JP2011128572A - ホログラム像投影方法およびホログラム像投影装置 - Google Patents

Abstract

【課題】標本内の深さ方向に異なる位置に配置されている刺激位置にも同時に刺激光を集光させる。
【解決手段】対物レンズを介してレーザ光を集光すべき複数の集光点の標本内における３次元的な位置情報を設定するステップＳ１と、設定された各集光点の標本内における位置情報、標本の屈折率および対物レンズの全系の特性データを用いて、各集光点から対物レンズの入射瞳位置までの逆光線追跡を行って、各集光点からのレーザ光の入射瞳位置における波面を算出するステップＳ２と、算出された複数の波面を合成して合成波面を算出するステップＳ３と、算出された合成波面に基づいて波面変調素子に付与する位相パターンを設定するステップＳ４と、設定された位相パターンを波面変調素子に付与してレーザ光を入射させ、位相パターンによって波面が変調されたレーザ光を、対物レンズを介して標本に集光するステップＳ５とを含むホログラム像投影方法を提供する。
【選択図】図２

Description

本発明は、ホログラム像投影方法およびホログラム像投影装置に関するものである。

従来、標本上の複数箇所に同時に光を照射するために、ホログラムを利用することが知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
この方法においては、蛍光顕微鏡等によって標本の蛍光画像を取得し、取得した蛍光画像内において光刺激等をすべき複数の注目部位を特定することにより刺激光の照射パターンを生成し、当該照射パターンをフーリエ変換することによりホログラムの位相パターンを作成することとしている。そして、作成した位相パターンを波面変調素子に付与し、この波面変調素子に対して光源から導いてきた略平行光からなるレーザ光を入射させることにより、レーザ光を変調し、変調されたレーザ光を対物レンズによって集光している。このようにして、ホログラム像を標本に投影し、複数箇所同時に刺激光を集光させるようになっている。

Volodymyr Nikolenko et al, "SLM microscopy: scanless two-photon imaging and photostimulation with spatial light modulators", Frontiers in Neural Circuits, Vol 2, Article 5, 19 December 2008，p1-15

しかしながら、従来の方法においては、対物レンズの焦点面に存在する複数の注目部位に対しては同時に光を集光させることができるものの、焦点面から光軸方向にずれた位置に配置されている注目部位には集光させることができないという不都合がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、標本内の深さ方向に異なる位置に配置されている注目部位に同時に光を集光させることができるホログラム像投影方法およびホログラム像投影装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、対物レンズを介してレーザ光を集光すべき複数の集光点の標本内における３次元的な位置情報を設定する位置設定ステップと、設定された各集光点の前記標本内における前記位置情報、前記標本の屈折率および前記対物レンズの全系の特性データを用いて、設定された位置に仮定された各前記集光点から前記対物レンズの入射瞳位置までの逆光線追跡を行って、各前記集光点からの前記レーザ光の前記入射瞳位置における波面を算出する波面算出ステップと、各前記集光点に対応して算出された複数の波面を合成して合成波面を算出する波面合成ステップと、算出された前記合成波面に基づいて波面変調素子に付与する位相パターンを設定する位相パターン設定ステップと、設定された前記位相パターンを前記波面変調素子に付与して前記レーザ光を入射させ、前記位相パターンによって波面が変調された前記レーザ光を、前記対物レンズを介して標本に集光する集光ステップとを含むホログラム像投影方法を提供する。

本発明によれば、標本内の異なる位置に３次元的に配置されている各集光点の３次元的な位置情報が位置設定ステップにより設定され、波面算出ステップにおいて、各集光点から対物レンズの入射瞳位置までの逆光線追跡が行われる。波面算出ステップにおいて算出された複数の波面は、波面合成ステップにおいて合成されることにより、３次元的に異なる位置に同時にレーザ光を集光させるために対物レンズの入射瞳位置に入射させることが必要な波面としての合成波面が演算によって得られる。そして、波面変調素子に入射されるレーザ光の波面が、得られた合成波面と同一の波面に変調されるように、合成波面に基づいて波面変調素子に位相パターンが付与される。これにより、異なる深さ位置に３次元的に配置される集光点に同時にレーザ光が集光するようなホログラム像を標本内に投影することができる。

上記発明においては、前記波面合成ステップが、前記複数の波面の線形和を算出することにより前記合成波面を算出するステップであってもよい。
また、上記発明においては、前記波面合成ステップが、前記複数の波面をそれぞれ領域分割したものを前記集光点の数の逆数の割合で配列することにより前記合成波面を算出するステップであってもよい。

また、本発明は、対物レンズを介してレーザ光を集光すべき複数の集光点の標本内における３次元的な位置情報を設定する位置設定ステップと、設定された各集光点の前記標本内における前記位置情報を用いて、各前記集光点を標本内の所定の基準面上に投影した仮想像を生成する仮想像生成ステップと、生成された前記仮想像を、前記標本の屈折率、前記対物レンズの全系の特性データを用いてフーリエ変換して、前記レーザ光の前記対物レンズの入射瞳位置における波面を算出する波面算出ステップと、算出された前記波面に基づいて波面変調素子に付与する位相パターンを設定する位相パターン設定ステップと、設定された前記位相パターンを前記波面変調素子に付与して前記レーザ光を入射させ、前記位相パターンによって波面が変調された前記レーザ光を、前記対物レンズを介して標本に集光する集光ステップとを含むホログラム像投影方法を提供する。

本発明によれば、標本内の異なる位置に３次元的に配置されている各集光点の３次元的な位置情報が位置設定ステップにより設定され、仮想像生成ステップにおいて、対物レンズを介してレーザ光を集光すべき複数の集光点を所定の基準面上に投影した仮想像が生成される。また、波面算出ステップにおいて、仮想像がフーリエ変換されることにより、対物レンズの入射瞳位置における波面が算出される。そして、位相パターン設定ステップにおいて波面変調素子に付与する位相パターンが設定され、集光ステップにおいて、設定された位相パターンを波面変調素子に付与して、波面変調素子にレーザ光を入射させることにより、位相パターンによって波面が変調されたレーザ光が対物レンズを介して標本に集光される。これにより、標本内に３次元的に配置された複数の集光点に同時にレーザ光が集光するホログラム像を標本内に投影することができる。

上記発明においては、前記位置設定ステップが、前記複数の集光点の前記標本内における平面的な位置情報を設定する平面位置設定ステップと、各集光点の前記基準面に対する深さ情報を設定する深さ情報設定ステップとを含み、前記仮想像生成ステップが、各前記集光点の前記標本内における平面的な位置情報を用いて、各前記集光点が標本内の所定の基準面上に集光して複数のスポットを形成していると仮定したときの第１の仮想像を生成する第１仮想像生成ステップと、設定された各前記集光点の深さ情報に基づいて前記第１の仮想像内の対応するスポットを補正して第２の仮想像を生成する第２仮想像生成ステップとを含んでいてもよい。

このようにすることで、全てのスポットが所定の基準面に集光する第１の仮想像におけるスポットの内、基準面に集光しない集光点に対応するスポットについて、設定された深さ情報に基づいてスポットを補正して生成された第２の仮想像から位相パターンを生成するので、当該位相パターンが付与された波面変調素子に平行光からなるレーザ光を照射するだけで、波面変調素子によって変調されたレーザ光が、標本において基準面とは異なる深さ位置にも集光させることができる。これにより、深さ方向に異なる複数の集光点に同時にレーザ光を集光させることができる。

また、上記発明においては、前記第２仮想像生成ステップが、前記第１の仮想像内の前記スポットを、各集光点に集光するレーザ光を前記基準面まで光線追跡して得られる前記レーザ光のスポットに置き換えることにより、前記第１の仮想像内の対応するスポットを補正するステップであってもよい。
このようにすることで、第１の仮想像内のスポットが、各集光点に集光するレーザ光を基準面まで順光線追跡または逆光線追跡して得られたスポットによって置き換えられることにより、標本内において深さ方向に異なる位置に集光するようなスポットを形成する第２の仮想像を演算によって簡易に生成することができる。

また、上記発明においては、前記第２仮想像生成ステップが、対物レンズの焦点位置を前記基準面から光軸方向に所定距離だけずらすように対物レンズを配置した状態で、前記基準面上に集光するように、対物レンズの焦点面における収差を表すベクトル情報を変化させたときのベクトル情報の変化量を前記所定距離で除算して比例係数を算出するステップと、各スポットについて前記比例係数と前記深さ情報とを乗算して得られたベクトル情報を用いて前記スポットを補正するステップとを含んでいてもよい。

このようにすることで、算出されている比例係数に実際の集光点と基準面との距離を示す深さ情報を乗算することで、基準面にレーザ光を集光させるための対物レンズの位置において、基準面とは異なる深さ位置にレーザ光を集光させるために必要な対物レンズの焦点面における収差を表すベクトル情報を得ることができ、これに基づいてスポットを補正した第２の仮想像を生成することで、対物レンズを固定したまま、深さ方向の異なる複数の集光点に同時にレーザ光を集光させることができる。

また、本発明は、位相パターンによりレーザ光の波面を変調する波面変調素子と、該波面変調素子により変調された前記レーザ光を標本に集光する対物レンズと、前記対物レンズを介して前記レーザ光を集光すべき複数の集光点の標本内における３次元的な位置情報を設定する位置情報設定部と、該位置情報設定部により設定された各集光点の前記標本内における前記位置情報、前記標本の屈折率、前記対物レンズの全系の特性データを用いて、設定された位置に仮定された各前記集光点から前記対物レンズの入射瞳位置までの逆光線追跡を行って、各前記集光点からの前記レーザ光の前記入射瞳位置における波面を算出する波面算出部と、該波面算出部により各前記集光点に対応して算出された複数の波面を合成して合成波面を算出する波面合成部と、算出された前記合成波面に基づいて前記波面変調素子に付与する前記位相パターンを設定する位相パターン設定部とを備えるホログラム像投影装置を提供する。

本発明によれば、位置情設定部により各集光点の３次元的な位置情報が設定されると、波面算出部により、設定された位置情報、標本の屈折率および対物レンズの全系の特性データを用いて、集光点から対物レンズの入射瞳位置までの逆光線追跡が行われる。これにより、各集光点からのレーザ光の対物レンズの入射瞳位置における波面が算出される。そして、各集光点について得られた複数の波面は波面合成部において合成されて、合成波面が得られる。このようにして得られた合成波面に基づいて、位相パターン設定部によって位相パターンが設定される。これにより、設定された位相パターンを付与した波面変調素子にレーザ光を入射させるだけで、対物レンズによって集光されるレーザ光を３次元的に異なる位置に配置された複数の集光点に同時に集光させるホログラム像を標本内に投影することができる。

また、本発明は、位相パターンによりレーザ光の波面を変調する波面変調素子と、該波面変調素子により変調された前記レーザ光を標本に集光する対物レンズと、前記対物レンズを介して前記レーザ光を集光すべき複数の集光点の標本内における３次元的な位置情報を設定する位置情報設定部と、該位置情報設定部により設定された各集光点の前記標本内における前記位置情報を用いて、各前記集光点を標本内の所定の基準面上に投影した仮想像を生成する仮想像生成部と、該仮想像生成部により生成された前記仮想像を、前記標本の屈折率および前記対物レンズの全系の特性データを用いてフーリエ変換して、前記レーザ光の前記対物レンズの入射瞳位置における波面を算出する波面算出部と、算出された前記波面に基づいて前記波面変調素子に付与する前記位相パターンを設定する位相パターン設定部とを備えるホログラム像投影装置を提供する。

本発明によれば、位置情報設定部により各集光点の３次元的な位置情報が設定されると、仮想像生成部により、設定された位置情報を用いて各集光点を標本内の所定の基準面上に投影した仮想像が生成され、波面算出部により、標本の屈折率および対物レンズの全系の特性データを用いて仮想像がフーリエ変換され、対物レンズの入射瞳位置における波面が算出される。そして、位相パターン設定部により、算出された波面に基づいて波面調節素子に付与する位相パターンが設定される。これにより、設定された位相パターンを付与した波面変調素子にレーザ光を入射させるだけで、対物レンズによって集光されるレーザ光を３次元的に異なる位置に配置された複数の集光点に同時に集光させるホログラム像を標本内に投影することができる。

本発明によれば、標本内の深さ方向に異なる位置に配置されている注目部位にも同時に光を集光させることができるという効果を奏する。

本発明の第１の実施形態に係るホログラム像投影装置を模式的に示す全体構成図である。 図１のホログラム像投影装置を用いた本発明の第１の実施形態に係るホログラム像投影方法を説明するフローチャートである。 本発明の第２の実施形態に係るホログラム像投影装置を模式的に示す全体構成図である。 図３のホログラム像投影装置を用いた本発明の第２の実施形態に係るホログラム像投影方法を説明するフローチャートである。 図４のホログラム像投影方法における第２の仮想像の（ａ）順光線追跡、（ｂ）逆光線追跡による生成方法を説明する図である。 図５の方法により、（ａ）順光線追跡、（ｂ）逆光線追跡によって生成された第２の仮想像を示す図である。 図４のホログラム像投影方法の変形例を説明する図であり（ａ）対物レンズの焦点面に基準面を一致させた状態、（ｂ）対物レンズの焦点面を基準面から深さ方向にずらした状態、（ｃ）Ｚｅｒｎｉｋｅ係数を調節して対物レンズの焦点位置を基準面に一致させた状態をそれぞれ模式的に示す図である。

本発明の第１の実施形態に係るホログラム像投影装置およびホログラム像投影方法について、図１および図２を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るホログラム像投影装置１は、顕微鏡システムであって、図１に示されるように、レーザ光を発生する光源装置２と、該光源装置２から入射されたレーザ光を標本Ａに照射する顕微鏡装置３と、光源装置２から顕微鏡装置３に入射させるレーザ光の波面を調節する調節装置４とを備えている。

光源装置２は、レーザ光を発生するレーザ光源５と、該レーザ光源５から発せられたレーザ光をコリメート光に変換するコリメータレンズ６と、コリメート光からなるレーザ光の波面を変調する波面変調部７と、リレーレンズ８，１０と、レーザ光を走査するスキャナ９とを備えている。
波面変調部７は、レーザ光を反射するプリズム１１と、該プリズム１１により反射されたレーザ光を反射し、その際に、位相パターンによりレーザ光の波面を変調してプリズム１１に戻す反射型の波面変調素子１２とを備えている。

プリズム１１により反射されたレーザ光は波面変調素子１２によって同じプリズム１１に戻るように光路が折り返され、レーザ光源５からのレーザ光と同軸の光路に戻されるようになっている。
波面変調素子１２は、後述する調節装置４によって、その表面形状を任意に変化させることができるセグメントタイプのＭＥＭＳミラーによって構成されている。この場合、ＭＥＭＳミラーの各セグメントの凹凸により形成される表面形状が、レーザ光の波面を変調するための位相パターンとなる。波面変調素子１２と対物レンズ１３の入射瞳位置とは、光学的に共役な位置関係に配置されている。

スキャナ９は、相互に交差する方向に配置された軸線回りに揺動可能な２枚のガルバノミラー９ａ，９ｂを近接して配置した、いわゆる近接ガルバノミラーであり、入射されるレーザ光を２次元的に走査することができるようになっている。

顕微鏡装置３は、ステージ１４上に配置した標本Ａに対し、レーザ光を集光させる一方、標本Ａからの光を受光する対物レンズ１３と、該対物レンズ１３により受光された光を検出する光電子増倍管からなる光検出器１５と、標本Ａにおける蛍光像を撮影するＣＣＤ等のカメラ１６と、光検出器１５またはカメラ１６への光路を切り替えるように光路に挿脱されるミラー１７とを備えている。符号１８〜２０は集光レンズ、符号２１はダイクロイックミラーである。対物レンズ１３は、既知の全系に係る特性データを有し、ステージ１４との間の光軸方向の距離を変更可能に設けられている。ここで、対物レンズ１３の全系の特性データとしては、対物レンズ１３の全系の焦点距離、開口数、入射瞳の径等がある。

波面変調素子１２における表面形状を平坦な反射面形状に設定しておくことにより、平面波からなる波面を有するレーザ光を対物レンズ１３の入射瞳位置に入射させることができる。これによって、該対物レンズ１３の焦点面にレーザ光を集光させることができるようになっている。
ミラー１７を光検出器１５側（破線で示す光路から取り外された位置）に切り替えた状態で、レーザ光源５からレーザ光を出射させ、スキャナ９を駆動して、標本Ａ内の焦点面に集光しているレーザ光を２次元的に走査させつつ、各集光位置において発生した蛍光を光検出器１５によって検出することにより、対物レンズ１３の焦点面に沿って広がる標本Ａの２次元的な蛍光像を取得することができるようになっている。

そして、対物レンズ１３とステージ１４との距離を相対的に移動させて、対物レンズ１３の焦点面の位置を変化させながら２次元的な蛍光像（スライス画像）を複数取得していくことにより、標本Ａの３次元的な蛍光像を取得することができるようになっている。

調節装置４は、図１に示されるように、対物レンズ１３の全系の特性データおよび標本Ａの屈折率を記憶する記憶部２２と、標本Ａにおけるレーザ光の集光点の３次元位置情報を設定する入力部（位置情報設定部）２３と、入力部２３により設定された各集光点の位置情報、記憶部２２に記憶されている対物レンズ１３の全系の特性データおよび標本Ａの屈折率に基づいて各集光点に対応する、対物レンズ１３の入射瞳位置における波面を算出する波面算出部２４と、全ての集光点について算出された波面を合成する波面合成部２５と、該波面合成部２５により合成された合成波面に基づいて波面変調素子１２に付与する位相パターンを設定する位相パターン設定部２６とを備えている。

入力部２３は、観察者がレーザ光を集光させたい位置、すなわち集光点をモニタ（図示略）上において指定することにより、各集光点の３次元的な位置情報を設定するようになっている。ここで、各集光点の深さ方向の位置情報は、標本Ａの所定の深さの面を基準面としたときの該基準面からの相対的な深さ情報として設定されるようになっている。この基準面は、好ましくは標本Ａに対して対物レンズ１３を所定の位置に固定したときの対物レンズ１３の焦点面に設定されるが、これに限定されるものではない。
また、標本Ａにおける集光点は、任意の位置に設定される場合と、光刺激に応答する位置に設定される場合とがある。集光点を光刺激に応答する位置に設定したい場合には、観察者が集光点を指定しやすいように、モニタ（図示略）が顕微鏡装置３により取得された２次元画像又は３次元画像を表示していることが好ましい。

波面算出部２４は、設定された各集光点について、入力部２３から設定された位置情報と、記憶部２２に記憶されている対物レンズ１３の全系の特性データおよび標本Ａの屈折率とを用いて、各集光点に対応する波面を算出する。
具体的には、集光点について設定された位置情報によって特定される位置に点光源を仮定し、該点光源から対物レンズ１３の入射瞳位置まで、標本Ａの屈折率および対物レンズ１３の全系の特性データを用いて、レーザ光の逆光線追跡を行うことにより波面を算出するようになっている。基準面である焦点面上に配される集光点については、入射瞳位置における波面は、基準面内における集光点の位置に応じて対物レンズ１３の光軸に対する角度を異ならせた平面波である。
波面合成部２５は、全ての集光点について算出された波面を合成するようになっている。本実施形態では、波面合成部２５は、全ての集光点について算出された波面の線形和を算出するようになっている。

位相パターン設定部２６は、対物レンズ１３の入射瞳位置において得られた合成波面に基づいて、波面変調素子１２に付与すべき位相パターンを設定し、波面変調素子１２に出力するようになっている。ここで、波面変調素子１２は、対物レンズ１３の入射瞳と共役な関係にあるため、波面変調素子１２に付与される位相パターンは、対物レンズ１３の入射瞳位置における合成波面と同一か又は位相ラッピング処理したものとなっている。位相ラッピング処理は、波面変調素子１２における位相変調の範囲が２ｎπ（ｎは整数）に設定されている場合に、対物レンズ１３の入射瞳位置における合成波面のうち２ｎπを超える位相差を有する部分について、その位相差から２ｎπを差し引くことにより行われる。本実施形態におけるセグメントタイプのＭＥＭＳミラーでは、通常は位相変調の範囲が２ｎπの範囲に設定されているので、必要に応じて位相ラッピング処理が行われる。

このようにして、波面変調素子１２が、入力された位相パターンに合わせた表面形状となるように調節される。これにより、波面変調素子１２において反射されたレーザ光は、波面変調素子１２の表面において対物レンズ１３の入射瞳位置において得られた合成波面と同一の波面を有するように変調される。したがって、そのようなレーザ光が対物レンズ１３によって集光されることにより、対物レンズ１３を固定したままの状態で、設定された各集光点に同時に集光されるようになっている。

このように構成された本実施形態に係るホログラム像投影装置１を用いて標本Ａ内の深さの異なる複数の位置に同時にレーザ光を集光させるようなホログラム像を投影するホログラム像投影方法について説明する。
まず、図２に示されるように、入力部２３において、各集光点の位置情報が設定される（ステップＳ１）。

ここで、集光点が標本Ａにおいて光刺激に応答する位置に設定される場合には、調節装置４からの出力によって、波面変調素子１２を平坦な反射面形状となる位相パターンに設定する。顕微鏡装置３においては、光路上からミラー１７を退避させておく。そして、レーザ光源５からレーザ光を発生させ、スキャナ９によってレーザ光を２次元的に走査する。

レーザ光源５から発せられたレーザ光は波面を変化させることなく光路を伝播されて、スキャナ９によって２次元的に走査された後、ダイクロイックミラー２１によって反射されて対物レンズ１３に入射され標本Ａ内の焦点面に集光される。レーザ光の集光位置においては蛍光が発生し、発生した蛍光は対物レンズ１３によって受光され、ダイクロイックミラー２１を透過して集光レンズ１８，１９により集光され、光検出器１５によって検出される。

蛍光は対物レンズ１３の焦点面近傍の極めて薄い領域のみにおいて発生するので、光検出器１５より検出された蛍光の強度と、スキャナ９によるレーザ光の走査位置とを対応づけて記憶しておくことにより、焦点面に沿って広がる標本Ａの蛍光像（スライス画像）を取得することができる。対物レンズ１３と標本Ａとを光軸方向に相対的に移動させつつ、複数枚のスライス画像を取得することにより、３次元的な蛍光画像を取得することができる。

観察者は、図示しないモニタに表示された３次元的な蛍光画像において、レーザ光を集光させたい集光点の位置を指定する。例えば、標本Ａが神経細胞であって、レーザ光による刺激を与えて挙動の観察を行う場合において、刺激を与えたい集光点は３次元的に分布している。この場合、観察者は、全ての集光点を指定することにより、集光点の３次元的な位置情報を設定する。

標本Ａに対して対物レンズ１３を固定することにより、対物レンズ１３の焦点面が標本Ａに対して固定される。集光点の位置情報のうち、深さ情報については、標本Ａの所定の深さの面を基準面としたときの該基準面からの深さ方向の相対的な距離を設定する。この基準面は、例えば、対物レンズ１３の焦点面に設定される。
その一方で、集光点が標本Ａにおける任意の位置に設定される場合には、このような３次元的な蛍光画像の取得は必要ない。

次に、波面算出部２４においては、入力部２３により設定された位置情報、記憶部２２に記憶されている対物レンズ１３の全系の特性データおよび標本Ａの屈折率を用いて、逆光線追跡が行われ、各集光点に仮定された点光源から発生したレーザ光の対物レンズ１３の入射瞳位置における波面が算出される（ステップＳ２）。

全ての集光点について対物レンズ１３の入射瞳位置における波面が算出されると、波面合成部２５によって波面の線形和が算出され、合成波面が生成される（ステップＳ３）。生成された合成波面は、位相パターン設定部２６に入力されて、波面変調素子１２に付与する位相パターンが対物レンズ１３の入射瞳位置における合成波面と同一か又は位相ラッピング処理したパターンとなるように設定される（ステップＳ４）。そして、位相パターン設定部２６により設定された位相パターンは、波面変調素子１２に対して出力される。
これにより、標本Ａに対して光刺激を行いながら観察するための準備が完了する。

この状態で、顕微鏡装置３においては、ミラー１７を光路上に挿入し（図中、実線で示す位置に配置し）、対物レンズ１３によって集光される蛍光が、集光レンズ２０によって集光され、カメラ１６によって撮影されるように設定しておく。そして、スキャナ９を原点位置に停止した状態で、レーザ光源５から発せられたレーザ光を波面変調部７に入射させると、波長変調素子１２に表示されている位相パターンに従ってレーザ光の波面が変調される。変調されたレーザ光は、リレーレンズ８、スキャナ９およびリレーレンズ１０を通過してダイクロイックミラー２１により反射され、対物レンズ１３の入射瞳に入射される（ステップＳ５）。

対物レンズ１３の入射瞳位置は波面変調素子１２と光学的に共役な位置に配置されているので、入射瞳位置に入射されるレーザ光は、波面変調素子１２により変調された時点における波面と同じ波面を有している。
そして、このようなレーザ光が対物レンズ１３によって集光されることにより、深さ方向に異なる位置に配置されている複数の集光点に同時に集光させるような３次元的なホログラム像を標本Ａ内に投影することができる。

指定された複数の集光点に同時にレーザ光が照射されることにより、標本Ａに刺激が与えられた状態で、標本Ａから発せられる蛍光が対物レンズ１３によって受光され、ダイクロイックミラー２１を透過して、ミラー１７により反射され、集光レンズ２０によって集光されてカメラ１６により撮影される。これにより、光刺激を与えたときの標本Ａの蛍光画像を取得することができる。

このように、本実施形態に係るホログラム像投影装置１およびホログラム像投影方法によれば、標本Ａの深さ方向に異なる位置に配置される複数の注目部位に、同時にレーザ光を集光させることができる。この結果、集光点が標本Ａにおいて光刺激に応答する位置に設定されている場合には、光刺激直後に発生する標本Ａの挙動を時間差なく正確に観察することができるという利点がある。

なお、本実施形態においては、波面合成部２５における波面の合成は、波面の線形和を算出することによって行われていたが、これに代えて、各集光点について算出された複数の波面を領域分割したものを集光点の総数の逆数の割合で配列することにより行うこととしてもよい。

具体的には、集光点の総数がｎ個の場合、各集光点について算出した波面の線形和を算出せずに、波長変調素子１２上の領域を分割し、分割された各領域に対して複数の集光点のいずれかを対応付ける。このとき、各集光点の対応領域が集光点の総数ｎの逆数の割合で周期的に分布するように、対応付けを行うことが好ましい。また、各集光点の対応領域の分布は、モザイク状であってもよいし、同心円状であってもよい。このような対応付けをした上で、予め算出された各集光点からの波面のうち、波長変調素子１２上での対応領域と重なる部分の波面要素を抽出し、抽出された波面要素を全領域にわたって配列して波面を合成する。このようにして得られた合成波面に基づいて、波長変調素子１２に付与する位相パターンが設定される。

本発明の第２の実施形態に係るホログラム像投影装置およびホログラム像投影方法について、図３〜図７を参照して以下に説明する。
なお、本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係るホログラム像投影装置およびホログラム像投影方法と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

第１の実施形態においては、設定された各集光点から対物レンズ１３の入射瞳位置まで逆光線追跡を行うことにより波面を生成することとしたが、本実施形態においては、これに代えて、各集光点から所定の基準面まで順光線追跡を行ってスポット像を求め、これを変換することにより波面を生成することとしている。

本実施形態に係るホログラム像投影装置１００は、図３に示されるように、調節装置４の構成が、第１の実施形態とは異なる。すなわち、調節装置４は、対物レンズ１３の全系の特性データおよび標本Ａの屈折率を記憶する記憶部２２と、標本Ａにおけるレーザ光の集光点の３次元位置情報を設定する入力部（位置情報設定部）２３と、入力部２３により設定された各集光点の位置情報、記憶部２２に記憶されている対物レンズ１３の全系の特性データおよび標本Ａの屈折率に基づいて、各集光点を所定の基準面に投影した仮想像を生成する仮想像生成部２７と、生成された仮想像をフーリエ変換して対物レンズ１３の入射瞳位置における波面を算出する波面算出部２８と、該波面算出部２８により算出された波面に基づいて波面変調素子１２に付与する位相パターンを設定する位相パターン設定部２６とを備えている。
ここで、波面算出部２８は、記憶部２２に記憶されている対物レンズ１３の全系の特性データおよび標本Ａの屈折率を用いて、仮想像生成部２７により生成された仮想像をフーリエ変換している。

このように構成された本実施形態に係るホログラム像投影装置１００を用いて標本Ａ内の深さの異なる複数の位置に同時にレーザ光を集光させるようなホログラム像を投影するホログラム像投影方法について説明する。

まず、図４に示されるように、入力部２３において、各集光点の基準面内における平面的な位置情報が設定される（ステップＳ１１）。
次いで、仮想像生成部２７において、入力部２３により設定された各集光点の基準面内における平面的な位置情報に基づいて、基準面に対して深さ方向に異なる位置に配置されている全ての集光点が、基準面上に集光してスポットを形成していると仮定したときの第１の仮想像が生成される（ステップＳ１２）。第１の仮想像の生成は、任意の基準面において取得された１枚のスライス画像のみを用いて各集光点を指定することにより行う。この基準面は、好ましくは対物レンズ１３の焦点面に設定されるが、これに限定されるものではない。このように、第１の仮想像の生成においては、集光点の実際の深さ情報が用いられていないため、第１の仮想像は、現実のスポット像を反映しているのではなく、全ての集光点が基準面にあると仮定したときのスポット像となっている。

次に、各集光点における基準面からの深さ情報を入力部２３から入力する（ステップＳ１３）。
そして、仮想像生成部２７において、基準面と異なる位置に集光している集光点に対応するスポットについて、入力部２３により設定された深さ情報を追加する補正を行うことにより、基準面における第２の仮想像が生成される（ステップＳ１４）。この後に、生成された第２の仮想像をフーリエ変換して、第２の仮想像におけるスポットを投影可能な、対物レンズ１３の入射瞳位置における波面が算出される（ステップＳ１５）。そして、算出された波面は、位相パターン設定部２６に入力されて、波面変調素子１２に付与する位相パターンが対物レンズ１３の入射瞳位置における波面と同一か又は位相ラッピング処理したパターンとなるように設定される（ステップＳ１６）。そして、位相パターン設定部２６により設定された位相パターンは、波面変調素子１２に対して出力される。この状態でレーザ光源５からレーザ光を発生させて波面変調部７に入射させると、波長変調素子１２の位相パターンに従ってレーザ光の波面が変調される。変調されたレーザ光は、リレーレンズ８、スキャナ９、リレーレンズ１０およびダイクロイックミラー２１を介して、対物レンズ１３により標本に集光して照射される（ステップＳ１７）。

第２の仮想像を生成する方法は、図５に示されるように、基準面Ｑ上に存在しない集光点Ｐに点光源を仮定して、当該点光源から基準面Ｑまで（ａ）順光線追跡または（ｂ）逆光線追跡することにより、基準面Ｑ上における新たなスポットＲ１，Ｒ２を構成する波面を算出する。得られる波面においては、図６に示されるように、（ａ）順光線追跡の場合のスポットＲ１と（ｂ）逆光線追跡の場合のスポットＲ２とでは、波面に含まれる深さ情報が反転している。基準面Ｑ上に存在しているスポットＲについては補正を施さない。

また、第２の仮想像を生成する他の方法としては、まず、図７（ａ）に示されるように、標本Ａに対して対物レンズ１３を固定して基準面Ｑ上にレーザ光を集光させて蛍光画像を取得する。次いで、図７（ｂ）に示されるように、対物レンズ１３を光軸方向にΔｄだけ移動させる。これにより、集光点Ｐが基準面Ｑからずれるので、蛍光像の光量は変化する。この状態で、図７（ｃ）に示されるように、対物レンズ１３の焦点面Ｑにおける収差を表すベクトル情報であるＺｅｒｎｉｋｅ多項式の第４項の係数Ｚ_４を連続的に変化させたときの蛍光像の光量を観察し、最初の光量と同一の光量が得られるような係数Ｚ_４の値を決定する。そして、このときの係数Ｚ_４の変化量をΔＺとして、比例係数Ｋ＝ΔＺ／Δｄを算出する。これにより、算出された比例係数Ｋと、基準面Ｑから集光点Ｐまでの深さ情報とに基づいて、Ｚｅｒｎｉｋｅ係数Ｚ_４及び対物レンズ１３の入射瞳位置（図６中に黒塗りの三角形で示す位置）における波面Ｗを算出する。

なお、Ｚｅｒｎｉｋｅ多項式である波面の形状を与える円筒関数ｗ（ｒ，θ）は、次式で示される。すなわち、
ｗ（ｒ，θ）＝Ｚ1
＋Ｚ2・ρｃｏｓθ
＋Ｚ3・ρｓｉｎθ
＋Ｚ4・（２ρ²−１）
＋Ｚ5・ρ²ｃｏｓ２θ
＋Ｚ6・ρ²ｓｉｎ２θ
＋Ｚ7・（３ρ²−２）ρｃｏｓθ
＋Ｚ8・（３ρ²−２）ρｓｉｎθ
・・・
である。ここで、ρは、対物レンズ１３における入射瞳の瞳中心からの半径で規格化したときの瞳中心からの距離であり、θは、波面変調素子１２の面上又は対物レンズ１３の入射瞳面上における極座標による所定の基準線に対する角度を示す。Ｚｎは、Ｚｅｒｎｉｋｅ係数である。

また、対物レンズ１３の入射瞳位置における波面Ｗは、Ｚｅｒｎｉｋｅ多項式のデフォーカス項である第４項を用いて、
Ｗ＝Ｚ_４×（２ρ^２−１）
と表すことができる。また、Ｚｅｒｎｉｋｅ係数Ｚ_４は、
Ｚ_４＝Ｋ×ｄ
と表すことができる。
ここで、ｄは、入力部２３において設定された、基準面Ｑから集光点Ｐまでの深さ情報である。

このようにして波面Ｗが求められた後に、この波面のレーザ光を対物レンズ１３の入射瞳位置に入射させた場合の基準面Ｑにおける波面を求め、第１の仮想像における対応するスポットをこの波面に置き換えることにより補正する。基準面Ｑに対して深さ方向にずれている全ての集光点Ｐについて同じ作業を繰り返すことにより、第２の仮想像が生成される。

なお、本実施形態においては、全ての集光点が基準面上に集光していると仮定したときの第１の仮想像を生成した上で、深さ情報に基づいて補正した第２の仮想像を生成することとしていたが、これに代えて、集光点の３次元位置情報に基づいて各集光点を所定の基準面に投影した仮想像を１回で生成することとしてもよい。この場合、入力部２３においては、各集光点の３次元的な位置情報が設定される。また、仮想像生成部２７は、その３次元的な位置情報、記憶部２２に記憶されている対物レンズ１３の全系の特性データおよび標本Ａの屈折率に基づいて、各集光点を所定の基準面に投影した仮想像を生成する。

また、上記第１および第２の実施形態においては、波面変調素子１２として、その表面形状を変化させるセグメントタイプのＭＥＭＳミラーを例示したが、これに代えて、他の任意の波面変調素子１２、例えば、液晶素子、デフォーマブルミラー等でもよい。液晶素子の場合は、液晶分子の配向による屈折率の分布が位相パターンとなり、デフォーマブルミラーの場合は、その表面形状が位相パターンとなる。

Ａ 標本
Δｄ 所定距離
Ｐ 集光点
Ｑ 基準面
Ｒ，Ｒ１，Ｒ２ スポット
ΔＺ ベクトル情報の変化量
Ｓ１，Ｓ１１ 位置情報を設定するステップ
Ｓ２ レーザ光の入射瞳位置における波面を算出するステップ
Ｓ３ 合成波面を算出するステップ
Ｓ４，Ｓ１６ 位相パターンを設定するステップ
Ｓ５ レーザ光を標本に集光するステップ
Ｓ１２ 第１の仮想像を生成するステップ
Ｓ１４ 第２の仮想像を生成するステップ
１，１００ ホログラム像投影装置
１２ 波面変調素子
１３ 対物レンズ
２３ 入力部（位置情報設定部）
２４ 波面算出部
２５ 波面合成部
２６ 位相パターン設定部

Claims (9)

1. 対物レンズを介してレーザ光を集光すべき複数の集光点の標本内における３次元的な位置情報を設定する位置設定ステップと、
   設定された各集光点の前記標本内における前記位置情報、前記標本の屈折率および前記対物レンズの全系の特性データを用いて、設定された位置に仮定された各前記集光点から前記対物レンズの入射瞳位置までの逆光線追跡を行って、各前記集光点からの前記レーザ光の前記入射瞳位置における波面を算出する波面算出ステップと、
   各前記集光点に対応して算出された複数の波面を合成して合成波面を算出する波面合成ステップと、
   算出された前記合成波面に基づいて波面変調素子に付与する位相パターンを設定する位相パターン設定ステップと、
   設定された前記位相パターンを前記波面変調素子に付与して前記レーザ光を入射させ、前記位相パターンによって波面が変調された前記レーザ光を、前記対物レンズを介して標本に集光する集光ステップとを含むホログラム像投影方法。
2. 前記波面合成ステップが、前記複数の波面の線形和を算出することにより前記合成波面を算出するステップである請求項１に記載のホログラム像投影方法。
3. 前記波面合成ステップが、前記複数の波面をそれぞれ領域分割したものを前記集光点の数の逆数の割合で配列することにより前記合成波面を算出するステップである請求項１に記載のホログラム像投影方法。
4. 対物レンズを介してレーザ光を集光すべき複数の集光点の標本内における３次元的な位置情報を設定する位置設定ステップと、
   設定された各集光点の前記標本内における前記位置情報を用いて、各前記集光点を標本内の所定の基準面上に投影した仮想像を生成する仮想像生成ステップと、
   生成された前記仮想像を、前記標本の屈折率および前記対物レンズの全系の特性データを用いてフーリエ変換して、前記レーザ光の前記対物レンズの入射瞳位置における波面を算出する波面算出ステップと、
   算出された前記波面に基づいて波面変調素子に付与する位相パターンを設定する位相パターン設定ステップと、
   設定された前記位相パターンを前記波面変調素子に付与して前記レーザ光を入射させ、前記位相パターンによって波面が変調された前記レーザ光を、前記対物レンズを介して標本に集光する集光ステップとを含むホログラム像投影方法。
5. 前記位置設定ステップが、前記複数の集光点の前記標本内における平面的な位置情報を設定する平面位置設定ステップと、各集光点の前記基準面に対する深さ情報を設定する深さ情報設定ステップとを含み、
   前記仮想像生成ステップが、各前記集光点の前記標本内における平面的な位置情報を用いて、各前記集光点が標本内の所定の基準面上に集光して複数のスポットを形成していると仮定したときの第１の仮想像を生成する第１仮想像生成ステップと、設定された各前記集光点の深さ情報に基づいて前記第１の仮想像内の対応するスポットを補正して第２の仮想像を生成する第２仮想像生成ステップとを含む請求項４に記載のホログラム像投影方法。
6. 前記第２仮想像生成ステップが、前記第１の仮想像内の前記スポットを、各集光点に集光するレーザ光を前記基準面まで光線追跡して得られる前記レーザ光のスポットに置き換えることにより、前記第１の仮想像内の対応するスポットを補正するステップである請求項５に記載のホログラム像投影方法。
7. 前記第２仮想像生成ステップが、対物レンズの焦点位置を前記基準面から光軸方向に所定距離だけずらすように対物レンズを配置した状態で、前記基準面上に集光するように、対物レンズの焦点面における収差を表すベクトル情報を変化させたときのベクトル情報の変化量を前記所定距離で除算して比例係数を算出するステップと、各スポットについて前記比例係数と前記深さ情報とを乗算して得られたベクトル情報を用いて前記スポットを補正するステップとを含む請求項５に記載のホログラム像投影方法。
8. 位相パターンによりレーザ光の波面を変調する波面変調素子と、
   該波面変調素子により変調された前記レーザ光を標本に集光する対物レンズと、
   前記対物レンズを介して前記レーザ光を集光すべき複数の集光点の標本内における３次元的な位置情報を設定する位置情報設定部と、
   該位置情報設定部により設定された各集光点の前記標本内における前記位置情報、前記標本の屈折率および前記対物レンズの全系の特性データを用いて、設定された位置に仮定された各前記集光点から前記対物レンズの入射瞳位置までの逆光線追跡を行って、各前記集光点からの前記レーザ光の前記入射瞳位置における波面を算出する波面算出部と、
   該波面算出部により各前記集光点に対応して算出された複数の波面を合成して合成波面を算出する波面合成部と、
   算出された前記合成波面に基づいて前記波面変調素子に付与する前記位相パターンを設定する位相パターン設定部とを備えるホログラム像投影装置。
9. 位相パターンによりレーザ光の波面を変調する波面変調素子と、
   該波面変調素子により変調された前記レーザ光を標本に集光する対物レンズと、
   前記対物レンズを介して前記レーザ光を集光すべき複数の集光点の標本内における３次元的な位置情報を設定する位置情報設定部と、
   該位置情報設定部により設定された各集光点の前記標本内における前記位置情報を用いて、各前記集光点を標本内の所定の基準面上に投影した仮想像を生成する仮想像生成部と、
   該仮想像生成部により生成された前記仮想像を、前記標本の屈折率および前記対物レンズの全系の特性データを用いてフーリエ変換して、前記レーザ光の前記対物レンズの入射瞳位置における波面を算出する波面算出部と、
   算出された前記波面に基づいて前記波面変調素子に付与する前記位相パターンを設定する位相パターン設定部とを備えるホログラム像投影装置。

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