JP2012502040A - 三リン酸塩オリゴヌクレオチドの合成方法および誘導体 - Google Patents

三リン酸塩オリゴヌクレオチドの合成方法および誘導体 Download PDF

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Abstract

本発明は、抗ウイルス反応または抗菌反応の誘発、特にＲＩＧ−Ｉに結合することにより、Ｉ型ＩＦＮ、ＩＬ−１８、および／またはＩＬ−１βの誘発を可能にする、式Ｉ
のオリゴヌクレオチド、またはその医薬的に許容される塩もしくはプロドラッグを特徴とする。本発明は、少なくとも１つの三リン酸塩またはその類似体を含む、修飾オリゴヌクレオチドの作製および使用方法に関する。本発明は、さらに、ウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫感染症、腫瘍、アレルギー、自己免疫疾患、免疫不全症、および免疫抑制等の、種々の疾患および疾病を治療するための方法に関する。

Description

本発明は、少なくとも１つの三リン酸塩またはその類似体を含む、修飾核酸の作製および使用方法に関する。本発明は、対象の免疫系を刺激するか、または阻害するかのいずれかをするように修飾されるｉＲＮＡ剤にも関する。本発明は、抗ウイルスまたは抗菌反応の誘発、特にＲＩＧ−Ｉを調節することにより、Ｉ型ＩＦＮ、ＩＬ−１８、および／またはＩＬ−１βの誘発を可能にする、ｉＲＮＡ剤およびＲＮＡ剤の使用を記載する。本発明は、ウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫感染症、腫瘍、アレルギー、自己免疫疾患、免疫不全症、および免疫抑制等の、特定の免疫関連疾病の配列特異的ｍＲＮＡを標的とする、ｉＲＮＡ剤の使用にも関する。
二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる高度に維持される調節機構により、遺伝子発現を遮断することができる。つまり、ＲＮＡ ＩＩＩダイサー酵素は、ｄｓＲＮＡを処理して約２２のヌクレオチドの小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）にする。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘発サイレンシング複合体と呼ばれる、タンパク質／ＲＮＡ複合体に組み込まれる（非特許文献１）。ｓｉＲＮＡ二本鎖の１つである、アンチセンス鎖、またはガイド鎖の鎖は、特異的なワトソン−クリック塩基対の形成を通して、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とハイブリッド形成する。ＲＩＳＣのエンドヌクレアーゼ構成要素のスライサーは、標的とするｍＲＮＡを切断する（非特許文献２）。ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖は、このプロセスで切断または分解されず、このアンチセンス鎖を含むＲＩＳＣは、その後、追加の相補的なｍＲＮＡを切断することができる。
多くの疾患（例えば、癌、造血障害、内分泌疾患、および免疫疾患）は、特定の遺伝子または遺伝子群の異常もしくは望ましくない発現または活性から生じる。例えば、疾病は、調節欠落遺伝子発現、タンパク質の突然変異型の発現、またはウイルス、細菌もしくは他の病原体由来の遺伝子を通して生じる。ＲＮＡｉ経路は、このような遺伝子の望ましくない発現を阻害または減少するように使用され得る（非特許文献３および４）。
核酸の認識に関与するいくつかの受容体タンパク質が、進化してきた。抗ウイルス防御に最も重要なタンパク質受容体の１つは、カスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）およびＤＥｘＤ／Ｈボックスヘリカーゼドメインの２つを含有するヘリカーゼファミリーの構成要素である、レチノイン酸誘導タンパク質Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）であることが、近年の研究で示されている（非特許文献５）。特定のＲＮＡウイルスの組（フラビウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、およびラブドウイルス）のＲＩＧ−ｌ媒介性認識（非特許文献５〜７）は、生体外および生体内の抗ウイルス宿主防御に重要な役割を持つ。ヘリカーゼファミリーの第２の構成要素であるＭＤＡ−５は、相反的な組のＲＮＡウイルス（ピコマウイルス）に対する抗ウイルス防御に関与する（非特許文献８）。
ＲＩＧ−ＩおよびＭＤＡ−５に加え、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ファミリーである、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、およびＴＬＲ９の４つの構成要素も、ウイルスの核酸認識に関与することが知られている。ＲＩＧ−ＩおよびＭＤＡ−５は、それらの細胞内局在、発現パターン、シグナル伝達経路、およびリガンドにおいて、ＴＬＲと異なる。
ＲＩＧ−ＩおよびＭＤＡ−５は、細胞質受容体であるが、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９は、エンドソーム膜に位置する。
ＴＬＲは、特定の決められた免疫細胞のサブセット上（すなわち、ＰＤＣおよびＢ細胞に限定されるＴＬＲ９）に主に発現するが、ＲＩＧ−ＩおよびＭＤＡ−５は、免疫細胞および非免疫細胞の両方で発現する（非特許文献９）。
明確な発現プロファイルおよび細胞局在に加え、エンドソームＴＬＲ、ならびに２つの細胞質受容体ＲＩＧ−ＩおよびＭＤＡ−５のシグナル伝達は異なる。ＴＬＲ３は、ＴＲＩＦおよびＴＬＲ７を介してシグナル伝達され、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９は、ＭｙＤ８８を介してシグナル伝達されるが、ＲＩＧ−Ｉは、ＣＡＲＤ含有アダプターを動員する。
本特許に記載されるｉＲＮＡ剤は、化学的に合成されたオリゴリボヌクレオチドの二本鎖である。二本鎖の１本または両方の鎖は、化学的に修飾され、以下に記載する二本鎖の特性を変更し得る。配列特異的である様式で認識されるｍＲＮＡのＲＩＳＣ媒介性切断に加え、二本鎖は、免疫系に影響を及ぼす場合がある。この発明は、対象の免疫系を刺激または阻害のいずれかをするように修飾されるｉＲＮＡ剤に関する。これらのｉＲＮＡ剤は、二重機能を有し、免疫カスケードに関連しない遺伝子のｍＲＮＡも、配列特異的に標的とし得る。これらの免疫刺激または阻害ｉＲＮＡ剤は、また、化学療法剤、抗生物質、または第２のｉＲＮＡ剤であってもよい、第２の療法と併用して使用され得る。この発明は、ＲＩＳＣに基づく機構を介した分解において、例えば、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９の、特定の免疫関連タンパク質のｍＲＮＡを配列特異的に標的とするｉＲＮＡ剤の使用にも関する。
病原体認識は、免疫系の先天性認識アームにより媒介される。適応性免疫系と違い、先天性免疫は、全ての可能な病原体の認識に対する潜在能力を持たない。代わりに、多くの異なる微生物に存在する、いくつかの高度に維持された構造が認識される。先天性免疫応答は、上皮および免疫細胞上の病原体認識受容体（ＰＲＲ）による、リガンドの認識に基づく。リガンドとしては、グラム陰性細胞壁、ペプチドグリカン、グラム陽性細胞壁からのリポテイコ酸、マンノース糖、細菌ＤＮＡ、Ｎ−ホルミルメチオニン、ウイルスからの二本鎖ＲＮＡ、および真菌細胞壁からのグルカンが挙げられる。先天性免疫は、認識されたリガンドへの露出後、即時に、または数時間後に活性化される。
先天性免疫応答に関与する細胞としては、貪食細胞、好塩基球、マスト細胞、好酸球、および天然キラー細胞（ＮＫ細胞）が挙げられる。これらは、これらの細胞上の細胞表面パターン認識受容体の２つの機能的に異なるクラスである、飲食パターン認識受容体およびシグナル伝達パターン認識受容体である。本明細書の目的において、一般的にシグナル伝達パターン認識受容体、および特にｔｏｌｌ様受容体は、最も重要である。ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、細菌からのＤＮＡおよび二本鎖ＲＮＡを含む、微生物起源のいくつかの異なる分子に結合する（非特許文献１０）。
リガンドがＴＬＲに結合すると、シグナルが核に伝達され、細胞内調節分子の合成をコードする遺伝子が発現する（非特許文献１１）。ＴＬＲシグナル伝達は、ＭｙＤ８８、Ｔｏｌｌｉｐ、Ｍａｌ等のアダプタータンパク質に依存する。これらのアダプタータンパク質は、細胞応答を活性化して、炎症性サイトカイン産生の産生を誘発し、樹状細胞の成熟化を誘発し、インターフェロンの産生を誘発する。同様にサイトカインは、炎症、熱、およびファゴサイトーシス等の、先天性免疫防御を引き起こし、侵入微生物に対する即時反応を提供する。ＴＬＲも、液性免疫（抗体の産生）および細胞媒介性免疫（細胞障害性Ｔリンパ球およびさらなるサイトカインの産生）に必要な種々の二次シグナルを引き起こすことにより、適合性免疫に関与する。
本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤は、核酸またはヌクレオチド類似体に結合することで知られる受容体の１つを通して、先天性免疫系を活性化し得る。Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）は、二本鎖ＲＮＡの受容体である。ＴＬＲ３は、樹状細胞、線維芽細胞、マクロファージ、および上皮細胞上で発現する（非特許文献１２）。ＴＬＲ３のアダプター分子は、ＴＩＣＡＭ−１である。ＴＬＲ３のＴＩＣＡＭ−１への結合は、最終的に、Ｉ型インターフェロンの産生につながる、多重シグナル伝達カスケードを誘発する（ＩＦＮ−αβ，非特許文献１２）。インターフェロンは、ＲＮＡを分解することができる酵素を産生し、したがって、ウイルスの増殖を阻止する、非感染細胞を誘発するサイトカインである。インターフェロンは、細胞障害性Ｔリンパ球、マクロファージ、およびＮＫ細胞を含む、防御に重要な種々の細胞も活性化する。
一本鎖ＲＮＡ認識は、マウスではＴｏｌｌ−様受容体７、およびヒトではＴＬＲ−８により媒介される。マウスにおいて、ＴＬＲ７は、アダプターＭｙＤ８８に結合し、ＩＦＮ−αの活性化をもたらす。Ｄｉｅｂｏｌｄら（非特許文献１３）は、インフルエンザウイルスＲＮＡ、ポリウリジル酸および生体外合成ｍＲＮＡ全てが、形質細胞様粥状細胞において、ＩＦＮ−αの産生を誘発したことを示す。Ｈｅｉｌら（非特許文献１４）は、ホスホロチオエート末端を伴う２０の残基のグアニンおよびウリジン豊富なＲＮＡオリゴヌクレオチドが、樹状細胞およびマクロファージを刺激し、ＩＮＦ−α、ならびに炎症性および調節性サイトカインを分泌したことを示す。彼らは、ＴＬＲ欠損マウスを使用して、マウスＴＬＲ−７およびヒトＴＬＲ−８が、一本鎖ＲＮＡへの結合に関与することを示した。ヒトＴＬＲ−７も、グアニンヌクレオチド類似体により活性化される（非特許文献１５）。
細菌からのＤＮＡは、哺乳類免疫細胞に刺激作用を有する。この応答は、細菌ＤＮＡの非メチル化ジヌクレオチドの存在に依存し、哺乳類のＤＮＡは、低頻度のＣｐＧジヌクレオチドを有し、これらは、ほとんどメチル化されるため、哺乳類のＤＮＡは、免疫刺激活性をもたない。ＣｐＧ ＤＮＡに対する細胞応答は、ＴＬＲ９により媒介される（非特許文献１６）。ＣｐＧモチーフを伴う短ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドに隣接する塩基、ＣｐＧモチーフの数および間隔、ＯＤＮにおけるポリＧ配列の存在、およびＯＣＤの骨格に依存する、免疫刺激作用を有する（非特許文献１７）。
二本鎖ＲＮＡは、ＰＫＲと呼ばれる、偏在的に発現するセリン／スレオニンタンパク質キナーゼとの相互作用を通して、先天性免疫系も活性化する場合がある。ＰＫＲは、細菌ＬＰＳのＴＬＲ４結合により活性化されるＴＬＲ４カスケードの一部である。ＰＫＲは、インターフェロンにより誘発され、ｄｓＲＮＡ、サイトカイン、成長因子、およびストレスシグナルにより活性化される。ＰＫＲは、自己リン酸化し、ｄｓＲＮＡに結合すると活性化される。活性化は、ｅＩＦ２ａのリン酸化を介して、タンパク質合成の阻害をもたらし、異なる転写制御因子の活性化のＰＫＲ依存信号伝達により、炎症性遺伝子の転写も誘発する（非特許文献１８）。ＰＫＲは、その阻害剤ＩｋＢのリン酸化を通して、ＮＦ−κＢ発現を上方制御する（非特許文献１９）。ｄｓＲＮＡの１１の塩基対だけで、ＰＫＲに結合し、活性を誘発することができるが、最大活性は、少なくとも３０の塩基対を必要とする（非特許文献２０）。興味深いことに、Ｋｉｍら（非特許文献２１）は、近年、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して転写されたｓｉＲＮＡ上の５’三リン酸塩が、Ｉ型ＩＦＮの誘発に関与することを示した。
ｓｉＲＮＡ二本鎖は、特定の条件下で、ヒト細胞の免疫応答を引き起こすことができることが報告された。Ｓｌｅｄｚら（非特許文献２２）は、検査された６つの異なるｓｉＲＮＡ二本鎖のそれぞれで、インターフェロン系の誘発を報告した。Ｂｒｉｄｇｅら（非特許文献２３）は、ウイルスベクターを使用して送達された、全てではないがいくつかのヘアピンｓｉＲＮＡが、インターフェロン刺激遺伝子の発現を誘発したことを報告した。ｓｉＲＮＡ二本鎖の濃度は、免疫応答の程度と直接相関する。これらの２つの報告は、ｓｉＲＮＡ二本鎖がＰＫＲを活性化したことを示した。逆に、Ｋａｒｉｋｏら（非特許文献２４）からのデータは、先天性免疫のｓｉＲＮＡ誘発において、ＴＬＲ３経路を関係付けた。Ｋａｒｉｋｏら（非特許文献２４）は、ＴＬＲ３活性化は濃度依存性であるが、ｄｓＲＮＡによる最適なＴＬＲ３の必要条件は、現在不明であることを示した。
先天性免疫応答の活性化は、ウイルス感染から癌に及ぶまで、疾病に有利である。ｄｓＲＮＡおよびＣｐＧ ＤＮＡによる先天性免疫の活性化は、マウスモデルにおいて、抗腫瘍作用を促進した（非特許文献２５）。ｉＲＮＡ剤は、種々の細菌およびウイルス病原体に対するワクチン接種の強力なアジュバンドであるべきである。このようなアジュバントは、適応性免疫応答を同様に形づくるであろう先天性免疫を活性化するはずである。いくつかのｉＲＮＡ配列および修飾は、他のものより先天性免疫応答を良く活性化する場合がある。この活性化は、核酸に結合することが知られるＴｏｌｌ様受容体経路：二本鎖ＲＮＡの受容体であるＬＲ３、一本鎖ＲＮＡの受容体であるＴＬＲ８、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡに対する選択性を伴う受容体であるＴＬＲ９、またはｄｓＲＮＡにより活性化されるタンパク質キナーゼであるＰＫＲのいずれかを介して生じ得る。これらのタンパク質のそれぞれは、記載されるｉＲＮＡ剤に類似する分子に結合することが知られている。
先天性免疫系の抑制が有利であり得るのには、いくつかの理由がある。先天性免疫系の刺激は炎症をもたらすため、非産生時のこの系の抑制は、喘息、重篤な局所性もしくは全身性感染症、または炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患、および関節炎等の慢性炎症疾患を伴う患者に有益であり得る。免疫系を抑制する化合物も、癌の治療に有用である。特に、ＮＦ−κＢの活性化をもたらすＰＫＲ経路の破壊は、魅力的である。ＮＦ−κＢは、ほかの欠損細胞を排除するであろうアポトーシスの阻害をもたらし（非特許文献２６）、転移性成長も促進する（非特許文献２７）。
ＲＩＳＣ；Ｂａｒｔｅｌ，Ｃｅｌｌ，２００４，１１６，２８１−２９７ Ｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２００４，１５，１８５−１９７ Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ．，２００３，６７，６５７−６８５ Ａｌｉｓｋｙ ＆ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００４，４，４５−５１ Ｍ．Ｙｏｎｅｙａｍａ ｅｔ ａ／．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５，７３０（ＪｕＩ，２００４） Ｒ．Ｓｕｍｐｔｅｒ，Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９，２６８９（Ｍａｒ，２００５） Ｈ．Ｋａｔｏ ｅｔ ａ／．，Ｎａｔｕｒｅ ４４１，１０１（Ａｐｒ ９，２００６） Ｈ．Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４４１（７０８９）：１０１−１０５，Ａｐｒ ９，２００６ Ｈ．Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３，１９（ＪｕＩ１２００５） Ｊａｎｓｓｅｎｓ ＆ Ｂｅｙａｅｒｔ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，２００３，１６，６３７−６４６ Ｕｌｅｖｉｔｃｈ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００４，４，５１２−５２０ Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００４，４８，１４７−１５４ Ｄｉｅｂｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，３０３，１５２９−１５３１ Ｈｅｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，３０３，１５２６−１５２９ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００３，１００，６６４６−６６５１ Ｈｅｍｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ， ２０００，４０８，７４０−７４５ Ｋｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９５，３７４，５４６−５４９、Ｋｒｉｅｇ，Ｉｎ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２００１，ｅｄ．Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．，ｐｐ． ４７１−５１６，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９９，１８，６１１２−６４２０ Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１，６２８８−６２９２ Ｍａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９２，１２，５２３８−５２４８、Ｎａｎｄｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９８，１７，５４５８−５４６５ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００４，２２，３２１−３２５ Ｓｌｅｄｚ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２００３，５，８３４−８３９ Ｂｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２００３，３４，２６３−２６４ Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ，２００４，１７７，１３２−１３８ Ｗｈｉｔｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００４，６４，５８５０−５８６０ Ｐｉｋａｒｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００４，４３１，４６１−４６６ Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００４，１１４，５６９−５８１
本発明は、抗ウイルスまたは抗菌反応の誘発、ＲＩＧ−Ｉを調節することにより、特にＩ型ＩＦＮ、ＩＬ−１８、および／またはＩＬ−１βの誘発を可能にする、新規クラスのｉＲＮＡ剤を提供する。
一実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤は、以下に図示する式Ｉ
Figure 2012502040
により表されるか、またはその医薬的に許容される塩もしくはプロドラッグであり、式中、
Ｑ２およびＱ３は、それぞれ、独立して、ＮＨ、Ｏ、またはＳであり、
ＸおよびＹは、それぞれ、独立して、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｏ−、ＳＨ、Ｓ−、Ｓｅ、ＢＨ３、ＢＨ３ −、Ｈ、Ｎ（Ｒ２）２、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、ここで、Ｒ１は、独立して、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、Ｒ２は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されるか、またはＯＨであってもよく、
Ｑ４およびＱ５は、それぞれ、独立して、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨＭｅ、ＣＭｅ２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＨ、ＮＲ１、またはＳであり、
Ｑ１は、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｓ−、ＳＨ、ＳＲ１であり、
ｎは、１、２、３、４、または５であり、各反復単位は、同一であるか、または異なってもよく、
Ａは存在しないか、または一本鎖オリゴヌクレオチドおよび二本鎖オリゴヌクレオチドからなる群から選択され、それぞれ、化学的に修飾されてもよく、
Ｂは存在しないか、またはリンカー／スペーサーであり、
Ｅは、一本鎖オリゴヌクレオチドまたは二本鎖オリゴヌクレオチドであり、それぞれ、化学的に修飾されるか、またはリガンドと共役し得るが、
ただし、ＡおよびＢが、共に両方とも存在せず、かつｎが、０、１、または３である時、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｑ５、Ｘ、およびＹは、全てが酸素ではないことを条件とする。
本発明の別の実施形態において、医薬的に許容される担体または賦形剤と組み合わせた、治療有効量の本発明のｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物を開示する。本発明のさらに別の実施形態において、医薬組成物とを用いたウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫感染症、腫瘍、アレルギー、自己免疫疾患、免疫不全症、および免疫抑制等の治療方法を開示する。
前述および本明細書の他の目的、特徴、および利点は、異なる図を通して、同様の符号が同じ部分を示す添付の図面に図示されるように、以下の本発明の好適な実施形態のより特定の説明により理解されるであろう。図面は、必ずしも実際の尺度ではなく、代わりに、本発明の原理を図示する部分が強調されている。
精製されたＲＮＡ−三リン酸塩のイオン交換ＨＰＬＣ分析である。 ＲＮＡ５’−三リン酸塩のＬＣ−ＭＳ分析である。
本発明の化合物の第１の実施形態において、化合物は、上記に図示される式Ｉにより表されるか、またはその医薬的に許容される塩もしくはプロドラッグである。
本発明のｉＲＮＡ剤の一実施形態において、薬剤は、以下に図示される式ＩＩ
Figure 2012502040
により表されるか、またはその医薬的に許容される塩もしくはプロドラッグであり、
式中、Ｑ２、Ｑ３、およびＱ３０は、それぞれ、独立して、ＮＨ、Ｏ、またはＳであり、
ＸおよびＹおよびＹ１０は、それぞれ、独立して、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｏ−、ＳＨ、Ｓ−、Ｓｅ、ＢＨ３、ＢＨ３ −、Ｈ、Ｎ（Ｒ２）２、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、ここで、Ｒ１は、独立して、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、Ｒ２は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されるか、またはＯＨであってもよく、
Ｑ４およびＱ５は、それぞれ、独立して、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨＭｅ、ＣＭｅ２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＨ、ＮＲ１、またはＳであり、
Ｑ１は、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｓ−、ＳＨ、ＳＲ１であり、
Ｗは、Ｈ、ＯＨ、または−Ｇ−Ｌであり、ここで、Ｇは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、アセタール、ケタール、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−、−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−、−Ｓ−、−Ｏ−、ピロリジン、モルホリン、ピペラジン、およびチアゾリジンからなる群から選択され、Ｌは、リガンドであるが、
ＷがＯＨである時Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｑ５、Ｑ３０、Ｘ、Ｙ、およびＹ１０は、全てが酸素ではないことを条件とする。
本発明のｉＲＮＡ剤の一実施形態において、薬剤は、以下に図示される式ＩＩＩ
Figure 2012502040
により表されるか、またはその医薬的に許容される塩もしくはプロドラッグであり、
式中、Ｑ２およびＱ３は、それぞれ、独立して、ＮＨ、Ｏ、またはＳであり、
ＸおよびＹおよびＹ１０は、それぞれ、独立して、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｏ−、ＳＨ、Ｓ−、Ｓｅ、ＢＨ３、ＢＨ３ −、Ｈ、Ｎ（Ｒ２）２、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、ここで、Ｒ１は、独立して、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、Ｒ２は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されるか、またはＯＨであってもよく、
Ｑ４およびＱ５は、それぞれ、独立して、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨＭｅ、ＣＭｅ２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＨ、ＮＲ１、またはＳであり、
Ｑ１は、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｓ−、ＳＨ、ＳＲ１であり、
Ｗは、それぞれ、独立して、Ｈ、ＯＨ、または−Ｇ−Ｌであり、Ｇは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、アセタール、ケタール、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−、−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−、−Ｓ−、−Ｏ−、ピロリジン、モルホリン、ピペラジン、およびチアゾリジンからなる群から選択され、ここで、Ｌは、リガンドである。
本発明のｉＲＮＡ剤の一実施形態において、薬剤は、以下に図示される式ＩＶ
Figure 2012502040
により表されるか、またはその医薬的に許容される塩もしくはプロドラッグであり、
式中、Ｑ２、Ｑ３、およびＱ３０は、それぞれ、独立して、ＮＨ、Ｏ、またはＳであり、
ＸおよびＹおよびＹ１０は、それぞれ、独立して、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｏ−、ＳＨ、Ｓ−、Ｓｅ、ＢＨ３、ＢＨ３ −、Ｈ、Ｎ（Ｒ２）２、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、ここで、Ｒ１は、独立して、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、Ｒ２は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されるか、またはＯＨであってもよく、
Ｑ４およびＱ５は、それぞれ、独立して、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨＭｅ、ＣＭｅ２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＲ１、またはＳであり、
Ｑ１は、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｓ−、ＳＨ、ＳＲ１であり、
Ｒは、Ｈ、リン酸、またはホスホロチオエートであり、
ＷおよびＷ１は、それぞれ、独立して、Ｈ、ＯＨ、リン酸、ホスホロチオエート、または−Ｇ−Ｌであり、ここで、Ｇは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、アセタール、ケタール、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−、−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−、−Ｓ−、−Ｏ−、ピロリジン、モルホリン、ピペラジン、およびチアゾリジンからなる群から選択され、ここで、Ｌは、リガンドであるが、
ＷがＯＨである時、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｑ５、Ｑ３０、Ｘ、Ｙ、Ｙ１０は、全てが酸素ではないことを条件とする。
本発明のｉＲＮＡ剤の一実施形態において、薬剤は、以下に図示される式ＩＶａ
Figure 2012502040
により表されるか、またはその医薬的に許容される塩もしくはプロドラッグであり、
式中、Ｑ２、Ｑ３、およびＱ３０は、それぞれ、独立して、ＮＨ、Ｏ、またはＳであり、
ＸおよびＹおよびＹ１０は、それぞれ、独立して、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｏ−、ＳＨ、Ｓ−、Ｓｅ、ＢＨ３、ＢＨ３ −、Ｈ、Ｎ（Ｒ２）２、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、ここで、Ｒ１は、独立して、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、Ｒ２は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されるか、またはＯＨであってもよく、
Ｑ４およびＱ５は、それぞれ、独立して、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨＭｅ、ＣＭｅ２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＲ１、またはＳであり、
Ｑ１は、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｓ−、ＳＨ、ＳＲ１であり、
ＷおよびＷ１は、それぞれ、独立して、Ｈ、ＯＨ、リン酸、ホスホロチオエート、または−Ｇ−Ｌであり、ここで、Ｇは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、アセタール、ケタール、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−、−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−、−Ｓ−、−Ｏ−、ピロリジン、モルホリン、ピペラジン、およびチアゾリジンからなる群から選択され、ここで、Ｌは、リガンドであるが、
ＷがＯＨである時、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｑ５、Ｑ３０、Ｘ、Ｙ、Ｙ１０は、全てが酸素ではないことを条件とする。
本発明のｉＲＮＡ剤の一実施形態において、薬剤は、以下に図示される式Ｖ
Figure 2012502040
により表されるか、またはその医薬的に許容される塩もしくはプロドラッグであり、
式中、Ｑ２およびＱ３は、それぞれ、独立して、ＮＨ、Ｏ、またはＳであり、
ＸおよびＹおよびＹ１０は、それぞれ、独立して、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｏ−、ＳＨ、Ｓ−、Ｓｅ、ＢＨ３、ＢＨ３ −、Ｈ、Ｎ（Ｒ２）２、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、ここで、Ｒ１は、独立して、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、Ｒ２は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されるか、またはＯＨであってもよく、
Ｑ４およびＱ５は、それぞれ、独立して、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨＭｅ、ＣＭｅ２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＲ１、またはＳであり、
Ｑ１は、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｓ−、ＳＨ、ＳＲ１であり、
Ｒは、Ｈ、リン酸、またはホスホロチオエートであり、
ＷおよびＷ１は、それぞれ、独立して、Ｈ、ＯＨ、リン酸、ホスホロチオエート、または−Ｇ−Ｌであり、Ｇは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、アセタール、ケタール、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−、−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−、−Ｓ−、−Ｏ−、ピロリジン、モルホリン、ピペラジン、およびチアゾリジンからなる群から選択され、ここで、Ｌは、リガンドである。
本発明のｉＲＮＡ剤の一実施形態において、薬剤は、以下に図示される式ＶＩ
Figure 2012502040
により表されるか、またはその医薬的に許容される塩もしくはプロドラッグであり、
式中、Ｑ２、Ｑ３、およびＱ３０は、それぞれ、独立して、ＮＨ、Ｏ、またはＳであり、
ＸおよびＹおよびＹ１０は、それぞれ、独立して、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｏ−、ＳＨ、Ｓ−、Ｓｅ、ＢＨ３、ＢＨ３ −、Ｈ、Ｎ（Ｒ２）２、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、ここで、Ｒ１は、独立して、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、Ｒ２は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されるか、またはＯＨであってもよく、
Ｑ４およびＱ５は、それぞれ、独立して、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨＭｅ、ＣＭｅ２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＲ１、またはＳであり、
Ｑ１は、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｓ−、ＳＨ、ＳＲ１であり、
Ｗ、Ｗ１、およびＷ２は、それぞれ、独立して、Ｈ、ＯＨ、リン酸、ホスホロチオエート、または−Ｇ−Ｌであり、ここで、Ｇは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、アセタール、ケタール、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−、−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−、−Ｓ−、−Ｏ−、ピロリジン、モルホリン、ピペラジン、およびチアゾリジンからなる群から選択され、ここで、Ｌは、リガンドであり、
リンカー／スペーサーは、リン酸、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アミド、エステル、ジスルフィド、チオエーテル、オキシム、およびヒドラゾン、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ならびにヘテロアリールからなる群から選択される。
本発明のｉＲＮＡ剤の一実施形態において、薬剤は、以下に図示される式ＶＩＩ
Figure 2012502040
により表されるか、またはその医薬的に許容される塩もしくはプロドラッグであり、
式中、Ｑ２およびＱ３は、それぞれ、独立して、ＮＨ、Ｏ、またはＳであり、
ＸおよびＹおよびＹ１０は、それぞれ、独立して、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｏ−、ＳＨ、Ｓ−、Ｓｅ、ＢＨ３、ＢＨ３ −、Ｈ、Ｎ（Ｒ２）２、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、ここで、Ｒ１は、独立して、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、Ｒ２は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されるか、またはＯＨであってもよく、
Ｑ４およびＱ５は、それぞれ、独立して、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＲ１、またはＳであり、
Ｑ１は、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｓ−、ＳＨ、ＳＲ１であり、
Ｗ、Ｗ１、およびＷ２は、それぞれ、独立して、Ｈ、ＯＨ、リン酸、ホスホロチオエート、または−Ｇ−Ｌであり、ここで、Ｇは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、アセタール、ケタール、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−、−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−、−Ｓ−、−Ｏ−、ピロリジン、モルホリン、ピペラジン、およびチアゾリジンからなる群から選択され、ここで、Ｌは、リガンドであり、
リンカー／スペーサーは、リン酸、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アミド、エステル、ジスルフィド、チオエーテル、オキシム、およびヒドラゾン、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ならびにヘテロアリールからなる群から選択される。
本発明のさらなる代表的な亜化学種は、式（Ａ）のｉＲＮＡ剤（１）〜（１５）であり、ここで、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｑ５、Ｑ６、Ｘ、Ｙ、およびＺを表１に示す。
Figure 2012502040
本発明のさらなる代表的な亜化学種は、式（Ｂ）のｉＲＮＡ剤（１６）〜（３１）であり、ここで、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ５、Ｑ６、Ｘ、Ｙ、およびＺを表２に示す。
Figure 2012502040
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、（ａ）フッ化物不安定基またはフッ化物非不安定基を用いて、２’ヒドロキシル部分を保護する工程と、（ｂ）
Figure 2012502040
（式中、
Ｒ100は、独立して、電子吸引性基(ＥＷＧ)であり、
Ｒ200およびＲ300は、それぞれ、独立して、ハロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロ環、置換ヘテロ環であり、
Ｚ10は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＢＨ3、またはＮＲ’であり、
Ｘ40は、Ｃｌ、ジアルキルアミン、または環状アミンであり、
Ｘ10は、Ｃｌ、Ｏ−アリール、またはＯ−置換アリールであり、
Ｙ10およびＹ20は、独立して、Ｏ−置換アルキル、ジアルキルアミン、または環状アミンである）
からなる群から選択される試薬を用いて、５’ヒドロキシル部分を三リン酸塩または三リン酸類似体に変換する工程と、（ｃ）固相ホスホラミダイト、液相ホスホラミダイト、固相Ｈ−ホスホネート、液相Ｈ−ホスホネート、ハイブリッド相ホスホラミダイト、およびハイブリッド相Ｈ−ホスホネート系合成方法からなる群から選択される方法を使用して、核酸分子を合成する工程と、（ｄ）保護基および／または固体支持体を除去する工程とを含む、三リン酸塩または三リン酸類似体を含む核酸分子を調製するＡプロセスにより調製され得る。一実施形態において、合成の工程は、入れ替えられ得る。例えば、工程（ｃ）は、工程（ａ）および／または（ｂ）の前に行うことができる。
好適な電子求引性基としては、ハロゲン、ＮＯ２、ＣＮ、アシル、およびスルホニルが挙げられる。好適なジアルキルアミンとしては、Ｎ（ｉ−Ｐｒ）２が挙げられる。
一実施形態において、オリゴヌクレオチドの配列およびモチーフは、１）ホスホロチオエート連結（ＰＳ連結を伴う５’−三リン酸塩−５’および内部位置でラセミ、またはＰＳ連結を伴う５’−三リン酸塩、任意に、５’および内部位置で純粋（Ｒおよび／または構造）、２）キメラオリゴヌクレオチド（ＴＬＲ活性化を誘発するための、短ＤＮＡ部分上のＣＰＧモチーフを伴う５’−三リン酸塩−ＲＮＡ−ＤＮＡ−ＲＮＡ−３’。ＲＮａｓｅ Ｈに最小の影響を及ぼす、ＤＮＡ部分の長さが４〜６ヌクレオチド；ＲＮａｓｅ Ｈを誘発する可能性を有するＤＮＡ部分上にＣＰＧモチーフを持たない５’−三リン酸塩−ＲＮＡ−ＤＮＡ−ＲＮＡ−３’；ＲＮａｓｅ ＨおよびＴＬＲ活性化を誘発する可能性を有するＤＮＡ部分上にＣＰＧモチーフを有する５’−三リン酸塩−ＲＮＡ−ＤＮＡ−ＲＮＡ−３’；ＲＮａｓｅ Ｈに最小の影響を及ぼす、ＤＮＡ部分の長さが４〜６ヌクレオチドである、ＴＬＲ活性化を誘発するための短ＤＮＡ部分上にＣＰＧモチーフを伴う５’−三リン酸塩−ＲＮＡ−ＤＮＡ−３’；ＲＮａｓｅ Ｈを誘発する可能性を有するＤＮＡ部分上にＣＰＧモチーフを持たない５’−三リン酸塩−ＲＮＡ−ＤＮＡ−３’；ＲＮａｓｅ ＨおよびＴＬＲ活性化を誘発する可能性を有するＤＮＡ部分上にＣＰＧモチーフを伴う５’−三リン酸塩−ＲＮＡ−ＤＮＡ−３’、３）免疫刺激で知られる挿入配列モチーフである、５’−三リン酸塩オリゴリボヌクレオチド、４）上述の単一モチーフまたはその組み合わせでセンス鎖に刺激モチーフを配置して、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖を保存すること、および５）上述の単一モチーフまたはその組み合わせで刺激モチーフをセンス鎖に配置して、ＲＮＡｉ活性を維持し、ヌクレアーゼからアンチセンス鎖を保護する最小の化学修飾を導入することを組み合わせて、ＲＩＧ−１活性化を誘発するように変更され得る。
一実施形態において、好ましいオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間連結で、ホスホロチオエート骨格を伴って、または伴わずに、全ての天然の２’−デオキシリボおよび２’−リボヌクレオシド、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）、２’−デオキシ−２’−リボフルオロ（２’−Ｆ）、２’−デオキシ−２’−アラビノフルオロ（２’−アラＦ）糖修飾、およびそれらの組み合わせを有することができる。
一実施形態において、好ましい核酸塩基修飾としては、２−チオＵ、２’−アミノ−Ａ、プソイドウリジン、イノシン、５−Ｍｅ−Ｕ、５−Ｍｅ−Ｃ、化学的に修飾されたＵ類似体が挙げられる。
一実施形態において、好ましいリガンドとしては、脂溶性分子、コレステロールおよび類似体等のＰＫ修飾因子、胆汁酸、ステロイド、循環エンハンサー（４００から始まり、最大６０，０００ａｍｕの異なるモル分子量を有するＰＥＧ）、小分子タンパク質結合剤（例えば、ナプロキセンまたはイブプロフェン用）、および例えば、葉酸、ＧａｌＮＡｃ、およびマンノース用の受容体標的のための標的リガンドが挙げられる。
ｉＲＮＡ剤の評価は、生物系、例えば、試料（例えば、細胞培養物）で、修飾された鎖（その補体を伴う、または伴わないが、好ましくは、その補体とアニールされる）をインキュベートすることを含むことができる。生物試料は、免疫系の構成要素を発現することができる。これは、構成要素に影響を及ぼすｉＲＮＡ剤の同定を可能にする。一実施形態において、ｉＲＮＡ剤が、免疫応答を調節する、例えば、刺激または阻害するかどうかを評価する工程は、サイトカインもしくはインターロイキン等の１つ以上の成長因子、無細胞検定、細胞を用いた検定、または動物検定における細胞表面受容体タンパク質の発現を評価することを含む。代表的な検定法は、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット解析を含む。評価され得る成長因子は、ＴＮＦα、ＩＬ１αおよびβ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＦＮαおよびβ、ならびにＩＦＮγを含む。好ましい実施形態において、検査は、インターロイキンＩＬ−１８、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、およびＩＬ−６の１つ以上の発現を評価することを含む。関連する細胞表面受容体は、ｔｏｌｌ様受容体、例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９を含む。他の好ましい実施形態において、検査は、ｔｏｌｌ様受容体ＴＬ−３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９の１つ以上の発現を評価することを含む。ＴＬＲ９とのリガンド相互作用は、ＮＦκＢの発現を刺激する。したがって、ｉＲＮＡ剤が免疫応答を刺激するかどうかの検査は、ＮＦκＢタンパク質またはｍＲＮＡ発現の検定を含むことができる。
一実施形態において、修飾されたｉＲＮＡ剤が、免疫応答を調節する、例えば、刺激するかどうかを検査する工程は、ｉＲＮＡ剤と免疫系のタンパク質構成要素、例えば、サイトカインもしくはインターロイキン等の成長因子、または細胞表面受容体タンパク質との間の相互作用を検定することを含む。例えば、検査は、修飾されたｉＲＮＡとｔｏｌｌ様受容体、例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９との間の相互作用を検定することを含むことができる。好ましい実施形態の１つにおいて、検査は、ｔｏｌｌ様受容体、例えば、ＴＬＲ−９との相互作用の検定を含む。代表的な検定法としては、免疫細胞化学法により促進されるもの等の、共免疫沈降法、ビーズを用いた共単離法、核酸フットプリント法、および共局在実験が挙げられる。
一実施形態において、候補ｉＲＮＡ剤は、ＲＮＡ干渉経路を通して、特定の遺伝子の発現を配列特異的に阻害する能力を有する。例えば、ｉＲＮＡ剤は、サイトカイン、サイトカイン受容体、またはＴｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９）等の、免疫系のタンパク質構成要素をコードする配列を標的とすることができる。遺伝子発現を阻害するための本発明のｉＲＮＡ剤組成物の能力は、特定のｍＲＮＡについてのノーザンブロット解析もしくはＲＴ−ＰＣＲ、または存在する標的タンパク質量についてのウエスタンブロット解析を含む、種々の技法を使用して測定され得る。さらに別の実施形態において、タンパク質量により影響を受ける表現型を検出することができる。
一実施形態において、候補ｉＲＮＡ剤は、免疫系のタンパク質構成要素と相互作用するか、または相互作用しないように修飾され、また、免疫系に関与しない配列も標的とする。
一実施形態において、候補ｉＲＮＡ剤は、少なくとも１つのリボヌクレオチド修飾（例えば、以下に記載されるような）を含み、修飾の存在は、修飾されたｉＲＮＡ剤が、細胞と接触した時、または対象に投与された時、免疫刺激応答（例えば、修飾を欠損するｉＲＮＡ剤で見られ得るものと比較して）を調節する。好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤の１つ以上の天然塩基は、修飾された塩基によって置換される。より好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤の１つ以上の天然塩基は、修飾された塩基によって置換される。ｉＲＮＡ剤に対する特定の修飾は、薬剤の鎖が分離し、後に免疫系の１つ以上タンパク質構成要素と相互作用することを阻止する。免疫系の応答が効果的に阻止される範囲内で、特定の修飾も、免疫系のタンパク質構成要素との相互作用から二本鎖または一本鎖のｉＲＮＡ剤の相互作用を阻害し得る。
化学修飾は、ヌクレオチド塩基、糖、または骨格に対する修飾を含む。一実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、アデニンの２−置換プリン（例えば、２−アミノ−アデニン）、６−置換プリン、７−デアザ−アルキル−置換プリン、７−デアザ−アルケニル−置換プリン、７−デアザ−アルキニル−置換プリン、またはアデニンではないプリン（例えば、グアニンまたはイノシン）との置換を含む。別の実施形態において、候補ｉＲＮＡ剤は、グアニンのイノシン、アミノプリン、２−置換グアニン、７−デアザ−アルキル−置換グアニン、７−デアザ−アルケニル−置換グアニン、７−デアザ−アルキニル−置換グアニン、またはＯ−６−アルキル化グアニンとの置換を含む。別の実施形態において、候補ｉＲＮＡ剤は、シトシンの５−置換シトシン（例えば、５−メチルシトシン）、Ｎ−４置換シトシン、Ｇ−クランプ、Ｇ−クランプの類似体、２−チオ−シトシン、４−チオ−シトシン、またはウラシルとの置換を含む。一実施形態において、候補ｉＲＮＡ剤は、ウラシルの５−置換ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−メチル−２−チオ−ウラシル、プソイドウリジン、１−アルキルプソイドウリジン、３−アルキルプソイドウリジン、または２−チオ−ウラシルとの置換を含む。一実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、２’−デオキシフルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルコキシアルキル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−（Ｎ−メチル−アセトアミド（ＮＭＡ）、２’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）、またはＧ−クランプ修飾を含む。一実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、リボヌクレオシドを置換する、アラビノース含有ヌクレオシドを含む。別の実施形態において、アラビノース含有ヌクレオシドは、２’−フルオロアラビノース含有ヌクレオシド、または２’−Ｏ−メチルアラビノース含有ヌクレオシドであり得る。別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、リボヌクレオシドを置換する、デオキシヌクレオシドを含む。一実施形態において、デオキシヌクレオシドは、２’−フルオロデオキシヌクレオシド、または２’−Ｏ−メチルデオキシヌクレオシドである。
一実施形態において、免疫選択性ｉＲＮＡ剤は、少なくとも１つの骨格修飾、例えば、ホスホロチオエート、ボラノリン酸塩、メチルホスホン酸、またはジチオエート修飾を含む。別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ剤の末端ヌクレオチドの１つ以上の間の連結において、Ｐ−アルキル修飾を含む。別の実施形態において、センスおよび／またはアンチセンス鎖は、Ｒｐ構造を有する不斉中心リン原子を実質的に持たず、別の実施形態において、センスおよび／またはアンチセンス鎖は、Ｓｐ構造を有する不斉中心リン原子を実質的に持たない。
別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤の１つ以上の末端ヌクレオチドは、糖修飾、例えば、２’または３’糖修飾を含む。一実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、少なくとも２つの糖２’修飾を含む。代表的な糖修飾は、例えば、２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−Ｏ−アルコキシアルキルヌクレオチド、２’−Ｏ−アリルヌクレオチド、２’Ｏ−プロピルヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−デオキシヌクレオチド、２´−デオキシフルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−Ｎ−Ｍｅアセトアミドヌクレオチド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチルヌクレオチド（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−アミノプロピル、２’−ヒドロキシ、２’−アラ−フルオロ、または３’−アミド化（３’−Ｏの代わりに３’−ＮＨ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、延長エチレン核酸（ＥＮＡ）、ヘキソース核酸（ＨＮＡ）、またはシクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）を含む。
一実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、３’糖修飾、例えば、３’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む。好ましくは、３’−Ｏ−Ｍｅ修飾は、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖上である。
いくつかの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、５’−アルキル−ピリミジン、例えば、５’−メチル−ピリミジン（例えば、５’−メチル−ウリジン修飾、または５’−メチル−シトシン修飾）を含む。
本明細書に記載される修飾は、単一の候補ｉＲＮＡ剤上で組み合わされ得る。例えば、一実施形態においてｉＲＮＡ剤の、少なくとも１つのヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結を有し、少なくとも１つのヌクレオチドは２’糖修飾、例えば、２’−Ｏ−Ｍｅもしくは２´−デオキシフルオロ修飾を有する。別の実施形態において、候補ｉＲＮＡ剤の少なくとも１つのヌクレオチドは、５’−Ｍｅ−ピリミジン、および２’糖修飾、例えば、２’−デオキシフルオロもしくは２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を有する。
一実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、脱塩基カチオン修飾等の、カチオン修飾等の核酸塩基修飾を含む。カチオン修飾は、例えば、アルキルアミノ−ｄＴ（例えば、Ｃ６アミノ−ｄＴ）、アルキルアミノ共役、ピロリジン共役、フタルアミド、ポルフィリン、またはヒドロキシプロリノール共役であってもよい。
一実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、センス鎖上に少なくとも１つのリボヌクレオチド修飾、およびアンチセンス鎖上に少なくとも１つのリボヌクレオチド修飾を含み、２つの鎖上のアンチセンス鎖修飾は、異なる。
別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤、例えば、免疫応答を阻害することができるｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ剤の１つ以上のヌクレオチド上での共役を含む場合がある。共役は、例えば、脂溶性分子、テルペン、タンパク質結合剤、ビタミン、糖質、またはペプチドであってもよい。例えば、共役は、ナプロキセン、ニトロインドール（または積み重ね相互作用に起因する別の共役）、葉酸、イブプロフェン、またはＣ５ピリミジンリンカーであってもよい。他の実施形態において、共役は、グリセリド脂質共役（例えば、ジアルキルグリセリド誘導体）、ビタミンＥ共役、またはチオ−コレステロールである。
一実施形態において、共役は、コレステロールであり、コレステロールは、例えば、ピロリジンリンカー、セリノールリンカー、ヒドロキシプロリノールリンカーによる、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖に共役する。他の実施形態において、共役は、ｄＵ−コレステロールであるか、またはコレステロールは、ジスルフィド連結によりｉＲＮＡ剤に共役される。別の実施形態において、共役はコラン酸であり、コラン酸は、センス鎖またはアンチセンス鎖に結合される。一実施形態おいて、コラン酸は、センス鎖およびアンチセンス鎖に結合される。
別の実施形態において、１つ以上のヌクレオチドは、２’−５’連結を有し、好ましくは、，２’−５’連結は、センチ鎖上である。
一実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、好ましくはセンチ鎖上にＬ−糖を含む。
一実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、メチルホスホン酸を含む。
一実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、１つ以上のリボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドと置換することにより修飾された。好ましくは、隣接するデオキシリボヌクレオチドはホスホロチオエート連結により連結され、ｉＲＮＡ剤は、センス鎖またはアンチセンス鎖上に、４つ以上の連続したデオキシリボヌクレオチドを含まない。
いくつかの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、ジフルオロトリル（ＤＦＴ）修飾、例えば、２，４−ジフルオロトリルウラシル、またはグアニジンのイノシンへの置換を含む。
一実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、５’−ウリジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチドを含み、ここで、ウリジンは、２’−修飾されたヌクレオチドまたは５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチドであり、ここで、５’−ウリジンは２’−修飾されたヌクレオチドまたは５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチドであり、ここで、５’−シチジンは、２’−修飾されたヌクレオチドまたは５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチドであり、ここで、５’−ウリジンは、２’−修飾されたヌクレオチドまたは５’−シチジン−シチジン−３’（５’−ＣＣ−３’）ジヌクレオチドであり、ここで、５’−シチジンは、２’−修飾されたヌクレオチドまたは５’−シチジン−ウリジン−３’（５’−ＣＵ−３’）ジヌクレオチドであり、ここで、５’−シチジンは、２’−修飾されたヌクレオチドまたは５’−ウリジン−シチジン−３’（５’−ＵＣ−３’）ジヌクレオチドであり、５’−ウリジンは、２’−修飾されたヌクレオチドである。ｉＲＮＡ剤において、化学修飾されたヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態において、修飾されたヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチド、２´−デオキシフルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド、２’−Ｏ−ＮＭＡ、２’−ＤＭＡＥＯＥ、２’−アミノプロピル、２’−ヒドロキシ、または，２’−アラ−フルオロ、または３’−アミド化（３’−Ｏの代わりに３’−ＮＨ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、延長核酸（ＥＮＡ）、ヘキソース核酸（ＨＮＡ）、またはシクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）であってもよい。
一実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、例えば、ｉＲＮＡ剤の一端が、３’または５’のオーバーハングを有し、ｉＲＮＡ剤のもう一端が平滑末端である、単一のオーバーハングを有する。別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、例えば、ｉＲＮＡ剤の両端が、ジヌクレオチドオーバーハング等の３’または５’のオーバーハングを有する、二重オーバオーハングを有する。別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤の両端は、平滑末端を有する。
一実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖を含み、アンチセンスＲＮＡ鎖は、長さが１８〜３０ヌクレオチドである。別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、アンチセンスＲＮＡ鎖の３’末端であってもよい、１〜４つの不対ヌクレオチドを有するヌクレオチドオーバーハングを含み、ヌクレオチドオーバーハングは、ヌクレオチド配列５’−ＧＣ−３’または５’−ＣＧＣ−３’を有し得る。不対ヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエートジヌクレオチド連結を有してもよく、不対のヌクレオチドの少なくとも１つは、２’位置で化学的に修飾され得る。一実施形態において、候補ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は、センス鎖およびアンチセンス鎖の１つまたは両方上にホスホロチオエート連結を含む。好ましい実施形態において、候補ｉＲＮＡ剤は、センスまたはアンチセンス剤の５’または３末端のヌクレオチド１から５までの間にホスホロチオエート連結を含む。
一実施形態において、アンチセンスＲＮＡ鎖およびセンスＲＮＡ鎖は、リンカーと連結される。化学的リンカーは、ヘキサエチレングリコールリンカー、ポリ−（オキシホスフィニコ−オキシ−１，３−プロパンジオール）リンカー、アリルリンカー、またはポリエチレングリコールリンカーであってもよい。アンチセンス鎖とセンス鎖を連結するためのリンカーの使用は、生体内鎖分離を阻害し、これによって、免疫刺激を阻害する。
別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤の１つ以上の修飾は、生物系における（例えば、血流または血清試料における）一本鎖ｉＲＮＡ剤に対する二本鎖ｉＲＮＡ剤の比率を増加させることができる。このような修飾は、センス鎖とアンチセンス鎖間の解離定数（ＫＤ）を減少させ得る。いくつかの実施形態において、生物系において、一本鎖ｉＲＮＡ剤に対する二本鎖ｉＲＮＡ剤の比率を増加させる修飾は、２本の鎖を一緒に結合するヘキサエチレングリコールリンカー、ポリ−（オキシホスフィニコ−オキシ−１，３−プロパンジオール）リンカー、アリルリンカー、またはポリエチレングリコールリンカー等の、化学的リンカーである。一実施形態において、リンカーは、エステルを含み、リンカーは、エステラーゼによって切断され得る。いくつかの実施形態において、修飾は、２’−Ｆ、ＬＮＡ、ＥＮＡ、２’−Ｏ−ＭＯＥ、ならびにＣ−５−プロピニルピリミジンまたはＧ−クランプおよびその類似体等の、高親和性化学的修飾である。さらに別の実施形態において、修飾は、化学的架橋、例えば、ジスルフィド含有架橋である。
別の実施形態において、免疫選択性ｉＲＮＡ剤は、少なくとも２つの修飾を含むことができる。修飾は、相互に異なることができ、二本鎖のｉＲＮＡ剤の異なるＲＮＡ鎖に適用され得る。例えば、センス鎖は、少なくとも１つの修飾を含むことができ、アンチセンス鎖は、センス鎖上の修飾または複数の修飾と異なる修飾を含むことができる。別の実施形態において、センス鎖は、少なくとも２つの修飾を含むことができ、アンチセンス鎖は、センス鎖上の２つの修飾と異なる、少なくとも１つの修飾を含むことができる。したがって、センス鎖は、複数の異なる修飾を含むことができ、アンチセンス鎖は、さらに複数の修飾を含むことができ、そのいくつかは、センス鎖上の修飾と同一または異なる。
一態様において、本発明は、免疫系のタンパク質構成要素の１つに特異的に結合し、免疫カスケードを阻害するか、または刺激するかのいずれかである、ｉＲＮＡ剤を設計する方法に関する。方法は、センス鎖、ならびにセンス鎖とハイブリッド形成するのに十分に相補的であるアンチセンス鎖を含むｉＲＮＡ剤を設計することを含んでもよく、センス鎖および／またはアンチセンス鎖上のヌクレオチドの１つ以上が、本明細書に記載されるように修飾されるように鎖を設計する。ｉＲＮＡ剤は、さらに合成され、例えば、上述の免疫系のタンパク質構成要素に結合するために、生体外または生体内系で試験され得る。例えば、ｉＲＮＡ剤は、例えば、サイトカインもしくはインターロイキン等の成長因子、または細胞表面受容体の免疫系の構成要素との相互作用について検定することにより検査され得る。検定は、ｉＲＮＡ剤の細胞への導入、免疫系の構成要素を発現するのに好適な条件下での細胞の維持、およびｉＲＮＡ剤が、例えば、免疫細胞化学技法により促進されるもの等の共免疫沈降実験、または共局在実験により、免疫系の構成要素と相互作用することができるかどうかの決定を含むことができる。細胞は、哺乳類細胞であってもよい。ｉＲＮＡ剤は、細胞検定で、免疫刺激または免疫阻害について検査され得る。ｉＲＮＡ剤は、マウス等の哺乳類にｉＲＮＡ剤を投与した後、拡大もしくは細胞増殖の増加について、またはＩＬ１０、ＩＬ１２、および／またはＩＬ６等の１つ以上のインターロイキンタンパク質の産生の増加について、膵臓を調べることによって、生体内系で検査され得る。
いくつかの実施形態において、候補ｉＲＮＡ剤は、第１の系、例えば、無細胞系または細胞系で検査された後、再検査される。再検査は、同じ、または異なる検定であってもよい。例えば、同じ、もしくは異なる細胞検定、または無細胞検定は、活性を確認するために使用されるか、または動物系が、活性（例えば、遺伝子サイレンシング活性、または免疫系の刺激もしくは阻害）を確認するために使用され得る。いくつかの実施形態において、候補ｉＲＮＡ剤は、無細胞系または細胞系で最初に検査され、その後、動物系で再検査される。
一態様において、本発明は、少なくとも１つのリボヌクレオチド修飾を含むｉＲＮＡ剤、例えば、上述のリボヌクレオチド剤を特徴とし、修飾されたｉＲＮＡ剤が細胞と接触した時、または対象、例えば、ヒト等の哺乳類対象に投与された時、修飾の存在が、免疫刺激応答（例えば、修飾を欠損するｉＲＮＡ剤で見られ得るものと比較して）を阻害または刺激する。好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤の１つ以上の自天塩基は、修飾された塩基によって置換される。
一態様において、本発明は、少なくとも１つのリボヌクレオチド修飾を有する候補一本鎖ｉＲＮＡ剤を提供することと、候補一本鎖ｉＲＮＡ剤を無細胞系、細胞系、または動物系に接触させる、および未修飾一本鎖ｉＲＮＡ剤と接触させることと、無細胞系、細胞系、または動物系における免疫応答と比較した、無細胞系、細胞系、または動物系における免疫応答を評価することとを含む、ｉＲＮＡ剤を評価する方法を特徴とする。候補一本鎖ｉＲＮＡ剤は、対照より低い、またはそれ上回る程度に免疫応答を刺激する。例えば、未修飾ｉＲＮＡ剤は、免疫系応答を調節するｉＲＮＡ剤であることが決定される。一実施形態において、候補一本鎖ｉＲＮＡ剤は、長さが１５〜２０００ヌクレオチドである（例えば、長さが１７、１９、２１、２３、２５、２７、２８、２９、３０、１００、５００、１０００、または１５００ヌクレオチド）。
一態様において、本発明は、免疫系を阻害するか、もしくは刺激するかのいずれかであり、かつＲＩＳＣ媒介性ＲＮＡ干渉経路を介して分解に関連する治療のｍＲＮＡを配列特異的に標的とするｉＲＮＡ剤である、二重機能を有するｉＲＮＡ剤に関する。免疫選択性ｉＲＮＡ剤（例えば、免疫刺激を阻害する、または刺激するｉＲＮＡ剤）は、本明細書に開示されるプロセス、例えば、標的とアニールするのに標的核酸に対して十分に相補的である第１のオリゴヌクレオチド、および第１のオリゴヌクレオチドとアニールするのに十分に相補的である第２のオリゴヌクレオチドを提供するプロセスにより調製される。第１および／または第２のオリゴヌクレオチドは、上述の１つ以上の修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド連結を含む。アンチセンス鎖およびセンス鎖の１つまたは両方、または好ましくは、アニールされたアンチセンス鎖およびセンス鎖が、例えば、検査対象に投与される時、免疫応答を調節する、例えば、刺激または阻害する能力について、例えば、上述のように検査される。例えば、ｉＲＮＡ剤が、予め選択された程度、例えば、１つ以上の修飾されたヌクレオチドを欠損するｉＲＮＡ剤の程度に免疫応答を刺激しない場合、薬剤は、免疫刺激を阻害すると決定される。修飾されたｉＲＮＡ剤、例えば、免疫刺激を阻害または刺激すると決定された薬剤は、例えば、ＲＮＡ剤の未修飾型と同程度に、例えば、ＲＮＡ干渉の機構により標的ｍＲＮＡの発現を低減することができるかどうかを決定するために、さらに検査される。
別の実施形態において、本発明は、免疫系の特定の構成要素、例えば、ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）またはｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）における遺伝子のサイレンシングに関する。この実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、構成要素におけるｍＲＮＡの領域に相補的であるように設計され、ｉＲＮＡ剤は、ＲＮＡ干渉の機構を通して標的の発現を低減する。
さらに別の態様において、本発明は、上述の免疫選択性ｉＲＮＡ剤および医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物に関する。医薬的に許容される担体は、リン酸緩衝生理食塩水等の水性溶液であるか、またはリポソーム、カプシド、カプソイド、高分子ナノカプセル、または高分子マイクロカプセル等の、ミセル構造を含んでもよい。
またさらなる態様において、本発明は、対象の疾病または疾患を治療するための方法に関する。方法は、疾病を有する、またはそれを発達するリスクを有する対象を同定することと、上述の修飾されたヌクレオチドまたは連結の１つ以上、および医薬的に許容される担体を有する免疫選択性ｉＲＮＡ剤を含有する医薬組成物を投与することとを含む。対象は、上述のサイトカインまたは細胞表面受容体、（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体）等の成長因子の発現の増加を監視すること等により、免疫系、例えば、免疫刺激または免疫阻害応答への影響について監視され得る。関心のサイトカインは、対象のＴ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、または天然キラー細胞から発現するものであり得る。検定は、対象からの血液または血清試料を使用して実施され得る。疾病または疾患は、例えば、臓器、組織、または骨髄移植を受けた患者において、免疫系を刺激することが特に望ましくないものであり得る。別の代替例において、疾病または疾患は、例えば、癌またはウイルス疾病を伴う患者において、免疫系を刺激することが特に望ましくないものであり得る。一実施形態において、対象は免疫不全であり、ヌクレオチド修飾を含むｉＲＮＡ剤は、ヌクレオチド修飾を含まないｉＲＮＡ剤を上回る程度に細胞の免疫応答を刺激する。対象は、ヒト等の哺乳類であってもよい。
好ましい実施形態において、免疫選択性ｉＲＮＡ剤の投与は、対象に存在する疾病または疾患の治療のためである。別の好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤の投与は、予防的治療のためである。
したがって、本発明の目的は、抗ウイルス反応、特にＩ型ＩＦＮ反応を刺激することができるポリヌクレオチド／オリゴヌクレオチドを提供することである。本発明の別の目的は、ウイルス感染症等の疾病および疾患の阻止ならびに治療において、患者の抗ウイルス反応、特にＩ型ＩＦＮ産生を誘発することができる医薬的組成物を提供することである。本発明の目的は、腫瘍を治療するための医薬組成物を提供することでもある。
疾病および／または疾患としては、これらに限定されないが、腫瘍、アレルギー、多発性硬化症、および免疫疾患が挙げられる。
感染症としては、これらに限定されないが、ウイルス感染症、細菌感染症、炭疽病、寄生虫感染症、真菌症、およびプリオン感染症が挙げられる。ウイルス感染症としては、これらに限定されないが、肝炎Ｃ、肝炎Ｂ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ＨＩＶ−ＡＩＤＳ、ポリオウイルス、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、および天然痘ウイルスが挙げられる。阻害の標的とされ得る（＋）鎖ＲＮＡウイルスの例としては、ピコルナウイルス、カリシウイルス、ノダウイルス、コロナウイルス、アルテリウイルス、フラビウイルス、およびトガウイルスが挙げられる。ピコルナウイルス類の例としては、エンテロウイルス（ポリオウイルス１）、ライノウイルス（ヒトライノウイルス１Ａ）、ヘパトウイルス（肝炎Ａウイルス）、カルジオウイルス（脳心筋炎ウイルス）、アフトウイルス（口蹄疫ウイルスＯ）、およびパレコウイルス（ヒトエコーウイルス２２）が挙げられる。カリシウイルス類の例としては、ベシクロウイルス（ブタ水泡性発疹ウイルス）、ラゴウイルス（ウサギ出血性疾病ウイルス）、「ノーウォーク様ウイルス」（ノーウォークウイルス）、「サッポロ様ウイルス」（サッポロウイルス）、および「肝炎Ｅ様ウイルス」（肝炎Ｅウイルス）が挙げられる。ベータノダウイルス（シマアジ神経壊死症ウイルス）は、代表的なノダウイルスである。コロナウイルス類は、コロナウイルス（トリ感染症気管支炎ウイルス）およびトロウイルス（ベルンウイルス）を含む。アルテリウイルス類（ウマ動脈炎ウイルス）は、代表的なアルテリウイルス（ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄｕｓ）である。トガウイルス類は、アルファウイルス（シンドビスウイルス）およびルビウイルス（風疹ウイルス）を含む。最後に、フラビウイルス類は、フラビウイルス（黄熱ウイルス）およびヘパシウイルス（肝炎Ｃウイルス）を含む。
特定の実施形態において、ウイルス感染症は、慢性肝炎Ｂ、慢性肝炎Ｃ、感染症、ＲＳＶ感染症、ＨＳＶ感染症、ＶＳＶ感染症、ＣＭＶ感染症、およびインフルエンザ感染症から選択される。
一実施形態において、阻止および／または治療される感染症は、ウイルスおよび／または細菌により引き起こされる上気道感染症である。別の実施形態において、阻止および／または治療される感染症は、鳥インフルエンザである。
細菌感染症としては、これらに限定されないが、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、シュードモナス菌が挙げられる。
一実施形態において、細菌感染症は、細胞内細菌感染症である。細胞内細菌感染症は、マイコバクテリア（結核）等の細胞内細菌、クラミジア、マイコプラズマ、リステリア、および黄色ブドウ球菌等の通性細胞内細菌による感染症を指す。
寄生虫感染症としては、これらに限定されないが、寄生虫感染症、特に腸内寄生虫感染症が挙げられる。
腫瘍は、良性および悪性腫瘍（すなわち、癌）の両方を含む。
癌としては、これらに限定されないが、胆道癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、上皮内新生物、白血病、リンパ腫、肝臓癌、肺癌、メラノーマ、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、および腎癌が挙げられる。
特定の実施形態において、癌は、毛様細胞白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞白血病、慢性骨髄白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、悪性メラノーマ、扁平上皮細胞癌腫、腎細胞癌腫、前立腺癌腫、膀胱細胞癌腫、乳癌腫、卵巣癌腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肝細胞癌腫、基底細胞癌、結腸癌腫、子宮頸部異形成、およびカポジ肉腫（ＡＩＤＳ関連および非ＡＩＤＳ関連）から選択される。
アレルギーとしては、これらに限定されないが、呼吸アレルギー、接触アレルギー、および食物アレルギーが挙げられる。
免疫疾患としては、これらに限定されないが、自己免疫疾患、免疫不全、および免疫抑制が挙げられる。
自己免疫疾患としては、これらに限定されないが、真性糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形関節炎、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、ライ反転反応、ライ性結節性紅斑、自己免疫ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球癆貧血、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブン−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、類肉腫症、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、および間質性肺線維症が挙げられる。免疫不全症としては、これらに限定されないが、自発性免疫不全症、後天性免疫不全症（ＡＩＤＳ）、薬物誘発性免疫不全症（移植に使用される免疫抑制、および癌治療に使用される化学療法剤により誘発されるもの等）、慢性血液透析、外傷、および外科手技により引き起こされる免疫抑制が挙げられる。
免疫抑制は、これに限定されないが、細胞障害性化学療法による骨髄抑制を含む。
一実施形態において、医薬組成物は、腫瘍ワクチンである。本発明に記載されるｉＲＮＡ剤、または細菌ＲＮＡは、ＲＩＧ−Ｉへの結合を通して腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する、腫瘍細胞によりＩ型ＩＦＮ１ ＩＬ−１８および／またはＩＬ−１β産生を誘発する、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、およびγδＴ細胞等の先天性免疫のエフェクター細胞を直接的および／または間接的に活性化する、ならびに／または抑制因子のＴ細胞を直接的および／または間接的に不活性化し、これによって、腫瘍細胞成長の阻害および／または破壊をもたらし得る。
本発明に記載されるｉＲＮＡ剤または細菌ＲＮＡ等のＲＩＧ−Ｉリガンドで刺激された腫瘍細胞は、腫瘍ワクチンとしても使用され得る。
好ましい実施形態において、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、生理的条件、特に細胞内の生理的条件下で、任意の分子内または分子間の二本鎖構造を自身で形成することができる、任意の配列を含有しない一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、ｓｓＲＮＡのヌクレオチド配列は、疾病／疾患関連ＲＮＡに相補的である。
一実施形態において、疾病／疾患関連ＲＮＡは、疾病／疾患関連遺伝子のｍＲＮＡである。別の実施形態において、疾病／疾患関連ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである。疾病／疾患関連ＲＮＡは、内因性細胞ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、細菌、真菌、または寄生虫等の侵入微生物または生物からのＲＮＡであってもよい。
相補性の程度は、好ましくは、少なくとも５０％、６０％、７０％、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、さらにより好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、そして最も好ましくは１００％である。
一態様において、本発明は、修飾を含まないｄｓｉＲＮＡ剤と比較して、ｄｓｉＲＮＡ剤の解離を阻害する１つ以上の修飾を含むｄｓｉＲＮＡ剤をヒトに投与することにより、ヒトにおいて、一本鎖ｉＲＮＡ（ｓｓｉＲＮＡ）剤に対する二本鎖ｉＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）の比率を増加するための方法を特徴とする。一実施形態において、修飾は、ヘキサエチレングリコールリンカー、ポリ（オキシホスフィニコ−オキシ−１，３−プロパンジオール）リンカー、アリルリンカー、またはポリエチレングリコールリンカー等の、化学的リンカーを含む。別の実施形態において、修飾は、修飾を含まないｄｓｉＲＮＡと比較して、ｄｓｉＲＮＡの融点温度を上昇させる。このような修飾は、ロックド核酸、Ｇ−クランプ、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メトキシエチル、２−チオ−ピリミジン、２−アミノ−アデニン、またはプソイドウリジンを含むことができる。いくつかの実施形態において、ｄｓｉＲＮＡ剤の修飾は、ｄｓｉＲＮＡ剤のセンス鎖のみで、またはｄｓｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖のみで生じる。
一態様において、本発明は、本明細書に記載される、免疫選択性ｉＲＮＡ剤で治療するのに適した患者を選択する方法を特徴とする。一実施形態において、患者の選択は、免疫刺激または免疫抑制のいずれかの必要性に基づく。別の実施形態において、選択は、免疫系に関与しない遺伝子の発現の減少を必要とし、免疫系機能の増加または減少も必要とする患者の同定に基づく。免疫系機能に関する患者の必要性は、どの修飾が、治療免疫選択性ｉＲＮＡ剤に組み込まれるかを決定する。一態様において、本発明は、免疫系を刺激する、免疫選択性ｉＲＮＡ剤と特徴とする。例えば刺激性免疫選択性ｉＲＮＡ剤は、１つ以上の修飾、例えば、免疫系を刺激するための、本明細書に記載される修飾を含む。例えば、修飾されたｉＲＮＡ剤は、１つ以上の修飾を含まないｉＲＮＡ剤を上回る程度に、免疫系を刺激する。これらの刺激性免疫選択性ｉＲＮＡ剤は、免疫不全の患者に投与されるか、または第２の療法の免疫不全効果を相殺するように、第２の療法を用いて投与され得る。第２の療法は、化学療法、または例えば、抗生物質であり得る。刺激性免疫選択性ｉＲＮＡ剤は、腫瘍、自己免疫疾患、気道炎症（例えば、喘息）、アレルギー（例えば、食物または呼吸アレルギー）、または細菌、真菌、寄生虫、ウイルスもしくはウイルス様体粒子、またはプリオン等の、病原性疾病を有する、または発達するリスクを有する対象に投与され得る。
定義
「リンカー」または「スペーサー」という用語は、概して、糖、塩基、または骨格を通して、共有結合または非共有結合によりオリゴリボヌクレオチドに結合され得る、任意の部分を指す。リンカー／スペーサーは、２つ以上のヌクレオシドを結合するために使用されるか、またはオリゴリボヌクレオチドの５’および／または３’末端ヌクレオチドに結合され得る。このようなリンカーは、非ヌクレオチドリンカーまたはヌクレオチドリンカーのいずれかであり得る。
「非ヌクレオチドリンカー」という用語は、概して、共有結合または非共有結合によりオリゴリボヌクレオチドに結合され得る、ヌクレオチド連結以外の化学的部分を指す。好ましくは、このような非ヌクレオチドリンカーは、長さが約２オングストローム〜約２００オングストロームであり、シスまたはトランス配置（例えば、ｄ（Ｔ）ｎ、ここでｎは１〜１０である）であるか、または非ヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されるリンカー、例えば、任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、またはヘテロアリールｌ）のいずれかであってもよい。
「非ヌクレオチドリンカー」という用語は、概して、リン酸、非リン酸、荷電された、または中性群（例えば、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、ジチオリン酸、アルキルリン酸（例えば、メチルホスホン酸）、アミド、エステル、ジスルフィド、チオエーテル、オキシム、および隣接するヌクレオシド間のヒドラゾン連結からなる、それらの糖を通して２つのヌクレオシドを結合する化学的連結（例えば３’−３’、２’−３’，２’−５’、３’−５’）を指す。
一実施形態において、２つのオリゴヌクレオチド間のリンカー／スペーサーは、切断可能な連結基、例えば、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼ等の、生物に存在する酵素により生体分解可能であるか、細胞内部に高レベルで存在するグルタチオン等により、酸性ｐＨで、または還元条件下で切断可能である基である。いくつかの代表的な切断可能な連結基は、これらに限定されないが、ジスルフィド、アミド、エステル、ペプチド連結、およびリン酸ジエステルを含む。２００４年１１月９日に出願された同時係属米国特許出願第１０／９８５，４２６号明細書は、切断可能基を含むスペーサーとしての用途可能である、切断可能な連結を記載している。
切断可能な連結基は、スペーサーに対して内部であり得るか、またはスペーサーの末端の一端もしくは両端に存在し得る。一実施形態において、切断可能な連結基は、オリゴヌクレオチドの１つとスペーサーとの間にある。一実施形態において、切断可能な連結基は、スペーサーの両端上に存在する。一実施形態において、切断可能な連結基は、スペーサーに対して内部である。
「ハロ」という用語は、任意のフッ素、塩素、臭素、またはヨウ素の任意の基を指す。
「脂肪族」という用語は、炭素原子、水素原子、ハロゲン原子、酸素、窒素、または他の原子の任意の組み合わせを含有してもよく、任意で、１つ以上の単位の不飽和、例えば、二重および／または三重結合を含有し得る、非芳香族部分を指す。脂肪族基は、直鎖、分枝鎖、または環式であってもよく、好ましくは、約１〜２４個の炭素原子の間、より典型的には、約１〜１２個の間の炭素原子を含有する。脂肪族炭化水素基に加え、脂肪族基は、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、およびポリイミン等の、例えば、ポリアルコキシアルキルを含む。このような脂肪族基は、さらに置換され得る。
「アルキル」という用語は、示される数の炭素原子を含有する、直鎖または分枝鎖であってもよい炭化水素を指す。例えば、Ｃ１−Ｃ１２アルキルは、基がその中に１〜１２（包括的）炭素原子を有することを示す。「ハロアルキル」という用語は、１つ以上の水素原子が、ハロにより置換されるアルキルを指し、全ての水素が、ハロと置換されたアルキル部分（例えば、パーフルオロアルキル）を含む。アルキルおよびハロアルキル基は、任意で、Ｏ、Ｎ、またはＳで挿入され得る。「アラルキル」という用語は、アルキル水素原子がアリール基と置換されるアルキル部分を指す。アラルキルは、１つ以上の水素原子が、アリール基と置換された基を含む。「アラルキル」の例としては、ベンジル基、９−フルオレニル基、ベンズヒドリル基、およびトリチル基が挙げられる。
「アルケニル」という用語は、２〜８個の炭素原子を含有し、１つ以上の二重結合を有することを特徴とする、直鎖または分枝鎖炭化水素を指す。典型的なアルケニルの例としては、これらに限定されないが、アリル基、プロぺニル基、２−ブテニル基、３−ヘキセニル基、および３−オクテニル基が挙げられる。「アルキニル」という用語は、２〜８個の炭素原子を含有し、１つ以上の三重結合を有することを特徴とする、直鎖または分枝鎖炭化水素を指す。典型的なアルキニルのいくつかの例は、エチニル、２−プロピニル、および３−メチルブテニル、およびプロパギルである。ｓｐ２およびｓｐ３炭素は、任意で、それぞれ、アルケニル基およびアルキニル基の結合点としての役割をはたし得る。
「アルキルアミノ」および「ジアルキルアミノ」という用語は、それぞれ、−ＮＨ（アルキル）および−Ｎ（アルキル）２基を指す。「アラルキルアミノ」という用語は、−ＮＨ（アラルキル）基を指す。「アルコキシ」という用語はＯ−アルキル基を指し、「シクロアルコキシ」および「アラルコキシ」という用語は、それぞれ、−Ｏ−シクロアルキル基およびＯ−アラルキル基を指す。「シロキシ」という用語は、Ｒ３ＳｉＯ−基を指す。「メルカプト」という用語は、ＳＨ基を指す。「チオアルコキシ」という用語は、−Ｓ−アルキル基を指す。
「アルキレン」という用語は、二価のアルキル（すなわち、−Ｒ−）、例えば、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を指す。「アルキレンジオキソ」という用語は、Ｒがアルキレンを表す、構造−Ｏ−Ｒ−Ｏ−の二価の化学種を指す。
「アリール」という用語は、芳香族単環式、二環式、または三環式炭化水素環系を指し、ここで、任意の環原子は、置換され得る。アリール部分の例としては、これらに限定されないが、フェニル、ナフチル、アントラセニル、およびピレニルが挙げられる。
本明細書で使用される、「シクロアルキル」という用語は３〜１２個の炭素を有する、飽和環式、二環式、三環式、または多環式炭化水素基を含み、ここで、任意の環原子は置換され得る。本明細書に記載されるシクロアルキル基は、縮合環も含有し得る。縮合環は、共通の炭素−炭素結合、または共通の炭素原子を共有する環（例えば、スピロ縮合環）である。シクロアルキル部分の例としては、これらに限定されないが、シクロヘキシル、アダマンチル、およびノルボルニルが挙げられる。
「ヘテロシクリル」という用語は、単環式の場合、１〜３個ヘテロ原子、二環式の場合、１〜６個のヘテロ原子、または三環式の場合、１〜９個のヘテロ原子を有する、非芳香族３〜１０員単環式、８〜１２員二環式、または１１〜１４員三環式環系を指し、ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳ（例えば、単環式、二環式、または三環式の場合、それぞれ、炭素原子および１〜３、１〜６、または１〜９個のヘテロ原子のＮ、ＯもしくはＳ）から選択され、ここで、任意の環原子は、置換され得る。本明細書に記載されるヘテロシクリル基も、縮合環を含有し得る。縮合環は、共通の炭素−炭素結合、または共通の炭素原子を共有する環（例えば、スピロ縮合環）である。ヘテロシクリルの例としては、これらに限定されないが、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ピぺリジニル、モルフォリノ、ピロリニル、およびピロリジニルが挙げられる。
「ヘテロアリール」という用語は、単環式の場合、１〜３個ヘテロ原子、二環式の場合、１〜６個のヘテロ原子、または三環式の場合、１〜９個のヘテロ原子を有する、芳香族５〜８員単環式、８〜１２員二環式、または１１〜１４員三環式環系を指し、ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳ（例えば、単環式、二環式、または三環式の場合、それぞれ、炭素原子および１〜３、１〜６、または１〜９個のヘテロ原子のＮ、ＯもしくはＳ）から選択され、ここで、任意の環原子は、置換され得る。本明細書に記載されるヘテロアリール基も、共通の炭素−炭素結合を共有する縮合環を含有し得る。
「オキソ」という用語は、炭素と結合する時にカルボニル、窒素と結合する時にＮ−オキシド、および硫黄と結合する時にスルホキシドまたはスルホンを形成する、酸素原子を指す。
「アシル」という用語は、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、またはヘテロアリールカルボニル置換基を指し、いずれも、置換基でさらに置換され得る。
「置換基」という用語は、その基の任意の原子で、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロシクリル基、ヘテロシクロアルケニル基、シクロアルケニル基、アリール基、またはヘテロアリール基上で置換される基を指す。好適な置換基は、これらに限定されないがアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、ＳＯ３Ｈ、硫酸、リン酸、パーフルオロアルキル、パーフルオロアルコキシ、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、カルボキシル、オキソ、チオキソ、イミノ（アルキル、アリール、アラルキル）、Ｓ（Ｏ）ｎアルキル（ここで、ｎは０〜２）、Ｓ（Ｏ）ｎアリール（ここで、ｎは０〜２）、Ｓ（Ｏ）ｎヘテロアリール（ここで、ｎは０〜２）、Ｓ（Ｏ）ｎヘテロシクリル（ここで、ｎは０〜２）、アミン（モノ−、ジ−、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびそれらの組み合わせ）、エステル（アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル）、アミド（モノ−、ジ−、アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびそれらの組み合わせ）、スルホンアミド（モノ−、ジ−、アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびそれらの組み合わせ）、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、非置換ヘテロシクリル、および非置換シクロアルキルを含む。一態様において、基上の置換基は、独立して、前述の置換基の任意の１つの単一の、または任意のサブセットである。
「保護された」部分とは、反応性官能基、例えば、ヒドロキシル基もしくはアミノ基、または官能基の反応性が結合された保護基の存在により一時的に遮断される、１つ以上の官能基を有する分子のクラス、例えば糖類を指す。本明細書に記載される単量体または方法に有用な保護基は、例えば、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），１９８１に見ることができ、参照により本明細書に援用される。
「プロドラッグ」という用語は、内因性酵素の作用、または他の化学物質および／または状態により、その身体内または細胞内で活性化状態（すなわち、薬物）に変換される、不活性状態で調製される治療薬を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ型は、１９９３年１２月９日に公開されたＧｏｓｓｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．の国際公開第９３／２４５１０号パンフレット、またはＩｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．の国際公開第９４／２６７６４号パンフレットならびに米国特許第５，７７０，７１３号明細書に公開される方法に従い、ＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）リン酸］誘導体として調製される。
「医薬的に許容される塩」とは、本発明のオリゴマー化合物の生理学的および医薬低に許容される塩、すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を維持し、それに望ましくない毒性作用を付与しない塩を指す。オリゴヌクレオチドにおいて、医薬的に許容される塩およびそれらの使用の好ましい例は、米国特許第６，２８７，８６０号明細書にさらに記載されており、本明細書にその全体が援用される。
リガンド
本発明において、リガンドは、芳香族基、アラルキル基、またはステロイド、胆汁酸、ピリドキサール、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、多環式化合物、クラウンエーテル、干渉物質、切断分子、タンパク質結合剤、糖質、または任意で置換された飽和５−員環の基である。特定の場合において、リガンドは、アルキル基、例えば、２−アリールプロパノイル部分である。リガンドの構造特徴は、リガンドが、生体内の少なくとも１つのタンパク質に結合するように選択される。特定の実施形態において、リガンドの構造特徴は、リガンドが、血清、脈管、または細胞タンパク質に結合するように選択される。特定の実施形態において、リガンドの構造特徴は、アルブミン、免疫グロブリン、リポタンパク質、α−２−マクログロブリン、またはα−１−グリコタンパク質への結合を促進する。
多くのステロイドが当該技術分野で公知であり、本発明に適している。ステロイドの代表的な例としては、コレステロール、５β−コラン酸、プロゲステロン、アルドステロン、デヒドロアルドステロン、イソアンドロステロン、エステロン（ｅｓｔｅｒｏｎｅ）、エストラジオール、エルゴステロール、デヒドロエルゴステロール、ラノステロール、４−コレステン−３−オン、ググルステロン、テストステロン、ノルテストステロン、ホルメスタン、ヒドロキシエクジソン、ケトエストリオール、コルチコステロン、ジエンエストロール、ジヒドロキシプログナノン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｅｇｎａｎｏｎｅ）、プレグナノン（ｐｒｅｇｎａｎｏｎｅ）、コポルモン（ｃｏｐｏｒｎｍｏｎ）、エキレニン、エキリン、エストリオール、エチニルエストラジオール、メストラノール、モクセストロール、ミタトリエンジオール、キネストラジオール、キネストロール、ヘルボン酸、プロトスタジエン（ｐｒｏｔｏｓｔａｄｉｅｎｅ）、フシジン酸、シクロアルテノール、トリカロール（ｔｒｉｃａｌｌｏｌ）、ククルビタシンセドレロン（ｃｕｃｕｒｂｉｔａｎｉｎ ｃｅｄｒｅｌｏｎｅ）、オイホール、ダメレンジオール（ｄａｍｍｅｒｅｎｅｄｉｏｌ）、パルケオール、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、パラメタゾン、ベータメタゾン、コルチゾン、フルオシノニド、フルオロメトロン、ハルシノニド、およびブデソニド、または１つ以上のヒドロキシル、ハロゲン、アミノ、アルキルアミノ、アルキル、カルボン酸、エステル、アミド、カルボニル、アルコキシル、またはシアノが挙げられる。
多くの胆汁酸が当該技術分野で公知であり、本発明に適している。胆汁酸は、大半の脊椎動物の胆汁中のグリシンまたはタウリンと共役して生じ、これらのいくつかは、医薬に用途を見出し得る。したがって、いくつかの胆汁酸は、それらの固有の薬理特性により、利胆薬として使用される（例えば、Ｊａｍｅｓ Ｅ．Ｆ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（ｅｄｉｔｏｒ） Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ Ｔｈｅ Ｅｘｔｒａ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，３０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９９３），１３４１頁を参照のこと）。胆汁酸の代表的な例としては、コール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、およびケノデオキシコール酸が挙げられる。本発明に適したさらなる胆汁酸は、米国特許第５，６４１，７６７号、同第５，６５６，２７７号、同第５，６１０，１５１号、同第５，４２８，１８２号、および同第３，９１０，８８８号の各明細書に記載されるものを含む。
多くの脂質が当該技術分野で公知であり、本発明に適している。脂質の代表的な例としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、トリアシルグリセロール、ホスホアシルグリセロール、スフィンゴ脂質、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、セステルテルペン、トリテルペン、およびテトラテルペンが挙げられる。
多くの芳香族化合物が当該技術分野で公知であり、本発明に適している。芳香族化合物の代表的な例としては、任意で置換されたフェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、ピレニル、ピリジニル、キノリニル、アクリジニル、フェナントリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、１，７−フェナントロリニル、インドリル、チアナフテニル、ベンズオキサゾリル、ベンゾフラニル、１，２−ベンズイソキサゾリル、ベンズイミダゾリル、ピロリル、チオフェニル、イソキサゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、およびフラニルが挙げられる。
多くの炭水化物が当該技術分野で公知であり、本発明に適している。炭水化物の代表的な例としては、エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、およびタロース、またはこれらのいずれか間の１，４グリコシド連結を介して形成される二糖類もしくは三糖類が挙げられる。特定の場合において、含水化物は、ヘキソースまたはペントースである。
多くの多環式化合物が当該技術分野で公知であり、本発明に適している。多環式化合物の代表的なクラスは、二環式化合物を含み、第１および第２の環が、独立して、Ｏ、Ｎ、またはＳからなる基から選択される、０、１、２、または３個ヘテロ原子を含有する、３、４、５、または６員飽和または不飽和炭素環である。特定の場合において、第１の環は芳香族環である。特定の場合において、第２の環は芳香族環である。特定の場合において、両方の環は、飽和である。特定の場合において、第１の環はヘテロ原子を含有しない。特定の場合において、第２の環はヘテロ原子を含有する。特定の場合において、第１の環は窒素原子を含有する。特定の場合において、第２の環は窒素原子を含有する。特定の場合において、多環式化合物は、三環式化合物であり、第１、第２、および第３の環は、独立して、Ｏ、Ｎ、またはＳからなる基から選択される、０、１、２、または３個のヘテロ原子を含有する、３、４、５、または６員飽和または不飽和炭素環である。特定の場合において、第１の環は芳香族環である。特定の場合において、第２の環は芳香族環である。特定の場合において、第３の環は芳香族環である。特定の場合において、３つの環は、飽和である。特定の場合において、第１の環はヘテロ原子を含有しない。特定の場合において、第２の環はヘテロ原子を含有する。特定の場合において、第３の環はヘテロ原子を含有する。特定の場合において、第１の環は窒素原子を含有する。特定の場合において、第２の環は窒素原子を含有する。特定の場合において、第３の環は窒素原子を含有する。特定の場合において、多環式化合物は、架橋多環式化合物である。特定の場合において、多環式化合物は、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［２．２．２］オクタン、ビシクロ［３．２．１］オクタン、ビシクロ［３．２．２］ノナン、またはビシクロ［３．３．１］ノナンである。
多くのクラウンエーテルが当該技術分野で公知であり、本発明に適している。クラウンエーテルは、それぞれが、２個以上の炭素原子により隣と単離される、４〜２０個の酸素原子を含有する、大環状ポリエーテル中性化合物である。大環状ポリエーテルは、アルカリ金属および他の金属の塩類、ならびにアンモニウム塩類と共に、安定した複合体を形成することが知られている；“Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ”，Ｃ．Ｊ．Ｐｅｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｅｄ．，Ｖｏｌ．１１，ページ１６，（１９７２）、および米国特許第３，５６２，２９５号ならびに同第３，６８７，９７８号の各明細書。大環状ポリエーテルの立体モデルは、クラウン様態様を付与するため、これらは、通常、Ｎ−クラウン−Ｍポリエーテルとして設計され、ここで、Ｎは、ポリエーテル環の原子の総数であり、Ｍは、ポリエーテル環の酸素原子の数である。エチレンオキシド（［１２］−クラウン−４）およびプロピレンオキシド（［１６］−クラウン−４）の環式四量体〜６０員ポリエーテル環（ジベンゾ［６０］−クラウン−２０）の大きさの範囲のクラウンポリエーテルが、報告されている。好ましいクラウンエーテルは、１２−クラウン−４、１５−クラウン−５、および１８−クラウン−６を含む。
多くのオリゴヌクレオチド干渉物質が当該技術分野で公知であり、本発明に適している。干渉物質の一クラスは、二本鎖ＤＮＡに、非共有結合的に結合するＤＮＡ干渉物質であり、ＤＮＡの二重らせんの塩基対間に挿入される平分子を特徴とする。干渉物質の代表的な例としては、ｐ−カルボキシメチジウム、ｐ−カルボキシエチジウム、アクリジン、およびエリプチシンが挙げられる。
多くのオリゴヌクレオチド切断分子が当該技術分野で公知であり、本発明に適している。切断分子は、オリゴヌクレオチド鎖を切断することができる化合物である。グリコペプチド抗生物質であるブレオマイシンは、鉄二価イオンおよび分子状酸素の存在に依存する反応において、ＤＮＡに結合し、それを切断することが知られている、“Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ： Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ”；Ｈｅｃｈｔ，Ｓ．Ｍ．，Ｅｄ．；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７９；Ｓａｕｓｖｉｌｌｅ，Ｅ．Ａ．；Ｐｅｉｓａｃｈ，Ｊ．；Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｓ．Ｂ．“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”１９７８，１７，２７４０．Ｂｕｒｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．；Ｐｅｉｓａｃｈ，Ｊ；Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｓ．Ｂ．“Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１９８１，２８，７１５、およびＬｏｗｎ，Ｊ．Ｗ．；Ｓｉｍ，Ｓ．Ｆ．“Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．”１９７７，７７，１１５０。抗腫瘍剤ストレプトニグリンも、酸素および銅一価イオンを使用して、ＣＮＡの一本鎖の切断をもたらすことができる（Ｃｏｎｅ，Ｒ；Ｈａｓａｎ，Ｓ．Ｋ．；Ｌｏｗｎ，Ｊ．Ｗ．；Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．Ｒ．“Ｃａｎ．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．”１９７６，５４，２１９．。近年、１−１０フェナンスロリン−銅一価複合体が、酸素の存在下で、ＤＮＡを切断することを示した（Ｓｉｇｍａｎ，Ｄ．Ｓ．；Ｇｒａｈａｍ，Ｄ．Ｒ．；Ｄ’Ａｕｒｏｒａ，Ｖ．；Ｓｔｅｒｎ，Ａ．Ｍ．“Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．”１９７９，２５４，１２２６９；Ｇｒａｈａｍ，Ｄ．Ｒ．；Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｌ．Ｅ．；Ｒｅｉｃｈ，Ｋ． Ａ．；Ｓｉｇｍａｎ，Ｄ．Ｓ．“Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．”１９８０，１０２，５４１９；Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｌ．Ｅ．；Ｇｒａｈａｍ，Ｄ．Ｒ．；Ｒｅｉｃｈ，Ｋ．Ａ．；Ｓｉｇｍａｎ，Ｄ．Ｓ．“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”１９８１，２０，２４４、およびＱｕｅ，Ｂ．Ｇ．；Ｄｏｗｎｅｙ，Ｋ．Ｍ．；Ｓｏ．，Ａ．Ｇ．“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”１９８０，１９，５９８７）。加えて、メチジウム、エチジウム、およびシスプラチンは、オリゴヌクレオチド配列を切断することが知られている。
一般的にリガンドは、例えば、取り込みを高めるための治療修飾因子、例えば、分布の監視のための診断化合物またはリポーター基、架橋剤、ヌクレアーゼ耐性を付与する部分、および天然または非天然核酸塩基を含むことができる。一般例としては、脂溶性分子、脂質、ステロイド、（例えば、コレステロール、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導化リトコール酸）、ビタミン類（例えば、葉三、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビオチン、ピリドキサール）、炭水化物、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリンを標的とする分子、ポリカチオン、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド疑似物質が挙げられる。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド擬似物質であり得る。ペプチド擬似物質（本明細書において、オリゴペプチド擬似物質とも称される）は、天然ペプチドに類似する、所定の３次元構造に折り畳むことができる分子である。ペプチドおよびペプチド擬似物質のｉＲＮＡ剤への結合は、細胞認識および吸収を高めることにより、ｉＲＮＡの薬物動態の分布に影響を与えることができる。ペプチドまたはペプチド擬似物質部分は、長さが約５〜５０のアミノ酸、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０のアミノ酸の長さであり得る。
ｉＲＮＡ剤構造
本明細書に記載される単量体は、例えば、対象の内因性遺伝子または病原体の遺伝子に関して、ＲＮＡｉを媒介するＲＮＡｉ剤、例えば、ＲＮＡ分子（二本鎖、一本鎖）として有用であるオリゴヌクレオチドを作製するために使用され得る。多くの場合、ｉＲＮＡ剤は、自然に生じるヌクレオシドもしくはヌクレオチド、または他の修飾されたヌクレオシドもしくはヌクレオチドと一緒に、本明細書に記載される単量体を組み込む。修飾された単量体は、ｉＲＮＡ剤の任意の位置、例えば、ｉＲＮＡ剤の末端もしくはその中間領域で、または二本鎖領域もしくは不対領域で存在し得る。好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、任意の構造、例えば、本明細書に記載される構造を有することができる。例えば、本明細書に記載される、オーバーハング構造、ヘアピン、または他の一本鎖構造もしくは二本鎖構造を有するｉＲＮＡ剤に組み込まれ得る。
本明細書で使用される、「ＲＮＡ剤」とは、未修飾ＲＮＡ、修飾されたＲＮＡ、またはヌクレオシド代用物であり、全てが本明細書で定義される（例えば、ＲＮＡ剤と題される以下の項を参照のこと）。多数の修飾されたＲＮＡおよびヌクレオシド代用物が記載されるが、好ましい実施例は、未修飾ＲＮＡよりもヌクレアーゼ分解に高い耐性を有するものを含む。好ましい実施例は、一本鎖オーバーハングにおける修飾、好ましくは３’一本鎖オーバーハングである２’糖修飾、または特に一本鎖の場合、１つ以上のリン酸基もしくは１つ以上のリン酸基の類似体を含む５’修飾を有するものを含む。
本明細書で使用される、「ｉＲＮＡ剤」とは、免疫応答を刺激もしくは阻害することができる、または免疫応答に影響を及ぼさないＲＮＡ剤を分割できる、またはそれに分割され得るＲＮＡ剤である。ｉＲＮＡ剤は、標的遺伝子、好ましくは、内因性または病原体標的ＲＮＡの発現も下方制御し得る。理論に束縛されるわけではないが、標的遺伝子の発現を下方制御するｉＲＮＡ剤は、標的ｍＲＮＡの転写後切断（時折、当該技術分野においてＲＮＡｉと称される）、または転写前もしくは翻訳前機構を含む、いくつかの機構の１つ以上により作用され得る。ｉＲＮＡ剤は一本鎖を含むか、または一本鎖以上、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤を含むことができる。ｉＲＮＡ剤が一本鎖である場合、１つ以上のリン酸基もしくは１つ以上のリン酸基の類似体を含む５’修飾を含むことが、特に好ましい。
説明を容易にするために、ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドという用語は、時折、本明細書において、ＲＮＡ剤の１つ以上の単量体サブユニットに関連して使用される。「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語の使用は、修飾されたＲＮＡまたはヌクレオチドの場合において、１つ以上の位置での修飾されたヌクレオチドまたは代用置換部分も指すように本明細書では理解される。
本明細書の別の個所で論議される、ｉＲＮＡ剤は、多くの場合、修飾されるか、またはリボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）に加え、ヌクレオシド代用物を含む。ｉＲＮＡ剤の一本鎖領域は、多くの場合、修飾されるか、またはヌクレオシド代用物を含み、例えば、不対領域もしくはヘアピン構造の領域、例えば、２つの相補的な領域を連結する領域は、修飾またはヌクレオシド代用物を有することができる。例えば、エキソヌクレアーゼに対して、ｉＲＮＡ剤の１つ以上の３’−もしくは５’−末端を安定化するための、またはＲＩＳＣに侵入するようにアンチセンスｓＲＮＡ剤を支持するための修飾も好まれる。修飾は、ホスホラミダイトとして作用し、別のＤＭＴ保護ヒドロキシル基を有する、Ｃ３（またはＣ６、Ｃ７、Ｃ１２）アミノリンカー、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチドスペーサー（Ｃ３、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、脱塩基、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール）、特殊ビオチンまたはフルオレセイン試薬を含むことができ、ＲＮＡ合成中の多重カップリングを可能にする。
塩基
アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルは、ＲＮＡに見られる最も一般的な塩基である。これらの塩基は、修飾されるか、または置換され、改善された特性を有するＲＮＡ’を提供する。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴリボヌクレオチドは、これらの塩基を用いて、または合成および天然核酸塩基（例えば、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、イソグアニシン、またはツベルシジン）、および上記の修飾のいずれか１つを用いて調製され得る。例えば、代替的に、置換された、または修飾された上記の塩基のいずれかの類似体、例えば、本明細書に記載される「特殊な塩基」および「一般的な塩基」も利用され得る。例としては、これらに限定されないが、２−アミノアデニン、６−メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシおよび他の８−置換されたアデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換されたウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換されたピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換されたプリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む）、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、Ｎ６、Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル、置換された１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化塩基が挙げられる。さらにプリンおよびピリミジンは、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されるもの、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ページ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．に開示されるもの Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０、およびＥｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示されるものを含む。
一般的な塩基は、天然ＤＮＡ／ＲＮＡ塩基のそれぞれと塩基対を形成することができ、それらの間では相対的にほとんど相違を示さない。概して、一般的な塩基は、積み重ね相互作用を介して、例えば、二本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ様分子を安定化することができる、非水素結合の疎水性芳香族部分である。一般的な塩基は、水素結合置換基も含むことができる。本明細書で使用される、「一般的な塩基」とは、アントラセン、ピレン、または以下のうちのいずれか１つを含むことができる。
Figure 2012502040
概して、塩基の変化は、安定性を促進するためにあまり好まれないが、これらは他の理由、例えば、２，６−ジアミノプリンおよび２アミノプリンが蛍光性であるという、例えば、いくつかの理由において有用であり得る。修飾された塩基は、標的特異性を低減することができる。これは、ｉＲＮＡ剤の設計に考慮されるべきである。
一般参考文献
本発明に従い使用されるオリゴリボヌクレオチドよびオリゴリボヌクレオシドは、固相合成を用いてもよく、例えば、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｅｄ．Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８４、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｅｄ．Ｆ． Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９９１（特に第１章、Ｍｏｄｅｒｎ ｍａｃｈｉｎｅ−ａｉｄｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２章、Ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３章、２’−Ｏ−−Ｍｅｔｈｙｌｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第４章、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、第５章、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅｓ、第６章、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏ−２’−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ、および第７章、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂａｓｅｓを参照のこと。他の特に有用な合成法、試薬、遮断基、および反応状形は、Ｍａｒｔｉｎ， Ｐ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４、Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｒ． Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２，４８， ２２２３−２３１１、およびＢｅａｕｃａｇｅ，Ｓ． Ｌ．ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３，４９，６１２３−６１９４、またはそこで参照される参考文献に記載されている。
国際公開第００／４４８９５号、国際公開第０１／７５１６４号、または国際公開第０２／４４３２１号の各パンフレットに記載される修飾が、本明細書で使用され得る。
本明細書に挙げられる全ての出版物、特許、および公開特許出願の開示は、参照により本明細書に援用される。
リン酸基参考文献
ホスフィン酸オリゴリボヌクレオチドの調製物は、米国特許第５，５０８，２７０号明細書に記載される。アルキルホスホネートオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第４，４６９，８６３号明細書に記載される。ホスホラミダイトオリゴリボヌクレオチドの調製物は、米国特許第５，２５６，７７５号明細書、または米国特許第５，３６６，８７８号明細書に記載される。リン酸トリエステルオリゴリボヌクレオチドの調製物は、米国特許第５，０２３，２４３号明細書に記載される。ボラノリン酸オリゴリボヌクレオチドの調製物は、米国特許第５，１３０，３０２号明細書および米国特許第５，１７７，１９８号明細書に記載される。３’−デオキシ−３’−アミノホスホロアミド酸オリゴリボヌクレオチドの調製物は、米国特許第５，４７６，９２５号明細書に記載される。３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートオリゴリボヌクレオチドは、Ａｎ，Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００１，６６，２７８９−２８０１に記載される。硫黄架橋されたヌクレオチドの調製物は、Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９８８，７，６５１およびＣｒｏｓｓｔｉｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９８９，３０，４６９３に記載される。
糖基の参考文献
２’修飾への修飾は、Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １４８９：１１７−１３０，１９９９、Ｖｅｒｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９−１３４，１９９８およびそこの参考文献に見出され得る。リボースへの特異的修飾は、以下の参考文献に見出され得る：２’−ｆｌｕｏｒｏ（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ． ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３６，８３１−８４１），２’−ＭＯＥ （Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９９６，７９，１９３０−１９３８），“ＬＮＡ”（Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．１９９９，３２，３０１−３１０）。ｉＲＮＡ特異的化学修飾は、Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８：５７０−５７９，２００４に記載される。
カチオン基
修飾は、１つ以上のカチオン基のリン酸もしくは修飾されたリン酸骨格部分の糖、塩基、および／またはリン原子への結合も含むことができる。カチオン基は、天然、特殊な、または一般的な塩基上で置換することができる任意の原子に結合され得る。好ましい位置は、ハイブリッド形成を妨げない位置、すなわち、塩基対に必要な水素結合相互作用を妨げない位置である。カチオン基は、例えば、環式または非環式糖代用物における糖または類似位置のＣ２’位置を通して結合され得る。カチオン基は、例えば、Ｏ−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）由来のプロトン化アミノ基、アミノアルコキシ、例えば、Ｏ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）、アミノ（ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）、またはＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ）を含むことができる。
非リン酸連結
修飾は、鎖の５’および／または３末端で、非リン酸連結の取り込みも含むことができる。リン酸基を置換することができる非リン酸連結の例としては、メチルホスホン酸、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、炭酸、カルボキシメチル、カルバミン酸、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホン酸、スルホンアミド、チオホルムアセタル、ホルムアセタル、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｈｙｄｒａｚｏ）、メチレンジメチルヒドラゾ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒａｚｏ）、およびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。好ましい置換は、メチルホスホン酸およびヒドロキシアミノ基を含む。
修飾は、第１の糖の２’位置および第２の糖の５’位置を通して、リン酸または修飾されたリン酸基を介する、２つの連結も含むことができる。第１と第２の糖の両方が、それぞれ３’位置を通して切断可能に連結される、逆連結も関与する。修飾されたＲＮＡ’は、Ｃ−１’で核酸塩基を欠損する「脱塩基」糖も含むことができる。糖基は、リボースで、対応する炭素のそれより、対向する立体化学構造を有する１つ以上の炭素を含有することもできる。したがって、修飾されたｉＲＮＡ剤は、糖として、例えば、アラビノースを含有するヌクレオチドを含むことができる。この修飾の別のサブセットにおいて、天然、特殊な、または一般的な塩基は、α構造を有し得る。修飾は、Ｌ−ＲＮＡも含むことができる。
修飾は、５’−ホスホン酸、例えば、Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）２−Ｘ−Ｃ５’糖（Ｘ＝ＣＨ２、ＣＦ２、ＣＨＦ、および５’−リン酸プロドラッグ、例えば、Ｐ（Ｏ）［ＯＣＨ２ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）Ｒ］２ＣＨ２Ｃ５’糖も含むことができる。後者の場合において、プロドラッグ基は、最初にカルボキシエステラーゼとの反応を介して分解され得る。分子内ＳＮ２置換を介して、残りのエチルチオレート基は、エピスルフィドとして脱離し、非誘導化リン酸基が得られる。
修飾は、本明細書の別の個所に記載される共役基の追加も含むことができ、これは、好ましくは、共役に利用可能な任意のアミノ基を通して、ｉＲＮＡ剤に結合される。
いくつかが末端にのみ配置され、残りは任意の位置に配置されることができる、ヌクレアーゼ耐性修飾を含む。概して、ハイブリッド形成を阻害することができる修飾は、好ましくは、末端領域でのみそれらを使用し、対象配列もしくは遺伝子を標的とする配列の切断部位または切断領域で、それらを使用しないことが好ましい。これらは、センス配列のどの場所においても使用され得るが、ｉＲＮＡ剤の２つの配列間で十分なハイブリッド形成がが維持されることを条件とする。いくつかの実施形態において、標的ではないサイレンシングを最小にできるため、対象配列または遺伝子を標的としない配列の切断部位もしくは切断領域にＮＲＭを置くことが望ましい。
加えて、本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ剤の他の配列と二本鎖構造を形成しないオーバーハングを有することができ、これは、オーバーハングであるが、それ自体またはｉＲＮＡ剤の別の配列以外の別の核酸のいずれかとハイブリッド形成する。
多くの場合において、修飾を促進するヌクレアーゼ耐性は、配列が、対象における配列を標的とする（多くの場合、抗センス配列と称される）か、または対象における配列を標的としない（多くの場合、センス配列と称される）かにより異なって分配される。配列が、対象における配列を標的とする場合、エンドヌクレアーゼ切断を妨げる、または阻害する修飾は、ＲＩＳＣ媒介性切断を受ける部位、例えば、切断部位または切断領域に挿入されるべきではない（参照により本明細書に援用されるＥｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．１５：１８８に記載されるように、標的の切断は、２０または２１ｎｔガイドＲＮＡの中央の周囲、またはガイド配列に相補である第１のヌクレオチドの１０または１１ヌクレオチド上流の周囲で生じる。本明細書に使用される切断部位は、それとハイブリッド形成する標的上、またはｉＲＮＡ剤鎖上の切断部位のいずれかの側上のヌクレオチドを指す。切断領域は、いずれかの方向の切断部位の１、２、３ヌクレオチドを伴うヌクレオチドを意味する。）
このような修飾は、例えば、対象における配列を標的とする配列、または標的としない配列の末端位置で、または末端の２、３、４、または５位置を伴う末端領域に導入され得る。
ｉＲＮＡ剤は、以下から選択される第１および第２鎖を有することができる：
配列を標的とせず、かつ３末端からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内にＮＲＭ修飾を有する第１の鎖、
配列を標的とせず、かつ５末端からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内にＮＲＭ修飾を有する第１の鎖、
配列を標的とせず、かつ３末端からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内でＮＲＭ修飾を有し、かつ５末端からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内にＮＲＭ修飾を有する第１の鎖、
配列を標的とせず、かつ切断部位で、または切断領域にＮＲＭ修飾を有する第１の鎖、
配列を標的とせず、かつ切断部位で、または切断領域にＮＲＭ修飾、および３末端からの１、２、３、４、５、または６位置でもしくはその位置内にＮＲＭ修飾、５末端からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内にＮＲＭ修飾、または３’および５末端の両方からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内にＮＲＭ修飾の１つ以上を有する第１の鎖、ならびに
配列を標的とし、かつ３’からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内にＮＲＭ修飾を有する第２の鎖、
配列を標的とし、かつ５末端からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内にＮＲＭ修飾を有する第２の鎖（５末端ＮＲＭ修飾は、優先的に、末端ではなく、むしろアンチセンス鎖の５’から離れた位置１、２、３、４、５もしくは６においてである。）、
配列を標的とし、かつ３末端からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内でＮＲＭ修飾を有し、かつ５末端からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内にＮＲＭ修飾を有する第２の鎖、
配列を標的とし、かつ好ましくは、切断部位で、または切断領域にＮＲＭ修飾を有さない第２の鎖、
配列を標的とし、かつ切断部位で、または切断領域にＮＲＭ修飾、および３末端からの１、２、３、４、５、または６位置でもしくはその位置内にＮＲＭ修飾、５末端からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内にＮＲＭ修飾、または３’および５末端の両方からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内にＮＲＭ修飾の１つ以上を有さない第２の鎖、（５末端ＮＲＭ修飾は、優先的に末端ではなく、むしろアンチセンス鎖の５’から離れた位置１、２３４５もしくは６においてである。）。
ｉＲＮＡ剤は、２つの配列を標的とすることができ、かつ
配列を標的とし、かつ３末端からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内にＮＲＭ修飾を有する第１の鎖、
配列を標的とし、かつ５末端からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内にＮＲＭ修飾を有する第１の鎖（５末端ＮＲＭ修飾は、優先的に、末端ではなく、むしろアンチセンス鎖の５’から離れた位置１、２、３、４、５もしくは６においてである）、
配列を標的とし、かつ３末端からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内でＮＲＭ修飾を有し、かつ５末端からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内にＮＲＭ修飾を有する第１の鎖、
配列を標的とし、かつ好ましくは、切断部位で、または切断領域にＮＲＭ修飾を有さない第１の鎖、
配列を標的とし、かつ切断部位で、または切断領域にＮＲＭ修飾、および３末端からの１、２、３、４、５、または６位置でもしくはその位置内にＮＲＭ修飾、５末端からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内にＮＲＭ修飾、または３’および５末端の両方からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内にＮＲＭ修飾の１つ以上を有さない第１の鎖（５末端ＮＲＭ修飾は、優先的に末端ではなく、むしろアンチセンス鎖の５’から離れた位置１、２、３、４、５もしくは６においてである）、ならびに
配列を標的とし、かつ３末端からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内にＮＲＭ修飾を有する第２の鎖、
配列を標的とし、かつ５末端からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内にＮＲＭ修飾を有する第２の鎖（５末端ＮＲＭ修飾は、優先的に末端ではなく、むしろアンチセンス鎖の５’から離れた位置１、２、３、４、５もしくは６においてである。）、
配列を標的とし、かつ３末端からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内でＮＲＭ修飾を有し、かつ５末端からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内にＮＲＭ修飾を有する第２の鎖、
配列を標的とし、かつ好ましくは、切断部位で、または切断領域にＮＲＭ修飾を有さない第２の鎖、
配列を標的とし、かつ切断部位で、または切断領域にＮＲＭ修飾、および３末端からの１、２、３、４、５、または６位置でもしくはその位置内にＮＲＭ修飾、５末端からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内にＮＲＭ修飾、または３’および５末端の両方からの１、２、３、４、５もしくは６位置で、またはその位置内にＮＲＭ修飾の１つ以上を有さない第２の鎖（５末端ＮＲＭ修飾は、優先的に末端ではなく、むしろアンチセンス鎖の５’から離れた位置１、２３４５もしくは６においてである。）から選択される第１および第２の鎖を有することができる。
リボース擬似物質
本明細書に記載される単量体および方法は、本明細書に記載されるもの、ならびに両方とも参照により本明細書に援用される２００３年３月１３日に出願された同時係属共所有の米国仮出願第６０／４５４，９６２号明細書および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号パンフレットに記載されるもの等の、ＲＮＡ、例えば、ｉＲＮＡ剤を調製するために使用され得る。
したがって、本発明の態様は、有効性を高め、かつ／または薬剤に対するヌクレアーゼ耐性を付与することができる、二級ヒドロキシル基を含むｉＲＮＡ剤を特徴とする。ヌクレアーゼ、例えば、細胞ヌクレアーゼは、核酸ホスホジエステル結合を加水分解することができ、核酸の部分的または完全な分解をもたらす。二級ヒドロキシ基は、修飾を欠損するｉＲＮＡに対してｉＲＮＡ剤をヌクレアーゼ分解しにくくすることにより、ｉＲＮＡ剤に対するヌクレアーゼ耐性を付与する。論理に束縛されるつもりはないが、ｉＲＮＡ剤上の二級ヒドロキシル基の存在は、３’リボースヒドロキシル基の構造擬似物質として作用することができ、これによりｉＲＮＡ剤の分解への感受性を低くすると考えられている。
併用療法
一態様において、本発明の組成物は、併用療法において使用され得る。「併用療法」という用語は、さらに他の生物学的活性成分（これに限定されないが、第２の、および異なる抗腫瘍剤等）および非薬物療法（これらに限定されないが、外科手術または放射能治療等）と組み合わせた対象化合物の投与を含む。例えば、本発明の化合物は、他の医薬的活性化合物、好ましくは本発明の化合物の作用を高めることができる化合物と組み合わせて使用され得る。本発明の化合物は、同時に（単一製剤または個別の製剤）、または他の薬物療法に対して順次に投与され得る。概して、併用療法は、治療の単一周期中または経過中の２つ以上の薬物の投与を想定する。
本発明の一態様において、対象化合物は、種々の疾病状態に関与するタンパク質キナーゼを調節する、１つ以上の別個の薬剤と組み合わせて投与され得る。このようなキナーゼの例としては、これらに限定されないが、セリン／スレオニン特異的キナーゼ、受容体チロシン特異的キナーゼ、および非受容体チロシン特異的キナーゼが挙げられる。セリン／スレオニンキナーゼは、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）、減数分裂特異的キナーゼ（ＭＥＫ）、ＲＡＦ、およびオーロラキナーゼを含む。受容体キナーゼファミリーの例としては、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）（例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＥｒｂＢ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、Ｘｍｒｋ、ＤＥＲ、Ｌｅｔ２３）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体（例えば、ＦＧＦ−Ｒｌ、ＧＦＦ−Ｒ２／ＢＥＫ／ＣＥＫ３、ＦＧＦ−Ｒ３／ＣＥＫ２、ＦＧＦ−Ｒ４／ＴＫＦ、ＫＧＦ−Ｒ）、肝細胞増殖／散乱因子受容体（ＨＧＦＲ）（例えば、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＳＥＡ、ＳＥＸ）、インスリン受容体（例えば、ＩＧＦＩ−Ｒ）、Ｅｐｈ（例えば、ＣＥＫ５、ＣＥＫ８、ＥＢＫ、ＥＣＫ、ＥＥＫ、ＥＨＫ−Ｉ、ＥＨＫ−２、ＥＬＫ、ＥＰＨ、ＥＲＫ、ＨＥＫ、ＭＤＫ２、ＭＤＫ５、ＳＥＫ）、ＡｘＩ（例えば、Ｍｅｒ／Ｎｙｋ、Ｒｓｅ）、ＲＥＴ、および血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）（例えば、ＰＤＧＦα−Ｒ、ＰＤＧβ−Ｒ、ＣＳＦｌ −Ｒ／ＦＭＳ、ＳＣＦ− Ｒ／Ｃ−ＫＩＴ、ＶＥＧＦ−Ｒ／ＦＬＴ、ＮＥＫ／ＦＬＫ１、ＦＬＴ３／ＦＬＫ２／ＳＴＫ−１）が挙げられる。非受容体チロシンキナーゼファミリーは、これらに限定されないが、ＢＣＲ−ＡＢＬ（例えば、ｐ４３ａｂｌ、ＡＲＧ）、ＢＴＫ（例えば、ＩＴＫ／ＥＭＴ、ＴＥＣ）、ＣＳＫ、ＦＡＫ、ＦＰＳ、ＪＡＫ、ＳＲＣ、ＢＭＸ、ＦＥＲ、ＣＤＫ、およびＳＹＫを含む。
本発明の別の態様において、対象化合物は、非キナーゼ生物学的標的またはプロセスを調節する１つ以上の薬剤と組み合わせて投与され得る。このような標的は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）、熱ショックタンパク質（例えば、ＨＳＰ９０）、およびプロテアソームを含む。
一実施形態において、対象化合物は、ゾリンザ、タルセバ、イレッサ、タイケルブ、グリベック、スーテント、スプリセル、ネクサバール、ソラフィニブ、ＣＮＦ２０２４、ＲＧ１０８、ＢＭＳ３８７０３２、アフミタク（Ａｆｆｍｉｔａｋ）、アバスチン、ハーセプチン、エルビタックス、ＡＧ２４３２２、ＰＤ３２５９０１、ＺＤ６４７４、ＰＤ１８４３２２、オバトダックス、ＡＢＴ７３７、およびＡＥＥ７８８等の１つ以上の生物学的標的を阻害する抗腫瘍剤（例えば、小分子、モノクローナル抗体、アンチセンスＲＮＡ、および融合タンパク質）と組み合わされ得る。このような組み合わせは、薬剤のみのいずれかにより達成される効力に対して治療効力を高めるか、または耐性突然変異性変異体の出現を阻止または遅延し得る。
特定の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、化学療法と組み合わせて投与される。化学治療薬は、腫瘍学の分野における広範な治療上の処置を包含する。これらの薬剤は、腫瘍を収縮させる、外科手術後に残った癌細胞の残りを破壊する、寛解を誘発する、寛解を維持し、かつ／または癌またもしくはその治療に関する症状を緩和する目的のための様々な疾病の段階で投与される。このような薬剤の例としては、これに限定されないが、マスタードガス誘導体（メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、イフォスファミド）、エチレンイミン（チオテパ、ヘキサメチルメラニン）、アルキルスルホン酸（ブスルファン）、ヒドラジンおよびトリアジン（アルトレタミン、プロカルバジン、ダカルバジンおよびテモゾロミド）、ニトロソウレア（カルムスチン、ロムスチン、およびストレプトゾシン）、イホスファミド、および金属塩（カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチン）等のアルキル化剤、ポドフィロトキシン（エトポシドおよびテニソピド）、タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビン）、およびカプトテカン類似体（イリノテカンおよびトポテカン）等の植物アルカロイド、クロモマイシン（ダクチノマイシンおよびプリカマイシン）、アントラサイクリン（ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、バルルビシン、およびイダルビシン）等の抗腫瘍抗生物質、ならびにマイトマイシン、アクチノマイシン、およびブレオマイシン等の種々の抗生物質、葉酸拮抗薬（メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、アミノプテリン）、ピリミジン拮抗薬（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、カペシタビン、およびゲムシタビン）、プリン拮抗薬（６−メルカプトプリンおよび６−チオグアニン）、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤（クラドリビン、フルダラビン、メルカプトプリン、クロファラビン、チオグアニン、ネララビン、およびペントスタチン）等の抗代謝物、トポイソメラーゼＩ阻害剤（イロノテカン、トポテカン）、およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド）等のトポイソメラーゼ阻害剤、モノクローナル抗体（アレムツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、リツキシマブ、トラスツズマブ、イブリツモマブチオキセタン（Ｔｉｏｘｅｔａｎ）、セツキシマブ、パニツムマブ、トシツモマブ、ベバシズマブ）、ならびにリボヌクレオチドレラクターゼ阻害剤（ヒドロキシウレア）等の種々の抗腫瘍薬、副腎皮質ステロイド阻害剤（ミトタン）、酵素（アスパラギナーゼおよびペガスガルガーゼ）、抗微小管剤（エストラムスチン）、およびレチノイド（ベキサロテン、イソトレチノイン、トレチノイン（ＡＴＲＡ）が挙げられる。特定の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、化学保護剤と組み合わせて投与される。化学保護剤は、身体を保護する、または化学療法の副作用を最小にするように作用する。このような薬剤の例としては、これらに限定されないが、アムフォスチン（ａｍｆｏｓｔｉｎｅ）、メスナ、およびデクスラゾキサンが挙げられる。
本発明の一態様において、対象化合物は、放射線療法と組み合わせて投与される。放射線は、通常、内部的に（癌部近くへの放射性物質の移植）、または光子（ｘ線またはガンマ線）もしくは粒子放射を利用する機器から外部的に送達される。併用療法が放射線治療をさらに含む場合には、放射線治療は、治療薬と放射線治療の組み合わせの相互作用から有益な効果が達成される限り、任意の好適な時間で実施され得る。例えば、好適な場合において、有益な効果は、放射線治療が、数日または数週間で治療薬の投与から一時的に取り除かれる時にも達成されるであろう。
本発明の化合物は、免疫療法剤と組み合わせて使用され得ることを理解されたい。免疫療法の一形態は、腫瘍から離れた部位でワクチン化合物を投与することによる、宿主源の全身腫瘍特異的免疫応答の活性の生成である。腫瘍抗原単離ワクチンおよび抗イディオタイプワクチンを含む、様々な種類が提案されている。別のアプローチは、対象からの治療される腫瘍細胞、またはこのような細胞の誘導体を使用することである（Ｓｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２１：４８７に概説される）。米国特許第５，４８４，５９６号明細書において、Ｈａｎｎａ Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．は、外科的に腫瘍を除去することと、コレゲナーゼを用いて細胞を分散することと、細胞を照射することと、約１０７細胞の連続投与で患者にワクチン接種することとを含む、再発または転移を阻止するように、切除可能な癌を治療するための方法を主張している。
本発明の化合物は、１つ以上の補助的な治療薬と併せて、有利に使用され得ることを理解されたい。補助的な療法に好適な薬剤の例としては、副腎皮質ステロイド（アムシノイド、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ブデソニド、クロベタゾール、酢酸クロベタゾール、酪酸クロベタゾール、クロベタゾール１７−プロピオン酸、コルチゾン、デフラザコート、デスオキシメタゾン、吉草酸ジフルコルトロン、デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、デソニド、フロ酸、フルオシノニド、フルオシノロンアセトニド、ハルシノニド、ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、吉草酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、モメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、およびプロピオン酸ハロベタゾール）等のステロイド、トリプタン（例えば、スマトリプタンまたはナラトリプタン）等の５ＨＴｉ作動薬、アデノシンＡｌ作動薬、ＥＰリガンド、グリシン拮抗薬等のＮＭＤＡ修飾物質、ナトリウムチャネル遮断薬（例えば、ラモトリジン）、物質Ｐ拮抗薬（例えば、ＮＫｉ拮抗薬）、カンナビノイド、アセトアミノフェンまたはフェナセチン、５−リポキシゲナーゼ阻害剤、ロイコトリエン受容体拮抗薬、ＤＭＡＲＤ（例えば、メトトレキサート）、ガバペンチンおよび関連する化合物、三環系抗うつ剤（例えば、ａｍｉｔｒｙｐｔｉｌｌｉｎｅ）、神経細胞安定化抗てんかん薬、モノアミン作動性取り込み阻害剤（ベンラファキシン）、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、ｉＮＯＳまたはｎＮＯＳ阻害剤等の一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）阻害剤、腫瘍壊死因子αの放出または作動阻害剤、モノクローナル抗体療法等の抗体療法、ヌクレオシド阻害剤（例えば、ラミブジン）または免疫系修飾因子（例えば、インターフェロン）等の抗ウイルス剤、オピオイド鎮痛薬、局所麻酔薬、カフェイン等の刺激薬、Ｈ２−拮抗薬（例えば、ラニチジン）、プロトンポンプ阻害剤（例えば、オメプラゾール）、制酸薬（例えば、アルミニウムまたは水酸化マグネシウム）、抗鼓腸剤（例えば、シメチコン）、うっ血除去薬（例えば、フェニレフリン、フェニルプロパノールアミン、プソイドエフェドリン、オキシメタゾリン、エピネフリン、ナファゾリン、キシロメタゾリン、プロピルヘキセドリン、またはレボ−デオキシエフェドリン）、鎮咳剤（例えば、コデイン、ヒドロコドン、カルミフェン、カルベタペンタン、またはデキストラメトルファン）、利尿薬、または鎮静または非鎮静抗ヒスタミン剤が挙げられる。
医薬組成物
一実施形態において、本発明は、前項に記載される本発明のｉＲＮＡ剤、および以下に記載される医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物に関する。修飾されたｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物は、標的遺伝子の発現により生じる疾病を治療するのに有用である。本発明のこの態様において、本発明のｉＲＮＡ剤は、以下のように製剤化される。医薬組成物は、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与される。
本発明の医薬組成物は、標的遺伝子の発現または活性を阻害するのに十分な投与用で投与される。本発明のｉＲＮＡ剤を含有する組成物は、驚くほど低い投与量で投与され得る。キログラム体重当り５ｍｇのｉＲＮＡ剤の最大投与量が、標的遺伝子の発現または活性を阻害、または完全に抑制するのに十分であってもよい。
概して、修飾されたｉＲＮＡ剤の好適な用量は、１日につき受給者のキログラム体重当り、０．００１〜５００ミリグラムの範囲である（例えば、キログラム当り約１マイクログラム〜キログラム当り約５００ミルグラム、キログラム当り約１００マイクログラム〜キログラム当り約１００ミリグラム、キログラム当り約１ミリグラム〜キログラム当り約７５ミリグラム、キログラム当り約１０マイクログラム〜キログラム当り約５０ミリグラム、またはキログラム当り約１マイクログラム〜キログラム当り約５０マイクログラム）。医薬組成物は、１日１回投与されるか、またはｉＲＮＡ剤は、１日を通して好適な間隔で、２、３、４、５、６以上の副投与量として投与され得る。この場合、各副投与量に含有されるｉＲＮＡ剤は、合計日用量を達成するために、それに応じて少量でなければならない。投与単位は、数日間にわたりｉＲＮＡ剤の徐放性を提供する、例えば、従来の徐放性製剤を使用して、数日にわたって送達するようにも配合され得る。徐放性製剤は、当該技術分野において公知である。この実施形態において、投与単位は、対応する複数の日用量を含有する。
これらに限定されないが、対象の感染または疾病の重篤度、以前の治療法、一般健康状態、および／または年齢、ならびに他の疾病の存在を含む、特定の要因が、対象を効果的に治療するために必要とされる投与量およびタイミングに影響を与え得ることを当業者は理解するであろう。さらに、治療有効量の組成物を用いた対象の治療は、単回治療または一連の治療を含むことができる。本発明に包含される個別のｉＲＮＡ剤の有効投与量および生体内半減期の推定は、従来の方法を使用するか、または本明細書の別の個所に記載される好適な動物モデルを使用した生体内試験に基づき行われ得る。
マウス遺伝学での進歩は、種々のヒト疾病の研究のためのマウスモデルを生成してきた。例えば、マウスレポジトリは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｈａｒｌａｎ，Ｍｕｔａｎｔ Ｍｏｕｓｅ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒｓ（ＭＭＲＲＣ）Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ およびＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｕｓｅ Ｍｕｔａｎｔ Ａｒｃｈｉｖｅで見つけることができる。このようなモデルは、ｉＲＮＡ剤の生体内試験ならびに治療有効量の決定のために使用され得る。
本発明により包含される医薬組成物は、これらに限定されないが、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、眼球、直腸、膣および局所（頬側および舌下）投与を含む、経口または非経口経路を含む、当該技術分野で公知の任意の手段により投与され得る。好ましい実施形態において、医薬組成物は、静脈内または非経口的内部注入もしくは注射により投与される。医薬組成物は、また、実質内、くも膜下腔内、および／または定位注射により投与され得る。
経口投与において、本発明に有用なｉＲＮＡ剤は、一般的に、錠剤もしくはカプセルの形態で、粉末もしくは顆粒として、または水性溶液もしくは懸濁液として提供される。
経口使用のための錠剤は、不活性希釈剤、壊変剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、風味剤、着色剤、および防腐剤等の、医薬的に許容される賦形剤と混合される活性成分を含んでもよい。好ましい不活性希釈剤は、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、ならびにラクトースを含み、一方、コーンスターチおよびアルギン酸は、好適な壊変剤である。結合剤は、澱粉およびゼラチンを含んでもよく、一方、潤滑剤は、存在する場合、一般的にステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクである。所望する場合、錠剤は、消化管での吸収を遅延するように、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル等の材料で被覆され得る。
経口使用のためのカプセルは、活性成分が固形希釈剤と混合される硬ゼラチンカプセル、および活性成分が水またはピーナッツ油、液状パラフィンもしくはオリーブ油等の油と混合される軟ゼラチンカプセルを含む。
筋肉内、腹腔内、皮下、および静脈内使用において、本発明の医薬組成物は、一般的に、好適なｐＨおよび等張性に緩衝された、減菌水性溶液または懸濁液で提供される。好適な水性ビヒクルは、リンゲル液および等張塩化ナトリウムを含む。好ましい実施形態において、担体は、排他的に、水性緩衝液からなる。この内容において、「排他的」とは、標的遺伝子またはウイルスを持つ細胞において、ｉＲＮＡ剤の取り込みに影響を及ぼす、またはそれを媒介する場合がある補助剤もしくはカプセル封入物質が存在しないことを意味する。このような物質は、例えば、以下に記載する、リポソームまたはカプシド等のミセル構造を含む。微量注入、リポフェクション、ウイルス、ウイロイド、カプシド、カプソイド（ｃａｐｓｏｉｄｓ）、または他の補助剤が、細胞培養物中にｉＲＮＡ剤を導入するために必要とされるが、驚くことに、これらの方法および薬剤は、生体内ｉＲＮＡ剤の取り込みに必ずしも必要ではない。本発明のｉＲＮＡ剤は、多くが毒性であるか、または有害な副作用に関連する、細胞へのｉＲＮＡ剤の取り込みを媒介するための補助剤の使用を必要としない点で、特に有益である。本発明に従う水性懸濁剤は、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドンおよびトラガントガム等の懸濁剤、ならびにレシチン等の湿潤剤を含んでもよい。水性懸濁剤の好ましい防腐剤は、エチルおよびｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートを含む。
医薬組成物は、移植片およびマイクロカプセル化送達系を含む、放出制御製剤等の身体からの急速な除去に対してｉＲＮＡ剤を保護するように、カプセル化製剤も含むことができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグルコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ乳酸等の、生体分解性で、生体適合性重合体が使用され得る。このような調製方法は、当業者に明らかである。Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．からも材料が商業的に入手できる。リポソーム懸濁剤（モノクローナル抗体のウイルス抗原への感染細胞を標的とするリポソームを含む）も、医薬的に許容される担体として使用され得る。これらは、例えば、参照により本明細書に援用される、米国特許第４，５２２，８１１号明細書、国際公開第９１／０６３０９号パンフレットならびに欧州特許出願公開第ＥＰ−Ａ−４３０７５号明細書に記載される、当業者に公知な方法に従い調製され得る。
ｉＲＮＡ剤の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％に有効な治療量）を決定するために、細胞培養物または実験動物における標準的な医薬手順により決定され得る。毒性作用と治療作用間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表される。高治療指数を表すｉＲＮＡ剤が好ましい。
細胞培養検定および動物研究から得られたデータは、ヒトでの使用に対する様々な投与量を製剤化するのに使用され得る。本発明の組成物の投与量は、好ましくは、ほぼ毒性がない、または全く毒性がないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、利用される投与形態および使用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明の方法に使用される任意のｉＲＮＡ剤において、治療有効量は、最初に、細胞培養検定から推定され得る。用量は、細胞培養物で決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半値を達成する試験ｉＲＮＡ剤の濃度）を含む、ｉＲＮＡ剤の、または好適な場合、標的配列のペプチド産物（例えば、低減されたポリペプチド濃度を達成する）の循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて製剤化され得る。このような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用され得る。血漿レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
上述のように、これらの個別のまたは複数の投与に加えて、本発明に関連するｉＲＮＡ剤は、ウイルス感染および疾病を治療するのに有効な他の公知の薬剤と組み合わせて投与され得る。任意の事象において、投与医師は、当該技術分野で公知の、または本明細書に記載される有効性の標準的な手段を使用して観察される結果に基づき、ｉＲＮＡ剤投与量およびタイミングを調節することができる。
経口投与において、本発明に有用なｉＲＮＡ剤は、一般的に、錠剤もしくはカプセルの形態で、粉末もしくは顆粒として、または水性溶液もしくは懸濁液として提供される。
本発明により包含される医薬組成物は、これらに限定されないが、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、眼球、直腸、膣および局所（頬側および舌下）投与を含む、経口または非経口経路を含む、当該技術分野で公知の任意の手段により投与され得る。好ましい実施形態において、医薬組成物は、静脈内または非経口的内部注入もしくは注射により投与される。医薬組成物は、また、実質内、くも膜下腔内、および／または定位注射により投与され得る。
増加した安定性を有するｉＲＮＡ剤を同定するための方法
さらに別の態様において、本発明は、血清等の生体組織および流体において、増加した安定性を有するｉＲＮＡ剤を同定するための方法に関する。増加した安定性を有するｉＲＮＡ剤は、例えば、通常ＲＮＡ分子を分解する化学物質またはヌクレアーゼ（特にエンドヌクレアーゼ）により、分解に対して高い耐性を有する。核酸安定性の増加を検出するための方法は、当該技術分野において周知である。任意の測定可能な物理的パラメータにおいて、試験ｉＲＮＡ剤と対照ｉＲＮＡ剤との間の相違を測定または検出することができる任意の検定は、本発明の方法での使用に適してい得る。概して、標的遺伝子活性または発現に対するｉＲＮＡ剤の阻害作用は、分子が無損傷であることが要求されるため、特定のｉＲＮＡ剤の安定性は、遺伝子の発現に関連する特性を観察または測定することにより、間接的に評価され得る。したがって、ｉＲＮＡ剤の相対的安定性は、（１）標的遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルの不在または観察可能な減少、（２）標的遺伝子からのｍＲＮＡ産生のレベルの不在または観察可能な減少、および（３）標的遺伝子の発現と関連する表現型の変化もしくは欠損を観察または検出することにより決定され得る。医学的治療に関連して、ｉＲＮＡ剤の安定性は、標的遺伝子の発現または機能の阻害の程度に基づき評価されてもよく、これは、同様に症状の軽減、寛解、もしくは疾病状態の変化等の、患者の疾病状態の変化に基づき評価され得る。
一実施形態において、方法は、上述のように（例えば、化学合成を通して）ｉＲＮＡ剤を調製すること、生体試料を用いてｉＲＮＡ剤をインキュベートすること、次いで、対照ｉＲＮＡ剤と比較して増加した安定性を示すこれらのｉＲＮＡ剤を分析し、同定することを含む。
例示的な実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、好ましくは、少なくとも約３：７のモル比、より好ましくは約４：６のモル比、最も好ましくは基本的に等モル量（例えば、約５：５のモル比）で、相補的一本鎖のＲＮＡ鎖を混合／アニールすることにより生体外産生される。好ましくは、一本鎖のＲＮＡ鎖は、混合／アニール前に変性され、混合／アニール反応が起こる緩衝剤は、塩、好ましくは塩化カリウムを含有する。一本鎖のＲＮＡ鎖は、上述のように、例えば、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｐｐｌｅｒａ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、固相合成により合成され得る。
ｉＲＮＡ剤は、酵素機能に十分なまたは最適な条件下で、生体試料を用いてインキュベートされる。生体試料を用いたインキュベート後、ｉＲＮＡ剤の安定性は、当該技術分野において慣習的な手段、例えば、本明細書に例示されるＲＮＡゲル電気泳動法により合成される。例えば、試料が血清の場合ｉＲＮＡ剤は、１〜１０μＭ、好ましくは２〜８μＭ、より好ましくは３〜６μＭ、最も好ましくは４〜５μＭの濃度でインキュベートされ得る。インキュベートの温度は、好ましくは２５℃〜４５℃の間、より好ましくは３５℃〜４０℃の間、最も好ましくは約３７℃である。
インキュベートの工程で使用される生体試料は、組織、細胞、生体流体またはそれらの単離物であってもよい。例えば、生体試料は、全生体、またはその組織もしくは細胞のサブセット等の、対象から単離され得る。血液、血清、血漿、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊臍帯血、尿、膣液、および精液を含む、体液等の生体試料も対象の構成要素の一部であってもよい。好ましくは、生体試料は、対象の血液試料由来の血清である。対象は、好ましくは、哺乳類、より好ましくはヒトまたはマウスである。
別の実施形態において、方法は、ｉＲＮＡ剤の導入後、細胞の標的遺伝子のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現レベルを測定することにより、増加した安定性を有するｉＲＮＡ剤を選択することを含む。この実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤は、細胞の標的遺伝子の発現を阻害し、したがって、方法は、対照ｉＲＮＡ剤と比較して、標的遺伝子の発現において測定可能な減少を誘発するｉＲＮＡ剤を選択することを含む。ＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを監視することによる遺伝子発現を測定する検定は、ｉＲＮＡ剤の細胞による取り込み後約２４時間内に実施され得る。例えば、ＲＮＡレベルは、当該技術分野において公知のノーザンブロット法、ＲＮＡｓｅ保護検定、または精度管理ＰＣＲ（ＱＣ−ＰＣＲ）（定量的逆転写を組み合わせたＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ））、およ類似方法により測定され得る。タンパク質レベルは、例えば、ウエスタンブロット法、フローサイトメトリー、または受容体遺伝子発現（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光受容体タンパク質の発現）により検定され得る。標的遺伝子発現により生じるＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルは、試験ｉＲＮＡ剤の導入後、通常の時間間隔で測定され得、レベルは、対照ｉＲＮＡ剤の細胞への導入後のものを比較される。対照ｉＲＮＡ剤は、対象に存在しない遺伝子（例えば、ｉＲＮＡ剤がヒト細胞で試験された場合、ルシフェラーゼ遺伝子）を標的とするｉＲＮＡ剤、または標的遺伝子の発現抑制に効果がないことが以前に示されているｉＲＮＡ剤である、無意味なｉＲＮＡ剤（すなわち、対象の任意のヌクレオチド配列を標的としない置換された配列を有するｉＲＮＡ剤）であり得る。試験試料および対照試料のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルが比較され得る。試験ｉＲＮＡ剤は、対照ｉＲＮＡ剤と比較して、試験ｉＲＮＡ剤の吸収後の発現レベルが測定可能な減少である時に増加した安定性を有するものとして選択される。ｍＲＮＡおよびタンパク質測定は、任意の当該技術分野で認識される技法を使用して行われ得る（例えば、Ｃｈｉａｎｇ，Ｍ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：１８１６２−７１、Ｆｉｓｈｅｒ，Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９３）２１：３８５７、およびＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６） ２７１：２８２５９を参照のこと）。
遺伝子発現を阻害する能力を伴うｉＲＮＡ剤を同定するための方法
遺伝子発現を阻害するための本発明のｉＲＮＡ剤組成物の能力は、当該技術分野で公知の種々の技法を使用して測定され得る。例えば、ノーザンブロット解析は、標的タンパク質をコードするＲＮＡの存在を測定するように使用され得る。標的遺伝子により産生された特定のｍＲＮＡのレベルは、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを使用して測定され得る。ｉＲＮＡ剤は、ＲＮＡｉを通して内因性ｍＲＮＡの配列特異的分解を導くため、本発明の選択法は、標的ＲＮＡの測定可能な減少を検出することができる任意の技法を包含する。さらに別の実施例において、ウエスタンブロット法は、存在する標的タンパク質量を測定するように使用され得る。さらに別の実施形態において、タンパク質量により影響を受ける表現型を検出することができる。ウエスタンブロット法を実施するための技法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９６） ２７１：２８２５９を参照のこと）。
標的遺伝子が、標的遺伝子のプロモーター配列を標的とするｉＲＮＡ剤により発現抑制される時、標的遺伝子は、受容体遺伝子に縮合され得、受容体遺伝子発現（例えば、転写および／または翻訳）が監視され得る。同様に、標的遺伝子が、プロモーター以外の配列を標的とするｉＲＮＡ剤により発現抑制される時、標的遺伝子の一部（例えば、標的配列を含む一部）は、受容体遺伝子が転写されるように受容体遺伝子と縮合され得る。ｉＲＮＡ剤の存在下で受容体遺伝子の発現における変化を監視することにより、受容体遺伝子の発現の阻害においてｉＲＮＡ剤の有効性を決定することが可能である。次いで、対照ｉＲＮＡ剤に対する試験ｉＲＮＡ剤の存在下の受容体遺伝子の発現レベルが比較される。試験ｉＲＮＡ剤は、対照ｉＲＮＡ剤と比較して受容体遺伝子の発現レベルが測定可能な減少である時に、増加した安定性を有するように選択される。本発明での使用に有用な受容体遺伝子の例としては、これらに限定されないが、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、クロラムアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシターゼ、およびアルカリホスファターゼについてコードするものが挙げられる。好適な受容体は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８９）、Ｇｏｕｌｄ，Ｓ．Ｊ．，ａｎｄ Ｓ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）７：４０４−４０８、Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）２：１０４４−１０５１、およびＳｅｌｄｅｎ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）６：３１７３−３１７９に記載され、それぞれ、参照により本明細書に援用される。
特に記載されない限り、本明細書に使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する当業者により通常理解される同様の意味を有する。本明細書に記載されるものと類似する、または等しい方法および材料が、本発明の実践または試験に使用され得るが、好適な方法および材料は、以下に記載される。本明細書に記載される全ての出版物、特許出願、および他の参考文献は、参照によりその全体が援用される。矛盾がある場合、定義を含み、本明細書に準ずる。加えて、材料、方法、および実施例は、単に例示であって、制限されるものではない。
合成方法
本発明のｉＲＮＡ剤は、参照によりその全体が援用される以下の参考文献等の当該技術分野で公知の一般的な手順に従い調製される。
１． Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ． Ｖａｇｈｅｆｉ， Ｍ． Ｍ．． Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）： Ｖａｇｈｅｆｉ， Ｍｏｒｔｅｚａ． Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｎａｌｏｇｓ， ２００５， １０５−１１３．
２． Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ５’−ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｔｏ ｃａｐｐｅｄ ｍ７Ｇｐｐｐ−ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ａｓ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｂｒｏｗｎｌｅｅ， Ｇ． Ｇ．； Ｆｏｄｏｒ， Ｅ．； Ｐｒｉｔｌｏｖｅ， Ｄ． Ｃ．； Ｇｏｕｌｄ， Ｋ． Ｇ．； Ｄａｌｌｕｇｅ， Ｊ． Ｊ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９５， ２３（１４）， ２６４１−７．
３． Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ５’−ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｎｄ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ３’，５’ ＡｐＡ， ＡｐＧ， ＧｐＡ ａｎｄ ＧｐＧ． ＣＤ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒｏｕｐｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ３’，５’ ＧｐＧ． Ｔｏｍａｓｚ， Ｊ．； Ｓｉｍｏｎｃｓｉｔｓ， Ａ．； Ｋａｊｔａｒ， Ｍ．； Ｋｒｕｇ， Ｒ． Ｍ．； Ｓｈａｔｋｉｎ， Ａ． Ｊ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９７８， ５（８）， ２９４５−５７．
４． Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｅｕｈａｒｙｔｉｃ ｃｅｌｌｓ： ｐｐｐＡ２’，５’Ａ２’，５’Ａ ａｎｄ ｓｏｍｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ． Ｈａｒｔｏｇ， Ｊ． Ａ． Ｊ． ｄｅｎ； Ｗｉｊｎａｎｄｓ， Ｒ． Ａ．； ｖａｎ Ｂｏｏｍ， Ｊ． Ｈ．； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ ７， １９８０， １５７−１６６．
５． Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ５’−０−（１−ｔｈｉｏｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）， ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ ａｎｄ ２’，３’−ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ２−ｃｈｌｏｒｏ−４Ｈ−１，３，２−ｂｅｎｚｏｄｉｏｘａｐｈｏｓｐｈｏｒｉｎ−４−ｏｎｅ． Ｌｕｄｗｉｇ， Ｊａｎｏｓ； Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， Ｆｒｉｔｚ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， １９８９， ５４（３）， ６３１−３５．
６． Ｎｏｖｅｌ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ α −ｔｈｉｏ ａｎａｌｏｇｓ． Ｇａｕｒ， Ｒ． Ｋ．； Ｓｐｒｏａｔ， Ｂ． Ｓ．； Ｋｒｕｐｐ， Ｇｕｉｄｏ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． １９９２， ３３（２３）， ３３０１−４．
７． Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ ａｐｐｒｏａｃｈ． Ｌｅｂｅｄｅｖ， Ａ． Ｖ．； Ｋｏｕｋｈａｒｅｖａ， Ｉ． Ｉ．； Ｂｅｃｋ， Ｔ．； Ｖａｇｈｅｆｉ， Ｍ． Ｍ． Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ， Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， ２００１， ２０（４−７），１４０３−１４０９．
８． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＮＴＰ ａｎａｌｏｇｓ ｗｉｔｈ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｈａｉｎｓ． Ｋｏｕｋｈａｒｅｖａ， Ｉｎｎａ； Ｖａｇｈｅｆｉ， Ｍｏｒｔｅｚａ； Ｌｅｂｅｄｅｖ， Ａｌｅｘａｎｄｒｅ． Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）： Ｖａｇｈｅｆｉ， Ｍ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｎａｌｏｇｓ， ２００５， ３９−１０４ （ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｃｉｔｅｄ ｔｈｅｒｅ ｉｎ）
９． Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ａｎａｌｏｇｓ： Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｖａｇｈｅｆｉ， Ｍ．； Ｅｄｉｔｏｒ． ＵＳＡ． ２００５， ３９３ ｐｐ． Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ： ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＬＣ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌａ． （ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｃｉｔｅｄ ｔｈｅｒｅ ｉｎ）．
Figure 2012502040
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ＲＮＡ ５’三リン酸塩合成：
ＲＮＡ５’三リン酸塩の合成は、５’三リン酸塩部分または修飾類似体の導入のための種々の２’Ｏ保護基対策ならびに種々の化学性質を含む。
ＲＮＡ５’−三リン酸塩（ＲＮＡＴＰ）は、２’ヒドロキシルの代替保護基を含む種々の手段で、効果的に調節され得る。今までに開発され、報告されている全ての２’保護基（ＲＢｅａｕｃａｇｅ，Ｃｕｒ．Ｏｐ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．，２００８，１１，２０３により概説されている）は、ＲＮＡＴＰの合成に使用され得る。これらは、ＴＢＤＭＳ、ＴＯＭ、ＣＥＭ等の周知のフルオロ不安定基だけでなく、非フッ化物イオン条件で切断される保護基も特に関心がもたれる。これは、フッ化物イオン治療の延長および／または加熱過程が、ＲＮＡＴＰを損傷し、収率を低減するためである。同様に、増殖／脱塩過程の延長は、同様の作用を有する。
これらの全ての代替合成は、自動化ＲＮＡ合成用の単量体形成ブロックとして容易に入手可能な、３’ホスホラミダイト形成ブロック（スキームの化合物ａ）の使用を含む。塩基不安定（高速不安定）保護基は、優先的に使用されるため（すなわち、Ｃに対してアセチル、ＡおよびＧに対してフェノキシアセチル（Ｐａｃ）、ならびに／またはＧに対してｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル（ｔＢｕＰａｃ）およびイソ−プロピルフェノキシアセチル（ｉＰｒＰａｃ））、これらの単量体形成ブロック（スキームのＢＰＧに留意）の核酸塩基の環外アミノ基の保護基の選択も、調節され得る。これらの高速不安定保護基は、標準的な保護基に必要であるため、反応混合物を加熱せずに除去される利点を有する。この後者の点は、標的ＲＮＡＴＰの収率を向上する。
ＲＮＡＴＰ合成の実施例、種々の２’保護基の表示、Ｌｕｄｗｉｇホスフィチル化試薬を使用する全てを記載する（Ｌｕｄｗｉｇ ａｎｄ Ｅｋｃｓｔｅｉｎ，１９８９，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５４，６３１）。
Figure 2012502040
スキーム６：標的ＲＮＡＴＰは、２’ｔｅｒｔ−ブチルジチオメチル（ＤＴＭ）保護基を使用して合成され得る（Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２８，１２３５６）。対応する核酸塩基保護された（標準または高速不安定ＰＧ）５’ＤＭＴｒ ３’ホスホラミダイト（１０１ａ）は、固体支持体（スクシニル連結ＬＣＡＡ ＣＰＧ）上で標準的な条件を使用して、自動化ＲＮＡ合成で使用される。他の支持体およびリンカーも容易に使用され得る。５’末端ＤＭＴｒ基（５’ＯＨ、化合物１０１ｂ）を欠損する、得られた固体支持オリゴヌクレオチドは、過剰なサリチルホスホロクロリダイト（ｓａｌｉｃｙｌｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｃｈｌｏｒｉｄｉｔｅ）含有ピリジンを使用した、ホスフィチル化反応を含む（Ｌｕｄｗｉｇ ａｎｄ Ｅｋｃｓｔｅｉｎ，１９８９，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５４，６３１）。室温で、３０分間、０．５Ｍのホスフィチル化試薬溶液とともに固体支持体を振蘯した後、溶液を洗い流し、固体支持体を乾燥アセトニトリルでよく洗浄する。次いで、０．５Ｍのトリブチルアンモニウムピロリン酸含有ＤＭＦを固体支持されたオリゴヌクレオチドに導入し、２４時間振蘯する。溶液を洗い流した後、標準的な試薬を使用して、得られたオリゴヌクレオチド（１０１ｃ）を酸化するか、または硫化する。次いで、アンモニアで処理する時に、対応する環式ＴＰ（１０１ｄ）を加水分解し、同時に固体支持体からのオリゴヌクレオチドのデブロック化（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）、および核酸塩基の脱保護を可能にする。最後に、５５℃で、ＤＴＴまたはＴＣＥＰ含有ｐＨ７．６緩衝液等の還元剤を使用して全ての２’ＤＴＭ基を除去し、標的ＲＮＡＴＰまたはＲＮＡ（αＳ）ＴＰを得る。
Figure 2012502040
スキーム７：標的ＲＮＡＴＰは２’アセタールレブリニル（ＡＬＥ）保護基を使用して合成され得る（Ｄａｍｈａ ｅｔ ａｌ，２００９，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１３１，８４９６）。対応する塩基保護された（ＰＧ＝ＡおよびＣに対してレブリニル、Ｇに対してＤＭＦ）、５’ＤＭＴｒ ３’ホスホラミダイト（１０２ａ）は、固体支持体上で標準的な条件を使用して自動化ＲＮＡ合成で使用される（ＱリンカーＬＣＡＡ ＣＰＧがこの２’保護基とともに使用される）。他の支持体およびリンカーも使用され得ると思われる。５’末端ＤＭＴｒ基（５’ＯＨ、化合物１０２ｂ）を欠損する、得られた固体支持されたオリゴヌクレオチドは、過剰なサリチルホスホロクロリダイト含有ピリジンを使用した、ホスフィチル化反応を含む。室温で、３０分間、ホスフィチル化試薬とともに固体支持体を振蘯した後、溶液を洗い流し、固体支持体を乾燥アセトニトリルでよく洗浄する。次いで、０．５Ｍのトリブチルアンモニウムピロリン酸含有ＤＭＦを固体支持されたオリゴヌクレオチドに導入し、２４時間振蘯する。溶液を洗い流した後、標準的な試薬を使用して、得られたオリゴヌクレオチド（１０２ｃ）を酸化するか、または硫化する。次いで、ＡＣＮ中に水を添加することにより、対応する環式ＴＰ（１０２ｄ）を加水分解した後、乾燥ＡＣＮで洗浄し、アルゴンフラッシュ下で良く乾燥させた。特定のデブロック化条件がＡＬＥ基に使用される、つまり、最初に骨格シアノエチル基は、トリエチルアミン含有無水アセトニトリルで処理される時に除去される。次いで、ＡｃＯＨとピリジンの混合緩衝液中のヒドラジン水和物で処理される時に、塩基保護基と一緒に２’ＡＬＥ基が切断される。最後に、室温でＱリンカーを１Ｍ ＴＢＡＦで切断し、標的ＲＮＡＴＰまたはＲＮＡ（αＳ）ＴＰを得る。
Figure 2012502040
スキーム８：標的ＲＮＡＴＰは、２’ビスアセトキシエトキシメチル（ＡＣＥ）保護基を使用して合成され得る（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０，１１８２０）。対応する塩基保護された（標準または高速不安定ＰＧ）５’シリル（ＤＯＤ）３’ホスホラミダイト（１０３ａ）は、商業的に入手可能であり、固体支持体（スクシニル連結ＬＣＡＡ ＣＰＧ）上で、標準的な条件を使用して、自動化ＲＮＡ合成で使用される。他の支持体およびリンカーも容易に使用され得る。５’末端シリル基（５’ＯＨ、化合物１０３ｂ）を欠損する、得られた固体支持されたオリゴヌクレオチドは、過剰なサリチルホスホロクロリダイト含有ピリジンを使用した、ホスフィチル化反応を含む。室温で、３０分間、０．５Ｍのホスフィチル化試薬溶液とともに固体支持体を振蘯した後、溶液を洗い流し、固体支持体を乾燥アセトニトリルでよく洗浄する。次いで、０．５Ｍのトリブチルアンモニウムピロリン酸含有ＤＭＦを固体支持されたオリゴヌクレオチドに導入し、２４時間振蘯する。溶液を洗い流した後、標準的な試薬を使用して、得られたオリゴヌクレオチド（１０３ｃ）を酸化するか、または硫化する。次いで、アンモニアで処理する時に、対応する環式ＴＰ（１０３ｄ）を加水分解し、同時に固体支持体からのオリゴヌクレオチドのデブロック化、および核酸塩基の脱保護を可能にする。最後に、僅かに酸性のｐＨ３緩衝液を使用して、全ての２’ＡＣＥ基を除去し、標的ＲＮＡＴＰまたはＲＮＡ（αＳ）ＴＰを得る。
Figure 2012502040
スキーム９：標的ＲＮＡＴＰは、酸不安定２’ＣｔｍｐまたはＦｐｍｐ保護基を使用して合成され得る（Ｒｅｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，２２０９）。対応する塩基保護された（標準または高速不安定ＰＧ）５’ＤＭＴｒ ３’ホスホラミダイト（１０４ａ）は、商業的に入手可能であり、固体支持体（スクシニル連結ＬＣＡＡ ＣＰＧ）上で、標準的な条件を使用して、自動化ＲＮＡ合成で使用される。他の支持体およびリンカーも容易に使用され得る。５’末端ＤＭＴｒ基（５’ＯＨ、化合物１０４ｂ）を欠損する、得られた固体支持されたオリゴヌクレオチドは、過剰なサリチルホスホロクロリダイト含有ピリジンを使用した、ホスフィチル化反応を含む。室温で、３０分間、０．５Ｍのホスフィチル化試薬溶液とともに固体支持体を振蘯した後、溶液を洗い流し、固体支持体を乾燥アセトニトリルでよく洗浄する。次いで、０．５Ｍのトリブチルアンモニウムピロリン酸含有ＤＭＦを固体支持されたオリゴヌクレオチドに導入し、２４時間振蘯する。溶液を洗い流した後、標準的な試薬を使用して、得られたオリゴヌクレオチド（１０４ｃ）を酸化するか、または硫化する。次いで、アンモニアで処理する時に、対応する環式ＴＰ（１０４ｄ）を加水分解し、同時に固体支持体からのオリゴヌクレオチドのデブロック化、および核酸塩基の脱保護を可能にする。最後に、酸性のｐＨ ２．０〜２．３緩衝液を使用して、全ての２’Ｃｔｍｐ／Ｆｔｍｐ基を除去し、標的ＲＮＡＴＰまたはＲＮＡ（αＳ）ＴＰを得る。
２’保護基および／または核酸塩基の標準または高速不安定保護基の変形と組み合わせて、三リン酸塩（または修飾されたα−チオまたはα−ボラノ類似体）部分を固体支持されたオリゴヌクレオチドに導入するための、前述のＬｕｄｗｉｇ−Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法以外のいくつかの異なる方式が適用され得る。これらは、種々の５’ビス（モノまたはポリ置換された）アリール亜リン酸トリエステル、５’ホスホロジアミダイト、５’オキソチアもしくはジチアホスホ−２−レーン、または固体支持された５’モノ（チオ）リン酸塩の使用および調製を含む。いくつかの実施例を以下に記載する。ＲＮＡ５’アルファチオ三リン酸塩および５’アルファジチオ三リン酸塩の合成において、ジフェニルチオ亜リン酸を使用した、５’Ｈ−ホスホノチオエートおよび５’Ｈ−ホスホノジチオエートの使用および調製物を記載する。
スキーム５〜８：一般的な方式において、Ｌｕｄｗｉｇ試薬のサリチル部分は、異なる電子求引基（ＥＷＧ）によりモノまたはポリ置換されるビスアリール部分により置換され得る。このようなＥＷＧは、ニトロ、シアノ、オルソ−クロロ、オルソ−フルオロ、オルソ，パラ、ジ−クロロ、オルソ，パラ−ジ−フルオロ、ペンタクロロ、ペンタフルオロ等であり得る。トリブチルアンモニウムピロリン酸塩との反応後、このようなＯ，Ｏ−ビスアリールホスホロクロリダイトを使用して環式中間体（ｃ）を得る。酸化／硫化またはボラン複合体生成工程後、続いて、脱保護および支持体切断工程後、標的ＲＮＡＴＰまたは修飾された類似体が、同様の様式で得られる。種々の２’保護基を表すいくつかの実施例は、スキーム５〜８に図示され、後に簡単に説明される。
Figure 2012502040
スキーム１０：最も一般的に使用される２’ＴＢＤＭＳ保護された５’ＤＭＴｒ ３’ホスホラミダイト（１０５ａ）および標準の固体支持されたＲＮＡ合成の条件は、５’ＯＨオリゴヌクレオチド（化合物１０５ｂ）の構築に使用され得る。次いで、乾燥ピリジン中の過剰Ｏ，Ｏ−ビスアリールホスホロクロリダイト含有溶液を使用した、ホスフィチル化反応に関与する。室温で、３０分間、０．５Ｍのホスフィチル化試薬溶液とともに固体支持体を振蘯した後、溶液を洗い流し、固体支持体を乾燥アセトニトリルでよく洗浄し、アルゴンフラックスで乾燥させる。次いで、０．５Ｍのトリブチルアンモニウムピロリン酸含有ＤＭＦを固体支持されたオリゴヌクレオチドに導入し、２４時間振蘯する。溶液を洗い流した後、標準的な試薬を使用して、得られたオリゴヌクレオチド（１０５ｃ）を酸化、硫化、または好適なボロン複合体と反応させる。次いで、アンモニアで処理する時に、対応する環式ＴＰ（１０５ｄ）を加水分解し、同時に固体支持体からのオリゴヌクレオチドのデブロック化、および核酸塩基の脱保護を可能にする。最後に、ＨＦ−ピリジンを使用して、全ての２’ＴＢＤＭＳ基を除去し、標的ＲＮＡＴＰ、ＲＮＡ（αＳ）ＴＰまたはＲＮＡ（αＢＨ３）ＴＰを得る。
Figure 2012502040
スキーム１１：２’ＡＬＥ保護された５’ＤＭＴｒ３’ホスホラミダイト（１０２ａ）および標準の固体支持されたＲＮＡ合成条件は、スキーム２で前述される、５’ＯＨオリゴヌクレオチド（化合物１０２ｂ）の構築に使用され得る。次いで、乾燥ピリジン中の過剰Ｏ，Ｏ，Ｏ−トリス４−ニトロフェニル亜リン酸含有溶液を使用した、ホスフィチル化反応に関与する。室温で、３０分間、０．５Ｍのホスフィチル化試薬溶液とともに固体支持体を振蘯した後、溶液を洗い流し、固体支持体を乾燥アセトニトリルでよく洗浄する。次いで、０．５Ｍのトリブチルアンモニウムピロリン酸含有ＤＭＦを固体支持されたオリゴヌクレオチドに導入し、２４時間振蘯する。溶液を洗い流した後、標準的な試薬を使用して、得られたオリゴヌクレオチド（１０２ｃ）を酸化、硫化、または好適なボロン複合体と反応させる。前述の（１０２ｄ）の加水分解およびデブロック化工程により標的ＲＮＡＴＰ、ＲＮＡ（αＳ）ＴＰまたはＲＮＡ（αＢＨ３）ＴＰを得る。
Figure 2012502040
スキーム１２：２’ＡＣＥ保護されたホスホラミダイト（１０３ａ）および標準の固体支持されたＲＮＡ合成条件は、スキーム３で前述される、５’ＯＨオリゴヌクレオチド（化合物１０３ｂ）の構築に使用され得る。次いで、乾燥ピリジン中の過剰Ｏ，Ｏ−ビス４−シアノホスホロクロリダイト含有溶液を使用した、ホスフィチル４化反応に関与する。室温で、３０分間、０．５Ｍのホスフィチル化試薬溶液とともに固体支持体を振蘯した後、溶液を洗い流し、固体支持体を乾燥アセトニトリルでよく洗浄する。次いで、０．５Ｍのトリブチルアンモニウムピロリン酸含有ＤＭＦを固体支持されたオリゴヌクレオチドに導入し、２４時間振蘯する。溶液を洗い流した後、標準的な試薬を使用して、得られたオリゴヌクレオチド（１０３ｃ）を酸化、硫化、または好適なボロン複合体と反応させる。前述の（１０３ｄ）の加水分解およびデブロック化工程により標的ＲＮＡＴＰ、ＲＮＡ（αＳ）ＴＰまたはＲＮＡ（αＢＨ３）ＴＰを得る。
Figure 2012502040
スキーム１３：２’Ｃｔｍｐ／Ｆｔｍｐ保護されたホスホラミダイト（１０４ａ）および標準の固体支持されたＲＮＡ合成条件は、スキーム４で前述される、５’ＯＨオリゴヌクレオチド（化合物１０４ｂ）の構築に使用され得る。次いで、乾燥ピリジン中の過剰Ｏ，Ｏ−ビス２，４−ジクロロホスホロクロリダイト含有溶液を使用した、ホスフィチル４化反応に関与する。室温で、３０分間、０．５Ｍ溶液のホスフィチル化試薬とともに固体支持体を振蘯した後、溶液を洗い流し、固体支持体を乾燥アセトニトリルでよく洗浄する。次いで、０．５Ｍのトリブチルアンモニウムピロリン酸含有ＤＭＦを固体支持されたオリゴヌクレオチドに導入し、２４時間振蘯する。溶液を洗い流した後、標準的な試薬を使用して、得られたオリゴヌクレオチド（１０４ｃ）を酸化、硫化、または好適なボロン複合体と反応させる。前述の（１０４ｄ）の加水分解およびデブロック化工程により標的ＲＮＡＴＰ、ＲＮＡ（αＳ）ＴＰまたはＲＮＡ（αＢＨ３）ＴＰを得る。
スキーム１４〜１７：一般的な方式において、オリゴヌクレオチド５’ホスホロジアミダイトを、テトラゾールの存在下で、トリブチルアンモニウムと反応させ、前述の環式中間体（ｃ）を得る（Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，５，２４０１； Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．２００２， Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４５，５３８４）。酸化／硫化またはボラン複合体生成工程後、続いて、脱保護および支持体切断工程の後に、標的ＲＮＡＴＰまたは修飾された類似体が、同様の様式で得られる。種々の２’保護基を表すいくつかの実施例は、スキーム９〜１２に図示され、後に簡単に説明される。
Figure 2012502040
スキーム１４：２’ＴＢＤＭＳ保護された５’ＤＭＴｒ３’ホスホラミダイト（１０５ａ）および標準の固体支持されたＲＮＡ合成条件は、スキーム５で前述される、５’ＯＨオリゴヌクレオチド（化合物１０５ａ）の構築に使用され得る。次いで、乾燥ピリジン中の過剰クロロ−Ｎ，Ｎ−テトライソプロピル−ホスホロビスアミダイト含有溶液を使用した、ホスフィチル化反応に関与する。室温で、３０分間、０．５Ｍ溶液のホスフィチル化試薬とともに固体支持体を振蘯した後、溶液を洗い流し、固体支持体を乾燥アセトニトリルでよく洗浄する。次いで、０．５Ｍのトリブチルアンモニウムピロリン酸含有ＤＭＦを固体支持されたオリゴヌクレオチドに導入し、２４時間振蘯する。溶液を洗い流した後、標準的な試薬を使用して、得られたオリゴヌクレオチド（１０５ｃ）を酸化、硫化、または好適なボロン複合体と反応させる。対応する環式ＴＰ（１０５ｄ）は、次いで、前述のように加水分解、デブロック化し、標的ＲＮＡＴＰ、ＲＮＡ（αＳ）ＴＰまたはＲＮＡ（αＢＨ３）ＴＰを得る。
Figure 2012502040
スキーム１５：２’Ｃｔｍｐ／Ｆｔｍｐ保護されたホスホラミダイト（１０４ａ）および標準の固体支持されたＲＮＡ合成条件は、スキーム４で前述される、５’ＯＨオリゴヌクレオチド（化合物１０４ｂ）の構築に使用され得る。次いで、テトラゾール溶液を含有する乾燥ＡＣＮの過剰Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサイソプロピル−ホスホロトリスアミダイト含有用得域を使用した、ホスフィチル化反応に関与する。室温で、３０分間、０．５Ｍ溶液のホスフィチル化試薬およびテトラゾールとともに固体支持体を振蘯した後、溶液を洗い流し、固体支持体を乾燥アセトニトリルでよく洗浄する。次いで、０．５Ｍのトリブチルアンモニウムピロリン酸含有ＤＭＦを固体支持されたオリゴヌクレオチドに導入し、２４時間振蘯する。溶液を洗い流した後、標準的な試薬を使用して、得られたオリゴヌクレオチド（１０４ｃ）を酸化、硫化、または好適なボロン複合体と反応させる。前述の（１０４ｄ）の加水分解およびデブロック化工程により標的ＲＮＡＴＰ、ＲＮＡ（αＳ）ＴＰまたはＲＮＡ（αＢＨ３）ＴＰを得る。
Figure 2012502040
スキーム１６：２’ＡＣＥ保護されたホスホラミダイト（１０３ａ）および標準の固体支持されたＲＮＡ合成条件は、スキーム３で前述される、５’ＯＨオリゴヌクレオチド（化合物１０３ｂ）の構築に使用され得る。次いで、乾燥ピリジン中の過剰クロロ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピル−ホスホロビスアミダイト含有溶液を使用した、ホスフィチル化反応に関与する。室温で、３０分間、０．５Ｍ溶液のホスフィチル化試薬とともに固体支持体を振蘯した後、溶液を洗い流し、固体支持体を乾燥アセトニトリルでよく洗浄する。次いで、０．５Ｍのトリブチルアンモニウムピロリン酸含有ＤＭＦを固体支持されたオリゴヌクレオチドに導入し、２４時間振蘯する。溶液を洗い流した後、標準的な試薬を使用して、得られたオリゴヌクレオチド（１０３ｃ）を酸化、硫化、または好適なボロン複合体と反応させる。前述の（１０３ｄ）の加水分解およびデブロック化工程により標的ＲＮＡＴＰ、ＲＮＡ（αＳ）ＴＰまたはＲＮＡ（αＢＨ３）ＴＰを得る。
Figure 2012502040
スキーム１７：２’ＡＣＥ保護されたホスホラミダイト（１０３ａ）および標準の固体支持されたＲＮＡ合成条件は、スキーム３で前述される、５’ＯＨオリゴヌクレオチド（化合物１０３ｂ）の構築に使用され得る。次いで、乾燥ピリジン中の過剰クロロ−ホスホロビス−ピロロ−アミダイト含有溶液を使用した、ホスフィチル化反応に関与する。前述のスキーム１１の工程により、標的ＲＮＡＴＰ、ＲＮＡ（αＳ）ＴＰまたはＲＮＡ（αＢＨ３）ＴＰを得る。
スキーム１７〜１９：オリゴヌクレオチド５’（２−チオ，２−オキソまたは２−ボラノ）オキソチア、またはジチアホスホ−２−レーンを、共塩基触媒ＤＢＵの存在下で、無機ピロリン酸と反応させ、対応するＲＮＡＴＰ、ＲＮＡ（αＳ）ＴＰ、ＲＮＡ（αＳ２）ＴＰ、ＲＮＡ（αＢＨ３）ＴＰ、またはＲＮＡ（αＳ，ＢＨ３）ＴＰを得る（Ｏｋｒｕｓｚｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７，３８５０）。この修飾されたＴＰ部分の導入の対策は、前述の類似する様式で、２’保護基の変形を用いて使用され得る。いくつかの実施例を以下に記載する。
Figure 2012502040
スキーム１８：２’ＡＣＥ保護されたホスホラミダイト（１０３ａ）および標準の固体支持されたＲＮＡ合成条件は、スキーム３で前述される、５’ＯＨオリゴヌクレオチド（化合物１０３ｂ）の構築に使用され得る。次いで、乾燥ピリジン中の過剰クロロ−ホスホロビス−ピロロ−アミダイト含有溶液を使用した、ホスフィチル化反応に関与する。前述のスキーム１１の工程により、標的ＲＮＡＴＰ、ＲＮＡ（αＳ）ＴＰまたはＲＮＡ（αＢＨ３）ＴＰを得る。
用いて使用され得る。いくつかの実施例を以下に記載する。
Figure 2012502040
スキーム１９：２’ＡＣＥ保護された５’ＤＭＴｒ３’ホスホラミダイト（１０３ａ）および標準の固体支持されたＲＮＡ合成条件は、スキーム５に前述される、５’ＯＨオリゴヌクレオチド（化合物１０３ｂ）の構築に使用される。次いで、乾燥アセトニトリル中の過剰ジ−イソプロピル−オキソチアホスホ−２−レーンアミダイト含有溶液を使用した、ホスフィチル化反応に関与する。室温で、３０分間、乾燥ＡＣＮ中のテトラゾールの０．２５Ｍ溶液と予め混合された、０．５Ｍ溶液のホスフィチル化試薬とともに固体支持体を振蘯した後、溶液を洗い流し、固体支持体を乾燥アセトニトリルでよく洗浄し、さらに標準の試薬を用いて、酸化、硫化、または好適な複合体と反応させる、オリゴヌクレオチド５’オキソチアホスホレーン中間体（１０８ｃ）を得る。次いで、０．５Ｍのトリブチルアンモニウムピロリン酸溶液含有ＤＭＦを、触媒量のＤＢＵとともに固体支持されたオリゴヌクレオチドに添加し、２４時間振蘯し、ジチアホスホレーン環を開放し、未決定チオエチル基を排除し、αチオ／ジチオ／チオボラノ三リン酸塩中間体（１０９ｄ）を得る。次いで、このオリゴヌクレオチドＴＰを、スキーム３で前述の加水分解し、デブロック化し、標的ＲＮＡＴＰ、ＲＮＡ（αＳ）ＴＰまたはＲＮＡ（αＢＨ３）ＴＰを得る。
Figure 2012502040
スキーム２０：ヌクレオシド５’一リン酸塩は、対応するＮＴＰ合成のためのいくつかの効率的な方法に使用される、周知の中間体である（Ｂｕｒｇｅｓｓ ａｎｄ Ｃｏｏｋ，２０００，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１００，２０４７）。同様のアプローチとして、固体支持され、便宜的に保護されたオリゴヌクレオチドの５’一リン酸塩は、同様の様式で使用され得る。Ｏ，Ｏ−ビスシリル保護された５’ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、このような中間体の調製に使用され得る。５’ホスホトリエステルが、各５’工程脱保護に使用される条件を利用して脱保護され得るため、２’ＡＣＥ対策は、このような合成に最も好適であるようである。２ＡＣＥ保護された５’ＤＭＴｒ３’ホスホラミダイト（１０３ａ）および標準の固体支持されたＲＮＡ合成条件は、スキーム５で前述される、５’ＯＨオリゴヌクレオチド（化合物１０３ｂ）の構築に使用され得る。次いで、乾燥アセトニトリル中の過剰Ｏ，Ｏ−ビス−トリメチルシリルエチル−Ｎ，Ｎ−ジ−イソプロピルホスホラアミダイト含有溶液を使用した、ホスフィチル化反応に関与する。室温で、３０分間、乾燥ＡＣＮ中のテトラゾールの０．２５Ｍ溶液と予め混合された、０．５Ｍ溶液のホスフィチル化試薬とともに固体支持体を振蘯した後、溶液を洗い流し、固体支持体を乾燥アセトニトリルでよく洗浄し、標準の試薬を使用して、さらに酸化または硫化する２つのＴＳＥ保護基の脱保護は、１Ｍ ＴＢＡＦを使用して実施される。得られた５’一リン酸オリゴヌクレオチド（１１０ｃ）を、最初に、ＣＤＩまたはＤＰＰＣのいずれかを使用して活性化し、次いで、０．５Ｍ溶液のトリブチルアンモニウムピロリン酸含有ＤＭＦを固体支持されたオリゴヌクレオチドに添加し、２４時間振蘯し、対応する三リン酸塩中間体（１１１ｄ）を得る。次いで、このオリゴヌクレオチドＴＰをスキーム３で前述の加水分解し、デブロック化し、標的ＲＮＡＴＰまたはＲＮＡ（αＳ）ＴＰを得る。
Figure 2012502040
Figure 2012502040
スキーム２１および２２：ＲＮＡ（αＳ）ＴＰおよびＲＮＡ（αＳ２）ＴＰ方向への別の可能な経路は、５’Ｈ−ホスホノチオエートまたはホスホノジチオエートオリゴヌクレオチド（それぞれ、１１２ｃおよび１１４ｃ、スキーム１６および１７、Ｘ＝Ｏ、ならびにＸ＝Ｓ）の使用を含む。後者は、５’ＯＨ固体支持されたオリゴヌクレオチド（化合物ｂ）を、以前に報告された商業的に入手可能なジフェニル亜リン酸塩から調製された、ジフェニルチオ亜リン酸塩（１２０、スキーム１６）と反応させた後、容易に調製され得る（Ｔａｓｈｍａ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，８，９６６）。このような様式において、１０５ｂ（スキーム１６）および１０３ｂ（スキーム１７）を０．５Ｍ溶液の１２０含有乾燥ピリジンと１時間反応させた後、続いて加水分解（Ｈ２Ｏ−ＮＥｔ３）または硫化（ＴＭＳ２Ｓ−ＮＥｔ３）し、対応する化合物１１２ｃおよび１１４ｃ（それぞれ、スキーム１６および１７、Ｘ＝Ｏ、ならびにＸ＝Ｓ）を得る。後者は、対応するピリジニウムチオホスホラアミダイトの形成を可能にする、ピリジンを含有するシリル化剤の存在下で、ヨウ素によりさらに酸化される（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００８，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，１０，７０３）、チオ三リン酸塩（Ｘ＝Ｏ）１１３ｄ（スキーム１６）および１１５ｄ（スキーム１７）または対応するジチオ三リン酸塩（Ｘ＝Ｓ）を得るために、トリブチルアンモニウムピロリン酸と反応する、スキーム５および３に前述される条件を使用して、固体支持体からの脱保護および切断の後、標的ＲＮＡ（αＳ）ＴＰおよびＲＮＡ（αＳ２）ＴＰを得る。
ＲＮＡ ５’−三リン酸塩の合成
Figure 2012502040
Figure 2012502040
アルゴン雰囲気下で、ＲＮＡ支持体（ＣＰＧ，２００ｍｇ）含有ペプチド合成槽にピリジン（０．５ｍＬ）を添加した後、２−ｃクロロ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オン（４０ｍｇ）含有無水１，４−ジオキサン（２ｍＬ）の溶液を添加した。反応槽を５時間アナログ振蘯機に設置した。陽圧のアルゴンを印加し、過剰試薬を除去した。支持体を無水１，４−ジオキサン（１０ｍＬ）で洗浄し、トリブチルアンモニウムピロリン酸（４５０ｍｇ）溶液含有乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）およびトリブチルアミン（０．５ｍＬ）を同時に添加した。アナログ振蘯機上で２２時間、反応槽を攪拌した後、陽圧のアルゴンを印加し、過剰試薬を除去した。支持体に１％ヨウ素溶液含有ピリジンおよび水（９８：２）を添加した。３０分後、陽圧のアルゴンを印加し、過剰試薬を除去した。支持体を冷１Ｍ ＴＥＡＢ緩衝液、次いでアセトンで洗浄した。支持体を乾燥させ、支持体を２０ｍＬバイアルに移動した。支持体をエタノール（１．８ｍＬ）と水酸化アンモニウム（５ｍＬ）の混合物中に懸濁した。室温で１５時間攪拌し、溶液を濾過し、支持体を１２ｍＬのＤＭＳＯで洗浄した。ＲＮＡ−三リン酸塩を含有する溶液を−２０℃で１５分間冷却し、冷ＨＦ／ＴＥＡ（７ｍＬ）溶液を添加した。反応フラスコをアナログ振蘯機上で８時間、室温で攪拌した。少量の反応混合物を水（４回）で希釈し、Ｄｉｏｎｅｘ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ−１００カラムを使用して、分析ＨＰＬＣで分析した。反応混合物のＨＰＬＣ分析は、ＲＮＡ−三リン酸塩の形成を明らかに示した。
反応混合物を水で１００ｍＬに希釈し、アニオン交換カラムクロマトグラフィーを使用して、産物を精製した。産物を２５ｍＭトリス（ｐＨ８．０）の勾配を使用して、２５ｍＭトリス（ｐＨ８．０）緩衝剤を含有する１Ｍ塩化アンモニウムに溶出した。産物を含有する好適な画分をプールし、逆相カラムクロマトグラフィーを使用して脱塩した。
ＲＮＡ５’−三リン酸塩の同定は、イオン交換ＨＰＬＣ分析およびＬＣ−ＭＳにより確立される。
Figure 2012502040
図１において、ＲＮＡ−三リン酸塩のイオン交換ＨＰＬＣ分析を示す。
図２において、ＲＮＡ５’三リン酸塩のＬＣ−ＭＳ分析を示す。以下のデータは、図２のグラフに関する。
Figure 2012502040
２’−ＯＭｅ ＲＮＡ三リン酸塩の合成
ＲＮＡ−三リン酸塩の合成に記載する、２’Ｏ−メチルＲＮＡ三リン酸塩を同様の様式で調製した。２’−ヒドロキシル官能基上にシリル基を全く含有しないため、これは、ＨＦ／ＴＥＡ処理を必要としない。
ＲＮＡチオ三塩酸塩の合成
ＲＮＡ−チオ三リン酸塩を上述の同様の様式で調製した。しかしながら、ヨウ素溶液は、フェニルアセチルジスルフィド含有２，６−ルチジン溶液と置換された。
免疫系を阻害または刺激する能力を有するｉＲＮＡ剤を同定するための方法
免疫系の調節は、例えば、（ｉ）例えば、細胞または動物の免疫系の構成要素（例えば、成長因子、サイトカイン、またはインターロイキン）のｍＲＮＡまたはタンパク質発現レベルのいずれかの測定、（ｉｉ）例えば、細胞または動物の免疫系の構成要素（例えば、ＮＦＫＢ）により活性化されるタンパク質因子のｍＲＮＡまたはタンパク質レベルの測定、（ｉｉｉ）例えば、外植組織または動物の組織の細胞増殖の測定により測定され得る。
ｉＲＮＡ剤の評価は、生物系、例えば、試料（例えば、細胞培養物）で、修飾された鎖（その補体を伴う、または伴わないが、好ましくは、その補体とアニールされる）をインキュベートすることを含むことができる。生物試料は、免疫系の構成要素を発現し得る。これは、構成要素に影響を及ぼすｉＲＮＡ剤の同定を可能にする。一実施形態において、ｉＲＮＡ剤が、免疫応答を調節する、例えば、刺激または阻害するかどうかを評価する工程は、サイトカインもしくはインターロイキン等の１つ以上の成長因子、無細胞検定、細胞を用いた検定、または動物検定における細胞表面受容体タンパク質の発現を評価することを含む。タンパク質レベルは、例えば、ウエスタンブロット法、フローサイトメトリー、または受容体遺伝子発現（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光受容体タンパク質の発現）により検定され得る。関心のタンパク質のｍＲＮＡレベルは、当該技術分野において公知のノーザンブロット法、ＲＮＡｓｅ保護検定、または精度管理ＰＣＲ（ＱＣ−ＰＣＲ）（定量的逆転写を組み合わせたＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ））、およ類似方法により測定され得る。標的遺伝子発現により生じるＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルは、試験ｉＲＮＡ剤の導入後、通常の時間間隔で測定され得、レベルは、対照ｉＲＮＡ剤の細胞への導入後のものを比較される。
一実施形態において、修飾されたｉＲＮＡ剤が、免疫応答を調節する、例えば、刺激するかどうかを検査する工程は、ｉＲＮＡ剤と免疫系のタンパク質構成要素、例えば、サイトカインもしくはインターロイキン等の成長因子、または細胞表面受容体タンパク質との間の相互作用を検定することを含む。代表的な検定法は、免疫細胞化学法により促進されるもの等の、共免疫沈降法、ビーズを用いた共単離法、核酸フットプリント法、および共局在実験を含む。
細胞増殖は、［３Ｈ］チミジンまたは蛍光色素の取り込みを追跡することにより監視され得る。細胞を９６ウェル組織培養プレートに平板培養し、次いで、ｉＲＮＡ剤とともにインキュベートした。放射線分析において、［３Ｈ］チミジンを添加し、インキュベートを続ける。細胞を多重チャネル自動細胞回収機（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）上で続いて処理し、液体シンチレーション計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で計数する。蛍光を用いた分析において、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＰｒｏｂｅｓからのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤの生存能／細胞毒性検定等の、商業的に入手可能な検定を使用することができる。キットは、膜統合性およびエストラーゼ活性に基づく、死細胞に対して生存細胞を同定する。このキットは、顕微鏡、フローサイトメトリー、またはマイクロ平板検定で使用され得る。
本発明のいくつかの実施形態が説明された。にもかかわらず、種々の修飾が本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われ得ることを理解されたい。他の実施形態は、特許請求の範囲に記載される。

Claims (31)

  1. 式（Ｉ）
    Figure 2012502040
     のオリゴヌクレオチド、またはその医薬的に許容される塩もしくはプロドラッグであって、式中、
    Ｑ２およびＱ３は、それぞれ、独立して、ＮＨ、Ｏ、またはＳであり、
    ＸおよびＹは、それぞれ、独立して、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｏ−、ＳＨ、Ｓ−、Ｓｅ、ＢＨ３、ＢＨ３ −、Ｈ、Ｎ（Ｒ２）２、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、
    Ｒ１は、独立して、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、
    Ｒ２は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、
    Ｑ４およびＱ５は、それぞれ、独立して、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨ（Ｍｅ）、Ｃ（Ｍｅ）２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＨ、ＮＲ１、またはＳであり、
    Ｑ１は、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｓ−、ＳＨ、またはＳＲ１であり、
    ｎは、０、１、２、３、４、または５であり、各反復単位は、同一であるか、または異なってもよく、
    Ａは存在しないか、または一本鎖オリゴヌクレオチドおよび二本鎖オリゴヌクレオチドからなる群から選択され、それぞれ、化学的に修飾されてもよく、
    Ｂは存在しないか、またはリンカー／スペーサーであり、
    Ｅは、一本鎖オリゴヌクレオチドまたは二本鎖オリゴヌクレオチドであり、それぞれ、化学的に修飾され、かつ／またはリガンドと共役し得るが、
    ただし、ＡおよびＢが、共に両方とも存在せず、かつｎが、０、１、または３である時、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｑ５、Ｘ、およびＹは、全てが酸素ではないことを条件とする、オリゴヌクレオチド。
  2. 式（ＩＩ）
    Figure 2012502040
     により表され、式中、
    Ｑ２、Ｑ３、およびＱ３０は、それぞれ、独立して、ＮＨ、Ｏ、またはＳであり、
    ＸおよびＹおよびＹ１０は、それぞれ、独立して、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｏ−、ＳＨ、Ｓ−、Ｓｅ、ＢＨ３、ＢＨ３ −、Ｈ、Ｎ（Ｒ２）２、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、または，ヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、
    Ｒ１は、独立して、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、
    Ｒ２は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、
    Ｑ４およびＱ５は、それぞれ、独立して、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨ（Ｍｅ）、Ｃ（Ｍｅ）２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＨ、ＮＲ１、またはＳであり、
    Ｑ１は、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｓ−、ＳＨ、またはＳＲ１であり、
    Ｗは、Ｈ、ＯＨ、または−Ｇ−Ｌであり、Ｇは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、アセタール、ケタール、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−、−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−、−Ｓ−、−Ｏ−、ピロリジン、モルホリン、ピペラジン、およびチアゾリジンからなる群から選択され、ここで、Ｌは、リガンドであるが、
    ただし、ＷがＯＨである時、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｑ５、Ｑ３０、Ｘ、Ｙ、およびＹ１０は、全てが酸素ではないことを条件とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド、またはその医薬的に許容される塩もしくはプロドラッグ。
  3. 式（ＩＩＩ）
    Figure 2012502040
     により表され、式中、
    Ｑ２およびＱ３は、それぞれ、独立して、ＮＨ、Ｏ、またはＳであり、
    ＸおよびＹおよびＹ１０は、それぞれ、独立して、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｏ−、ＳＨ、Ｓ−、Ｓｅ、ＢＨ３、ＢＨ３ −、Ｈ、Ｎ（Ｒ２）２、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、
    Ｒ１は、独立して、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、
    Ｒ２は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、
    Ｑ４およびＱ５は、それぞれ、独立して、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨ（Ｍｅ）、Ｃ（Ｍｅ）２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＨ、ＮＲ１、またはＳであり、
    Ｑ１は、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｓ−、ＳＨ、またはＳＲ１であり、
    Ｗは、それぞれ、独立して、Ｈ、ＯＨ、または−Ｇ−Ｌであり、ここで、Ｇは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、アセタール、ケタール、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−、−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−、−Ｓ−、−Ｏ−、ピロリジン、モルホリン、ピペラジン、およびチアゾリジンからなる群から選択され、ここで、Ｌは、リガンドである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド、またはその医薬的に許容される塩もしくはプロドラッグ。
  4. 式（ＩＶ）
    Figure 2012502040
     により表され、式中、
    Ｑ２、Ｑ３、およびＱ３０は、それぞれ、独立して、ＮＨ、Ｏ、またはＳであり、
    ＸおよびＹおよびＹ１０は、それぞれ、独立して、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｏ−、ＳＨ、Ｓ−、Ｓｅ、ＢＨ３、ＢＨ３ −、Ｈ、Ｎ（Ｒ２）２、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、
    Ｒ１は、独立して、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、
    Ｒ２は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、
    Ｑ４およびＱ５は、それぞれ、独立して、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨ（Ｍｅ）、Ｃ（Ｍｅ）２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＲ１、またはＳであり、
    Ｑ１は、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｓ−、ＳＨ、またはＳＲ１であり、
    Ｒは、Ｈ、リン酸、またはホスホロチオエートであり、
    ＷおよびＷ１は、それぞれ、独立して、Ｈ、ＯＨ、リン酸、ホスホロチオエート、または−Ｇ−Ｌであり、ここで、Ｇは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、アセタール、ケタール、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−、−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−、−Ｓ−、−Ｏ−、ピロリジン、モルホリン、ピペラジン、およびチアゾリジンからなる群から選択され、ここで、Ｌは、リガンドであるが、
    ただし、ＷがＯＨである時、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｑ５、Ｑ３０、Ｘ、Ｙ、およびＹ１０は、全てが酸素であることができないことを条件とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド、またはその医薬的に許容される塩もしくはプロドラッグ。
  5. 式（Ｖ）
    Figure 2012502040
     により表されるか、またはその医薬的に許容される塩もしくはプロドラッグであって、式中、
    Ｑ２およびＱ３ は、それぞれ、独立して、ＮＨ、Ｏ、またはＳであり、
    ＸおよびＹおよびＹ１０は、それぞれ、独立して、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｏ−、ＳＨ、Ｓ−、Ｓｅ、ＢＨ３、ＢＨ３ −、Ｈ、Ｎ（Ｒ２）２、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、
    Ｒ１は、独立して、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、
    Ｒ２は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、
    Ｑ４およびＱ５は、それぞれ、独立して、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨ（Ｍｅ）、Ｃ（Ｍｅ）２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＲ１、またはＳであり、
    Ｑ１は、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｓ−、ＳＨ、またはＳＲ１であり、
    Ｒは、Ｈ、リン酸、またはホスホロチオエートであり、
    ＷおよびＷ１は、それぞれ、独立して、Ｈ、ＯＨ、リン酸、ホスホロチオエート、または−Ｇ−Ｌであり、ここで、Ｇは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、アセタール、ケタール、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−、−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−、−Ｓ−、−Ｏ−、ピロリジン（ｐｙｒｏｌｉｄｉｎｅ）、モルホリン、ピペラジン、およびチアゾリジンからなる群から選択され、ここで、Ｌは、リガンドである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  6. 式（ＶＩ）
    Figure 2012502040
     により表されるか、またはその医薬的に許容される塩もしくはプロドラッグであって、式中、
    Ｑ２、Ｑ３、およびＱ３０は、それぞれ、独立して、ＮＨ、Ｏ、またはＳであり、
    ＸおよびＹおよびＹ１０は、それぞれ、独立して、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｏ−、ＳＨ、Ｓ−、Ｓｅ、ＢＨ３、ＢＨ３ −、Ｈ、Ｎ（Ｒ２）２、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、
    Ｒ１は、独立して、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、
    Ｒ２は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、
    Ｑ４およびＱ５は、それぞれ、独立して、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨ（Ｍｅ）、Ｃ（Ｍｅ）２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＲ１、またはＳであり、
    Ｑ１は、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｓ−、ＳＨ、またはＳＲ１であり、
    Ｗ、Ｗ１、およびＷ２は、それぞれ、独立して、Ｈ、ＯＨ、リン酸、ホスホロチオエート、または−Ｇ−Ｌであり、ここで、Ｇは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、アセタール、ケタール、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−、−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−、−Ｓ−、−Ｏ−、ピロリジン（ｐｙｒｏｌｉｄｉｎｅ）、モルホリン、ピペラジン、およびチアゾリジンからなる群から選択され、ここで、Ｌは、リガンドであり、
    リンカー／スペーサーは、リン酸、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アミド、エステル、ジスルフィド、チオエーテル、オキシム、ヒドラゾン、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、およびヘテロアリールからなる群から選択される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  7. 式（ＶＩＩ）
    Figure 2012502040
     により表されるか、またはその医薬的に許容される塩もしくはプロドラッグであって、式中、
    Ｑ２およびＱ３は、それぞれ、独立して、ＮＨ、Ｏ、またはＳであり、
    ＸおよびＹおよびＹ１０は、それぞれ、独立して、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｏ−、ＳＨ、Ｓ−、Ｓｅ、ＢＨ３、ＢＨ３ −、Ｈ、Ｎ（Ｒ２）２、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、
    Ｒ１は、独立して、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、
    Ｒ２は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、それぞれ、任意に置換されてもよく、
    Ｑ４およびＱ５は、それぞれ、独立して、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨ（Ｍｅ）、Ｃ（Ｍｅ）２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＲ１、またはＳであり、
    Ｑ１は、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ１、Ｓ−、ＳＨ、またはＳＲ１であり、
    Ｗ、Ｗ１、およびＷ２は、それぞれ、独立して、Ｈ、ＯＨ、リン酸、ホスホロチオエート、または−Ｇ−Ｌであり、ここで、Ｇは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、アセタール、ケタール、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−、−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−、−Ｓ−、−Ｏ−、ピロリジン（ｐｙｒｏｌｉｄｉｎｅ）、モルホリン、ピペラジン、およびチアゾリジンからなる群から選択され、ここで、Ｌは、リガンドであり、
    リンカー／スペーサーは、リン酸、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アミド、エステル、ジスルフィド、チオエーテル、オキシム、ヒドラゾン、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、およびヘテロアリールからなる群から選択される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  8. 前記一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  9. 前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結される末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
  10. 前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つは、２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−Ｏ−アルコキシアルキルヌクレオチド、２’−Ｏ−アリルヌクレオチド、２’Ｏ−プロピルヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−デオキシヌクレオチド、２´−デオキシフルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−Ｎ−Ｍｅアセトアミドヌクレオチド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチルヌクレオチド（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−アミノプロピル、２’−ヒドロキシ、２’−アラ−フルオロ、３’−アミド化（３’−Ｏの代わりに３’−ＮＨ）、ロックドオリゴヌクレオチド（ＬＮＡ）、延長エチレンオリゴヌクレオチド（ＥＮＡ）、ヘキソースオリゴヌクレオチド（ＨＮＡ）、またはシクロヘキセンオリゴヌクレオチド（ＣｅＮＡ）の群から選択される、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
  11. 前記オリゴヌクレオチドは、ウイルスベクターに含まれる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  12. 前記オリゴヌクレオチドは、ＲＩＧ−Ｉに結合する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  13. 請求項１〜１２のいずれか１項に定義されるオリゴヌクレオチドと、免疫賦活性剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗腫瘍剤、遺伝子発現抑制剤、抗腫瘍療法、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１つの薬剤と、を含む、組成物。
  14. 前記薬剤は、レチノイン酸、Ｉ型ＩＦＮ、またはそれらの組み合わせである、請求項１３に記載の組成物。
  15. 脊椎動物において、腫瘍細胞のアポトーシスを誘発するための、抗ウイルス反応を誘発するための、抗菌反応を誘発するための、および／または抗腫瘍反応を誘発するための、請求項１〜１２のいずれか１項に定義されるオリゴヌクレオチドの使用。
  16. 前記抗ウイルス反応、前記抗菌反応、および／または前記抗腫瘍反応は、Ｉ型ＩＦＮ産生、ＩＬ−１８産生、および／またはＩＬ−１β産生を含む、請求項１５に記載の使用。
  17. 請求項１〜１２のいずれか１項に定義されるオリゴヌクレオチドと、脊椎動物において、抗原に対する免疫応答を誘発するための、少なくとも１つの抗原と、を含む、組成物。
  18. 前記オリゴヌクレオチドは、前記少なくとも１つの抗原に共有結合的に連結される、請求項１７に記載の組成物。
  19. 脊椎動物における、ウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫感染症、腫瘍、多発性硬化症、アレルギー、自己免疫疾患、免疫抑制、および免疫不全症からなる群から選択される疾病および／または疾患を阻止および／または治療するための薬物の調製のための、請求項１〜１２のいずれか１項に定義される前記オリゴヌクレオチドの使用。
  20. 脊椎動物において、腫瘍細胞のアポトーシスを誘発するための、抗ウイルス反応を誘発するための、抗菌反応を誘発するための、および／または抗腫瘍反応を誘発するための、請求項１〜１２のいずれか１項に定義される前記オリゴヌクレオチドの使用。
  21. 前記抗ウイルス反応、前記抗菌反応、および／または前記抗腫瘍反応は、Ｉ型ＩＦＮ産生、ＩＬ−１８産生、および／またはＩＬ−１β産生を含む、請求項２０に記載の使用。
  22. 請求項１〜１２のいずれか１項に定義されるオリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物。
  23. 請求項１〜１２のいずれか１項に定義されるオリゴヌクレオチドと、免疫賦活性剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗腫瘍剤、および遺伝子発現抑制剤からなる群から選択される、少なくとも１つの薬剤と、を含み、前記オリゴヌクレオチドおよび前記少なくとも１つの薬剤は、同時に、別個に、または順次投与される、複合製剤物。
  24. 前記薬剤は、レチノイン酸、Ｉ型ＩＦＮ、またはそれらの組み合わせである、請求項２３に記載の複合製剤。
  25. 請求項２２に記載の医薬組成物、または前記請求項２３もしくは２４に記載の複合製剤と、使用説明書と、を含む、医薬品パッケージ。
  26. 脊椎動物における、ウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫感染症、腫瘍、多発性硬化症、アレルギー、自己免疫疾患、免疫抑制、および免疫不全症からなる群から選択される疾病および／または疾患を阻止および／または治療するための細菌ＲＮＡの調製のための、請求項１〜１２のいずれか１項に定義される前記オリゴヌクレオチドの使用。
  27. 三リン酸塩または三リン酸類似体を含む、１つ以上のリボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド分子を調製するためのプロセスであって、
    （ａ）フッ化物不安定基またはフッ化物非不安定基を用いて、２’ヒドロキシル部分を保護する工程と、
    （ｂ）
    Figure 2012502040
     （式中、
    Ｒ100は、独立して、電子求引性基(EWG)であり、
    Ｒ200およびＲ300は、それぞれ、独立して、ハロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロ環、置換ヘテロ環であり、
    Ｚ10は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＢＨ3、またはＮＲ’であり、
    Ｘ40は、Ｃｌ、ジアルキルアミン、または環状アミンであり、
    Ｘ10は、Ｃｌ、Ｏ−アリール、またはＯ−置換アリールであり、
    Ｙ10およびＹ20は、独立して、Ｏ−置換アルキル、ジアルキルアミン、または環状アミンであり、窒素は、リンに連結され、
    Ｘ20およびＸ30は、独立して、Ｏ、ＣＨ2、Ｓ、ＮＲ’であり、Ｒ’は、Ｈまたは脂肪族であり、
    Ｎは、１、２、３、４、または５であり、
    ｓは、０、１、２、または３である）
    からなる群から選択される試薬を用いて、前記所望の末端ヒドロキシル部分を三リン酸塩または三リン酸類似体に変換する工程と、
    （ｃ）固相ホスホラミダイト、液相ホスホラミダイト、固相Ｈ−ホスホネート、液相Ｈ−ホスホネート、ハイブリッド相ホスホラミダイト、およびハイブリッド相Ｈ−ホスホネートに基づく合成方法からなる群から選択される方法を使用して、前記オリゴヌクレオチド分子を合成する工程と、
    （ｄ）保護基および／または固体支持体を除去する工程と、を含む、プロセス。
  28. 眼内注射、経口摂取、経腸的適用、吸入、局所適用、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、くも膜下腔内注射、気管内注射、および静脈内注射からなる群から選択されるモードにより送達するように適合される、請求項２２に記載の医薬組成物。
  29. ラベル貼付されたパッケージに請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを含むキットであって、前記パッケージ上の前記ラベルは、前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのウイルスに対して使用され得ることを示す、キット。
  30. 前記キットは、ヒトにおける使用について、規制当局により承認される、請求項３０に記載のキット。
  31. 検査試料を試験薬と接触させることを含み、前記試験薬は、請求項１〜１２のいずれか１項に定義されるオリゴヌクレオチドを含む、抗ウイルス反応または抗菌反応を同定するための検定。
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