JP2012103263A - 未分画ヘパリンの酸化方法及びヘパリン及びヘパリン製品中のグリコセリンの有無の検出 - Google Patents

Abstract

【課題】未分画ヘパリンを酸化して得られた、、グリコセリン含量を減少させたヘパリン及びヘパリン製品中のグリコセリンの有無の検出方法を提供する。
【解決手段】試料を少なくとも１種のヘパリナーゼで脱重合し、クロマトグラフィー法を使用して前記試料を分析することを含む、ヘパリン又はヘパリン製品の試料のグリコセリンを測定する方法であって、前記クロマトグラフィー法が陰イオンクロマトグラフィーを含み、アセチル化された基を検出する、方法。
【選択図】図１

Description

本発明の１実施形態は、過マンガン酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム及び過マンガン酸４級アンモニウムから選択される少なくとも１種の過マンガン酸塩を使用した粗ヘパリン調製物の酸化方法に関する。得られたヘパリン調製物は、グリコセリン残基が比較的少なく、たとえば、グリコセリン残基が比較的少ない低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）及び超低分子量ヘパリン（ＵＬＭＷＨ）の調製に有用である。本発明の他の実施形態は、ヘパリンの、及び断片化ヘパリンの調製におけるグリコセリン及びグリコセリン誘導体の存在の検出方法に関する。

ヘパリンは、グルコサミノグリカンファミリーの生体活性構成要素であり、たとえば、ウシ及びブタ原料から抽出することができる。ヘパリンは、抗凝血特性及び抗血栓症特性を有し、動脈血栓症及び静脈血栓症などの血栓症の治療に有用となっている。単離されると、天然のヘパリン分子は高い抗凝血活性を有し、出血を引き起こし得る。さらに、ヘパリン分子は、特定の血清因子に敏感であり、したがって、抗血栓症の利点を得るには大量に投与しなければならず、出血の危険性が非常に高くなる。

ＬＭＷＨは様々なヘパリン処理、溶媒による分画（ＦＲ２４４０３７６、米国特許第４６９２４３５号）、陰イオン樹脂による分画（ＦＲ２４５３８７５）、ゲル濾過（Ｂａｒｒｏｗｃｌｉｆｆｅ、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１２、２７〜３６（１９７７））、アフィニティークロマトグラフィ（米国特許第４４０１７５８号）、限定はしないが亜硝酸を含めた化学物質（ＥＰ１４１８４、ＥＰ３７３１９、ＥＰ７６２７９、ＥＰ６２３６２９、ＦＲ２５０３７１４、米国特許第４８０４６５２号、ＷＯ８１３２７６）、ヘパリンエステルからのベータ脱離（ＥＰ ４０１４４、米国特許第５３８９６１８号）、過ヨウ素酸（ＥＰ２８７４７７）、水素化ホウ素ナトリウム（ＥＰ３４７５８８、ＥＰ３８０９４３）、アスコルビン酸（米国特許第４５３３５４９号）、過酸化水素（米国特許第４６２９６９９号、米国特許第４７９１１９５号）、ヘパリンの４級アンモニウムからの水酸化４級アンモニウム（米国特許第４９８１９５５号）、水酸化アルカリ金属（ＥＰ３８０９４３、ＥＰ３４７５８８）、酵素的経路（ＥＰ６４４５２、米国特許第４３９６７６２号、ＥＰ２４４２３５、ＥＰ２４４２３６、米国特許第４８２６８２７号、米国特許第３７６６１６７号）又は照射による（ＥＰ２６９９８１）制御脱重合によって調製することができる。米国特許第４３０３６５１号及び米国特許第４７５７０５７号も参照のこと。得られたＬＭＷＨ混合物は、抗第Ｘａ因子（ａＸａ）が高く、抗第ＩＩａ因子（ａＩＩａ）が低いので、分画ヘパリンよりも高い抗血栓症活性を示すことが報告されており、血栓症の治療が必要な患者に投与するためにより望ましい混合物であることが多い。

承認された製品のＬＭＷＨ製造者はそれぞれ、異なる脱重合法を利用している。２製造者が同様の方法を使用しない限り、この方法の違いによってＬＭＷＨ構造の違いが生じ、したがって、薬理学的活性が異なり、臨床使用で承認される適用が異なってくる。

したがって、ＬＭＷＨは、製造に使用した脱重合工程によって構造的に異なる（Ｒ．Ｊ．Ｌｉｎｈａｒｄｔ他、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｔｈｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｓ １９９９；２５（補足３）：５〜１６）。結果として、ＬＭＷＨはヘパリンよりも不均一である。それぞれの異なる方法によって、多糖鎖に特有で非常に複雑な構造の変化が生じる。これらの変化には、鎖長及び鎖配列並びに構造指紋の違いが含まれる。結果として、異なる市販のＬＭＷＨはそれぞれ薬理学的特性が異なり、承認された適用が異なる。

米国においてＬｏｖｅｎｏｘ（登録商標）、及びその他の国々でＣｌｅｘａｎｅ（登録商標）の商標名で販売されているエノキサパリンナトリウムの純粋なヘパリンからの調製方法において、水相アルカリ性脱重合法によって、オリゴ糖鎖の還元末端のグルコサミンの、部分的ではあるが特徴的な変換が生じる。

この変換の第１段階は、グルコサミン←→マンノサミン異性化（Ｔ．Ｔｏｉｄａ他、Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１５（３）、３５１〜３６０（１９９６））から成り、第２段階は、グルコサミンの６−Ｏ−脱硫酸で、「１，６無水」と呼ばれる誘導体の形成がもたらされる（国際特許出願ＷＯ０１／２９０５５）。

この種の誘導体は、末端グルコサミンが６−Ｏ−硫酸化されているオリゴ糖鎖のために得られる。

末端が１，６−無水結合で修飾されたオリゴ糖鎖の割合は、Ｌｏｖｅｎｏｘ（登録商標）エノキサパリンナトリウムのオリゴ糖混合物の構造的特徴である。現在の知識では、Ｌｏｖｅｎｏｘ（登録商標）（エノキサパリンナトリウム）の１５％から２５％がその鎖の還元末端に１，６−無水構造を有する。

最近、強塩基の存在下で脱重合を使用するヘパリン断片を調製するための新規方法は、たとえば、本明細書に参照により明確に組み込む米国特許出願第２００２−００５５６２１Ａ１において記載されたように、約１５００ダルトンから約３０００ダルトン（ＵＬＭＷＨ）の範囲の重量平均分子量を有する超低分子量ヘパリンを生じた。

ＬＭＷＨ及びＵＬＭＷＨ断片の組成は不均一で、長さ及び分子量が様々な個々のヘパリン断片を含有する。

ＦＲ２４４０３７６ 米国特許第４６９２４３５号明細書 ＦＲ２４５３８７５ 米国特許第４４０１７５８号明細書 ＥＰ１４１８４ ＥＰ３７３１９ ＥＰ７６２７９ ＥＰ６２３６２９ ＦＲ２５０３７１４ 米国特許第４８０４６５２号明細書 ＷＯ８１３２７６ ＥＰ ４０１４４ 米国特許第５３８９６１８号明細書 ＥＰ２８７４７７ ＥＰ３４７５８８ ＥＰ３８０９４３ 米国特許第４５３３５４９号明細書 米国特許第４６２９６９９号明細書 米国特許第４７９１１９５号明細書 米国特許第４９８１９５５号明細書 ＥＰ６４４５２ 米国特許第４３９６７６２号明細書 ＥＰ２４４２３５ ＥＰ２４４２３６ 米国特許第４８２６８２７号明細書 米国特許第３７６６１６７号明細書 ＥＰ２６９９８１ 米国特許第４３０３６５１号明細書 米国特許第４７５７０５７号明細書 ＷＯ０１／２９０５５ 米国特許出願公開第２００２−００５５６２１号明細書

Ｂａｒｒｏｗｃｌｉｆｆｅ、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１２、２７〜３６（１９７７） Ｒ．Ｊ．Ｌｉｎｈａｒｄｔ他、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｔｈｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｓ １９９９；２５（補足３）：５〜１６ Ｔ．Ｔｏｉｄａ他、Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１５（３）、３５１〜３６０（１９９６）

ヘパリン自体及びヘパリン断片混合物はいずれも、保存中に着色するので、少なくとも部分的に貯蔵寿命が制限されている。一旦色がつくと、これらの組成物は患者に注射するために商用的に望ましくないであろう。したがって、着色に耐性のあるヘパリンを生成する方法は、商用的理由のために強く望まれている。もちろん、このような着色耐性ヘパリンは、当業界で公知の方法によって着色耐性ＬＭＷＨ及び／又はＵＬＭＷＨを調製するために使用され得る。さらに、着色に対するヘパリン調製物の可能性を評価する方法は、ヘパリン、ＬＭＷＨ及びＵＬＭＷＨの製造に有用であろう。

したがって、着色に耐性のあるヘパリンを調製するための方法を提供することが本発明の１実施形態である。得られたヘパリンはその後、ＬＭＷＨ及びＵＬＭＷＨの混合物、特に商用に有用な混合物、たとえば、着色に耐性であるフラキシパリン（ｆｒａｘｉｐａｒｉｎ）、フラグミン（ｆｒａｇｍｉｎ）、インノヘップ（ｉｎｎｏｈｅｐ）（またはロギパリン（ｌｏｇｉｐａｒｉｎ））、ノルミフロ（ｎｏｒｍｉｆｌｏ）、エムボレックス（ｅｍｂｏｌｌｅｘ）（またはサンドパリン（ｓａｎｄｏｐａｒｉｎ））、フラクサム（ｆｌｕｘｕｍ）（またはミニダルトン（ｍｉｎｉｄａｌｔｏｎ））、クリバリン（ｃｌｉｖａｒｉｎ）及びヒボール（ｈｉｂｏｒ）を生成するために使用することができる。本明細書で明らかなように、本発明のある実施形態は、合衆国でＬｏｖｅｎｏｘ（登録商標）（エノキサパリンナトリウム）及びいくつかのその他の国々でＣｌｅｘａｎｅ（登録商標（エノキサパリンナトリウム）として市販されているエノキサパリン（ｅｎｏｘｏｐａｒｉｎ）を利用することができる。エノキサパリンは、Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ Ｓ．Ａ．及びＡｖｅｎｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから市販されている。その他の実施形態では、エノキサパリンは利用しない。本発明の他の実施形態は、ヘパリン及びヘパリン断片の混合物の着色傾向をモニターする方法を提供する。

本発明の１実施形態は、グリコセリンを含まないヘパリン組成物を製造するためのヘパリンの酸化方法において、過マンガン酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム及び過マンガン酸４級アンモニウムから選択される少なくとも１種の過マンガン酸塩、たとえば、過マンガン酸カリウムを使用してヘパリンを調製する新規方法を提供する。この方法を以下に説明する。この出願人は、これらの過マンガン酸塩の少なくとも１種、たとえば、過マンガン酸カリウムを酸化段階で使用すると、グリコセリンを含まない、又は低グリコセリンのヘパリンが得られることを発見した。グリコセリン残基及び／又はグリコセリン誘導体をヘパリンから除去すると、商用特性の改善された製品をもたらすことができることもまた、発見された。このようなグリコセリン低下製品は無色又はほとんど無色で、過マンガン酸カリウムの存在下で酸化されなかったヘパリンで製造された製品に対して着色の傾向が減少していることが示されている。

さらに、本発明の少なくとも１種の実施形態は、ヘパリン組成物中でグリコセリン残基（又はそれらの欠如）を検出するための方法を含む。この方法は、１種又は複数のヘパリナーゼでヘパリンを予備処理し、クロマトグラフィーを使用してアセチル化された基を検出することを含む。本発明のさらに詳細な説明を以下に示す。

本発明では、ヘパリンからグリコセリン残基及びグリコセリン誘導体、たとえば、酸化グリコセリンの化学選択的除去を可能にする条件を提供する。

本発明の１実施形態では、低グリコセリンヘパリン又はグリコセリンを含まないヘパリンを得るために、過マンガン酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム及び過マンガン酸４級アンモニウムから選択される少なくとも１種の過マンガン酸塩、たとえば、過マンガン酸カリウムをヘパリンの酸化方法で使用し、前記少なくとも１種の過マンガン酸塩の、ヘパリンに対して約４重量％から約１０重量％により酸化することを含む。得られた低グリコセリンヘパリン又は無グリコセリンヘパリンは、当業界で公知の方法を使用して脱重合され、低グリコセリン又は無グリコセリンのＬＭＷＨ又はＵＬＭＷＨ、たとえば、フラキシパリン、フラグミン、インノヘップ（ロギパリン）、ノルミフロ、エムボレックス（サンドパリン）、フラクサム（ミニダルトン）、クリバリン及びヒボールを得ることができるが、エノキサパリンナトリウムは得ることはできない。

しかし、これらの市販製品を製造するための商用方法は、譲受人である、Ａｖｅｎｔｉｓ ＳＡの子会社Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．を代表して提出された、２００３年２月１９日付け市民請願書及び市民誓願書補足（０３Ｐ−００６４／ＣＰ１）（米国食品医薬品局（ＵＳＦＤＡ）から公式に入手可能）に記載されているように、少なくともエノキサパリンの場合、最終製品の生物学的特徴に影響を及ぼし得る専有情報を含有すると考えられる。

したがって、本発明の実施形態は、
ａ）過マンガン酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム及び過マンガン酸４級アンモニウムから選択される少なくとも１種の過マンガン酸塩の、ヘパリンに対して約４重量％から約１０重量％により酸化することによってヘパリンを精製し、酸化は約３５℃から約９０℃の範囲の温度で起こること、及び
ｂ）前記ヘパリン製品を得るための方法に従って、前記酸化ヘパリンの製造者により脱重合することを含む、フラキシパリン、フラグミン、インノヘップ（ロギパリン）、ノルミフロ、エムボレックス（サンドパリン）、フラクサム（ミニダルトン）、クリバリン及びヒボールから選択される脱色ヘパリン製品の少なくとも１種の調製方法に関する。

或いは、該製造者はヘパリンに対して約４重量％から約１０重量％の、過マンガン酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム及び過マンガン酸４級アンモニウムから選択される少なくとも１種の過マンガン酸塩により酸化されたヘパリンを脱重合することができ、酸化は前記ヘパリン製品を得るための方法に従って約３５℃から約９０℃の範囲の温度で起こる。

実施可能性に関し、本発明の態様で引用した市販の製品の１種の製造者は、本発明のこれらの実施形態を実施することができ得る。

一般に、商用方法に限る必要はないが、脱重合に適した方法は、たとえば、ＦＲ２４４０３７６、米国特許第４６９２４３５号、ＦＲ２４５３８７５、Ｂａｒｒｏｗｃｌｉｆｆｅ、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１２、２７〜３６（１９７７）、米国特許第４４０１７５８号、ＥＰ１４１８４、ＥＰ３７３１９、ＥＰ７６２７９、ＥＰ６２３６２９、ＦＲ２５０３７１４、米国特許第４８０４６５２号、ＷＯ８１３２７６、ＥＰ４０１４４、米国特許第５３８９６１８号、ＥＰ２８７４７７、ＥＰ３４７５８８、ＥＰ３８０９４３、米国特許第４５３３５４９号、米国特許第４６２９６９９号、米国特許第４７９１１９５号、米国特許第４９８１９５５号、ＥＰ３８０９４３、ＥＰ３４７５８８、ＥＰ６４４５２、米国特許第４３９６７６２号、ＥＰ２４４２３５、ＥＰ２４４２３６、米国特許第４８２６８２７号、米国特許第３７６６１６７号、ＥＰ２６９９８１、米国特許第４３０３６５１号、米国特許第４７５７０５７号及び米国特許出願公開第２００２−００５５６２１号Ａ１に開示されている（これらのすべてがこのような方法の開示について本明細書に組み込まれるが、但し、米国特許第５３８９６１８号は共存する再発行手続において補正されたときのみ組み込まれる。）。

本発明の他の主題は、脱色されたヘパリンを得るための、前述したヘパリン酸化方法における過マンガン酸カリウムなどの過マンガン酸塩の少なくとも１種の使用、すなわち、前記少なくとも１種の過マンガン酸塩の、ヘパリンに対して約４重量％から約１０重量％による酸化である。前記の商用方法についての説明に従って、得られた脱色ヘパリンを脱重合するならば、フラキシパリン、フラグミン、インノヘップ（ロギパリン）、ノルミフロ、エムボレックス（サンドパリン）、フラクサム（ミニダルトン）、クリバリン及びヒボールなどのＬＭＷＨ又はＵＬＭＷＨを含む脱色ヘパリン製品が得られるであろう。

本発明の他の主題は、低グリコセリン又は無グリコセリンのヘパリンを得るための、前述したヘパリンの酸化方法における過マンガン酸カリウムの使用である。得られた低グリコセリン又は無グリコセリンの脱色されたヘパリンを脱重合するならば、前記で説明したように、フラキシパリン、フラグミン、インノヘップ（ロギパリン）、ノルミフロ、エムボレックス（サンドパリン）、フラクサム（ミニダルトン）、クリバリン及びヒボールなどのＬＭＷＨ又はＵＬＭＷＨを含む脱色ヘパリン製品が得られる。

本発明において、「ヘパリン」という表現は、限定はしないが、粗ヘパリン、改良ヘパリン及び精製ヘパリンを含む、ヘパリン製品以外のヘパリンの形態全てを意味する。

本発明において、「改良ヘパリン」という表現は、改良前の開始へパリンと比較して抗Ｘａ活性が高まったヘパリンを意味する。たとえば、限定はしないが、開始ヘパリンの抗Ｘａ活性が１４０ＩＵ／ｍｇの場合、改良ヘパリンの抗Ｘａ活性は１５０ＩＵ／ｍｇ又は２００ＩＵ／ｍｇであってよい。

本発明において、「低分子量ヘパリン」又は「ＬＭＷＨ」という表現は、約３，０００ダルトンを上回り約１０，０００ダルトン未満の重量平均分子量を有する、ヘパリンから得られた多糖類の混合物を意味する。

本発明において、「超低分子量ヘパリン」又は「ＵＬＭＷＨ」という表現は、約１，５００ダルトンから約３，０００ダルトンまでの範囲の重量平均分子量を有する、ヘパリンから得られた多糖類の混合物を意味する。

本発明において、「脱重合」（及び脱重合する、又は脱重合することなどのそれらの変形）の表現は、限定はしないが、断片化、化学的及び酵素的脱重合を含む全種類の脱重合並びに、限定はしないが、分画を含むヘパリン断片を調製するその他方法を含む。

本発明において、「低グリコセリン」という表現は、試料中の二糖残基全体の０．３％に等しいまたは未満の（たとえば、以下の段落５９で例示したような）百分率のグリコセリンが結合しているグリコセリンを意味する。

本発明において、「グリコセリンを含まない」という表現は、試料中の二糖残基全体の０．１％に等しいまたは未満の（たとえば、以下の段落５９で例示したような）百分率のグリコセリンが結合しているグリセリンを意味する。

本発明において、「比較的グリコセリンを含まない」という表現は、試料中の二糖残基全体の０．３％に等しいまたは未満の（たとえば、以下の段落５９で例示したような）百分率のグリコセリンが結合しているグリコセリンを意味する。

本発明において、「脱色された」という表現は、以下の見出し「比色分析用試料の調製」で説明したものなどの安定性増強試験において、吸収単位が０．２に等しいことまたは未満であることを意味する。

図１は、エノキサパリンナトリウムの安定性増強試験の結果を示す。

本発明において、「着色」という表現は、以下の見出し「比色分析用試料の調製」で説明したものなどの安定性増強試験において吸収単位が０．２に等しいまたは０．２を上回ることを意味する。

図１は、エノキサパリンナトリウムの安定性増強試験の結果を示す。

本発明において、「着色耐性」という表現は、以下の見出し「比色分析用試料の調製」で説明したものなどの安定性増強試験において吸収単位が０．２に等しいことまたは未満であることを意味する。図１は、エノキサパリンナトリウムの安定性増強試験の結果を示す。

本発明において、「ヘパリン製品」という表現はＬＭＷＨ及びＵＬＭＷＨを意味する。

本発明の方法の１実施形態において、過マンガン酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム及び過マンガン酸４級アンモニウムから選択される少なくとも１種の過マンガン酸塩、たとえば、過マンガン酸カリウムの、ヘパリンに対して４重量％から１０重量％が、酸化によって精製されたヘパリンの調製のために使用される。関連する実施形態において、過マンガン酸カリウムのヘパリンに対して約８重量％が、酸化によって精製したヘパリンの調製方法において使用される。

本発明の他の実施形態において、過マンガン酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム及び過マンガン酸４級アンモニウムから選択される少なくとも１種の過マンガン酸塩、たとえば、過マンガン酸カリウムで酸化することによって精製されたヘパリンを調製する方法は、約３５℃から約９０℃の範囲の温度で実施する。関連する実施形態において、過マンガン酸カリウムで酸化することによって精製したヘパリンを調製するための方法は、約４０℃から約８０℃の範囲の温度で実施する。

本発明の他の主題は、以下の段階
ａ）過マンガン酸ナトリウム及び過マンガン酸４級アンモニウムから選択される少なくとも１種の過マンガン酸塩、たとえば過マンガン酸カリウムの、ヘパリンに対して約４重量％から約１０重量％の作用によってヘパリンを精製し、酸化が約３５℃から約９０℃の範囲の温度で起こる段階、
ｂ）該ヘパリンを脱重合する段階、及び
ｃ）場合によって、少なくとも１種の組成物を精製する段階を含む方法によって得ることができる、本出願の出願日現在ＵＳＦＤＡによって承認されている製品を除く、低グリコセリン、グリコセリンを含まない、並びに脱色されたＬＭＷＨ及びＵＬＭＷＨから選択される少なくとも１種の組成物である。

本発明の他の主題は、過マンガン酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム、過マンガン酸４級アンモニウムから選択される少なくとも１種の過マンガン酸塩の、ヘパリンに対して４重量％から１０重量％の作用によって酸化されたヘパリンを脱重合することを含み、酸化が約３５℃から約９０℃の範囲の温度で起こる方法によって得ることができる、本出願の出願日現在ＵＳＦＤＡによって承認されている製品を除く、低グリコセリン、グリコセリンを含まない、並びに脱色されたＬＭＷＨ及びＵＬＭＷＨから選択される少なくとも１種の組成物である。

本発明の他の主題は、
ａ）ヘパリン及びヘパリン製品から選択される試料を処理すること、及び
ｂ）その後、試料中のグリコセリン残基の存在を決定するためにクロマトグラフィー法を使用することを含む、限定はしないがＬＭＷＨ及びＵＬＭＷＨ及びそれらの市販の形態を含む、ヘパリン又はヘパリン製品の試料のグリコセリン含量を測定する方法である。

本発明の１実施形態において、ヘパリン及びヘパリン製品から選択される試料は、クロマトグラフィー法によって分析する前にヘパリナーゼの作用によって脱重合処理する。他の実施形態において、ヘパリン及びヘパリン製品から選択される試料は、ヘパリナーゼ混合物の作用によって脱重合する。たとえば、ヘパリナーゼ混合物は、ヘパリナーゼ１（ＥＣ４．２．２．７．）、ヘパリナーゼ２（ヘパリンリアーゼＩＩ）及びヘパリナーゼ３（ＥＣ４．２．２．８．）を含むことができる。

本発明の他の実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ−強陰イオン交換）が、試料処理後の試料中のグリコセリンの存在（又は非存在）の測定に使用される。本発明の関連する実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィー用の固定相は、たとえば、−ＮＭｅ３＋を含む４級アンモニウム誘導体がグラフトされている。本明細書では、「強陰イオン交換クロマトグラフィー」（ＳＡＸ）という用語は、一定の正味正電荷がｐＨ約２〜１２の範囲に維持されている任意の樹脂で実施される陰イオン交換クロマトグラフィーを包含する。本発明のある実施形態において、強陰イオン交換クロマトグラフィーは、４級アンモニウム交換基で機能化された固相支持体を使用する。たとえば、粒子の大きさが約５μｍ、カラムの長さが約２５ｃｍ、カラムの直径が約１ｍｍと約４．６ｍｍとの間であるＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂ（登録商標）ＳＡＸ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ ＭＡ）などのカラムを使用することができる。他の実施形態において、同日にＵＳＰＴＯに出願され、ＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーの参照だけのために本明細書に組み込んだ「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｒｏｕｐｓ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｎｇ Ｈｅｐａｒｉｎｓ ｏｒ Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｈｅｐａｒｉｎｓ」という表題の米国特許出願に記載されたように、ＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーを使用することができる。ＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーは、前記出願において、一定の正味正電荷がｐＨ約２からｐＨ約１２の範囲に維持されている逆相シリカカラムに、力学的に被覆された４級アンモニウム塩で実施される陰イオン交換クロマトグラフィーとして定義されている。

したがって、本発明の１実施形態は、ヘパリン又はヘパリン製品の試料のグリコセリン含量を分析することによって、該試料のグリコセリン含量を定量する方法を提供する。１実施形態において、試料の分析は試料を酵素的消化すること及び消化した試料中のグリコセリン残基含量をＨＰＬＣなどのクロマトグラフィー法による定量することを含む。関連する実施形態において、ＣＴＡ−ＳＡＸ又はＳＡＸをグリコセリン残基含量の定量のために使用することができる。たとえば、限定はしないが、該試料のグリコセリン含量は試料の２．０％未満、試料の０．３％未満、又は試料の０．１％未満に低下させることができる。試料のグリコセリン含量はまた、０．０％（すなわち、検出不能）であることが可能である。

ヘパリン又はヘパリン製品の試料のグリコセリン含量を測定するための方法の１実施形態において、クロマトグラフィー段階の移動相は約２００ｎｍから約４００ｎｍの範囲の紫外線（ＵＶ）透過性である。該移動相は、たとえば、過塩素酸ナトリウム、メタンスルホン酸塩又はリン酸塩を含むことができる。

ヘパリン及びヘパリン製品から選択される試料の処理後グリコセリン含量を測定するための方法の１実施形態では、多糖類はクロマトグラフィー後のＵＶ吸収によって検出される。多糖類のＵＶ吸収は、非アセチル化多糖類の吸収シグナルを消すために、クロマトグラフィー後に、たとえば、２０２ｎｍ及び２４０ｎｍの２波長で測定することができる。

該方法の他の実施形態は、
ａ）試料からグリコセリン及び／又は酸化グリコセリン残基を除去し、及び／又は減少させること、及び
ｂ）該試料中のグリコセリン及び／又は酸化グリコセリン残基の有無を検出するためにクロマトグラフィー法を使用して該試料を分析することを含む、ヘパリン又はヘパリン製品の試料のグリコセリン含量をモニターする方法を提供する。

関連する実施形態は、グリコセリン及び／又は酸化グリコセリン残基の除去及び／又は減少は、
ａ）過マンガン酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム及び過マンガン酸４級アンモニウムから選択される少なくとも１種の過マンガン酸塩の、ヘパリンに対して約４重量％から約１０重量％により酸化することによってヘパリンを精製し、酸化は約３５℃から約９０℃の範囲の温度で起こること、及び
ｂ）前記酸化ヘパリンを脱重合することを含む。

本発明の他の実施形態において、ヘパリン及びヘパリン製品から選択される試料のグリコセリン含量は、たとえば、外部較正又は内部較正のいずれかによって定量することができる。内部較正は、２−ナフトール−３，６−ジスルホン酸などの内部標準物質の使用を含むことができる。他の関連する実施形態において、測定すべき溶液は２−ナフトール−３，６−ジスルホン酸約０．１５ｇ／ｌを含有することが可能である。

この方法の他の実施形態は、ヘパリン又はヘパリン製品のグリコセリン含量を測定することを含む、前記ヘパリン又はヘパリン製品の着色傾向を予測する方法を提供する。関連する実施形態では、グリコセリン含量は外部較正又は内部較正によって定量される。内部較正は、内部標準を含有することができる。関連する実施形態において、該内部標準は２−ナフトール−３，６−ジスルホン酸又は２−ナフトール−３，６−ジスルホン酸約０．１５ｇ／ｌである。

本発明の１実施形態において、クロマトグラフィー段階はヘパリン分子のグリコセリン結合ドメインの四糖を検出する。ヘパリンのグリコセリン結合ドメインの四糖は、

である。

当業者であれば、この方法及び本明細書で説明した態様は、当業界で公知のＬＭＷＨ及びＵＬＭＷＨ並びに市販のもののグリコセリン含量を測定するために使用することができることを理解するだろう。本発明の他の利点は、以下の説明にある程度は説明されており、ある程度は説明から明らかであるか、又は本発明を実施する当業者には認識できるであろう。本発明の利点は、添付した特許請求の範囲で特に指摘した要素及び組み合わせによって実現し、達成されるだろう。

前述の一般説明及び以下の詳細な説明の両方は例示し、説明するのみであって、本発明を特許請求の範囲のように限定するのではないことを理解されたい。

同様に、この明細書に組み込まれ、この明細書の一部を構成する添付図面は、本発明のいくつかの実施形態を例示しており、説明と共に本発明の原理を説明するために役立つ。

図１は、前述したように市販の非過マンガン酸塩処理及び過マンガン酸塩処理エノキサパリンナトリウムの安定性増強試験を示す図である。

図２は、脱重合ヘパリン物質の代表的なクロマトグラムである。

図３は、アセチル化糖の選択的検出方法を例示するＵＶスペクトルである。

市販の過マンガン酸塩無処理及び過マンガン酸塩処理エノキサパリンナトリウムの安定性増強試験を示す図である。 脱重合ヘパリン物質の代表的なクロマトグラムである。 アセチル化糖の選択的検出方法を例示するＵＶスペクトルである。

四糖ＧｌｃＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｓｅｒ（ピーク番号１）のＮＭＲは、Ｄ_２Ｏ、５００ＭＨｚ（σ、ｐｐｍ）で以下のようなスペクトルを示す。３．３０（１Ｈ、ｔ、７Ｈｚ）、３．３４（１Ｈ、ｔ、８Ｈｚ）、３．５５（１Ｈ、ｔ、７Ｈｚ）、３．６０（１Ｈ、ｔ、７Ｈｚ）、３．６３と３．８５との間（１０Ｈ、未分割ピーク）、３．９１（２Ｈ、未分割ピーク）３．９６（１Ｈ、ｄｄ、７Ｈｚ及び２Ｈｚ）、４．０２と４．１０の間（３Ｈ、未分割ピーク）、４．１２（１Ｈ、ｄ、２Ｈｚ）、４．１８（１Ｈ、未分割ピーク）、４．４０（１Ｈ、ｄ、６Ｈｚ）、４．４６（１Ｈ、ｄ、６Ｈｚ）、４．６１（１Ｈ、ｄ、６Ｈｚ）、５．２９（１Ｈ、ｄ、３Ｈｚ）、５．８５（１Ｈ、ｄ、３Ｈｚ）。

添付した図面で示した本発明の例示的実施形態を詳細にここで記載する。

ヘパリンの調製物、ＬＭＷＨ及びＵＬＭＷＨにおけるグリコセリン残基の存在は、製品の商用価値を低下させる品質的及び安定性の問題の原因と成り得る。たとえば、エノキサパリン安定性試験では、グリコセリン残基は着色速度を増加させ、承認された製造計画にはない製品バッチを導く可能性がある。図１参照。ヘパリンにおいてグリコセリンの量を制御すると、ＬＭＷＨ及びＵＬＭＷＨを含めた、生じる市販製品をよりよく標準化することが可能である。その結果、販売できない製造製品バッチの危険性を減少させることができる。

過マンガン酸カリウムなどの本明細書で記載した過マンガン酸塩の少なくとも１種の作用によって、ヘパリン鎖中のグリコセリン残基の選択的切断が可能であることが示された。さらに、過マンガン酸塩の作用部位、過マンガン酸塩の作用機構及び過マンガン酸作用から得られる構造が特徴付けられた。

その結果として、本発明の主題は、以下の段階、
ａ）前述したような方法に従って、ヘパリンの重量に対して約４％から約１０％の、過マンガン酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム及び過マンガン酸４級アンモニウムから選択される少なくとも１種の過マンガン酸塩、たとえば過マンガン酸カリウムにより、約３５℃から約９０℃の範囲の温度でヘパリンを処理する段階、及び
ｂ）グリコセリンを含まない、脱色ヘパリンを精製する段階を含む、グリコセリンを含まない脱色ヘパリン及びグリコセリンを含まない脱色ヘパリンの調製方法である。

１実施形態では、温度は約４０℃から約８０℃の範囲である。この範囲内で、ヘパリンの重量に対して８％の過マンガン酸塩により処理すると、グリコセリン残基の除去におけるその効果が維持される。ヘパリンの重量に対して４％以上の過マンガン酸塩の過マンガン酸塩濃度により、約８０℃の温度で本発明にしたがって処理すると、検出可能なグリコセリン残基を実質的に除去される。ヘパリンの重量に対して８％未満の過マンガン酸塩により処理すると、グリコセリン残基の除去はもはや十分ではあり得ない（以下の実施例９を参照のこと）。実際に、酸化段階で使用した過マンガン酸カリウムの濃度は、グリコセリン残基の減少又は除去における温度よりも重要である。

本発明によって調製されたヘパリンは、次にその他のグリコセリンを含まない脱色ヘパリン製品、たとえば、フラキシパリン、フラグミン、インノヘップ（ロギパリン）、ノルミフロ、エムボレックス（サンドパリン）、フラクサム（ミニダルトン）、クリバリン及びヒボールの調製に使用することができる。

本発明の他の実施形態は、
ａ）過マンガン酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム及び過マンガン酸４級アンモニウムから選択される少なくとも１種の過マンガン酸塩の、ヘパリンに対して約４重量％から約１０重量％により酸化することによってヘパリンを精製し、酸化は約３５℃から約９０℃の範囲の温度で起こること、及び
ｂ）Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＳＡ、その完全子会社、及びその承継人及び譲渡人、及びＡｖｅｎｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＳＡの代理人、その完全子会社及びその承継人及び譲渡人から選択される製造者以外の製造者によって、前記エノキサパリンを得るための方法に従って酸化ヘパリンを脱重合することを含む、ヘパリンからの脱色エノキサパリンの調製法を目的とする。

さらに、本発明の他の実施形態は、前記エノキサパリンを得るために、Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＳＡ、その完全子会社、及びその承継人及び譲渡人、及びＡｖｅｎｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＳＡの代理人、その完全子会社及びその承継人及び譲渡人から選択される製造者以外の製造者による方法に従って、過マンガン酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム及び過マンガン酸４級アンモニウムから選択される少なくとも１種の過マンガン酸塩の、ヘパリンに対して約４重量％から約１０重量％によって酸化されたヘパリンを脱重合し、酸化が約３５℃から約９０℃の範囲の温度で起こることを含む、脱色エノキサパリンの調製法を目的とする。

さらに、本発明によって調製されたヘパリンは、次にグリコセリンを含まない、脱色ＵＬＭＷＨを調製するために使用することができる。ＬＭＷＨ及びＵＬＭＷＨの調製方法は、たとえば、ＦＲ２４４０３７６、米国特許第４６９２４３５号、ＦＲ２４５３８７５、Ｂａｒｒｏｗｃｌｉｆｆｅ、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１２、２７〜３６（１９７７）、米国特許第４４０１７５８号、ＥＰ１４１８４、ＥＰ３７３１９、ＥＰ７６２７９、ＥＰ６２３６２９、ＦＲ２５０３７１４、米国特許第４８０４６５２号、ＷＯ８１３２７６、ＥＰ４０１４４、米国特許第５３８９６１８号、ＥＰ２８７４７７、ＥＰ３４７５８８、ＥＰ３８０９４３、米国特許第４５３３５４９号、米国特許第４６２９６９９号、米国特許第４７９１１９５号、米国特許第４９８１９５５号、ＥＰ３８０９４３、ＥＰ３４７５８８、ＥＰ６４４５２、米国特許第４３９６７６２号、ＥＰ２４４２３５、ＥＰ２４４２３６、米国特許第４８２６８２７号、米国特許第３７６６１６７号）、ＥＰ２６９９８１、米国特許第４３０３６５１号、米国特許第４７５７０５７号及び米国特許出願公開第２００２−００５５６２１ Ａ１に開示されている。（いずれもこのような方法の開示について本明細書に組み込まれるが、但し、米国特許第５３８９６１８号は共存する再発行手続の結果として補正されたときのみ組み込まれる。）。

したがって、本発明の他の主題は、この出願の出願日現在でＵＳＦＤＡによって承認されている入手可能なＬＭＷＨを除いた、グリコセリンを含まない脱色ＬＭＷＨ及び、以下の段階、
ａ）前述したような方法に従って、ヘパリンの重量に対して約４％から約１０％の、過マンガン酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム及び過マンガン酸４級アンモニウムから選択される少なくとも１種の過マンガン酸塩、たとえば過マンガン酸カリウムにより、約３５℃から約９０℃の範囲の温度でヘパリンを処理する段階、
ｂ）グリコセリンを含まない脱色ヘパリンを精製する段階、及び
ｃ）前記グリコセリンを含まない脱色ＬＭＷＨを製造するために、グリコセリンを含まない脱色ヘパリンを脱重合する段階を含む、グリコセリンを含まない脱色ＬＭＷＨの調製方法である。

以下の構造は、ヘパリン中の過マンガン酸塩切断点を示しており、ヘパリン分子の酸化中の過マンガン酸カリウムの作用機構を示す。

理論付けられてはないが、ヘパリンが本発明の方法に従って処理されるとき、過マンガン酸塩はグルクロン酸の近接したジオールに作用し、セリン残基の選択的除去を可能にすると考えられる。過マンガン酸カリウムは非常に選択的であるが、過ヨウ素酸ナトリウムはまた、これらの部位でヘパリンを切断する（Ｈ．Ｅ．Ｃｏｎｒａｄ、Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、１３０、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）を参照のこと。）。しかし、過マンガン酸による反応とは対照的に、過ヨウ素酸ナトリウムのヘパリンとの反応はＡＴＩＩＩ部位を分解し、抗凝固活性の所望しない損失が生じる。同著。

本発明による過マンガン酸カリウムによる処理はまた、グリコセリンアミノ酸を酸に分解し、それによってヘパリン着色反応（メイラード反応）に必要な成分のもとを除去する。本発明の方法によるヘパリンに対する過マンガン酸塩の作用は、以下の反応によって例示することができるが、これらは網羅的なものではない。

切断点を同定するための一般的な方法は、たとえば、本発明によって過マンガン酸カリウムで処理されたヘパリンにヘパリナーゼＩＩＩを作用させる方法である。この酵素は、ヘパリンの非硫酸化領域に対して特異性が高い。２−Ｏ−硫酸を含まないウロン酸を含有する二糖単位及び蛋白質（ヘパリン鎖を有する蛋白質はセリン−グリシン鎖である）に対してヘパリンが結合するドメインを選択的に脱重合する。ΔＩＶａ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｓｅｒ成分又はその任意の酸化誘導体のΔＩＶａ、ΔＩＶｓ二糖の形成は、すなわち、ＩＶａ二糖を有する結合領域は、主にヘパリナーゼＩＩＩによる消化後に認められる。この酵素は、ヘパリン鎖の残りの部分に影響を及ぼさない。したがって、脱重合された物質は、ヘパリンオリゴ糖（二糖から四糖）及びその他の多糖の混合物を含有する。この混合物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析できるようにする前に、ヘパリン鎖を除去するために前処理する必要がある。当業者であれば、ミリポア膜（５ｋＤａ）による超遠心又はメタノール沈殿とその後の遠心を含めたいくつかのヘパリン鎖除去方法に精通しているであろう。したがって、調製された溶液はその後ＨＰＬＣによって分析することができる。以下の断片は、ＨＰＬＣ（多孔質黒鉛）／質量分析連結（「ＭＭ」は分子量を意味する）によって同定することができる。

四糖ＭＭ＝６９０及び三糖ＭＭ＝５８８の構造は、各磁気共鳴（ＮＭＲ）によって確認した。

これらの断片は、本発明による過マンガン酸カリウムによる処理は蛋白質結合領域に選択的に作用し、セリン残基を除去することを示している。化合物ＭＭ＝６９０は、反応１とそれに続く酵素消化の結果である。化合物ＭＭ＝５１１は、反応２とそれに続く酵素消化の結果である。化合物ＭＭ＝５８８は、反応３とそれに続く酵素消化の結果である。

前記の化合物ＭＭ＝５１１、ＭＭ＝５８８及びＭＭ＝６９０は、実質的に純粋な形態で単離され、得ることができる。本明細書では、「実質的に純粋」とは、質量分析又はＮＭＲによって化合物を同定するために十分純粋であることを意味する。１実施形態において、実質的に純粋な化合物は少なくとも８０％純粋な化合物である。他の実施形態において、実質的に純粋な化合物は少なくとも９０％純粋な化合物である。本発明の一態様において、試料を脱重合して、ＭＭ＝５１１、ＭＭ＝５８８及びＭＭ＝６９０から選択されるオリゴ糖を検出するためにクロマトグラフィー法を使用して試料を分析することを含む、ヘパリン又はヘパリン製品の試料のオリゴ糖含量を決定する方法を提供する。関連する実施形態において、オリゴ糖含量は外部較正又は内部較正によって定量される。他の実施形態において、該内部較正は内部標準を含む。関連する実施形態において、該内部標準は、ＭＭ＝５１１、ＭＭ＝５８８及びＭＭ＝６９０から選択される実質的に純粋な化合物である。

構造確認のために、ＨＰＬＣを使用して、結合関連ドメイン（グリコセリン）に特徴的な四糖を単離して、ＮＭＲで同定する（たとえば、粗ヘパリンはヘパリナーゼＩＩＩの作用によって選択的に脱重合できる。）。

Ｙａｍａｄａ他は、Ｙａｍａｄａ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（３９）：２２９１４（１９９５）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（３）：１５２８（１９９２）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８：８３８（１９９９）において、ヘパリナーゼによるヘパリン脱重合の研究によってこの断片を特徴付けた。

着色の問題は、ヘパリン、ＬＭＷＨ及びＬＭＷＨ調製物の貯蔵寿命に影響を与える可能性があるので、製造工程中の品質管理が必要であり、本発明の他の主題は、グリコセリン及びその酸化誘導体の存在を検出し、及び／又は定量するための、このような調製物の分析方法である。該方法の１実施形態は、以下の段階、
ａ）試料の脱重合段階、
ｂ）該試料がヘパリン又はヘパリン製品いずれであるにせよ、得られたオリゴ糖をＨＰＬＣで分離する段階、及び
ｃ）グリコセリン及び／又はその酸化誘導体を含有するオリゴ糖を検出する段階を含む。

本発明の１実施形態において、試料の脱重合は、たとえば、Ｇｒａｍｐｉａｍ Ｅｎｚｙｍｅｓから入手したヘパリナーゼ１（ＥＣ４．２．２．７．）、ヘパリナーゼ２（ヘパリンリアーゼＩＩ）及びヘパリナーゼ３（ＥＣ４．２．２．８．）を含むヘパリナーゼ混合物の作用によって実施することができる。酵素的脱重合は、当業者によって決定できる一定の時間、当業者によってまた決定できる適切な温度で実施することができる。たとえば、酵素的脱重合は、測定すべきヘパリン２０ｍｇ／ｍｌを含有する水性溶液２０μｌ並びに酢酸カルシウム２ｍＭ及びＢＳＡ２ｍｇ／ｍｌを含有する１００ｍＭ酢酸／ＮａＯＨ溶液、ｐＨ７．０、１００μｌをヘパリナーゼ１、２及び３それぞれを０．５単位／ｍｌを含むヘパリナーゼ１、ヘパリナーゼ２及びヘパリナーゼ３の混合物を含む保存溶液２０μｌと混合することによって、周囲温度で４８時間実施することができる。当業者は、これらの実験条件を基質及び酵素の様々な量に容易に適応させることができる。

本発明の方法において、脱重合された試料中に存在する様々な多糖及びオリゴ糖は、当業者に公知の方法を使用して分離し定量する。たとえば、グリコセリン及びその酸化誘導体を含む多糖及びオリゴ糖は、たとえば、−ＮＭｅ_３ ^＋などの４級アンモニウム誘導体がグラフトされた固定相を備えた陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して、ＨＰＬＣによって分離することができる。該クロマトグラフィー用カラムには様々な使用可能な樹脂のいずれか、たとえば、粒子の大きさがたとえば５μｍから１０μｍの範囲のＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂ ＳＡＸ種を充填することができる。

使用した装置は、溶出勾配の形成が可能でＵＶ検出器を利用できる任意のクロマトグラフであってよい。本発明の１実施形態では、ＵＶ検出器は、少なくとも２種類の異なる波長で要素のＵＶスペクトルを測定でき、これらの異なる波長の吸収の間の違いから得られる信号を記録できるダイオードアレイであってよい。これによって、アセチル化オリゴ糖の特異的検出が可能である。この種の検出を可能にするために、２００ｎｍまでのＵＶ光を通過させる移動相が好ましい。移動相の例は、過塩素酸塩、メタンスルホン酸塩又はリン酸塩をベースとしてよい。また、分離用の移動相のｐＨは、約２．０から約６．５であることが可能である。特定の１実施形態では、移動相のｐＨは約３である。非アセチル化多糖類は全て、所与のｐＨで、よく似たＵＶスペクトルを示すので、非アセチル化糖類の吸収率を相殺するように選択された２種類の波長での吸収の違いをシグナルとして取得することよって、選択的にアセチル化糖類を検出することが可能である。

グリコセリン及びその酸化誘導体を含む多糖類及びオリゴ糖類の定量は、外部較正又は内部較正の方法を使用して実施できる。本発明の１実施形態において、使用した内部標準は、２−ナフトール−３，６−ジスルホン酸である。この実施形態において、測定すべきヘパリンの水性溶液は、２−ナフトール−３，６−ジスルホン酸約０．１５ｇ／ｌを含有する。脱重合化された試料は、本明細書に参考により組み込む２００２年９月２２日に出願された特許ＦＲ０２１１７２４に記載された方法に従ってクロマトグラフィーによって測定することができ、グリコセリン含量の測定法についてその特定の適用を以下に例示した。

例として、本発明によるクロマトグラフィー分離の可能な条件を以下に挙げる。

−５μｍ ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ ＳＡＸカラム、長さ２５ｃｍ、内径２．１ｍｍ。

−溶媒Ａ：Ｈ_３ＰＯ_４を添加してｐＨ２．９にしたＮａＨ_２ＰＯ_４ ２．５ｍＭ。

−溶媒Ｂ：Ｈ_３ＰＯ_４を添加してｐＨ３．０にした１Ｎ ＮａＣｌＯ_４−ＭａＨ_２ＰＯ_４ ２．５ｍＭ。

溶出勾配は以下の通りであってよい。

−Ｔ＝０分：％Ｂ＝３
−Ｔ＝４０分：％Ｂ＝６０、及び
−Ｔ＝６０分：％Ｂ＝８０。

これらの条件例によって脱重合ヘパリン物質を分析した結果を表したクロマトグラムを図２に示す。特に、本発明の主題は、結合ドメイン（グリコセリン）に特徴的な四糖の存在を追究する、前記で定義した様な分析方法である。この四糖は、

である。

本発明の他の態様は、クロマトグラフィー分離中に利用される検出方法である。特に、ＵＶ検出の特異性を高めるために、方法を開発した。図３に示したように、２０２ｎｍ及び２４０ｎｍを検出及び参照波長として選択し、２０２〜２４０ｎｍ信号を記録する。この技法に適切な検出器は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＤＡＤ１１００検出器である。この場合、２重検出、すなわち、最初に２３４ｎｍ、次に２０２〜２４０ｎｍの検出を実施する。

本発明の主題はまた、陰イオン交換クロマトグラフィーによる分離を使用した前記で定義した分析法であり、該検出方法はアセチル化糖の選択的検出を可能にする。本発明の主題はまた、交換クロマトグラフィーによる分離を使用した、前記で定義した分析方法であり、非アセチル化糖類の吸収率を相殺するように選択された２種類の波長の吸収の違いを信号として取得することよって、アセチル化糖の選択的な検出を実施する。

試料の比色分析の準備
濃度が１００ｍｇ／ｍｌに調節されるように水溶液を調製することが可能であり、得られた溶液を次に多孔率０．２２μｍの膜フィルターで濾過する。次に、４００ｎｍにおける吸収の値を測定する。この測定値は試験開始値に対応する。該溶液を瓶当たり約５ｍｌの割合で７本の瓶に分配する。次に、該試料を４５℃のオーブン内に設置する。毎週、オーブンから瓶を１本取り出し、４００ｎｍの吸収の値を２０℃で測定する。６週間後、試料の適合性を測定することができる。

糖類及び図２のクロマトグラフによるピークに関する用語：
ＩｄｏＡ：α−Ｌ−ヨードピラノシルウロン酸、
ＧｌｃＡ：β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸、
ΔＧｌｃＡ：４，５−不飽和酸：４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘクス−４−エンピラノシルウロン酸、
Ｇａｌ：Ｄ−ガラクトース、
Ｘｙｌ：キシロース、
ＧｌｃＮＡｃ：２−デオキシ−２−アセトアミド−α−Ｄ−グルコピラノース、
ＧｌｃＮＳ：２−デオキシ−２−スルファミド−α−Ｄ−グルコピラノース、
２Ｓ：２−Ｏ−硫酸、
３Ｓ：３−Ｏ−硫酸、
６Ｓ：６−Ｏ−硫酸、
１：ΔＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ
２：（４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘキセンピラノシルウロン酸）−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−α−Ｄ−グルコピラノース、ナトリウム塩、
５：（４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘキセンピラノシルウロン酸）−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−α−Ｄ−グルコピラノース、２ナトリウム塩、
６：（４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘキセンピラノシルウロン酸）−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノース、２ナトリウム塩、
９：（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−トレオ−ヘキセンピラノシルウロン酸）−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−α−Ｄ−グルコピラノース、２ナトリウム塩、
１１：（４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘキセンピラノシルウロン酸）−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノース、３ナトリウム塩、
１２：（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−トレオ−ヘキセンピラノシルウロン酸）−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−α−Ｄ−グルコピラノース、３ナトリウム塩、
１４：（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−トレオ−ヘキセンピラノシルウロン酸）−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノース、３ナトリウム塩、
１５：（４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘキセンピラノシルウロン酸）−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−（β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸）−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−３−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノース、５ナトリウム塩、
１６：（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−トレオ−ヘキセンピラノシルウロン酸）−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノース、４ナトリウム塩、
１７：（４−デオキシ−α−Ｌ−トレオ−ヘキセンピラノシルウロン酸）−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−（β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸）−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−３，６−ジ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノース、６ナトリウム塩。

したがって、本発明の方法は、分析前の試料の予備処理方法及び結合ドメインに特徴的な四糖の有無を決定するために使用したクロマトグラフィー法を含む。

（実施例）
以下の実施例において、略語「ＮＩ」は内部較正の意味である。実施例６〜１１は、ヘパリンのグリコセリン残基の除去に対する温度及び過マンガン酸カリウム濃度の影響を示す。

「改良型」ヘパリンの調製
この方法は、粗ヘパリン調製物の抗Ｘａ活性を高めるもので、グリコセリン残基を除去する方法によりヘパリン調製物を使用する前に使用することができる。この実施例で調製された「改良型」ヘパリンは、実施例２〜１０で使用された。また、この実施例で使用した粗ヘパリン調製物の最初の抗Ｘａ活性は１５０ＩＵ／ｍｇである。

水５２０ミリリットル及びＮａＣｌ１１２．５ｇ（２０％ｗ／ｖ）を２Ｌの容器に入れた。溶解後、粗ヘパリン６０．０ｇを該溶液に添加した。３０分間機械的に撹拌した後、懸濁液中の沈殿物を、ｃｌａｒｃｅｌ３３．９ｇを充填した３番焼結ガラス濾過器で濾過した。次に、該焼結ガラスフィルターをＮａＣｌ２０％（ｗ／ｖ）溶液１２０ｍｌで濯いだ。得られた濾液（７０４ｍｌ）を２Ｌの反応容器に添加し、機械的攪拌機の存在下でメタノール（３８８ｍｌ）を迅速に注いだ。温度約２０℃で約２時間撹拌した後、懸濁液を一晩沈殿させた。上清（８０４ｍｌ）を取り出し、廃棄して、沈殿した沈殿物をＮａＣｌ２０％溶液（水３６８ｍｌ中ＮａＣｌ７３．５ｇ）に溶解した。３０分間撹拌した後、メタノール３８５ｍｌを迅速に添加した。温度約２０℃で約１時間撹拌した後、懸濁液を約１２時間沈殿させた。次に上清（８４０ｍｌ）を取り出し、廃棄して、メタノール（４００ｍｌ）を沈殿した沈殿物に添加した。再度、約１時間撹拌した後、該懸濁液を約１２時間沈殿させ、上清（４３０ｍｌ）を取り除いて廃棄した。メタノール（４００ｍｌ）を沈殿した沈殿物に添加した。約１時間この溶液を撹拌した後、懸濁液を約１２時間沈殿させた。沈殿後、懸濁した沈殿物を３番焼結ガラス濾過器で濾過した。得られたケーキをメタノール４００ｍｌで２回洗浄した。湿った固形物をフィルター乾燥して、次に減圧下（６ｋＰａ）で約４０℃の温度で乾燥させた。乾燥後、「改良型」ヘパリン４３．７ｇが得られた。収率は７３％だった。

グリコセリン残基はこれらの処理によって影響を受けず、試料中のグリコセリンの割合（ＮＩ％）は２．４であった。

過マンガン酸カリウムで酸化し、脱重合した「改良型」ヘパリン
実施例１で説明したように得られた「改良型」ヘパリン１２グラム及び蒸留水１２０ｍｌを２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れた。磁石で撹拌して該混合物の温度を４０℃に調節した。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによって、該混合物のｐＨを８．７±０．３に調節した。反応媒体を８０℃まで加熱して、固形ＫＭｎＯ_４０．９６ｇを添加した。１５分間撹拌した後、該混合物を８０℃で１時間凝集させた。次に、ｃｌａｒｃｅｌ（１．２ｇ）を添加した。１５分間撹拌した後、ｃｌａｒｃｅｌ１５ｇを充填した３番焼結ガラス濾過器で濾過することよって沈殿物を収集した。該沈殿物を６０℃の水２５ｍｌ、次いで２０℃の水２５ｍｌで洗浄した。次に、濾液（１８０ｍｌ）を２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れて、１％溶液を得るためにＮａＣｌ１．８ｇを濾液に添加した。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによって、ｐＨを約１１．２±０．３に調節した。該反応媒体を４５℃で２時間加熱して、次に約２０℃で約１２時間ゆっくり撹拌した。この溶液を３番焼結ガラス濾過器で濾過して、該漏斗を２０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液１５ｍｌで洗浄した。濾液を２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れて、３０％過ヨウ素酸水素水溶液１．２ｍｌを添加した。該反応媒体を２０℃で約１２時間ゆっくり撹拌した。６Ｎ ＨＣｌ溶液を添加することによってｐＨを６．２±０．３に調節して、ＮａＣｌ濃度を３％に調節した。この溶液を多孔率１μｍの膜で濾過して、該膜を水５ｍｌで洗浄した。この濾過から集めた濾液（２０４ｍｌ）を５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れて、磁石撹拌機の存在下でメタノール（１６３ｍｌ）を迅速に添加した。３０分間激しく撹拌した後、懸濁液を約１２時間沈殿させた。次に上清（２９５ｍｌ）を取り出し、廃棄して、メタノール（７０ｍｌ）を沈殿した沈殿物に添加した。約３０分間撹拌した後、懸濁液を約３時間沈殿させた。次に上清（８０ｍｌ）を取り出し、廃棄して、メタノール（６０ｍｌ）を沈殿した沈殿物に添加した。約３０分間撹拌した後、懸濁液を約１２時間沈殿させた。懸濁液中の沈殿物を３番焼結ガラス濾過器で濾過した。濾過によって得られたケーキをメタノール２５ｍｌで２回洗浄した。湿った固形物をフィルター乾燥して、次に減圧下（６ｋＰａ）で約４０℃の温度で乾燥させた。乾燥後、「精製」ヘパリン１０．３３ｇが得られた。得られた収率は８６．１％だった。

得られた組成物は以下の特徴を有した。

Ｎ％グリコセリン＝０
抗Ｘａ活性＝２０３．５ＩＵ／ｍｇ

酸化せずに発熱性物質を除去した「改良型」ヘパリン
実施例１で説明したように得られた「改良型」ヘパリン１２グラム及び蒸留水１２０ｍｌを２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れた。１％溶液を得るために、ＮａＣｌ（１．２１ｇ）を添加した。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによって、ｐＨを約１１．２±０．３に調節した。該反応媒体を４５℃で２時間加熱して、次に約２０℃の温度で約１２時間ゆっくり撹拌した。この溶液を３番焼結ガラス濾過器で濾過して、該漏斗を２０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液１０ｍｌで洗浄した。得られた濾液を２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れて、３０％過ヨウ素酸水素水溶液１．２ｍｌを添加した。該反応媒体を約２０℃の温度で１２時間ゆっくり撹拌した。６Ｎ ＨＣｌ溶液を添加することによって、ｐＨを６．２±０．３に調節して、ＮａＣｌ濃度を３％に調節した。この溶液を多孔率１μｍの膜で濾過した。濾液（１３８ｍｌ）を２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れて、磁石撹拌機の存在下でメタノール（１１０ｍｌ）を迅速に添加した。３０分間撹拌した後、懸濁液を約１２時間沈殿させた。次に上清（１９５ｍｌ）を取り出し、廃棄して、メタノール（５５ｍｌ）を沈殿した沈殿物に添加した。約３０分間撹拌した後、懸濁液を約１時間沈殿させた。上清（５７ｍｌ）を再度取り出して、廃棄した。メタノール（５５ｍｌ）を沈殿した沈殿物に添加した。３０分間撹拌した後、懸濁液を約１２時間沈殿させた。次に、この沈殿物を３番焼結ガラス濾過器で濾過することによって収集し、得られたケーキをメタノール２５ｍｌで２回洗浄した。湿った固形物をフィルター乾燥して、次に減圧下（６ｋＰａ）で約４０℃の温度で乾燥させた。乾燥後、「精製」ヘパリン１１．１２ｇが得られた。得られた収率は９２．７％だった。

得られた組成物は以下の特徴を有した。

ＮＩ％ グリコセリン＝２．４
抗Ｘａ活性＝２０３．５ＩＵ／ｍｇ

酸化も発熱性物質除去もしていない「改良型」ヘパリン
実施例１で説明したように得られた「改良型」ヘパリン１２グラム及び蒸留水１２０ｍｌを２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れた。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加して、ｐＨを約１１．２±０．３にし、過ヨウ素酸水素水溶液１．２ｍｌを添加した。該反応媒体を約２０℃の領域の温度で１２時間ゆっくり撹拌した。６Ｎ ＨＣｌ溶液を添加することによって、ｐＨを６．２±０．３に戻して、ＮａＣｌ力価を３％に調節した。この溶液を多孔率１μｍの膜で濾過して、水２ｍｌで洗浄した。得られた濾液（１３３ｍｌ）を５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れて、メタノール（１０６ｍｌ）を磁石撹拌機の存在下で迅速に添加した。３０分間撹拌した後、懸濁液を翌日まで沈殿させた。次に上清を取り出し、廃棄して（１９０ｍｌ）、メタノール５０ｍｌを沈殿した沈殿物に添加した。約３０分間撹拌した後、懸濁液を４時間沈殿させた。再度上清を取り出し、その後廃棄して（４８ｍｌ）、メタノール５０ｍｌを沈殿した沈殿物に添加した。３０分間撹拌した後、懸濁液を約１２時間沈殿させた。沈殿後、懸濁液中の沈殿物を３番焼結ガラス濾過器で濾過した。次に、得られたケーキをメタノール２５ｍｌで２回洗浄した。湿った固形物をフィルター乾燥して、次に減圧下（６ｋＰａ）で約４０℃の領域の温度で乾燥させた。乾燥後、「精製」ヘパリン１０．４８ｇが得られた。得られた収率は８７．３５％だった。

得られた組成物は以下の特徴を有した。

ＮＩ％グリコセリン＝２．４
抗Ｘａ活性＝２０９．５ＩＵ／ｍｇ

酸化して発熱性物質を除去しなかった「改良型」ヘパリン
実施例１によって得られた「改良型」ヘパリン１２グラム及び蒸留水１２０ｍｌを２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れた。該混合物を磁石撹拌機の存在下で４０℃にした。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによってｐＨを８．７±０．３にした。反応媒体を約８０℃まで加熱して、固形ＫＭｎＯ_４０．９６ｇを該反応媒体に添加した。１５分間撹拌した後、該混合物を８０℃で１時間凝集させた。次に、ｃａｒｃｅｌ１．２ｇを添加した。１５分間撹拌した後、懸濁液中の沈殿物を、ｃｌａｒｃｅｌ１５ｇを充填した３番焼結ガラス濾過器で濾過した。これを６０℃の水２５ｍｌ、次いで２０℃の水２５ｍｌで連続的に洗浄した。濾液（１７８ｍｌ）を２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れて、３０％過ヨウ素酸水素水溶液１．２ｍｌを添加した。該反応混合物を約２０℃の領域の温度で１２時間ゆっくり撹拌した。６Ｎ ＨＣｌ溶液を添加することによって、ｐＨを６．２±０．３に戻して、ＮａＣｌ力価を３％に調節した。次に、この溶液を多孔率１μｍの膜で濾過して、水２ｍｌで洗浄した。得られた濾液（１９２ｍｌ）を５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れて、メタノール１５４ｍｌを磁石撹拌機の存在下で迅速に添加した。３０分間撹拌した後、懸濁液を翌日まで沈殿させた。次に上清を取り出し、廃棄して（２８３ｍｌ）、メタノール６０ｍｌを沈殿した沈殿物に添加した。約３０分間撹拌した後、懸濁液を４時間沈殿させた。再度上清を取り出し、廃棄して（５８ｍｌ）、メタノール６０ｍｌを沈殿した沈殿物に添加した。３０分間撹拌した後、懸濁液を約１２時間沈殿させた。懸濁液中の沈殿物を３番焼結ガラス濾過器で濾過した。次に、得られたケーキをメタノール２５ｍｌで２回洗浄した。湿った固形物をフィルター乾燥して、次に減圧下（６ｋＰａ）で約４０℃の領域の温度で乾燥させた。乾燥後、「精製」ヘパリン１０．３１ｇが得られた。得られた収率は８５．９％だった。

得られた組成物は以下の特徴を有した。

ＮＩ％グリコセリン＝０
抗Ｘａ活性＝２１０．３ＩＵ／ｍｇ

８％ＫＭｎＯ_４中で８０℃で酸化した「改良型」ヘパリン
実施例１によって得られた「改良型」ヘパリン１０グラム及び蒸留水１００ｍｌを２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れた。該混合物を磁石撹拌機の存在下で４０℃にした。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによって、ｐＨを８．７±０．３にした。反応媒体を８０℃まで加熱して、固形ＫＭｎＯ_４０．８０ｇを添加した。１５分間撹拌した後、該混合物を８０℃で１時間凝集させた。次に、ｃａｒｃｅｌ１．０ｇを添加した。１５分間撹拌した後、懸濁液中の沈殿物を、ｃｌａｒｃｅｌ１５ｇを充填した３番焼結ガラス濾過器で濾過した。これを６０℃の水２５ｍｌ、次いで２０℃の水２５ｍｌで連続的に洗浄した。得られた濾液（１５２ｍｌ）を２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れて、１％溶液を得るためにＮａＣｌ１．５ｇを添加した。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによって、ｐＨを約１１±０．３にした。該反応媒体を約４５℃で２時間加熱して、次に約２０℃の領域の温度で１２時間ゆっくり撹拌した。該溶液を３番焼結ガラス濾過器で濾過した。得られた濾液を２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れて、３０％過ヨウ素酸水素水溶液１．０ｍｌを添加した。該反応媒体を約２０℃の領域の温度で１２時間ゆっくり撹拌した。６Ｎ ＨＣｌ溶液でｐＨを６．２±０．３に戻して、ＮａＣｌ力価を３％に調節した。該溶液を多孔率１μｍの膜で濾過して、濾液の半分（７０ｍｌ）を２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れて、メタノール５６ｍｌを磁石撹拌機の存在下で迅速に添加した。３０分間撹拌した後、該混合物を沈殿させた。上清を取り出し、その後廃棄して（１１８ｍｌ）、メタノール６０ｍｌを沈殿した沈殿物に添加した。３０分間撹拌した後、懸濁液を約１２時間沈殿させた。次に上清を取り出し、廃棄して（５４ｍｌ）、メタノール５０ｍｌを沈殿した沈殿物に添加した。約３０分間撹拌した後、懸濁液を約１２時間沈殿させた。懸濁液中の沈殿物を３番焼結ガラス濾過器で濾過した。次に、得られたケーキをメタノール２５ｍｌで２回洗浄した。湿った固形物をフィルター乾燥して、次に減圧下（６ｋＰａ）で約４０℃の領域の温度で乾燥させた。乾燥後、「精製」ヘパリン２．８０ｇが得られた。得られた収率は６３．３％だった。

得られた組成物は以下の特徴を有した。

ＮＩ％グリコセリン＝０．０

４％ＫＭｎＯ_４中で８０℃で酸化した「改良型」ヘパリン
実施例１によって得られた「改良型」ヘパリン１０グラム及び蒸留水１００ｍｌを２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れた。該混合物を磁石撹拌機の存在下で４０℃にした。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによってｐＨを８．７±０．３にした。反応媒体を８０℃まで加熱して、固形ＫＭｎＯ_４０．４０ｇを添加した。１５分間撹拌した後、該混合物を８０℃で１時間凝集させた。ｃａｒｃｅｌ１．０ｇを添加した。１５分間撹拌した後、懸濁液中の沈殿物を、ｃｌａｒｃｅｌ１５ｇを充填した３番焼結ガラス濾過器で濾過した。これを６０℃の水２５ｍｌ、次いで２０℃の水２５ｍｌで連続的に洗浄した。得られた濾液（１５８ｍｌ）を２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れて、１％溶液を得るためにＮａＣｌ１．６ｇを添加した。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによってｐＨを約１１±０．３にした。該反応媒体を４５℃で２時間加熱して、次に約２０℃の領域の温度で１２時間ゆっくり撹拌した。該溶液を３番焼結ガラス濾過器で濾過した。濾液を再度２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れて、３０％過ヨウ素酸水素水溶液１．０ｍｌを添加した。該反応媒体を２０℃の領域の温度で１２時間ゆっくり撹拌した。６Ｎ ＨＣｌ溶液でｐＨを６．２±０．３に戻して、ＮａＣｌ力価を３％に調節した。この溶液を多孔率１μｍの膜で濾過した。濾液（１５２ｍｌ）を５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れて、メタノール１２２ｍｌを磁石撹拌機の存在下で迅速に添加した。上清を取り出し、廃棄して（２５１ｍｌ）、メタノール１００ｍｌを沈殿した沈殿物に添加した。３０分間撹拌した後、懸濁液を約１２時間沈殿させた。次に上清を取り出し、廃棄して（９７ｍｌ）、メタノール１００ｍｌを沈殿した沈殿物に添加した。約３０分間撹拌した後、懸濁液を約１２時間沈殿させた。懸濁液中の沈殿物を３番焼結ガラス濾過器で濾過した。次に、得られたケーキをメタノール３０ｍｌで２回洗浄した。湿った固形物をフィルター乾燥して、次に減圧下（６ｋＰａ）で４０℃の領域の温度で乾燥した。乾燥後、「精製」ヘパリン６．４ｇが得られた。得られた収率は７１％だった。

得られた組成物は以下の特徴を有した。

ＮＩ％グリコセリン＝０．０

８％ＫＭｎＯ_４中で４０℃で酸化した「改良型」ヘパリン
実施例１によって得られた「改良型」ヘパリン１０グラム及び蒸留水１００ｍｌを２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れた。該混合物を磁石撹拌機の存在下で４０℃にした。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによって、ｐＨを８．７±０．３にした。次に、反応媒体を４０℃まで加熱して、固形ＫＭｎＯ_４０．８０ｇを添加した。１５分間撹拌した後、該混合物を８０℃で１時間凝集させた。ｃａｒｃｅｌ１．０ｇを添加した。１５分間撹拌した後、懸濁液中の沈殿物を、ｃｌａｒｃｅｌ１５ｇを充填した３番焼結ガラス濾過器で濾過した。これを６０℃の水２５ｍｌ、次いで２０℃の水２５ｍｌで連続的に洗浄した。得られた濾液（１４２ｍｌ）を２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れて、１％溶液を得るためにＮａＣｌ１．４２ｇを添加した。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによって、ｐＨを約１１±０．３にした。該反応媒体を４５℃で２時間加熱して、次に２０℃の領域の温度で１２時間ゆっくり撹拌した。次に、該溶液を３番焼結ガラス濾過器で濾過した。濾液を再度２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れて、３０％過ヨウ素酸水素水溶液１．０ｍｌを添加した。該反応媒体を２０℃の領域の温度で１２時間ゆっくり撹拌した。６Ｎ ＨＣｌ溶液でｐＨを６．２±０．３に戻して、ＮａＣｌ力価を３％に調節した。この溶液を多孔率１μｍの膜で濾過して、濾液の半分（８０ｍｌ）を２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れた。磁石撹拌機の存在下でメタノール６４ｍｌを迅速に添加した。約３０分間撹拌した後、懸濁液を沈殿させた。上清を取り出し、その後廃棄して（１３１ｍｌ）、メタノール６０ｍｌを沈殿した沈殿物に添加した。約３０分間撹拌した後、懸濁液を約１２時間沈殿させた。次に上清を取り出し、廃棄して（５２ｍｌ）、メタノール５０ｍｌを沈殿した沈殿物に添加した。該懸濁液を３番焼結ガラス濾過器で濾過した。次に、得られたケーキをメタノール２５ｍｌで２回洗浄した。湿った固形物をフィルター乾燥して、次に減圧下（６ｋＰａ）で４０℃の領域の温度で乾燥させた。乾燥後、「精製」ヘパリン２．３ｇが得られた。得られた収率は５４％だった。

得られた組成物は以下の特徴を有した。
ＮＩ％グリコセリン＝０．０

８％ＫＭｎＯ_４で、６０℃で酸化した「改良型」ヘパリン
実施例１によって得られた「改良型」ヘパリン１０グラム及び蒸留水１００ｍｌを２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れた。該混合物を磁石で撹拌しながら４０℃にした。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによって、ｐＨを８．７±０．３にした。反応媒体を６０℃まで加熱して、固形ＫＭｎＯ_４０．８０ｇを添加した。１５分間撹拌した後、該混合物を８０℃で１時間凝集させた。次に、ｃａｒｃｅｌ１．０ｇを添加した。１５分間撹拌した後、懸濁液中の沈殿物を、ｃｌａｒｃｅｌ１５ｇを充填した焼結ガラス濾過器３で濾過した。次に、これを６０℃の水２５ｍｌ、次いで２０℃の水２５ｍｌで洗浄した。得られた濾液（１５０ｍｌ）を２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れた。１％溶液を得るために、ＮａＣｌ１．５ｇを添加した。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによって、ｐＨを約１１±０．３にした。該反応媒体を４５℃で２時間加熱して、次に約２０℃の領域の温度で１２時間ゆっくり撹拌した。該溶液を３番焼結ガラス濾過器で濾過した。濾液を再度２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れて、３０％過酸化酸素水溶液１．０ｍｌを添加した。該反応媒体を約２０℃の領域の温度で１２時間ゆっくり撹拌した。６Ｎ ＨＣｌ溶液でｐＨを６．２±０．３に戻して、ＮａＣｌ力価を３％に調節した。この溶液を多孔率１μｍの膜で濾過して、濾液の半分（７０ｍｌ）を２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れた。磁石撹拌機の存在下でメタノール５６ｍｌを迅速に添加した。次に上清を取り出し、廃棄して（１１８ｍｌ）、メタノール６０ｍｌを沈殿した沈殿物に添加した。約３０分間撹拌した後、該混合物を約１２時間沈殿させた。次に上清を取り出し、廃棄して（５４ｍｌ）、メタノール５０ｍｌを沈殿した沈殿物に添加した。該懸濁液を３番焼結ガラス濾過器で濾過した。次に、得られたケーキをメタノール２５ｍｌで２回洗浄した。湿った固形物をフィルター乾燥して、次に減圧下（６ｋＰａ）で約４０℃の領域の温度で乾燥した。乾燥後、「精製」ヘパリン３．１２ｇが得られた。得られた収率は６８％だった。

得られた組成物は以下の特徴を有した。

ＮＩ％グリコセリン＝０．０

２％ＫＭｎＯ_４で８０℃で酸化した「改良型」ヘパリン
前述のように得られた「改良型」ヘパリン１０グラム及び蒸留水１００ｍｌを２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れた。該混合物を磁石撹拌機の存在下で４０℃にした。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによって、ｐＨを８．７±０．３にした。反応媒体を８０℃まで加熱して、固形ＫＭｎＯ_４０．１６ｇを添加した。１５分間撹拌した後、該混合物を８０℃で１時間凝集させた。次に、ｃａｒｃｅｌ１．０ｇを添加した。１５分間撹拌した後、懸濁液中の沈殿物を、ｃｌａｒｃｅｌ１５ｇを充填した３番焼結ガラス濾過器で濾過した。次に、これを４０℃の水２５ｍｌ、次いで２０℃の水２５ｍｌで洗浄した。濾液（１１４ｍｌ）を２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れた。１％溶液を得るために、ＮａＣｌ１．１４ｇを添加した。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによって、ｐＨを約１１±０．３にした。該反応媒体を４５℃で２時間加熱して、次に約２０℃の領域の温度で１２時間ゆっくり撹拌した。該溶液を３番焼結ガラス濾過器で濾過した。濾液を再度２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れて、３０％過ヨウ素酸水素水溶液０．８ｍｌを添加した。該反応媒体を約２０℃の領域の温度で１２時間ゆっくり撹拌した。６Ｎ ＨＣｌ溶液でｐＨを６．２±０．３に戻して、ＮａＣｌ力価を３％に調節した。この溶液を多孔率１μｍの膜で濾過して、濾液の半分（７５ｍｌ）を２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れた。磁石撹拌機の存在下でメタノール６０ｍｌを迅速に添加した。約３０分間撹拌した後、混合物を沈殿させた。上清を取り出し、その後廃棄して（１２０ｍｌ）、メタノール５０ｍｌを沈殿した沈殿物に添加した。約３０分間撹拌した後、混合物を沈殿させた。次に上清を取り出し、廃棄して（３８ｍｌ）、メタノール４０ｍｌを沈殿した沈殿物に添加した。約３０分間撹拌した後、懸濁液を沈殿させた。次に、上清を取り出し、廃棄して（２７ｍｌ）、メタノール３０ｍｌを沈殿した沈殿物に添加した。該懸濁液を３番焼結ガラス濾過器で濾過した。次に、得られたケーキをメタノール２５ｍｌで２回洗浄した。湿った固形物をフィルター乾燥して、次に減圧下（６ｋＰａ）で約４０℃の領域の温度で乾燥させた。乾燥後、「精製」ヘパリン２．６１ｇが得られた。得られた収率は７２％だった。

得られた組成物は以下の特徴を有した。
ＮＩ％グリコセリン＝０．８

２％ＫＭｎＯ_４で６０℃で酸化した「改良型」ヘパリン
実施例１によって得られた「改良型」ヘパリン１０グラム及び蒸留水１００ｍｌを２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れた。該混合物を磁石撹拌機の存在下で４０℃にした。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによって、ｐＨを８．７±０．３にした。反応媒体を６０℃まで加熱して、固形ＫＭｎＯ_４０．１６ｇを添加した。１５分間撹拌した後、該混合物を６０℃で１時間凝集させた。次に、ｃａｒｃｅｌ１．０ｇを添加した。１５分間撹拌した後、懸濁液中の沈殿物を、ｃｌａｒｃｅｌ１５ｇを充填した３番焼結ガラス濾過器で濾過した。次に、これを４０℃の水２０ｍｌで２回洗浄した。濾液（１２９ｍｌ）を２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れた。１％溶液を得るために、ＮａＣｌ１．２９ｇを添加した。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによって、ｐＨを約１１±０．３にした。該反応媒体を４５℃で２時間加熱して、次に約２０℃の領域の温度で１２時間ゆっくり撹拌した。該溶液を３番焼結ガラス濾過器で濾過した。濾液を再度２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れて、３０％過ヨウ素酸水素水溶液０．８ｍｌを添加した。該反応媒体を約２０℃の領域の温度で１２時間ゆっくり撹拌した。６Ｎ ＨＣｌ溶液でｐＨを６．２±０．３に戻して、ＮａＣｌ力価を３％に調節した。この溶液を多孔率１μｍの膜で濾過して、濾液の半分（７５ｍｌ）を２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れた。磁石撹拌機の存在下でメタノール６０ｍｌを迅速に添加した。上清を取り出し、その後廃棄して（１２０ｍｌ）、メタノール５０ｍｌを沈殿した沈殿物に添加した。約３０分間撹拌した後、混合物を沈殿させた。次に、上清を取り出し、その後廃棄して（３２ｍｌ）、メタノール３０ｍｌを沈殿した沈殿物に添加した。約３０分間撹拌した後、混合物を沈殿させた。次に、上清を取り出し、廃棄して（２６ｍｌ）、メタノール３０ｍｌを沈殿した沈殿物に添加した。該懸濁液を３番焼結ガラス濾過器で濾過した。次に、得られたケーキをメタノール２５ｍｌで２回洗浄した。湿った固形物をフィルター乾燥して、次に減圧下（６ｋＰａ）で約４０℃の領域の温度で乾燥させた。乾燥後、「精製」ヘパリン２．２４ｇが得られた。得られた収率は６２％だった。

得られた組成物は以下の特徴を有した。
ＮＩ％グリコセリン＝０．９

Claims (69)

1. ａ）過マンガン酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム及び過マンガン酸４級アンモニウムから選択される少なくとも１種の過マンガン酸塩の、ヘパリンに対して約４重量％から約１０重量％により酸化することによってヘパリンを精製し、酸化が約３５℃から約９０℃の範囲の温度で起こること、及び
   ｂ）少なくとも１種の脱色ヘパリン製品を得るために前記酸化ヘパリンを脱重合することを含む、本出願の出願日現在ＵＳＦＤＡによって承認されている市販のＬＭＷＨ以外の、少なくとも１種の脱色ヘパリン製品をヘパリンから調製する方法。
2. 前記ヘパリン製品が脱重合後精製される、請求項１に記載の方法。
3. 少なくとも１種の過マンガン酸塩の濃度が約８％である、請求項１に記載の方法。
4. 前記少なくとも１種の過マンガン酸塩が過マンガン酸カリウムである、請求項１に記載の方法。
5. 前記ヘパリン製品が、エノキサパリン又はエノキサパリンナトリウムではない低分子量ヘパリンである、請求項１に記載の方法。
6. 前記ヘパリン製品が超低分子量ヘパリンである、請求項１に記載の方法。
7. 酸化が約４０℃から約８０℃の範囲の温度で起こる、請求項１に記載の方法。
8. 前記少なくとも１種のヘパリン製品がグリコセリンを含まない、請求項１に記載の方法。
9. 前記少なくとも１種のヘパリン製品が低下されたグリコセリン含量を有する、請求項１に記載の方法。
10. ａ）試料を処理すること、及び
    ｂ）前記試料中のグリコセリン及び／又は酸化グリコセリン残基の存在又は非存在を検出するためにクロマトグラフィー法を使用して前記試料を分析することを含む、ヘパリン又はヘパリン製品の試料のグリコセリン含量を測定する方法。
11. 前記試料の処理が前記試料の脱重合を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記試料が少なくとも１種のヘパリナーゼで脱重合される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記少なくとも１種のヘパリナーゼが、ヘパリナーゼ１、ヘパリナーゼ２及びヘパリナーゼ３から選択される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記試料が、ヘパリナーゼ１、ヘパリナーゼ２及びヘパリナーゼ３を含むヘパリナーゼの混合物で脱重合される、請求項１１に記載の方法。
15. 前記クロマトグラフィー法がアセチル化された基を検出する、請求項１０に記載の方法。
16. 前記クロマトグラフィー法が陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項１０に記載の方法。
17. 前記クロマトグラフィー法が強陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）を含む、請求項１５に記載の方法。
18. 前記強陰イオン交換クロマトグラフィーが４級アンモニウム交換基で官能化された固相支持体を含む、請求項１７に記載の方法。
19. 固定相が−ＮＭｅ^３＋を含む４級アンモニウム誘導体がグラフトされている、請求項１６に記載の方法。
20. 前記クロマトグラフィー法がＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーを含む、請求項１０に記載の方法。
21. 陰イオン交換クロマトグラフィー用の移動相が、波長約２００ｎｍから約４００ｎｍまでの紫外線（ＵＶ）光を透過する、請求項１６に記載の方法。
22. 前記移動相が、過塩素酸ナトリウム、メタンスルホン酸塩又はリン酸塩を含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記クロマトグラフィー法に続いて多糖類を検出する方法をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
24. 前記多糖類がＵＶ吸収によって検出される、請求項２３に記載の方法。
25. 前記ＵＶ吸収が、非アセチル化多糖類の吸収信号が相殺されるように選択された少なくとも２種類の波長で測定される、請求項２４に記載の方法。
26. 前記少なくとも２種類の波長が２０２ｎｍ及び２４０ｎｍを含む、請求項２５に記載の方法。
27. グリコセリン含量が外部又は内部較正によって定量される、請求項１０に記載の方法。
28. 前記内部較正が内部標準の使用を含む、請求項２７に記載の方法。
29. 前記内部標準が２−ナフトール−３，６−ジスルホン酸である、請求項２８に記載の方法。
30. 前記内部標準が２−ナフトール−３，６−ジスルホン酸約０．１５ｇ／ｌである、請求項２８に記載の方法。
31. 前記クロマトグラフィー法が、以下の構造
    

    

    を有するヘパリンのグリコセリン結合ドメインの四糖を検出することを含む、請求項１０に記載の方法。
32. 前記移動相のｐＨの範囲が約２．０から約６．５である、請求項２１に記載の方法。
33. 前記移動相のｐＨが約３である請求項３２に記載の方法。
34. ａ）試料を脱重合すること、
    ｂ）高速液体クロマトグラフィーによって前記試料中のオリゴ糖を分離すること、
    ｃ）グリコセリン及び／又はグリコセリンの酸化誘導体を含有するオリゴ糖を検出し、及び／又は定量することを含む、前記試料中のグリコセリン及び／又はグリコセリンの酸化誘導体を検出し、及び／又は定量するために、ヘパリン製品の試料を分析する方法。
35. 前記試料が少なくとも１種のヘパリナーゼの作用で脱重合される、請求項３４に記載の方法。
36. 前記少なくとも１種のヘパリナーゼが、ヘパリナーゼ１、ヘパリナーゼ２及びヘパリナーゼ３から選択される、請求項３５に記載の方法。
37. 前記試料がヘパリナーゼの混合物の作用によって脱重合される、請求項３４に記載の方法。
38. ヘパリナーゼの前記混合物が、ヘパリナーゼ１、ヘパリナーゼ２及びヘパリナーゼ３を含む、請求項３７に記載の方法。
39. 下式
    

    

    を有する実質的に純粋な化合物。
    下式
    

    

    を有する実質的に純粋な化合物。
40. 下式
    

    

    を有する実質的に純粋な化合物。
41. ａ）過マンガン酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム及び過マンガン酸４級アンモニウムから選択される少なくとも１種の過マンガン酸塩の、ヘパリンに対して約４重量％から約１０重量％により酸化することによってヘパリンを精製し、酸化が約３５℃から約９０℃の範囲の温度で起こること、及び
    ｂ）脱色ヘパリン製品を得るための方法に従って、前記酸化ヘパリンの製造者によって脱重合すること、を含む、フラキシパリン（ｆｒａｘｉｐａｒｉｎ）、フラグミン（ｆｒａｇｍｉｎ）、インノヘップ（ｉｎｎｏｈｅｐ）（ロギパリン（ｌｏｇｉｐａｒｉｎ））、ノルミフロ（ｎｏｒｍｉｆｌｏ）、エムボレックス（ｅｍｂｏｌｌｅｘ）（サンドパリン（ｓａｎｄｏｐａｒｉｎ））、フラクサム（ｆｌｕｘｕｍ）（ミニダルトン（ｍｉｎｉｄａｌｔｏｎ））、クリバリン（ｃｌｉｖａｒｉｎ）及びヒボール（ｈｉｂｏｒ）から選択される少なくとも１種の脱色ヘパリン製品を、ヘパリンから調製する方法。
42. 前記脱色ヘパリン製品を得るための方法に従って、過マンガン酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム及び過マンガン酸４級アンモニウムから選択される少なくとも１種の過マンガン酸塩の、ヘパリンに対して約４重量％から約１０重量％により酸化されたヘパリンを脱重合し、酸化が約３５℃から約９０℃の範囲の温度で起こることを含む、フラキシパリン（ｆｒａｘｉｐａｒｉｎ）、フラグミン（ｆｒａｇｍｉｎ）、インノヘップ（ｉｎｎｏｈｅｐ）（ロギパリン（ｌｏｇｉｐａｒｉｎ））、ノルミフロ（ｎｏｒｍｉｆｌｏ）、エムボレックス（ｅｍｂｏｌｌｅｘ）（サンドパリン（ｓａｎｄｏｐａｒｉｎ））、フラクサム（ｆｌｕｘｕｍ）（ミニダルトン（ｍｉｎｉｄａｌｔｏｎ））、クリバリン（ｃｌｉｖａｒｉｎ）及びヒボール（ｈｉｂｏｒ）から選択される少なくとも１種の脱色ヘパリン製品を調製する方法。
43. ａ）過マンガン酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム及び過マンガン酸４級アンモニウムから選択される少なくとも１種の過マンガン酸塩の、ヘパリンに対して４重量％から１０重量％の作用によってヘパリンを精製し、酸化が約３５℃から約９０℃の範囲の温度で起こること、
    ｂ）前記少なくとも１種の組成物を得るためにヘパリンを脱重合すること、及び
    ｃ）場合によって、前記少なくとも１種の組成物を精製することを含む方法に従って得られた、本出願の出願日現在でＵＳＦＤＡによって承認されているＬＭＷＨ及びＵＬＭＷＨ製品を除く、低グリコセリン及び無グリコセリンの、脱色されたＬＭＷＨ及びＵＬＭＷＨから選択される少なくとも１種の組成物。
44. 過マンガン酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム及び過マンガン酸４級アンモニウムから選択される少なくとも１種の過マンガン酸塩の、ヘパリンに対して４重量％から１０重量％の作用によって酸化されたヘパリンを脱重合し、酸化が約３５℃から約９０℃の範囲の温度で起こることを含む方法に従って得られた、本出願の出願日現在でＵＳＦＤＡによって承認されているＬＭＷＨ及びＵＬＭＷＨ製品を除く、低グリコセリン及び無グリコセリンの、脱色ＬＭＷＨ及びＵＬＭＷＨから選択される少なくとも１種の組成物。
45. ａ）過マンガン酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム及び過マンガン酸４級アンモニウムから選択される少なくとも１種の過マンガン酸塩の、ヘパリンに対して約４重量％から約１０重量％により酸化することによってヘパリンを精製し、酸化が約３５℃から約９０℃の範囲の温度で起こること、及び
    ｂ）Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＳＡ、その完全子会社、及びその承継人及び譲渡人、並びにＡｖｅｎｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＳＡの代理人、その完全子会社及びその承継人及び譲渡人から選択される製造者以外の製造者によって、エノキサパリンを得るための方法に従って酸化ヘパリンを脱重合することを含む、ヘパリンからの脱色エノキサパリンを調製する方法。
46. 前記エノキサパリンを得るために、Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＳＡ、その完全子会社、及びその承継人及び譲渡人、並びにＡｖｅｎｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＳＡの代理人、その完全子会社及びその承継人及び譲渡人から選択される製造者以外の製造者によって、過マンガン酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム及び過マンガン酸４級アンモニウムから選択される少なくとも１種の過マンガン酸塩の、ヘパリンに対して約４重量％から約１０重量％により酸化されたヘパリンを脱重合し、酸化が約３５℃から約９０℃の範囲の温度で起こることを含む、脱色エノキサパリンを調製する方法。
47. ａ）グリコセリン及び／又は酸化グリコセリン残基を試料から除去すること、及び／又は減少させること、及び
    ｂ）前記試料中のグリコセリン及び／又は酸化グリコセリン残基の存在又は非存在を検出するためにクロマトグラフィー法を使用して前記試料を分析することを含む、ヘパリン又はヘパリン製品の試料のグリコセリン含量をモニターする方法。
48. グリコセリン及び／又は酸化グリコセリン残基の除去及び／又は減少が、
    ａ）過マンガン酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム及び過マンガン酸４級アンモニウムから選択される少なくとも１種の過マンガン酸塩の、ヘパリンに対して約４重量％から約１０重量％により酸化することによってヘパリンを精製し、酸化が約３５℃から約９０℃の範囲の温度で起こること、及び
    ｂ）前記酸化ヘパリンを脱重合することを含む、請求項４８に記載の方法。
49. 前記ヘパリン又はヘパリン製品が脱重合後に精製される、請求項４９に記載の方法。
50. 少なくとも１種の過マンガン酸塩の濃度が約８％である、請求項４９に記載の方法。
51. 前記少なくとも１種の過マンガン酸塩が過マンガン酸カリウムである、請求項４９に記載の方法。
52. 前記クロマトグラフィー法がアセチル化された基を検出する、請求項４８に記載の方法。
53. 前記クロマトグラフィー法が陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項４８に記載の方法。
54. 前記クロマトグラフィー法が強陰イオン交換（ＳＡＸ）を含む、請求項４８に記載の方法。
55. 前記クロマトグラフィー法がＣＴＡ−ＳＡＸクロマトグラフィーを含む、請求項４８に記載の方法。
56. 前記ヘパリン又はヘパリン製品のグリコセリン含量を測定することを含む、ヘパリン又はヘパリン製品の着色傾向を予測する方法。
57. 前記グリコセリン含量が外部較正又は内部較正によって定量される、請求項５７に記載の方法。
58. 前記内部較正が内部標準の使用を含む、請求項５８に記載の方法。
59. 前記内部標準が２−ナフトール−３，６−ジスルホン酸である、請求項５９に記載の方法。
60. 前記内部標準が２−ナフトール−３，６−ジスルホン酸約０．１５ｇ／ｌである、請求項５９に記載の方法。
61. ａ）試料を脱重合すること、及び
    ｂ）前記試料中のＭＭ＝５１１、ＭＭ＝５８８及びＭＭ＝６９０から選択される少なくとも１種のオリゴ糖を検出するためにクロマトグラフィー法を使用して前記試料を分析することを含む、ヘパリン又はヘパリン製品の試料のオリゴ糖含量を測定する方法。
62. 前記オリゴ糖含量が外部較正又は内部較正によって定量される、請求項６２に記載の方法。
63. 前記内部較正が内部標準を含む、請求項６３に記載の方法。
64. 前記内部標準が、ＭＭ＝５１１、ＭＭ＝５８８及びＭＭ＝６９０から選択される実質的に純粋な化合物である、請求項６４に記載の方法。
65. 試料を酵素的に消化すること、及び消化された試料中のグリコセリン残基の含量をクロマトグラフィー法によって定量することを含む、ヘパリン又はヘパリン製品の試料のグリコセリン含量を定量する方法。
66. 前記クロマトグラフィー法がＨＰＬＣである、請求項６６に記載の方法。
67. 前記クロマトグラフィー法がＣＴＡ−ＳＡＸである、請求項６６に記載の方法。
68. 前記クロマトグラフィー法がＳＡＸである、請求項６６に記載の方法。
69. 前記グリコセリン含量が前記試料の２％未満に減少される、請求項６６に記載の方法。

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