストラクト、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸緩衝液、１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール、０．００５％ヒスチジン）に接種して、３０℃にて２６時間培養した。その後、得られた培養液を５０００ｇ、室温で１０分間遠心分離して菌体を得た。
回収した菌体をＯＤ６００＝約１０になる様に５０ｍｌのＢＭＭ培地（１００ｍＭリン酸緩衝液、１．３４％ イーストナイトロジェンベース、４×１０−５%ビオチン、０．５％メタノール、０．００５％ヒスチジン）に植菌し、３０℃にて６０時間培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
４ｍｌの前記培養液を５０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離した後、菌体を回収し、２ｍｌの氷冷した蒸留水に懸濁した。前記懸濁液を５０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離し、得られた菌体を０．７ｍｌの１００ｍＭ、ｐＨ７．０のリン酸カリウム緩衝液に再懸濁した。
マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて懸濁液を破砕した。破砕は酵母用の破砕条件（ガラスビーズ０．５ｍｍΦ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて行った。得られた破砕液を１００００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離した後、上清を回収した。
上清をLaemmli, U. K., Nature, （1970） 227, 680に記載の方法に準じてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した。泳動終了後、アクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン−Ｐ、ミリポア社製）にブロットした。
得られたメンブレンを２５ｍｌのBlocking one（ナカライテスクより購入）中で１時間振とうし、その後、ＰＢＳ−Ｔ（０．５％のＴｗｅｅｎ‐２０を含むＰＢＳ溶液）にて２回洗浄した。
１０μｌの抗リジルヒドロキシラーゼ１抗体（ＴＡＬ１６００２５）を１０ｍｌのCan Get Signal solution1（東洋紡社製）で希釈して希釈液を調製し、前記メンブレンを希釈液に浸漬し１時間振とうした。振とう後、前記メンブレンを２５ｍｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。その後、１０μｌの２次抗体（坑ウサギ IgG-HRP Linked ロバ抗体 NA-934、GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を１０ｍｌのCan Get Signal solution2（東洋紡社製）で希釈して希釈液を調製し、前記メンブレンを希釈液に浸漬して１時間振とうした。振とう後、前記メンブレンを２５ｍｌのＰＢＳ−Ｔにて３回洗浄した。洗浄後のメンブレンを化学発光検出試薬（ECL plus Western Blotting Detection System、GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて発光させ、イメージアナライザー（LAS-3000UVmini 富士フィルム社製）で当該発光を検出した。その結果、ＴＴ０６１０１８−１−１３株ではＬＨ１に相当する分子量のバンドが検出されたことから、ＬＨ１を生産していることが示された。
（４−５） プロリルヒドロキシラーゼα１サブユニットの発現の確認
ＴＴ０６１０１８−１−１３株を、１００ｍｌのＢＭＧＹ培地（１％イーストエキストラクト、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸緩衝液、１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール、０．００５％ヒスチジン）に接種して、３０℃にて２６時間培養した。その後、得られた培養液を５０００ｇ、室温で１０分間遠心分離して菌体を得た。
回収した菌体をＯＤ６００＝約１０になる様に５０ｍｌのＢＭＭ培地（１００ｍＭリン酸緩衝液、１．３４％ イーストナイトロジェンベース、４×１０−５%ビオチン、０．５％メタノール、０．００５％ヒスチジン）に植菌し、３０℃にて６０時間培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
４ｍｌの前記培養液を５０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離した後、菌体を回収し、２ｍｌの氷冷した蒸留水に懸濁した。前記懸濁液を５０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離し、得られた菌体を０．７ｍｌの１００ｍＭ、ｐＨ７．０のリン酸カリウム緩衝液に再懸濁した。
マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて懸濁液を破砕した。破砕は酵母用の破砕条件（ガラスビーズ０．５ｍｍΦ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて行った。得られた破砕液を１００００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離した後、上清を回収した。
上清をLaemmli, U. K., Nature, （1970） 227, 680に記載の方法に準じてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した。泳動終了後、アクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン−Ｐ、ミリポア社製）にブロットした。
得られたメンブレンを２５ｍｌのBlocking one（ナカライテスクより購入）中で１時間振とうし、その後、ＰＢＳ−Ｔ（０．５％のＴｗｅｅｎ‐２０を含むＰＢＳ溶液）にて２回洗浄した。
５μｌの抗プロリルヒドロキシラーゼα１抗体（６３１６７、ＭＰＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳ社より購入）を１０ｍｌのCan Get Signal solution1（東洋紡社製）で希釈して希釈液を調製し、前記メンブレンを希釈液に浸漬し１時間振とうした。振とう後、前記メンブレンを２５ｍｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。その後、１０μｌの２次抗体（坑マウス IgG-HRP Linked ヒツジ抗体 NA-931、GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を１０ｍｌのCan Get Signal solution2（東洋紡社製）で希釈して希釈液を調製し、前記メンブレンを希釈液に浸漬して１時間振とうした。振とう後、前記メンブレンを２５ｍｌのＰＢＳ−Ｔにて３回洗浄した。洗浄後のメンブレンを化学発光検出試薬（ECL Western Blotting Detection System、GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて発光させ、イメージアナライザー（LAS-3000UVmini 富士フィルム社製）で当該発光を検出した。その結果、ＴＴ０６１０１８−１−１３株ではプロリルヒドロキシラーゼα１サブユニットに相当する分子量のバンドが検出されたことから、プロリルヒドロキシラーゼα１サブユニットを生産していることが示された。
（４−６） プロリルヒドロキシラーゼβサブユニットの発現の確認
ＴＴ０６１０１８−１−１３株を、１００ｍｌのＢＭＧＹ培地（１％イーストエキストラクト、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸緩衝液、１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール、０．００５％ヒスチジン）に接種して、３０℃にて２６時間培養した。その後、得られた培養液を５０００ｇ、室温で１０分間遠心分離して菌体を得た。
回収した菌体をＯＤ６００＝約１０になる様に５０ｍｌのＢＭＭ培地（１００ｍＭリン酸緩衝液、１．３４％ イーストナイトロジェンベース、４×１０−５%ビオチン、０．５％メタノール、０．００５％ヒスチジン）に植菌し、３０℃にて６０時間培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
４ｍｌの前記培養液を５０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離した後、菌体を回収し、２ｍｌの氷冷した蒸留水に懸濁した。前記懸濁液を５０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離し、得られた菌体を０．７ｍｌの１００ｍＭ、ｐＨ７．０のリン酸カリウム緩衝液に再懸濁した。
マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて懸濁液を破砕した。破砕は酵母用の破砕条件（ガラスビーズ０．５ｍｍΦ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて行った。得られた破砕液を１００００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離した後、上清を回収した。
上清をLaemmli, U. K., Nature, （1970） 227, 680に記載の方法に準じてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した。泳動終了後、アクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン−Ｐ、ミリポア社製）にブロットした。
得られたメンブレンを２５ｍｌのBlocking one（ナカライテスクより購入）中で１時間振とうし、その後、ＰＢＳ−Ｔ（０．５％のＴｗｅｅｎ‐２０を含むＰＢＳ溶液）にて２回洗浄した。
２μｌの抗プロリルヒドロキシラーゼβ抗体（ＳＰＡ−８９０、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ社より購入）を１０ｍｌのCan Get Signal solution1（東洋紡社製）で希釈して希釈液を調製し、前記メンブレンを希釈液に浸漬し１時間振とうした。振とう後、前記メンブレンを２５ｍｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。その後、１μｌの２次抗体（坑ウサギ IgG-HRP Linked ロバ抗体 NA-934、GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を１０ｍｌのCan Get Signal solution2（東洋紡社製）で希釈して希釈液を調製し、前記メンブレンを希釈液に浸漬して１時間振とうした。振とう後、前記メンブレンを２５ｍｌのＰＢＳ−Ｔにて３回洗浄した。洗浄後のメンブレンを化学発光検出試薬（ECL plus Western Blotting Detection System、GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて発光させ、イメージアナライザー（LAS-3000UVmini 富士フィルム社製）で当該発光を検出した。その結果、ＴＴ０６１０１８−１−１３株ではプロリルヒドロキシラーゼβサブユニットに相当する分子量のバンドが検出されたことから、プロリルヒドロキシラーゼβサブユニットを生産していることが示された。
実施例５ （ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩ発現酵母の作製）
（５−１） ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩ遺伝子の酵母への導入
遺伝子導入プラスミドであるｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ３Ａ１を前記リジルヒドロキシラーゼ１、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット、及び、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子導入酵母ＴＴ０６１０１８−１−１３株に導入し、相同的組換えにより染色体に組み込んだ。当該遺伝子導入方法について以下に説明する。
１００ｍｌのＹＰＤ液体培地に酵母ＴＴ０６１０１８−１−１３株を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６００）＝約１０となるまで培養した。８０ｍｌの培養液を氷上にて冷却した後、３０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離し菌体を沈殿させた。上清を取り除き、等量、１／２量、１／４量の氷冷滅菌蒸留水で順次洗菌した。その後、１／４量の氷冷１Ｍソルビトールに菌体を懸濁し、３０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離を行い、菌体を回収した。得られた菌体を氷冷１Ｍソルビトールに懸濁し、ＯＤ６００＝約１５０に調整した。
１０μｇのｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ３Ａ１を制限酵素ＸｂａＩで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
菌体懸濁液１００μｌを滅菌試験管にとり、５μｌのＤＮＡ溶液と混合した。遺伝子導入装置（ＢＴＸ社製のＥＣＭ６３０）を酵母用の条件（１５００Ｖ／２ｍｍ、２５μＦ、並列抵抗値２００Ω）に設定し、電極付キュベットに前記混合液を移した後、装置にセットしてパルスを加えた。その後、電圧を与えた後の混合液に１ｍｌの１Ｍソルビトールを混合した。当該混合液２００μｌをＭＤ寒天培地上に広げ、３０℃にて４８時間培養した。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換酵母として単離した。
（５−２） ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩ遺伝子導入の確認
形質転換酵母の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い染色体上にヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩ遺伝子が組み込まれていることを確認した。
ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーから少量の菌体を採り１０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。懸濁液に５μｌの２０００ｕ／μｌLyticase（シグマ社から購入）を加え、３０℃で２０分間保温した。その後、−８０℃で１０分間、９８℃で５分間保温した後、１２０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離した。上清を回収し染色体ＤＮＡ抽出液として用いた。
オリゴヌクレオチド５０及びオリゴヌクレオチド５１を合成した。尚、当該オリゴヌクレオチド５０は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩ遺伝子の５’末端、当該オリゴヌクレオチド５１は３’末端に位置するオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド５０及び５１をプライマーとし、染色体ＤＮＡ抽出液を鋳型として用いたＰＣＲにより、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩ遺伝子の二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド５０：TATTCGAAACGATGATGAGCTTTGTGCAAAAGGGG（配列番号５０）
(b)オリゴヌクレオチド５１：TTACTAGTTTATAAAAAGCAAACAGGGCCAACGT（配列番号５１）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のBlendTaqを用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)染色体ＤＮＡ抽出液 ・・・５μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１μｌ
(d)10×PCR buffer for BlendTaq ・・・５μｌ
(e)BlendTaq DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・０．５μｌ
(9)滅菌蒸留水 ・・・３２．５μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて５分間の伸長反応からなるサイクルを４０回行った。
ＰＣＲした溶液をアガロースゲル電気泳動した結果、ゲル上で明瞭な約４４００ｂｐの単一バンドが観察された。これによって、染色体上にプロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子が導入されていることが明らかになった。
尚、当該酵母について以後、ＴＴ０６１０１８−１−１３株にヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩ遺伝子を導入した株をＴＴ０６１２２６−１−３株と記す。
（５−３） ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩの発現の確認
ＴＴ０６１２２６−１−３株を１００mlのＢＭＧＹ培地に接種して、３０℃にて２６時間培養した。その後、得られた培養液を５０００ｇ、室温で１０分間遠心分離して菌体を得た。
回収した菌体をＯＤ６００＝約１０になる様に５０ｍｌのＢＭＭ培地に植菌し、３０℃にて６０時間培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
４ｍｌの前記培養液を５０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離した後、菌体を回収し、２ｍｌの氷冷した蒸留水に懸濁した。前記懸濁液を５０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離し、得られた菌体を０．７ｍｌの１００ｍＭ、ｐＨ７．０のリン酸カリウム緩衝液に再懸濁した。
マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて懸濁液を破砕した。破砕は酵母用の破砕条件（ガラスビーズ０．５ｍｍΦ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて行った。得られた破砕液を１００００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離した後、上清を回収した。
上清をLaemmli, U. K., Nature, （1970） 227, 680に記載の方法に準じてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した。電気泳動後のゲルをページブルー８３（コスモ・バイオ社製）にて染色した。
電気泳動の結果、ゲル上の１００ｋＤａ以上の位置に明瞭なバンドが存在した。ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩのプロコラーゲンの分子量は約１４０ｋＤａであり、観察されたバンドの分子量はヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩプロコラーゲンに相当する大きさであった。これらの結果からＴＴ０６１２２６−１−３株でヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩが発現していることが確認された。
実施例６ （コラーゲンの解析）
（６−１） 酵母の培養
ＴＴ０６１２２６−１−３株を１００ｍｌのＢＭＧＹ培地に植菌して、３０℃にて２０時間前培養を行った。
３Ｌの容量のファーメンター（マルビシバイオ）に仕込んだ１ＬのＢａｓａｌ ｓａｌｔ培地に、前培養液をＯＤ６６０＝約１．２５となる様に植菌し、通気攪拌して本培養を行った。
本培養は、３０℃にて開始し、最大通気量を１．０ｖｖｍ（１Ｌ）に設定した。培地中のグリセロールが消費され尽くした時点より、グリセロール流加培地（５０％グリセロール、１．２％ＰＭＴ１溶液）の添加を開始した。グリセロール流加培養は培養液のＯＤ６６０＝約１４０となった時点で停止した。その後、メタノール流加培地（９９．８％（Ｗ／Ｖ）メタノール、１．２％のＰＭＴ１）の添加を開始しメタノール流加培養を行った。メタノール流加培養では、培養温度を３２℃に変更し、溶存酸素量を約８ｐｐｍとなるよう制御した。また、培養期間を通じて培養液のｐＨは２８％アンモニア水、及び、４Ｍリン酸を用いて約５．０に定値制御した。約１４０時間の培養により約２Ｌの培養液が得られた。以下に用いた培地の組成を示す。
(a)（Ｂａｓａｌ ｓａｌｔ培地の組成）
(b)８５％Ｈ３ＰＯ４ ・・・２６．７ｍＬ／Ｌ
(c)ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ ・・・０．９３ｇ／Ｌ
(d)Ｋ２ＳＯ４ ・・・１８．２ｇ／Ｌ
(e)ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ・・・１４．９ｇ／Ｌ
(f)ＫＯＨ ・・・４．１３ｇ／Ｌ
(g)グリセロール ・・・４０ｇ／Ｌ
前記成分を混合後、オートクレーブ滅菌した。２８％アンモニア水でｐＨを５．０に調製した後、２ｍｌ／ＬのＰＭＴ１溶液を、及び、１ｍｌ／Ｌの消泡剤メタノール溶液（１２．５％アデカノールＬＧ２９５Ｓ）を添加した。
（ＰＭＴ１溶液の組成）
(a)ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ・・・６．０ｇ／Ｌ
(b)ＫＩ ・・・０．８ｇ／Ｌ
(c)ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ ・・・３．０ｇ／Ｌ
(d)Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ・・・０．２ｇ／Ｌ
(e)Ｈ３ＢＯ４ ・・・０．２ｇ
(f)ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ ・・・０．５ｇ／Ｌ
(g)ＺｎＣｌ２ ・・・２０ｇ／Ｌ
(h)ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ・・・６５ｇ／Ｌ
(i)ビオチン ・・・０．２ｇ／Ｌ
(j)濃硫酸 ・・・５ｍL／Ｌ
（６−２） コラーゲンの粗精製
前記培養にて得られた菌体を破砕し、得られた破砕液からコラーゲンを精製した。菌体の破砕はダイノミル（DYNO-MILL TypeKDL-A、WILLY A.BACHOFEN AG社製）を用いて行った。培養液を５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体はリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）に懸濁した後、懸濁液を遠心分離して菌体を回収した。この作業を再度繰り返して培地成分を取り除いた後、６００ｇの湿菌体をリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）１５００ｍｌに懸濁した。送液ポンプを用いて、酵母用の条件に設定したダイノミルに前記懸濁液を送り込んで懸濁液を破砕した。破砕完了の確認は顕微鏡で菌体の形状を観察して行った。
リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）を用いて菌体破砕液を２倍に希釈した。濃塩酸を用いてｐＨを約２．０に調整した。終濃度５ｍｇ／ｍｌとなるようペプシン（シグマより購入）を添加した。４℃にて９６時間保温した後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離を行って上清を回収した。得られた上清に１０ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを約１０に調整した。４℃にて攪拌しながら保温した。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離を行って上清を回収した。
得られた上清に終濃度が０．５Ｍとなるように酢酸を添加した。濃塩酸を用いてｐＨを３．０に調整した。９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離を行って上清を回収した。得られた上清に終濃度が１ＭになるようにＮａＣｌを添加して、４℃にて攪拌しながら保温した。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離を行って沈殿を回収した。得られた沈殿を０．１ＮのＨＣｌに溶解した。
溶解液に終濃度が０．０５Ｍとなるように１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を添加した後、１０ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを約７．４に調整した。ＮａＣｌを終濃度が２Ｍとなるように添加し、４℃にて攪拌しながら保温した。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離を行い、沈殿を回収した。得られた沈殿を０．１ＮのＨＣｌで溶解した後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して上清を回収した。
得られた上清に終濃度が０．５Ｍとなるように酢酸を添加した。濃塩酸を用いてｐＨを約３．０に調整した。終濃度が１ＭとなるようにＮａＣｌを添加し、４℃にて攪拌しながら保温した。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離行い、沈殿を回収した。得られた沈殿を０．１Ｎの ＨＣｌに溶解した。溶解液を４００００ｒｐｍ、４℃で６０分間超遠心分離して上清を回収した。
得られた上清を透析チューブ（Spectra/Por SPECTUM社製）に入れ、１０倍量の１ｍＭ ＨＣｌ溶液に対する透析を３回行なった後、０．２２μｍのフィルター（Millex GP MILLIPORE社製）を用いてろ過し、コラーゲンの粗精製品を得た。
（６−３） コラーゲンの精製
コラーゲン粗精製品に終濃度が０．０５Ｍとなるように１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を添加した後、１０ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを約７．４に調整した。ＮａＣｌを終濃度が２Ｍとなるように添加し、４℃にて攪拌しながら保温した。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離を行い、沈殿を回収した。得られた沈殿の重量の５倍重量の０．１ＮのＨＣｌを用いて溶解した後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して沈殿を回収した。
得られた沈殿に終濃度が０．５Ｍとなるように酢酸を添加した。濃塩酸を用いてｐＨを約３．０に調整した。終濃度が１ＭとなるようにＮａＣｌを添加し、４℃にて攪拌しながら保温した。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離行い、沈殿を回収した。得られた沈殿を０．１Ｎの ＨＣｌに溶解した。溶解液を４００００ｒｐｍ、４℃で６０分間超遠心分離して上清を回収した。
得られた上清を透析チューブ（Spectra/Por SPECTUM社製）に入れ、１０倍量の１ｍＭ ＨＣｌ溶液に対する透析を３回行なった後、０．２２μｍのフィルター（Millex GP MILLIPORE社製）を用いてろ過し、コラーゲンの精製品を得た。
（６−４） コラーゲンの電気泳動
前記精製品を、Laemmli, U. K., Nature, (1970) 227, 680に記載の方法に準じて、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した。電気泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルーＧ２５０染色液（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で染色した。電気泳動による結果から、ゲル上で明瞭なコラーゲンの単一バンドが確認された。また、当該バンドの分子量もコラーゲンに相当する大きさであった（図６参照）。図６のレーン１にＴＴ０６１２２６−１−３株におけるコラーゲン精製品の電気泳動パターンを示す。
（６−５） アミノ酸分析
精製された組換えヒトコラーゲン１ｍｇを含む０．１Ｍ 塩酸溶液を加水分解管に採取し、減圧乾固した後に、６Ｍ塩酸溶液５００μＬを加えた。加水分解管内の気体を窒素に置換後、減圧しながら封管した。
封管した加水分解管を１１０℃にて２４時間保持して、精製された組換えヒトコラーゲンの加水分解処理を行った。加水分解管を開管したのち、塩酸を減圧乾固した。
加水分解後のヒトコラーゲンを２ ｍＬの２０ｍＭのＨＣｌにて溶解し、加水分解物１０μｇをニンヒドリン発色法（（株）日立製作所 L-8800形高速アミノ酸分析計）にて分析した。
尚、カラムはイオン交換樹脂カラム（#2622）、溶離液は市販品L-8500 Buffer Solution PH-1（021-09111、和光純薬）、L-8500 Buffer Solution PH-2（028-09121、和光純薬）、L-8500 Buffer Solution PH-3（025-09131、和光純薬）、L-8500 Buffer Solution PH-4（022-09141、和光純薬）、及び、L-8500 Column Regenerating Solution PH（PH-RG）（036-12531、和光純薬）を使用した。ニンヒドリンによるアミノ酸の発色には、市販品であるNinhydrin Solution Set（201-06251、和光純薬）を使用した。アミノ酸混合標準液は、市販品であるAMINO ACID CALIBRATION MIXTURE（782-3140）、（株）日立ハイテクフィールディング）にtrans-4-Hydroxy-L-PROLINE（H-6002、Sigma）、及び、DL-plus allo-δ Hydroxylysine, HCl（3920、CALBIO. CHEM.）を添加し、各アミノ酸濃度が１００ｎｍｏｌ／ｍＬ（ただし、プロリン及びヒドロキシプロリンは２００ｎｍｏｌ／ｍＬ）になるように調製したものを用いた。
図７に示すように、本実施例では水酸化リジンの割合が、全リジン残基のうち３６．９％にまで上昇することが明らかになった。
（６−６） 線維形成能の測定
精製された組換えヒトコラーゲンを１ｍＭのＨＣｌに対して透析したのち、タンパク質濃度が０．０６％になるように透析時の外液で希釈した。続いて、６倍濃度のＤ−ＰＢＳ（−）（塩化ナトリウム８ｇ、リン酸一水素二ナトリウム１．１５ｇ、塩化カリウム０．２ｇ、リン酸水素カリウム０．２ｇを水に溶解し１０００ｍＬとしたもの）を加え、最終コラーゲン濃度が０．０５％、Ｄ−ＰＢＳ（−）の濃度が１倍になる様に調製した。尚、調製後のｐＨは、７．３〜７．４であった。前記精製された組換えヒトコラーゲンをジャケット付石英ガラスセルに入れ、油回転ポンプを用いて減圧脱気した後、分光光度計（U-2000、(株)日立製作所）のセル台にセットした。３７℃の循環水を流した状態にて、波長４００ｎｍの吸光度を経時的に測定した（サンプリングポイントは３０秒）。
図８に示すように、ＴＴ０６１２２６−１−３株から調製したコラーゲンでは、線維形成能が上昇していることが明らかになった。
尚本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
実施例７ （リジルヒドロキシラーゼ２、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット、及び、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブニット発現酵母の作製）
（７−１） リジルヒドロキシラーゼ２遺伝子、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子、及び、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブニット遺伝子の酵母への導入
遺伝子導入プラスミドであるｐＥＸＰ−ＬＨ２（＋）−Ｐ４ＨＡＢを、酵母コマガタエラ パストリスＰＰＹ１２株（ＡＴＣＣより購入、ＡＴＣＣ２０４１６３）に導入し、相同的組換えにより染色体に組み込んだ。当該遺伝子導入方法を以下に説明する。
１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（イーストエキストラクト１ｇ、及び、バクトペプトン２ｇをイオン交換水に溶解し、全量を９０ｍｌとした後オートクレーブで滅菌し、当該培地と別途濾過滅菌した２０％グルコース１０ｍｌとを混合して作製）に酵母コマガタエラ パストリスＰＰＹ１２株を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６００）＝約１０となるまで培養した。８０ｍｌの培養液を氷上にて冷却した後、３０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離し菌体を沈殿させた。上清を取り除き、等量、１／２量、１／４量の氷冷滅菌蒸留水で順次洗菌した。その後、１／４量の氷冷１Ｍソルビトールに菌体を懸濁し、３０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離を行い、菌体を回収した。得られた菌体を氷冷１Ｍソルビトールに懸濁し、ＯＤ６００＝約１５０に調整した。
１０μｇのｐＥＸＰ−ＬＨ２（＋）−Ｐ４ＨＡＢを制限酵素ＡａｔＩＩで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
菌体懸濁液１００μｌを滅菌試験管にとり、５μｌのＤＮＡ溶液と混合した。遺伝子導入装置（ＢＴＸ社製のＥＣＭ６３０）を酵母用の条件（１５００Ｖ／２ｍｍ、２５μＦ、並列抵抗値２００Ω）に設定し、電極付キュベットに前記混合液を移した後、装置にセットしてパルスを加えた。その後、電圧を与えた後の混合液に１ｍｌの１Ｍソルビトールを混合した。当該混合液２００μｌをＭＤ寒天培地（終濃度１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０−５％ビオチン、２％グルコース、０．００５％ヒスチジン、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養した。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換酵母として単離した。
（７−２） リジルヒドロキシラーゼ２遺伝子導入の確認
形質転換酵母の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い染色体上にリジルヒドロキシラーゼ２遺伝子が組み込まれていることを確認した。
ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーから少量の菌体を採り１０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。懸濁液に５μｌの２０００ｕ／μｌLyticase（シグマ社から購入）を加え、３０℃で２０分間保温した。その後、−８０℃で１０分間、９８℃で５分間保温した後、１２０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離した。上清を回収し染色体ＤＮＡ抽出液として用いた。
オリゴヌクレオチド４４及びオリゴヌクレオチド４５を合成した。尚、当該オリゴヌクレオチド４４は、リジルヒドロキシラーゼ２の５’末端、当該オリゴヌクレオチド４５は３’末端に位置するオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド４４及び４５をプライマーとし、染色体ＤＮＡ抽出液を鋳型として用いたＰＣＲにより、リジルヒドロキシラーゼ２遺伝子の二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド４４：TATTCGAAACGATGGGGGGATGCACGGTG（配列番号４４）
(b)オリゴヌクレオチド４５：CGACTAGTTTAGGGATCTATAAATGACACTG（配列番号４５）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のBlendTaqを用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)染色体ＤＮＡ抽出液 ・・・５μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１μｌ
(d)10×PCR buffer for BlendTaq ・・・５μｌ
(e)BlendTaq DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・０．５μｌ
(f)滅菌蒸留水 ・・・３２．５μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて４分間の伸長反応からなるサイクルを４０回行った。
ＰＣＲした溶液をアガロースゲル電気泳動した結果、ゲル上で明瞭な約２２００ｂｐの単一バンドが観察された。これによって、染色体上にリジルヒドロキシラーゼ２遺伝子が導入されていることが明らかになった。
（７−３） プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子導入の確認
形質転換酵母の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い染色体上にプロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子が組み込まれていることを確認した。
ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーから少量の菌体を採り１０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。懸濁液に５μｌの２０００ｕ／μｌLyticase（シグマ社から購入）を加え、３０℃で２０分間保温した。その後、−８０℃で１０分間、９８℃で５分間保温した後、１２０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離した。上清を回収し染色体ＤＮＡ抽出液として用いた。
オリゴヌクレオチド２７及びオリゴヌクレオチド２８を合成した。尚、当該オリゴヌクレオチド２７は、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子の５’末端、当該オリゴヌクレオチド２８は３’末端に位置するオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド２７及び２８をプライマーとし、染色体ＤＮＡ抽出液を鋳型として用いたＰＣＲにより、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子の二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド２７： TATTCGAAACGATGATCTGGTATATATTAATTATA（配列番号２７）
(b)オリゴヌクレオチド２８： TTGCTAGCTCATTCCAATTCTGACAACGTACAAGG（配列番号２８）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のBlendTaqを用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)染色体ＤＮＡ抽出液 ・・・５μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１μｌ
(d)10×PCR buffer for BlendTaq ・・・５μｌ
(e)BlendTaq DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・０．５μｌ
(f)滅菌蒸留水 ・・・３２．５μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて４分間の伸長反応からなるサイクルを４０回行った。
ＰＣＲした溶液をアガロースゲル電気泳動した結果、ゲル上で明瞭な約１６００ｂｐの単一バンドが観察された。これによって、染色体上にプロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子が導入されていることが明らかになった。
（７−４） プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子導入の確認
形質転換酵母の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い染色体上にプロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子が組み込まれていることを確認した。
ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーから少量の菌体を採り１０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。懸濁液に５μｌの２０００ｕ／μｌLyticase（シグマ社から購入）を加え、３０℃で２０分間保温した。その後、−８０℃で１０分間、９８℃で５分間保温した後、１２０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離した。上清を回収し染色体ＤＮＡ抽出液として用いた。
オリゴヌクレオチド３３及びオリゴヌクレオチド３４を合成した。尚、当該オリゴヌクレオチド３３は、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子の５’末端、当該オリゴヌクレオチド３４は３’末端に位置するオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド３３及び３４をプライマーとし、染色体ＤＮＡ抽出液を鋳型として用いたＰＣＲにより、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子の二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド３３：TTACTAGTGACGCCCCCGAGGAGGA（配列番号３３）
(b)オリゴヌクレオチド３４：TTACTAGTTTACAGTTCATCTTTCACAGCTTTCT（配列番号３４）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のBlendTaqを用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)染色体ＤＮＡ抽出液 ・・・５μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１μｌ
(d)10×PCR buffer for BlendTaq ・・・５μｌ
(e)BlendTaq DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・０．５μｌ
(f)滅菌蒸留水 ・・・３２．５μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて４分間の伸長反応からなるサイクルを４０回行った。
ＰＣＲした溶液をアガロースゲル電気泳動した結果、ゲル上で明瞭な約１５００ｂｐの単一バンドが観察された。これによって、染色体上にプロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子が導入されていることが明らかになった。
以上、７−２、７−３、及び、７−４の遺伝子導入の確認を行った結果、すべての遺伝子が導入された組換え酵母としてＴＴ０６１０１８−３−５株が得られた。
（７−５） リジルヒドロキシラーゼ２の発現の確認
ＴＴ０６１０１８−３−５株を、１００ｍｌのＢＭＧＹ培地（１％イーストエキストラクト、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸緩衝液、１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール、０．００５％ヒスチジン）に接種して、３０℃にて２６時間培養した。その後、得られた培養液を５０００ｇ、室温で１０分間遠心分離して菌体を得た。
回収した菌体をＯＤ６００＝約１０になる様に５０ｍｌのＢＭＭ培地（１００ｍＭリン酸緩衝液、１．３４％ イーストナイトロジェンベース、４×１０−５%ビオチン、０．５％メタノール、０．００５％ヒスチジン）に植菌し、３０℃にて６０時間培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
０．７ｍｌの前記培養液を５０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離した後、菌体を回収し、０．７ｍｌの氷冷した蒸留水に懸濁した。前記懸濁液を５０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離し、得られた菌体を０．７ｍｌの滅菌蒸留水に再懸濁した。
得られた菌体からRNeasy Kit (QIAGEN)を用いてtotal RNAを抽出した後、得られたtotal RNAを鋳型として用いて逆転写反応を行いｃＤＮＡを合成した。逆転写はTaKaRA RNA PCR Kit（AMV）ver.3.0を用い、逆転写反応プライマーはRandom 9merを用いた。
オリゴヌクレオチド６２及びオリゴヌクレオチド６３を合成した。尚、当該オリゴヌクレオチド６２及びオリゴヌクレオチド６３は、ＰＬＯＤ２遺伝子のＮ末端側約６００ｂｐを増幅するプライマーである。
下記オリゴヌクレオチド６２及び６３をプライマーとし、逆転写反応により得られたｃDNAを鋳型として用いたＰＣＲにより、ＰＬＯＤ２遺伝子の転写産物に由来する二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド６２：TGGAGAGGTGGTGATGGAATT（配列番号８２）
(b)オリゴヌクレオチド６３：AAAGAGTGCAGCCATTATCCTG（配列番号８３）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のBlendTaqを用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)染色体ＤＮＡ抽出液 ・・・５μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１μｌ
(d)10×PCR buffer for BlendTaq ・・・５μｌ
(e)BlendTaq DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・０．５μｌ
(f)滅菌蒸留水 ・・・３２．５μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、９４℃にて３０秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて１分間の伸長反応からなるサイクルを３０回行った。
ＰＣＲした溶液をアガロースゲル電気泳動した結果、ゲル上で明瞭な約６００ｂｐの単一バンドが観察された。これにより、染色体上に入されているPLOD２遺伝子が発現していることが明らかになった。
（７−６） プロリルヒドロキシラーゼα１サブユニットの発現の確認
ＴＴ０６１０１８−３−５株を、１００ｍｌのＢＭＧＹ培地（１％イーストエキストラクト、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸緩衝液、１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール、０．００５％ヒスチジン）に接種して、３０℃にて２６時間培養した。その後、得られた培養液を５０００ｇ、室温で１０分間遠心分離して菌体を得た。
回収した菌体をＯＤ６００＝約１０になる様に５０ｍｌのＢＭＭ培地（１００ｍＭリン酸緩衝液、１．３４％ イーストナイトロジェンベース、４×１０−５%ビオチン、０．５％メタノール、０．００５％ヒスチジン）に植菌し、３０℃にて６０時間培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
４ｍｌの前記培養液を５０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離した後、菌体を回収し、２ｍｌの氷冷した蒸留水に懸濁した。前記懸濁液を５０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離し、得られた菌体を０．７ｍｌの２００ｍＭ、ｐＨ７．４のリン酸カリウム緩衝液に再懸濁した。
マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて懸濁液を破砕した。破砕は酵母用の破砕条件（ガラスビーズ０．５ｍｍΦ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて行った。得られた破砕液を１００００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離した後、上清を回収した。
上清をLaemmli, U. K., Nature, （1970） 227, 680に記載の方法に準じてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した。泳動終了後、アクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン−Ｐ、ミリポア社製）にブロットした。
得られたメンブレンを２５ｍｌのBlocking one（ナカライテスクより購入）中で１時間振とうし、その後、ＰＢＳ−Ｔ（０．５％のＴｗｅｅｎ‐２０を含むＰＢＳ溶液）にて２回洗浄した。
５μｌの抗プロリルヒドロキシラーゼα１抗体（６３１６７、ＭＰＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳ社より購入）を１０ｍｌのCan Get Signal solution1（東洋紡社製）で希釈して希釈液を調製し、前記メンブレンを希釈液に浸漬し１時間振とうした。振とう後、前記メンブレンを２５ｍｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。その後、１０μｌの２次抗体（坑マウス IgG-HRP Linked ヒツジ抗体 NA-931、GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を１０ｍｌのCan Get Signal solution2（東洋紡社製）で希釈して希釈液を調製し、前記メンブレンを希釈液に浸漬して１時間振とうした。振とう後、前記メンブレンを２５ｍｌのＰＢＳ−Ｔにて３回洗浄した。洗浄後のメンブレンを化学発光検出試薬（ECL Western Blotting Detection System、GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて発光させ、イメージアナライザー（LAS-3000UVmini 富士フィルム社製）で当該発光を検出した。その結果、ＴＴ０６１０１８−３−５株ではプロリルヒドロキシラーゼα１サブユニットに相当する分子量のバンドが検出されたことから、プロリルヒドロキシラーゼα１サブユニットを生産していることが示された。
（７−７） プロリルヒドロキシラーゼβサブユニットの発現の確認
ＴＴ０６１０１８−３−５株を、１００ｍｌのＢＭＧＹ培地（１％イーストエキストラクト、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸緩衝液、１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール、０．００５％ヒスチジン）に接種して、３０℃にて２６時間培養した。その後、得られた培養液を５０００ｇ、室温で１０分間遠心分離して菌体を得た。
回収した菌体をＯＤ６００＝約１０になる様に５０ｍｌのＢＭＭ培地（１００ｍＭリン酸緩衝液、１．３４％ イーストナイトロジェンベース、４×１０−５%ビオチン、０．５％メタノール、０．００５％ヒスチジン）に植菌し、３０℃にて６０時間培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
４ｍｌの前記培養液を５０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離した後、菌体を回収し、２ｍｌの氷冷した蒸留水に懸濁した。前記懸濁液を５０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離し、得られた菌体を０．７ｍｌの２００ｍＭ、ｐＨ７．４のリン酸カリウム緩衝液に再懸濁した。
マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて懸濁液を破砕した。破砕は酵母用の破砕条件（ガラスビーズ０．５ｍｍΦ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて行った。得られた破砕液を１００００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離した後、上清を回収した。
上清をLaemmli, U. K., Nature, （1970） 227, 680に記載の方法に準じてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した。泳動終了後、アクリルアミドゲルを、ＰＶＤＦメンブレン（イモビロン−Ｐ、ミリポア社製）にブロットした。
得られたメンブレンを２５ｍｌのBlocking one（ナカライテスクより購入）中で１時間振とうし、その後、ＰＢＳ−Ｔ（０．５％のＴｗｅｅｎ‐２０を含むＰＢＳ溶液）にて２回洗浄した。
２μｌの抗プロリルヒドロキシラーゼβ抗体（ＳＰＡ−８９０、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ社より購入）を１０ｍｌのCan Get Signal solution1（東洋紡社製）で希釈して希釈液を調製し、前記メンブレンを希釈液に浸漬し１時間振とうした。振とう後、前記メンブレンを２５ｍｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。その後、１μｌの２次抗体（坑ウサギ IgG-HRP Linked ロバ抗体 NA-934、GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を１０ｍｌのCan Get Signal solution2（東洋紡社製）で希釈して希釈液を調製し、前記メンブレンを希釈液に浸漬して１時間振とうした。振とう後、前記メンブレンを２５ｍｌのＰＢＳ−Ｔにて３回洗浄した。洗浄後のメンブレンを化学発光検出試薬（ECL plus Western Blotting Detection System、GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて発光させ、イメージアナライザー（LAS-3000UVmini 富士フィルム社製）で当該発光を検出した。その結果、ＴＴ０６１０１８−３−５株ではプロリルヒドロキシラーゼβサブユニットに相当する分子量のバンドが検出されたことから、プロリルヒドロキシラーゼβサブユニットを生産していることが示された。
実施例８ （ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩ発現酵母の作製）
（８−１） ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１遺伝子及びヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２遺伝子の酵母への導入
遺伝子導入プラスミドであるｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１を前記リジルヒドロキシラーゼ１、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット、及び、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子導入酵母ＴＴ０６１０１８−１−１３株、及び、前記リジルヒドロキシラーゼ２、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット、及び、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子導入酵母ＴＴ０６１０１８−３−５株に導入し、相同的組換えにより染色体に組み込んだ。当該遺伝子導入方法について以下に説明する。
１００ｍｌのＹＰＤ液体培地に酵母ＴＴ０６１０１８−１−１３株、ＴＴ０６１０１８−３−５株を各々接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６００）＝約１０となるまで培養した。８０ｍｌの培養液を氷上にて冷却した後、３０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離し菌体を沈殿させた。上清を取り除き、等量、１／２量、１／４量の氷冷滅菌蒸留水で順次洗菌した。その後、１／４量の氷冷１Ｍソルビトールに菌体を懸濁し、３０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離を行い、菌体を回収した。得られた菌体を氷冷１Ｍソルビトールに懸濁し、ＯＤ６００＝約１５０に調整した。
１０μｇのｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１を制限酵素ＸｂａＩで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
菌体懸濁液１００μｌを滅菌試験管にとり、５μｌのＤＮＡ溶液と混合した。遺伝子導入装置（ＢＴＸ社製のＥＣＭ６３０）を酵母用の条件（１５００Ｖ／２ｍｍ、２５μＦ、並列抵抗値２００Ω）に設定し、電極付キュベットに前記混合液を移した後、装置にセットしてパルスを加えた。その後、電圧を与えた後の混合液に１ｍｌの１Ｍソルビトールを混合した。当該混合液２００μｌをＭＤ寒天培地上に広げ、３０℃にて４８時間培養した。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換酵母として単離した。
（８−２） ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１遺伝子導入の確認
形質転換酵母の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い染色体上にヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１遺伝子が組み込まれていることを確認した。
ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーから少量の菌体を採り１０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。懸濁液に５μｌの２０００ｕ／μｌLyticase（シグマ社から購入）を加え、３０℃で２０分間保温した。その後、−８０℃で１０分間、９８℃で５分間保温した後、１２０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離した。上清を回収し染色体ＤＮＡ抽出液として用いた。
オリゴヌクレオチド５６及びオリゴヌクレオチド５７を合成した。尚、当該オリゴヌクレオチド５６は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１遺伝子の５’末端、当該オリゴヌクレオチド５７は３’末端に位置するオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド５６及び５７をプライマーとし、染色体ＤＮＡ抽出液を鋳型として用いたＰＣＲにより、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１遺伝子の二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド５６：TATTCGAAACGATGTTCAGCTTTGTGGACCTCCG（配列番号７６）
(b)オリゴヌクレオチド５７：TTACTAGTTTACAGGAAGCAGACAGGGCCAA（配列番号７７）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のBlendTaqを用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)染色体ＤＮＡ抽出液 ・・・５μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１μｌ
(d)10×PCR buffer for BlendTaq ・・・５μｌ
(e)BlendTaq DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・０．５μｌ
(9)滅菌蒸留水 ・・・３２．５μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて５分間のアニーリング反応、及び、伸長反応からなるサイクルを４０回行った。
ＰＣＲした溶液をアガロースゲル電気泳動した結果、ゲル上で明瞭な約４４００ｂｐの単一バンドが観察された。これによって、染色体上にヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１遺伝子が導入されていることが明らかになった。
（８−３） ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２遺伝子導入の確認
形質転換酵母の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い染色体上にヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２遺伝子が組み込まれていることを確認した。
ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーから少量の菌体を採り１０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。懸濁液に５μｌの２０００ｕ／μｌLyticase（シグマ社から購入）を加え、３０℃で２０分間保温した。その後、−８０℃で１０分間、９８℃で５分間保温した後、１２０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離した。上清を回収し染色体ＤＮＡ抽出液として用いた。
オリゴヌクレオチド５８及びオリゴヌクレオチド５９を合成した。尚、当該オリゴヌクレオチド５８は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２遺伝子の５’末端、当該オリゴヌクレオチド５９は３’末端に位置するオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド５８及び５９をプライマーとし、染色体ＤＮＡ抽出液を鋳型として用いたＰＣＲにより、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２遺伝子の二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド５８：TATTCGAAACGATGCTCAGCTTTGTGGATACGCG（配列番号７８）
(b)オリゴヌクレオチド５９：TTACTAGTTTATTTGAAACAGACTGGGCCAATGTC（配列番号７９）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のBlendTaqを用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)染色体ＤＮＡ抽出液 ・・・５μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１μｌ
(d)10×PCR buffer for BlendTaq ・・・５μｌ
(e)BlendTaq DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・０．５μｌ
(9)滅菌蒸留水 ・・・３２．５μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて５分間の伸長反応からなるサイクルを４０回行った。
ＰＣＲした溶液をアガロースゲル電気泳動した結果、ゲル上で明瞭な約４１００ｂｐの単一バンドが観察された。これによって、染色体上にヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２遺伝子が導入されていることが明らかになった。
尚、当該酵母について以後、ＴＴ０６１０１８−１−１３株にヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１遺伝子及びヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２遺伝子を導入した株をＴＴ０８０４１７−１−８株、ＴＴ０６１０１８−３−５株にヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１遺伝子及びヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２遺伝子を導入した株をＴＴ０８０７２４−１−１１株、と記す。
（８−４） ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１及びヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２の発現の確認
ＴＴ０８０４１７−１−８株、ＴＴ０８０７２４−１−１１株を各々１００mlのＢＭＧＹ培地に接種して、３０℃にて２６時間培養した。その後、得られた培養液を５０００ｇ、室温で１０分間遠心分離して菌体を得た。
回収した菌体をＯＤ６００＝約１０になる様に５０ｍｌのＢＭＭ培地に植菌し、３０℃にて６０時間培養した。この間、約１２時間おきに５０％メタノールを０．５ｍｌ添加した。
４ｍｌの前記培養液を５０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離した後、菌体を回収し、２ｍｌの氷冷した蒸留水に懸濁した。前記懸濁液を５０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離し、得られた菌体を０．７ｍｌの２００ｍＭ、ｐＨ７．４のリン酸カリウム緩衝液に再懸濁した。
マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて懸濁液を破砕した。破砕は酵母用の破砕条件（ガラスビーズ０．５ｍｍΦ、２５００ｒｐｍ、４０分）にて行った。得られた破砕液を１００００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離した後、上清を回収した。
上清をLaemmli, U. K., Nature, （1970） 227, 680に記載の方法に準じてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した。電気泳動後のゲルをページブルー８３（コスモ・バイオ社製）にて染色した。
電気泳動の結果、ゲル上の約１００ｋＤａ以上の位置に明瞭なバンドが２本存在した。ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１のプロコラーゲンの分子量は約１４０ｋＤａ、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２のプロコラーゲンの分子量は約１３０ｋＤａであり、これらの結果からＴＴ０８０４１７−１−８株、及び、ＴＴ０８０７２４−１−１１株ではヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１及びヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２が発現していることが確認された。
実施例９ （コラーゲンの解析）
（９−１） 酵母の培養
ＴＴ０９０４１７−１−８株、及び、ＴＴ０８０７２４−１−１１株を各々１００ｍｌのＢＭＧＹ培地に植菌して、３０℃にて２０時間前培養を行った。
３Ｌ容量のファーメンター（型式：BMS-03P1、エイブル）に０．８ＬのＢａｓａｌ ｓａｌｔ培地を調製した。前培養液を終濃度ＯＤ660＝約１．２５となる様に植菌し、通気攪拌して本培養を開始した。
本培養は、培養温度３０℃、最大通気量を０．８ｖｖｍ（０．８Ｌ）、攪拌速度８００pmに設定して開始した。培地中のグリセロールがすべて消費され、酸素消費量が低下した時点より、約１５g/hの速度でグリセロール流加培地（５０％グリセロール、１．２％PMT１溶液）の流加を開始した。グリセロール流加は培養液のＯＤ660＝約１３０となった時点で停止した。その後、メタノール流加培地［９８．６％（Ｗ／Ｖ）メタノール、１．２％ＰＭＴ１溶液］の添加を開始しメタノール流加培養を行った。メタノール流加開始後、培養温度を３２℃に変更し、溶存酸素量を約８ｐｐｍとなるよう制御した。また、培養期間を通じて培養液のｐＨは２８％アンモニア水を用いてｐＨ＝約５．０に定値制御した。約１３６時間の培養によりＴＴ０８０４１７−１−８株の培養液が１３５８ｇ、ＴＴ０８０７２４−１−１１株の培養液が１３７１ｇ得られた。以下に用いた培地の組成を示す。
(a)（Ｂａｓａｌ ｓａｌｔ培地の組成）
(b)８５％Ｈ３ＰＯ４ ・・・２６．７ｍＬ／Ｌ
(c)ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ ・・・０．９３ｇ／Ｌ
(d)Ｋ２ＳＯ４ ・・・１８．２ｇ／Ｌ
(e)ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ・・・１４．９ｇ／Ｌ
(f)ＫＯＨ ・・・４．１３ｇ／Ｌ
(g)グリセロール ・・・４０ｇ／Ｌ
前記成分を混合後、オートクレーブ滅菌した。２８％アンモニア水でｐＨを５．０に調製した後、２ｍｌ／ＬのＰＭＴ１溶液を、及び、１ｍｌ／Ｌの消泡剤メタノール溶液（１２．５％アデカノールＬＧ２９５Ｓ）を添加した。
（ＰＭＴ１溶液の組成）
(a)ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ・・・６．０ｇ／Ｌ
(b)ＫＩ ・・・０．８ｇ／Ｌ
(c)ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ ・・・３．０ｇ／Ｌ
(d)Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ・・・０．２ｇ／Ｌ
(e)Ｈ３ＢＯ４ ・・・０．２ｇ
(f)ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ ・・・０．５ｇ／Ｌ
(g)ＺｎＣｌ２ ・・・２０ｇ／Ｌ
(h)ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ・・・６５ｇ／Ｌ
(i)ビオチン ・・・０．２ｇ／Ｌ
(j)濃硫酸 ・・・５ｍL／Ｌ
前記培養液を５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して菌体を回収した。培地成分を取り除くため前記菌体をリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）に懸濁した後、懸濁液を遠心分離して菌体を回収した。この作業を合計２回繰り返し、菌体を調製した。ＴＴ０８０４１７−１−８株の菌体が５５７ｇ、ＴＴ０８０７２４−１−１１株の菌体が５９０ｇ得られた。
（９−２） コラーゲンの抽出・精製
ＴＴ０８０４１７−１−８株（実施例（９−１）参照）の菌体５５７ｇ、及び、ＴＴ０８０７２４−１−１１株（実施例（４−１）参照）の菌体５９０ｇを破砕してコラーゲンを抽出・精製した。菌体の破砕はダイノミル（DYNO-MILL TypeKDL-A、WILLY A.BACHOFEN AG製）を用いて行った。
前記菌体を４０％（W/W）の濃度でリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）に懸濁し、懸濁液を調製した。送液ポンプを用いて、酵母用の条件に設定したダイノミルに前記懸濁液を４０００g／時間の速度で送り込んで懸濁液を破砕した。
リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）を加えて菌体破砕液の濃度を１／２に希釈した。終濃度０．２Nで濃塩酸を用えてｐＨを強酸性（ｐＨ１．５以下）に調整した。終濃度５ｍｇ／ｍｌとなるようペプシン（Ｐ７０００、SIGMA）を添加した後、前記菌体破砕液を攪拌しながら４℃で保温した。約９６時間後、前記菌体破砕液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。前記上清に８ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを約１０に調整した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。
前記上清に終濃度０．５Ｍとなるように酢酸を添加し、濃塩酸を用いてｐＨを３．０に調整した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。前記上清に終濃度１ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃に保温した。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を回収した。前記不溶性の画分に０．１ＮのＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製した。約１６時間後、前記溶解液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。
前記上清に終濃度が０．０５Ｍとなるように１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を添加した後、８ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを約７．４に調整した。終濃度４ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して不溶性の画分を回収した。前記不溶性の画分の重量の２．８倍の重量の０．１Ｎ ＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して不溶性の画分を回収した。前記不溶性の画分に０．１ＮのＨＣｌを添加して攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製した。約１６時間後、前記溶解液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。
前記上清に終濃度が０．５Ｍとなるように酢酸を添加し、濃塩酸を用いてｐＨを約３．０に調整した。前記上清に終濃度２ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して、不溶性の画分を回収した。前記不溶性の画分に０．１ＮのＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製した。約１６時間後、前記溶解液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。
前記上清を透析チューブ（Spectra/Por １３２６６５、SPECTUM LABORATORIES）に入れ、１０倍容量の１ｍＭ ＨＣｌ溶液に対する透析を３回行なった後、０．２２μｍのフィルター（Millex GP、ミリポア）を用いてろ過した。ＴＴ０７０３２７−１−１１株の菌体から６７．６ｇ、ＴＴ０８０４１７−１−８株の菌体から２５．３ｇ、及び、ＴＴ０８０７２４−１−１株の菌体から３４．７ｇの精製コラーゲン溶液が得られた。
（９−３） コラーゲンの電気泳動
前記精製品を、Laemmli, U. K., Nature, (1970) 227, 680に記載の方法に準じて、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した。電気泳動後のゲルをページブルー８３染色液（ナカライテスク社製）で染色した。図１０のレーン２にＴＴ０８０４１７−１−８株におけるコラーゲン精製品、レーン３にＴＴ０８０７２４−１−１１株におけるコラーゲン精製品の電気泳動パターンを示す。電気泳動による結果（図１０参照）、各レーンにおいてゲル上で明瞭な２本のバンドが確認され、高分子量１側のバンドがＴｙｐｅＩα１に由来するバンド、また、低分子量側のバンドがＴｙｐｅＩα２に由来するバンドであった。
（９−４） アミノ酸分析
ＴＴ０７０３２７−１−１１株から精製された組換えヒトコラーゲン１ｍｇを含む０．１Ｍ 塩酸溶液を加水分解管に採取し、減圧乾固した後に、６Ｍ塩酸溶液５００μＬを加えた。加水分解管内の気体を窒素に置換後、減圧しながら封管した。
封管した加水分解管を１１０℃にて２４時間保持して、精製された組換えヒトコラーゲンの加水分解処理を行った。加水分解管を開管したのち、塩酸を減圧乾固した。
加水分解後のヒトコラーゲンを２ ｍＬの２０ｍＭのＨＣｌにて溶解し、加水分解物１０μｇをニンヒドリン発色法（（株）日立製作所 L-8800形高速アミノ酸分析計）にて分析した。
尚、カラムはイオン交換樹脂カラム（#2622）、溶離液は市販品L-8500 Buffer Solution PH-1（021-09111、和光純薬）、L-8500 Buffer Solution PH-2（028-09121、和光純薬）、L-8500 Buffer Solution PH-3（025-09131、和光純薬）、L-8500 Buffer Solution PH-4（022-09141、和光純薬）、及び、L-8500 Column Regenerating Solution PH（PH-RG）（036-12531、和光純薬）を使用した。ニンヒドリンによるアミノ酸の発色には、市販品であるNinhydrin Solution Set（201-06251、和光純薬）を使用した。アミノ酸混合標準液は、市販品であるAMINO ACID CALIBRATION MIXTURE（782-3140）、（株）日立ハイテクフィールディング）にtrans-4-Hydroxy-L-PROLINE（H-6002、Sigma）、及び、DL-plus allo-δ Hydroxylysine, HCl（3920、CALBIO. CHEM.）を添加し、各アミノ酸濃度が１００ｎｍｏｌ／ｍＬ（ただし、プロリン及びヒドロキシプロリンは２００ｎｍｏｌ／ｍＬ）になるように調製したものを用いた。
図１１に示すように、本実施例では水酸化リジンの割合が、全リジン残基のうち５０．１％にまで上昇することが明らかになった。
（９−５） 線維形成能の測定
精製された組換えヒトコラーゲンを１ｍＭのＨＣｌに対して透析したのち、コラーゲン質濃度が０．２４％になるように透析時の外液で希釈した。続いて、６倍濃度のＤ−ＰＢＳ（−）（塩化ナトリウム８ｇ、リン酸一水素二ナトリウム１．１５ｇ、塩化カリウム０．２ｇ、リン酸水素カリウム０．２ｇを水に溶解し１０００ｍＬとしたもの）を加え、最終コラーゲン濃度が０．２０％、Ｄ−ＰＢＳ（−）の濃度が１倍になる様に調製した。尚、調製後のｐＨは、７．３〜７．４であった。前記精製された組換えヒトコラーゲンをジャケット付石英ガラスセルに入れ、油回転ポンプを用いて減圧脱気した後、分光光度計（U-2000、(株)日立製作所）のセル台にセットした。３７℃の循環水を流した状態にて、波長４００ｎｍの吸光度を経時的に測定した（サンプリングポイントは３０秒）。
図１２に示すように、ＴＴ０８０４１７−１−８株から調製したコラーゲン、及び、ＴＴ０８０７２４−１−１１株から調製したコラーゲンでは、線維形成能が上昇していることが明らかになった。
参考例１ （プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット発現酵母の作製）
（１−１） プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子、及び、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブニット遺伝子の酵母への導入
遺伝子導入プラスミドであるｐＥＸＰ−Ａ−Ｐ４ＨＢｓｉｇ（−）Ａ１ｒｅｖを、酵母コマガタエラ パストリスＰＰＹ１２株に導入し、相同的組換えにより染色体に組み込んだ。当該遺伝子導入方法を以下に説明する。
１００ｍｌのＹＰＤ液体培地（イーストエキストラクト１ｇ、及び、バクトペプトン２ｇをイオン交換水に溶解し、全量を９０ｍｌとした後オートクレーブで滅菌し、当該培地と別途濾過滅菌した２０％グルコース１０ｍｌとを混合して作製）に酵母コマガタエラ パストリスＰＰＹ１２株を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６００）＝約１０となるまで培養した。８０ｍｌの培養液を氷上にて冷却した後、３０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離し菌体を沈殿させた。上清を取り除き、等量、１／２量、１／４量の氷冷滅菌蒸留水で順次洗菌した。その後、１／４量の氷冷１Ｍソルビトールに菌体を懸濁し、３０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離を行い、菌体を回収した。得られた菌体を氷冷１Ｍソルビトールに懸濁し、ＯＤ６００＝約１５０に調整した。
１０μｇのｐＥＸＰ−Ａ−Ｐ４ＨＢｓｉｇ（−）Ａ１ｒｅｖを制限酵素ＡａｔＩＩで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
菌体懸濁液１００μｌを滅菌試験管にとり、５μｌのＤＮＡ溶液と混合した。遺伝子導入装置（ＢＴＸ社製のＥＣＭ６３０）を酵母用の条件（１５００Ｖ／２ｍｍ、２５μＦ、並列抵抗値２００Ω）に設定し、電極付キュベットに前記混合液を移した後、装置にセットしてパルスを加えた。その後、電圧を与えた後の混合液に１ｍｌの１Ｍソルビトールを混合した。当該混合液２００μｌをＭＤ寒天培地（終濃度１．３４％イーストナイトロジェンベース、４×１０−５％ビオチン、２％グルコース、０．００５％ヒスチジン、２％寒天）上に広げ、３０℃にて４８時間培養した。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換酵母として単離した。
（１−２） プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子導入の確認
形質転換酵母の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い染色体上にプロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子が組み込まれていることを確認した。
ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーから少量の菌体を採り１０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。懸濁液に５μｌの２０００ｕ／μｌLyticase（シグマ社から購入）を加え、３０℃で２０分間保温した。その後、−８０℃で１０分間、９８℃で５分間保温した後、１２０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離した。上清を回収し染色体ＤＮＡ抽出液として用いた。
オリゴヌクレオチド２７及び２８を合成した。尚、当該オリゴヌクレオチド２７は、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子の５’末端、当該オリゴヌクレオチド２８は３’末端に位置するオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド２７及びオリゴヌクレオチド２８を用いるとともに、染色体ＤＮＡ抽出液を鋳型として用いたＰＣＲにより、プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子の二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド２７：TATTCGAAACGATGATCTGGTATATATTAATTATA（配列番号２７）
(b)オリゴヌクレオチド２８：TTGCTAGCTCATTCCAATTCTGACAACGTACAAGG（配列番号２８）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のBlendTaqを用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)染色体ＤＮＡ抽出液 ・・・５μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１μｌ
(d)10×PCR buffer for BlendTaq ・・・５μｌ
(e)BlendTaq DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・０．５μｌ
(f)滅菌蒸留水 ・・・３２．５μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて４分間の伸長反応からなるサイクルを４０回行った。
ＰＣＲした溶液をアガロースゲル電気泳動した結果、ゲル上で明瞭な約１６００ｂｐの単一バンドが観察された。これによって、染色体上にプロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット遺伝子が導入されていることが明らかになった。
（１−３） プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子導入の確認
形質転換酵母の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い染色体上にプロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子が組み込まれていることを確認した。
ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーから少量の菌体を採り１０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。懸濁液に５μｌの２０００ｕ／μｌLyticase（シグマ社から購入）を加え、３０℃で２０分間保温した。その後、−８０℃で１０分間、９８℃で５分間保温した後、１２０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離した。上清を回収し染色体ＤＮＡ抽出液として用いた。
オリゴヌクレオチド３３及びオリゴヌクレオチド３４を合成した。尚、当該オリゴヌクレオチド３３は、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子の５’末端、当該オリゴヌクレオチド３４は３’末端に位置するオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド３３及びオリゴヌクレオチド３４をプライマーとし、染色体ＤＮＡ抽出液を鋳型として用いたＰＣＲにより、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子の二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド３３：TTACTAGTGACGCCCCCGAGGAGGA（配列番号３３）
(b)オリゴヌクレオチド３４：TTACTAGTTTACAGTTCATCTTTCACAGCTTTCT（配列番号３４）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のBlendTaqを用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)染色体ＤＮＡ抽出液 ・・・５μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１μｌ
(d)10×PCR buffer for BlendTaq ・・・５μｌ
(e)BlendTaq DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・０．５μｌ
(f)滅菌蒸留水 ・・・３２．５μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて４分間の伸長反応からなるサイクルを４０回行った。
ＰＣＲした溶液をアガロースゲル電気泳動した結果、ゲル上で明瞭な約１５００ｂｐの単一バンドが観察された。これによって、染色体上にプロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子が導入されていることが明らかになった。
以上、１−２、及び、１−３の遺伝子導入の確認を行った結果、プロリル−４−ヒドロキシラーゼαサブユニット遺伝子、及び、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子が導入された酵母として０５０５１８−３−１株が得られた
参考例２ （プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット、及び、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩ発現酵母の作製）
（２−１） ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩ遺伝子の酵母への導入
遺伝子導入プラスミドであるｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ３Ａ１を前記プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット、及び、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子導入酵母０５０５１８−３−１株に導入し、相同的組換えにより染色体に組み込んだ。当該遺伝子導入方法について以下に説明する。
１００ｍｌのＹＰＤ液体培地に酵母０５０５１８−３−１株を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６００）＝約１０となるまで培養した。８０ｍｌの培養液を氷上にて冷却した後、３０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離し菌体を沈殿させた。上清を取り除き、等量、１／２量、１／４量の氷冷滅菌蒸留水で順次洗菌した。その後、１／４量の氷冷１Ｍソルビトールに菌体を懸濁し、３０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離を行い、菌体を回収した。得られた菌体を氷冷１Ｍソルビトールに懸濁し、ＯＤ６００＝約１５０に調整した。
１０μｇのｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ３Ａ１を制限酵素ＸｂａＩで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
菌体懸濁液１００μｌを滅菌試験管にとり、５μｌのＤＮＡ溶液と混合した。遺伝子導入装置（ＢＴＸ社製のＥＣＭ６３０）を酵母用の条件（１５００Ｖ／２ｍｍ、２５μＦ、並列抵抗値２００Ω）に設定し、電極付キュベットに前記混合液を移した後、装置にセットしてパルスを加えた。その後、電圧を与えた後の混合液に１ｍｌの１Ｍソルビトールを混合した。当該混合液２００μｌをＭＤ寒天培地上に広げ、３０℃にて４８時間培養した。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換酵母として単離した。
（２−２） ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩ遺伝子導入の確認
形質転換酵母の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い染色体上にヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩ遺伝子が組み込まれていることを確認した。
ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーから少量の菌体を採り１０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。懸濁液に５μｌの２０００ｕ／μｌLyticase（シグマ社から購入）を加え、３０℃で２０分間保温した。その後、−８０℃で１０分間、９８℃で５分間保温した後、１２０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離した。上清を回収し染色体ＤＮＡ抽出液として用いた。
オリゴヌクレオチド５０及びオリゴヌクレオチド５１を合成した。尚、当該オリゴヌクレオチド５０は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩ遺伝子の５’末端、当該オリゴヌクレオチド５１は３’末端に位置するオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド５０及び５１をプライマーとし、染色体ＤＮＡ抽出液を鋳型として用いたＰＣＲにより、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩ遺伝子の二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド５０：TATTCGAAACGATGATGAGCTTTGTGCAAAAGGGG （配列番号５０）
(b)オリゴヌクレオチド５１：TTACTAGTTTATAAAAAGCAAACAGGGCCAACGT （配列番号５１）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のBlendTaqを用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)染色体ＤＮＡ抽出液 ・・・５μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１μｌ
(d)10×PCR buffer for BlendTaq ・・・５μｌ
(e)BlendTaq DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・０．５μｌ
(f)滅菌蒸留水 ・・・３２．５μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて５分間の伸長反応からなるサイクルを４０回行った。
ＰＣＲした溶液をアガロースゲル電気泳動した結果、ゲル上で明瞭な約４４００ｂｐの単一バンドが観察された。これによって、染色体上にプロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子が導入されていることが明らかになった。
尚、当該酵母について以後、０５０５１８−３−１株にヒトコラーゲンＴｙｐｅＩＩＩ遺伝子を導入した株をＴＴ０６１２２６−３−６株と記す。
参考例３ （コラーゲンの解析）
（３−１） 酵母の培養
ＴＴ０６１２２６−３−６株を、１００ｍｌのＢＭＧＹ培地に植菌して、３０℃にて２０時間前培養を行った。
３Ｌの容量のファーメンター（マルビシバイオ）に仕込んだ１ＬのＢａｓａｌ ｓａｌｔ培地に、前培養液をＯＤ６６０＝約１．２５となる様に植菌し、通気攪拌して本培養を行った。
本培養は、３０℃にて開始し、最大通気量を１．０ｖｖｍ（１Ｌ）に設定した。培地中のグリセロールが消費され尽くした時点より、グリセロール流加培地（５０％グリセロール、１．２％ＰＭＴ１溶液）の添加を開始した。グリセロール流加培養は培養液のＯＤ６６０＝約１４０となった時点で停止した。その後、メタノール流加培地（９９．８％（Ｗ／Ｖ）メタノール、１．２％のＰＭＴ１）の添加を開始しメタノール流加培養を行った。メタノール流加培養では、培養温度を３２℃に変更し、溶存酸素量を約８ｐｐｍとなるよう制御した。また、培養期間を通じて培養液のｐＨは２８％アンモニア水、及び、４Ｍリン酸を用いて約５．０に定値制御した。約１４０時間の培養により約２Ｌの培養液が得られた。以下に用いた培地の組成を示す。
(a)（Ｂａｓａｌ ｓａｌｔ培地の組成）
(b)８５％Ｈ３ＰＯ４ ・・・２６．７ｍＬ／Ｌ
(c)ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ ・・・０．９３ｇ／Ｌ
(d)Ｋ２ＳＯ４ ・・・１８．２ｇ／Ｌ
(e)ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ・・・１４．９ｇ／Ｌ
(f)ＫＯＨ ・・・４．１３ｇ／Ｌ
(g)グリセロール ・・・４０ｇ／Ｌ
前記成分を混合後、オートクレーブ滅菌した。２８％アンモニア水でｐＨを５．０に調製した後、２ｍｌ／ＬのＰＭＴ１溶液を、及び、１ｍｌ／Ｌの消泡剤メタノール溶液（１２．５％アデカノールＬＧ２９５Ｓ）を添加した。
（ＰＭＴ１溶液の組成）
(a)ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ・・・６．０ｇ／Ｌ
(b)ＫＩ ・・・０．８ｇ／Ｌ
(c)ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ ・・・３．０ｇ／Ｌ
(d)Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ・・・０．２ｇ／Ｌ
(e)Ｈ３ＢＯ４ ・・・０．２ｇ
(f)ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ ・・・０．５ｇ／Ｌ
(g)ＺｎＣｌ２ ・・・２０ｇ／Ｌ
(h)ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ・・・６５ｇ／Ｌ
(i)ビオチン ・・・０．２ｇ／Ｌ
(j)濃硫酸 ・・・５ｍL／Ｌ
（３−２） コラーゲンの粗精製
前記培養にて得られた菌体を破砕し、得られた破砕液からコラーゲンを精製した。菌体の破砕はダイノミル（DYNO-MILL TypeKDL-A、WILLY A.BACHOFEN AG社製）を用いて行った。培養液を５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体はリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）に懸濁した後、懸濁液を遠心分離して菌体を回収した。この作業を再度繰り返して培地成分を取り除いた後、６００ｇの湿菌体をリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）１５００ｍｌに懸濁した。送液ポンプを用いて、酵母用の条件に設定したダイノミルに前記懸濁液を送り込んで懸濁液を破砕した。破砕完了の確認は顕微鏡で菌体の形状を観察して行った。
リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）を用いて菌体破砕液を２倍に希釈した。濃塩酸を用いてｐＨを約２．０に調整した。終濃度５ｍｇ／ｍｌとなるようペプシン（シグマより購入）を添加した。４℃にて９６時間保温した後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離を行って上清を回収した。得られた上清に１０ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを約１０に調整した。４℃にて攪拌しながら保温した。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離を行って上清を回収した。
得られた上清に終濃度が０．５Ｍとなるように酢酸を添加した。濃塩酸を用いてｐＨを３．０に調整した。９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離を行って上清を回収した。得られた上清に終濃度が１ＭになるようにＮａＣｌを添加して、４℃にて攪拌しながら保温した。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離を行って沈殿を回収した。得られた沈殿を０．１ＮのＨＣｌに溶解した。
溶解液に終濃度が０．０５Ｍとなるように１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を添加した後、１０ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを約７．４に調整した。ＮａＣｌを終濃度が２Ｍとなるように添加し、４℃にて攪拌しながら保温した。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離を行い、沈殿を回収した。得られた沈殿を０．１ＮのＨＣｌで溶解した後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して上清を回収した。
得られた上清に終濃度が０．５Ｍとなるように酢酸を添加した。濃塩酸を用いてｐＨを約３．０に調整した。終濃度が１ＭとなるようにＮａＣｌを添加し、４℃にて攪拌しながら保温した。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離行い、沈殿を回収した。得られた沈殿を０．１Ｎの ＨＣｌに溶解した。溶解液を４００００ｒｐｍ、４℃で６０分間超遠心分離して上清を回収した。
得られた上清を透析チューブ（Spectra/Por SPECTUM社製）に入れ、１０倍量の１ｍＭ ＨＣｌ溶液に対する透析を３回行なった後、０．２２μｍのフィルター（Millex GP MILLIPORE社製）を用いてろ過し、コラーゲンの粗精製品を得た。
（３−３） コラーゲンの精製
コラーゲン粗精製品に終濃度が０．０５Ｍとなるように１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を添加した後、１０ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを約７．４に調整した。ＮａＣｌを終濃度が２Ｍとなるように添加し、４℃にて攪拌しながら保温した。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離を行い、沈殿を回収した。得られた沈殿の重量の５倍重量の０．１ＮのＨＣｌを用いて溶解した後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して沈殿を回収した。
得られた沈殿に終濃度が０．５Ｍとなるように酢酸を添加した。濃塩酸を用いてｐＨを約３．０に調整した。終濃度が１ＭとなるようにＮａＣｌを添加し、４℃にて攪拌しながら保温した。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離行い、沈殿を回収した。得られた沈殿を０．１Ｎの ＨＣｌに溶解した。溶解液を４００００ｒｐｍ、４℃で６０分間超遠心分離して上清を回収した。
得られた上清を透析チューブ（Spectra/Por SPECTUM社製）に入れ、１０倍量の１ｍＭ ＨＣｌ溶液に対する透析を３回行なった後、０．２２μｍのフィルター（Millex GP MILLIPORE社製）を用いてろ過し、コラーゲンの精製品を得た。
参考例４ （プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１、及び、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２発現酵母の作製）
（４−１） ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１遺伝子及びヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２遺伝子の酵母への導入
遺伝子導入プラスミドであるｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１を前記プロリル−４−ヒドロキシラーゼα１サブユニット、及び、プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット遺伝子導入酵母０５０５１８−３−１株に導入し、相同的組換えにより染色体に組み込んだ。当該遺伝子導入方法について以下に説明する。
１００ｍｌのＹＰＤ液体培地に酵母０５０５１８−３−１株を接種し、３０℃にて菌濁度（ＯＤ６００）＝約１０となるまで培養した。８０ｍｌの培養液を氷上にて冷却した後、３０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離し菌体を沈殿させた。上清を取り除き、等量、１／２量、１／４量の氷冷滅菌蒸留水で順次洗菌した。その後、１／４量の氷冷１Ｍソルビトールに菌体を懸濁し、３０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離を行い、菌体を回収した。得られた菌体を氷冷１Ｍソルビトールに懸濁し、ＯＤ６００＝約１５０に調整した。
１０μｇのｐＥＸＰ−ＨＡ−ＨｓＣＯＬ１Ａ２−１Ａ１を制限酵素ＸｂａＩで切断した。エタノール沈殿でＤＮＡを回収し５μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶解してＤＮＡ溶液を調製した。
菌体懸濁液１００μｌを滅菌試験管にとり、５μｌのＤＮＡ溶液と混合した。遺伝子導入装置（ＢＴＸ社製のＥＣＭ６３０）を酵母用の条件（１５００Ｖ／２ｍｍ、２５μＦ、並列抵抗値２００Ω）に設定し、電極付キュベットに前記混合液を移した後、装置にセットしてパルスを加えた。その後、電圧を与えた後の混合液に１ｍｌの１Ｍソルビトールを混合した。当該混合液２００μｌをＭＤ寒天培地上に広げ、３０℃にて４８時間培養した。ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーを形質転換酵母として単離した。
（４−２） ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１遺伝子導入の確認
形質転換酵母の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い染色体上にヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１遺伝子が組み込まれていることを確認した。
ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーから少量の菌体を採り１０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。懸濁液に５μｌの２０００ｕ／μｌLyticase（シグマ社から購入）を加え、３０℃で２０分間保温した。その後、−８０℃で１０分間、９８℃で５分間保温した後、１２０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離した。上清を回収し染色体ＤＮＡ抽出液として用いた。
オリゴヌクレオチド５６及びオリゴヌクレオチド５７を合成した。尚、当該オリゴヌクレオチド５６は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１遺伝子の５’末端、当該オリゴヌクレオチド５７は３’末端に位置するオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド５６及び５７をプライマーとし、染色体ＤＮＡ抽出液を鋳型として用いたＰＣＲにより、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１遺伝子の二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド５６：TATTCGAAACGATGTTCAGCTTTGTGGACCTCCG（配列番号７６）
(b)オリゴヌクレオチド５７：TTACTAGTTTACAGGAAGCAGACAGGGCCAA（配列番号７７）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のBlendTaqを用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)染色体ＤＮＡ抽出液 ・・・５μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１μｌ
(d)10×PCR buffer for BlendTaq ・・・５μｌ
(e)BlendTaq DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・０．５μｌ
(9)滅菌蒸留水 ・・・３２．５μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６８℃にて５分間のアニーリング反応、及び、伸長反応からなるサイクルを４０回行った。
ＰＣＲした溶液をアガロースゲル電気泳動した結果、ゲル上で明瞭な約４４００ｂｐの単一バンドが観察された。これによって、染色体上にヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１遺伝子が導入されていることが明らかになった。
（４−３） ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２遺伝子導入の確認
形質転換酵母の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い染色体上にヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２遺伝子が組み込まれていることを確認した。
ＭＤ寒天培地上に形成したコロニーから少量の菌体を採り１０μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。懸濁液に５μｌの２０００ｕ／μｌLyticase（シグマ社から購入）を加え、３０℃で２０分間保温した。その後、−８０℃で１０分間、９８℃で５分間保温した後、１２０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離した。上清を回収し染色体ＤＮＡ抽出液として用いた。
オリゴヌクレオチド５８及びオリゴヌクレオチド５９を合成した。尚、当該オリゴヌクレオチド５８は、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２遺伝子の５’末端、当該オリゴヌクレオチド５９は３’末端に位置するオリゴヌクレオチドである。
下記オリゴヌクレオチド５８及び５９をプライマーとし、染色体ＤＮＡ抽出液を鋳型として用いたＰＣＲにより、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２遺伝子の二本鎖ＤＮＡ断片を増幅した。
(a)オリゴヌクレオチド５８：TATTCGAAACGATGCTCAGCTTTGTGGATACGCG（配列番号７８）
(b)オリゴヌクレオチド５９：TTACTAGTTTATTTGAAACAGACTGGGCCAATGTC（配列番号７９）
ＰＣＲ用のポリメラーゼとしては、東洋紡社製のBlendTaqを用いた。尚、反応溶液の具体的な組成を、以下に示す。
(a)染色体ＤＮＡ抽出液 ・・・５μｌ
(b)ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ・・・５μｌ
(c)プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ） ・・・各１μｌ
(d)10×PCR buffer for BlendTaq ・・・５μｌ
(e)BlendTaq DNA polymerase（１Ｕ／μｌ） ・・・０．５μｌ
(9)滅菌蒸留水 ・・・３２．５μｌ
ＰＣＲは、PERKIN ELMER社のGeneAmp PCR System9700を用いて行った。当該反応は、反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９４℃にて１５秒間の変性反応、６０℃にて３０秒間のアニーリング反応、及び、６８℃にて５分間の伸長反応からなるサイクルを４０回行った。
ＰＣＲした溶液をアガロースゲル電気泳動した結果、ゲル上で明瞭な約４１００ｂｐの単一バンドが観察された。これによって、染色体上にヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２遺伝子が導入されていることが明らかになった。
尚、当該酵母について以後、０５０５１８−３−１株にヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα１遺伝子及びヒトコラーゲンＴｙｐｅＩα２遺伝子を導入した株を０６０７１３−１−３株と記す。
参考例５ （コラーゲンの解析）
（５−１） 酵母の培養
０６０７１３−１−３株を各々１００ｍｌのＢＭＧＹ培地に植菌して、３０℃にて２０時間前培養を行った。
３Ｌ容量のファーメンター（型式：BMS-03P1、エイブル）に０．８ＬのＢａｓａｌ ｓａｌｔ培地を調製した。前培養液を終濃度ＯＤ660＝約１．２５となる様に植菌し、通気攪拌して本培養を開始した。
本培養は、培養温度３０℃、最大通気量を０．８ｖｖｍ（０．８Ｌ）、攪拌速度８００pmに設定して開始した。培地中のグリセロールがすべて消費され、酸素消費量が低下した時点より、約１５g/hの速度でグリセロール流加培地（５０％グリセロール、１．２％PMT１溶液）の流加を開始した。グリセロール流加は培養液のＯＤ660＝約１３０となった時点で停止した。その後、メタノール流加培地［９８．６％（Ｗ／Ｖ）メタノール、１．２％ＰＭＴ１溶液］の添加を開始しメタノール流加培養を行った。メタノール流加開始後、培養温度を３２℃に変更し、溶存酸素量を約８ｐｐｍとなるよう制御した。また、培養期間を通じて培養液のｐＨは２８％アンモニア水を用いてｐＨ＝約５．０に定値制御した。約１３６時間の培養により０６０７１３−１−３株の培養液が１４１５ｇ得られた。以下に用いた培地の組成を示す。
(a)（Ｂａｓａｌ ｓａｌｔ培地の組成）
(b)８５％Ｈ３ＰＯ４ ・・・２６．７ｍＬ／Ｌ
(c)ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ ・・・０．９３ｇ／Ｌ
(d)Ｋ２ＳＯ４ ・・・１８．２ｇ／Ｌ
(e)ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ・・・１４．９ｇ／Ｌ
(f)ＫＯＨ ・・・４．１３ｇ／Ｌ
(g)グリセロール ・・・４０ｇ／Ｌ
前記成分を混合後、オートクレーブ滅菌した。２８％アンモニア水でｐＨを５．０に調製した後、２ｍｌ／ＬのＰＭＴ１溶液を、及び、１ｍｌ／Ｌの消泡剤メタノール溶液（１２．５％アデカノールＬＧ２９５Ｓ）を添加した。
（ＰＭＴ１溶液の組成）
(a)ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ・・・６．０ｇ／Ｌ
(b)ＫＩ ・・・０．８ｇ／Ｌ
(c)ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ ・・・３．０ｇ／Ｌ
(d)Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ・・・０．２ｇ／Ｌ
(e)Ｈ３ＢＯ４ ・・・０．２ｇ
(f)ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ ・・・０．５ｇ／Ｌ
(g)ＺｎＣｌ２ ・・・２０ｇ／Ｌ
(h)ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ・・・６５ｇ／Ｌ
(i)ビオチン ・・・０．２ｇ／Ｌ
(j)濃硫酸 ・・・５ｍL／Ｌ
前記培養液を５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して菌体を回収した。培地成分を取り除くため前記菌体をリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）に懸濁した後、懸濁液を遠心分離して菌体を回収した。この作業を合計２回繰り返し、菌体を調製した。０６０７１３−１−３株の菌体が５８８ｇ得られた。
（５−２） コラーゲンの抽出・精製
０６０７１３−１−３株（参考例（５−１）参照）の菌体５８８ｇを破砕してコラーゲンを抽出・精製した。菌体の破砕はダイノミル（DYNO-MILL TypeKDL-A、WILLY A.BACHOFEN AG製）を用いて行った。
前記菌体を４０％（W/W）の濃度でリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）に懸濁し、懸濁液を調製した。送液ポンプを用いて、酵母用の条件に設定したダイノミルに前記懸濁液を４０００g／時間の速度で送り込んで懸濁液を破砕した。
リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）を加えて菌体破砕液の濃度を１／２に希釈した。終濃度０．２Nで濃塩酸を用えてｐＨを強酸性（ｐＨ１．５以下）に調整した。終濃度５ｍｇ／ｍｌとなるようペプシン（Ｐ７０００、SIGMA）を添加した後、前記菌体破砕液を攪拌しながら４℃で保温した。約９６時間後、前記菌体破砕液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。前記上清に８ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを約１０に調整した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。
前記上清に終濃度０．５Ｍとなるように酢酸を添加し、濃塩酸を用いてｐＨを３．０に調整した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。前記上清に終濃度１ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃に保温した。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を回収した。前記不溶性の画分に０．１ＮのＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製した。約１６時間後、前記溶解液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。
前記上清に終濃度が０．０５Ｍとなるように１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を添加した後、８ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを約７．４に調整した。終濃度４ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して不溶性の画分を回収した。前記不溶性の画分の重量の２．８倍の重量の０．１Ｎ ＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して不溶性の画分を回収した。前記不溶性の画分に０．１ＮのＨＣｌを添加して攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製した。約１６時間後、前記溶解液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。
前記上清に終濃度が０．５Ｍとなるように酢酸を添加し、濃塩酸を用いてｐＨを約３．０に調整した。前記上清に終濃度２ＭでＮａＣｌを溶解した後、攪拌しながら４℃で保温した。約１６時間後、前記上清を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して、不溶性の画分を回収した。前記不溶性の画分に０．１ＮのＨＣｌを添加した後、攪拌しながら４℃で保温して溶解液を調製した。約１６時間後、前記溶解液を９０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、不溶性の画分を除去して上清を調製した。
前記上清を透析チューブ（Spectra/Por １３２６６５、SPECTUM LABORATORIES）に入れ、１０倍容量の１ｍＭ ＨＣｌ溶液に対する透析を３回行なった後、０．２２μｍのフィルター（Millex GP、ミリポア）を用いてろ過した。０６０７１３−１−３株の菌体から３５．６ｇの精製コラーゲン溶液が得られた。
本発明により、医薬品、工業製品、化粧品、食品等として商業的に一層価値がある高性能な多用途素材となるようなコラーゲン（具体的には例えば、３重ヘリックス構造が安定化され、且つ、線維形成能が高いコラーゲン）、及び、当該コラーゲンを取得するための方法等が提供可能となる。

Claims (18)

  1. 下記（１）〜（３）の全てのタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する外来遺伝子が微生物細胞内に導入されて得られることを特徴とする形質転換体。
    （１）リジン水酸化酵素
    （２）プロリン水酸化酵素
    （３）コラーゲン
  2. 請求項１記載の形質転換体が、前記（１）〜（３）の全てのタンパク質をその細胞内で共発現していることを特徴とする形質転換体。
  3. 前記リジン水酸化酵素が、リジルヒドロキシラーゼ１、リジルヒドロキシラーゼ２又はリジルヒドロキシラーゼ３から選択される少なくとも１種類のリジン水酸化酵素であることを特徴とする請求項１又は２記載の形質転換体。
  4. 前記プロリン水酸化酵素が、プロリル−４−ヒドロキシラーゼのαサブユニット及びプロリル−４−ヒドロキシラーゼのβサブユニットからなる酵素であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかの請求項記載の形質転換体。
  5. 前記プロリル−４−ヒドロキシラーゼのβサブユニットが酵母αファクターの分泌シグナルとの融合体であることを特徴とする請求項４記載の形質転換体。
  6. 前記プロリル−４−ヒドロキシラーゼのαサブユニットが、α１サブユニット、α２サブユニット又はα３サブユニットであることを特徴とする請求項４又は５記載の形質転換体。
  7. 前記コラーゲンが、コラーゲンType I〜Type XXIXから選択される少なくとも１種類のコラーゲンであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかの請求項記載の形質転換体。
  8. 前記リジン水酸化酵素及び前記プロリン水酸化酵素のタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する外来遺伝子の少なくとも１つが、酵母由来のプロモーターの下流に連結されていることを特徴とする請求項１又は２記載の形質転換体。
  9. 前記プロモーターが、アルコールオキシダーゼ１プロモーターであることを特徴とする請求項８記載の形質転換体。
  10. 前記微生物細胞が、真核生物細胞であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかの請求項記載の形質転換体。
  11. 前記真核生物細胞が、酵母細胞であることを特徴とする請求項１０記載の形質転換体。
  12. 前記酵母細胞が、メタノール資化性酵母細胞であることを特徴とする請求項１１記載の形質転換体。
  13. 前記メタノール資化性酵母細胞が、Komagataella pastorisであることを特徴とする請求項１２記載の形質転換体。
  14. 請求項１〜１３のいずれかの請求項記載の形質転換体が産生して得られうることを特徴とするコラーゲン。
  15. 全リジン残基のうち１５％以上が水酸化されていることを特徴とする請求項１４記載のコラーゲン。
  16. テロペプチド領域のリジン残基が水酸化されていることを特徴とする前項１４記載のコラーゲン。
  17. 微生物細胞内に、下記（１）〜（３）の全てのタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する外来遺伝子を導入する第一工程、第一工程で得られる形質転換体によってコラーゲンを産生させる第二工程、及び、第二工程で産生されたコラーゲンを回収することを特徴とするコラーゲンの取得方法。
    （１）リジン水酸化酵素
    （２）プロリン水酸化酵素
    （３）コラーゲン
  18. 請求項１７記載の取得方法により取得されたコラーゲン。
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