JP2011196879A - 標的生体分子の検出方法及びキット - Google Patents

Abstract

【課題】 化学合成可能なアプタマーを用いて、生体分子を感度良く、簡便に検出することを課題とする。
【解決手段】
反応セル１内に設けられた第１電極２にアプタマーとして機能する第1の核酸鎖２１が固定化され、第２の電極３に比較対象とする第２の核酸鎖２２が固定化された装置に、標的生体分子４１を含むサンプル溶液を供給し、さらに核酸鎖２１の相補鎖である第６の核酸鎖２６を供給の後、第１、第２の電極２、３からの信号量の差分を求めることにより標的生体分子４１の検出を行う方法である。
【選択図】 図４

Description

生体分子を検出する方法及びキットに関する。

近年、腫瘍マーカーに代表されるような、疾病に関連する生体分子を容易にモニターする方法が求められている。一般的にタンパク質を始めとする生体分子は、抗原抗体反応を利用したセンシングを行うことが知られている。実際の医療現場においても、抗原抗体反応を原理とするイムノクロマトグラフィキットが用いられている。抗原抗体反応を利用する場合、抗原を検出するには抗体を、抗体を検出するには抗原を、生物学的にセンサーとして準備する必要がある。しかしながら、いずれもマウスやうさぎ等の生体に免疫して生物学的に生成する必要があり、大量生産や品質バラツキが発生する恐れがある。

近年、抗原抗体反応と同じように、タンパク質を始めとする生体分子を認識し、特異的に結合する核酸分子であるアプタマーが知られてきている。アプタマーは、核酸分子であるため、化学合成が可能であり、品質管理された物質を、工業的に大量生産することが出来る。従って、アプタマーを用いて、必要な生体分子を容易に検出することができれば有用であると考えられる。

特許文献１には、アプタマーを用いた生体分子の検出方法が開示されている。ところが、いずれの場合も、蛍光標識・誘電体・インターカレーターにより、事前にアプタマーが標識されていることが必要であり、これらの物質により、標的生体分子との相互作用に影響を受けてしまい、検出が困難であったり、検出感度が低下してしまう危険性があった。

特開２００８−２７８８３７号

本発明は、化学合成可能なアプタマーを用いて、生体分子を感度良く、簡便に検出する装置及び方法を提供することを課題とする。

本発明の第１の標的生体分子の検出方法は、反応セルと、前記反応セル内に設けられた第１及び第２の電極と、前記第１の電極に一端が固定化され、標的生体分子に対してアプタマーとして機能し、前記標的生体分子と結合可能な第１の核酸鎖と、前記第２の電極に一端が固定化され、前記標的生体分子に対してアプタマーとして機能しない第２の核酸鎖と、を具備する装置を準備する工程と、前記反応セルに、前記第１、第２の核酸鎖及びそれらの相補鎖と二本鎖を形成しない第３の核酸鎖と、前記第２の核酸鎖と二本鎖を形成している領域及び前記第３の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第４の核酸鎖、を供給する工程と、前記標的生体分子を含む可能性のあるサンプル溶液を供給し、前記標的生体分子と前記第1の核酸鎖が結合する条件下におく工程と、前記反応セルに、前記第１乃至第４の核酸鎖とは二本鎖を形成しない第５の核酸鎖と、前記第１核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第５の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第６の核酸鎖と、を供給し、前記標的生体分子と結合しなかった前記第１の核酸鎖と前記第６の核酸鎖の前記一本鎖領域とが二本鎖を形成する条件下におく工程と、前記第１の電極から、前記第１の核酸鎖及び前記第５の核酸鎖と、前記第６の核酸鎖間で形成される二本鎖に由来する第１の電気化学信号、及び、前記第２の電極から前記第２の核酸鎖及び前記第３の核酸鎖と、前記第４の核酸鎖間で形成される二本鎖に由来する第２の電気化学的信号を検出する工程と、 前記第１の電気化学的信号と、前記第２の電気化学的信号との差分から、前記標的生体分子の量を算出する工程とを行うことを特徴とする。前記反応セルに、前記第３の核酸鎖と、前記第４の核酸鎖、を供給する前記工程と、前記標的生体分子を含む可能性のあるサンプル溶液を供給し、前記標的生体分子と前記第1の核酸鎖が結合する条件下におく前記工程とは同時に行われても良い。

また、本発明の第２の標的核酸の検出方法は、反応セルと、前記反応セル内に設けられた第１及び第２の電極と、前記第１の電極に一端が固定化され、標的生体分子に対してアプタマーとして機能し、前記標的生体分子と結合可能な第１の核酸鎖と、前記第２の電極に一端が固定化され、前記標的生体分子に対してアプタマーとして機能しない第２の核酸鎖と、前記第１、第２の核酸鎖及びそれらの相補鎖と二本鎖を形成しない第３の核酸鎖と、前記第２の核酸鎖と二本鎖を形成している領域及び前記第３の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第４の核酸鎖、を具備する装置を準備する工程と、前記標的生体分子を含む可能性のあるサンプル溶液を供給し、前記標的生体分子と前記第1の核酸鎖が結合する条件下におく工程と、前記反応セルに、前記第１乃至第４の核酸鎖とは二本鎖を形成しない第５の核酸鎖と、前記第１核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第５の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第６の核酸鎖と、を供給し、前記標的生体分子と結合しなかった前記第１の核酸鎖と前記第６の核酸鎖の前記一本鎖領域とが二本鎖を形成する条件下におく工程と、前記第１の電極から、前記第１の核酸鎖及び前記第５の核酸鎖と、前記第６の核酸鎖間で形成される二本鎖に由来する第１の電気化学信号、及び、前記第２の電極から前記第２の核酸鎖及び前記第３の核酸鎖と、前記第４の核酸鎖間で形成される二本鎖に由来する第２の電気化学的信号を検出する工程と、前記第１の電気化学的信号と、前記第２の電気化学的信号との差分から、前記標的生体分子の量を算出する工程とを行うことを特徴とする。前記第２の核酸鎖と前記第３の核酸鎖とが連結していてもよい。

上記の第１及び第２の標的核酸の検出方法において、前記第１及び第２の電気化学的信号を検出する工程は、前記反応セルに二本鎖特異的に結合する挿入剤溶液を供給し、前記反応性セル内の二本鎖に挿入剤を結合させる工程と、前記挿入剤が酸化もしくは還元反応することにより発生する電気化学信号を前記第１の電極及び第２の電極で各々検出する工程を行うことが望ましい。

また、本発明の第１の標的生体分子検出用キットは、反応セルと、前記反応セル内に設けられた第１及び第２の電極と、前記第１の電極に固定化され、標的生体分子に対してアプタマーとして機能し、前記標的生体分子と結合可能な第１の核酸鎖と、前記第２の電極に一端が固定化され、前記標的生体分子に対してアプタマーとして機能しない第２の核酸鎖と、を具備する装置と、前記第１、第２の核酸鎖及びそれらの相補鎖と二本鎖を形成しない第３の核酸鎖と、前記第２の核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第３の核酸鎖と二本鎖を形成している領域とを有する第４の核酸鎖と、前記第１乃至第４の核酸鎖とは二本鎖を形成しない第５の核酸鎖と、前記第１核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第５の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第６の核酸鎖と、を具備することを特徴とする。

本発明の第２の標的生体分子検出用キットは、反応セルと、前記反応セル内に設けられた第１及び第２の電極と、前記第１の電極に一端が固定化され、標的生体分子に対してアプタマーとして機能し、前記標的生体分子と結合可能な第１の核酸鎖と、前記第２の電極に一端が固定化され、前記標的生体分子に対してアプタマーとして機能しない第２の核酸鎖と、前記第１、第２の核酸鎖及びそれらの相補鎖と二本鎖を形成しない第３の核酸鎖と、前記第２の核酸鎖と二本鎖を形成している領域及び前記第３の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第４の核酸鎖と、を具備する装置と、前記第１乃至第４の核酸鎖とは二本鎖を形成しない第５の核酸鎖と、前記第１核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第５の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第６の核酸鎖と、を具備することを特徴とする。前記第２の核酸鎖と前記第３の核酸鎖とが連結していても良い。

上記第１及び第２のキットにおいて、さらに二本鎖特異的に結合する挿入剤溶液を具備するものであることが望ましい。

本発明によれば、アプタマーを用いて、生体分子を感度よく、簡便に検出することが可能となる。

本実施形態の方法を示す模式図。 本実施形態の方法を示す模式図。 本実施形態の方法を示す模式図。 本実施形態の方法を示す模式図。 本実施形態の方法を示す模式図。 本実施形態の方法を示す模式図。 本実施形態の方法を示す模式図。 本実施形態の方法を示す模式図。 本実施形態の方法を示す模式図。 本実施形態の方法を示す模式図。 本実施形態の方法を示す模式図。 本実施形態の方法による検出電極からの信号値と標的生体分子の結合割合の関係図。 実施例の方法による検出結果を示す特性図。

本発明は、生体分子に特異的に結合するアプタマーをプローブとして、サンプル中の標的生体分子を電気化学的に検出する方法にかかわる。

本明細書において、アプタマーとは、特定の生体分子と特異的な結合する機能を持った核酸分子である。前記核酸分子としては、DNAまたはRNA、PNAなどが挙げられる。

標的とする生体分子としては、タンパク質、細胞、細胞組織、微生物、ウィルス、細菌、毒素などがある。
以下、図面を参照しながら本発明の方法の好適な実施形態について説明する。

＜第１工程＞
まず、電気化学的に標的生体分子を検出するための装置を準備する。図１は本実施形態に関わる装置の模式図である。装置は、サンプル溶液をアプタマーと反応させるための反応セル１を備えている。同一の反応セル１内には標的生体分子の検出用の第１の電極２、及び比較用の第２の電極３が設けられている。第１の電極２には、標的生体分子に対してアプタマーとして機能する第１の核酸鎖２１の一端が固定化されている。第1の核酸鎖２１の配列は標的生体分子の種類に応じて適宜選択される。第２の電極３には、前記標的生体分子に対してアプタマーとして機能しない第２の核酸鎖２２の一端が固定化されている。例えば第１の電極２及び第２の電極３は、金で作られ、第１の核酸鎖２１及び第２の核酸鎖２２の一端は、チオール基で修飾されていることにより核酸鎖の固定化が可能である。

複数の標的生体分子を検出対象とする場合は、反応セル１内に第1の電極２を複数設け、各電極上に、各々標的生体分子に応じたアプタマーを固定化しておけばよい。その場合、異なるアプタマーが固定化された第１の電極１つ毎に、それぞれ１つの第２電極を設けても良いし、異なるアプタマーが固定化された複数の第1の電極毎に、１つの第２の電極を共有しても良い。

なお、第１の電極２と、第２の電極３との間では、物質の移動が可能な状態である。

＜第２工程＞
次に、以下に示す第３の核酸鎖２３と、第４の核酸鎖２４と、を反応セル１内に供給する。図２は第３核酸鎖及び第４核酸鎖を示す模式図である。

第３の核酸鎖２３は、第１及び第２の核酸鎖２１、２２及びそれらの相補鎖の各々と非相補的な配列を有し、それらと二本鎖は形成しない配列である。第４の核酸鎖２４は、第２の核酸鎖２２の少なくとも一部と相補的で、第２の核酸鎖２２と二本鎖を形成可能な配列を有する領域３１と、第３の核酸鎖２３に相補的で第３の核酸鎖２３と二本鎖を形成して結合している領域３２を有する。つまり第３の核酸鎖２３と第4の核酸鎖２４が結合して二本鎖を形成している第１の核酸鎖対１１（部分二本鎖）を反応セル１内に供給する。

図３は第３核酸鎖及び第４核酸鎖を装置に供給したときの様子を示す模式図である。これにより図３に示すように第２の電極３上には第４の核酸鎖２４と、第３の核酸鎖２３との二本鎖、第４の核酸鎖２４と第２の核酸鎖２２との二本鎖が存在することとなる。

すなわち、第２の核酸鎖２２には、第４の核酸鎖２４が結合し二本鎖を形成する。またこの第４の核酸鎖２４の、第２の核酸鎖２２と二本鎖を形成していない領域には第３の核酸鎖２３が結合して二本鎖を形成する。つまり第４の核酸鎖２４は、第２の核酸鎖２２と二本鎖を形成して結合している領域３１と、第３の核酸鎖２３と二本鎖を形成して結合している領域３２を有する。
なお、第１工程の装置を準備する段階で、第２の電極３上の第２の核酸鎖を固定化する際に、第２の核酸鎖２２及び第３の核酸鎖２３と、それと相補的な配列を有する第４の核酸鎖２４が二本鎖となって第２の電極３上に固定化された装置を準備してもよい。この場合は、さらなる第３の核酸鎖２３と、第４の核酸鎖２４を供給する第２工程は不要である。

第２の核酸鎖２２及び第３の核酸鎖２３と、それと相補的な第４の核酸鎖２４の二本鎖となって第２の電極３上に固定化された装置を得るには、あらかじめ第２の核酸鎖２２を固定化後、この核酸鎖に相補的な配列を有する第４の核酸鎖を供給してハイブリダイゼーションさせ、更に第３の核酸鎖２３を供給してハイブリダイゼーションさせることにより得ることができる。 より好ましくは、図２に示すように、第３の核酸鎖２３と第４の核酸鎖２４を領域３１で、二本鎖を形成している第１の核酸鎖対１１をあらかじめ準備しておき、第２の電極３上に固定化されている第２の核酸鎖２２とハイブリダイゼーションさせることにより得ることができる。

＜第３工程＞
次に、反応セル１に、標的生体分子４１を含む可能性のあるサンプル溶液を注入し、前記標的生体分子と前記第1の核酸鎖が結合する条件下におく。

図４は第２の電極上の第２の核酸鎖２２に二本鎖が形成され、第１の核酸２１に、標的生体分子４１が結合した状態を示す模式図である。サンプル溶液中に標的生体分子４１が含まれていた場合、第１の核酸鎖２１はアプタマーとして機能し、図４に示すように、標的生体分子４１は、第１の核酸鎖２１に結合する。

サンプル溶液中に標的生体分子４１が含まれていない場合は、当然のことながら、第１の核酸鎖２１に結合する標的生体分子４１はない。

標的生体分子４１が第１の核酸鎖２１に結合する条件とは、例えば、２５℃で３０分〜1時間程度である。温度を２５℃から３７℃に上げることにより、時間をより短縮することが可能である。但し、標的生体分子がタンパク質である場合には、３７℃を超えると、タンパク質が変性してしまう可能性があるため、好ましくない。

また、第２工程を省略して、第３工程において、サンプル溶液中に、第１の核酸鎖対１１を含有させておいても良い。このようにすることにより、サンプル溶液を反応セル１中に供給したかどうかをモニターすることができる。また、この第３工程は以下に示す第４工程と同時に行われても良い。
＜第４工程＞
次に反応セル１に部分的に二本鎖を形成した第２の核酸鎖対１２を供給する。図５は第２の核酸鎖対１２の模式図である。図６は、第１の核酸鎖２１に標的生体分子４１が結合した場合に、反応セル１に第２の核酸鎖対１２を添加した状態を示す模式図である。図７は、第１の核酸鎖２１に標的生体分子４１が結合しなかった場合に、反応セル１に第２の核酸鎖対１２を添加した状態を示す模式図である。

添加する第２の核酸鎖対１２は、図５に示すような、第５の核酸鎖２５と、前記第１核酸鎖２１と二本鎖を形成可能な一本鎖領域３３及び第５の核酸鎖２５と二本鎖を形成している領域３４を有する第６の核酸鎖２６と、を備える。なお、前記第５の核酸鎖は第１乃至第２の核酸鎖２１、２２、前記第４の核酸鎖の領域３１、前記第６の核酸鎖２６の領域３３とは二本鎖を形成しない配列である。

この第２の核酸鎖対１２を供給後、前記第６の核酸鎖２６の一本鎖領域３３と、前記第１の核酸鎖２１とがハイブリダイゼーションし、第２の核酸鎖対１２における前記第６の核酸鎖２６の一本鎖領域３３と第1の核酸鎖２１とが、二本鎖を形成する条件下におく。

サンプル溶液中に標的生体分子４１が充分量含まれており、第３工程で、第１の核酸鎖２１と標的生体分子４１との結合が生じている場合は、図６に示すように、第２の核酸鎖対１２における第６の核酸鎖２６の一本鎖領域３３は前記第１の核酸鎖２１と二本鎖は形成しない。なお、ここでいう充分量とは、少なくとも、標的生体分子４１の数が、第１の電極２上に固定化されている第１の核酸鎖２１の数よりも多い必要がある。

サンプル溶液中に標的生体分子４１が含まれていない場合は、図７に示すように第１の電極２上の第1の核酸鎖２１は、第２の核酸鎖対１２の第６の核酸鎖２６の一本鎖領域３３と二本鎖を形成する。

また、サンプル溶液中に標的生体分子４１が含まれていても、微量の場合には、一部の第１の核酸鎖２１には、標的生体分子４１が結合するために、当該第１の核酸鎖２１と、第２の核酸鎖対１２の第６の核酸鎖２６の一本鎖領域３３とは二本鎖を形成せず、標的生体分子４１が結合していない第１の核酸鎖２１と、第２の核酸鎖対１２における第６の核酸鎖２６の一本鎖領域３３とは二本鎖を形成する。

核酸のハイブリダイゼーション条件とは、例えば、２５℃での３０分保持である。

なお、この第４工程は前記第３工程と同時、つまり第２の核酸鎖対１２の供給とサンプル溶液の反応セル１への供給は同時に行われても良い。

＜第５工程＞
次に、第１および第２の電極上に存在する二本鎖に由来する電気化学的信号を検出する。検出を行う方法としては、二本鎖に特異的に結合する挿入剤分子５１を二本鎖に結合させ、挿入剤分子の酸化または還元反応を電気化学的に検出する方法が、検出効率が高く望ましいが、この方法でなくとも、二本鎖が検出できる方法であればよい。

図８は第１の核酸２１に標的生体分子４１が結合している場合に、挿入剤分子５１を添加し、二本鎖形成領域に挿入剤分子５１が結合した状態を示す模式図である。図１０は、第１の核酸２１に標的生体分子４１が結合していない場合に、挿入剤分子５１を添加し、二本鎖形成領域に挿入剤分子５１が結合した状態を示す模式図である。

以下に具体的に手順を示す。

まず、二本鎖核酸に特異的に結合する挿入剤分子５１を含む溶液を反応セル１に添加する。

サンプル溶液中に標的生体分子４１が充分量存在している場合、図８のように第１の電極２上には二本鎖は形成されていないので、挿入剤分子５１は結合しない。一方、第２の電極３上では第２の核酸鎖２２、第３の核酸鎖２３、第４の核酸鎖２４が二本鎖を形成しているためここに二本鎖に挿入剤分子５１が結合する。

サンプル溶液中に標的生体分子４１が存在していない場合、図１０のように第１の電極２上にも、第１の核酸鎖２１、第５の核酸鎖２５、第６の核酸鎖２６とが二本鎖を形成する。したがってこの二本鎖に挿入剤分子５１が結合する。第２の電極３上でも第２の核酸鎖２２、第３の核酸鎖２３、第４の核酸鎖２４が二本鎖を形成している。この二本鎖にも挿入剤分子５１が結合する。

サンプル溶液中に標的生体分子４１が微量に存在する場合には、図８のように第１の電極２上に二本鎖が形成されていない場合と、図１０のように第１の電極２上に二本鎖が形成されている場合とが混在することになる。二本鎖が形成されている場合には、挿入剤分子５１が結合し、二本鎖が形成されていない場合には、挿入剤分子５１は結合しない。

挿入剤としては、ヘキスト３３２５８が望ましいが、ヘキスト３３２５８に限定されるものではない。アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター、ポリインターカレーターなどの二本鎖認識体を用いても良い。更に、これらの物質にフェロセン、ビオロゲン等の、電気化学的な応答を示す物質で修飾しても同様な検出を行うことが出来る。

次に、第１の電極２及び第２の電極３を、各々作用極とし、別途設けられた対極及び参照極を用い、必要に応じて反応セル内に設けられた参照極の電位をフィードバックしながら、反応セル内の作用極と対極との間に電位を掃引して、作用極から検出される電流を測定する。 これらの二本鎖に由来する電気化学的信号の測定は、特開２００４−６１４２６号や特開２００４−１２５７７７号に開示されている塩基配列自動解析装置を用いることにより、簡便に自動にて検査することが可能である。

図９は第１の核酸鎖２１に標的生体分子４１が結合した場合に、電流検出を行った状態を示す模式図である。図１１は第１の核酸鎖２１に標的生体分子４１が結合しなかった場合に、電流検出を行った状態を示す模式図である。

サンプル溶液中に標的生体分子４１が充分量存在している場合、図９に示すように、検出用の第１の電極２上には二本鎖は存在しないため、第１の電極２からは、挿入剤分子５１からの電気化学信号６１は観測されない。比較用の第２の電極３上には二本鎖が存在するため、第２の電極３からは挿入剤分子５１からの電気化学信号６１が観測される。ここで、電気化学信号６１の向きは、挿入剤分子として、ヘキスト３３２５８を用いたときの電子の流れの向きを示している。

サンプル溶液中に標的生体分子４１が存在していない場合、図１１に示すように、検出用の第１の電極２上に二本鎖が存在するので、第１の電極２からは、挿入剤分子５１からの電気化学信号６２が観測される。また比較用の第２の電極３上にも二本鎖が存在するため、第２の電極３から挿入剤分子５１からの電気化学信号６２が観測される。

サンプル溶液中に標的生体分子４１が微量に存在する場合には、検出用の第１の電極２上の第１の核酸鎖２１の一部は、図１１に示すように第２の核酸鎖対１２と二本鎖を形成しており、また一部は図９に示すように二本鎖を形成していない状態になる。従って、二本鎖が形成されている核酸鎖からは電気化学信号が観測され、二本鎖が形成されていない核酸鎖からは電気化学信号が観測されないことになる。従って、この場合には、第１の電極２としては、すべての第１の核酸鎖２１が二本鎖を形成している場合の電気化学信号の値と、第１の核酸鎖２１が全く二本鎖を形成していない場合の電気化学信号の値の間の値を観測することになる。

このように、サンプル溶液中の、標的生体分子４１の存否また、存在量によって、第１の電極２から得られる電気化学信号の大きさが異なる。一方、比較用の第２の電極３から得られる電気化学信号の大きさは標的生体分子４１の存否にかかわらず一定である。したがって、比較用の第２の電極３から得られる電気化学信号の大きさから、検出用の第１の電極から得られる電気化学信号の差分を算出することによって、第１の核酸２１に結合した標的生体分子４１の存否、更には存在量を決定することが出来る。標的生体分子の存在量が多ければ差分の値は大きく、存在量が少なければ差分の値は小さくなる。差分の大きさの判定にはあらかじめ実験等により求めた閾値との比較によって行うことが実用的である。

また、添加されるサンプル溶液中に、充分量の標的生体分子４１が存在し、第１の電極２上の全ての第１の核酸鎖２１に標的生体分子４１が結合している場合には、理想的には電気化学信号が検出されず、第２の電極３のみから電気化学信号６１が検出される。実際には標的生体分子４１の数によって、標的生体分子４１が結合している第１の核酸鎖２１の数が変化する。第１の電極２からの電気化学信号６２は、標的生体分子４１が結合していない第１の核酸鎖２１の量に応じた量だけ、観測されることになるため、上記の方法にてサンプル中の標的生体分子の存在量も測定することが可能である。つまり、第２の電極３から得られた電気化学信号の値と、第１の電極２から得られた電気化学信号の値の差分の値から、検出用の第１の電極２に結合した標的生体分子４１の量を算出することが可能になる。差分の大きさの判定にはあらかじめ実験等により求めた検量線との比較によって行うことが実用的である。

図１２は本実施形態の方法による検出電極からの信号値と標的生体分子の結合割合の関係図である。

実際の測定では、すべての第１の核酸２１に標的生体分子が結合し、第1の電極２上に二本鎖が存在しない場合でも、電気化学信号は零にはならず、二本鎖以外に非特異的に吸着する挿入剤分子５１の酸化・還元反応による電気化学信号が検出される。その場合には、このようなバックグランド信号を差し引いて、信号の大小を評価する必要がある。（図１２）
本発明の方法では、標的生体分子４１が全く存在しない状況で、挿入剤分子５１を反応セル１内に供給し、電圧掃引の結果、検出用の第１の電極２から得られる電気化学信号の値と、比較用の第２の電極３から得られる電気化学信号の値がほぼ等しくなるように第１の核酸鎖対１１を形成する第４及び第５の核酸鎖、また第２の核酸鎖対１２を形成する第５及び第６核酸鎖、の配列及び長さを選択することが望ましい。また、原理的には、第１の核酸鎖対１１は第４の核酸鎖２４の領域３１のみ、第２の核酸鎖対１２は、第６の核酸鎖２６の領域３３のみでも、第１の核酸鎖２１や第２の核酸鎖２２が二本鎖を形成したか否かの検出は可能ではあるが、二本鎖由来の電気化学信号を明瞭に検出するため、上記のように、第１の核酸鎖対１１に、予め第３の核酸鎖２３と第４の核酸鎖２４の領域３２における二本鎖領域を、第２の核酸鎖対１２に、予め第５の核酸鎖２５と第６の核酸鎖２６の領域３４における二本鎖領域を、準備しておくことが非常に有用である。

具体的には、第１の核酸鎖の長さは１０塩基以上３０塩基以下、さらに望ましくは１３塩基以上２０塩基以下、第２の核酸鎖の長さは１０塩基以上３０塩基以下、さらに望ましくは１３塩基以上２０塩基以下、であることが望ましい。

また、第４の核酸鎖や、第６の核酸鎖は、長い方が望ましく、第３の核酸鎖は、第４の核酸鎖の内、第２の核酸鎖の相補的な領域以外と相補的に、なっていることが望ましく、第５の核酸鎖は、第６の核酸鎖の内、第１の核酸鎖の相補的な領域以外と相補的になっていることが望ましい。ここで、それぞれの二本鎖領域は、挿入剤分子が結合する領域であるため、長いほど、結合領域が多く、結果として、電気化学信号が大きくなるため、電気化学信号の大小の差を大きく取ることができ、望ましい。

更には、ここでは、一本鎖である第４の核酸鎖と一本鎖である第３の核酸鎖により、第１の核酸鎖対を形成させ、また、一本鎖である第６の核酸鎖と一本鎖である第５の核酸鎖により、第２の核酸鎖対を形成させ、それぞれを、第２の核酸鎖や第１の核酸鎖とハイブリダイゼーションさせる構成を記述してきたが、これに限定される訳ではない。即ち、第１の核酸鎖対は、第２の核酸鎖と相補的な一本鎖領域と、二本鎖領域が存在していればよいのであるから、第２の核酸鎖と相補的な領域が一本鎖になっている構造を持つＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ： 栄研化学）増幅された核酸でも良い。第２の核酸鎖対も同様に、第１の核酸鎖と相補的な領域が一本鎖になっている構造を持つＬＡＭＰ増幅された核酸でも良い。

本実施形態の方法では、標的生体分子を反応させる際に、予め標的生体分子や第２の核酸鎖対に蛍光色素等の標識をする必要がない。従って、これらの標識物質が反応を阻害することによる検出不能、検出感度低下等の問題が発生する心配がない。また、第１及び第２の核酸鎖以外に第３乃至第６の核酸鎖を用い、電極上に形成される二本鎖の絶対量を多くし、各電極から得られる信号量をいわば増幅して測定しているため、精度のよい測定が可能である。

本発明の方法を実施するに当たり、本発明にかかる装置と供給する核酸鎖、試薬類をキット化しておくことが実用上望ましい。キットの形態としては以下のキットＡ、Bが例示される。

［キットＡ］ 装置Ａ、核酸鎖セットＡ、その他試薬
装置Ａ：反応セルと、前記反応セル内に設けられた第１及び第２の電極と、前記第１の電極に固定化され、標的生体分子に対してアプタマーとして機能し、前記標的生体分子と結合可能な第１の核酸鎖と、前記第２の電極に一端が固定化され、前記標的生体分子に対してアプタマーとして機能しない第２の核酸鎖と、を具備する。

核酸鎖セットＡ： 第１の核酸鎖対として、前記第１、第２の核酸鎖及びそれらの相補鎖と二本鎖を形成しない第３の核酸鎖と、前記第２の核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第３の核酸鎖と二本鎖を形成している領域とを有する第４の核酸鎖、
第２の核酸鎖対として、前記第１乃至第４の核酸鎖とは二本鎖を形成しない第５の核酸鎖と、前記第１核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第５の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第６の核酸鎖、とを具備する核酸鎖セット。

試薬類：挿入剤溶液（挿入剤を用いた測定を行う場合）、バッファー類など。
［キットＢ］ 装置Ｂ、核酸鎖セットＢ、その他試薬
装置Ｂ：反応セルと、前記反応セル内に設けられた第１及び第２の電極と、前記第１の電極に一端が固定化され、標的生体分子に対してアプタマーとして機能し、前記標的生体分子と結合可能な第１の核酸鎖と、前記第２の電極に一端が固定化され、前記標的生体分子に対してアプタマーとして機能しない第２の核酸鎖と、第１の核酸鎖対として、前記第１、第２の核酸鎖及びそれらの相補鎖と二本鎖を形成しない第３の核酸鎖と、前記第２の核酸鎖と二本鎖を形成している領域及び前記第３の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第４の核酸鎖と、を具備する装置（第２の核酸鎖と第３の核酸が連結された連結核酸鎖であってもよい。）
核酸鎖セットＢ：第２の核酸鎖対として、前記第１乃至第４の核酸鎖とは二本鎖を形成しない第５の核酸鎖と、前記第１核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第５の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第６の核酸鎖と、を具備する核酸鎖セット。

試薬類：挿入剤溶液（挿入剤を用いた測定を行う場合）、バッファー類など。

その他、本発明の要素を具備し、当業者が適宜設計変更しうる全ての方法、キットは、本発明の範囲に包含される。

以下に、上述の検出装置を用いて、標的生体分子としてトロンビンを検出した具体例を説明する。

ガラス基板上に、溝が形成されたシリコーン樹脂構造体を、この溝が基板上に配置されるよう積載し、反応セル１とした。検出用第１の電極２及び比較用第２の電極３はいずれも反応セル１内に収まるように配置されている。ガラス基板上に成膜された金で構成されており、直径２００μｍの円形の電極とした。ガラス基板上には、１２個の電極を形成した。

電極番号１〜４は、ネガティブコントロール用電極に、電極番号５〜８は、比較用の第２の電極３に、電極番号９〜１２は、検出用の第１の電極２として割り当てた。

第１の電極２には、第１の核酸鎖２１として、トロンビンアプタマープローブ（配列番号１）を固定化した。これは、トロンビンのフィブリノーゲン結合部位に結合することが知られているアプタマー配列である。

第２の電極３には、トロンビンアプタマープローブ（配列番号１）とは異なる配列である第２の核酸鎖２２として、ポジティブコントロールプローブ（配列番号２）を固定化した。

更に、ネガティブコントロール用電極には、トロンビンアプタマープローブ（配列番号１）ともポジティブコントロールプローブ（配列番号２）とも異なる配列を持つネガティブコントロールプローブ（配列番号３）を固定化した。

ここでは、いずれの核酸鎖も３’末端に、チオール基を修飾することにより、金電極上に固定化した。表１に使用した核酸プローブ配列を示す。

このようなチップを反応セル内に設置し、トロンビンを２．７μＭの濃度で含有する溶液をチップ上に供給し、２５℃で６０分間放置した。なお、トロンビンは、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎによるバッファに溶解させている。

その後、第６の核酸鎖として検出電極用ターゲット核酸１（配列番号４）、第５の核酸鎖及び第３の核酸鎖として共通なターゲット核酸２（配列番号５）及び第４の核酸鎖としてポジティブコントロールターゲット核酸３（配列番号６）を混合した溶液をチップ上に供給した。これらの核酸は、２×ＳＳＣ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎによるバッファに溶解させ、ターゲット核酸の終濃度は、それぞれ、ターゲット核酸１が０．４μＭ、ターゲット核酸２が１．６μＭ、ターゲット核酸３が０．４μＭとなるように調製している。

その後、特開２００４−６１４２６号や特開２００４−１２５７７７号に開示されている塩基配列自動解析装置を用いて、２５℃で３０分間放置した後に、挿入剤ヘキスト３３２５８をチップ上に供給後、電気化学測定を行った。

図１３には、上記の方法による測定結果を示す。電極番号１〜４は、バックグラウンド電流としてネガティブコントロールプローブから固定化されている電極からの電流を検出している。電極番号５〜８は、比較用としてポジティブコントロールプローブが固定化されている電極からの電流を示す。電極番号９〜１２は、検出用として、アプタマープローブが固定化されている電極からの電流を示す。（ａ）は、標的生体分子であるトロンビンが含まれていない場合を、（ｂ）には、トロンビンが含まれている場合の実験結果を示している。これを見て分かるように、トロンビンが含まれていると、電流値が低下することが示されており、本手法による検出の効果が実証された。

１： 反応セル
２： 第１の電極（検出用）
３： 第２の電極（比較用）
１１： 第１の核酸鎖対
１２： 第２の核酸鎖対
２１： 第１の核酸鎖
２２： 第２の核酸鎖
２３： 第３の核酸鎖
２４： 第４の核酸鎖
２５： 第５の核酸鎖対
２６： 第６の核酸鎖
４１： 標的生体分子
５１： 挿入剤分子
６１，６２： 電気化学信号

Claims (9)

1. 反応セルと、前記反応セル内に設けられた第１及び第２の電極と、前記第１の電極に一端が固定化され、標的生体分子に対してアプタマーとして機能し、前記標的生体分子と結合可能な第１の核酸鎖と、前記第２の電極に一端が固定化され、前記標的生体分子に対してアプタマーとして機能しない第２の核酸鎖と、を具備する装置を準備する工程と、
   前記反応セルに、前記第１、第２の核酸鎖及びそれらの相補鎖と二本鎖を形成しない第３の核酸鎖と、前記第２の核酸鎖と二本鎖を形成している領域及び前記第３の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第４の核酸鎖、を供給する工程と、
   前記標的生体分子を含む可能性のあるサンプル溶液を供給し、前記標的生体分子と前記第1の核酸鎖が結合する条件下におく工程と、
   前記反応セルに、前記第１乃至第４の核酸鎖とは二本鎖を形成しない第５の核酸鎖と、前記第１核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第５の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第６の核酸鎖と、を供給し、前記標的生体分子と結合しなかった前記第１の核酸鎖と前記第６の核酸鎖の前記一本鎖領域とが二本鎖を形成する条件下におく工程と、
   前記第１の電極から、前記第１の核酸鎖及び前記第５の核酸鎖と、前記第６の核酸鎖間で形成される二本鎖に由来する第１の電気化学信号、及び、前記第２の電極から前記第２の核酸鎖及び前記第３の核酸鎖と、前記第４の核酸鎖間で形成される二本鎖に由来する第２の電気化学的信号を検出する工程と、
   前記第１の電気化学的信号と、前記第２の電気化学的信号との差分から、前記標的生体分子の量を算出する工程とを行うことを特徴とする標的生体分子の検出方法。
2. 前記反応セルに、前記第３の核酸鎖と、前記第４の核酸鎖、を供給する前記工程と、
   前記標的生体分子を含む可能性のあるサンプル溶液を供給し、前記標的生体分子と前記第1の核酸鎖が結合する条件下におく前記工程とは同時に行われることを特徴とする請求項１記載の標的生体分子の検出方法。
3. 反応セルと、前記反応セル内に設けられた第１及び第２の電極と、前記第１の電極に一端が固定化され、標的生体分子に対してアプタマーとして機能し、前記標的生体分子と結合可能な第１の核酸鎖と、前記第２の電極に一端が固定化され、前記標的生体分子に対してアプタマーとして機能しない第２の核酸鎖と、前記第１、第２の核酸鎖及びそれらの相補鎖と二本鎖を形成しない第３の核酸鎖と、前記第２の核酸鎖と二本鎖を形成している領域及び前記第３の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第４の核酸鎖、を具備する装置を準備する工程と、
   前記標的生体分子を含む可能性のあるサンプル溶液を供給し、前記標的生体分子と前記第1の核酸鎖が結合する条件下におく工程と、
   前記反応セルに、前記第１乃至第４の核酸鎖とは二本鎖を形成しない第５の核酸鎖と、前記第１核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第５の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第６の核酸鎖と、を供給し、前記標的生体分子と結合しなかった前記第１の核酸鎖と前記第６の核酸鎖の前記一本鎖領域とが二本鎖を形成する条件下におく工程と、
   前記第１の電極から、前記第１の核酸鎖及び前記第５の核酸鎖と、前記第６の核酸鎖間で形成される二本鎖に由来する第１の電気化学信号、及び、前記第２の電極から前記第２の核酸鎖及び前記第３の核酸鎖と、前記第４の核酸鎖間で形成される二本鎖に由来する第２の電気化学的信号を検出する工程と、
   前記第１の電気化学的信号と、前記第２の電気化学的信号との差分から、前記標的生体分子の量を算出する工程とを行うことを特徴とする標的生体分子の検出方法。
4. 前記第２の核酸鎖と前記第３の核酸鎖とが連結していることを特徴とする請求項３記載の標的生体分子の検出方法。
5. 前記第１及び第２の電気化学的信号を検出する工程は、
   前記反応セルに二本鎖特異的に結合する挿入剤溶液を供給し、前記反応性セル内の二本鎖に挿入剤を結合させる工程と、
   前記挿入剤が酸化もしくは還元反応することにより発生する電気化学信号を前記第１の電極及び第２の電極で各々検出する工程を行うことを特徴とする請求項１乃至４記載の標的生体分子の検出方法。
6. 反応セルと、
   前記反応セル内に設けられた第１及び第２の電極と、
   前記第１の電極に固定化され、標的生体分子に対してアプタマーとして機能し、前記標的生体分子と結合可能な第１の核酸鎖と、前記第２の電極に一端が固定化され、前記標的生体分子に対してアプタマーとして機能しない第２の核酸鎖と、を具備する装置と、
   前記第１、第２の核酸鎖及びそれらの相補鎖と二本鎖を形成しない第３の核酸鎖と、
   前記第２の核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第３の核酸鎖と二本鎖を形成している領域とを有する第４の核酸鎖と、
   前記第１乃至第４の核酸鎖とは二本鎖を形成しない第５の核酸鎖と、
   前記第１核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第５の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第６の核酸鎖と、
   を具備することを特徴とする標的生体分子検出用キット。
7. 反応セルと、前記反応セル内に設けられた第１及び第２の電極と、前記第１の電極に一端が固定化され、標的生体分子に対してアプタマーとして機能し、前記標的生体分子と結合可能な第１の核酸鎖と、前記第２の電極に一端が固定化され、前記標的生体分子に対してアプタマーとして機能しない第２の核酸鎖と、前記第１、第２の核酸鎖及びそれらの相補鎖と二本鎖を形成しない第３の核酸鎖と、前記第２の核酸鎖と二本鎖を形成している領域及び前記第３の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第４の核酸鎖と、を具備する装置と、
   前記第１乃至第４の核酸鎖とは二本鎖を形成しない第５の核酸鎖と、
   前記第１核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第５の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第６の核酸鎖と、
   を具備することを特徴とする標的生体分子検出用キット。
8. 前記第２の核酸鎖と前記第３の核酸鎖とが連結していることを特徴とする請求項７記載の標的生体分子の検出方法。
9. さらに二本鎖特異的に結合する挿入剤溶液を具備することを特徴とする請求項６乃至８記載の標的生体分子検出用キット。

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