JP2012120529A - 骨芽細胞分化誘導用培養基材、骨芽細胞分化誘導方法、及び骨芽細胞製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の課題は、従来法と比較して、効率的且つ強力に骨芽細胞を分化誘導する方法を提供することにある。
【解決手段】本発明の課題は、魚類由来コラーゲンが被覆された、間葉系幹細胞との接触面を有する、骨芽細胞分化誘導用培養基材によって解決できる。また、魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養基材と、間葉系幹細胞とを接触させる魚類由来コラーゲン接触工程を含む、骨芽細胞分化誘導方法、又は魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養基材によって、間葉系幹細胞を培養する魚類由来コラーゲン培養工程を含む、骨芽細胞製造方法によって解決できる。
【選択図】図１

Description

本発明は、骨芽細胞分化誘導用培養基材、骨芽細胞分化誘導方法、骨芽細胞製造方法及び前記製造方法によって得られた骨芽細胞に関する。本発明によれば、間葉系幹細胞から骨芽細胞を誘導することができる。

骨芽細胞は、骨組織において骨形成を行う細胞であり、タンパク質等を産生及び分泌して、骨基質をつくる。具体的には、骨芽細胞は、生体内でコラーゲンなどの基質タンパク質を分泌し、そこにMatrix Vesicleと呼ばれる基質小胞を作製する。そして、この基質小胞の周囲にリン酸カルシウムが沈着して、骨の基質が完成し、骨芽細胞は、最終的には、この基質の中で骨細胞となる。

この骨芽細胞は、間葉系幹細胞から分化するものであり、非特許文献１には、間葉系幹細胞にデキサメタゾン、β−グリセロリン酸、及びアスコルビン酸を作用させることにより分化誘導できることが開示されている（非特許文献１）。また、特許文献１は、（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−１−（４−ピリジルカルバモイル）シクロヘキサン等のRhoキナーゼ阻害活性を有する化合物と骨誘導因子を併用することにより、間葉系細胞が骨芽細胞に分化誘導されることを開示している。更に、特許文献２には、カルシウム拮抗薬が、間葉系細胞を骨芽細胞に分化誘導することが開示されている（特許文献２）。

しかしながら、前記の化合物による骨芽細胞の分化誘導活性、特に初期分化誘導活性は、十分なものではなかった。また、デキサメタゾンや（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−１−（４−ピリジルカルバモイル）シクロヘキサンは、本来生体内に存在するものではなく、得られた骨芽細胞へのこれらの合成された化合物の影響については、十分には調べられていなかった。更に、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化する際に、１０％程度のウシの胎児血清などを用いて培養を行っており、ウシ血清中にプリオンなどの人獣共通感染症の病原体が存在する可能性も考えられた。

国際公開第２００１／０１７５６２号 国際公開第２００６／１２３６９９号 特開２００６−２５７０１４号公報

「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９９年、２８４巻、ｐ．１４３−１４７

本発明の目的は、従来法と比較して、効率的且つ強力に骨芽細胞を分化誘導する方法を提供することであり、特には、初期分化誘導が可能な方法を提供することである。また、低濃度の血清存在下、又は血清非存在下において、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることのできる骨芽細胞分化誘導方法、又は骨芽細胞製造方法を提供することである。更に、前記製造方法によって製造された骨芽細胞を提供することである。

本発明者は、効率的且つ強力に間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることのできる骨芽細胞分化誘導方法、又は骨芽細胞製造方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養基材と、間葉系幹細胞とを接触させることにより、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることができることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。

すなわち、本発明は、
［１］魚類由来コラーゲンが被覆された、間葉系幹細胞との接触面を有する、骨芽細胞分化誘導用培養基材、
［２］前記魚類由来コラーゲンが、テラピア鱗由来のコラーゲンである、［１］に記載の骨芽細胞分化誘導用培養基材、
［３］前記間葉系幹細胞が、骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、滑膜組織由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、歯胚由来間葉系幹細胞、耳介軟骨膜由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、靭帯由来間葉系幹細胞、腱由来間葉系幹細胞、ＥＳ細胞由来間葉系幹細胞、又はｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞である、［１］又は［２］に記載の骨芽細胞分化誘導用培養基材、
［４］前記間葉系幹細胞が、ヒト由来である、［１］〜［３］のいずれかに記載の骨芽細胞分化誘導用培養基材、
［５］前記被覆された第１の魚類由来コラーゲン以外の第２のコラーゲン少なくとも１つが被覆された間葉系幹細胞との接触面を有する、［１］〜［４］のいずれかに記載の骨芽細胞分化誘導用培養基材、
［６］前記第２のコラーゲンが、哺乳類由来コラーゲン、鳥類由来コラーゲン、爬虫類由来コラーゲン、両生類由来コラーゲン、魚類由来コラーゲン、無脊椎動物由来コラーゲン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるコラーゲンである、［１］〜［５］のいずれかに記載の、骨芽細胞分化誘導用培養基材、
［７］［１］〜［６］のいずれかに記載の骨芽細胞分化誘導用培養基材を含む、骨芽細胞分化誘導キット、
［８］骨芽細胞分化誘導因子を更に含む、［７］に記載の骨芽細胞分化誘導キット、
［９］魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養基材と、間葉系幹細胞とを接触させる魚類由来コラーゲン接触工程を含む、骨芽細胞分化誘導方法、
［１０］前記間葉系幹細胞が、骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、滑膜組織由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、歯胚由来間葉系幹細胞、耳介軟骨膜由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、靭帯由来間葉系幹細胞、腱由来間葉系幹細胞、ＥＳ細胞由来間葉系幹細胞、又はｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞である、［９］に記載の骨芽細胞分化誘導方法、
［１１］前記間葉系幹細胞が、ヒト由来である、［９］又は［１０］に記載の骨芽細胞分化誘導方法、
［１２］前記被覆された第１の魚類由来コラーゲン以外の第２のコラーゲン少なくとも１つが被覆された細胞培養基材と、間葉系幹細胞とを接触させる第２コラーゲン接触工程を更に含む、［９］〜［１１］のいずれかに記載の骨芽細胞分化誘導方法、
［１３］前記第２のコラーゲンが、哺乳類由来コラーゲン、鳥類由来コラーゲン、爬虫類由来コラーゲン、両生類由来コラーゲン、魚類由来コラーゲン、無脊椎動物由来コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるコラーゲンである、［９］〜［１２］のいずれかに記載の骨芽細胞分化誘導方法、
［１４］前記間葉系幹細胞を骨芽細胞分化誘導因子に接触させる骨芽細胞分化誘導因子接触工程を更に含む、［９］〜［１３］のいずれかに記載の骨芽細胞分化誘導方法、
［１５］前記第１の魚類由来コラーゲンが、テラピア鱗由来のコラーゲンである、［９］〜［１４］のいずれかに記載の骨芽細胞分化誘導方法、
［１６］前記接触工程が、５％以下の血清の存在下、又は血清の非存在下で行われる、［９］〜［１５］のいずれかに記載の骨芽細胞分化誘導方法、
［１７］魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養基材によって、間葉系幹細胞を培養する魚類由来コラーゲン培養工程を含む、骨芽細胞製造方法、
［１８］前記間葉系幹細胞が、骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、滑膜組織由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、歯胚由来間葉系幹細胞、耳介軟骨膜由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、靭帯由来間葉系幹細胞、腱由来間葉系幹細胞、ＥＳ細胞由来間葉系幹細胞、又はｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞である、［１７］に記載の骨芽細胞製造方法、
［１９］前記間葉系幹細胞が、ヒト由来である、［１７］又は［１８］に記載の骨芽細胞製造方法、
［２０］前記細胞培養基材が、前記被覆された第１の魚類由来コラーゲン以外の第２のコラーゲン少なくとも１つが被覆された間葉系幹細胞との接触面を有する、［１７］〜［１９］のいずれかに記載の骨芽細胞製造方法、
［２１］前記第２のコラーゲンが、哺乳類由来コラーゲン、鳥類由来コラーゲン、爬虫類由来コラーゲン、両生類由来コラーゲン、魚類由来コラーゲン、無脊椎動物由来コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるコラーゲンである、［１７］〜［２０］のいずれかに記載の骨芽細胞製造方法、
［２２］前記間葉系幹細胞の培養培地が、５％以下の血清を含む培地又は無血清培地である、［１７］〜［２１］のいずれかに記載の骨芽細胞製造方法、
［２３］前記間葉系幹細胞の培養培地が、骨芽細胞分化誘導因子を含む培地である、［１７］〜［２０］のいずれかに記載の骨芽細胞製造方法、
［２４］前記魚類由来コラーゲンが、テラピア鱗由来のコラーゲンである、［１７］〜［２３］のいずれかに記載の骨芽細胞製造方法、
［２５］［１７］〜［２４］のいずれかに記載の骨芽細胞製造方法により得られる骨芽細胞、
［２６］骨芽細胞分化誘導のための、魚類由来コラーゲンの細胞培養基材への使用、
［２７］骨芽細胞の製造のための、魚類由来コラーゲンの細胞培養基材への使用、
に関する。

本発明の骨芽細胞分化誘導方法、又は骨芽細胞製造方法によれば、効率的且つ強力に間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることができる。特には、骨芽細胞の初期分化誘導を強力に引き起こすことが可能である。また、低濃度の血清存在下、又は血清非存在下において、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させることができる。

ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートで培養（接触）した場合の、アルカリホスファターゼの活性を示したグラフである。コントロールとして、豚由来コラーゲン被覆細胞培養プレート及び非被覆細胞培養プレートを用いた。 ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、デキサメタゾン存在下（Ｄｅｘ ＋）又は非存在下（Ｄｅｘ −）において、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートで、３日（Ａ）又は７日（Ｂ）培養した場合の、アルカリホスファターゼの活性を示したグラフである。コントロールとして、豚由来コラーゲン被覆細胞培養プレート及び非被覆細胞培養プレートを用いた。「Ｄｅｘ＋３％」は、デキサメタゾン１０ｎＭ及びＦＢＳ３％を、「Ｄｅｘ−３％」は、デキサメタゾン０ｎＭ及びＦＢＳ３％を、「Ｄｅｘ＋１５％」は、デキサメタゾン１０ｎＭ及びＦＢＳ１５％を、「Ｄｅｘ−１５％」は、デキサメタゾン０ｎＭ及びＦＢＳ１５％を示す。 ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、デキサメタゾン存在下（Ｄｅｘ ＋）又は非存在下（Ｄｅｘ −）において、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートで、培養した場合の、細胞のＤＮＡ量の増加を示したグラフである。ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）３％又は１５％の存在下で培養した。コントロールとして、豚由来コラーゲン被覆細胞培養プレート及び非被覆細胞培養プレートを用いた。 テラピア鱗由来コラーゲンで被覆されたウェルの表面（Ａ）又は豚由来のコラーゲンで被覆されたウェルの表面（Ｂ）を、位相差顕微鏡で観察した写真である。 ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートで培養（接触）した場合の、ＢＭＰ２（Ａ）又はＳＰＰ１（Ｂ）の発現を示したグラフである。それぞれのｍＲＮＡの発現は、ＧＡＰＤＨの発現量で補正した。また、コントロールとして、豚由来コラーゲン被覆細胞培養プレート及び非被覆細胞培養プレートを用いた。 ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、デキサメタゾン存在下（Ｄｅｘ ＋）又は非存在下（Ｄｅｘ −）において、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートで、３日間培養（接触）した場合の、ＢＭＰ２（Ａ）又はＳＰＰ１（Ｂ）の発現を示したグラフである。それぞれのｍＲＮＡの発現は、ＧＡＰＤＨの発現量で補正した。「Ｄｅｘ＋３％」は、デキサメタゾン１０ｎＭ及びＦＢＳ３％を、「Ｄｅｘ−３％」は、デキサメタゾン０ｎＭ及びＦＢＳ３％を、「Ｄｅｘ＋１５％」は、デキサメタゾン１０ｎＭ及びＦＢＳ１５％を、「Ｄｅｘ−１５％」は、デキサメタゾン０ｎＭ及びＦＢＳ１５％を示す。コントロールとして、豚由来コラーゲン被覆細胞培養プレート及び非被覆細胞培養プレートを用いた。 ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートで培養（接触）した場合の、アルカリホスファターゼの活性を示したグラフ（Ａ）及びヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、デキサメタゾン存在下（Ｄｅｘ＋）又は非存在下（Ｄｅｘ−）において、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートで、３日培養した場合の、アルカリホスファターゼの活性を示したグラフ（Ｂ）である。コントロールとして、豚由来コラーゲン被覆細胞培養プレート（０．３ｗｔ％の濃度で被覆）及び非被覆細胞培養プレートを用いた。「Ｄｅｘ＋」は、デキサメタゾン１０ｎＭ及びＦＢＳ３％を、「Ｄｅｘ−」は、デキサメタゾン０ｎＭ及びＦＢＳ３％を示す。 ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートで培養（接触）した場合の、ＢＭＰ２（Ａ）又はＳＰＰ１（Ｂ）の発現を示したグラフ（Ｄａｙ０）、及び１０ｎＭデキサメタゾン存在下において、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートで、３日間（Ｄａｙ３）又は７日間（Ｄａｙ７）培養（接触）した場合の、ＢＭＰ２（Ａ）又はＳＰＰ１（Ｂ）の発現を示したグラフである。それぞれのｍＲＮＡの発現は、ＧＡＰＤＨの発現量で補正した。また、コントロールとして、豚由来コラーゲン被覆細胞培養プレート（０．３ｗｔ％の濃度で被覆）及び非被覆細胞培養プレートを用いた。

〔１〕骨芽細胞分化誘導用培養基材
本発明の骨芽細胞分化誘導用培養基材は、魚類由来コラーゲンが被覆された、間葉系幹細胞との接触面を有するものである。
（魚類由来コラーゲン）
本発明の骨芽細胞分化誘導用培養基材に用いる魚類由来コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンであれば、特に限定されるものではない。例えば、魚類の種類としては、テラピア、ゴンズイ、ラベオ・ロヒータ、カトラ、コイ、雷魚、ピラルク、タイ、ヒラメ、サメ、及びサケなどを挙げることができるが、後述の変性温度の観点から、水温の高い川、湖沼、又は海に生息する魚類が好ましい。このような魚類として、具体的には、オレオクロミス属の魚類を挙げる事ができ、特にはテラピアが好ましい。オレオクロミス属の魚類からは、変性温度が比較的高いコラーゲンを取得でき、例えば日本や中国で食用として養殖されているナイルテラピア（Oreochromis niloticus）は入手が容易であり、大量のコラーゲンを取得することができる。

魚類由来コラーゲンを取得する魚の部位も、限定されるものではない。例えば、鱗、皮、骨、軟骨、ひれ、及び臓器等を挙げることができるが、鱗が好ましい。鱗は、魚臭の原因となる脂質が少ないからである。また、魚類の鱗由来のコラーゲンは、他のコラーゲンと比較して線維化しやすく、線維形成速度が著しく速いからである。

魚類のＩ型コラーゲンは、分子量約１０万のポリペプチド鎖が３本集まって「３重らせん構造」を作っており、分子量は約３０万である。長さ３００ｎｍで、直径１．５ｎｍの１本の硬い棒のような形態をしている。魚類のＩ型コラーゲンが特異な「３重らせん構造」を作るのは、ポリペプチド鎖のアミノ酸の配列が関与している。ポリペプチド鎖は３個のアミノ酸が並んだユニット「Ｇ−Ｘ−Ｙ」のつながりからできている。Ｇはグリシンを表し、Ｘはプロリン、そしてＹはヒドロキシプロリンであることが多い。ヒドロキシプロリンは、通常のタンパク質に含まれておらず、コラーゲンに特有のアミノ酸であるが、ヒドロキシプロリンの水酸基と水和水との水素結合によって３重らせん構造が安定すると考えられている。

コラーゲンは、温度が上昇すると３本のポリペプチドからなる「３重らせん構造」が解けて、３本のポリペプチドがばらばらになり、ゼラチンとなる。コラーゲンからゼラチンへの変化を変性と呼び、一度変性が起きると、再び温度を低下させても「３重らせん構造」に戻すことは困難である。コラーゲンの変性温度は、通常そのコラーゲンが由来する生物の棲息温度より、若干高い程度であり、従って、水中に生息している魚類の鱗のコラーゲンの変性温度は、それほど高くない。

本発明に用いる魚類由来コラーゲンは、その変性温度によって、限定されるものではないが、変性温度の高い魚類由来コラーゲンが好ましく、具体的には２０℃以上が好ましく、２５℃以上がより好ましく、２８℃以上が更に好ましく、３０℃以上が最も好ましい。本発明の骨芽細胞分化誘導方法において、魚類由来コラーゲンと間葉系幹細胞とを接触させる温度は、３７℃前後のことが多く、「３重らせん構造」が破壊されたゼラチンでは、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導は起こらないと考えられるからである。
しかしながら、変性温度が２０℃未満の魚類由来コラーゲンであっても、間葉系幹細胞との接触を２０℃未満で行うことにより、コラーゲンの変性を起こさずに、間葉系幹細胞を骨芽細胞へ分化させることができる。

本発明に用いるコラーゲンの変性温度は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３２，１９９（２００３）に記載の方法に従って、ＣＤ分光計（Ｊａｓｃｏ ｍｏｄｅｌ ７２５ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を使用してコラーゲン水溶液の温度を段階的に上昇させることによって求める。即ち、コラーゲン水溶液をｐＨ３の希塩酸で希釈し、０．０３ｗｔ％となるように調整し、光路長１ｍｍの石英セルに入れる。セルの温度を１℃／ｍｉｎで上昇させ、２２１ｎｍにおける旋光度を０．２℃ごとに測定する。各温度における旋光度を温度に対してプロットすると、旋光度の値がコラーゲン螺旋の値からランダムコイルの値へと急激に変化する変性曲線が得られる。それらの旋光度値の中間値を与える温度、すなわち、螺旋率（Ｈｅｌｉｃｉｔｙ；％）が５０％になるときの温度を変性温度とする。

魚類由来コラーゲンの取得方法は、コラーゲンの３重らせん構造が破壊されない方法であれば、特に限定されないが、例えば、前記特許文献３に開示された取得方法によって得ることができる。以下に、代表例として、鱗由来のコラーゲンの製造方法について説明する。

まず、集めた鱗から魚皮や鰭などの不要物を水洗により取り除く。必要に応じて、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどのアルコール類やアセトンなどの親水性有機溶剤、界面活性剤、塩化ナトリウムなどの塩類、水酸化ナトリウムなどのアルカリ溶液などを用いて、鱗表面に付着したコラーゲン以外のたんぱく質や脂質など、臭気の原因とされている物質を鱗から除去してもよい。

更に、脱灰処理溶液中で、１〜４８時間、攪拌羽根を用いて緩やかに攪拌し、鱗に含まれる無機成分（リン酸カルシウム）を除去する。処理溶液は、無機成分を溶解できればよく、塩酸やリン酸などの無機酸、酢酸、クエン酸などの有機酸、エチレンジアミン４酢酸などの水溶液を用いればよいが、汎用的に利用されている塩酸や酢酸が好ましく用いられる。使用量は、特に制限する必要はなく、脱灰終了後の鱗を水洗すれば良い。

このようにして夾雑物を除去した鱗を、プロテアーゼを添加した酸性溶液中で２時間〜７２時間、攪拌羽根などを用いて緩やかに攪拌することでコラーゲン分子間の架橋が切断されて可溶化したコラーゲンが抽出される。この抽出工程以降の操作は、コラーゲンの変性を防ぐため、変性温度以下、望ましくは変性温度−５℃以下で行うべきである。

プロテアーゼの種類は、酸性溶液中で高い活性を有する、ペプシン、プロクターゼ、パパインなどが好ましく用いられる。溶液のｐＨは、プロテアーゼの活性が高くなる範囲を用いればよく、一般に２〜５程度である。プロテアーゼの使用量は、特に限定する必要はないが、通常は魚鱗の乾燥重量に対して１〜１５％程度であり、鱗が均一に攪拌できる程度の液量となるように濃度を決定すれば良い。使用する酸は、特に制限されないが、塩酸や酢酸、クエン酸、リンゴ酸など、生物に対して安全性の高いものから選ぶことが望ましく、特に塩酸や酢酸が好ましく用いられる。このような方法により、コラーゲン分子の両末端に存在する非螺旋領域（テロペプチド）が分解されたコラーゲン（アテロコラーゲン）を抽出することができる。

このようにして可溶化したコラーゲンは、遠心分離、濾過などによって可溶化していない魚鱗残渣と分離する。魚鱗残渣は、プロテアーゼを添加した酸性溶液中で処理することで、再度、可溶化したコラーゲンを抽出することができるため、２〜４回程度繰り返して収率を高めてもよい。

このようにして得られたコラーゲン溶液には、プロテアーゼやコラーゲン以外のたんぱく質、ゼラチン（変性コラーゲン）などを含むため、必要に応じて精製する。精製方法について述べると、可溶化したコラーゲン溶液に、塩化ナトリウムなどの塩類を加え、塩濃度を上昇させることで、コラーゲンを析出させる。例えば、可溶化したコラーゲン水溶液中に塩化ナトリウムを終濃度１Ｍになるように添加し、５分〜２４時間程度静置することで、コラーゲンが析出する。

水酸化ナトリウムなどを添加して、ｐＨを中性以上にすることでも析出することができる。例えば、ｐＨ７〜９程度になるまで水酸化ナトリウム溶液を添加し、５分〜２４時間程度静置することで、コラーゲンが析出する。このようなコラーゲンの析出は、溶液が白濁することで容易に確認できる。

析出したコラーゲンは遠心分離や濾過など、一般的な固液分離方法により回収し、これを酸性溶液中で緩やかに攪拌して再溶解する。例えば、ｐＨ２〜４程度の塩酸溶液中で１〜４８時間程度ゆるやかに攪拌すればよい。このようにして、コラーゲンを精製することができ、繰り返すことで更に純度を高めることができる。精製工程で使用した塩類は、透析膜などを用いて純水に対して脱塩することで除去することができる。

細胞を培養する際、細菌などが共存することは重大な問題となるため、得られたコラーゲン溶液は、ろ過滅菌などコラーゲンの構造を壊さない方法で無菌化して用いることが望ましい。

（細胞培養基材）
前記魚類由来コラーゲンを被覆する細胞培養基材は、通常細胞培養用に使用される基材であれば、限定されることなく使用することが可能である。材質としては、ガラス、多孔質体（例えば、ポリカーボネート）、又はプラスチック（例えばポリスチレン、又はポリプロピレン）の基材を使用することができ、形状としては、フラスコ、シャーレ、マルチカルチャープレート（例えば６ウェルマルチカルチャープレート、１２ウェルマルチカルチャープレートなど）、又はビーズなどの形状の基材を使用することができる。但し、コラーゲン溶液が親水性であるため、親水性の材質基材あるいは親水化処理を施した表面を有する基材が好ましい。

（間葉系幹細胞との接触面）
間葉系幹細胞との接触面は、細胞培養基材の中で魚類由来コラーゲンが被覆される部分である。例えば、フラスコの細胞培養面、シャーレの細胞培養面、マルチカルチャープレートのウェルの底面、ビーズの表面、又は多孔質体の表面などを挙げることができる。これらの部分を、魚類由来コラーゲンを用いて被覆し、間葉系幹細胞との接触面として用いる。

（細胞培養基材へのコラーゲンの被覆）
前記細胞培養基材への魚類コラーゲンの被覆は、常法に従って行うことができる。
コラーゲンを溶解する溶液のｐＨは、コラーゲンの等電点以下であるｐＨ２〜５が好ましい。溶液の酸源は特に制限されないが、塩酸、酢酸、クエン酸、又はリンゴ酸など、生物に対して安全性の高いものから選ぶことが好ましく、乾燥時に気化する塩酸や酢酸がより好ましい。ｐＨについては、低すぎるとコラーゲンの構造を破壊する場合があり、また高すぎると溶解性が低下し、増粘、ゲル化する場合がある。

使用するコーティング溶液のコラーゲン濃度は、特に限定されないが、一般的には０．０１〜１重量％であり、より好ましくは０．０３〜０．３重量％である。濃度が低いと、１回のコーティングで基材を被覆できるコラーゲン量が少なくなる。濃度が高いと、基材を被覆するコラーゲン量を増やすことができるが、厚みが増すだけである。本発明の効果を発揮するのは、表層部分が主であるため、被覆したコラーゲンの厚さが増しても、コラーゲン量に見合った効果を期待できない。

コーティング方法としては、酸性溶液を用いて適度な濃度に調整したコラーゲン溶液を、あわ立たないようにディシュなどの細胞培養基材上に流し込み、基材上に均一に塗り広げた後、余剰のコラーゲンを除去する。これを乾燥させることで、基材上に線維化したコラーゲンが均一に被覆される。これは魚鱗由来コラーゲン特有の現象であり、従来から使用されている哺乳類由来のコラーゲンでは達成されない。

細菌が混入することは細胞培養時に重大な問題となるため、コラーゲンの被覆作業は、清浄な無菌基材を用い、クリーンルームやクリーンベンチなどの無菌環境で行うことが望ましい。必要に応じて、エチレンオキサイドやＵＶ照射など、コラーゲンの構造を壊さない滅菌工程を加えてもよい。
コーティング及び乾燥時の温度について言えば、変性温度以下、望ましくは変性温度−５℃以下で行う。変性温度を上回る温度で処理すると、基材間結合やコラーゲン線維を形成する前にコラーゲンが変性することにより線維化機能が失われ、コラーゲンとしての特性を発揮できない場合がある。
乾燥時間は湿度などにより異なるが、クリーンベンチ内のような通風下であれば、５分〜２時間程度で乾燥する。乾燥が不十分な場合は、コラーゲンの線維化や基材との接着が不十分となる場合があり、細胞培養液を添加したとき、被膜の再溶解や剥離などにより本発明の効果を十分発揮しない場合がある。十分乾燥し、線維化した状態であれば、数ヶ月保存してもその効果を発揮することができる。保存は変性温度以下の温度、望ましくは冷蔵保存が好ましい。

本発明の骨芽細胞分化誘導用培養基材は、前記被覆された第１の魚類由来コラーゲン以外の第２のコラーゲン少なくとも１つが被覆された間葉系幹細胞との接触面を有してもよい。すなわち、本発明の骨芽細胞分化誘導用培養基材は、異なる由来のコラーゲンが被覆された複合材料とすることも可能である。

（第２のコラーゲン）
前記第２のコラーゲンは、被覆された第１の魚類由来コラーゲンと由来の異なるものであれば、特に制限されるものではなく、例えば第１の魚類由来コラーゲン以外の魚類由来コラーゲンを用いることも可能である。第２のコラーゲンとして、具体的には、哺乳類由来コラーゲン（例えば、ウシ由来コラーゲン、ブタ由来コラーゲン、ヒツジ由来コラーゲン、ヤギ由来コラーゲン、又はサル由来コラーゲン）、鳥類由来コラーゲン（例えば、ニワトリ由来コラーゲン、ガチョウ由来コラーゲン、アヒル由来コラーゲン、又はダチョウ由来コラーゲン）、爬虫類由来コラーゲン（例えば、ワニ由来コラーゲン）、両生類由来コラーゲン（例えば、カエル由来コラーゲン）、魚類由来コラーゲン（例えば、テラピア由来コラーゲン、タイ由来コラーゲン、ヒラメ由来コラーゲン、サメ由来コラーゲン、又はサケ由来コラーゲン）、無脊椎動物由来コラーゲン（例えば、クラゲ由来コラーゲン）、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。第２のコラーゲンの組み合わせとしては、哺乳類由来コラーゲン及び鳥類由来コラーゲンを組み合わせてもよく、由来の異なる哺乳類由来コラーゲン同士、例えばウシ由来コラーゲン及びブタ由来コラーゲンを組み合わせてもよい。また、第２のコラーゲンは、従来公知の方法に従って製造することができる。

（第２のコラーゲンの細胞培養基材への被覆）
第２のコラーゲンは、第１の魚類由来コラーゲンと同じように、細胞培養基材の間葉系細胞との接触面に被覆することができる。第１の魚類由来コラーゲン及び第２のコラーゲンを混合して、接触面に被覆してもよく、また別々に順番に接触面に被覆してもよい。また、第１の魚類由来コラーゲンと、第２のコラーゲンとを同じ接触面に被覆してもよく、異なる接触面に被覆してもよい。
例えば、第１の魚類由来コラーゲン及び第２のコラーゲンを、異なる接触面に被覆する場合、マルチカルチャープレートのウェルの底面を２つ以上に分割して、第１の魚類由来コラーゲン及び第２のコラーゲンをそれぞれ、被覆してもよい。また、マルチカルチャープレートのウェルの底面に第１の魚類由来コラーゲンを被覆し、ビーズの表面に第２のコラーゲンを被覆して、マルチカルチャープレート及びビーズを組み合わせて、細胞培養基材として用いてもよい。

（間葉系幹細胞）
魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養基材と接触させる間葉系幹細胞としては、髄骨芽細胞に分化誘導することのできる細胞であれば、限定されないが、例えば、骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、滑膜組織由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、歯胚由来間葉系幹細胞、耳介軟骨膜由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、靭帯由来間葉系幹細胞、腱由来間葉系幹細胞、ＥＳ細胞由来間葉系幹細胞、又はｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞を挙げることができる。また、前記間葉系幹細胞の由来する動物種も、特に限定されず、哺乳類としては、例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ウサギ、モルモット、ラット、及びマウスを挙げることができる。また、鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ガチョウ、ダチョウ、及びホロホロチョウを挙げることができ、爬虫類としては、ワニ、カメ、及びトカゲを挙げることができ、両生類としては、カエル、及びイモリを挙げることができ、魚類としては、テラピア、タイ、ヒラメ、サメ、及びサケを挙げることができる。更に、無脊椎動物としては、カニ、貝類、クラゲ、及びエビを挙げることができる。
前記間葉系幹細胞は骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、又は軟骨細胞などの間葉系に属する細胞への分化能を持つ細胞であり、骨、血管、又は心筋を構成することのできる細胞となるものである。

前記間葉系幹細胞は、株化細胞を用いてもよく、また、常法に従って調整することも可能であり、更には市販されている細胞を用いることもできる。また、生体から分離した間葉系幹細胞（例えば、骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、滑膜組織由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、歯胚由来間葉系幹細胞、耳介軟骨膜由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、靭帯由来間葉系幹細胞、腱由来間葉系幹細胞、ＥＳ細胞由来間葉系幹細胞、又はｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞）を、本発明の骨芽細胞分化誘導方法により骨芽細胞に分化誘導することができる。この場合、生体から採取された細胞は、常法に従って結合組織等を除去して調製することが好ましい。更に、生体から採取された細胞は、初代培養細胞を用いることが好ましい。継代して用いることも可能であるが、継代数は少ないほうが好ましく、１０回以下が好ましく、５回以下が更に好ましく、２回以下であることが、最も好ましい。

（骨芽細胞）
本発明の方法により分化誘導される骨芽細胞は、骨組織において骨形成を行う細胞であり、細胞質は好塩基性を示し、アルカリホスファターゼ活性を有している。また、骨芽細胞はアンドロゲンとエストロゲンのレセプターを持っていてもよく、アンドロゲンは骨芽細胞の活動性を低下させ、エストロゲンは骨芽細胞を刺激する。間葉系幹細胞から、骨芽細胞への分化誘導は、アルカリホスファターゼの活性を測定することによって確認することができる。アルカリホスファターゼの測定は、後述の実施例に示すように、常法に従って行うことができる。

〔２〕骨芽細胞分化誘導キット及び骨芽細胞製造装置
本発明の骨芽細胞分化誘導キットは、骨芽細胞分化誘導用培養基材を含む。骨芽細胞分化誘導用培養基材は、魚類由来コラーゲンが被覆された、間葉系幹細胞との接触面を有するものである。具体的には、本発明の前記骨芽細胞分化誘導用培養基材を含むことができる。また、前記骨芽細胞分化誘導方法〔１〕に記載の魚類由来コラーゲン、及び細胞培養基材を用いて、「細胞培養基材へのコラーゲンの被覆」に記載の方法、及び公知の方法に従って、骨芽細胞分化誘導用培養基材を製造することが可能である。
前記間葉系細胞との接触面には、魚類由来コラーゲンが被覆されているが、具体的にはフラスコ、又はシャーレの細胞培養面、マルチカルチャープレートのウェルの底面、ビーズの表面、又は多孔質体の表面などであり、間葉系細胞が接触することのできるものである。

また、本発明の骨芽細胞分化誘導キットは、骨芽細胞分化誘導因子を含んでもよい。骨芽細胞分化誘導因子としては、デキサメタゾン、ＦＫ−５０６又はシクロスポリン等の免疫抑制剤、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７又はＢＭＰ９等の骨形成タンパク質（ＢＭＰ：Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ＴＧＦβ等の骨形成液性因子を挙げることができる。本発明の骨芽細胞分化誘導キットは、これらの骨芽細胞分化誘導因子から選択される１種又は２種以上を含むことができる。
また、本発明の骨芽細胞分化誘導キットは、間葉系幹細胞からの骨芽細胞の分化誘導用であることを明記した使用説明書を含んでもよい。間葉系幹細胞からの骨芽細胞の分化誘導用である旨の記載は、キットの容器等に付されていてもよい。

本発明の骨芽細胞製造装置は、骨芽細胞分化誘導用培養基材を含むものである。骨芽細胞分化誘導用培養基材は、魚類由来コラーゲンが被覆された、間葉系幹細胞との接触面を有するものであり、本発明の骨芽細胞分化誘導キットに含まれるものと同じものを用いることができる。
また、本発明の骨芽細胞製造装置は、細胞培養用のＣＯ_２インキュベータを含んでもよい。ＣＯ_２インキュベータ中で、骨芽細胞分化誘導用培養基材を用いて、間葉系幹細胞からの骨芽細胞を製造することができる。

〔３〕骨芽細胞分化誘導方法
本発明の骨芽細胞分化誘導方法は、魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養基材と、間葉系幹細胞とを接触させる工程（以下、魚類コラーゲン接触工程と称することがある）を含むことを特徴とするものである。
本発明の骨芽細胞分化誘導方法においては、前記骨芽細胞分化誘導用培養基材に記載の魚類由来コラーゲン、及び細胞培養基材を用いることができ、そして細胞培養基材に魚類由来コラーゲンを、前記「細胞培養基材へのコラーゲンの被覆」の記載、及び公知の方法にしたがって被覆することができる。しかしながら、魚類由来コラーゲンが被覆された細胞培養基材は、特に骨芽細胞分化誘導用の用途に限定されたものを用いる必要はない。
また、骨芽細胞分化誘導方法に用いる間葉系幹細胞も、骨芽細胞分化誘導用培養基材に記載の間葉系幹細胞を用いることができ、分化誘導される骨芽細胞の特徴は、前記のとおりである。

（接触）
骨芽細胞分化誘導方法において、前記細胞培養基材と、間葉系幹細胞との接触に用いる培地は、間葉系幹細胞が維持できる培地であれば限定されないが、通常その間葉系幹細胞の培養に用いる培地を用いればよい。例えば、ＭＥＭ培地、α−ＭＥＭ培地、又はＤＭＥＭ培地等の公知の培地を、培養する細胞に合わせて適宜選んで用いることができる。
接触時間は、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導が起きる限りにおいて、限定されないが、実質的には、下限は１０分以上であり、好ましくは１時間以上であり、より好ましくは１日以上である。接触時間の上限も限定されないが、３０日以下であり、好ましくは１５日以下であり、より好ましくは７日以下である。
接触温度は、間葉系幹細胞の最適な培養温度に従って、適宜決定することができる。例えば、哺乳類の間葉系幹細胞の場合、３０℃〜４０℃であり、３５℃〜３７℃が好ましい。しかしながら、培養温度よりも高い温度、又は低い温度で接触させることも可能である。例えば、変性温度が低い魚類由来コラーゲンを用いた場合、培養温度よりも低い接触温度で、細胞培養基材と、間葉系幹細胞との接触を行い、最適な培養温度に上昇させて、間葉系幹細胞の培養を行うことも可能である。

通常、骨芽細胞分化誘導は、１０〜１５％程度の血清の存在下で行う。本発明の骨芽細胞分化誘導方法においても、１０〜１５％程度の血清の存在下で分化誘導を行うことが可能であるが、低濃度の血清の存在下、又は血清の非存在下でも骨芽細胞分化誘導を行うことが可能である。間葉系幹細胞から骨芽細胞分化誘導する場合の、血清中の様々な因子の影響を排除するためには、低濃度の血清の存在下で接触させるのが好ましい。例えば、１０％以下の血清存在下が好ましく、５％以下の血清存在下がより好ましく、３％以下の血清存在下が更に好ましく、血清非存在下が最も好ましい。
骨芽細胞分化誘導において用いることのできる血清は、哺乳動物の血清であれば、特に限定されないが、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、又はヤギなどの血清を用いることができる。しかしながら、間葉系幹細胞を生体から分離した場合、その間葉系幹細胞を採取した個体の血清を用いることが最も好ましい。その個体自体の血清を用いることにより、ウシなどの血清に含まれる可能性のある人畜共通感染症の病原体との接触を防ぐことが可能である。

（骨芽細胞分化誘導因子）
本発明の骨芽細胞分化誘導方法は、前記間葉系幹細胞を骨芽細胞分化誘導因子に接触させる工程（以下、骨芽細胞分化誘導因子接触工程と称することがある）を、含むことができる。骨芽細胞分化誘導因子接触工程は、魚類コラーゲン接触工程と同時に行ってもよく、魚類コラーゲン接触工程の前又は後に行ってもよい。骨芽細胞分化誘導因子接触工程は、骨芽細胞分化誘導因子を、間葉系幹細胞が含まれている培地に添加することによって行うことができる。
骨芽細胞分化誘導因子は、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導できる限り、限定されるものではないが、例えば、デキサメタゾン、ＦＫ−５０６又はシクロスポリン等の免疫抑制剤、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７又はＢＭＰ９等の骨形成タンパク質（ＢＭＰ：Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ＴＧＦβ等の骨形成液性因子を挙げることができる。これらの骨芽細胞分化誘導因子から選択される１種又は２種以上を、培地に添加することにより、骨芽細胞分化誘導因子接触工程を行うことができる。
骨芽細胞分化誘導因子の濃度は、用いる骨芽細胞分化誘導因子の種類に応じて、適宜決めることができる。例えば、デキサメタゾンを用いる場合、１〜１００ｎＭの濃度で用いることができ、特には１０ｎＭが好ましい。

本発明の骨芽細胞分化誘導方法においては、第１の魚類由来コラーゲン以外の第２のコラーゲン少なくとも１つが被覆された細胞培養基材と、間葉系幹細胞とを接触させる第２コラーゲン接触工程を更に含んでもよい。
第２コラーゲン接触工程において用いる第２のコラーゲンとしては、本発明の骨芽細胞分化誘導用培養基材に記載の第２のコラーゲンを用いることができる。また、第２のコラーゲンの細胞培養基材への被覆も、本発明の骨芽細胞分化誘導用培養基材に記載の方法に従って、被覆することができる。

本発明の骨芽細胞分化誘導方法における魚類コラーゲン接触工程、第２コラーゲン接触工程、及び骨芽細胞分化誘導因子接触工程は、同時に行ってもよく、別々に行ってもよい。それぞれの工程を別に行う場合、３つの工程を別に行ってもよく、２つの工程を同時に行い、もう１つの工程を別に行うこともできる。
それぞれの工程を行う順番も、特に限定されないが、魚類コラーゲン接触工程により、骨芽細胞の初期分化誘導が強く惹起されるため、魚類コラーゲン接触工程、及び第２コラーゲン接触工程を別に行う場合は、魚類コラーゲン接触工程を行い、次に２コラーゲン接触工程を行うことが好ましい。第２コラーゲン接触工程により、魚類コラーゲン接触工程により分化した骨芽細胞が、更に分化誘導されるからである。

本発明の骨芽細胞分化誘導用培養基材は、上述の本発明の骨芽細胞分化誘導方法に使用することができる。

〔４〕骨芽細胞製造方法及び骨芽細胞
本発明の骨芽細胞製造方法は、魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養基材によって、間葉系幹細胞を培養する工程を含むことを特徴とするものである。
前記骨芽細胞分化誘導方法を用いて、骨芽細胞を製造することができる。すなわち、本発明の骨芽細胞製造方法においては、前記骨芽細胞分化誘導用培養基材に記載の魚類由来コラーゲン、及び細胞培養基材を用いることができ、そして細胞培養基材に魚類由来コラーゲンを、前記「細胞培養基材へのコラーゲンの被覆」の記載にしたがって被覆することができる。しかしながら、魚類由来コラーゲンが被覆された細胞培養基材は、特に骨芽細胞分化誘導用の用途に限定されたものを用いる必要はない。
また、骨芽細胞分化誘導方法に用いる間葉系幹細胞も、骨芽細胞分化誘導用培養基材に記載の間葉系幹細胞を用いることができる。

（培養）
本発明の骨芽細胞製造方法における培地は、用いる間葉系幹細胞、例えば骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、滑膜組織由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、歯胚由来間葉系幹細胞、耳介軟骨膜由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、靭帯由来間葉系幹細胞、腱由来間葉系幹細胞、ＥＳ細胞由来間葉系幹細胞、又はｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞に合わせて、適宜選択することができる。例えば、骨髄間葉系幹細胞の場合、ＭＥＭ培地、α−ＭＥＭ培地、又はＤＭＥＭ培地等を用いることができる。また、前記の培地には、抗生物質等を添加してもよい。

培養時間は、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導が起きる限りにおいて、限定されないが、１日〜３０日であり、好ましくは１日〜１４日であり、より好ましくは３日〜１０日である。
培養温度は、間葉系幹細胞の最適な培養温度に従って、適宜決定することができるが、哺乳類の間葉系幹細胞の場合、３０℃〜４０℃が好ましく、３５℃〜３７℃がより好ましい。しかしながら、変性温度が低い魚類由来コラーゲンを用いた場合、間葉系幹細胞の培養の最適温度よりも低い温度で培養することも可能である。また、培養は、３〜１０％のＣＯ_２存在下で行うことが好ましく、５％ＣＯ_２存在下で行うことがより好ましい。

通常、間葉系幹細胞の培養は、１０〜１５％程度の血清の存在下で行い、骨芽細胞を製造する。本発明の骨芽細胞製造方法においても、１０〜１５％程度の血清の存在下で骨芽細胞を製造することが可能であるが、低濃度の血清の存在下、又は血清の非存在下でも骨芽細胞の製造を行うことが可能である。間葉系幹細胞から骨芽細胞を製造する場合の、血清中の様々な因子の影響を排除するためには、低濃度の血清の存在下で製造するのが好ましい。例えば、１０％以下の血清存在下が好ましく、５％以下の血清存在下がより好ましく、３％以下の血清存在下が更に好ましく、血清非存在下が最も好ましい。
骨芽細胞の製造において用いることのできる血清は、哺乳動物の血清であれば、特に限定されないが、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、又はヤギなどの血清を用いることができる。しかしながら、間葉系幹細胞を生体から分離した場合、その間葉系幹細胞を採取した個体の血清を用いることが最も好ましい。その個体自体の血清を用いることにより、ウシなどの血清に含まれる可能性のある人畜共通感染症の病原体との接触を防ぐことが可能である。

（骨芽細胞分化誘導因子）
本発明の骨芽細胞製造方法において、培養用の培地に骨芽細胞分化誘導因子を含むことができる。骨芽細胞分化誘導因子は、培養の開始から添加してもよく、培養の途中で添加してもよい。
骨芽細胞分化誘導因子は、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導できる限り、限定されるものではないが、例えば、デキサメタゾン、ＦＫ−５０６又はシクロスポリン等の免疫抑制剤、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７又はＢＭＰ９等の骨形成タンパク質（ＢＭＰ：Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ＴＧＦβ等の骨形成液性因子を挙げることができる。これらの骨芽細胞分化誘導因子から選択される１種又は２種以上を、培地に添加することにより、骨芽細胞分化誘導因子接触工程を行うことができる。
骨芽細胞分化誘導因子の濃度は、用いる骨芽細胞分化誘導因子の種類に応じて、適宜決めることができる。例えば、デキサメタゾンを用いる場合、１〜１００ｎＭの濃度で用いることができ、特には１０ｎＭが好ましい。

本発明の骨芽細胞製造方法においては、細胞培養基材が前記被覆された第１の魚類由来コラーゲン以外の第２のコラーゲン少なくとも１つが被覆された間葉系幹細胞との接触面を有してもよい。すなわち、本発明の骨芽細胞製造方法においては、第２のコラーゲンが被覆された細胞培養基材による培養を、更に行ってもよい。
第２のコラーゲンとしては、本発明の骨芽細胞分化誘導用培養基材に記載の第２のコラーゲンを用いることができる。また、第２のコラーゲンの細胞培養基材への被覆も、本発明の骨芽細胞分化誘導用培養基材に記載の方法に従って、被覆することができる。

第２のコラーゲンが被覆された細胞培養基材による培養は、第１の魚類由来コラーゲンが被覆された細胞培養基材による培養と同時に行ってもよく、別々に行ってもよい。第１の魚類由来コラーゲン及び第２のコラーゲンが、同じ接触面に被覆された細胞培養基材を用いる場合は、それぞれの培養は同時に行われる。一方、第１の魚類由来コラーゲン及び第２のコラーゲンが異なる接触面に被覆されている場合は、それぞれの培養は、同時に行うこともでき、また別々に行うこともできる。培養を同時に行う場合は、例えばマルチカルチャープレートのウェルの底面に第１の魚類由来コラーゲンを被覆し、ビーズの表面に第２のコラーゲンを被覆して、マルチカルチャープレート及びビーズを組み合わせた、細胞培養基材を用いればよい。更に、それぞれの培養は、骨芽細胞分化誘導因子の存在下で行ってもよく、骨芽細胞分化誘導因子の非存在下で行ってもよい。

本発明の骨芽細胞分化誘導用培養基材は、上述の本発明の骨芽細胞製造方法に使用することができる。

（骨芽細胞）
本発明の骨芽細胞は、本発明の製造方法により得ることのできる骨芽細胞であり、骨組織において骨形成を行うことができる。前記骨芽細胞は、間葉系幹細胞から、骨芽前駆細胞に分化し、更に骨芽細胞へと分化されたものである。また、骨芽細胞の細胞質は好塩基性を示し、アルカリホスファターゼ活性を有している。更に、本発明の骨芽細胞は、アンドロゲンとエストロゲンのレセプターを持っていてもよい。アンドロゲンは骨芽細胞の活動性を低下させ、エストロゲンは骨芽細胞を刺激するものである。

〔５〕魚類由来コラーゲンの使用
本発明の魚類由来コラーゲンの使用は、骨芽細胞分化誘導、又は骨芽細胞の製造を目的とするものである。具体的には、細胞培養基材に使用するものであり、より具体的には、細胞培養基材に被覆するものである。魚類由来コラーゲンとしては、前記前記骨芽細胞分化誘導方法〔１〕に記載の魚類由来コラーゲンを用いることができる。また、細胞培養基材への魚類由来コラーゲンの被覆は、前記骨芽細胞分化誘導方法〔１〕の「細胞培養基材へのコラーゲンの被覆」に記載の方法及び公知の方法に従って、行うことが可能である。
更に、魚類由来コラーゲンは、本発明の骨芽細胞分化誘導キットの製造に使用することができる。また、本明細書は本発明の骨芽細胞分化誘導キットの使用を開示している。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《アルカリホスファターゼ活性の測定》
実施例で得られた骨芽細胞のアルカリホスファターゼの測定は以下のように行った。
細胞をＰＢＳ（−）（ｐＨ７．４）で洗浄後、スクレイパーで回収し、２００μＬの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に懸濁して超音波破砕した。破砕後、６，０００ｇで10分間遠心して上清を回収した。上清２０μＬ（適宜１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５ｍＭ ＭｇＣｌ_２にて希釈）を使用し、ＬａｂＡｓｓａｙ ＡＬＰ（Ｗａｋｏ）を用いてアルカリホスファターゼ活性を測定した。

《製造例１：魚類由来コラーゲンの製造》
テラピアの鱗からのコラーゲンの製造方法を以下に記載する。
テラピアの鱗を水で十分洗浄し、更に１０％塩化ナトリウム溶液で十分洗浄し、鰭などの夾雑物を除去した後、室温にて乾燥した。含水率は１８．５％であった。
このテラピア鱗１ｋｇをｐＨ２の塩酸溶液９ｋｇに分散し、１Ｍの塩酸溶液を添加しながらｐＨを２に保った状態で、２５℃、２時間穏やかに攪拌し、鱗に含まれる無機成分を溶出した。これをザルにあげて、十分水洗した後、総重量が４ｋｇとなるようにｐＨ２の塩酸溶液を添加した。

これに、ペプシン（和光純薬 １：１００００）２４ｇを添加し、攪拌羽根を用いて２５℃、２４時間、穏やかに攪拌して、鱗からコラーゲンを溶出した。これをザルにあげて、鱗残渣と分離した後、更に遠心分離（１００００Ｇ、６０ｍｉｎ）により上澄を回収して微細な鱗残渣と分離した。これに、ペプシンを０．５ｇ添加し、２５℃、２４時間保持した。

得られた溶液（２．４ｋｇ）を０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過した後、終濃度が１．０Ｍになるように塩化ナトリウムを加えて緩やかに攪拌した。２５℃、３０ｍｉｎ静置して塩析した後、遠心分離（１００００Ｇ，２０ｍｉｎ）により上澄を除去し、コラーゲンの沈殿物を回収した。この沈殿物にｐＨ２の塩酸溶液４００ｍＬを加え、５℃、２４時間緩やかに攪拌して溶解した。この塩析精製工程を３回繰り返し、コラーゲン塩酸水溶液を得た。

《製造例２：魚鱗由来のコラーゲンで被覆した細胞培養基材の製造》
前記製造例１で得られたテラピア鱗由来のコラーゲン溶液を、ｐＨ３の０．０１Ｍ酢酸溶液を用いて０．３ｗｔ％に希釈した。アイスプレート上で、ポリスチレン製１２ウェル細胞培養プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に、前記コラーゲン溶液５００μＬを薄く広げて、２５℃で６０分静置した。余分なコラーゲン溶液を除去し、クリーンベンチ内で２５℃、６０分間乾燥した。
テラピア鱗由来コラーゲンの被覆されたウェルの表面を、位相差顕微鏡で観察した写真を図４Ａに示す。５０〜２００ｎｍ程度の太さのコラーゲン線維が、基材と接合し、均一に被覆されていた。

《比較製造例１：豚由来のコラーゲンで被覆した細胞培養基材の製造》
テラピア鱗由来のコラーゲン溶液（０．３ｗｔ％）に代えて、豚由来のコラーゲン（新田ゼラチン製、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ Ｔｙｐｅ Ｉ−Ｃ）溶液（０．０３ｗｔ％、）を使用したことを除いては、製造例２の操作を繰り返し、豚由来のコラーゲンを被覆したウェルを作成した。
豚由来コラーゲンの被覆されたウェルの表面を、位相差顕微鏡で観察した写真を図４Ｂに示す。コラーゲン線維は見られず、いくつかの凝集体が見られた。

《実施例１及び比較例１：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化》
本実施例では、製造例１で得られた魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養プレートを用いて、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化を行った。
（１）実施例１
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ；Ｌｏｎｚａ，Ｌｏｔ．Ｎｏ．６Ｆ３９７４）を１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養プレートに播種した。培地は、１５％ＦＢＳ添加α−ＭＥＭを用い、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で、２０時間培養を行った。細胞を回収し、アルカリホスファターゼの活性を測定した。結果を図１に示す。
なお、回収した細胞は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ^ＴＭ Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ^Ｒ ｄｓ ＤＮＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＤＮＡ量を定量し、測定したＤＮＡ量によりアルカリホスファターゼの活性を補正した。

（２）比較例１
比較例として、比較製造例１で得られた豚由来のコラーゲンで被覆された細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いて、骨髄由来間葉系幹細胞を骨芽細胞へ分化を試みた。
魚鱗由来のコラーゲンを被覆した細胞培養プレートに代えて、豚由来のコラーゲンで被覆した細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いたことを除いては、前記実施例１の操作を繰り返した。結果を図１に示す。

図１に示すように、豚由来コラーゲン被覆プレート又は非被覆プレートで培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、アルカリホスファターゼの活性が非常に低かった。一方、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートによって培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、アルカリホスファターゼの活性が高く、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートと接触することによって、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は骨芽細胞へ分化した。

《実施例２及び比較例２：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化》
本実施例では、魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養プレートを用いて、３％又は１５％のＦＢＳ存在下における、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化を行った。
（１）実施例２
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ；Ｌｏｎｚａ，Ｌｏｔ．Ｎｏ．６Ｆ３９７４）を１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、プレートに播種した。１５％ＦＢＳ添加α−ＭＥＭを用い、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で、２０時間前培養した。
培地を除去し、３％ＦＢＳ又は１５％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ培地に交換した。３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で、７日間培養した。３日後及び７日後に細胞を回収し、アルカリホスファターゼの活性を測定した。結果を図２Ａ及びＢ（Ｄｅｘ−３％及びＤｅｘ−１５％）に示す。
なお、回収した細胞について、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ^ＴＭ Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ^Ｒ ｄｓ ＤＮＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＤＮＡ量を定量し、測定したＤＮＡ量によりアルカリホスファターゼの活性を補正した。また、図３Ａ（Ｄｅｘ−３％及びＤｅｘ−１５％）に培養開始３日、７日、及び１０日の細胞の増殖をＤＮＡ量により示した。

（２）比較例２
比較例として、比較製造例１で得られた豚由来のコラーゲンで被覆された細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いて、骨髄由来間葉系幹細胞を骨芽細胞へ分化を試みた。
魚鱗由来のコラーゲンを被覆した細胞培養プレートに代えて、豚由来のコラーゲンで被覆した細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いたことを除いては、前記実施例２の操作を繰り返した。結果を図２Ａ及びＢ（Ｄｅｘ−３％及びＤｅｘ−１５％）に示す。
なお、回収した細胞について、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ^ＴＭ Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ^Ｒ ｄｓ ＤＮＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＤＮＡ量を定量し、測定したＤＮＡ量によりアルカリホスファターゼの活性を補正した。また、図３Ｂ及びＣ（Ｄｅｘ−３％及びＤｅｘ−１５％）に培養開始３日、７日、及び１０日の細胞の増殖をＤＮＡ量により示した。

図２Ａに示すように、豚由来コラーゲン被覆プレート又は非被覆プレートで培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、血清濃度３％および１５％のいずれも骨芽細胞分化誘導３日後のアルカリホスファターゼの活性が非常に低かった。一方、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートによって培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、血清濃度３％および１５％のいずれも骨芽細胞分化誘導３日後のアルカリホスファターゼの活性が高く、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートと接触することによって、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は骨芽細胞へ分化した。
また、図２Ｂに示すように、豚由来コラーゲン被覆プレート又は非被覆プレートで培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、特に血清濃度３％で骨芽細胞分化誘導７日後のアルカリホスファターゼの活性が非常に低かった。一方、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートによって培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、特に血清濃度３％で骨芽細胞分化誘導７日後のアルカリホスファターゼの活性が高く、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートと接触することによって、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は骨芽細胞へ分化した。

《実施例３及び比較例３：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化》
本実施例では、魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養プレート及び骨芽細胞分化誘導因子（デキサメタゾン）を用いて、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化を行った。
（１）実施例３
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ；Ｌｏｎｚａ，Ｌｏｔ．Ｎｏ．６Ｆ３９７４）を１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、プレートに播種した。１５％ＦＢＳ添加α−ＭＥＭを用い、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で、２０時間培養した。
培地を除去し、３％ＦＢＳ又は１５％ＦＢＳ、及び１０ｎＭ デキサメタゾン、５０μｇ／ｍＬ Ｌ−アスコルビン酸、１０ｍＭ β−グリセロリン酸を含むα−ＭＥＭ培地に交換した。３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で、７日間培養した。３日後及び７日後に細胞を回収し、アルカリホスファターゼの活性を測定した。結果を図２Ａ及びＢ（Ｄｅｘ＋３％及びＤｅｘ＋１５％）に示す。
なお、回収した細胞について、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ^ＴＭ Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ^Ｒ ｄｓ ＤＮＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＤＮＡ量を定量し、測定したＤＮＡ量によりアルカリホスファターゼの活性を補正した。また、図３Ａ（Ｄｅｘ＋３％及びＤｅｘ＋１５％）に培養開始３日、７日、及び１０日の細胞の増殖をＤＮＡ量により示した。

（２）比較例３
比較例として、比較製造例１で得られた豚由来のコラーゲンで被覆された細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いて、骨髄由来間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を試みた。
魚鱗由来のコラーゲンを被覆した細胞培養プレートに代えて、豚由来のコラーゲンで被覆した細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いたことを除いては、前記実施例３の操作を繰り返した。結果を図２Ａ及びＢに示す。
なお、回収した細胞について、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ^ＴＭ Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ^Ｒ ｄｓ ＤＮＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＤＮＡ量を定量し、測定したＤＮＡ量によりアルカリホスファターゼの活性を補正した。また、図３Ｂ及びＣ（Ｄｅｘ＋３％及びＤｅｘ＋１５％）に培養開始３日、７日、及び１０日の細胞の増殖をＤＮＡ量により示した。

図２Ａに示すように、豚由来コラーゲン被覆プレート又は非被覆プレートで培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、血清濃度３％および１５％のいずれも骨芽細胞分化誘導３日後のアルカリホスファターゼの活性が非常に低かった。一方、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートによって培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、血清濃度３％および１５％のいずれも骨芽細胞分化誘導３日後のアルカリホスファターゼの活性が高かった。
また、図２Ｂに示すように、豚由来コラーゲン被覆プレート又は非被覆プレートで培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、血清濃度３％および１５％のいずれも骨芽細胞分化誘導７日後のアルカリホスファターゼの活性が非常に低かった。一方、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートによって培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、血清濃度３％および１５％のいずれも骨芽細胞分化誘導７日後のアルカリホスファターゼの活性が高かった。

（実施例２及び３の結果）
図２Ａに示すように、３％ＦＢＳ存在下又は１５％ＦＢＳ存在下（実施例２）において、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートとの接触により、培養開始３日後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼの活性が上昇しており、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は骨芽細胞へ分化したことが確認された。特に、３％ＦＢＳ存在下でのアルカリホスファターゼの活性の上昇が大きかった。しかしながら、豚由来コラーゲン被覆プレート又は非被覆プレートとの接触では、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼの活性は、３％ＦＢＳ存在下又は１５％ＦＢＳ存在下においても実施例２の１／６以下であり、骨芽細胞への分化は確認できなかった。
更に骨芽細胞分化誘導因子であるデキサメタゾンを添加した実施例３においても、培養開始３日後及び７日後に、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートとの接触により、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼの活性が上昇した（図２Ａ及びＢ）。デキサメタゾンを添加しない場合と同じように、３％ＦＢＳ存在下でのアルカリホスファターゼの活性の上昇が大きかった。しかしながら、デキサメタゾンを添加した場合においても、豚由来コラーゲン被覆プレート又は非被覆プレートとの接触では、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼの活性の上昇は少なく、３日後においても実施例３の１／６以下であり、７日後において、若干アルカリホスファターゼの活性が上昇したのみであった。
すなわち、本発明の方法によれば、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートとの接触の初期段階で、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は骨芽細胞への強力な初期分化誘導が起こることがわかった。豚由来のコラーゲンで被覆した細胞培養プレートでは、骨芽細胞への分化は、観察されなかった。更に、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートとの接触による間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化は、代表的な骨芽細胞分化誘導因子であるデキサメタゾンと比較しても強いものであった。
なお、図３に示すように、細胞の増殖（ＤＮＡ量）は、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレート、豚由来コラーゲン被覆プレート又は非被覆プレートのいずれを用いた場合においても、大きな差は見られなかった。従って、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートとの接触によるヒト骨髄由来間葉系幹細胞は骨芽細胞へ分化は、細胞の増殖とは関係なく起きているものであると考えられる。

《実施例４及び比較例４：骨分化マーカー遺伝子の発現》
本実施例では、実施例１におけるヒト骨髄由来間葉系幹細胞の骨芽細胞へ分化を、骨分化マーカー遺伝子のｍＲＮＡの検出によって確認した。
（１）実施例４
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ；Ｌｏｎｚａ，Ｌｏｔ．Ｎｏ．６Ｆ３９７４）を１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、製造例２で得られたプレートに播種した。培地は、１５％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭを用い、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下、２０時間前培養を行った。細胞からRNeasy Micro Kit（QIAGEN社）を用い、添付のプロトコールに従ってトータルＲＮＡを回収した。Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche）を用いて、得られたトータルＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡを鋳型として、bone morohogenetic protein 2（ＢＭＰ２）、及びOsteopontin（ＳＰＰ１）の発現を、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（TOYOBO）を用い、リアルタイムＰＣＲで測定した。用いたプライマーは、以下のとおりである。なお、骨芽細胞の分化において発現が変動しないGlyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（ＧＡＰＤＨ）を、コントロールとして測定した。結果を図５Ａ及びＢに示す。

ＢＭＰ２
Forward primer：5’- TCA AGC CAA ACA CAA ACA GC -3’
Reverse primer：5’- ACG TCT GAA CAA TGG CAT GA -3’
増幅されるＰＣＲ産物の長さは、２００ｂｐである。
Osteopontin (SPP1)
Forward primer：5’- TTC GCA GAC CTG ACA TCC AGT ACC C -3’
Reverse primer：5’- GGG GAT GGC CTT GTA TGC ACC ATT C -3’
増幅されるＰＣＲ産物の長さは、９８ｂｐである。
GAPDH
Forward primer：5’- CAT GGA GAA GGC TGG GGC TCA TTT G -3’
Reverse primer：5’- GTT CAC ACC CAT GAC GAA CAT GGG G -3’
増幅されるＰＣＲ産物の長さは、９７ｂｐである。

（２）比較例４
比較例として、比較製造例１で得られた豚由来のコラーゲンで被覆された細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いて、ＢＭＰ２及びＳＰＰ１の発現を確認した。
魚鱗由来のコラーゲンを被覆した細胞培養プレートに代えて、豚由来のコラーゲンで被覆した細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いたことを除いては、前記実施例４の操作を繰り返した。結果を図５Ａ及びＢに示す。

図５に示すように、豚コラーゲン被膜プレート及び被膜無プレートに比べて、テラピアコラーゲン被膜プレートで培養したｈＭＳＣにおけるＢＭＰ２及びＳＰＰ１の遺伝子発現は、培養（接触）２０時間において、極めて高かった。すなわち、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートとの接触の初期に、骨芽細胞へ分化した。

《実施例５及び比較例５：骨分化マーカー遺伝子の発現》
本実施例では、実施例２及び３におけるヒト骨髄由来間葉系幹細胞の骨芽細胞へ分化を、骨分化マーカー遺伝子のｍＲＮＡの検出によって確認した。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ；Ｌｏｎｚａ，Ｌｏｔ．Ｎｏ．６Ｆ３９７４）を１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、製造例２で得られたプレートに播種した。培地は、１５％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭを用い、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下、２０時間前培養を行った。培地を除去し、骨分化誘導因子（１０ｎＭ デキサメタゾン），５０μｇ／ｍＬ Ｌ−アスコルビン酸及び１０ｍＭ β−グリセロリン酸を添加したもの及び骨分化誘導因子を添加していない３％ＦＢＳ又は１５％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭに置換した。３日目に細胞を回収し、細胞からRNeasy Micro Kit（QIAGEN社）を用い、添付のプロトコールに従ってトータルＲＮＡを回収した。Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche）を用いて、得られたトータルＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡを鋳型として、bone morohogenetic protein 2（ＢＭＰ２）、及びOsteopontin（ＳＰＰ１）の発現を、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（TOYOBO）を用い、リアルタイムＰＣＲで測定した。プライマーは、前記実施例４に記載のプライマーを用いた。結果を図６Ａ及びＢに示す。

（２）比較例５
比較例として、比較製造例１で得られた豚由来のコラーゲンで被覆された細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いて、ＢＭＰ２及びＳＰＰ１の発現を確認した。
魚鱗由来のコラーゲンを被覆した細胞培養プレートに代えて、豚由来のコラーゲンで被覆した細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いたことを除いては、前記実施例４の操作を繰り返した。結果を図６Ａ及びＢに示す。

図６に示すように、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートとの培養（接触）の初期と比較するとＢＭＰ２及びＳＰＰ１のｍＲＮＡの発現は減少した。しかしながら、豚由来コラーゲン被覆プレート又は非被覆プレートで培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞と比較して、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートによって培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、ＢＭＰ２及びＳＰＰ１のｍＲＮＡの発現が高かった。特に、３％ＦＢＳ存在下で培養した場合、ＭＰ２及びＳＰＰ１のｍＲＮＡの発現が高かった。

ＢＭＰ２及びOsteopontinは骨芽細胞への分化の初期段階で高発現する遺伝子であることから、魚類由来コラーゲン被膜培養プレートとの接触初期段階で、ｈＭＳＣは骨芽細胞へ分化することが骨分化マーカー遺伝子の発現からも示された。

《製造例３：魚鱗由来のコラーゲンで被覆した細胞培養基材の製造》
本製造例では、テラピア由来のコラーゲンを塩酸で希釈し、骨芽細胞分化誘導用培養基材を製造した。
テラピア鱗由来のコラーゲン溶液（０．３重量％／０．０１Ｍ ＨＣｌ）５００μＬを、ポリスチレン製１２ウェル細胞培養プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に薄く広げて、２５℃で６０分静置した。余分なコラーゲン溶液を除去し、クリーンベンチ内で２５℃、６０分間乾燥した。

《比較製造例２：豚由来のコラーゲンで被覆した細胞培養基材の製造》
本比較製造例では、豚由来のコラーゲンを塩酸で希釈し、０．３ｗｔ％の濃度で被覆し、細胞培養基材を製造した。
テラピア鱗由来のコラーゲン溶液（０．３ｗｔ％）に代えて、豚由来のコラーゲン（新田ゼラチン製、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ Ｔｙｐｅ Ｉ−Ｃ）溶液（０．３ｗｔ％、）を使用したことを除いては、製造例３の操作を繰り返し、豚由来のコラーゲンを被覆したウェルを作成した。

《実施例６及び比較例６：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化》
本実施例では、製造例３で得られた魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養プレートを用いて、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化を行った。
（１）実施例６
製造例２で得られたプレートに代えて製造例３で得られたプレートを用いたこと、１５％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭに代えて１０％ＦＢＳ添加Ｄ−ＭＥＭ（ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）を用いたこと、を除いては、実施例１の操作を繰り返した。結果を図７Ａに示す。

（２）比較例６
比較例として、比較製造例２で得られた豚由来のコラーゲンで被覆された細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いて、骨髄由来間葉系幹細胞を骨芽細胞へ分化を試みた。
製造例３で得られたプレートに代えて、比較製造例２で得られたプレート又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いたことを除いては、実施例６の操作を繰り返した。結果を図７Ａに示す。

図７Ａに示すように、豚由来コラーゲン被覆プレート又は非被覆プレートで培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、アルカリホスファターゼの活性が非常に低かった。一方、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートによって培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、アルカリホスファターゼの活性が高く、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートと接触することによって、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は骨芽細胞へ分化した。

《実施例７及び比較例７：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化》
本実施例では、魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養プレートを用いて、３％ＦＢＳ存在下における、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化を行った。
（１）実施例７
製造例２で得られたプレートに代えて製造例３で得られたプレートを用いたこと、１５％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭに代えて１０％ＦＢＳ添加Ｄ−ＭＥＭ（ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）を用いたこと、３％又は１５％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ培地に代えて３％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ（ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）培地を用いたことを除いては、実施例２の操作を繰り返した。細胞の回収は３日後に行った。結果を図７Ｂ（Ｄｅｘ（−））に示す。

（２）比較例７
比較例として、比較製造例２で得られた豚由来のコラーゲンで被覆された細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いて、骨髄由来間葉系幹細胞を骨芽細胞へ分化を試みた。
製造例３で得られたプレートに代えて、比較製造例２で得られたプレート又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いたことを除いては、実施例７の操作を繰り返した。結果を図７Ｂ（Ｄｅｘ（−））に示す。

《実施例８及び比較例８：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化》
本実施例では、魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養プレート及び骨芽細胞分化誘導因子（デキサメタゾン）を用いて、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化を行った。
（１）実施例８
製造例２で得られたプレートに代えて製造例３で得られたプレートを用いたこと、１５％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭに代えて１０％ＦＢＳ添加Ｄ−ＭＥＭ（ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）を用いたこと、３％又は１５％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ培地に代えて３％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ（ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）培地を用いたことを除いては、実施例３の操作を繰り返した。細胞の回収は３日後に行った。結果を図７Ｂ（Ｄｅｘ（＋））に示す。

（２）比較例８
比較例として、比較製造例２で得られた豚由来のコラーゲンで被覆された細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いて、骨髄由来間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を試みた。
製造例３で得られたプレートに代えて、比較製造例２で得られたプレート又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いたことを除いては、実施例８の操作を繰り返した。結果を図７Ｂ（Ｄｅｘ（＋））に示す。

（実施例７及び８の結果）
図７（Ｂ）に示すように、３％ＦＢＳ存在下（実施例）において、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートとの接触により、培養開始３日後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼの活性が上昇しており、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は骨芽細胞へ分化したことが確認された。しかしながら、豚由来コラーゲン被覆プレートとの接触では実施例７の１／２以下、非被覆プレートとの接触では、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼの活性は実施例７の１／５以下であった。
更に骨芽細胞分化誘導因子であるデキサメタゾンを添加した実施例８においても、培養開始３日後に、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートとの接触により、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼの活性が上昇した（図７Ｂ）。豚由来コラーゲン被覆プレート又は非被覆プレートとの接触では、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞のアルカリホスファターゼの活性の上昇は少なく、３日後においてもそれぞれ実施例８の約１／２、および１／５以下であった。
すなわち、本発明の方法によれば、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートとの接触の初期段階で、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は骨芽細胞への強力な初期分化誘導が起こることがわかった。豚由来のコラーゲンで被覆した細胞培養プレートでは、骨芽細胞への分化は、観察されなかった。更に、魚類由来コラーゲン被覆細胞培養プレートとの接触による間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化は、代表的な骨芽細胞分化誘導因子であるデキサメタゾンと比較しても強いものであった。

《実施例９及び比較例９：骨分化マーカー遺伝子の発現》
本実施例では、実施例６におけるヒト骨髄由来間葉系幹細胞の骨芽細胞へ分化を、骨分化マーカー遺伝子（ＢＭＰ２及びＳＰＰ１）のｍＲＮＡの検出によって確認した。
（１）実施例９
製造例２で得られたプレートに代えて製造例３で得られたプレートを用いたこと、１５％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭに代えて１０％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ（ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）を用いたことを除いては、実施例４の操作を繰り返した。結果を図８Ａ及びＢ（Ｄａｙ０）に示す。

（２）比較例９
製造例３で得られたプレートに代えて、比較製造例２で得られたプレート又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いたことを除いては、実施例９の操作を繰り返した。結果を図８Ａ及びＢ（Ｄａｙ０）に示す。

図８に示すように、豚コラーゲン被膜プレートおよび被膜無プレートに比べて、テラピアコラーゲン被膜プレートで培養したｈＭＳＣにおけるＢＭＰ２およびＳＰＰ１の遺伝子発現は、培養（接触）２０時間において、極めて高かった。すなわち、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートとの接触の初期に、骨芽細胞へ分化した。

《実施例１０及び比較例１０：骨分化マーカー遺伝子の発現》
本実施例では、実施例７及び８におけるヒト骨髄由来間葉系幹細胞の骨芽細胞へ分化を、骨分化マーカー遺伝子のｍＲＮＡの検出によって確認した。
（１）実施例１０
製造例２で得られたプレートに代えて製造例３で得られたプレートを用いたこと、３％又は１５％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭに代えて３％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ（ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）を用いたこと、細胞の回収を３日目及び７日目に行ったことを除いては、実施例５（実施例３の１０ｎＭデキサメサゾン添加）の操作を繰り返した。結果を図８Ａ及びＢ（Ｄａｙ３及びＤａｙ７）に示す。

（２）比較例１０
比較例として、比較製造例２で得られた豚由来のコラーゲンで被覆された細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いて、ＢＭＰ２及びＳＰＰ１の発現を確認した。
魚鱗由来のコラーゲンを被覆した細胞培養プレートに代えて、豚由来のコラーゲンで被覆した細胞培養プレート、又はコラーゲンを被覆していない細胞培養プレートを用いたことを除いては、前記実施例１０の操作を繰り返した。結果を図８Ａ及びＢ（Ｄａｙ３及びＤａｙ７）に示す。

図８Ａ及びＢに示すように、テラピアの鱗由来のコラーゲンを被覆したプレートとの培養（接触）の初期と比較するとＢＭＰ２及びＳＰＰ１のｍＲＮＡの発現は減少した。

ＢＭＰ２およびＳＰＰ１は骨芽細胞への分化の初期段階で高発現する遺伝子であることから、魚類由来コラーゲン被膜培養プレートとの接触初期段階で、ｈＭＳＣは骨芽細胞へ分化することが骨分化マーカー遺伝子の発現からも示された。

本発明の骨芽細胞分化誘導方法を用いて、間葉系幹細胞から骨芽細胞を誘導することができる。また、本発明の骨芽細胞製造方法を用いて、間葉系幹細胞から骨芽細胞を製造することができる。
更に、本発明によれば、骨芽細胞分化誘導キット及び骨芽細胞製造装置を製造することができる。

Claims (25)

1. 魚類由来コラーゲンが被覆された、間葉系幹細胞との接触面を有する、骨芽細胞分化誘導用培養基材。
2. 前記魚類由来コラーゲンが、テラピア鱗由来のコラーゲンである、請求項１に記載の骨芽細胞分化誘導用培養基材。
3. 前記間葉系幹細胞が、骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、滑膜組織由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、歯胚由来間葉系幹細胞、耳介軟骨膜由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、靭帯由来間葉系幹細胞、腱由来間葉系幹細胞、ＥＳ細胞由来間葉系幹細胞、又はｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞である、請求項１又は２に記載の骨芽細胞分化誘導用培養基材。
4. 前記間葉系幹細胞が、ヒト由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の骨芽細胞分化誘導用培養基材。
5. 前記被覆された第１の魚類由来コラーゲン以外の第２のコラーゲン少なくとも１つが被覆された間葉系幹細胞との接触面を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の骨芽細胞分化誘導用培養基材。
6. 前記第２のコラーゲンが、哺乳類由来コラーゲン、鳥類由来コラーゲン、爬虫類由来コラーゲン、両生類由来コラーゲン、魚類由来コラーゲン、無脊椎動物由来コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるコラーゲンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の、骨芽細胞分化誘導用培養基材。
7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の骨芽細胞分化誘導用培養基材を含む、骨芽細胞分化誘導キット。
8. 骨芽細胞分化誘導因子を更に含む、請求項７に記載の骨芽細胞分化誘導キット。
9. 魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養基材と、間葉系幹細胞とを接触させる魚類由来コラーゲン接触工程を含む、骨芽細胞分化誘導方法。
10. 前記間葉系幹細胞が、骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、滑膜組織由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、歯胚由来間葉系幹細胞、耳介軟骨膜由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、靭帯由来間葉系幹細胞、腱由来間葉系幹細胞、ＥＳ細胞由来間葉系幹細胞、又はｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞である、請求項９に記載の骨芽細胞分化誘導方法。
11. 前記間葉系幹細胞が、ヒト由来である、請求項９又は１０に記載の骨芽細胞分化誘導方法。
12. 前記被覆された第１の魚類由来コラーゲン以外の第２のコラーゲン少なくとも１つが被覆された細胞培養基材と、間葉系幹細胞とを接触させる第２コラーゲン接触工程を更に含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の骨芽細胞分化誘導方法。
13. 前記第２のコラーゲンが、哺乳類由来コラーゲン、鳥類由来コラーゲン、爬虫類由来コラーゲン、両生類由来コラーゲン、魚類由来コラーゲン、無脊椎動物由来コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるコラーゲンである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の骨芽細胞分化誘導方法。
14. 前記間葉系幹細胞を骨芽細胞分化誘導因子に接触させる骨芽細胞分化誘導因子接触工程を更に含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の骨芽細胞分化誘導方法。
15. 前記第１の魚類由来コラーゲンが、テラピア鱗由来のコラーゲンである、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の骨芽細胞分化誘導方法。
16. 前記接触工程が、５％以下の血清の存在下、又は血清の非存在下で行われる、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の骨芽細胞分化誘導方法。
17. 魚類由来コラーゲンで被覆された細胞培養基材によって、間葉系幹細胞を培養する魚類由来コラーゲン培養工程を含む、骨芽細胞製造方法。
18. 前記間葉系幹細胞が、骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、滑膜組織由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、歯胚由来間葉系幹細胞、耳介軟骨膜由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、靭帯由来間葉系幹細胞、腱由来間葉系幹細胞、ＥＳ細胞由来間葉系幹細胞、又はｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞である、請求項１７に記載の骨芽細胞製造方法。
19. 前記間葉系幹細胞が、ヒト由来である、請求項１７又は１８に記載の骨芽細胞製造方法。
20. 前記細胞培養基材が、前記被覆された第１の魚類由来コラーゲン以外の第２のコラーゲン少なくとも１つが被覆された間葉系幹細胞との接触面を有する、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の骨芽細胞製造方法。
21. 前記第２のコラーゲンが、哺乳類由来コラーゲン、鳥類由来コラーゲン、爬虫類由来コラーゲン、両生類由来コラーゲン、魚類由来コラーゲン、無脊椎動物由来コラーゲン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるコラーゲンである、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の骨芽細胞製造方法。
22. 前記間葉系幹細胞の培養培地が、５％以下の血清を含む培地又は無血清培地である、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の骨芽細胞製造方法。
23. 前記間葉系幹細胞の培養培地が、骨芽細胞分化誘導因子を含む培地である、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の骨芽細胞製造方法。
24. 前記魚類由来コラーゲンが、テラピア鱗由来のコラーゲンである、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の骨芽細胞製造方法。
25. 請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の骨芽細胞製造方法により得られる骨芽細胞。