JP2012187308A - Sulfated polysaccharide immobilizing base material and method for removing virus using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、多孔性高分子支持体の表面を処理することにより得られる硫酸化多糖が固定化された高分子基材に関する。また、本発明の本高分子基材は肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスを吸着する機能を有することから、当該高分子基材を用いた肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスを除去する医療器具、及び除去する方法に関する。 The present invention relates to a polymer substrate on which a sulfated polysaccharide obtained by treating the surface of a porous polymer support is immobilized. In addition, since the polymer base material of the present invention has a function of adsorbing hepatitis virus or human immunodeficiency virus, a medical device that removes hepatitis virus or human immunodeficiency virus using the polymer base material, and removal On how to do.
Ｃ型肝炎はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の慢性的感染が原因であり、薬剤による治療法としてペグインターフェロン、リバビリンの併用療法が一般的である。ジェノタイプ１ｂかつ血液中のウイルス量の多い患者では、治療成績は５０％程度であり、肝硬変、肝がんへの移行割合が高いことからより有効な治療法、薬剤の開発が望まれている（非特許文献１）。一般的に薬剤による治療では血中のウイルス量が低い場合、治療成績が高いことが知られており、血中のＨＣＶを多孔性のフィルターで除去し、薬剤との併用療法を行うと、治療成績が向上するとの報告がある（非特許文献２）。即ち、体内のウイルス量を下げることで、治療成績が向上したものと推定される。 Hepatitis C is caused by chronic infection with hepatitis C virus (HCV), and a combination therapy of peginterferon and ribavirin is common as a therapeutic method using drugs. In patients with genotype 1b and a large amount of virus in the blood, the therapeutic result is about 50%, and since the rate of transition to cirrhosis and liver cancer is high, development of more effective treatment methods and drugs is desired. (Non-Patent Document 1). In general, treatment with drugs is known to have high therapeutic results when the amount of virus in the blood is low. When HCV in the blood is removed with a porous filter and combined with the drug, treatment is performed. There is a report that results are improved (Non-Patent Document 2). That is, it is presumed that the treatment results have been improved by reducing the amount of virus in the body.
しかしながら、上記フィルターで除去する方法は、一旦血球と血漿をフィルターで分離した後、血漿成分をさらに別のフィルターに通すことでウイルスを除去することから、回路構成は複雑で、より簡便に血中からウイルスを除去する方法が望まれている。 However, the method of removing with the above filter is to remove the virus by once separating blood cells and plasma with a filter and then passing the plasma component through another filter. There is a need for a method of removing viruses from sucrose.
一方、ＨＣＶに結合するリガンドとしてヘパリンが有効なことが知られている（非特許文献３）。よって、ヘパリンを固定化された基材は、より簡便にＨＣＶを除去できる可能性があり、患者への負担の少ないＨＣＶ除去モジュール等を提供できることが期待される。 On the other hand, it is known that heparin is effective as a ligand that binds to HCV (Non-patent Document 3). Therefore, the base material on which heparin is immobilized may be able to remove HCV more easily, and is expected to provide an HCV removal module or the like with less burden on the patient.
ヘパリンが固定化された基材の形態にはビーズや多孔質中空糸が挙げられる。多孔質中空糸を用いた内部循環型の体外循環モジュールは粒子状ヘパリン固定化基材の充填された体外循環モジュールと比較して血液の滞留部分が少ないことから、構成上血栓の形成が少ない利点を有する。多孔質中空糸にヘパリンを固定化する際、表面官能基の種類や固定化密度は基材材質によって異なり、各基材によって最適な方法を見出す必要がある。 Examples of the form of the substrate on which heparin is immobilized include beads and porous hollow fibers. The internal circulation type extracorporeal circulation module using a porous hollow fiber has less blood stagnation than the extracorporeal circulation module filled with the particulate heparin-immobilized base material, so it has the advantage of less thrombus formation due to its structure. Have When immobilizing heparin on the porous hollow fiber, the type of surface functional group and the immobilization density vary depending on the base material, and it is necessary to find an optimum method for each base material.
例えば、特許文献１には、血液入口、上流側血液回路、血漿分離手段、下流側血液回路がこの順に接続され、更に血漿分離手段の血漿出口、上流側血漿回路、血漿浄化手段、下流側血漿回路がこの順に接続され、下流側血漿回路の末端は下流側血液回路の途中に設けられた血液血漿混合手段に接続されている血液処理装置であって、下流側血液回路の血液血漿混合手段の下流側に少なくともウイルス及びウイルス感染細胞を除去する水不溶性担体からなる血球処理手段が設けられ血漿浄化手段が最大孔径２０ｎｍ以上５０ｎｍ以下の多孔性濾過膜からなる装置が記載されている。 For example, in Patent Document 1, a blood inlet, an upstream blood circuit, a plasma separation unit, and a downstream blood circuit are connected in this order, and further, a plasma outlet of the plasma separation unit, an upstream plasma circuit, a plasma purification unit, and a downstream plasma The circuits are connected in this order, and the end of the downstream plasma circuit is a blood processing apparatus connected to blood plasma mixing means provided in the middle of the downstream blood circuit, and the blood plasma mixing means of the downstream blood circuit A device is described in which a blood cell treatment means comprising a water-insoluble carrier for removing at least viruses and virus-infected cells is provided on the downstream side, and the plasma purification means comprises a porous filtration membrane having a maximum pore diameter of 20 nm to 50 nm.
特許文献２には、血液中の有害成分を吸着除去するための、安全性と性能が優れた吸着材であって、アニオン性基を有する分子量１０００以上１００万以下の化合物が、水不溶性担体に溶離値０．００１以下、熱解離値０．０１以下の強度で、水不溶性担体１ｍＬあたり０．０１ｍｇ以上１００ｍｇ以下共有結合されていることを特徴とする血液浄化用吸着材が記載されている。
一方、ヒト免疫不全症候群はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の慢性的感染が原因であり、薬剤による治療法として多剤併用療法が一般的である。しかし、薬剤耐性ウイルスの出現によりこれまでにない有効な治療法、薬剤の開発が望まれている。血液中のＨＩＶを除去或いは減数化した後に、薬剤との併用効果により、治療効果を高めることができると期待される。 On the other hand, human immunodeficiency syndrome is caused by chronic infection with human immunodeficiency virus (HIV), and multidrug therapy is a common treatment method using drugs. However, with the advent of drug-resistant viruses, the development of effective therapeutic methods and drugs that have never existed is desired. After removing or reducing HIV in blood, it is expected that the therapeutic effect can be enhanced by the combined use effect with the drug.
例えば、特許文献３には、多孔質体と、該多孔質体の細孔表面に担持されてなるポリ硫酸化合物とを有するＨＩＶ及びその関連物質除去材料であって、前記ポリ硫酸化合物は、実質的に硫酸基がカリウム塩またはナトリウム塩の形で存在することを特徴とするＨＩＶ及びその関連物質除去材料が記載されている。 For example, Patent Document 3 discloses an HIV and related substance removing material having a porous body and a polysulfate compound supported on the pore surfaces of the porous body, and the polysulfate compound is substantially In particular, a material for removing HIV and its related substances is described, wherein the sulfate group is present in the form of potassium salt or sodium salt.
これまでの技術では、ウイルス等の病原菌を除去する手段は濾過膜を用いた病原菌を含有する血液の濾過によるものが殆どであり、これらの手段では患者にとって肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスと同程度以上の大きさの有用成分、例えば脂質や免疫グロブリン等も一緒に除去されてしまうため、患者への負担が大きく問題となっていた。
そこで、本発明の課題は、血中のウイルスの除去を目的とした肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス吸着用高分子基材であって、除去が好ましくない血液中の成分を吸着・除去することなく、また、血栓等の形成により目詰まり等がを起こすことなく、肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスを除去できる機能を有する高分子基材、及びそれを用いた医療器具を提供することである。
In the conventional technology, most of the means for removing pathogenic bacteria such as viruses are filtration of blood containing pathogenic bacteria using a filtration membrane, and these means are equivalent to hepatitis virus or human immunodeficiency virus for patients. Since useful components of the above sizes, such as lipids and immunoglobulins, are also removed together, the burden on the patient has been a serious problem.
Accordingly, an object of the present invention is a polymer substrate for adsorbing hepatitis virus or human immunodeficiency virus for the purpose of removing viruses in the blood, without adsorbing / removing components in the blood that are undesirable for removal. Another object of the present invention is to provide a polymer base material having a function capable of removing hepatitis virus or human immunodeficiency virus without causing clogging or the like due to formation of a thrombus, and a medical device using the same.
上記課題を解決するために、本発明者らは多孔性高分子支持体（Ｂ）の選択、肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスを吸着する機能を有する硫酸化多糖の多孔性高分子支持体（Ｂ）への固定化方法、及びウイルス吸着能について詳細に検討を行った結果、本発明を完成させるに至った。 In order to solve the above problems, the present inventors select a porous polymer support (B), a sulfated polysaccharide porous polymer support (B) having a function of adsorbing hepatitis virus or human immunodeficiency virus. As a result of detailed examination of the immobilization method and the virus adsorption ability, the present invention has been completed.
即ち、本発明は、重合性化合物（Ａ）のグラフト重合反応により多孔性高分子支持体（Ｂ）が表面処理された肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス吸着用高分子基材であって、
重合性化合物（Ａ）が、水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）、少なくとも２個のエポキシ基を有する化合物（Ｄ）及びアンモニアからなる群から選ばれるいずれか一種と反応し得る官能基を有するものであり、且つ、硫酸化多糖が、水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）、少なくとも２個のエポキシ基を有する化合物（Ｄ）及びアンモニアからなる群から選ばれるいずれか一種との反応により形成される共有結合を介して重合性化合物（Ａ）により形成されるグラフト重合鎖と結合されたことを特徴とする肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス吸着用高分子基材に関する。
That is, the present invention is a polymer substrate for adsorbing hepatitis virus or human immunodeficiency virus, wherein the porous polymer support (B) is surface-treated by graft polymerization reaction of the polymerizable compound (A),
The polymerizable compound (A) has a functional group capable of reacting with any one selected from the group consisting of a compound (C) having a hydroxyl group or an amino group, a compound (D) having at least two epoxy groups, and ammonia. And a sulfated polysaccharide is formed by reaction with any one selected from the group consisting of a compound (C) having a hydroxyl group or an amino group, a compound (D) having at least two epoxy groups, and ammonia. The present invention relates to a polymer substrate for adsorbing hepatitis virus or human immunodeficiency virus, which is bonded to a graft polymer chain formed by a polymerizable compound (A) through a covalent bond.
本発明によれば、除去が好ましくない上記血液中の成分を吸着・除去することなく、また、血栓等の形成により目詰まり等を起こすことなく、肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスを除去できる機能を有する高分子基材、及びそれを用いた医療器具を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to remove hepatitis virus or human immunodeficiency virus without adsorbing / removing components in the blood that are not preferably removed and without causing clogging due to formation of a thrombus or the like. It is possible to provide a polymer substrate having the same and a medical instrument using the same.
即ち、本発明は、
１．重合性化合物（Ａ）のグラフト重合反応により多孔性高分子支持体（Ｂ）が表面処理された肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス吸着用高分子基材であって、
重合性化合物（Ａ）が、水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）、少なくとも２個のエポキシ基を有する化合物（Ｄ）及びアンモニアからなる群から選ばれるいずれか一種と反応し得る官能基を有する化合物であり、且つ、
硫酸化多糖が、水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）、少なくとも２個のエポキシ基を有する化合物（Ｄ）及びアンモニアからなる群から選ばれるいずれか一種との反応により形成される共有結合を介して重合性化合物（Ａ）により形成されるグラフト重合鎖と結合されたことを特徴とする肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス吸着用高分子基材、
２．重合性化合物（Ａ）が、（メタ）アクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート又は（メタ）アクリロイルオキシアルキルイソシアネートである１．に記載の肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス吸着用高分子基材、
３．多孔性高分子支持体（Ｂ）が、ポリオレフィン、ポリエーテルスルホン又はセルロース混合エステルを基質とする多孔性高分子支持体である１．に記載の肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス吸着用高分子基材、
４．多孔性高分子支持体（Ｂ）が、多孔性中空糸である１．に記載の肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス吸着用高分子基材、
５．ポリオレフィンが、ポリエチレン、ポリプロピレン又はポリ４−メチルペンテンである３．に記載の肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス吸着用高分子基材、
６．水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）が、水酸基若しくはアミノ基が保護基を有してもよいヒドロキシアルキルアミン誘導体、又は保護基を有しないアミノ基を少なくとも２個有する多価アミン誘導体である１．〜５．の何れかに記載の肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス吸着用高分子基材、
７．水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）が、２−アミノエタノール、エチレンジアミン、ブチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、１，２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミンからなる群から選ばれる何れかである６．に記載の肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス吸着用高分子基材、
８．少なくとも２個のエポキシ基を有する化合物（Ｄ）が、一般式（１）
That is, the present invention
1. A polymer substrate for adsorbing hepatitis virus or human immunodeficiency virus, wherein the porous polymer support (B) is surface-treated by graft polymerization reaction of the polymerizable compound (A),
The polymerizable compound (A) has a functional group capable of reacting with any one selected from the group consisting of a compound (C) having a hydroxyl group or an amino group, a compound (D) having at least two epoxy groups, and ammonia. A compound, and
Through a covalent bond formed by reaction of the sulfated polysaccharide with any one selected from the group consisting of a compound (C) having a hydroxyl group or an amino group, a compound (D) having at least two epoxy groups, and ammonia. A polymer substrate for adsorbing hepatitis virus or human immunodeficiency virus, characterized in that it is bound to a graft polymer chain formed by the polymerizable compound (A),
2. 1. The polymerizable compound (A) is (meth) acrylic acid, glycidyl (meth) acrylate or (meth) acryloyloxyalkyl isocyanate. A polymer substrate for adsorbing hepatitis virus or human immunodeficiency virus according to
3. 1. The porous polymer support (B) is a porous polymer support using polyolefin, polyethersulfone or cellulose mixed ester as a substrate. A polymer substrate for adsorbing hepatitis virus or human immunodeficiency virus according to
4). 1. The porous polymer support (B) is a porous hollow fiber. A polymer substrate for adsorbing hepatitis virus or human immunodeficiency virus according to
5. 2. The polyolefin is polyethylene, polypropylene or poly-4-methylpentene A polymer substrate for adsorbing hepatitis virus or human immunodeficiency virus according to
6). The compound (C) having a hydroxyl group or an amino group is a hydroxyalkylamine derivative in which the hydroxyl group or amino group may have a protecting group, or a polyvalent amine derivative having at least two amino groups having no protecting group. . ~ 5. A polymer substrate for adsorbing hepatitis virus or human immunodeficiency virus according to any one of
7). The compound (C) having a hydroxyl group or an amino group is selected from the group consisting of 2-aminoethanol, ethylenediamine, butylenediamine, hexamethylenediamine, 1,2-bis (2-aminoethoxy) ethane, polyethyleneimine, and polyallylamine. 5. Either A polymer substrate for adsorbing hepatitis virus or human immunodeficiency virus according to
8). The compound (D) having at least two epoxy groups is represented by the general formula (1)
（式中、ｍは１〜１００の整数、ｎは２〜４の整数を表す。）
で表される１．〜７．の何れかに記載の肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス吸着用高分子基材、
９．硫酸化多糖が、ヘパリン、ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体、デキストラン硫酸又はフコイダンである１．〜８．の何れかに記載の肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス吸着用高分子基材。
１０．１．〜９．の何れかに記載の肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス吸着用高分子基材を備えた肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス除去器具、
１１．肝炎ウイルスがＢ型又はＣ型肝炎ウイルスである１０．に記載の肝炎ウイルス除去器具、
１２．８．〜１１．の何れかに記載の肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス除去器具を用いた肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスの除去方法、
１３．４．に記載の肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス吸着用高分子基材を用いた肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスの除去方法において、
肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスを含む液を多孔性中空糸に通じることにより得られる、中空糸の有する孔を通過した液と、孔を通過しなかった液とを混合する工程を有することを特徴とする肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスを除去する方法、
(In the formula, m represents an integer of 1 to 100, and n represents an integer of 2 to 4.)
1. ~ 7. A polymer substrate for adsorbing hepatitis virus or human immunodeficiency virus according to any one of
9. The sulfated polysaccharide is heparin, a heparin derivative in which the primary or secondary hydroxyl group of heparin is sulfate esterified, a heparin derivative in which the N-acetyl group-elimination product of heparin is N-sulfate ester, dextran sulfate or fucoidan. There is one. ~ 8. A polymer substrate for adsorbing hepatitis virus or human immunodeficiency virus according to any one of the above.
10.1. ~ 9. A hepatitis virus or human immunodeficiency virus removal instrument comprising the polymer substrate for adsorbing hepatitis virus or human immunodeficiency virus according to any one of
11. 9. Hepatitis virus is hepatitis B or C Hepatitis virus removal instrument according to
12.8. ~ 11. A method for removing hepatitis virus or human immunodeficiency virus using the hepatitis virus or human immunodeficiency virus removal instrument according to any one of
13.4. In the method for removing hepatitis virus or human immunodeficiency virus using the polymer substrate for adsorbing hepatitis virus or human immunodeficiency virus described in
It has a step of mixing a liquid that has passed through the hole of the hollow fiber and a liquid that has not passed through the hole, which is obtained by passing a liquid containing hepatitis virus or human immunodeficiency virus through the porous hollow fiber. A method for removing hepatitis virus or human immunodeficiency virus,
に関する。 About.
・重合性化合物（Ａ）
本発明に用いられる重合性化合物（Ａ）は、水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）、少なくとも２個のエポキシ基を有する化合物（Ｄ）及びアンモニアからなる群から選ばれるいずれか一種と反応し得る基を有し、更に多孔性高分子支持体（Ｂ）にグラフト重合反応し得るエチレン性不飽和基を有するものであれば制限なく使用することが可能である。
多孔性高分子支持体（Ｂ）とのグラフト重合を考慮すると、水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）、少なくとも２個のエポキシ基を有する化合物（Ｄ）及びアンモニアからなる群から選ばれるいずれか一種と反応し得る基を有する（メタ）アクリル系化合物が好ましい。（メタ）アクリル系化合物として、（メタ）アクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート又は（メタ）アクリロイルオキシアルキルイソシアネートが特に好ましい。
・ Polymerizable compound (A)
The polymerizable compound (A) used in the present invention reacts with any one selected from the group consisting of a compound (C) having a hydroxyl group or an amino group, a compound (D) having at least two epoxy groups, and ammonia. As long as it has an ethylenically unsaturated group capable of undergoing a graft polymerization reaction on the porous polymer support (B), it can be used without limitation.
In consideration of graft polymerization with the porous polymer support (B), any one selected from the group consisting of a compound (C) having a hydroxyl group or an amino group, a compound (D) having at least two epoxy groups, and ammonia A (meth) acrylic compound having a group capable of reacting with one kind is preferred. As the (meth) acrylic compound, (meth) acrylic acid, glycidyl (meth) acrylate or (meth) acryloyloxyalkyl isocyanate is particularly preferable.
・多孔性高分子支持体（Ｂ）
本発明に用いる多孔性高分子支持体（Ｂ）は、電離放射線照射によってラジカルを生成する高分子化合物で好ましい。このような高分子化合物としては血液適合性の高いものであれば種々のものを用いることができるが、例えば、オレフィン系樹脂、スチレン系樹脂、スルホン系樹脂、アクリル系樹脂、ウレタン系樹脂、エステル系樹脂、エーテル系樹脂又はセルロースアセテートが挙げられ、より具体的にはポリエチレンテレフタレート、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリメチルメタクリレート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリエチレン、ポリプロピレン又はポリ−４−メチルペンテン等を例示できる。
・ Porous polymer support (B)
The porous polymer support (B) used in the present invention is preferably a polymer compound that generates radicals upon irradiation with ionizing radiation. As such a polymer compound, various compounds having high blood compatibility can be used. For example, olefin resin, styrene resin, sulfone resin, acrylic resin, urethane resin, ester Resin, ether resin or cellulose acetate, and more specifically, polyethylene terephthalate, ethylene vinyl alcohol copolymer, polymethyl methacrylate, polysulfone, polyether sulfone, polyacrylonitrile, polyethylene, polypropylene or poly-4-methyl. An example is pentene.
その他、多孔性高分子支持体（Ｂ）の材質としては、セルロースやその誘導体等の天然高分子、或いはポリオレフィン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール、ポリアミド、ポリイミド、ポリフッ化ビニリデン、ポリエーテルスルホンとポリアリレートのポリマーアロイ等の高分子材料を例示できる。更には、表面処理により親水性多孔質膜に表面改質されているものが好ましい。 In addition, as the material of the porous polymer support (B), natural polymers such as cellulose and derivatives thereof, or polyolefin, polysulfone, polyethersulfone, polyacrylonitrile, polymethyl methacrylate, ethylene vinyl alcohol, polyamide, polyimide, Examples thereof include polymer materials such as polyvinylidene fluoride and a polymer alloy of polyethersulfone and polyarylate. Furthermore, what is surface-modified to the hydrophilic porous membrane by surface treatment is preferable.
多孔性高分子支持体（Ｂ）の形状には特に限定はなく、中空糸、ビーズ等種々の形態のものを用いることができる。体外循環への適用時には血液が滞留する構造を持つビーズ等として用いることも可能であるが、ビーズ等は滞留部において血栓の発生が多くなることから、このような用途を目的とする場合は中空糸を使用することが望ましい。
本発明において中空糸を用いる場合には、用いられる中空糸は、その表面上でグラフト重合反応により重合性化合物（Ａ）を固定化できうるものであれば、特に制限はない。
また、本発明の多孔性中空糸の製造は、公知慣用の方法である多孔性でない中空糸を延伸等の操作によって多孔性中空糸とすることにより行うことができる。
The shape of the porous polymer support (B) is not particularly limited, and various forms such as hollow fibers and beads can be used. When applied to extracorporeal circulation, it can be used as a bead having a structure in which blood stays. However, since the bead and the like increase the number of thrombus in the staying part, they are hollow for the purpose of such use. It is desirable to use yarn.
When a hollow fiber is used in the present invention, the hollow fiber to be used is not particularly limited as long as the polymerizable compound (A) can be immobilized on the surface by a graft polymerization reaction.
Moreover, the porous hollow fiber of the present invention can be produced by converting a non-porous hollow fiber into a porous hollow fiber by an operation such as stretching, which is a known and usual method.
多孔性高分子支持体（Ｂ）として、多孔性中空糸を用いた場合には、肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスを含む液を中空糸に通じることにより、中空糸の有する孔を通過した液と、孔を通過しなかった液とが生成する。ウイルスを含む液中のウイルスの除去率の検討から、中空糸の孔を通過した液中のウイルスの除去率は好成績であり、また、代表的な血液成分であるアルブミンは除去しないことが明らかとなった。
また、中空糸の孔を通過しなかった液では、ウイルスを含む液中のウイルスの除去率は、中空糸の孔を通過した液中のウイルスの除去率より低く、多孔性中空糸の孔を通過する際にウイルスの除去の多くが起こっていることが示唆された。
When a porous hollow fiber is used as the porous polymer support (B), by passing a liquid containing hepatitis virus or human immunodeficiency virus through the hollow fiber, , A liquid that has not passed through the holes is formed. From the examination of the virus removal rate in the liquid containing virus, it is clear that the virus removal rate in the liquid that passed through the hole of the hollow fiber is good, and albumin, which is a representative blood component, is not removed. became.
In addition, in the liquid that did not pass through the hole of the hollow fiber, the virus removal rate in the liquid containing the virus was lower than the virus removal rate in the liquid that passed through the hole of the hollow fiber. It was suggested that much of the virus removal was happening during the passage.
そして、最終的に該中空糸の有する孔を通過した液と、当該孔を通過せずに中空糸を通過した液を混合することにより、中空糸を通じる前のウイルスを含む液からウイルスを除去することが可能となる。用いられる中空糸は、上記のウイルスを効果的に吸着させうる孔径のものであれば、特に制限はない。 Finally, by mixing the liquid that has passed through the hole of the hollow fiber and the liquid that has passed through the hollow fiber without passing through the hole, the virus is removed from the liquid containing the virus before passing through the hollow fiber. It becomes possible to do. The hollow fiber used is not particularly limited as long as it has a pore size capable of effectively adsorbing the virus.
更に、中空糸に通じて生成した液に、ウイルスを捕捉し除去させる機能を有する他の基材を接触させて、ウイルスの除去率の向上を図ることも可能である。このような他の基材としては、ウイルスを捕捉し除去させる機能を有するものであれば特に制限はないが、例えば、ヘパリン固定化ゲル等を挙げることができる。 Furthermore, it is possible to improve the virus removal rate by contacting the liquid produced through the hollow fiber with another substrate having a function of capturing and removing the virus. Such other base material is not particularly limited as long as it has a function of capturing and removing a virus, and examples thereof include a heparin-immobilized gel.
・水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）
本発明の水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）は、水酸基若しくはアミノ基が保護基を有してもよいヒドロキシアルキルアミン誘導体、又はアミノ基が保護基を有してもよい分子内に少なくとも２個のアミノ基を有するアミン誘導体であって、具体的には、水酸基若しくはアミノ基が保護基を有してもよい、２−アミノエタノール、エチレンジアミン、ブチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、１，２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン等を挙げることができる。
本化合物（Ｃ）は、重合性化合物（Ａ）との反応の際、水酸基或いはアミノ基に用いられる公知慣用の保護基を有していてもよい。使用される保護基としては、カーバメート結合により保護する基、エステル結合により保護する基、アミド結合により保護する基又はエーテル結合により保護する基等を挙げることができるが、これらに限らない。
カーバメート結合により保護する基としては、例えばｔ−ブチルカーバメート（Ｂｏｃ基）、ベンジルカーバメート等が挙げられ、エステル結合により保護する基としては、例えば、アセチル基、ベンゾイル基等が挙げられ、アミド結合により保護する基としては、アセチルアミド基、ベンゾイルアミド基等が挙げられ、エーテル結合により保護する基としては、メトキシメチルエーテル基、ベンジルエーテル基等の基を挙げることができる。これらの基は、用いられる化合物（Ｃ）の種類、重合性化合物（Ａ）との間で行われる反応の種類・条件等により適宜選択して行うことができる。
・ Compounds having a hydroxyl group or an amino group (C)
The compound (C) having a hydroxyl group or amino group of the present invention is a hydroxyalkylamine derivative in which the hydroxyl group or amino group may have a protecting group, or at least 2 in the molecule in which the amino group may have a protecting group. 2-aminoethanol, ethylenediamine, butylenediamine, hexamethylenediamine, 1,2-bis, which is an amine derivative having a specific number of amino groups, and the hydroxyl group or amino group may have a protective group. (2-aminoethoxy) ethane, polyethyleneimine, polyallylamine and the like can be mentioned.
This compound (C) may have a known and commonly used protective group used for a hydroxyl group or an amino group in the reaction with the polymerizable compound (A). Examples of the protecting group used include, but are not limited to, a group protecting with a carbamate bond, a group protecting with an ester bond, a group protecting with an amide bond, or a group protecting with an ether bond.
Examples of the group protected by a carbamate bond include t-butyl carbamate (Boc group) and benzyl carbamate. Examples of the group protected by an ester bond include an acetyl group and a benzoyl group. Examples of the protecting group include an acetylamide group and a benzoylamide group, and examples of the group to be protected by an ether bond include a methoxymethyl ether group and a benzyl ether group. These groups can be appropriately selected depending on the type of compound (C) used, the type and conditions of the reaction performed with the polymerizable compound (A), and the like.
・少なくとも２個のエポキシ基を有する化合物（Ｄ）
本化合物（Ｄ）は、重合性化合物（Ａ）及び硫酸化多糖の両方と反応しえるエポキシ基を有する化合物であれば、特に制限なく用いることができるが、反応硫酸化多糖との反応性、取扱の容易性から、一般式（１）
-Compound (D) having at least two epoxy groups
The compound (D) can be used without particular limitation as long as it is a compound having an epoxy group capable of reacting with both the polymerizable compound (A) and the sulfated polysaccharide, but the reactivity with the reactive sulfated polysaccharide, General formula (1) for ease of handling
（式中、ｍは１〜１００の整数、ｎは２〜４の整数を表す。）
で表される化合物を挙げることができる。
より具体的には、多価アルコールとエピクロロヒドリンとの反応生成物を挙げることができ、用いることのできる多価アルコールとして、両末端に水酸基を持つ直鎖状アルキルジオールおよび、その縮合体、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコールなどを挙げることができる。
(In the formula, m represents an integer of 1 to 100, and n represents an integer of 2 to 4.)
The compound represented by these can be mentioned.
More specifically, a reaction product of a polyhydric alcohol and epichlorohydrin can be mentioned. As the polyhydric alcohol that can be used, a linear alkyl diol having hydroxyl groups at both ends and a condensate thereof , Ethylene glycol, propylene glycol, butanediol, polyethylene glycol, polypropylene glycol, polybutylene glycol, and the like.
・グラフト重合
本発明では、前記多孔性高分子支持体（Ｂ）に電離放射線を照射して発生させたラジカルにより、前記重合性化合物（Ａ）が有するエチレン性不飽和基を多孔性高分子支持体にグラフト重合させる。グラフト重合に際して用いる電離放射線源としては、公知慣用のα線、β線、γ線、加速電子線、Ｘ線等があげられ、実用的にはγ線、加速電子線が望ましい。
-Graft polymerization In the present invention, the porous polymer support (B) supports the ethylenically unsaturated group of the polymerizable compound (A) by radicals generated by irradiating the porous polymer support (B) with ionizing radiation. Graft polymerize on the body. Examples of the ionizing radiation source used in the graft polymerization include known and commonly used α-rays, β-rays, γ-rays, accelerated electron beams, X-rays and the like, and practically preferred are γ-rays and accelerated electron beams.
グラフト重合法は前記多孔性高分子支持体（Ｂ）と重合性化合物（Ａ）とを接触させて電離放射線を照射する同時照射グラフト重合法と、多孔性高分子支持体（Ｂ）を予め照射した後重合性化合物（Ａ）と接触させる前照射グラフト重合法のいずれでも可能であり、目的に合わせて選択できる。本発明では、重合性化合物（Ａ）は、グラフト重合反応により、多孔性高分子支持体（Ｂ）表面上にグラフト重合鎖を形成しえる。 The graft polymerization method includes a simultaneous irradiation polymerization method in which the porous polymer support (B) and the polymerizable compound (A) are brought into contact with each other and irradiated with ionizing radiation, and the porous polymer support (B) is irradiated in advance. Any of the pre-irradiation graft polymerization methods in which the post-polymerization compound (A) is brought into contact with each other is possible and can be selected according to the purpose. In the present invention, the polymerizable compound (A) can form a graft polymer chain on the surface of the porous polymer support (B) by a graft polymerization reaction.
本発明に用いる電離放射線を用いたグラフト重合法において、照射線量や加速電圧は多孔性高分子支持体（Ｂ）によって異なるため一概には範囲を決めることができず、多孔性高分子支持体（Ｂ）の素材、形態、厚み等を考慮し適宜調整することが必要である。例えば、照射量が多いと帯電による絶縁破壊が発生し、照射量が少ないと重合反応が進行しない。このため、多孔性高分子支持体（Ｂ）の材質や形態等を考慮し、帯電による絶縁破壊が発生せず、かつ重合反応が充分に進む照射量を適宜調整すればよい。また、加速電圧は透過性に関係し、多孔性高分子支持体（Ｂ）の厚みによって異なる。フィルム等の薄い形態の場合、加速電圧は一般には小さくて済み、多孔性高分子支持体の形態によって選択すればよい。 In the graft polymerization method using ionizing radiation used in the present invention, the irradiation dose and the accelerating voltage differ depending on the porous polymer support (B). It is necessary to adjust appropriately considering the material, form, thickness, etc. of B). For example, when the irradiation amount is large, dielectric breakdown due to charging occurs, and when the irradiation amount is small, the polymerization reaction does not proceed. For this reason, in consideration of the material, form, etc. of the porous polymer support (B), the irradiation amount that does not cause dielectric breakdown due to charging and the polymerization reaction proceeds sufficiently may be appropriately adjusted. The acceleration voltage is related to the permeability and varies depending on the thickness of the porous polymer support (B). In the case of a thin form such as a film, the acceleration voltage is generally small and may be selected according to the form of the porous polymer support.
例えば、多孔性高分子支持体（Ｂ）がポリエチレンからなる厚さ１０（μｍ）〜１００（μｍ）の中空糸の場合においては、１０（ｋＧｙ）以上、３００（ｋＧｙ）以下であり、更に望ましくは９０（ｋＧｙ）以下であればよく、加速電圧は適宜選択することができる。 For example, when the porous polymer support (B) is a hollow fiber made of polyethylene and having a thickness of 10 (μm) to 100 (μm), it is preferably 10 (kGy) or more and 300 (kGy) or less. May be 90 (kGy) or less, and the acceleration voltage can be appropriately selected.
前記接触工程と前記電離放射線照射工程の順に特に限定はない。
例えば、前記多孔性高分子支持体（Ｂ）に重合性化合物（Ａ）又は該重合性化合物（Ａ）を含む重合性組成物を接触させた後、この状態で電離放射線を照射する工程をこの順で行っても良いし、逆に、前記多孔性高分子支持体（Ｂ）に電離放射線を先に照射し、その後該多孔性高分子支持体（Ｂ）に重合性化合物（Ａ）又は該重合性化合物（Ａ）を含む重合性組成物を接触させる工程をこの順で行ってもよい。
There is no particular limitation in the order of the contact step and the ionizing radiation irradiation step.
For example, the step of irradiating the porous polymer support (B) with the polymerizable compound (A) or the polymerizable composition containing the polymerizable compound (A) and then irradiating with ionizing radiation in this state Alternatively, the porous polymer support (B) may be irradiated with ionizing radiation first, and then the porous polymer support (B) may be polymerized with the polymerizable compound (A) or the You may perform the process of making the polymeric composition containing a polymeric compound (A) contact in this order.
前記照射グラフト重合において、照射後の基材中のラジカルは温度の上昇、酸素との接触によって速やかに不活化される。従って、照射後は十分に酸素を除いた状態で低温にて貯蔵し、速やかに固定化を行うことが好ましい。また前記の理由から、固定化においては脱酸素下、又は不活性ガス下で実施することが望ましい。重合後の多孔性高分子支持体（Ｂ）は、溶媒による洗浄等の方法で未反応の重合性化合物を除去すればよい。 In the irradiation graft polymerization, radicals in the substrate after irradiation are quickly inactivated by temperature increase and contact with oxygen. Therefore, after irradiation, it is preferable to store it at a low temperature in a state where oxygen is sufficiently removed, and to quickly fix it. For the above reasons, the immobilization is preferably carried out under deoxygenation or in an inert gas. What is necessary is just to remove the unreacted polymerizable compound by methods, such as washing | cleaning with a solvent, for the porous polymer support body (B) after superposition | polymerization.
水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）と重合性化合物（Ａ）との結合反応に特に制限はなく、水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）と重合性化合物（Ａ）とが共有結合をなし得るものであればよい。 There is no particular limitation on the bonding reaction between the compound (C) having a hydroxyl group or an amino group and the polymerizable compound (A), and the compound (C) having a hydroxyl group or an amino group and the polymerizable compound (A) are not covalently bonded. Anything can be obtained.
例えば、重合性化合物（Ａ）として（メタ）アクリル酸を用いた場合には、（メタ）アクリル酸のカルボキシル基と結合し得る官能基であるアミノ基を有する化合物が好ましい。この結合様式の場合には、（メタ）アクリル酸と、アミノ基を有する化合物とのアミド化反応を行う。
アミド化反応の方法は、例えば、活性エステルによるアミド化、縮合剤によるアミド化、これらの併用、混合酸無水物法、アジド法、酸化還元法、ＤＰＰＡ法、ウッドワード法等、ペプチド合成で用いられている公知慣用のアミド化反応を適宜行えばよい。
For example, when (meth) acrylic acid is used as the polymerizable compound (A), a compound having an amino group that is a functional group capable of binding to a carboxyl group of (meth) acrylic acid is preferred. In the case of this bonding mode, an amidation reaction between (meth) acrylic acid and a compound having an amino group is performed.
Amidation reaction methods include, for example, amidation with an active ester, amidation with a condensing agent, combinations thereof, mixed acid anhydride method, azide method, redox method, DPPA method, Woodward method, etc. The known and commonly used amidation reaction may be appropriately performed.
活性エステルによるアミド化としては、例えば、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）、ＨＯＢＴ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）、ＨＯＡＴ（ヒドロキシアザベンゾトリアゾール）等を用いて、脱離能の高い基をカルボキシ基と一旦縮合させた活性エステルを形成させておき、これにアミノ基を反応させる方法が挙げられる。縮合剤によるアミド化は、それ単独で用いても良いが、上記活性エステルと併用することができる。縮合剤としては、ＥＤＣ（１−（３−ジメチルアミノプロピル−３−エチル−カルボジイミドヒドロクロライド）、ＨＯＮＢ（エンド−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキサミド）、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＴＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）、ＨＯＯＢｔ（３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン）、ジ−ｐ−トリオイルカルボジイミド、ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ＢＤＰ（１−ベンゾトリアゾールジエチルホスフェート−１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニルエチル）カルボジイミド）、フッ化シアヌル、塩化シアヌル、ＴＦＦＨ（テトラメチルフルオロホルムアミジニウムヘキサフルオロホスホスフェート）、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホラジデート）、ＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシニミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）、ＨＡＴＵ（Ｎ−［（ジメチルアミノ）−１−Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５，６］−ピリジン−１−イルメチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウム・ヘキサフルオロホスフェート・Ｎ−オキシド）、ＢＯＰ−Ｃｌ（ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィンクロライド）、ＰｙＢＯＰ（（１−Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）−トリス（ピロリジノ）ホスホニウム・テトラフルオロホスフェート）、ＢｒＯＰ（ブロモトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート）、ＤＥＰＢＴ（３−（ジエトキシホスホリルオキシ）−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン）、ＰｙＢｒＯＰ（ブロモトリス（ピロリジノ）ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート）等が挙げられる。 Examples of amidation with an active ester include NHS (N-hydroxysuccinimide), nitrophenol, pentafluorophenol, DMAP (4-dimethylaminopyridine), HOBT (1-hydroxybenzotriazole), and HOAT (hydroxyazabenzotriazole). And the like to form an active ester obtained by once condensing a group having a high leaving ability with a carboxy group, and reacting this with an amino group. Amidation with a condensing agent may be used alone or in combination with the active ester. As the condensing agent, EDC (1- (3-dimethylaminopropyl-3-ethyl-carbodiimide hydrochloride), HONB (endo-N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboxamide), DCC (dicyclohexylcarbodiimide) , BOP (benzotriazol-1-yloxytris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate), HBTU (O-benzotriazol-1-yl-N, N, N ′, N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate) , TBTU (O-benzotriazol-1-yl-N, N, N ′, N′-tetramethyluronium tetrafluoroborate), HOBt (1-hydroxybenzotriazole), HOOBt (3,4-dihydro-3- Hydroxy-4-oxo- , 2,3-benzotriazine), di-p-trioylcarbodiimide, DIC (diisopropylcarbodiimide), BDP (1-benzotriazole diethyl phosphate-1-cyclohexyl-3- (2-morpholinylethyl) carbodiimide), fluorine Cyanuric chloride, cyanuric chloride, TFFH (tetramethylfluoroformamidinium hexafluorophosphophosphate), DPPA (diphenylphosphoradidate), TSTU (O- (N-succinimidyl) -N, N, N ′, N′-tetramethyl Uronium tetrafluoroborate), HATU (N-[(dimethylamino) -1-H-1,2,3-triazolo [4,5,6] -pyridin-1-ylmethylene] -N-methylmethanaminium. Hexafluorophosphate / N-oxide) BOP-Cl (bis (2-oxo-3-oxazolidinyl) phosphine chloride), PyBOP ((1-H-1,2,3-benzotriazol-1-yloxy) -tris (pyrrolidino) phosphonium tetrafluorophosphate), BrOP (bromotris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate), DEPBT (3- (diethoxyphosphoryloxy) -1,2,3-benzotriazin-4 (3H) -one), PyBrOP (bromotris (pyrrolidino) phosphonium Hexafluorophosphate) and the like.
このうち、（メタ）アクリル酸のカルボキシ基を一旦、ＮＨＳ化した後に、化合物（Ｃ）のアミノ基と反応させアミド化する方法が好ましい。 Among these, the method in which the carboxy group of (meth) acrylic acid is once NHS and then reacted with the amino group of compound (C) to be amidated is preferable.
これらのアミド化方法において利用できる溶媒としては、水及びペプチド合成に用いられる有機溶媒を使用することができ、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル等、更にはこれらの混合溶媒やこれらを含む水溶液が挙げられる。 As a solvent that can be used in these amidation methods, water and an organic solvent used for peptide synthesis can be used. For example, dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), hexaphosphoroamide, dioxane, tetrahydrofuran ( THF), ethyl acetate, and the like, and mixed solvents and aqueous solutions containing these.
カルボキシ基への活性化エステル残基導入割合は、用いる活性化剤の種類や、試薬の使用量に依存する。一般的に、溶液中での反応と比較し、重合性化合物から得られる重合体が結合されていることで、反応性が落ちる為、導入量を上げる為には反応試薬をかなり過剰量用いる必要があると考えられる。従って、多孔性高分子支持体（Ｂ）に重合せしめた（メタ）アクリル酸のカルボキシ基に対する活性化剤と縮合剤反応試薬の量比は一概には規定できないが、カルボキシル基に活性エステル基を等量的に導入するためには、概ねモル比で、１から１０程度用いることが望ましい。更に、反応試薬の過剰量を調整することで、活性エステル基の導入割合を０．０１から１００％の範囲で、任意に調整することが可能である。 The proportion of the activated ester residue introduced into the carboxy group depends on the type of activator used and the amount of reagent used. In general, compared to the reaction in solution, the polymer obtained from the polymerizable compound is bonded, and the reactivity is lowered. Therefore, in order to increase the introduction amount, it is necessary to use a considerably excessive amount of the reaction reagent. It is thought that there is. Accordingly, the ratio of the activator to the condensing agent reaction reagent with respect to the carboxy group of (meth) acrylic acid polymerized on the porous polymer support (B) cannot be specified in general, but the active ester group is added to the carboxyl group. In order to introduce it in an equal amount, it is desirable to use about 1 to 10 in a molar ratio. Furthermore, by adjusting the excess amount of the reaction reagent, it is possible to arbitrarily adjust the introduction ratio of the active ester group in the range of 0.01 to 100%.
重合性化合物（Ａ）として、グリシジル（メタ）アクリレートを用いた場合には、水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）の水酸基或いはアミノ基と、重合性化合物（Ａ）の有するグリシジル基と反応させることにより結合することができる。反応条件は、通常の水酸基若しくはアミノ基とグリシジル基の反応で使用される溶媒、反応温度、反応時間を挙げることができる。好ましい条件の一例として、水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）が溶液の場合には、直接使用しても良く、溶媒を使用する場合には、多孔性高分子支持体（Ｂ）を溶解又は膨潤させない溶媒で、より好ましくは、多孔性高分子支持体（Ｂ）を溶解及び膨潤せずに重合性化合物（Ａ）の重合物を溶解できる溶媒が使用でき、水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）の濃度は任意に選択することができ、好ましくは、重量濃度０．１〜５０％の濃度に調製して使用できる。 When glycidyl (meth) acrylate is used as the polymerizable compound (A), the hydroxyl group or amino group of the compound (C) having a hydroxyl group or amino group is reacted with the glycidyl group of the polymerizable compound (A). Can be combined. Examples of the reaction conditions include a solvent used in the reaction of a normal hydroxyl group or amino group and a glycidyl group, a reaction temperature, and a reaction time. As an example of preferable conditions, when the compound (C) having a hydroxyl group or an amino group is a solution, it may be used directly. When a solvent is used, the porous polymer support (B) is dissolved or dissolved. A solvent that does not swell can be used, more preferably a solvent that can dissolve the polymer of the polymerizable compound (A) without dissolving and swelling the porous polymer support (B), and a compound having a hydroxyl group or an amino group ( The density | concentration of C) can be selected arbitrarily, Preferably, it can adjust and use for the density | concentration of weight concentration 0.1-50%.
反応温度は、水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）や溶媒が気化しない温度から選択でき、好ましくは０〜７０℃、より好ましくは、２０〜６０℃である。反応時間は、水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）の種類、濃度、及び反応温度によりことになるが、反応溶液中の水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）の含有量をガスクロマトグラフ、液体クロマトグラフ、滴定等でモニターしながら、（Ｃ）が消費されなくなるまで行うことが好ましい。一般的には、３０分から１２時間で完結することができるが、これらに限定されず、適宜選択して反応条件を設定することができる。 The reaction temperature can be selected from the temperature at which the compound (C) having a hydroxyl group or amino group or the solvent does not vaporize, and is preferably 0 to 70 ° C, more preferably 20 to 60 ° C. The reaction time depends on the type and concentration of the compound (C) having a hydroxyl group or an amino group, and the reaction temperature. The content of the compound (C) having a hydroxyl group or an amino group in the reaction solution is determined by gas chromatography, liquid It is preferable to carry out until (C) is not consumed while monitoring by chromatography, titration or the like. In general, the reaction can be completed in 30 minutes to 12 hours, but is not limited thereto, and reaction conditions can be set by appropriately selecting.
重合性化合物（Ａ）として、（メタ）アクリロイルオキシアルキルイソシアネートを用いた場合には、水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）の水酸基若しくはアミノ基と、重合性化合物（Ａ）の有するイソシアネート基と反応させることにより結合することができる。反応条件は、通常の水酸基若しくはアミノ基とイソシアネート基の反応で使用される溶媒、反応温度、反応時間を挙げることができる。好ましい条件の一例として、溶媒として、酢酸エチルやアセトニトリル等、多孔性高分子支持体（Ｂ）を溶解及び膨潤せず、イソシアネートと反応しない溶媒から適宜選択することができる。反応濃度は任意に選択することが可能であり、具体的には重量濃度で０．５〜１５％から選択することができる。反応温度はイソシアネートとの反応が発熱反応であることから、０〜５０℃が好ましい。反応時間は、２〜２４時間を挙げることができるが、これらに限定されず、適宜選択して反応条件を設定することができる。 When (meth) acryloyloxyalkyl isocyanate is used as the polymerizable compound (A), the hydroxyl group or amino group of the compound (C) having a hydroxyl group or amino group, and the isocyanate group possessed by the polymerizable compound (A) It can couple | bond by making it react. Examples of the reaction conditions include a solvent used in a reaction between a normal hydroxyl group or amino group and an isocyanate group, a reaction temperature, and a reaction time. As an example of preferable conditions, the solvent can be appropriately selected from solvents that do not dissolve and swell the porous polymer support (B), such as ethyl acetate and acetonitrile, and do not react with isocyanate. The reaction concentration can be arbitrarily selected, and specifically can be selected from 0.5 to 15% by weight concentration. The reaction temperature is preferably 0 to 50 ° C. because the reaction with isocyanate is an exothermic reaction. Although reaction time can mention 2 to 24 hours, it is not limited to these, It can select suitably and can set reaction conditions.
本発明で用いられる硫酸化多糖の種類は、肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスを吸着する機能を有する硫酸化多糖であれば、特に制限はない。 The kind of sulfated polysaccharide used in the present invention is not particularly limited as long as it is a sulfated polysaccharide having a function of adsorbing hepatitis virus or human immunodeficiency virus.
このような、硫酸化多糖としては、例えば、ヘパリン、ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体、デキストラン硫酸、フコイダン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、グラタン硫酸、へパリチン硫酸、カラギーナン、硫酸化ヒアルロン酸、キシラン硫酸、カロニン硫酸、セルロース硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸、ペクチン硫酸、イヌリン硫酸、アルギン酸硫酸、グリコーゲン硫酸、デキストリン硫酸、ラミナリ硫酸、ラムナン硫酸、カードラン硫酸、ガラクタン硫酸、硫酸化ジュランおよび、これらの過硫酸化体、脱硫酸化体、分解物といった誘導体を挙げることができる。 Such sulfated polysaccharides include, for example, heparin, heparin derivatives in which primary or secondary hydroxyl groups of heparin are sulfated, and heparin in which an N-acetyl group-elimination product of heparin is converted to N-sulfate. Derivatives, dextran sulfate, fucoidan, heparan sulfate, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, gratan sulfate, heparitin sulfate, carrageenan, sulfated hyaluronic acid, xylan sulfate, caroline sulfate, cellulose sulfate, chitin sulfate, chitosan sulfate, pectin sulfate , Inulin sulfate, alginate sulfate, glycogen sulfate, dextrin sulfate, laminari sulfate, rhamnan sulfate, curdlan sulfate, galactan sulfate, sulfated durane, and derivatives thereof such as persulfates, desulfates, and degradation products. it can.
この中でも、好ましい硫酸化多糖として、ウイルスの吸着に適していることから、ヘパリン、ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体、デキストラン硫酸又はフコイダンを挙げることができる。 Among these, as preferred sulfated polysaccharides, they are suitable for adsorbing viruses. Therefore, heparin, heparin derivatives in which primary or secondary hydroxyl groups of heparin are sulfated, and acetyl group-eliminated bodies of N-acetyl groups of heparin are used. N-sulfate esterified heparin derivatives, dextran sulfate or fucoidan can be mentioned.
本発明に用いられるヘパリンは、通常公知のものを制限なく使用することができる。ヘパリンは、小腸、筋肉、肺、脾や肥満細胞等体内で幅広く存在し、化学的にはグリコサミノグリカンであるヘパラン硫酸の一種であり、β−Ｄ−グルクロン酸、或いはα−Ｌ−イズロン酸とＤ−グルコサミンが１，４−結合により重合した高分子であって、ヘパラン硫酸と比べて硫酸化の度合いが特に高いという特徴を有する。 As the heparin used in the present invention, generally known heparins can be used without limitation. Heparin exists widely in the small intestine, muscle, lungs, spleen, mast cells and the like, and is a kind of heparan sulfate that is chemically a glycosaminoglycan, β-D-glucuronic acid or α-L-iduron It is a polymer in which an acid and D-glucosamine are polymerized by 1,4-bonds, and has a feature that the degree of sulfation is particularly high compared to heparan sulfate.
また、ヘパリンの平均分子量についても特に制限はないが、平均分子量が大きい場合には水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ａ）との反応性が低くなる為、ヘパリンの固定化の効率が悪いと考えられる。従って、ヘパリンの分子量は、概ね、５００から５００，０００ダルトン、より好ましくは１,２００から５０，０００ダルトン、更に好ましくは５，０００〜２０，０００ダルトンであることが好ましい。 Further, the average molecular weight of heparin is not particularly limited, but when the average molecular weight is large, the reactivity with the compound (A) having a hydroxyl group or an amino group is lowered, so that the efficiency of immobilizing heparin is considered to be poor. It is done. Therefore, the molecular weight of heparin is preferably about 500 to 500,000 daltons, more preferably 1,200 to 50,000 daltons, and even more preferably 5,000 to 20,000 daltons.
ヘパリン誘導体としては、上記ヘパリンを、該ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体又は該ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体であることに特徴を有する。硫酸エステル化は通常公知の方法で行うことができる。
ヘパリンの１級又は２級水酸基を硫酸エステル化したヘパリン誘導体を合成する場合には、例えば、ヘパリンのアルカリ塩類をイオン交換樹脂（Ｈ＋）等に通じ、アミン類と処理することによりヘパリンアミン塩を調整する。その後に、硫酸化剤で処理して目的とするヘパリン誘導体（Ａ）とすることができる。硫酸化剤としては、公知慣用のＳＯ３・ピリジン等が好ましい。
また、ヘパリンのＮ−アセチル基のアセチル基脱離体をＮ−硫酸エステル化したヘパリン誘導体を合成する場合には、例えば、ヘパリンＮ−アセチル基をヒドラジン等で脱アセチル化した後に、硫酸化剤で処理して目的とするヘパリン誘導体とすることができる。硫酸化剤としては、公知慣用のＳＯ３・ＮＭｅ３等が好ましい。
The heparin derivative is a heparin derivative in which the primary or secondary hydroxyl group of the heparin is sulfate-esterified or a heparin derivative obtained by N-sulfate esterification of an acetyl group-eliminated N-acetyl group of the heparin. It has a special feature. The sulfuric esterification can be usually performed by a known method.
When synthesizing a heparin derivative in which a primary or secondary hydroxyl group of heparin is sulfated, for example, heparin amine salt is obtained by treating an alkali salt of heparin with an ion exchange resin (H + ) or the like and treating with an amine. Adjust. Thereafter, it can be treated with a sulfating agent to obtain the desired heparin derivative (A). As the sulfating agent, known and commonly used SO 3 • pyridine is preferable.
Moreover, when synthesizing a heparin derivative obtained by N-sulfate esterification of an acetyl group-eliminated heparin N-acetyl group, for example, after deacetylating the heparin N-acetyl group with hydrazine or the like, a sulfating agent is obtained. To obtain the desired heparin derivative. As the sulfating agent, known and commonly used SO 3 .NMe 3 and the like are preferable.
また、デキストリン硫酸又はフコイダンは、公知慣用のものを用いることができる。 Moreover, a well-known and usual thing can be used for dextrin sulfuric acid or fucoidan.
本発明の硫酸化多糖と水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）との結合は、例えば上記アミド化反応により行うことができる。 The coupling | bonding of the sulfated polysaccharide of this invention and the compound (C) which has a hydroxyl group or an amino group can be performed by the said amidation reaction, for example.
ここで、重合性化合物（Ａ）をグラフト重合反応に供してから、水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）又はアンモニアと反応させた後にヘパリンを固定化させても良いし、重合性化合物（Ａ）と水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）又はアンモニアを反応させた後に、グラフト重合反応を行い、ヘパリンを固定化させてもよい。 Here, after subjecting the polymerizable compound (A) to a graft polymerization reaction, heparin may be immobilized after reacting with the hydroxyl group or amino group-containing compound (C) or ammonia, or the polymerizable compound (A ), A hydroxyl group- or amino group-containing compound (C) or ammonia, and then a graft polymerization reaction may be carried out to immobilize heparin.
本発明の高分子基材を備えてなる医療器具の形態としては、前記用途に適用可能な形状であれば特に限定されるものではないが、例えば中空糸モジュールや濾過カラム、フィルター等が挙げられる。中空糸モジュールや濾過カラムにおいて、容器の形状及び材質は特に限定されないが、体液（血液）の体外循環に適用する場合、内部容量が１０〜４００ｍＬで外径が２〜１０ｃｍ程度の筒状容器とすることが好ましく、内部容量が２０〜３００ｍＬで外径が２．５〜７ｃｍ程度の筒状容器とすることがより好ましい。 The form of the medical device provided with the polymer substrate of the present invention is not particularly limited as long as it is a shape applicable to the above-mentioned use, and examples thereof include a hollow fiber module, a filtration column, and a filter. . In the hollow fiber module and the filtration column, the shape and material of the container are not particularly limited, but when applied to extracorporeal circulation of body fluid (blood), a cylindrical container having an internal volume of 10 to 400 mL and an outer diameter of about 2 to 10 cm It is preferable to use a cylindrical container having an internal volume of 20 to 300 mL and an outer diameter of about 2.5 to 7 cm.
本発明の医療器具の使用方法としては、肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスを含む液（例えば、肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスを含む水溶液や血液、血漿、血清等の体液）と接触させて該液中の肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスを吸着除去することができればいずれの方法でもよい。このような方法として、例えば以下の方法を挙げることができる。
（１）本発明の高分子基材を有するモジュールを用意し、該モジュールに肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスを含む液を通過させる方法
（２）流出口に液は通過できるが本発明の高分子基材は通過できないフィルターを装着し、内部に該基材を充填したカラム様容器を用意し、これに肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスを含む液を通過させる方法
（３）貯留バッグ等の容器を用意し、これに肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスを含む液と本発明の高分子基材を加えて混合した後、上澄み液を回収する方法
（１）や（２）の方法は操作が簡便である点で好ましく、体外循環回路に組み込むことにより患者の体液や血液から効率よくインラインで肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスを除去することが可能である。このうち、更に好ましい方法として（１）の方法が挙げられる。
（２）や（３）の方法では、例えば血液を扱う場合、その凝固を防止するため血液を血球と血漿に分離した上で血漿のみを処理する必要があるが、（１）の方法ではこのような工程を必要とせず、操作が最も簡便でかつ患者への負担が少なくて済む特徴を有する。
As a method of using the medical device of the present invention, a liquid containing hepatitis virus or human immunodeficiency virus (for example, an aqueous solution containing hepatitis virus or human immunodeficiency virus or a body fluid such as blood, plasma, serum, etc.) is contacted with the liquid. Any method may be used as long as hepatitis virus or human immunodeficiency virus can be adsorbed and removed. Examples of such methods include the following methods.
(1) Method of preparing a module having a polymer substrate of the present invention and passing a liquid containing hepatitis virus or human immunodeficiency virus through the module (2) Although the liquid can pass through the outlet, the polymer of the present invention Prepare a column-like container with a filter that cannot pass through the base material, and fill the base material with the filter, and allow the liquid containing the hepatitis virus or human immunodeficiency virus to pass therethrough. (3) A container such as a storage bag The methods (1) and (2) are easy to operate after preparing and mixing the liquid containing the hepatitis virus or human immunodeficiency virus and the polymer substrate of the present invention, and then collecting the supernatant. It is preferable at a certain point, and it is possible to efficiently remove hepatitis virus or human immunodeficiency virus in-line from a patient's body fluid or blood by incorporating it in an extracorporeal circuit. Among these, a more preferable method is the method (1).
In the methods (2) and (3), for example, when handling blood, it is necessary to separate only blood into blood cells and plasma to prevent coagulation, but in the method (1), Such a process is not required, the operation is the simplest, and the burden on the patient is small.
・肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスを含む液
本発明で対象とする肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスを含む液は、当該ウイルスを含む液であれば特に制限はない。より具体的には、例えば、ヒトの体内液体成分である体液、ウイルスを含んだ培養液等を挙げることができる。体液のより具体的な例としては、血液、唾液、汗、尿、鼻水、精液、血漿、リンパ液、組織液等を挙げることができる。
-Liquid containing hepatitis virus or human immunodeficiency virus The liquid containing hepatitis virus or human immunodeficiency virus targeted in the present invention is not particularly limited as long as it contains the virus. More specifically, for example, a body fluid which is a human body fluid component, a culture solution containing a virus, and the like can be mentioned. More specific examples of body fluids include blood, saliva, sweat, urine, runny nose, semen, plasma, lymph, tissue fluid and the like.
・肝炎ウイルス吸着能の評価
本発明で対象とする肝炎ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルス又はＣ型肝炎ウイルスであることに特徴を有する。本発明では、肝炎ウイルス吸着能を評価するため、ＨＣＶ−Ｅ２蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）に対する吸着能を評価した。Ｅ２蛋白質は脂質膜と共に、肝炎ウイルス粒子の外被（エンベロープ）を構成し、肝炎ウイルスのエントリーに重要な役割を果たす蛋白質であって、Ｅ２蛋白質への吸着能を評価することにより、ＨＣＶへの吸着能の評価が可能となる蛋白質である。
以下の実施例に示すように、本発明の高分子基材は、ＨＣＶ−Ｅ２蛋白質の吸着能を有することが確認され、肝炎ウイルスの吸着能を有することも確認することができた。
Evaluation of hepatitis virus adsorption ability The hepatitis virus targeted in the present invention is characterized by hepatitis B virus or hepatitis C virus. In this invention, in order to evaluate hepatitis virus adsorption ability, adsorption ability with respect to HCV-E2 protein (His-tag) was evaluated. The E2 protein, together with the lipid membrane, constitutes the envelope of the hepatitis virus particles (envelope) and plays an important role in the entry of hepatitis virus. It is a protein that makes it possible to evaluate adsorption capacity.
As shown in the following examples, it was confirmed that the polymer substrate of the present invention has the ability to adsorb HCV-E2 protein, and also has the ability to adsorb hepatitis virus.
また、Ｃ型肝炎患者由来のウイルスを用いて、下記実施例に記載の方法でＨＣＶ吸着能を評価した。その結果、本発明のウイルス除去器具の一つである多孔性中空糸を用いたモジュールによって効率的にＨＣＶを吸着できることが確認された。その際、血液成分であるアルブミンの吸着は殆どみられず、本発明の高分子基材及び除去器具の有用性が確認された。 Moreover, HCV adsorption ability was evaluated by the method as described in the following Example using the virus derived from a hepatitis C patient. As a result, it was confirmed that HCV can be efficiently adsorbed by a module using a porous hollow fiber which is one of the virus removal instruments of the present invention. At that time, almost no adsorption of albumin, which is a blood component, was observed, confirming the usefulness of the polymer substrate and removal device of the present invention.
・ヒト免疫不全ウイルス吸着能の評価
本発明では、ヒト免疫不全ウイルス吸着能を評価するため、ＨＩＶ−ｇｐ１２０蛋白質（Ｈｉｓ−ｔａｇ）に対する吸着能を評価した。ｇｐ１２０蛋白質は脂質膜と共に、ヒト免疫不全ウイルス粒子の外被（エンベロープ）を構成し、ヒト免疫不全ウイルスのエントリーに重要な役割を果たす蛋白質であって、ｇｐ１２０蛋白質への吸着能を評価することにより、ＨＩＶへの吸着能の評価が可能となる蛋白質である。
以下の実施例に示すように、本発明の高分子基材は、ＨＩＶ−ｇｐ１２０蛋白質の吸着能を有することが確認され、ヒト免疫不全ウイルスの吸着能を有することも確認することができた。
-Evaluation of human immunodeficiency virus adsorption ability In this invention, in order to evaluate human immunodeficiency virus adsorption ability, the adsorption ability with respect to HIV-gp120 protein (His-tag) was evaluated. The gp120 protein, together with the lipid membrane, constitutes the outer envelope (envelope) of human immunodeficiency virus particles and plays an important role in the entry of human immunodeficiency virus. It is a protein that makes it possible to evaluate the adsorption ability to HIV.
As shown in the following examples, it was confirmed that the polymer substrate of the present invention has the ability to adsorb HIV-gp120 protein, and also has the ability to adsorb human immunodeficiency virus.
以下の実施例により本発明を更に詳細に説明する。
下記の測定項目は下記に示す方法で行った。
＜ヘパリン固定化量＞
トルイジンブルーを用いた色素溶液の吸着を用いた定量法を用いて測定した。（参考：Ｐ．Ｋ．Ｓｍｉｔｈ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０９，４６６（１９８０））
具体的には、以下のように行った。
２５ｍｇのトルイジンブルーを０．２％ＮａＣｌ含有０．０１Ｍ ＨＣｌで５００ｍＬに溶解、メスアップして、色素溶液を調製した。ヘパリンを色素溶液２．５ｍＬに１０〜７０μｇ加え、０．２％ＮａＣｌ ２．５ｍＬを加え、さらにヘキサン５ｍＬを加えて３０秒間激しく振とうした。しばらく静置して溶液を分離させ、水層を１ｍＬとってメタノールで１０ｍＬに希釈して吸光度を測定し、検量線を作成した。
中空糸約１０ｃｍ２に色素溶液２．５ｍＬを加えて１０分間浸漬し、０．２％ＮａＣｌを２．５ｍＬ加えて希釈した。希釈した溶液を１ｍＬとり、メタノールで１０ｍＬに希釈して、吸光度を測定し、上記検量線から固定化量を算出した。
The following examples illustrate the invention in more detail.
The following measurement items were performed by the methods shown below.
<Heparin immobilization amount>
The measurement was performed using a quantitative method using adsorption of a dye solution using toluidine blue. (Reference: P.K. Smith, Anal. Biochem., 109, 466 (1980))
Specifically, it was performed as follows.
A dye solution was prepared by dissolving 25 mg of toluidine blue in 500 mL with 0.01 M HCl containing 0.2% NaCl and making up the volume. 10 to 70 μg of heparin was added to 2.5 mL of the dye solution, 2.5 mL of 0.2% NaCl was added, 5 mL of hexane was further added, and the mixture was shaken vigorously for 30 seconds. The solution was separated by standing for a while, 1 mL of the aqueous layer was taken, diluted to 10 mL with methanol, and the absorbance was measured to prepare a calibration curve.
To about 10 cm 2 of the hollow fiber, 2.5 mL of the dye solution was added and immersed for 10 minutes, and then diluted by adding 2.5 mL of 0.2% NaCl. 1 mL of the diluted solution was taken, diluted to 10 mL with methanol, the absorbance was measured, and the immobilized amount was calculated from the calibration curve.
＜ＨＣＶ−Ｅ２吸着量＞
ヘパリンを固定化した中空糸を５ｃｍ２に切り取り、マイクロチューブに入れて、ブロッキング液として１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を加え、４℃、一晩放置した。ブロッキング液を除去し、２〜４μｇ／ｍＬ濃度のＥ２溶液（Ａｂｃａｍ社製）を５００μＬ加え、室温で２時間ローテートして吸着前後のＥ２量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。
＜ＨＩＶ−ｇｐ１２０吸着量＞
ヘパリンを固定化した中空糸を５ｃｍ２に切り取り、マイクロチューブに入れて、ブロッキング液として１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を加え、４℃、一晩放置した。ブロッキング液を除去し、２〜４μｇ／ｍＬ濃度のｇｐ１２０溶液（Ａｂｃａｍ社製）を５００μＬ加え、室温で２時間ローテートして吸着前後のｇｐ１２０量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。
<HCV-E2 adsorption amount>
The hollow fiber on which heparin was immobilized was cut into 5 cm 2 , put into a microtube, 1% BSA / PBS solution was added as a blocking solution, and left overnight at 4 ° C. The blocking solution was removed, 500 μL of 2 to 4 μg / mL E2 solution (Abcam) was added, and the mixture was rotated at room temperature for 2 hours, and the amount of E2 before and after adsorption was measured by ELISA.
<HIV-gp120 adsorption amount>
The hollow fiber on which heparin was immobilized was cut into 5 cm 2 , put into a microtube, 1% BSA / PBS solution was added as a blocking solution, and left overnight at 4 ° C. The blocking solution was removed, 500 μL of a 2 to 4 μg / mL gp120 solution (manufactured by Abcam) was added, and the mixture was rotated at room temperature for 2 hours, and the amount of gp120 before and after adsorption was measured by ELISA.
＜ＨＣＶ吸着量＞
検体をオーソ製ＨＣＶ抗原ＥＬＩＳＡテストで測定し、
ＨＣＶ吸着除去率（％）＝（１−ろ液中のＨＣＶ量／ろ過前のＨＣＶ量）×１００
を求めた。
＜ＥＬＩＳＡ＞
検体を前処理液（ＳＤＳ）で前処理し、ＨＣＶコア抗原を遊離させると同時に共存するＨＣＶ抗体を失活させ測定試料とする。測定試料をＨＣＶコア抗原抗体固定化プレートに添加し、インキュベーションする。所定時間反応後、洗浄し、ホールラディッシュ由来ペルオキシダーゼ標識化ＨＣＶコア抗原抗体を添加し、インキュベーションする。所定時間反応後、洗浄し、ｏ−フェニレンジアミン試薬を添加し、インキュベーションする。所定時間反応後、反応停止液を添加する。４９２ｎｍの波長で発色を測光する。標品の吸光度より、濃度を算出する。
＜血清中アルブミン透過量＞
検体にブロムクレゾールグリーン試薬を添加し、６３０ｎｍの波長で発色を測光する。標品の吸光度より、濃度を算出した。
アルブミン透過率（％）＝（ろ液中のアルブミン量／ろ過前のアルブミン量）×１００
<HCV adsorption amount>
Specimen was measured by ortho HCV antigen ELISA test,
HCV adsorption removal rate (%) = (1-HCV amount in filtrate / HCV amount before filtration) × 100
Asked.
<ELISA>
The specimen is pretreated with a pretreatment solution (SDS) to release the HCV core antigen and simultaneously deactivate the coexisting HCV antibody to obtain a measurement sample. A measurement sample is added to an HCV core antigen antibody-immobilized plate and incubated. After the reaction for a predetermined time, washing is performed, and whole radish-derived peroxidase-labeled HCV core antigen antibody is added and incubated. After reacting for a predetermined time, washing is performed, and o-phenylenediamine reagent is added and incubated. After the reaction for a predetermined time, a reaction stop solution is added. Measure the color development at a wavelength of 492 nm. The concentration is calculated from the absorbance of the sample.
<Serum albumin permeation amount>
Bromocresol green reagent is added to the specimen, and color development is measured at a wavelength of 630 nm. The concentration was calculated from the absorbance of the sample.
Albumin permeability (%) = (albumin content in filtrate / albumin content before filtration) × 100
（合成例）硫酸エステル化したヘパリン誘導体の調整例
ヘパリンナトリウム塩１ｇをイオン交換樹脂（Ｈ＋）５０ｍＬに通し、溶出液をトリブチルアミン−エタノール溶液で中和した。過剰なトリブチルアミンをＥｔ２Ｏで抽出除去し、残った水層を凍結乾燥し、ヘパリンのトリブチルアンモニウム塩１．７ｇを調製した。
次に、ＳＯ３・Ｐｙ２．８ｇの無水ＤＭＦ１００ｍＬ溶液を、上記調製したヘパリンのｎ−トリブチルアンモニウム塩（８００ｍｇ）を溶解したＤＭＦ６０ｍＬに滴下したのち、混合液を４０℃で１時間反応させた。反応液を冷水に入れ、１Ｍ−ＮａＯＨで中和後、限外濾過により脱塩、精製し、凍結乾燥を行い、硫酸エステル化したヘパリン誘導体を４７０ｍｇ得た。
(Synthesis example) Preparation example of sulfated heparin derivative 1 g of heparin sodium salt was passed through 50 mL of an ion exchange resin (H + ), and the eluate was neutralized with a tributylamine-ethanol solution. Excess tributylamine was extracted and removed with Et 2 O, and the remaining aqueous layer was lyophilized to prepare 1.7 g of heparin tributylammonium salt.
Next, a solution of SO 3 · Py 2.8 g in anhydrous DMF in 100 mL was added dropwise to 60 mL of DMF in which n-tributylammonium salt of heparin prepared above (800 mg) was dissolved, and the mixture was reacted at 40 ° C. for 1 hour. The reaction solution was put into cold water, neutralized with 1M NaOH, desalted and purified by ultrafiltration, freeze-dried, and 470 mg of sulfated heparin derivative was obtained.
（実施例１）
多孔性ポリエチレン製中空糸束（中空糸表面積１００ｃｍ２）にアイエレクトロンビーム社製の電子線照射装置「ＥＣ２５０／３０／９０Ｌ」を用いて酸素濃度１００ｐｐｍ以下になるまで窒素置換し２００ｋＶの加速電圧で９０ｋＧｙの電子線を照射した。ガラス製試験管に中空糸束を入れてセプタムを付けて減圧窒素置換し、続いて２３℃でグリシジルメタクリレート（東京化成）メタノール溶液１０ｍｇ／ｍＬの脱酸素済み溶液を試験管に加えた。４時間後、試験管から中空糸束を取り出し、数回洗浄して乾燥後、重量を測定し、重量増加からグリシジルメタクリレートの固定化を確認した。ポリエチレンイミン（和光純薬、分子量１万）１ｇをメタノール１５ｍＬに溶解しグリシジルメタクリレート固定化中空糸を浸漬、４０℃で１６時間反応を行った。中空糸を溶液から取り出して洗浄後、ヘパリン（Ａｌｄｒｉｃｈ）３０ｍｇ、ＮＨＳ（和光純薬）１２ｍｇ、ＥＤＣ（同仁化学）１５ｍｇをＰＢＳ１５ｍＬに溶解し、溶液に浸漬した。１６時間浸漬後、中空糸を取り出し、洗浄後、Ａｃ２Ｏ／ＡｃＯＮａ １／２ｖ／ｖ溶液に中空糸を１時間浸漬しアセチル化処理を行い、ヘパリン固定化中空糸を得た。ヘパリン固定化量は上記トルイジンブルーを用いた色素溶液の吸着を用いた定量法を用いて測定した。ＨＣＶ−Ｅ２吸着率、及びＨＩＶ−ｇｐ１２０吸着率の評価は上記の方法で行った。
Example 1
A porous polyethylene hollow fiber bundle (hollow fiber surface area 100 cm 2 ) was replaced with nitrogen using an electron beam irradiation device “EC250 / 30 / 90L” manufactured by Ielectron Beam Co., Ltd. until an oxygen concentration of 100 ppm or less, and an acceleration voltage of 200 kV was applied. A 90 kGy electron beam was irradiated. A hollow fiber bundle was put into a glass test tube, a septum was attached, and the atmosphere was purged with nitrogen under reduced pressure. Subsequently, a deoxygenated solution of glycidyl methacrylate (Tokyo Kasei) methanol solution 10 mg / mL was added to the test tube at 23 ° C. After 4 hours, the hollow fiber bundle was taken out from the test tube, washed several times, dried, then weighed, and the immobilization of glycidyl methacrylate was confirmed from the increase in weight. Polyethyleneimine (Wako Pure Chemical, molecular weight 10,000) 1g was melt | dissolved in methanol 15mL, the glycidyl methacrylate fixed hollow fiber was immersed, and reaction was performed at 40 degreeC for 16 hours. After removing the hollow fiber from the solution and washing, 30 mg of heparin (Aldrich), 12 mg of NHS (Wako Pure Chemical Industries), and 15 mg of EDC (Dojin Chemical) were dissolved in 15 mL of PBS and immersed in the solution. After soaking for 16 hours, the hollow fiber was taken out, washed, and then immersed in an Ac 2 O / AcONa 1/2 v / v solution for 1 hour for acetylation treatment to obtain a heparin-immobilized hollow fiber. The amount of heparin immobilized was measured by a quantitative method using adsorption of a dye solution using the toluidine blue. The HCV-E2 adsorption rate and the HIV-gp120 adsorption rate were evaluated by the above methods.
（実施例２）
実施例１と同様にグリシジルメタクリレートを固定化し、ポリエチレンイミンの代わりに１，２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン（東京化成）４ｍＬをメタノール１５ｍＬに溶解しグリシジルメタクリレート固定化中空糸を浸漬、４０℃で１６時間反応を行った。引き続き実施例１と同様にヘパリン固定化を行い、ヘパリン固定化中空糸を得た。
(Example 2)
In the same manner as in Example 1, glycidyl methacrylate was fixed, and instead of polyethyleneimine, 4 mL of 1,2-bis (2-aminoethoxy) ethane (Tokyo Kasei) was dissolved in 15 mL of methanol, and the glycidyl methacrylate-fixed hollow fiber was immersed therein. The reaction was carried out at 16 ° C. for 16 hours. Subsequently, heparin was immobilized in the same manner as in Example 1 to obtain a heparin-immobilized hollow fiber.
（実施例３）
ヘパリンの替わりに上記合成例で得られた硫酸エステル化したヘパリン誘導体を用いた他は、実施１と同様にして、硫酸エステル化したヘパリン誘導体固定化中空糸を得た。
(Example 3)
A sulfated heparin derivative-immobilized hollow fiber was obtained in the same manner as in Example 1 except that the sulfated heparin derivative obtained in the above synthesis example was used instead of heparin.
（実施例４）
ヘパリンの替わりにデキストラン硫酸を用いた他は、実施１と同様にして、デキストラン硫酸固定化中空糸を得た。
Example 4
A dextran sulfate-immobilized hollow fiber was obtained in the same manner as in Example 1 except that dextran sulfate was used instead of heparin.
（実施例５）
ヘパリンの替わりにフコイダンを用いた他は、実施１と同様にして、フコイダン固定化中空糸を得た。
(Example 5)
A fucoidan-fixed hollow fiber was obtained in the same manner as in Example 1 except that fucoidan was used instead of heparin.
（実施例６）
実施例１と同様にヒドロキシエチルメタクリレートを中空糸に固定化した。１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル２．５ｍＬ、ＮａＢＨ４５０ｍｇ、１Ｍ−ＮａＯＨ ２．５ｍＬ、Ｈ２Ｏ ５ｍＬを混合し、２５℃で８時間反応を行ってエポキシ化中空糸を得た。水で洗浄後、０．１Ｍ−Ｎａ２ＣＯ３溶液を用いてヘパリン１００ｍｇ／ｍＬ溶液を調整し、この溶液にエポキシ化中空糸を４０℃で２４時間浸漬、反応し、ヘパリン固定化中空糸を得た。
(Example 6)
In the same manner as in Example 1, hydroxyethyl methacrylate was immobilized on the hollow fiber. 1,4-butanediol diglycidyl ether 2.5 mL, NaBH 4 50 mg, 1M-NaOH 2.5 mL, and H 2 O 5 mL were mixed and reacted at 25 ° C. for 8 hours to obtain an epoxidized hollow fiber. After washing with water, a 100 mg / mL solution of heparin was prepared using a 0.1 M Na 2 CO 3 solution, and the epoxidized hollow fiber was immersed in this solution for 24 hours at 40 ° C. and reacted to obtain a heparin-immobilized hollow fiber. Obtained.
（参考例）
＜ヒト免疫不全ウイルスの調製＞
ＡＤ８にて、ＨｅＬａ細胞にｐｒｏｖｉｒｕｓをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした後、４８時間後に上清を回収して使用した。
(Reference example)
<Preparation of human immunodeficiency virus>
After transfection of HeLa cells with AD8, supernatant was collected and used 48 hours later.
（比較例）
多孔性ポリエチレン製中空糸束の代わりに多孔性でないポリ４−メチルペンテン製中空糸束（ＤＩＣ（株）製）を用いる他は実施例１と同様にグリシジルメタクリレートの固定化を行い、ポリエチレンイミンで処理してヘパリンを固定化、アセチル化を行った。
以上の実施例１〜５、比較例で得られた高分子基材を用いたＨＣＶ−Ｅ２吸着率、及びＨＩＶ−ｇｐ１２０吸着率を表１に示す。
表中、水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ａ）、少なくとも２個のエポキシ基を有する化合物（Ｂ）又はアンモニアを「連結化合物」と記す。
(Comparative example)
Glycidyl methacrylate was immobilized in the same manner as in Example 1 except that a non-porous poly 4-methylpentene hollow fiber bundle (manufactured by DIC Corporation) was used instead of the porous polyethylene hollow fiber bundle. Treatment was performed to immobilize and acetylate heparin.
Table 1 shows the HCV-E2 adsorption rate and the HIV-gp120 adsorption rate using the polymer base materials obtained in Examples 1 to 5 and Comparative Examples.
In the table, a compound (A) having a hydroxyl group or an amino group, a compound (B) having at least two epoxy groups, or ammonia is referred to as a “linking compound”.
（実施例７）
実施例１で作製した多孔性中空糸を用いて得られるモジュールでＨＣＶ患者血清をろ過し、ろ液中のＨＣＶをＥＬＩＳＡ法で測定してＨＣＶの吸着除去率（％）を算出した。その結果、ＨＣＶ吸着率は８３％、アルブミン透過率は９５％であった。
（実施例８）
実施例２で作製した多孔性中空糸を用いて得られるモジュールでＨＣＶ患者血清をろ過し、ろ液中のＨＣＶをＥＬＩＳＡ法で測定してＨＣＶの吸着除去率（％）を算出した。その結果、ＨＣＶ吸着率は８１％、アルブミン透過率は９１％であった。
(Example 7)
The HCV patient serum was filtered with the module obtained using the porous hollow fiber produced in Example 1, and the HCV in the filtrate was measured by the ELISA method to calculate the HCV adsorption removal rate (%). As a result, the HCV adsorption rate was 83%, and the albumin permeability was 95%.
(Example 8)
The HCV patient serum was filtered with the module obtained using the porous hollow fiber produced in Example 2, and the HCV in the filtrate was measured by the ELISA method to calculate the HCV adsorption removal rate (%). As a result, the HCV adsorption rate was 81% and the albumin permeability was 91%.
（実施例９）
実施例３で作製した多孔性中空糸を用いて得られるモジュールでＨＣＶ患者血清をろ過し、ろ液中のＨＣＶをＥＬＩＳＡ法で測定してＨＣＶの吸着除去率（％）を算出した。その結果、ＨＣＶ吸着率は７８％、アルブミン透過率は９４％であった。
（実施例１０）
実施例４で作製した多孔性中空糸を用いて得られるモジュールでＨＣＶ患者血清をろ過し、ろ液中のＨＣＶをＥＬＩＳＡ法で測定してＨＣＶの吸着除去率（％）を算出した。その結果、ＨＣＶ吸着率は８２％、アルブミン透過率は９３％であった。
Example 9
The HCV patient serum was filtered with the module obtained using the porous hollow fiber produced in Example 3, and the HCV in the filtrate was measured by the ELISA method to calculate the HCV adsorption removal rate (%). As a result, the HCV adsorption rate was 78% and the albumin permeability was 94%.
(Example 10)
The HCV patient serum was filtered with the module obtained using the porous hollow fiber produced in Example 4, and the HCV in the filtrate was measured by the ELISA method to calculate the HCV adsorption removal rate (%). As a result, the HCV adsorption rate was 82% and the albumin permeability was 93%.
（実施例１１）
実施例５で作製した多孔性中空糸を用いて得られるモジュールでＨＣＶ患者血清をろ過し、ろ液中のＨＣＶをＥＬＩＳＡ法で測定してＨＣＶの吸着除去率（％）を算出した。その結果、ＨＣＶ吸着率は７９％、アルブミン透過率は９１％であった。
（実施例１２）
実施例６で作製した多孔性中空糸を用いて得られるモジュールでＨＣＶ患者血清をろ過し、ろ液中のＨＣＶをＥＬＩＳＡ法で測定してＨＣＶの吸着除去率（％）を算出した。その結果、ＨＣＶ吸着率は８１％、アルブミン透過率は９５％であった。
(Example 11)
The HCV patient serum was filtered with the module obtained using the porous hollow fiber produced in Example 5, and the HCV in the filtrate was measured by the ELISA method to calculate the HCV adsorption removal rate (%). As a result, the HCV adsorption rate was 79% and the albumin permeability was 91%.
(Example 12)
The HCV patient serum was filtered with the module obtained using the porous hollow fiber produced in Example 6, and the HCV in the filtrate was measured by the ELISA method to calculate the HCV adsorption removal rate (%). As a result, the HCV adsorption rate was 81% and the albumin permeability was 95%.
本発明の高分子基材は、肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスの除去器具としての利用が可能である。 The polymer substrate of the present invention can be used as an instrument for removing hepatitis virus or human immunodeficiency virus.
１流出口
２流入口
３硫酸化多糖
４中空糸
５容器
６隔壁
1
Claims (13)
重合性化合物（Ａ）が、水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）、少なくとも２個のエポキシ基を有する化合物（Ｄ）及びアンモニアからなる群から選ばれるいずれか一種と反応し得る官能基を有する化合物であり、且つ、
硫酸化多糖が、水酸基若しくはアミノ基を有する化合物（Ｃ）、少なくとも２個のエポキシ基を有する化合物（Ｄ）及びアンモニアからなる群から選ばれるいずれか一種との反応により形成される共有結合を介して重合性化合物（Ａ）により形成されるグラフト重合鎖と結合されたことを特徴とする肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス吸着用高分子基材。 A polymer substrate for adsorbing hepatitis virus or human immunodeficiency virus, wherein the porous polymer support (B) is surface-treated by graft polymerization reaction of the polymerizable compound (A),
The polymerizable compound (A) has a functional group capable of reacting with any one selected from the group consisting of a compound (C) having a hydroxyl group or an amino group, a compound (D) having at least two epoxy groups, and ammonia. A compound, and
Through a covalent bond formed by reaction of the sulfated polysaccharide with any one selected from the group consisting of a compound (C) having a hydroxyl group or an amino group, a compound (D) having at least two epoxy groups, and ammonia. A polymer substrate for adsorbing hepatitis virus or human immunodeficiency virus, characterized in that it is bonded to a graft polymer chain formed by the polymerizable compound (A).
で表される請求項１〜７の何れかに記載の肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルス吸着用高分子基材。 The compound (D) having at least two epoxy groups is represented by the general formula (1)
The polymer base material for hepatitis virus or human immunodeficiency virus adsorption in any one of Claims 1-7 represented by these.
肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスを含む液を多孔性中空糸に通じることにより得られる、中空糸の有する孔を通過した液と、孔を通過しなかった液とを混合する工程を有することを特徴とする肝炎ウイルス又はヒト免疫不全ウイルスを除去する方法。 A method for removing hepatitis virus or human immunodeficiency virus using the polymer substrate for adsorbing hepatitis virus or human immunodeficiency virus according to claim 4,
It has a step of mixing a liquid that has passed through the hole of the hollow fiber and a liquid that has not passed through the hole, which is obtained by passing a liquid containing hepatitis virus or human immunodeficiency virus through the porous hollow fiber. A method for removing hepatitis virus or human immunodeficiency virus.
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