JP2012505901A - 結合抗体の存在下における組換え血液凝固因子のｐｅｇ化 - Google Patents

結合抗体の存在下における組換え血液凝固因子のｐｅｇ化 Download PDF

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Abstract

本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリ（アルキレンオキシド）を含む少なくとも１種の水溶性ポリマーに結合している血液凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ））を含む、タンパク質性構築体に関する。さらに、本発明は、結合抗体の存在下における、ＰＥＧ化血液凝固因子（例えば、ＦＶＩＩＩ）を調製する方法に関する。本発明はまた、血液凝固因子（例えば、ＦＶＩＩＩ）の機能的欠陥または欠損に関連する出血性障害を有する哺乳動物の血中において、血液凝固因子（例えば、ＦＶＩＩＩ）のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長する方法にも関する。

Description

本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリ（アルキレンオキシド）を含む少なくとも１種の水溶性ポリマーに結合している血液凝固因子（例えば、凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ））を含む、タンパク質性構築体（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）に関する。さらに、本発明は、結合抗体の存在下における、ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩを調製する方法に関する。本発明はまた、ＦＶＩＩＩの機能的欠陥または欠損に関連する出血性障害を有する哺乳動物の血中において、ＦＶＩＩＩのｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長する方法にも関する。
凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、血漿中を非常に低濃度で循環しており、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）と非共有結合している。ＦＶＩＩＩは、止血の間にＶＷＦから分離されて、カルシウムおよびリン脂質、または細胞膜の存在下で活性化速度を高めることによって、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）が媒介する第Ｘ因子（ＦＸ）の活性化のための補因子として働く。
ＦＶＩＩＩは、ドメイン構造Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２を有する、約２７０〜３３０ｋＤの一本鎖の前駆体として合成される。血漿から精製した場合（例えば「血漿由来の」または「血漿性の（ｐｌａｓｍａｔｉｃ）」）、ＦＶＩＩＩは重鎖（Ａ１−Ａ２−Ｂ）および軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）から構成されている。軽鎖の分子量は８０ｋＤであるのに対し、重鎖は、Ｂドメイン内でタンパク質分解を受けるため、９０〜２２０ｋＤの範囲内にある。
ＦＶＩＩＩは、出血性障害の治療的使用のための組換えタンパク質としても合成される。治療薬としての組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）の潜在的効力を決定するために、様々なｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイが工夫されてきた。これらのアッセイは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける内因性ＦＶＩＩＩの作用を模倣するものである。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで測定した場合、ＦＶＩＩＩをｉｎ ｖｉｔｒｏでトロンビン処理すると、その凝固促進活性は急速に増加し、続いて低下する。この活性化および不活性化は、重鎖および軽鎖の両方の特異的な限定的タンパク質分解と一致しており、この分解は、例えばＶＷＦからＦＶＩＩＩを解離させてリン脂質表面に結合させる、または特定のモノクローナル抗体への結合能力を変化させる、などのＦＶＩＩＩ内の異なる結合エピトープの利用度を変化させる。
ＦＶＩＩＩの欠如または機能異常は、最も頻度の高い出血性障害である血友病Ａと関連する。血友病Ａを管理するために選択される処置は、血漿由来またはｒＦＶＩＩＩの濃縮製剤を用いる代償療法である。ＦＶＩＩＩレベルが１％未満の重症の血友病Ａ患者には、一般的に、投与間のＦＶＩＩＩを１％より高く維持することを目的とする予防的治療が行われる。各種ＦＶＩＩＩ製品の循環血液中の平均半減期を考慮に入れると、これは１週間に２〜３回ＦＶＩＩＩを投与することによって、通常、達成できる。
血友病Ａを処置するための、多くの濃縮製剤が上市されている。これらの濃縮製剤の１つは、組換え製品Ａｄｖａｔｅ（登録商標）であり、この製品はＣＨＯ細胞で産生され、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社によって製造されている。この製品の細胞培養プロセス、精製、または最終製剤化において、ヒトまたは動物の血漿タンパク質またはアルブミンは全く加えられていない。
ＦＶＩＩＩ濃縮製剤および治療用ポリペプチド薬の多くの製造業者の目標は、他のすべての製品特性を維持しながら、薬力学特性および薬物動態特性を高めた次世代製品を開発することである。
治療用ポリペプチド薬は、しばしば、タンパク質分解酵素によって急速に分解され、抗体によって中和される。これは、治療用ポリペプチド薬の半減期および循環時間を低下させ、それによって、その治療効力を制限する。しかし、ポリペプチドに可溶性ポリマーまたは炭水化物を付加すると、分解が阻止されてポリペプチドの半減期が増大することが示された。例えばポリペプチド薬のＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）は、ポリペプチド薬を保護し、それらの薬力学的プロファイルおよび薬物動態プロファイルを改善する（非特許文献１）。ＰＥＧ化法は、ポリペプチド薬にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の反復単位を結合させる。分子のＰＥＧ化により、酵素分解に対する薬物の耐性増加、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期増加、投与頻度の低減、免疫原性の低下、物理的および熱的安定性の向上、溶解度の向上、液安定性の向上、および凝集の減少をもたらすことができる。
このように、ＰＥＧ化などによる可溶性ポリマーの付加は、ＦＶＩＩＩ製品の特性を改良する１つのアプローチである。技術の現状が、様々な特許および特許出願によって以下のように文書化されている。
特許文献１には、当該タンパク質が前記ＦＶＩＩＩのカルボニル基を介して、ポリ（アルキレンオキシド）に共有結合しているポリ（アルキレンオキシド）−ＦＶＩＩＩ結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、またはポリ（アルキレンオキシド）−ＦＩＸ結合体について記載されている。
特許文献２には、ＦＶＩＩＩおよび生体適合性ポリマーの結合体を調製する方法が記載されている。この特許は、Ｒｏｅｓｔｉｎらの発表論文（非特許文献２）によって補完されていた。この結合体は、モノメトキシポリエチレングリコールで修飾された、Ｂドメインが欠失した組換えＦＶＩＩＩを含む。この結合体は、ＦＶＩＩＩ機能が低下しており、修飾度と共に凝固活性が急激に低下した。
特許文献３には、各結合体がＦＶＩＩＩ分子に共有結合している１から３種の水溶性ポリマーを有する、結合体を複数含むポリマー−ＦＶＩＩＩ分子結合体について記載されている。このＦＶＩＩＩ分子は、Ｂ−ドメインを欠失している。
特許文献４には、ＦＶＩＩＩ活性を有するタンパク質を含む不融性の結合体が非抗原性リガンドに共有結合した修飾ＦＶＩＩＩについて記載されている。
特許文献５には、ポリペプチドおよび生体適合性ポリマーの結合体について記載されている。
特許文献６には、５，０００ダルトン以下の好ましい分子量を有するポリエチレングリコールに結合したＦＶＩＩＩについて記載されている。
それにもかかわらず、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＦＶＩＩＩの半減期を延長するために可溶性ポリマーを結合しており、非修飾ＦＶＩＩＩおよび当技術分野で公知の他の修飾ＦＶＩＩＩ治療剤と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏで半減期を延長するが、機能活性を保持している、改善されたＦＶＩＩＩが依然として必要とされている。
米国特許第６，０３７，４５２号明細書 欧州特許第１２５８４９７号明細書 国際公開第０４０７５９２３号 米国特許第４，９７０，３００号明細書 米国特許第６，０４８，７２０号明細書 国際公開第９４／１５６２５号
Ｈａｒｒｉｓ Ｊ Ｍ ｅｔ Ｃｈｅｓｓ Ｒ Ｂ、 Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２００３年、２巻、２１４〜２１頁 Ｒｏｅｓｔｉｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ ２０００年、１１巻、３８７〜９６頁
本発明は、水溶性ポリマーに結合している血液凝固因子（例えば第ＶＩＩＩ因子の分子）を含むタンパク質性構築体、および結合抗体の存在下における、その調製方法に関する。
本発明の一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子に水溶性ポリマー（ＷＳＰ）を結合する方法であって、（ａ）前記ＦＶＩＩＩに前記抗体を結合させる条件下で、ＦＶＩＩＩ特異的抗体と共にＦＶＩＩＩをインキュベートして、抗体−ＦＶＩＩＩ複合体を形成させる工程と、（ｂ）前記抗体−ＦＶＩＩＩ複合体にＷＳＰを結合させる条件下で、前記ＷＳＰと共に前記抗体−ＦＶＩＩＩ複合体をインキュベートする工程と、（ｃ）前記ＷＳＰが結合したＦＶＩＩＩを、前記抗体から離す工程、を含む方法が提供される。
本発明の別の実施形態では、（ａ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）分子、および（ｂ）第ＶＩＩＩ因子分子に結合している少なくとも１種の水溶性ポリマー（ＷＳＰ）分子を含むタンパク質構築体であって、少なくとも１種のＷＳＰは、ＦＶＩＩＩに特異的に結合する抗体の存在下で、前記ＦＶＩＩＩ分子に結合する構築体が提供される。関連した実施形態では、第ＶＩＩＩ因子の分子は、組換え第ＶＩＩＩ因子である。さらに別の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子の分子は、完全長第ＶＩＩＩ因子である。
本発明のさらに別の実施形態では、ＷＳＰ分子はＰＥＧ分子である。関連した実施形態では、ＷＳＰ分子は、約２，０００Ｄａから約１５０，０００Ｄａ、または約１０，０００Ｄａから約５０，０００Ｄａの分子量を有する。別の実施形態では、ＷＳＰ分子は、約２０，０００Ｄａの分子量を有する。本発明のさらに別の実施形態では、ＷＳＰ分子は直鎖状構造または分枝構造を有する。
本発明のさらに別の実施形態では、前記抗体は樹脂に固定化されている。
本発明のＷＳＰを結合する方法もまた、本発明によって意図される。一実施形態では、血液凝固因子に水溶性ポリマー（ＷＳＰ）を結合する方法であって、（ａ）前記血液凝固因子に抗体を結合させる条件下で、血液凝固因子特異的抗体と共に血液凝固因子をインキュベートして、抗体−血液凝固因子複合体を形成させる工程と、（ｂ）抗体−血液凝固因子複合体にＷＳＰを結合させる条件下で、ＷＳＰと共に抗体−血液凝固因子複合体をインキュベートする工程と、（ｃ）ＷＳＰが結合した血液凝固因子を、前記抗体から離す工程を含み、血液凝固因子が、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）およびＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼからなる群から選択され、ＷＳＰが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分枝ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、でんぷん、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、および／または２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）からなる群から選択される、方法が提供される。
さらに別の実施形態では、血液凝固因子がＦＶＩＩＩである、前記修正が提供される。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩは完全長ＦＶＩＩＩである。
本発明のさらに別の実施形態では、ＷＳＰが約２，０００Ｄａから約１５０，０００Ｄａの分子量を有する、前記方法が提供される。別の実施形態では、ＷＳＰは直鎖状構造または分枝構造を有する。一実施形態では、ＷＳＰはＰＥＧである。別の実施形態では、ＷＳＰはＰＳＡである。本発明のさらに別の実施形態では、抗体が樹脂上に固定化されている前記方法が提供される。
前記方法の他に、本発明によってタンパク質性構築体が提供される。一実施形態では、（ａ）血液凝固因子、および（ｂ）血液凝固因子に結合している少なくとも１種の水溶性ポリマー（ＷＳＰ）分子を含むタンパク質性構築体であって、少なくとも１種のＷＳＰは、血液凝固因子に特異的に結合する抗体の存在下で、血液凝固因子に結合し、血液凝固因子が、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）およびＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼからなる群から選択され、ＷＳＰが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分枝ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、でんぷん、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、および／または２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）からなる群から選択される、構築体が提供される。
さらに別の実施形態では、血液凝固因子がＦＶＩＩＩである、前記タンパク質性構築体が提供される。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩは完全長ＦＶＩＩＩである。
さらに別の実施形態では、ＷＳＰが約２，０００Ｄａから約１５０，０００Ｄａの分子量を有する前記タンパク質性構築体が提供される。別の実施形態では、ＷＳＰは直鎖状構造または分枝構造を有する。一実施形態では、ＷＳＰはＰＥＧである。別の実施形態では、ＷＳＰはＰＳＡである。本発明のさらに別の実施形態では、抗体が樹脂に固定化されている前記タンパク質性構築体が提供される。
図１は、ＰＥＧ化した際のＦＶＩＩＩ効力の損失を示す図である。
治療用タンパク質の薬理学的特性および免疫学的特性は、化学的修飾およびポリマー化合物との結合によって改善し得る。得られた結合体の特性は、一般にポリマー構造およびサイズに大きく依存する。血液凝固因子（例えばＦＶＩＩＩ）のＰＥＧ化（例えばリジン反応性ＰＥＧ化化学物質による）は、実現可能であるが、同時に大幅な効力の低下が観察される恐れがある。したがって、本発明の一実施形態では、結合モノクローナル抗体によってタンパク質表面の一部が保護され、修飾の間にＦＶＩＩＩ表面領域に接近不能となる条件下において、ＦＶＩＩＩが修飾され、これにより、非部位特異的反応によって引き起こされるＦＶＩＩＩ効力の損失が低減される。
本発明はさらに、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、でんぷん、またはポリシアル酸（ＰＳＡ）もしくはデキストランなどの炭水化物を含むが、それらに限定されない、水溶性ポリマーに結合しており、Ｂドメインの少なくとも一部が無傷のＦＶＩＩＩ分子を含む、タンパク質性構築体を提供する。本発明の一実施形態では、水溶性ポリマーは、１０，０００ダルトンを超える分子量を有する。別の実施形態では、水溶性ポリマーは、１０，０００Ｄａを超え、約１２５，０００Ｄａまで、約１５，０００Ｄａから３５，０００Ｄａまで、または約１８，０００Ｄａから約２５，０００Ｄａまでの分子量を有する。別の実施形態では、水溶性ポリマーは２０，０００Ｄａ以上の分子量を有する。一実施形態では、構築体は非修飾（天然の）の治療用ＦＶＩＩＩ製品の機能活性を完全に保持しており、また非修飾の治療用ＦＶＩＩＩ製品と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長している。別の実施形態では、天然の第ＶＩＩＩ因子に対し、構築体が少なくとも１０、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０パーセント（％）の生物活性を維持している。関連のある態様では、修飾および天然の（ｎａｔｉｖｅ）第ＶＩＩＩ因子の生物活性は、ＦＶＩＩＩ抗原値に対する発色活性の比（ＦＶＩＩＩ：Ｃｈｒ：ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）によって決定される。本発明のさらに別の実施形態では、天然の第ＶＩＩＩ因子のｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期に対して、修飾ＦＶＩＩＩの半減期は、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍に低下または増加する。
ポリペプチド
本明細書に記載する場合、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）およびＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼを含むが、それだけに限らない「血液凝固タンパク質」または「血液凝固因子」が、本発明によって意図される。本明細書で使用する場合、「血液凝固タンパク質」または「血液凝固因子」という用語は、このような特定の天然の血液凝固タンパク質に関係する生物活性を示す、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）およびＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼ、または他の血液凝固因子のいずれかを指す。
本発明の一実施形態では、本発明の出発物質はＦＶＩＩＩであり、これは種々の態様では、ヒト血漿に由来する、または米国特許第４，７５７，００６号、米国特許第５，７３３，８７３号、米国特許第５，１９８，３４９号、米国特許第５，２５０，４２１号、米国特許第５，９１９，７６６号、欧州特許第３０６９６８号の特許に記載されている組換え工学技術によって産生される。本明細書では、「第ＶＩＩＩ因子」または「ＦＶＩＩＩ」という用語は、天然のＦＶＩＩＩに関連する生物活性を示す任意のＦＶＩＩＩ分子を指す。本発明の一実施形態では、ＦＶＩＩＩ分子は完全長第ＶＩＩＩ因子である。ＦＶＩＩＩ分子は、第ＶＩＩＩ因子：ＣをコードするＤＮＡに、ハイブリッド形成することができるＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質である。このようなタンパク質は、ドメインＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２間、またはその中の各種部位のアミノ酸欠失を含む（米国特許第４，８６８，１１２号）。別の態様では、ＦＶＩＩＩ分子は、１個または複数のアミノ酸残基が、部位特異的変異誘発によって置換された天然のＦＶＩＩＩの類似体である。
意図される血液凝固因子（例えばＦＶＩＩＩ）の分子は、完全長タンパク質、完全長タンパク質の前駆体、完全長タンパク質の生物活性なサブユニットまたは断片、ならびにＦＶＩＩタンパク質のこのような形態のいずれかの生物活性な誘導体および変異体を含む。したがって、ＦＶＩＩＩに言及する場合、このようなタンパク質の可能な形態すべてが含まれる。したがって、ＦＶＩＩＩタンパク質は、（１）少なくとも約２５、約５０、約１００．約２００、約３００、約４００またはそれより多数のアミノ酸（成熟天然タンパク質の場合の完全長配列の４０６アミノ酸まで）の領域にわたり、参照核酸によってコードされるポリペプチドまたは本明細書に記載のアミノ酸配列と、約６０％超、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％以上のアミノ酸配列同一性を持つアミノ酸配列を有するもの、ならびに／あるいは（２）本明細書に記載の参照アミノ酸配列を含む免疫原、その免疫原断片、および／または保存的に改変されたその変異体に対して産生される抗体（例えばポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）に特異的に結合するものが含まれる。
本発明によれば、例えば「組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）」、「組換え第ＶＩＩ因子（ｒＦＶＩＩ）」（ｒＦＶＩＩａを含む）、および「組換え第ＩＸ因子（ｒＦＩＸ）」などの「組換え血液凝固因子」という用語は、任意の組換え血液凝固因子（例えばｒＦＶＩＩＩ、ｒＦＶＩＩ、およびｒＦＩＸ）、または組換えＤＮＡ技術によって得られた、異種性（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）または天然に存在するその他の血液凝固因子を含む。ある実施形態では、本用語は上記のタンパク質を包含する。
本明細書で使用する場合、「内因性血液凝固因子」（例えば「内因性ＦＶＩＩＩ」、「内因性由来のＦＶＩＩ」または「内因性由来のＦＩＸ」）、あるいは他の内因性由来の血液凝固因子には、処置を受けようとする哺乳動物に由来するＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、またはその他の血液凝固因子を含む。本用語はまた、前記哺乳動物に存在する導入遺伝子、または他の任意の外来ＤＮＡから転写されるＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、またはその他の血液凝固因子をも含むが、それらに限定されない。本明細書で使用する場合、「外因性血液凝固因子」、例えば「外因性ＦＶＩＩＩ」は、前記哺乳動物に由来しないＦＶＩＩＩを含む。
本明細書で使用する場合、「血漿由来の血液凝固タンパク質」（例えば「血漿由来のＦＶＩＩＩ」、「血漿由来のＦＶＩＩ」または「血漿由来のＦＩＸ」）、あるいは他の血漿由来の血液凝固因子あるいは「血漿性の」は、凝固経路を活性化する性質を有する哺乳動物から得られた血液中に見出されるタンパク質すべての形態を含む。
本明細書で使用する場合、「生物活性な誘導体」または「生物活性な変異体」には、前記分子の、結合特性などの同一の機能的および／または生物学的特性、および／またはペプチド骨格または基本ポリマー単位などの同一の構造的基盤を実質的に有する分子の任意の誘導体または変異体を含む。
変異体または類似体ポリペプチドは、１個または複数のアミノ酸残基が、本発明の血液凝固因子（例えば、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩまたはＦＩＸ）のアミノ酸配列に追加されている、挿入変異体を含む。挿入は、タンパク質の一方の末端または両末端に位置してよく、かつ／またはＦＶＩＩＩアミノ酸配列の内部領域内に位置してもよい。一方の末端または両末端に残基をさらに有する挿入変異体は、例えば、融合タンパク質、およびアミノ酸タグまたは他のアミノ酸標識を含むタンパク質を含む。一態様では、ＦＶＩＩＩ分子は、特に分子がＥ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞で組換え的に発現される場合、場合によりＮ末端のメチオニンを含有する。
欠失変異体では、血液凝固因子（例えばＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩまたはＦＩＸ）、あるいは本明細書に記載の他の血液凝固因子ポリペプチド中の、１個または複数のアミノ酸残基が除去される。欠失は、ＦＶＩＩＩポリペプチドの一方または両方の末端において、および／またはＦＶＩＩＩアミノ酸配列内の１個または複数の残基の除去を伴い行われ得る。したがって、欠失変異体は、ＦＶＩＩＩポリペプチド配列の断片を含む。
置換変異体では、血液凝固因子（例えばＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩまたはＦＩＸ）、または他の血液凝固因子ポリペプチドの１個または複数のアミノ酸残基が除去されて、代替の残基に置換される。一態様では、置換は天然において保存的であり、この種の保存的置換は当技術分野では周知である。あるいは、本発明は非保存的でもある置換をも包含する。例示的な保存的置換は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７５年、７１〜７７頁）に記載されており、以下に述べる。
代替的には、例示的な保存的置換を以下に記載する。
水溶性ポリマー類
一態様では、提供される血液凝固因子（例えばＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩまたはＦＩＸ）、または他の血液凝固因子誘導体の分子は、限定なしに含む水溶性ポリマーに結合している。臨床的に許容される適切な水溶性ポリマーには、以下に限定されないが、ＰＥＧ、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、モノメトキシポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール類、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／マレイン酸無水物のコポリマー、ポリ（β−アミノ酸）（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールのホモポリマー類（ＰＰＧ）、および他のポリアルキレンオキシド類、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドのコポリマー類、ポリオキシエチル化ポリオール類（ＰＯＧ）（例えばグリセロール）および他のポリオキシエチル化ポリオール類、ポリオキシエチル化ソルビトール、またはポリオキシエチル化グルコース、コロン酸または他の炭水化物ポリマー類、フィコールまたはデキストラン、ならびにそれらの混合物が含まれる。
多糖のポリマー類は、タンパク質またはペプチドを修飾するために使用してもよい、別のタイプの水溶性ポリマーである。多糖（複数可）の添加によるタンパク質またはペプチドの修飾（例えばグリコシル化）は、半減期を増大させ、抗原性を低下させ、安定性を増加させ、かつ、タンパク質分解性を低下させ得る。デキストラン類は、主にα１−６結合によって連結されているグルコースの個々のサブユニットからなる多糖ポリマー類である。デキストラン自体は、多くの分子量範囲のものが入手可能であり、また約１ｋＤから約７０ｋＤの分子量のものが容易に入手できる。デキストランは、それ自体をビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）として、または他のビヒクル（例えばＦｃ）と組み合わせて本発明に使用するための、適切な水溶性ポリマーである。例えば、国際公開第９６／１１９５３号および国際公開第９６／０５３０９号を参照されたい。治療用または診断用免疫グロブリンに結合させるデキストランの使用が報告されており、例えば、参照により本明細書に組み込まれている欧州特許公開第０３１５４５６号を参照されたい。本発明に従ってデキストランがビヒクルとして使用される場合、約１ｋＤから約２０ｋＤのデキストランが好ましい。
本発明の一実施形態では、以下に限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分枝ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、でんぷん、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、および／または２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）を含む水溶性ポリマーが、本発明により提供される。
本発明の一実施形態では、水溶性ポリマーはシアル酸分子である。一実施形態では、構築体は標準的な治療用血液凝固因子（例えばＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩまたはＦＩＸ）、または他の血液凝固因子製品の機能活性を完全に保持しており、天然の治療用ＦＶＩＩＩ製品と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期の延長がもたらされる。別の実施形態では、修飾ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩまたはＦＩＸ、あるいは他の血液凝固因子は、天然の第ＶＩＩＩ因子、ＦＶＩＩ、またはＦＩＸ、あるいは他の血液凝固因子に対し、少なくとも５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０パーセント（％）の生物活性を維持している。関連のある態様では、修飾および天然の第ＶＩＩＩ因子の生物活性は、ＦＶＩＩＩ抗原値に対する発色活性の比（ＦＶＩＩＩ：Ｃｈｒ：ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）によって決定される。本発明のさらに別の実施形態では、天然の第ＶＩＩＩ因子のｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期に対して、修飾ＦＶＩＩＩの半減期は、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍に低下または増加する。
ポリヌクレオチド類
本発明の組換え血液凝固因子（例えばｒＦＶＩＩＩ）をコードする核酸は、例えば以下に限定されないが、遺伝子、ｍＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、多型変異体、対立遺伝子、合成および天然に存在する変異体を含む。ｒＦＶＩＩＩという用語によって包含されるタンパク質は、以下に限定されないが、例えば、本明細書中の上記のタンパク質およびポリペプチド、上記の核酸によってコードされるタンパク質、種間ホモログ、および他のポリペプチドを含む。
本発明の血液凝固因子（例えば、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩまたはＦＩＸ）、または他の血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドはまた、以下に限定されないが、（１）厳格な（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）ハイブリッド形成条件で、本明細書に記載の参照アミノ酸配列、およびそれらの保存的な修飾変異体をコードする核酸と、特異的にハイブリッド形成するもの、（２）少なくとも約２５、約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約５００、約１０００個またはそれを超えるヌクレオチド（最大で、成熟タンパク質の１２１８個のヌクレオチド完全長配列）からなる領域にわたり、本明細書に記載の参照核酸配列に対して約９５％を超える、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれを超えるヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有するものを含む。
「天然に存在する」ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、典型的には、霊長類（例えば、ヒト）、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター）、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジまたは任意の哺乳動物を含む哺乳動物に由来するが、それらに限定されない。本発明の核酸およびタンパク質は、組換え分子（例えば、異種性で、野生型配列またはその変異体をコードしたもの、あるいは天然に存在しないもの）とすることができる。
参照ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ００４５１（ＦＡ８＿ＨＵＭＡＮ）； Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ Ｊら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｇｅｎｅ、 Ｎａｔｕｒｅ、１９８４年、３１２巻（５９９２号）３２６〜３０頁； Ｖｅｈａｒ ＧＨら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ、Ｎａｔｕｒｅ、１９８４年、３１２巻（５９９２号）、３３７〜４２頁、および Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＡＲ．、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、 Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ、２００３：２９；１１〜２９（２００２）（参照の全体が本明細書中に組み込まれている）、第ＶＩＩ因子：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０２９３３（ゲノム配列）、Ｍ１３２３２（ｃＤＮＡ）（Ｈａｇｅｎら、ＰＮＡＳ、１９８６年、８３巻、２４１２〜６頁）、およびＰ０８７０９（ポリペプチド配列）（参照の全体が本明細書中に組み込まれている）を含む。種々のＦＶＩＩの多型体は記載されており、例えば、Ｓａｂａｔｅｒ−Ｌｌｅａｌら（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ、２００６年、１１８巻、７４１〜５１頁）（参照の全体が本明細書中に組み込まれている）、第ＩＸ因子：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ００７４０、米国特許第６，５３１，２９８号、およびＶＷＦ：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５５２およびＮＰ＿０００５４３を参照されたい。
血液凝固因子産生
血液凝固因子（例えばＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ）、または他の血液凝固因子の産生は、以下に挙げる当技術分野において公知の任意の方法を含む。（ｉ）遺伝子工学によって組換えＤＮＡを産生する、（ｉｉ）以下に限定されないが、例えば、トランスフェクション、電気穿孔法、またはマイクロインジェクションによって、組換えＤＮＡを原核細胞または真核細胞内に導入する、（ｉｉｉ）前記形質転換させた細胞を培養する、（ｉｖ）ＦＶＩＩＩを、例えば構成的に、または誘導時に発現させる、および（ｖ）例えば培地から、または形質転換された細胞を採取することにより、前記ＦＶＩＩＩを単離することによって、（ｖｉ）精製したｒＦＶＩＩＩを得る。
別の態様では、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、または他の血液凝固因子は、薬理学的に許容されるｒＦＶＩＩＩ分子を産生する適切な原核宿主系または真核宿主系で発現することによって産生される。真核細胞の例は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｅｐ、およびＨｅｐＧ２などの哺乳動物の細胞である。
ｒＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、または他の血液凝固因子を調製するために、広範囲のベクターが使用され、真核生物のおよび原核生物の発現ベクターから選択される。原核生物の発現用ベクターの例は、以下に限定されないが、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、およびｐＢＡＤなどのプラスミドを含み、原核生物発現のベクターに使用されるプロモーターは、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、またはａｒａＢＡＤを１種または複数含むが、これらに限定されない。真核生物の発現用のベクターの例は、（ｉ）イーストでの発現の場合、以下に限定されないが、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１またはＡＵＧ１などのプロモーターを使用する、非限定的なｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、またはｐＭＥＴなどのベクター、（ｉｉ）昆虫細胞での発現の場合、以下に限定されないが、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４またはｐｏｌｈなどのプロモーターを使用する、非限定的なｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、またはｐＢＡＣなどのベクター、（ｉｉｉ）哺乳類細胞での発現の場合、以下に限定されないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、およびβ−アクチンなどのプロモーターを用いる、非限定的な、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、またはｐＢＰＶなどのベクター、および一態様では、以下に限定されないが、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスまたはレトロウイルスなどのウイルス系由来のベクターを含む。
ＰＥＧ化
ある態様では、血液凝固因子（例えば、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ）、または他の血液凝固因子の分子は、任意の種々の化学的方法によって水溶性ポリマーに結合している（Ｒｏｂｅｒｔｓ ＪＭら、Ａｄｖａｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ、２００２年、５４巻、４５９〜７６頁）。例えば、一実施形態では、ＦＶＩＩＩは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを用いて、タンパク質の遊離アミノ基にＰＥＧを結合することによって修飾される。別の実施形態では、水溶性ポリマー（例えばＰＥＧ）は、マレイミドの化学を利用して遊離ＳＨ基に結合される、あるいは予め酸化を行った後、ＦＶＩＩＩの炭水化物部位にＰＥＧヒドラジドまたはＰＥＧアミンがカップリングされる。
一態様では、結合は、安定な結合形成の下で、水溶性ポリマーを血液凝固因子（例えばＦＶＩＩＩ）へ直接カップリング（またはリンカー系を介したカップリング）によって実施される。さらに、分解性の、解離性の（ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ）、または加水分解性のリンカー系が、本発明のある態様では使用される（Ｔｓｕｂｅｒｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００４年、２７９巻、３８１１８〜２４頁、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ１９９９年、４２巻、３６５７〜６７頁、Ｚｈａｏら、Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ２００６年、１７巻、３４１〜５１頁、国際公開第２００６／１３８５７２Ａ２号、米国特許出願公開第７２５９２２４Ｂ２号、米国特許出願公開第７０６０２５９Ｂ２号）。
本発明の一実施形態では、血液凝固因子（例えばＦＶＩＩＩ）は、スクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルグルタレート、またはスクシンイミジルプロピオネートなどの活性なＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）を含有するポリエチレングリコール誘導体の使用によって、リジン残基を介して修飾される。これらの誘導体は、温和な条件下で、安定なアミド結合を形成することによりＦＶＩＩＩのリジン残基と反応する。本発明の一実施形態では、ＰＥＧ誘導体の鎖長は５，０００Ｄａである。直鎖構造および分枝構造を含めて、５００から２，０００Ｄａ、２，０００から５，０００Ｄａ、５，０００を超えて最大１０，０００Ｄａまで、または１０，０００を超えて最大２０，０００Ｄａまで、または２０，０００を超えて最大１５０，０００Ｄａまでの鎖長を有する他のＰＥＧ誘導体が、種々の実施形態で使用される。
アミノ基のＰＥＧ化の代替的な方法は、以下に限定されないが、ウレタン結合の形成によるＰＥＧカーボネートとの化学的結合、または第二級アミド結合を形成する還元的アミノ化によるアルデヒドまたはケトンとの反応である。
本発明の一実施形態では、血液凝固因子（例えばＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ）、または他の血液凝固因子の分子は、市販のＰＥＧ誘導体を用いて化学的に修飾される。これらのＰＥＧ誘導体は、代替的態様では、直鎖状構造または分枝構造を有している。ＮＨＳ基を含有するＰＥＧ誘導体の例が、以下に挙げられる。
以下のＰＥＧ誘導体は、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、Ａｌａ、ｗｗｗ．ｎｅｋｔａｒ．ｃｏｍ／ＰＥＧ ｒｅａｇｅｎｔ ｃａｔａｌｏｇ、Ｎｅｋｔａｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ、価格表２００５−２００６を参照）から市販されているものの非限定例である。
分枝構造を有するこの試薬について、Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉら（ＢｉｏＤｒｕｇｓ、２００１年、５巻、４１９〜２９頁）によって、さらに詳細に記述されている。
ＰＥＧ誘導体の他の非限定的な例は、ＮＯＦ社から市販されている（東京、日本、ｗｗｗ．ｎｏｆ．ｃｏ．ｊｐ／ｅｎｇｌｉｓｈ： Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ２００５を参照）。
これらのプロパン誘導体は、１，２置換パターンを有するグリセロール骨格を示す。本発明においては、１，３置換を有するグリセロール構造、または米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６Ａ１号に記載の他の分枝構造に基づく分枝ＰＥＧ誘導体もまた、意図される。
Ｔｓｕｂｅｒｙら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００４年、２７９巻、３８１１８〜２４頁）およびＳｈｅｃｈｔｅｒら（国際公開第０４０８９２８０Ａ３号）によって記載されている分解性（例えば、加水分解可能なリンカー）を有するＰＥＧ誘導体もまた、意図される。
驚くべきことに、本発明のＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、または他の血液凝固因子は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＦＶＩＩＩの半減期の延長を兼ね備えた機能活性を示す。これに加えて、ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、または他の血液凝固因子は、トロンビン不活性化に対して、抵抗性がより高いようである。
シアル酸
本明細書で使用する場合、「シアル酸部分」は、水溶液または水性懸濁液に可溶なシアル酸のモノマーまたはポリマー（「多糖類」）を含み、医薬として有効な量のＰＳＡ−ＦＶＩＩＩ結合体を哺乳動物に投与した場合、副作用などの負の影響がほとんどない、または全くないものである。ポリマーは、一態様では、１から４単位を有するものとして特徴付けられる。ある態様では、異なるシアル酸単位が、鎖に組み込まれている。
本発明の種々の態様では、シアル酸部分は、例えば、参照により本明細書中に組み込まれている米国特許第４，３５６，１７０号に記載の方法によって、血液凝固因子（例えば、ＦＶＩＩＩ）に結合される。本発明の種々の実施形態では、多糖化合物は、天然に存在する多糖、天然に存在する多糖の誘導体、または天然に存在する多糖誘導体である。一般に、化合物中の糖類残基すべてが、シアル酸残基である。
ＰＳＡをポリペプチドにカップリングするための他の技法もまた公知である。例えば、米国特許出願公開第２００７／０２８２０９６号は、例えばＰＳＡのアミンまたはヒドラジド誘導体のタンパク質への結合について記載している。さらに、米国特許出願公開第２００７／０１９１５９７号は、還元末端において、基質（例えばタンパク質）との反応のためのアルデヒド基を含有するＰＳＡ誘導体について記載している。
本発明の一実施形態では、多糖化合物のポリシアル酸の部分は親水性が高く、また別の実施形態では、化合物全体の親水性が高い。親水性は、シアル酸単位のペンダントカルボキシル基、およびヒドロキシル基によって主に付与されている。その糖類単位は、種々の態様では、アミン基、ヒドロキシル基または硫酸基などの（他の官能性）基、またはそれらの組合せを含有する。これらの基は、天然に存在する糖類化合物に存在するか、または誘導体多糖化合物に導入される。
本発明のための特定の用途の多糖化合物は、一態様では、細菌によって産生されるものである。これらの天然で生じる多糖類の一部は、糖脂質類として公知である。一実施形態では、多糖化合物は、末端ガラクトース単位を実質的に有さない。
血液凝固因子抗体
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、標的タンパク質またはその断片に特異的な、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ニ官能性／ニ特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ならびに相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体を指す。「抗体」という用語は、さらに、ｉｎ ｖｉｖｏにおける治療用抗体の遺伝子移入をも含む。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、およびＦｖを含む抗体断片もまた、本発明によって提供される。抗体は、一部の好ましい実施形態において、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、一本鎖抗体、またはキメラ抗体であってよい。
本明細書で使用する場合、「エピトープ」という用語は、ポリペプチドの抗原決定基を指す。一部の実施形態において、エピトープは、エピトープに特有の空間高次構造に３つ以上のアミノ酸を含んでよい。一部の実施形態において、エピトープは、直鎖状または高次構造エピトープである。一般に、エピトープは少なくとも４個のこのようなアミノ酸からなり、より一般的には、少なくとも８〜１０個のこのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間高次構造の決定方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｘ線結晶解析および二次元核磁気共鳴を含む。
一部の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、霊長類化抗体、ファージディスプレイ化抗体、一本鎖抗体、または前記のいずれかの断片からなる群から選択される。一部の好ましい実施形態では、抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は、例えば、（１）ヒトフレームワークおよび定常領域上に、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植する（当技術分野においては、「ヒト化」と呼ばれる方法）、または代替として（２）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様表面でそれらを「覆う（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」（当分野においては、「化粧張り（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」と呼ばれる方法）を含めた種々の方法によって達成され得る。本発明では、ヒト化抗体は、「ヒト化した」および「化粧張りされた」抗体の両方が含まれることになる。同様に、ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン遺伝子が、部分的または完全に不活性化されたトランスジェニック動物（例えばマウス）に、ヒト免疫グロブリンの遺伝子座を導入することによって作製することができる。遺伝子座の導入時に、ヒト抗体の産生が観察され、この抗体は、遺伝子再配列、遺伝子アセンブリ、および抗体レパートリーを含めて、あらゆる点でヒトに見られるものとよく似ている。本アプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号、および以下の科学出版物、すなわち、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９２年、１０巻、７７９〜７８３頁；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９４年、３６８巻、８５６〜８５９頁；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、１９９４年、３６８巻、８１２〜１３頁；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９６年、１４巻、８４５〜５１頁；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９６年、１４巻、８２６頁；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９５年、１３巻、６５〜９３頁；Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８６年、３２１巻、５２２〜５２５頁；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、米国、１９８４年、８１巻、６８５１〜６８５５頁；ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＯｉ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８８年、４４巻、６５〜９２頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８年、２３９巻、１５３４〜１５３６頁；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎ．、１９９１年、２８巻、４８９〜４９８頁；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４年、３１巻、３号、１６９〜２１７頁；およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１９９１年、４巻、７号、７７３〜８３頁（これらの各々は、参照により本明細書中に組み込まれている）に記載されている。
本発明の抗体は、固体支持体に結合されてもよく、これらの支持体は、ＰＥＧ化した血液凝固因子（例えば、ｒＦＶＩＩＩ、ｒＦＶＩＩ、ｒＦＩＸ）、または他の血液凝固因子の免疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体は、非限定的に、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンを含む。
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒらのＮａｔｕｒｅ、１９７５年、２５６巻、４９５〜４９６頁の方法、またはこの変形を利用して調製され得る。通常、抗原を含有する溶液でマウスを免疫する。抗原を含有する生理食塩水溶液、好ましくは、フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ）完全アジュバントなどのアジュバント中で、混合または乳化させて、混合液または乳化液を非経口的に注射することによって、免疫は実施され得る。本発明のモノクローナル抗体を取得するために、当技術分野で公知の任意の免疫方法が使用されてよい。動物への免疫後、脾臓（および、場合により数個の大リンパ節）を取り出し、単一細胞に解離する。目的の抗原で被覆したプレートまたはウェルに、細胞の懸濁液を適用させることにより、脾臓細胞をスクリーニングすることができる。抗原に特異的な膜結合型免疫グロブリンを発現しているＢ細胞は、プレートに結合し、洗い流されない。得られたＢ細胞、または解離した脾臓細胞のすべてに、次に、骨髄腫細胞との融合を誘起してハイブリドーマを形成させて、選択培地で培養する。得られた細胞を、段階希釈または限界希釈によってプレート培養し、目的の抗原に特異的に結合する（および無関係な抗原に結合しない）抗体の産生をアッセイする。次いで、選択されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分泌するハイブリドーマをｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、組織培養瓶もしくはホローファイバー反応器の中で）、またはｉｎ ｖｉｖｏ（マウス中で腹水として）のいずれかで培養する。
発現用ハイブリドーマの使用の代替として、参照により本明細書中に組み込まれている、米国特許第５，５４５，４０３号、第５，５４５，４０５号、および第５，９９８，１４４号に開示の抗体を、ＣＨＯまたは骨髄腫細胞系などの細胞系の中で産生することもできる。略述すると、軽鎖および重鎖をそれぞれ発現する能力があるベクターで、細胞系をトランスフェクトする。別々のベクター上の二つのタンパク質をトランスフェクトすることにより、キメラ抗体を産生することができる。Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：８、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、１９９１年、３：８、および Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１年、２５１：７０のすべてが、参照により本明細書に組み込まれている。
投与
本発明のタンパク質性構築体を含む組成物を、ヒトまたは試験動物に投与するために、一態様では、その組成物は１つまたは複数の医薬として許容される担体を含む。「医薬として」または「薬理学的に許容される」という用語は、安定しており、凝集産物および開裂産物などのタンパク質分解を抑制し、さらに、以下に記載されるように、当技術分野で周知の経路を用いて投与される場合、アレルギー反応または他の有害反応をさらに生じない分子構成体（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｔｉｔｙ）および組成物を指す。「医薬として許容される担体」は、上で開示した薬剤を含め、任意およびすべての臨床的に有用な溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。
組成物は、経口的に、局所的に、経皮的に、非経口的に、吸入スプレーによって、経膣的に、直腸に、または頭蓋内注射によって投与される。本明細書で使用する場合の非経口的という用語は、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、大槽内注射、または注入技法を含む。静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、鞘内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、眼球後、肺内の注射、および、または特定部位における外科的移植による投与も同様に意図される。一般に、組成物は、発熱物質、および受益者に有害になり得る他の不純物を、本質的に含んでいない。
治療担当医によって，組成物の単回投与または複数回投与が、用量濃度およびパターンと共に検討され、選択される。疾患の予防または処置に関する適切な投与量は、上記のように処置すべき疾患の種類、疾患の重篤度および経過、薬物が予防目的かそれとも治療目的で投与されるのか、治療歴、患者の臨床歴および薬物応答、ならびに主治医の裁量に依存することになる。本明細書で使用する場合、「有効量」は、上で概要を述べたように、出血性障害を有する哺乳動物を処置するために適切な用量を含む。
本発明はまた、上で定義したタンパク質性構築体の有効量を含む医薬組成物にも関する。医薬組成物は、種々の態様では、医薬として許容される担体、希釈剤、塩、緩衝剤または賦形剤をさらに含む。本発明の医薬組成物は、溶液または凍結乾燥品を含む。医薬組成物の溶液は、場合により、任意の適切な凍結乾燥プロセスに付される。
追加の態様として、本発明には、被験者へ投与するために、その使用を促進する方法でパッケージされた本発明の組成物を含むキットが含まれる。一実施形態では、このようなキットは、密封された瓶または器（ｖｅｓｓｅｌ）などの容器にパッケージされて、前記方法を実行する際の、化合物または組成物の用途を説明するラベルが容器に貼付されるか、またはパッケージに含まれている、本明細書に記載の化合物または組成物（例えば、タンパク質性構築体を含む組成物）を含む。一実施形態では、キットは、タンパク質性構築体を含む組成物を有する第１の容器、および第１の容器内の組成物のための生理的に許容される再構成溶液を有する第２の容器を含有する。一態様では、化合物または組成物は、単位剤形でパッケージされる。キットは、特定の投与経路によって組成物を投与するのに適した装置をさらに含んでもよい。好ましくは、該キットは、治療用タンパク質またはペプチド組成物の用途を説明するラベルを含有する。
（実施例１）
ｒＦＶＩＩＩ中のリジン残基のＰＥＧ化
Ａ．ＦＶＩＩＩの固定化
樹脂上に固定化された抗ＦＶＩＩＩ ｍＡｂを完全に飽和させる条件下で、平衡化した抗ＦＶＩＩＩ免疫親和性樹脂と共に、ｒＦＶＩＩＩサンプルをインキュベートした（＞３ｍｇＦＶＩＩＩ／ｇ樹脂）。一実施形態では、抗ＦＶＩＩＩ ｍＡｂは、ｒＦＶＩＩＩの活性と関連のあるｒＦＶＩＩＩ分子上のエピトープに結合して、このエピトープが水溶性ポリマーに結合するのを阻止する。回転装置内で、２〜８℃でインキュベートを一晩実施した。結合ＦＶＩＩＩを有する樹脂を、ガラスフリットを用いてろ過により集め、緩衝液ＡＱ２（ＷＦＩ中、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）ポリソルベート８０、室温でｐＨ６．８±０．２）で２度洗浄した。
Ｂ．ＰＥＧ化
固定化ＦＶＩＩＩのＰＥＧ化は、ＮＥＫＴＡＲ社（Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、カリフォルニア）によって提供されているＰＥＧ化試薬を用いて、パイロットスケールのＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ製造に適用される手順に従って実施した。試薬は、安定なＦＶＩＩＩ−ＰＥＧ結合体をもたらす化学的性質を有する２０ｋＤａのＰＥＧとした。ＰＥＧ化速度は、ＦＶＩＩＩタンパク質に対し過剰モルのＰＥＧ化試薬を用いて調節した。反応後、過剰の未反応ＰＥＧ試薬は、グリシン溶液を添加することによって不活性化させた。
Ｃ．ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩの回収
ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ結合体を有する抗ＦＶＩＩＩ樹脂をカラムに充填し、緩衝液ＡＱ２およびＡＭ３（ＷＦＩ中、２０ｍＭ ＭＥＳ、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）ポリソルベート８０、室温でｐＨ５．９±０，２）で洗浄した。緩衝液ＡＨ２（ＷＦＩ中、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）ポリソルベート８０、室温でｐＨ６．８±０．２）、次いで、５０％のエチレングリコールを含有する緩衝液ＡＥ１（ＷＦＩ中、５０％（ｖ／ｖ）エチレングリコール、２０ｍＭ Ｌ−ヒスチジン、２０ｍＭ ＣａＣｌ２、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％（ｖ／ｖ）ポリソルベート８０、室温でｐＨ６．８±０．２）を、カラムにポンプ注入することによって、ＦＶＩＩＩの脱着を行った。ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩを画分で集め、ＵＶ２８０シグナルに従ってプールした。
Ｄ．解析
全タンパク質量は、実験的に求めた換算係数１，３１５（１ｍｇ／ｍｌタンパク質＝１，３１５のＵＶ２８０吸収）を用いて、ＵＶ２８０の吸収によって決定した。この係数は、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法（ＤＦ１０１３／０２４）に準拠して全タンパク質の測定から導いた。
ＦＶＩＩＩのＰＥＧ化度は、ＥＬＳＤ検出器（蒸発光散乱検出器）を利用したＨＰＬＣ法により決定した。サンプルをプロナーゼによって開裂させて、得られたペプチドをモノリシックＣ１８カラムで分離し、ペプチドを含有するＰＥＧをＥＬＳＤモニターによってモニターする。
Ｅ．結果
ＦＶＩＩＩのＡ２領域に局在しているエピトープに結合しているモノクローナル抗体Ｆ８．１とｒＦＶＩＩＩの複合体上の直鎖状２０Ｋポリエチレングリコール分子を用いて、ＦＶＩＩＩのＰＥＧ化実験を実施した。
過剰量のｒＦＶＩＩＩ（アドベート（Ａｄｖａｔｅ）ＢＤＳ）を、セファロースＣＬ ４Ｂに固定化されたモノクローナル抗体と共にインキュベートすることにより、複合体を形成させた。ガラス製カラム内で、種々の緩衝液を用いて、ｍＡＢ樹脂を洗浄することによって、非結合ｒＦＶＩＩＩを除去し、セファロースＣＬ ４Ｂ上に固定化された複合体をガラス製容器に注いだ。
その後、適用した条件下において、ＦＶＩＩＩポリペプチド（Ｎ末端のリジン）の第一級アミンと好ましく反応するＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド反応性基を有するＰＥＧ化試薬を添加することにより、ＰＥＧ化反応を開始した。ＰＥＧ化度は、ＰＥＧ化反応に用いた過剰のＰＥＧ試薬（反応におけるＦＶＩＩＩタンパク質に対して２５倍から２５０倍モル過剰の範囲）によって調節した。室温で６時間から１０時間の化学反応時間後、１００ｍＭグリシンのストック溶液を添加することによって、実験を終了した。セファロースＣＬ ４Ｂを再度、カラム内に充填し、ＡＭ３およびＡＱ２緩衝液を用いて、２〜１０ＣＶの種々の洗浄工程によって、過剰のＰＥＧ試薬を除去した。
溶離緩衝液ＡＥ１をカラムにポンプ注入して流すことによって、得られた安定なＦＶＩＩＩ−ＰＥＧ結合体をｍＡｂから分離し、以下の実施例２に記載のＦＶＩＩＩ活性、およびＰＥＧ化度について、集めた生成物を試験した。
（実施例２）
ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩの生化学的特徴付け
ＰＥＧ化ｒＦＶＩＩＩの生化学的特徴付けの結果を、以下の表１および表２にまとめる。
適応条件下において、２４〜５０％の範囲のＦＶＩＩＩ比活性の低下を伴い、０．６〜３．４モルＰＥＧ／モルＦＶＩＩＩのＰＥＧ化度が得られたことを表１は示している。ＰＥＧ化反応前にＦＶＩＩＩをｍＡｂと接触させない、ＰＥＧ化実験もパイロットスケールで実施した。表２に示された４バッチの結果は、非保護的条件下では、ＦＶＩＩＩ効力（比活性）の損失が、ｍＡｂ存在下で実施したＰＥＧ化実験と比較すると、顕著に大きかったことを示している。さらに、グラフを用いて結果を表すと、ＦＶＩＩＩ比活性の損失は、少なくとも部分的に、ＰＥＧ化の度合いの関数となることを示し得る（図１参照）。
これらの結果をまとめると、ＦＶＩＩＩ／ｍＡＢ複合体のＰＥＧ化により、ＦＶＩＩＩ単独のＰＥＧ化反応に比べて、より大きな比活性を維持するＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ分子がもたらされる。ＦＶＩＩＩ比活性の損失は、また、ＦＶＩＩＩタンパク質に対するＰＥＧ化試薬の比によって調節することができるＰＥＧ化の度合いの関数でもある。
（実施例３）
血液凝固因子中のリジン残基のＰＥＧ化
本発明において、上の実施例１による血液凝固タンパク質のＰＥＧ化が計画される。すなわち、以下：第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）およびＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼのうちのいずれか１つを用いて、実施例１を繰り返す。特定された各血液凝固因子に対して使用される抗体は、前記血液凝固因子の活性と関連のある血液凝固因子上のエピトープに対する結合親和性を有することができるが、それを必要とするわけではない。

Claims (16)

  1. 血液凝固因子に、水溶性ポリマー（ＷＳＰ）を結合する方法であって、
    （ａ）前記血液凝固因子に血液凝固因子特異抗体を結合させる条件下で、前記抗体と共に前記血液凝固因子をインキュベートして、抗体−血液凝固因子複合体を形成させる工程と、
    （ｂ）前記抗体−血液凝固因子複合体に前記ＷＳＰを結合させる条件下で、前記ＷＳＰと共に前記抗体−血液凝固因子複合体をインキュベートする工程と、
    （ｃ）前記ＷＳＰ結合血液凝固因子を、前記抗体から離す工程を含み、
    前記血液凝固因子は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）およびＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼからなる群から選択され、
    前記ＷＳＰは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分枝ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、でんぷん、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、および／または２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）からなる群から選択される、方法。
  2. 前記血液凝固因子がＦＶＩＩＩである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＦＶＩＩＩが完全長ＦＶＩＩＩである、請求項２に記載の方法。
  4. 前記ＷＳＰが約２，０００から約１５０，０００Ｄａの分子量を有する、請求項１に記載の方法。
  5. 前記ＷＳＰが直鎖状構造または分枝構造を有する、請求項４に記載の方法。
  6. 前記ＷＳＰがＰＥＧである、請求項５に記載の方法。
  7. 前記ＷＳＰがＰＳＡである、請求項５に記載の方法。
  8. 前記抗体が樹脂に固定化されている、請求項１に記載の方法。
  9. （ａ）血液凝固因子、および
    （ｂ）前記血液凝固因子に結合している少なくとも１種の水溶性ポリマー（ＷＳＰ）分子
    を含むタンパク質性構築体であって、
    前記少なくとも１種のＷＳＰは、前記血液凝固因子に特異的に結合する抗体の存在下で、前記血液凝固因子に結合し、
    前記血液凝固因子は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩ）、プロテインＣ、プロテインＳ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１、組織因子（ＴＦ）およびＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼからなる群から選択され、
    前記ＷＳＰは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分枝ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、でんぷん、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、および／または２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）からなる群から選択される、構築体。
  10. 前記血液凝固因子がＦＶＩＩＩである、請求項９に記載のタンパク質性構築体。
  11. 前記ＦＶＩＩＩが完全長ＦＶＩＩＩである、請求項１０に記載のタンパク質性構築体。
  12. 前記ＷＳＰが約２，０００から約１５０，０００Ｄａの分子量を有する、請求項９に記載のタンパク質性構築体。
  13. 前記ＷＳＰが直鎖状構造または分枝構造を有する、請求項１２に記載のタンパク質性構築体。
  14. 前記ＷＳＰがＰＥＧである、請求項１３に記載のタンパク質性構築体。
  15. 前記ＷＳＰがＰＳＡである、請求項１３に記載のタンパク質性構築体。
  16. 前記抗体が樹脂に固定化されている、請求項９に記載のタンパク質性構築体。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201007356D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
MY190257A (en) * 2012-04-16 2022-04-11 Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd Optimised subcutaneous therapeutic agents
CN102776260B (zh) * 2012-07-26 2015-04-29 上海泰龙生物医药科技有限公司 一种高效表达重组人凝血八因子的方法
KR20150133576A (ko) 2014-05-20 2015-11-30 삼성전자주식회사 화학적 개질된 표적화 단백질 및 그의 이용
CN105237762B (zh) * 2015-10-27 2017-11-14 深圳市健元医药科技有限公司 Peg化亮丙瑞林
EP3577140A1 (en) 2017-02-01 2019-12-11 Novo Nordisk A/S Procoagulant antibodies
WO2019222674A1 (en) * 2018-05-18 2019-11-21 Chan Zuckerberg Biohub, Inc. Epitope restriction for antibody selection
US11220554B2 (en) 2018-09-07 2022-01-11 Novo Nordisk A/S Procoagulant antibodies

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001506670A (ja) * 1997-03-10 2001-05-22 イミュネックス・コーポレーション 部位保護されたタンパク質修飾
JP2006519238A (ja) * 2003-02-26 2006-08-24 ネクター セラピューティクス アラバマ，コーポレイション ポリマー−ｖｉｉｉ因子部分結合体
WO2007126808A1 (en) * 2006-03-31 2007-11-08 Baxter International Inc Pegylated factor viii

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4686112A (en) * 1983-01-13 1987-08-11 Rca Corporation Deposition of silicon dioxide
US4757006A (en) 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
US4970300A (en) 1985-02-01 1990-11-13 New York University Modified factor VIII
ATE72838T1 (de) 1985-04-12 1992-03-15 Genetics Inst Neue prokoagulierungsproteine.
US5198349A (en) 1986-01-03 1993-03-30 Genetics Institute, Inc. Method for producing factor VIII:C and analogs
US5250421A (en) 1986-01-03 1993-10-05 Genetics Institute, Inc. Method for producing factor VIII:C-type proteins
JPH0387173A (ja) 1987-09-10 1991-04-11 Teijin Ltd ヒト活性化天然型ファクター８ｃの製造方法及びそれに用いる形質転換体
DE3889853D1 (de) 1987-11-05 1994-07-07 Hybritech Inc Polysaccharidmodifizierte Immunglobuline mit reduziertem immunogenem Potential oder verbesserter Pharmakokinetik.
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
ATE300615T1 (de) 1990-08-29 2005-08-15 Genpharm Int Transgene mäuse fähig zur produktion heterologer antikörper
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
US6037452A (en) 1992-04-10 2000-03-14 Alpha Therapeutic Corporation Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate
DE69329795T2 (de) 1992-10-02 2001-07-05 Genetics Institute, Inc. Zusammensetzung, welche den koagulationsfaktor viii beinhaltet; verfahren zu deren herstellung und die benutzung eines oberflächenaktiven stoffes als stabilisator
GB9225448D0 (en) * 1992-12-04 1993-01-27 Erba Carlo Spa Improved synthesis of polymer bioactive conjugates
AU6029594A (en) 1993-01-15 1994-08-15 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
US6309853B1 (en) 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
SE9503380D0 (sv) * 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
US5830698A (en) 1997-03-14 1998-11-03 Idec Pharmaceuticals Corporation Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
WO1999003496A1 (en) 1997-07-21 1999-01-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Factor ix antihemophilic factor with increased clotting activity
US7074878B1 (en) 1999-12-10 2006-07-11 Harris J Milton Hydrolytically degradable polymers and hydrogels made therefrom
US6413507B1 (en) 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
AU2002352524B2 (en) 2001-11-07 2007-10-04 Nektar Therapeutics Branched polymers and their conjugates
CA2521784C (en) 2003-04-08 2012-03-27 Yeda Research And Development Co. Ltd. Reversible pegylated drugs
WO2005016974A1 (en) 2003-08-12 2005-02-24 Lipoxen Technologies Limited Sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation
WO2006016168A2 (en) 2004-08-12 2006-02-16 Lipoxen Technologies Limited Sialic acid derivatives
BRPI0611872B8 (pt) 2005-06-16 2021-05-25 Nektar Therapeutics reagente polimérico, conjugado, método para preparação de um conjugado e composição farmacêutica

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001506670A (ja) * 1997-03-10 2001-05-22 イミュネックス・コーポレーション 部位保護されたタンパク質修飾
JP2006519238A (ja) * 2003-02-26 2006-08-24 ネクター セラピューティクス アラバマ，コーポレイション ポリマー−ｖｉｉｉ因子部分結合体
WO2007126808A1 (en) * 2006-03-31 2007-11-08 Baxter International Inc Pegylated factor viii

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022515298A (ja) * 2018-12-27 2022-02-17 天津鍵凱科技有限公司 結合部位制御可能なｐｅｇ化生体分子の製造方法

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