JP2012505912A - 線維芽細胞成長因子受容体３（ｆｇｆｒ−３）阻害剤および治療方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒトＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）およびＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｃ）、またはその突然変異型に対して特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントに関する。更に、実施形態としては、当該抗体を含む薬学的組成物および当該抗体を用いて癌を治療する方法が挙げられる。

Description

本発明は、免疫学および癌治療におけるものである。より具体的には、本発明は、ヒト線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ−３）（配列番号１１）に結合するヒト抗体に関する。ＦＧＦＲはまた、ＣＤ３３３、ＡＣＨ、ＣＥＫ２、ＨＳＦＧＦＲ−３ＥＸおよびＪＴＫ４としても知られる。

ＦＧＦＲ−３は、多発性骨髄種、膀胱腺癌および尿路上皮細胞癌を含む癌の発症に関与することが示されている。ＦＧＦリガンド−受容体結合は、受容体二量化および自己リン酸化を誘導し、エフェクター分子の下流活性を導く。ＦＧＦＲ−３シグナル伝達は、例えば、増殖、分化、移動、生存／アポトーシス、細胞骨格およびサイトカイン調節、ならびにエンドサイトーシス／エクソサイトーシス等の広範な細胞活動を制御可能である。ＦＧＦＲ−３シグナル伝達の過剰活性化は、腫瘍細胞の成長または生存における便宜を図り、それ故に腫瘍の悪性度に寄与する重要な事象として認識されている。

完全長ＦＧＦＲ−３は、ＦＧＦＲ−３の第３ＩｇＧ様ドメインをコードする選択的エクソンによって生じる、ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）およびＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｃ）と呼ばれる２つのスプライシング型を有する。ＦＧＦＲ−３はまた、ＤＮＡ複製または翻訳における誤りに起因する、文書で十分に裏づけされた突然変異型を有する。癌を含む広範な疾患におけるＦＧＦＲ−３シグナル伝達経路の積極的役割を鑑みると、この経路を制御する機構が必要とされている。

リガンド結合をブロックする抗ＦＧＦＲ−３抗体が開示されている（非特許文献１）。野生型および突然変異型の両方のＦＧＦＲ−３に対して結合する抗ＦＧＦＲ−３抗体が開示されている（非特許文献２、非特許文献３）。ＦＧＦＲ−３シグナル伝達のリガンド媒介性活性化を阻害し、かつ、ＦＧＦＲ−３腫瘍成長を阻害する、抗ＦＧＦＲ−３抗体が開示されている（非特許文献３）。併用療法として投与される場合のシスプラチンの抗腫瘍効果を促進する抗ＦＧＦＲ−３抗体が開示されている（非特許文献４、非特許文献５）。

Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８（４０）：３８１９４−２０５（２００３年１０月３日） Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｔｏｒｒｅｃｕａｄｒａｄａ，Ｊ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１１（１７）：６２８０−９０（２００５年９月１日） Ｔｒｕｄｅｌ Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１０７（１０）：４０３９−４６（２００６年５月１５日） Ｄｅｅｖｉ，Ｄ．ら、ＡＡＣＲ（２００７年１０月２１〜２４日） Ｗａｎｇ，Ｗ．ら、ＥＯＲＴＣ（２００８年１０月２２〜２６日）

しかしながら、当該技術分野において、ＦＧＦＲ−３の両方のスプライシング型（ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）およびＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｃ））に対して高度に特異的であり、ＦＧＦＲ−３を内在化し、ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）およびＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｃ）、またはその突然変異型の分解も好ましくは誘導し、治療効果を促進し、そして、化学的細胞毒性因子と組み合わせて用いる場合の化学療法耐性を逆転することのうち、１つ以上が可能な抗体アンタゴニストが必要とされている。加えて、当該抗体はまた、好ましくは、ＦＧＦＲ−３の突然変異型に対して活性であり、ＦＧＦＲ−３への結合からＦＧＦリガンドをブロックし、リガンド誘導ＦＧＦＲ−３シグナル伝達経路を阻害し、ＦＧＦＲ−３媒介性細胞活動を阻害し、または、インビトロおよびインビボにおける腫瘍成長を阻害することが必要とされている。

本発明の抗体は、これらの課題を解決する。本発明の抗体は、ＦＧＦＲ−３の両方のスプライシング型（ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）およびＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｃ））に対して高度に特異的であり、ＦＧＦＲ−３を内在化し、また好ましくは、ＦＧＦＲ−３受容体またはそれらの細胞の受容体突然変異体への結合における受容体分解を誘導し、治療効果を促進し、化学的細胞毒性因子と組み合わせて用いる場合における化学療法耐性を逆転させ、そして、ＦＧＦＲ−３の突然変異型に対して活性であり、ＦＧＦＲ−３への結合からＦＧＦリガンドをブロックし、リガンド誘導ＦＧＦＲ−３シグナル伝達経路を阻害し、ＦＧＦＲ−３媒介性細胞活動を阻害し、また、インビトロおよびインビボにおける腫瘍成長を阻害する。

本発明は、ヒトＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）およびＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｃ）に対して特異的に結合する、単離された抗体に関する。

好ましくは、本発明の抗体は、室温（２０〜２５℃）にて約１×１０^−８Ｍ以下のＫ_Ｄを有するヒト抗体である。

好ましくは、本発明の抗体は、ヒトＦＧＦＲ−３ドメイン２（配列番号１２）に対して特異的に結合する。

好ましくは、本発明の抗体は、ヒトＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）およびＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｃ）に対して特異的に結合し、当該抗体は、配列ＧＹＭＦＴＳＹＧＩＳ（配列番号１）を有するＣＤＲＨ１、配列ＷＶＳＴＹＮＧＤＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）を有するＣＤＲＨ２、配列ＶＬＧＹＹＤＳＩＤＧＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号３）を有するＣＤＲＨ３、配列ＧＧＮＮＩＧＤＫＳＶＨ（配列番号４）を有するＣＤＲＬ１、配列ＬＤＴＥＲＰＳ（配列番号５）を有するＣＤＲＬ２、および、配列ＱＶＷＤＳＧＳＤＨＶＶ（配列番号６）を有するＣＤＲＬ３を含む。

好ましくは、本発明の抗体は、重鎖可変アミノ酸配列：ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＭＦＴＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＶＳＴＹＮＧＤＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＶＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＬＧＹＹＤＳＩＤＧＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号７）、および、軽鎖可変アミノ酸配列：ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＬＳＶＡＰＧＫＴＡＴＦＴＣＧＧＮＮＩＧＤＫＳＶＨＷＹＲＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＭＹＬＤＴＥＲＰＳＧＩＰＥＲＭＳＧＳＮＦＧＮＴＡＴＬＴＩＴＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＳＧＳＤＨＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ（配列番号８）を含み得る。

好ましくは、本発明の抗体は、重鎖可変アミノ酸配列：ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＭＦＴＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＶＳＴＹＮＧＤＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＶＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＬＧＹＹＤＳＩＤＧＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号７）、または、軽鎖可変アミノ酸配列：ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＬＳＶＡＰＧＫＴＡＴＦＴＣＧＧＮＮＩＧＤＫＳＶＨＷＹＲＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＭＹＬＤＴＥＲＰＳＧＩＰＥＲＭＳＧＳＮＦＧＮＴＡＴＬＴＩＴＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＳＧＳＤＨＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ（配列番号８）を含み得る。

本発明の抗体の重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１または当該抗体のＦＧＦＲ−３結合フラグメント由来であり得る。好ましくは、本発明の抗体は、配列番号９の重鎖および配列番号１０の軽鎖を含む。好ましくは、本発明の抗体は、配列番号９の重鎖および配列番号１０の軽鎖、または、当該抗体のＦＧＦＲ−３−結合フラグメントを含む。

本発明の抗体はまた、配列番号９の２本の重鎖および配列番号１０の２本の軽鎖を含み得る。本発明の抗体はまた、配列番号９の２本の重鎖および配列番号１０の２本の軽鎖を含み得る。好ましくは、本発明の抗体は、配列番号９の２本の重鎖および配列番号１０の２本の軽鎖、または、当該抗体のＦＧＦＲ−３−結合フラグメントを含む。

本発明の抗体は、中和ヒトＦＧＦＲ−３結合フラグメントを含み得る。

好ましい態様において、本発明は、単離された抗体またはそのフラグメントに関する。ここで、本発明の抗体は、競合抗体を用いる競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＦＧＦＲ−３の細胞外ドメインに対する結合と競合し、当該競合抗体は、室温（２０〜２５℃）にて約１×１０^−８Ｍ以下のＫ_ＤでＦＧＦＲ−３と結合する。

本発明は更に、変異ＦＧＦＲ−３に対して結合する抗体に関する。

本発明は、本発明の抗体またはフラグメントと、薬学的に受容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む、薬学的組成物に関する。

本発明はまた、本発明の抗体またはフラグメントと、治療のための追加の抗癌剤とを含有し、同時投与、別個投与または連続投与を組み合わせて治療に用いられる、製剤に関する。

本発明の別の態様において、本発明の抗体またはフラグメントは、医薬として用いられる。本発明の別の態様において、本発明の抗体またはフラグメントは、癌の治療に用いられる。本発明の別の態様において、本発明の抗体またはフラグメントは、癌が膀胱癌または多発性骨髄腫である医薬として用いられる。

本発明の別の態様において、本発明の抗体またはフラグメントは、別の薬剤とともに癌の治療に用いられる。本発明の抗体またはフラグメントは、患者に対して有効量の別の薬剤とともに、同時投与、別個投与、または、連続投与され得る。本発明は、化合物と、薬学的に受容可能な担体および必要に応じて他の治療成分を共に含む、薬学的組成物を含み得る。

本発明はまた、患者に対して有効量の本発明の抗体を投与する工程を含む、患者における癌を治療する方法に関する。癌は、膀胱癌または多発性骨髄腫であり得る。別の態様において、本発明は、患者に対して有効量にて本発明の抗体および別の薬剤を、同時投与、別個投与、または、連続投与する工程を含む、患者における癌を治療する方法を含む。他の薬剤は、薬剤はシスプラチンであり得る。

したがって、本発明の抗体は、天然および突然変異型のＦＧＦＲ−３に対して結合し、ＦＧＦＲ−３の分解を誘導し、腫瘍細胞ならびに間質成分に作用することで腫瘍を阻害することができ、癌治療において広範な治療価値を有する。

用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子を含み、当該分子は、４本のポリペプチド鎖（２本の同一重鎖（Ｈ）および２本の同一軽鎖（Ｌ））を含み、ジスルフィド結合により相互に結合されている。個々の鎖は、同様の大きさ（１１０〜１２５アミノ酸）および構造であるが異なる機能を有するドメインに折り畳まれ得る。

「単離された抗体」とは、（１）構成要素の混合物から部分的、実質的、または、完全に精製されているか、（２）天然の構成要素から同定、分離、および／または回収されているか、（３）モノクローナルであるか、（４）同種由来の他のタンパク質が存在しないか、（５）異種由来の細胞により発現されているか、あるいは（６）天然に存在しない、抗体である。天然の環境における汚染物質の構成要素は、本発明の抗体についての診断的または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性溶質または非タンパク性溶質を含み得る。単離された抗体の例としては、アフィニティー精製された抗体、ハイブリドーマまたはインビトロにおける他の細胞株、あるいは、トランスジェニックマウス由来のヒト抗体から作成された抗体が挙げられる。

本願明細書において用いられる用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に同質の抗体の集団から得られた抗体を意味し、例えば、当該集団を含む個々の抗体であり、起こり得る自然発生変異または存在し得るマイナーな翻訳後変異体を除いて実質的に同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位（決定基またはエピトープとしても知られる）に対して高度に特異的である。更に、一般的に異なる決定基に対する異なる抗体を含む、従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対するものである。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の性質が、抗体の実質的に同質な集団から得られたものであることを示し、任意の特定の方法により必要な抗体の生産物と解釈されるべきはない。

本願明細書において用いられる、用語「ヒト抗体」とは、上述したＫａｂａｔら、Ｃｈｏｔｈｉａら、およびＭａｒｔｉｎの文献に記載されたような、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に対応する可変領域および定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロにおけるランダム突然変異または部位特異的突然変異により、あるいは、インビボにおける体細胞変異により誘導された変異）によりコードされていないアミノ酸残基を含み得る。ヒト抗体は、アミノ酸残基（例えば、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされていない活性促進アミノ酸残基）により置換された少なくとも１つの位置を有し得る。しかしながら、本願明細書において用いられる、用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖系列由来のＣＤＲ配列における抗体を含むこと、および、ヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含むことは、意図していない。

語句「組み換えヒト抗体」とは、組み換え方法により調製され、発現され、作製され、または、単離されたヒト抗体を含み、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを用いて発現された抗体、組み換え組み合わせヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子でトランスジェニックされる動物から単離された抗体、あるいは、他のＤＮＡ配列に対するヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングに関与する任意の他の方法により調製され、発現され、作成され、または、単離された抗体である。このような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する。

軽鎖は、１つの可変ドメイン（本願明細書においてＶＬとして略称される）、および／または、１つの定常ドメイン（本願明細書においてＣＬとして略称される）を含み得る。抗体の軽鎖は、カッパ（κ）軽鎖またはラムダ（λ）軽鎖のいずれかである。本願明細書において用いられる、ＶＬにおける発現は、カッパ型軽鎖（Ｖκ）由来の可変領域およびラムダ型軽鎖（Ｖλ）由来の可変領域の両方を含むことを意図する。重鎖はまた、１つの可変ドメイン（本願明細書においてＶＨとして略称される）を含み得、および／または、抗体のクラスもしくはアイソタイプ、３つもしくは４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）に依存し得る。ヒトにおいて、アイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、更にサブクラスまたはサブタイプ（ＩｇＡ_１−２およびＩｇＧ_１−４）に細分されたＩｇＡおよびＩｇＧを有する。

本発明は、上述したクラスまたはサブクラスのうちのいずれかの抗体を含む。ヒトＩｇＧは、本発明の抗体に対する好ましいアイソタイプである。超可変領域またはＣＤＲと呼ばれる３つの領域が、各ＶＬおよびＶＨにおいて見出され、これらは、フレームワーク領域（本願明細書においてＦＲとして略称される）と呼ばれる、より変化が少ない可変領域により支持される。

アミノ酸は、Ｋａｂａｔの定義（Ｋａｂａｔら，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−９３（１９７１）；Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１））、または、Ｃｈｏｔｈｉａの定義（Ｃ．ＣｈｏｔｈｉａおよびＡ．Ｍ．Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（４）：９０１−９１７（１９８７））、または、Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．Ｒ．Ａｃｃｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｋａｂａｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ｂｙ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２５（１９９６），１３０−１３３．）に従って、特定のＣＤＲ領域またはドメインに割り当てられる。

各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲにより構成されており、以下の順序（ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４）でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置される。ＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる抗体の部分は、Ｆｖ（フラグメント可変部）に指定され、抗原結合部位を構成する。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、１本のポリペプチド鎖上のＶＬドメインおよびＶＨドメインを含有する抗体フラグメントであり、ここで、１つのドメインのＮ末端および他のドメインのＣ末端は、柔軟なリンカーにより結合される（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号（Ｌａｄｎｅｒら）、国際公開第８８／０９３４４号パンフレット（Ｈｕｓｔｏｎら）参照）。

フラグメントは、全抗体のフラグメントと同じかまたは同程度の結合特性を有する。抗体の適切なフラグメントは、特異的に結合し、かつ、細胞成長を阻害する十分な親和性を有する超可変（すなわち、相補性決定）領域の十分な部分を含む任意のフラグメントを含む。このようなフラグメントは、例えば、１つまたは両方のＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントを含み得る。好ましくは、抗体フラグメントは、全抗体における全ての６つの相補性決定領域を含むが、このような領域の全てよりも少ない、例えば、３つ、４つまたは５つのＣＤＲを含む機能的フラグメントもまた含む。好ましいフラグメントは、一本鎖抗体またはＦｖフラグメントである。より好ましいフラグメントは、二価のフラグメントである。一本鎖抗体は、ポリペプチドであり、当該ポリペプチドは、相互結合リンカーを含むかまたは含まない、少なくとも抗体の重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域を含む。したがって、Ｆｖフラグメントは、全抗体の結合部位を含む。これらの鎖は、細菌または真核細胞において生成され得る。

Ｆａｂ（フラグメント、抗原結合）は、ＶＬ ＣＬ ＶＨ ＣＨ１ドメインからなる抗体のフラグメントを意味する。パパイン消化の後に生成されたものは、単に、Ｆａｂとして称され、重鎖ヒンジ領域を保持しない。ペプシン消化の後に、重鎖ヒンジを保持する種々のＦａｂが生成される。鎖間ジスルフィド結合を有するこれらのインタクトなフラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２として称され、一方で、ジスルフィド結合が保持されない場合、単一のＦａｂ’が生じる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、一価Ｆａｂフラグメントである抗原に対してより高い親和性を有する。

Ｆｃ（フラグメント結晶化）は、対の重鎖定常ドメインを含む抗体の部分またはフラグメントに対する記号表示である。ＩｇＧ抗体において、例えば、Ｆｃは、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。ＩｇＡ抗体またはＩｇＭ抗体のＦｃは、更に、ＣＨ４ドメインを含む。Ｆｃは、Ｆｃ受容体結合、補体媒介性細胞毒性の活性、および、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関連する。多数のＩｇＧ様タンパク質の複合体である抗体（例えばＩｇＡおよびＩｇＭ）について、複合体形成には、Ｆｃ定常ドメインが必要である。

ヒンジ領域は、抗体においてＦａｂ部分とＦｃ部分に分かれ、相互におよびＦｃに関連したＦａｂの移動性を提供し、２本の重鎖の共有結合について多数のジスルフィド結合を含む。

したがって、本発明の抗体は、限定されないが、抗原に対して特異的に結合する、天然抗体、ヒト抗体、組み換えヒト抗体、モノクローナル抗体、消化フラグメント、二価フラグメント（例えば、（Ｆａｂ’）２）、一価フラグメント（例えば、Ｆａｂ）、一本鎖抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、多価一本鎖抗体、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）などが挙げられる。

本発明の抗体は、ＦＧＦＲ−３に対して特異的である。抗体特異性は、抗原の特定のエピトープに対して抗体が選択的に認識することを意味する。抗体は、種および分子両方または分子のみに対して選択性を示し得、１つより多い種のＦＧＦＲ−３に結合する。本発明の抗体は、ヒト、マウス、ラット、イヌおよび／またはウサギのＦＧＦＲ−３に結合し得る。好ましくは、抗体は、ヒトＦＧＦＲ−３に結合する。抗体の型は、結合特異性を保持するが、他の特性もまた有するように開発されている。

本発明の抗体は、例えば、単一特異的、二重特異的または多特異的であり得る。二重特異的抗体（ＢｓＡｂｓ）は、２つの異なる抗原結合特異性または部位を有する抗体である。多特異的抗体は、２つより多い異なる抗原結合特異性または部位を有する。抗体が１つより多い特異性を有する場合、認識されたエピトープは、単一の抗原または１つより多い抗原と関連し得る。

ＦＧＦＲ−３抗体の特異性は、親和性および／または結合力に基づいて決定され得る。親和性は、抗原と抗体との解離についての平衡定数（Ｋ_Ｄ）により表され、抗原決定基と抗体結合部位との間の結合の強さを測定する。結合力は、抗体とその抗原と間の結合の強さを測定する。結合力は、抗体上のエピトープとその抗原結合部位との間の親和性、および、特定のエピトープの抗原結合部位数を示す、抗体の価数の両方に関連する。抗体は、一般的に、約１０^−５から約１０^−１１モル／リットル（例えば、Ｋ_Ｄ＜１００Ｍ）の解離定数（Ｋ_Ｄ）にて結合する。約１０^−４モル／リットル以下の任意のＫ_Ｄは、一般的に、非特異的結合を示すものと考えられる。ここで、Ｋ_Ｄの値が低いほど、抗原決定基と抗体結合部位との間の結合の強さが強くなる。

特定の態様において、本発明の抗体は、好ましくは約１×１０^−８Ｍ以下、より好ましくは約１×１０^−９Ｍ以下、より好ましくは約１×１０^−１０Ｍ以下、最も好ましく約１×１０^−１１Ｍ以下のＫ_Ｄにて、ＦＧＦＲ−３と結合する。以下の表１を参照のこと。

表１：ヒトおよびマウスのＦＧＦＲ−３スプライス変異体に対する抗体１の結合親和力

特定の態様において、本発明の抗体は、好ましくは約５．０×１０^−１０Ｍから約１．５×１０^−１１Ｍ、約１．０×１０^−１０Ｍから約１．０×１０^−１１Ｍ、または、約１．５×１０^−１１Ｍから約７．５×１０^−１０ＭのＫ_Ｄを有する。

本願明細書において用いられる用語「結合をブロックする」および「結合を阻害する」は、交換可能に用いられ、サイトカイン／受容体シグナル伝達経路の生物学的機能の完全または部分的な阻害または減少をもたらす、サイトカインのその受容体に対する結合のブロック／阻害を意味する。ＦＧＦのＦＧＦＲ−３に対する結合のブロック／阻害は、ＦＧＦ活動（例えば、受容体結合、細胞成長の阻害効果、走化性、アポトーシス、細胞内タンパク質リン酸化反応、または、シグナル変換）における１つ以上のインビトロまたはインビボの指標の完全または部分的な阻害または減少を測定することにより評価される。ＦＧＦのＦＧＦＲ−３に対する結合をブロックする能力は、本願明細書において記載されるＥＬＩＳＡにより測定され得る。本発明の抗体は、生細胞のリガンド誘導活性におけるＦＧＦＲ−３受容体をブロックするアンタゴニストである。結合アッセイは、当該技術分野において公知の種々の方法（例えば、限定されないが、ＥＬＩＳＡ）を利用して実施され得る。本願明細書において用いられる「結合について競合する」とは、抗体が結合またはシグナル伝達を、当該技術分野において利用可能な技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅを用いる競合ＥＬＩＳＡまたはＫ_Ｄ測定）により測定されるように、少なくとも約２０％、３０％、５０％、７０％または９０％まで減少させる状況を意味するが、結合を完全に除外することを意図しない。

重鎖アミノ酸配列は、配列番号９に記載される。軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１０に記載される。別の態様において、本発明の抗体は、抗体１のＣＤＲのうちいずれか１つの相補性決定領域の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全てを有する。

本発明の抗体はまた、直接変異法、親和性成熟法、ファージ提示法、または、鎖シャッフリング法により改善された結合特性を有する。親和性および特異性は、ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基を変異させ、所望の特性を有する抗原結合部位をスクリーニングすることにより、修飾または改良され得る（例えば、Ｙａｎｇら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２−４０３（１９９５）を参照）。１つの方法は、個々の残基または残基の組み合わせを無作為に選択するものであり、これにより、他の同一抗原結合部位の集団において、２個〜２０個のアミノ酸のサブセットが特定の位置にて見出される。あるいは、変異は、ＰＣＲ法を用いて広範囲の残基にわたってエラーにより誘発され得る（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９２）２２６：８８９ ９６を参照）。別の例において、重鎖可変領域遺伝子および軽鎖可変領域遺伝子を含むファージ提示ベクターは、大腸菌の突然変異誘発株において増殖され得る（例えば、Ｌｏｗら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０：３５９ ６８（１９９６）を参照）。

次いで、インビトロでの選択プロセスは、要求される（ｃｌａｉｍｅｄ）交差反応性を有するＦａｂフラグメントについてこれらの追加の可変領域アミノ酸配列をインビトロでスクリーニングするために適切に使用され得る。この方法において、更に、本発明に従ってヒト化抗体を調製するために適切なＦａｂフラグメントが同定される。好ましくは、フレームワーク内のアミノ酸置換は、本願明細書に開示された１つまたはそれぞれのフレームワーク配列内における１、２または３箇所の位置に制限される。好ましくは、ＣＤＲ内のアミノ酸置換は、１つまたはそれぞれのＣＤＲ内における１から３箇所の位置に制限され、より好ましくは、１つまたはそれぞれのＣＤＲ内における１または２箇所のアミノ酸位置にて置換が行われる。更に好ましくは、アミノ酸置換は、重鎖可変領域のＣＤＲにおける１または２箇所のアミノ酸位置にて行われる。本願明細書に記載された抗体を親抗体として用いて、本発明に従って代替抗体を調製するために、ＣＤＲおよびフレームワーク置換を組み合わせる適切な方法は、Ｗｕら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９４：１５１−１６２により提供される。

本発明の抗体は、当該技術分野に公知の方法により生成され得る。これらの方法は、ＫｏｈｌｅｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎのＮａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）、および、Ｂｕｒｄｏｎら，Ｅｄｓ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１３巻，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８５）におけるＣａｍｐｂｅｌｌの「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｄｅｎｔ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」により記載された免疫学的方法、ならびに、ＨｕｓｅらのＳｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）により記載された組み換えＤＮＡ法によるものを含む。

ヒト抗体はまた、当該技術分野において公知の種々の技術（例えば、ファージ提示ライブラリー）を用いて生成され得る（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｍｅｒらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製において利用可能である（Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）ならびにＢｏｅｍｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６−９５（１９９１））。サブクローンにより分泌された本発明の抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または、親和性クロマトグラフィー）により、培養培地または腹水から単離または精製され得る。

本発明の抗体をコードするポリ核酸は、標準的な分子生物学的技術により得られる。

本発明はまた、ベクターの形質転換および抗体の発現のための宿主細胞を含む。好ましい宿主細胞は、哺乳動物細胞を含み、例えば、ＮＳＯ（非分泌性（ｏ））マウス骨髄腫細胞、２９３およびＣＨＯ細胞、ならびに、リンパ系起源の他の細胞株（例えば、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞、またはハイブリドーマ細胞）が挙げられる。他の真核宿主（例えば、酵母）が用いられてもよい。

細菌（特に、大腸菌）においてタンパク質を発現するためのベクターが知られている。このようなベクターとしては、ＤｉｅｃｋｍａｎｎおよびＴｚａｇｏｌｏｆｆのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１５１３−１５２０（１９８５）により記載されたＰＡＴＨベクターが挙げられる。これらのベクターは、アントラニル酸塩合成酵素（ＴｒｐＥ）の後に、カルボキシル末端にてポリリンカーをコードするＤＮＡ配列を含む。他の発現ベクター系は、βガラクトシダーゼ（ｐＥＸ）、ラムダ ＰＬ、マルトース結合タンパク質（ｐＭＡＬ）、および、グルタチオンＳトラスフェラーゼ（ｐＧＳＴ）に基づくものである。Ｇｅｎｅ ６７：３１（１９８８）およびＰｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３：１６７（１９９０）を参照のこと。

酵母において有用なベクターが利用可能である。適切な例としては、ラムダＺＡＰプラスミドである。哺乳動物細胞における発現の適切なベクターもまた知られている。このようなベクターとしては、ＳＶ−４０、アデノウイルス、レトロウイルス由来ＤＮＡ配列、および、機能的哺乳動物ベクター（例えば、上述のベクター、機能的プラスミドおよびファージＤＮＡ）の組み合わせに由来するシャトルベクターにおける周知の誘導体が挙げられる。

本発明において有用なベクターは、発現されるＤＮＡ配列またはフラグメントに結合する少なくとも１つの制御エレメントを含む。制御エレメントは、クローンされたＤＮＡ配列の発現を制御および規制するためにベクター内に挿入される。

適切な培地内で維持される宿主細胞内の発現の後に、発現されるポリペプチドは、培地から回収され得、当該技術分野において公知の方法により精製され得る。ポリペプチドまたはペプチドが培養培地内へと分泌されない場合、宿主細胞は、単離および精製の前に溶解される。

本発明は更に、本発明における抗体、ポリ核酸、ベクターまたは宿主細胞を、薬学的に受容可能な担体、賦形剤または希釈剤と共に含む薬学的組成物を提供する。薬学的組成物はまた、追加の治療薬剤を含み得る。追加の薬剤は、化学療法薬（例えば、シスプラチン）であり得る。

本願明細書において用いられる担体としては、薬学的に受容可能な担体、賦形剤、または、安定剤が挙げられ、これらは、適用された用量および濃度にて曝露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である。多くの場合、生理学的に受容可能な担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。本発明の別の態様において、抗ＦＧＦＲ−３抗体または抗体フラグメントは、特に抗体が内在化する場合、化学的または生合成的に、抗腫瘍剤または検出可能なシグナル生成因子と結合され得る。ＦＧＦＲ−３に対する抗体は、それらの増殖能を阻害することになる、いくつかの癌細胞（例えば、膀胱癌細胞）中のリンＭＡＰＫおよびリンＡＫＴを含む、受容体（リン酸化ＦＧＦＲ−３）の活性化および下流シグナル伝達分子の活性を阻害し得る。

本発明の抗体は、天然ＦＧＦＲ−３またはそのスプライシング型もしくはその変異体と結合し得る。ＦＧＦＲ−３の「スプライシング型」とは、ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）およびＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｃ）と呼ばれるＦＧＦＲ−３の第３ＩｇＧ様ドメインをコードするエクソンの形態を意味する。ＦＧＦＲ−３変異体は、ＤＮＡ複製または翻訳時のエラーにより変更された受容体の形態を含む。変異は、例えば、構成的活性化、半減期の延長、および、増強されたリガンド感受性の機構を介して、突然変異体受容体の活性を高めた機能獲得型変異であり得る。

本発明の抗体は、野生型ＦＧＦＲ−３ドメイン２（配列番号１２）に対して結合し得る。ヒトおよびマウスのＦＧＦＲ−３配列の位置１７３におけるアルギニン残基は、他のファミリーメンバーと共通ではない。これは、この残基が抗体１により示されたＦＧＦＲ−３特異性に関与する可能性があることを示唆している。

本発明の抗体は、ＦＧＦＲ−３の分解を誘導する。分解は、受容体を分解して、そのシグナル伝達機能がもはや行われ得ないことを意味する。

本発明の抗体は、ＦＧＦＲ−３の活性を中和し得る。受容体を中和するとは、受容体の内因性キナーゼ活性を不活性化して、シグナルを変換することを意味する。中和は、例えば、リガンドへの特定エピトープの接近を抗体がブロックするか、または、特定の様式においてＦＧＦＲ−３の構造を変更することにより生じ得る。これにより、リガンド（特に、ＦＧＦ）は、受容体に結合できたとしても、受容体を活性化できない。例えば、受容体の内在化または分解を誘導するか、または、ＦＧＦＲ−３の発現を阻害することにより、ＦＧＦＲ−３を発現する細胞がそれらの表面上におけるＦＧＦＲ−３受容体の数を減少させる場合に、ダウンレギュレーションが生じ得る。ゆえに、中和は、阻害、減少、不活性化、および／または、成長（増殖および分化）の途絶、血管形成（血管の回復、侵襲、および、転移）、ならびに、細胞の運動性および転移（細胞粘着および侵襲性）を含む種々の効果を有する。

ＦＧＦＲ−３中和の測定の一つは、受容体のチロシンキナーゼ活性の阻害である。チロシンキナーゼ阻害は、例えば、組み換えキナーゼ受容体の自己リン酸化レベル、および／または、天然もしくは合成基質のリン酸化反応を測定することによる、周知の方法を用いて決定され得る。したがって、リン酸化アッセイは、本発明において中和抗体を決定するのに有用である。リン酸化は、ＥＬＩＳＡアッセイまたはウェスタンブロットにおいて例えばホスホチロシンに特異的な抗体を用いて決定され得る。チロシンキナーゼ活性のいくつかのアッセイは、Ｐａｎｅｋら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２８３：１４３３−４４（１９９７）、および、Ｂａｔｌｅｙら，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６２：１４３−５０（１９９８）において記載される。

加えて、本発明の抗体は、多くの腫瘍細胞がそれらの細胞表面上にＦＧＦＲ−３を有するので、腫瘍細胞自体によるシグナル伝達を阻害し得る。本発明の抗体は、それを必要とする哺乳動物を治療するために使用され得る。疾患を「治療する」とは、疾患を阻害すること、その進行を阻止または遅延させること、疾患を軽減すること、あるいは、疾患の症状を退行させることを含む。

本発明の抗体および組成物は、癌を治療するために使用され得る。癌は、難治性または最前線であり得る。癌は、限定されないが、脳、肺、扁平上皮細胞、膀胱、胃、脾臓、胸、頭、首、腎臓（ｒｅｎａｌ）、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）、卵巣、前立腺、大腸、結腸直腸、食道、婦人科（卵巣、子宮内膜）、前立腺、胃、または甲状腺における癌、白血病、および、リンパ腫が挙げられる。加えて、本発明の抗体および組成物により治療され得る癌としては、多発性骨髄種、結腸直腸癌、ユーイング肉腫、絨毛腫が挙げられる。

投与は、注射投与、注入投与、経口投与、非経口投与、皮下投与、筋肉注射投与または静脈内投与を含む任意の適切な投与経路により達成される。

本願明細書において記載された治療方法は、別の治療薬（例えば、抗腫瘍薬）を用いて投与する際に本発明の抗体とともに行われ得る。抗腫瘍薬は、小有機分子を含み得る。このような小有機分子の例としては、細胞毒性および／または化学療法薬（例えば、タキソール、ドキソルビシン、アクチノマイシン−Ｄ、シスプラチン、メトトレキサート、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ゲムシタビン、オキサプラチン（ｏｘｙｐｌａｔｉｎ）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコウリン（ｌｅｕｃｏｕｒｉｎ）、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、エポチロン、シスプラチン／カルボプラチンおよびペグ化アドリアマイシン）が挙げられる。本発明の好ましい治療は、シスプラチンとともに抗体を投与することである。

抗腫瘍薬はまた放射線であり得、放射線の供給源は、治療される患者に対する、外的療法（外照射療法（ＥＢＲＴ））または内的療法（小線源療法（ＢＴ））のいずれかであり得る。投与される抗腫瘍薬の用量は、多くの因子（例えば、薬剤の型、治療される腫瘍の型および重傷度、ならびに、薬剤の投与経路）に依存する。本発明は、任意の特定の用量に限定されない。

ＦＧＦＲ−３抗体を他の抗体および／または治療薬とともに投与することは、同時または異なる時間において、同じかまたは異なる経路を介して、同時にまたは別々に行われ得る。更に、抗体は、投与する他の１つ以上の薬剤と抱合され得る。

本願明細書において記載された治療方法は、霊長類（例えば、サルおよびヒト）、ウマ、ウシ、ネコ、イヌ、ウサギならびに齧歯類（ラットおよびマウス）を含む、任意の適切な哺乳動物を治療するために使用され得る。好ましくは、治療される哺乳動物は、ヒトである。

以下の実施例は、例示目的のためのみに提供されるものであって、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。実施例は、従来方法の詳細の説明を含まない。例えば、ベクターおよびプラスミドの構築、このようなベクターおよびプラスミドへのポリペプチドをコードする遺伝子の挿入、あるいは、宿主細胞へのプラスミドの導入において適用される方法などである。このような方法は当業者に周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを含む種々の文献に記載される。

（実施例１）
（ＦＧＦＲ−３特異的抗体アンタゴニストの生成）
組み換えヒトＦＧＦＲ−Ｆｃ、組み換えヒトＦＧＦ、カスタム合成プライマー、制限酵素およびＤＮＡポリメラーゼは、業者から取得され得るか、または、公知の方法により調製され得る。

公開された抽出プロトコルにしたがって、１０μｇのＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｃ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）−Ｆｃ組み換えタンパク質でコーティングされたチューブを用いて、ヒトＦＧＦＲ−３細胞外ドメインに対する未使用ヒトＦａｂバクテリオファージライブラリーを抽出する。抽出工程から保持されたファージを溶出し、保持されたファージを用いて細菌宿主細胞に感染させる。宿主細胞により生成されたファージを収集する。上記手順を再度繰り返す。感染させた宿主細胞の単一コロニーを１００μｌ／ウェルの２×ＹＴＡＧを含有する９６ウェルプレートへ移し、１０μｌのＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（５×１０１０ｐｆｕ／ｍｌ）の存在下で、ファージを成長させる。振とうさせずに３０分間３７℃にてプレートをインキュベートし、その後、振とうさせて（１００ｒｐｍ）３０分間インキュベートする。２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで細胞のペレットを調製し、２００μｌの２×ＹＴＡＫに再懸濁し、振とうさせて（１００ｒｐｍ）一晩３０℃にてインキュベートする。プレートを２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上澄みを新しいプレートに移し、６×ブロッキングバッファー（１８％ミルク／ＰＢＳ）と１時間混合する。下記に示すＥＬＩＳＡ結合・ブロッキングアッセイを用いてファージクローンをスクリーニングする。ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）またはＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｃ）に結合するファージクローンを選択し、その後、このプールから、ＦＧＦ−１リガンドに対する結合から受容体をブロックするファージクローンを選択する。標準的な配列決定技術にしたがって、受容体に結合しかつブロックするクローンのＤＮＡ配列を決定する。各特有のＤＮＡ配列を保持し、対応するファージクローンをＦＧＦＲ−３ブロッカーファージ候補として指定する。これらのファージ候補から可溶Ｆａｂを調製する。精製されたＦａｂを用いてＥＬＩＳＡ結合・ブロッキングアッセイを繰り返して、ブロック活性を確認する。公開された技術にしたがってＣＤＲ（配列番号１〜６）をヒトＩｇＧ１フレームワークへクローニングすることで、確認されたＦａｂブロッカーを完全なサイズの抗体内に設計する。ＥＬＩＳＡ結合アッセイを用いて、ＦＧＦＲ−１（ＩＩＩｂ）、ＦＧＦＲ−１（ＩＩＩｃ）、ＦＧＦＲ−２（ＩＩＩｂ）、ＦＧＦＲ−２（ＩＩＩｃ）、およびＦＧＦＲ−４細胞外ドメイン組み換え可溶タンパク質に対する抗体１の結合を決定する。ｂとｃの両方のスプライシング型ＦＧＦＲ−３の結合について高い親和性を示すが、他のＦＧＦＲ受容体の結合について低い親和性を示す抗体を選択する。

（実施例２）
（抗体１）
抗体１を周知の方法を用いて適切な哺乳動物発現系にて生合成することができ、かつ、周知の方法により精製することができる。

抗体１のアミノ酸配列を以下に示す。

（アッセイ）
（ＥＬＩＳＡ結合アッセイ）
組み換えＦＧＦＲを、９６ウェルプレート上でＰＢＳ中に１μｇ／ｍｌの濃度にて、２時間室温でコーティングする。プレートを０．２％のＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄し、使用前に５％のミルク／ＰＢＳで２時間ブロックする。ファージ、Ｆａｂまたは抗体をプレートに加え、０．２％のＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ中で連続希釈する。２時間以上、室温にてプレートをインキュベートする。適切な市販の二次抗体を用いて捕捉した分子を検出し、供給者の指示書に従って検出する。

（ＥＬＩＳＡブロッキングアッセイ）
組み換えＦＧＦを、室温で２時間、０．５〜２μｇ／ｍｌの濃度にてＩｍｍｕｌｏｎ（登録商標）２Ｂマイクロタイタープレート（ＴｈｅｒｍｏＬａｂ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）上でコーティングする。プレートを０．２％のＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄し、使用前に５％のミルク／ＰＢＳで２時間ブロックする。ファージ、Ｆａｂ、または抗体を５μｇ／ｍｌのヘパリン、５％のミルク、ＰＢＳで連続希釈する。ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）または（ＩＩＩｃ）ＥＣＤ（細胞外領域）ＦＣで標識を付けた可溶性組み換えタンパク質を１μｇ／ｍｌの最終濃度まで加える。ＦＧＦ−１でコーティングしたプレートに移す前に、室温にて１時間、混合物をインキュベートし、さらに２時間、室温にてインキュベートする。プレートを０．２％のＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄する。供給者の指示書に従って調製したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）溶液に結合した抗ヒトＦｃモノクローナル抗体を用いて、結合した受容体を検出する。ブロッキング活性は低いシグナルを生じる。

（ヒトおよびマウスのＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）およびＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｃ）に対する抗体１の結合親和性）
製造業者によって教示された標準プロトコルに従って、室温にてＢｉａＣｏｒｅ（登録商標）３０００バイオセンサー（ＢｉａＣｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いてＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）および（ＩＩＩｃ）に対する抗体の結合キネティクスを測定する。表１に記載した結果の要約により、抗体がヒトＦＧＦＲ−３のｂおよびｃ−スプライシング型の両方に結合し、１０^−９Ｍ未満の親和性でマウスＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｃ）受容体と完全に交差反応することが示される。

（膜結合ＦＧＦＲ−３に対する抗体１の特異性）
マウスＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｃ）のｃＤＮＡを、ピューロマイシン選択遺伝子を含有するｐＢＡＢＥ発現ベクターにクローニングする。Ｌ６細胞中で得られたプラスミドのレトロウイルス発現を実施する。細胞を選択し、１０％のＦＢＳおよび２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含有するＤＭＥＭ培地中で培養する。ＦＧＦＲ−３を発現するＬ６細胞を１％のＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁する。抗体１を１〜３０μｇ／ｍｌの最終濃度まで加える。氷上で１時間のインキュベーションの後、１％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で細胞を洗浄し、氷上で１時間、同じバッファー中の適切な二次検出抗体またはＦａｂフラグメントとともにインキュベートする。この二次抗体でのみコントロールサンプルを染色する。ＦＡＣＳｖａｎｔａｇｅ ＳＥフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて全てのサンプルを解析する。抗体１は、ＦＧＦＲ−３ネガティブＬ６親細胞を使用した場合ではなく、ＦＧＦＲ−３でトランスフェクトした細胞（Ｒ３−Ｌ６）を使用した場合のみ、ポジティブ染色シグナルを生じることによって示されるように、ＦＧＦＲ−３に特異的である。

ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、２９３フェクチン（ｆｅｃｔｉｎ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３培地およびＯｐｔｉＭＥＭ培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入できる。プロテイン−Ａ親和性精製培地は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入できる。ＦＧＦＲ（ＩＩＩｂ）−ＦｃについてのＤＮＡ構築物を生成する。

（ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）−Ｆｃ、ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）−Ｆｃ Ｉｇドメイン切断、およびＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）−Ｆｃの単一のアラニン残基の変異の生成）
ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩ）ｂドメイン境界は、公知であるＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）細胞外ドメイン３ＤモデルおよびＦＧＦＲの結晶構造に基づいて規定され得る。野生型ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）Ｄ１−３（２５−３７２）とともに５つの切断ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）ＥＣＤ構築物、すなわちＤ１（２５−１４８）、Ｄ２（１４９−２４５）、Ｄ３（２５０−３７２）、Ｄ１−２（２５−２４５）およびＤ２−３（１４９−３７２）を設計する。その構築物を、複数のクローニング部位の３’末端にて操作したＦｃタグを有するｐＧＳベクターにサブクローニングし、配列を確認した。推定リガンド結合領域に近接する２０のＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）残基ならびにヘパリン結合に関するものおよび受容体−受容体の二量体化を、公知のＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）ＥＣＤモデルおよびＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｃ）構造に基づいて選択する。ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）ＥＣＤの単一のアラニン残基の変異を、鋳型として完全長ＦＧＦＲ（ＩＩＩｂ）ＥＣＤ構築物を用いてオーバーラッピングＰＣＲにより生成し、続いてｐＧＳ−Ｆｃベクターにサブクローニングする。ドメイン切断およびアラニン変異を、２９３フェクチン（ｆｅｃｔｉｎ）（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるトランスフェクション後に２９３細胞において一時的に発現する。培養上清を、トランスフェクション後６日で収集し、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡアフィニティーカラムを通すことによって精製し、ＰＢＳ中で緩衝液を交換し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により定量し、評価して、構造的完全性を確認する。

（ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）−Ｆｃメソスケール結合アッセイ）
抗体−１の精製した溶液をＰＢＳ中に２ｍｇ／ｍｌの濃度まで希釈する。ＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ−ＴＡＧ ＮＨＳ−Ｅｓｔｅｒ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，＃Ｒ９１ＡＮ２）、ルテニウム−トリス−ビピリジンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、冷蒸留水を用いて１０ｎｍｏｌ／ｕｌの濃度に再構成する。１２：１モル比のＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ−ＴＡＧ ＮＨＳ−エステル：抗体１を反応に使用する。インキュベーションを、室温にて２時間、光を遮断して実施する。未反応のＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ−ＴＡＧ ＮＨＳ−Ｅｓｔｅｒを、脱塩樹脂を用いて結合した抗体１から除去する。ルテニウムが結合した抗体１を−８０℃にて保存する。結合した抗体１の濃度を、検量線のためにウシ血清アルブミンを用いて測定する。

切断した、変異または野生型ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）−ＦＣを、リン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳに５μｇ／ｍＬまで希釈する。標準９６ウェルプレートを、２５ｎｇ／ウェルの受容体でコーティングし、室温にて１時間インキュベートする。ウェル中の非特異的結合をブロックするために、１５０μＬの５％のＭＳＤ Ｂｌｏｃｋｅｒ Ａ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｔ，＃Ｒ９３Ｂａ−１）を各ウェルに加える。プレートを室温にて１時間インキュベートする。ブロッキング溶液を除去し、プレートを、２００μＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０２％のＴｗｅｅｎ（登録商標）−２０で５回洗浄する。３倍希釈系列（２５０〜０．００１ｎＭ）のルテニウム標識した抗体１を、試験される各タンパク質に関して３連で２５μＬの体積で加える。室温にて、穏やかに攪拌し、光を遮断する１時間のインキュベーション後、遊離のルテニウム標識された抗体を、１ウェルあたり２００μＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０でさらに５回洗浄することによって除去する。この洗浄後、１５０μＬの１×リードバッファー（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，＃Ｒ９２ＴＣ−２）を各ウェルに加える。電気化学的刺激の際に、結合抗体上のルテニウム標識が６２０ｎｍにて発光した。電気化学発光ＥＣＬシグナルを、ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ２４００プレートリーダー（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，＃１２５０）中で電荷結合素子カメラにより検出し、ＥＣＬＵとして表す。ＥＣＬシグナルを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン５．０でプロットする。ＫＤ値を、ソフトウェアのＯｎｅ Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｉｎｄｉｎｇ機能の非線形回帰曲線フィット解析により算出する。野生型ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）−Ｆｃに対するルテニウム標識した抗体１の結合を、切断または変異ＦＧＦＲの相対的結合親和性解析に関する基準として使用し、野生型の割合をプロットする。

（Ｍａｂ Ｂ９ ＥＬＩＳＡ結合アッセイ）
９６ウェルＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートのウェルを、４℃にて穏やかに攪拌しながら１００μＬのＰＢＳ、ｐＨ７．２中の２００ｎｇの抗ＦＧＦＲ−３モノクローナル抗体、Ｂ９（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−１３１２１）で一晩コーティングする。コーティング後、抗体溶液をデカントし、ウェルを、室温にて２時間、穏やかに攪拌しながら０．１％のＴｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）、５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水でブロックする。ブロック後、ウェルを、２００μＬのＰＢＳＴで５回洗浄する。次いで、３倍希釈系列（１００〜０．００６ｎＭ）の変異または野生型ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）−ＦＣを、試験される各タンパク質について３連で１００μＬのＰＢＳＴ、１％のＢＳＡに加え、室温にて１時間穏やかに攪拌しながらインキュベートする。ウェルを再び２００μＬのＰＢＳＴで５回洗浄する。１００μＬのＰＢＳＴ、５％のＢＳＡ中の１：５０００希釈のセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が結合した抗マウスＩｇＧを、室温にて１時間穏やかに攪拌しながら各ウェル中でインキュベートする。ウェルを最後に２００μＬのＰＢＳＴで５回洗浄し、次いで１００μＬの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ（ＴＭＢ）発色基質で５分間、発達させる。反応を１ウェルあたり１００μＬの１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４で停止する。吸光度を４５０ｎｍにて分光光度法で測定する。吸光度の読み取り値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアバージョン５．０でプロットする。ＫＤ値を、ソフトウェアのＯｎｅ Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｉｎｄｉｎｇ機能の非線形回帰曲線フィット解析により算出する。野生型ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）−Ｆｃに対するＢ９の結合を、切断または変異ＦＧＦＲの相対的結合親和性解析に関する基準として使用し、野生型の割合としてプロットする。

（ヒトＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）の分子モデリング）
突然変異生成研究を導くことを支援するために、ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）ＥＣＤのドメイン２および３の３次元モデルを、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ（登録商標）を用いて生成する。ヒトＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）、およびヒトＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｃ）の配列を、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（登録商標）法を用いて整列させ、そのモデルを、鋳型としてＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｃ）のＸ線結晶構造（タンパク質データバンクコードＩＲＹ７）を用いて構築する。

（抗体１のエピトープはＦＧＦＲ−３の第２の免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメイン内に含まれる）
ＦＧＦＲ受容体ファミリーのリガンド結合部位は、細胞外ドメインを規定する３つのＮ末端Ｉｇドメイン内に含まれる（Ｃｈｅｌｌａｉａｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９年１２月３日；２７４（４９）：３４７８５−３４７９４）。３つのＩｇドメインが抗体１のエピトープを含むことを決定するために、ドメイン切断のパネルを利用する。ヒトＩｇドメインをコードするＤＮＡ配列を、種々の形で切断し、ヒトＦｃタグを有するホモ二量体融合タンパク質として発現する。コードされたタンパク質を、一時的にトランスフェクトした細胞の馴化した上清から精製し、各々の精製したドメイン切断のホモ二量体構造をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認する。次いで、切断体を、メソスケール結合アッセイにおいて抗体１に対する結合に関して試験する（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）。抗体１は、Ｄ１およびＤ３切断体に対して検出可能な結合を示さないが、それは、メソスケール結合アッセイ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）において、およびＢＩＡｃｏｒｅ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって測定した場合、Ｄ１−２およびＤ２切断体に対して有意な結合を示した。Ｂ９は、受容体のドメイン１において構造的に感受性の高いエピトープを認識するので、ドメイン１を含むそれらの切断体は、完全な構造が破壊されない場合、抗体を結合することが予想される。Ｄ１およびＤ１−２切断体は、コントロールＭａｂ Ｂ９に対して有意な結合を示し、メソスケール結合アッセイ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）において、およびＢＩＡｃｏｒｅ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって測定した場合、それらの２つのタンパク質の構造的完全性を確認した。切断体の結合データは、ＦＧＦＲ−３の第２のＩｇドメインが、抗体１を結合するのに十分であるので、エピトープに必須の残基を含むことを明らかにした。

（抗体１によって認識されるエピトープ内のＦＧＦＲ−３のアミノ酸の同定）
ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）ＥＣＤのドメイン２および３の３次元モデルを、ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｃ）の結晶構造に基づいて生成した。リガンド結合、受容体の二量化またはヘパリン結合に近接するか、または直接関与するＦＧＦＲ−３の第２のドメイン内の２０のアミノ酸（Ｄ１６０、Ｋ１６１、Ｋ１６２、Ｌ１６３、Ｌ１６４、Ｖ１６６、Ｐ１６７、Ｐ２２０、Ｒ２２３、Ｄ２４４、Ｎ１７０、Ｔ１７１、Ｒ１５８、Ｒ１７３、Ｒ１７５、Ｋ２０５、Ｒ２０７、Ｌ２４６、Ｅ２４７、Ｓ２４９）を分子モデルに基づいて同定し、単一のアラニン残基の変異を生成する。

ＦＧＦＲ−３ドメイン２の野生型配列を決定する（配列番号１２）。示した各アミノ酸を、個々に、部位特異的突然変異誘発法によってアラニンに変異し、ＦＧＦＲ（ＩＩＩｂ）−Ｆｃタンパク質をコードする全ＥＣＤとの関連で発現する。コードされた変異タンパク質を、一時的にトランスフェクトした細胞の馴化した上清から精製し、各々の精製した変異のホモ二量体構造をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認する。

上記のアラニン変異が抗体１に対する結合の著しい損失を生じる場合、残基はエピトープに必須であるとみなす。次いで、結合の著しい損失を示す全ての変異タンパク質を、全タンパク質構造の肉眼的変化を調べるためにＭａｂ Ｂ９に対する結合について試験する。試験した２０部位のうち、１７３位におけるアルギニンに対するアラニンの置換（Ｒ１７３Ａ）は、抗体１に対する結合のほとんど完全な損失を生じる（ＷＴと比べて９０％より多い結合の減少）；一方で、他の置換は結合を保持する（ＷＴと比べて２０％より少ない結合の減少）。その後の試験により、Ｍａｂ Ｂ９に対する結合は、Ｒ１７３Ａ置換によって影響しなかったことを示し、これは、１７３位が、抗体１によって受容体の特異的認識に必須の残基を構築することを示唆する。Ｒ１７３Ａ変異に対する抗体１の親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）解析によって測定する。Ｒ１７３Ａ変異に対する抗体１の結合は、野生型タンパク質に対する抗体の親和性より７倍低い。

配列比較により、ヒトおよびマウスＦＧＦＲ−３配列の１７３位におけるアルギニン残基は、他のファミリーメンバーによって共有されないことが明らかにされ、この残基が、抗体１によって提示されるＦＧＦＲ−３特異性に関与している可能性があることを示唆する。

（ＦＧＦＲ−３抗体アンタゴニストはＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）およびＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｃ）により媒介されるＦＧＦ結合および細胞シグナル伝達をブロックする）
上述のＥＬＩＳＡブロッキングアッセイからの結果は、抗体１が、１〜１０ｎＭの範囲内のＩＣ５０でＦＧＦ−１／ＦＧＦＲ−３結合をブロックすることを示す。生細胞中のＦＧＦＲ−３シグナル伝達に対するこの抗体の活性を試験するために、上記のＦＧＦＲ−３発現Ｌ６細胞を使用する。ＦＧＦＲ−３発現Ｌ６細胞を、非常に低い濃度の血清（０．１％）を含む培地中で一晩休眠させる。次の日に、細胞を等しいサイズの５つのサンプルに分割する。サンプル１および２を、アイソタイプが一致した非特異的コントロール抗体（２００ｎＭ）および抗体１（２００ｎＭ）でそれぞれ１時間、処理する。サンプル３を０．６ｎＭのＦＧＦ−９で１５分間、曝露する。サンプル４および５を、まず、アイソタイプが一致した非特異的コントロール抗体（２００ｎＭ）および抗体１（２００ｎＭ）でそれぞれ１時間、処理し、次いで、０．６ｎＭのＦＧＦ−９に１５分間、曝露する。これらの処理および曝露後、細胞を溶解させ、それらをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットにかける。抗ホスホチロシン抗体を用いてＦＧＦＲ−３の活性化を調べる。抗体１単独では、活性化されたＦＧＦＲ−３およびＭＡＰＫのシグナルは増加も減少もせず、ＦＧＦ−９リガンド曝露により、活性化されたＦＧＦＲ−３およびＭＡＰＫのシグナルが同じ程度まで増加する。従って、これらの結果は、抗体１が、生細胞中のリガンドにより誘発された活性化においてＦＧＦＲ−３受容体をブロックするアンタゴニストであることを実証する。

（細胞表面ＦＧＦＲ−３は抗体１に対する結合の際に内在化する）
抗体１は、受容体シグナル伝達を下方調節する機構を構成する、ＦＧＦＲ−３の内在化を引き起こす。これを試験するために、抗体１／ＦＧＦＲ−３複合体の位置を追跡するために、市販のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で抗体を標識する。抗体１およびアイソタイプが一致した非特異的コントロール抗体を蛍光色素と結合させる。ＦＧＦＲ−３発現Ｌ６細胞を、非常に低い濃度の血清（０．１％）を含む培地中で一晩休眠させる。

細胞を等しいサイズの８つのサンプルに分割し、６ウェル組織培養プレートのウェルに播種する。それらのサンプルを３つの別個の処理に供する：１）結合する工程であって、細胞を、４℃で１時間、１ｍＬの２００ｎＭの複合体化された抗体とインキュベートする、工程。温度はエンドサイトーシスに関して禁止的に低いが、抗体−抗原相互作用を生じる；２）内在化する工程であって、細胞を、３７℃で１時間、１ｍＬの２００ｎＭの複合体化された抗体とインキュベートする、工程。この温度はエンドサイトーシスを可能にする；３）剥離する工程であって、細胞を、４℃で３０分間、１ｍＬの０．２Ｍグリシン−０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ３で処理する工程。この条件において、内在化しない抗体は、表面受容体にもはや結合できず、培地中に放出される。８つのＦＧＦＲ−３によりトランスフェクトしたＬ６細胞サンプルを、以下の記載に従って処理する：サンプル１は、４℃で１時間、複合体化したコントロール抗体（２００ｎＭ，１ｍＬ）とともにインキュベートする；サンプル２は、４℃で１時間、複合体化したコントロール抗体（２００ｎＭ，１ｍＬ）とともにインキュベートし、その後、剥離する；サンプル３は、３７℃で１時間、複合体化したコントロール抗体（２００ｎＭ，１ｍＬ）で処理する；サンプル４は、３７℃で１時間、複合体化したコントロール抗体（２００ｎＭ，１ｍＬ）で処理し、その後、剥離する；サンプル５は、４℃で１時間、複合体化した抗体１（２００ｎＭ，１ｍＬ）で処理する。サンプル６は、４℃で１時間、複合体化した抗体１（２００ｎＭ，１ｍＬ）で処理し、その後、剥離する；サンプル７は、３７℃で１時間、複合体化した抗体１（２００ｎＭ，１ｍＬ）で処理する。サンプル８は、３７℃で１時間、複合体化した抗体１（２００ｎＭ，１ｍＬ）で処理し、その後、剥離する。これらの処理後、全ての細胞を、１ｍＬの氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、相対的蛍光強度を検出するためにＯｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇシステムに供した。サンプル１〜８の読み出しは以下の通りである：１．５、０．６、１．１、１、３．３、１．５、５および５．８。サンプル１および５を処理する条件は、抗体−細胞表面結合を可能にするが、内在化を可能にしない。サンプル２および６を処理する条件は、細胞−表面結合も内在化のいずれも可能にしない。サンプル３および７を処理する条件は、細胞−表面結合および内在化を可能にする。サンプル４および８を処理する条件は、内在化を可能にするが、細胞−表面結合を可能にしない。サンプル１〜４およびサンプル６によって生成されるシグナルは非特異性に起因するバックグランドとみなされる。

インキュベーション後、一部のサンプルに「酸洗浄」工程を実施して、細胞内に輸送されたものに影響を与えずに表面結合抗体を剥離する。これにより、内在化抗体の定量化が可能となる。同様に標識したコントロール抗体（非特異的ｈＩｇＧ）は、インキュベーション温度にも、洗浄工程にも関わらず、保持されない。抗体１は洗浄前に両方の温度で保持されるが、後記のように３７℃でインキュベートされたものが残り；細胞による抗体の内在化を実証する。

（抗体１は細胞内のＦＧＦＲ３−受容体分解を誘発する）
ＯＰＭ−２は、複数の骨髄種の癌細胞から最初に単離された細胞株である。ＯＰＭ−２細胞は、Ｋ６５０Ｅ点突然変異の機能獲得を保有するＦＧＦＲ−３受容体を発現することが知られている。低血清培地（０．１％ＦＢＳ）中で一晩、ＯＰＭ−２細胞を休眠させる。次の日、これらの細胞を５群に分ける。群１をすぐに溶解し、溶解物をウェスタンブロット解析時まで−２０℃に維持する。従って、この群を０時間のサンプルに指定する。群２〜５の各々を、等しいサイズの３つのサンプルにし、群２、３、４および５をサンプルＡ、ＢおよびＣと名付ける。群２〜５のサンプルＡは、いかなるさらなる処理にも供さないが、３７℃でインキュベートする。群２〜５のサンプルＢを、３７℃にて３０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−１で処理する。群２〜５のサンプルＣを、３７℃にて３０μｇ／ｍｌの抗体１で処理する。処理の１時間後、群２の全てのサンプルを溶解し、溶解物をウェスタンブロット解析時まで−２０℃に維持する。この群を１時間のサンプルと指定する。処理の４時間後、群３の全てのサンプルを溶解し、溶解物をウェスタンブロット解析時まで−２０℃に維持する。この群を４時間のサンプルと指定する。８時間の処理後、群４の全てのサンプルを溶解し、溶解物をウェスタンブロット解析時まで−２０℃に維持する。この群を８時間のサンプルと指定する。２４時間の処理後、群５の全てのサンプルを溶解し、溶解物をウェスタンブロット解析時まで−２０℃に維持する。この群を２４時間のサンプルと指定する。全ての溶解物を調製して、それらをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてウェスタンブロット実験に供する。群１のＦＧＦＲ−３シグナルおよび群２の全てのサンプルは同様である。群３において、サンプルＡおよびＣのＦＧＦＲ−３シグナルは群１のものと同様であり、さらにサンプルＢのシグナルは著しく低い。群４において、サンプルＡのＦＧＦＲ−３シグナルは群１のものと同様であり、さらにサンプルＢおよびＣのシグナルは著しく低い。群５において、サンプルＡのＦＧＦＲ−３シグナルは群１のものより低く、さらにサンプルＢおよびＣのシグナルはほとんど存在しない。従って、ＦＧＦＲ分解を誘発することが知られている、ＦＧＦ−１と同様に、抗体１は時間依存性様式においてＦＧＦＲ−３分解を誘発でき、これは出願人がデータに示されていないと考える特徴である。

（抗体１は細胞表面由来の変異ＦＧＦＲ−３受容体の枯渇を誘発する）
膀胱癌において特定される多くのＦＧＦＲ−３活性化突然変異は受容体の細胞外ドメインに位置する。これらの変異（例えばＲ２４８ＣまたはＳ２４９Ｃ）は、リガンド非依存性様式においてジスルフィド結合されたＦＧＦＲ−３二量体の形成を導く、新規の、対になっていないシステイン残基を生じる。最も頻度の高い変異は、Ｓ２４９Ｃ、Ｙ３７５ＣおよびＲ２４８Ｃであり、それらは一緒に、膀胱癌においてＦＧＦＲ−３変異全ての９１％の割合を占める。さらに、ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｃ）上のＳ２４９Ｃはまた、ＦＧＦＲ３（ＩＩＩｃ）の構成的活性化を導く。抗体１は内在化し得、野生型（ＷＴ）ＦＧＦＲ−３だけでなく、最も多く見られる腫瘍関連ＦＧＦＲ−３変異体もまた枯渇させ得る。

３つの最も一般的なＦＧＦＲ３変異体およびＷＴ ＦＧＦＲ−３の各々を安定に発現するＮＩＨ−３Ｔ３およびＢａ／Ｆ３細胞株を生成するために、完全長ヒトＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）または（ＩＩＩｃ）をコードするｃＤＮＡを、ｐＭＳＣＶプロレトロウイルスベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）内にクローニングして、ｐＭＳＣＶプロ−ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）または（ＩＩＩｃ）を生成する。特定の変異体、すなわちＳ２４９Ｃ、Ｙ３７５ＣおよびＲ２４８Ｃを、ＱｉｃｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）によりｃＤＮＡ内に導入する。ＷＴまたは変異ＦＧＦＲ−３を発現するＮＩＨ３Ｔ３およびＢａ／Ｆ３安定細胞を生成するために、種々のｐＭＳＣＶｎｅｏ構築物を、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてパッケージング細胞Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ｅｃｏ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）内にトランスフェクトする。レトロウイルスを収集し、ＮＩＨ−３Ｔ３およびＢａ／Ｆ３細胞を感染させるために使用する。２週間、２μｇ／μｌのピューロマイシンを用いた選択後、ＷＴまたは変異ＦＧＦＲ−３を発現する細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８により複合体化した抗ヒトＦＧＦＲ−３で染色し、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いて解析する。

細胞表面由来の変異およびＷＴ ＦＧＦＲ−３の、抗体１により誘発された内在化／枯渇に関して、６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，＃３５９８）のウェルに、２ｍＬの培地（ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；１００Ｕ／５００ｍＬのペニシリンＧ、および１００μｇ／５００ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中の１．５×１０^５のＮＩＨ−３Ｔ３−ＦＧＦＲ−３変異体を播種する。プレートを、９５％の相対湿度および５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２下で、３７℃にて２４時間インキュベートする。次いで、抗体１を５μｇ／ｍＬの最終濃度でウェルに加える。２時間の処理後、培地をウェルから除去し、１ｍＬの酵素を含まない細胞解離溶液（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，＃Ｓ−０１４−Ｂ）と取り替える。細胞を、室温にて５分間インキュベートした後、遠心分離管中に収集し、培地中で一度洗浄し、続いて、結合緩衝液（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含むＤＰＢＳ）中で１回以上洗浄する。細胞を染色する前に、抗体１由来の異なるエピトープを認識するＦＧＦＲ−３抗体を、供給者の指示書に従って、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８モノクローナル抗体標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて標識する。２μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識した抗体を含有する１００μＬの結合緩衝液を細胞に加え、次いでそれを、氷上で６０分間インキュベートする。次いで、細胞を結合バッファーで一度洗浄し、（死細胞を染色するために）２μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを含有するＤＰＢＳに再懸濁する。細胞表面に残存しているＦＧＦＲ−３分子の量をＦＡＣＳ解析により解析し、１，０００事象を各々のサンプルについて獲得する。

細胞表面上の平均蛍光強度は、抗体１での処理後、細胞表面上に残存しているＦＧＦＲ−３分子の量を反映する。細胞表面上のＦＧＦＲ−３の枯渇の割合を、ヒトＩｇＧ１で処理した細胞の平均蛍光強度で割った抗体１で処理した細胞の平均蛍光強度を用いて算出する。抗体１は、細胞表面由来のＦＧＦＲ−３のＷＴおよび変異体の両方で著しく減少する。

Ｂａ／Ｆ３−ＦＧＦＲ３細胞増殖アッセイに関して、８０，０００細胞／ウェルを、１０％ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ １６４０倍地中に播種する。抗体１を、ヘパリン（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，カナダ）とともに０．００５〜１０μｇ／ｍｌの濃度で加える。７２時間のインキュベーション後、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で６時間、２０μｌ（２μＣｉ）／２００μｌのメチル−３Ｈチミジンでパルスした。細胞を収集し、３Ｈチミジン導入を計数した。抗体１は、Ｂａ／Ｆ３−ＦＧＦＲ−３−Ｒ２４８Ｃ増殖を著しく阻害した。

（ＦＧＦＲ−３抗体アンタゴニストは、インビトロにおいてＦＧＦＲ−３発現腫瘍細胞中のＦＧＦシグナル伝達を阻害する）
抗体１が一次抗体であるフローサイトメトリーを用いて野生型または変異ＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂおよび／またはＩＩＩｃ）を発現する腫瘍細胞株を同定する。３つの膀胱腫瘍細胞株、ＲＴ１１２、ＲＴ４およびＢＦＴＣ９０５は、有意なＦＧＦＲ−３発現を示す。Ｋ６５０Ｅ点突然変異の機能獲得を保有するＦＧＦＲ−３受容体を発現することが知られているＯＰＭ−２細胞もまた、この研究において高レベルの発現を示す。２つのさらなる細胞株、ＧＥＯおよびＦＡＤＵは、中程度であるが、なお有意なレベルの受容体を発現することが見出される。これらの腫瘍細胞中のＦＧＦＲ−３シグナル伝達を、ウェスタンブロットを用いて特徴付ける。

ＯＰＭ−２はヒト多発性骨髄腫由来の細胞株である。低血清培地（０．１％ＦＢＳ）中で一晩、細胞を休眠させる。次の日、これらの細胞を、等しいサイズの４つのサンプルに分ける。サンプル１を、コントロールサンプルとして３７℃にて１時間、取っておき、維持する。サンプル２を、３７℃にて１時間、２００ｎＭの抗体１とともにインキュベートする。サンプル３を、３７℃にて１時間、取っておき、次いでその同じサンプルを、１５分間、０．２ｎＭのＦＧＦ−９リガンドに曝露する。サンプル４を、３７℃にて１時間、２００ｎＭの抗体１とともにインキュベートし、次いでその同じサンプルを３７℃にて１５分間、０．２ｎＭのＦＧＦ−９に曝露する。次に、全ての４つのサンプルを溶解し、それらをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてウェスタンブロッティングに供する。抗リン酸化チロシン抗体を用いてＦＧＦＲ−３の活性化を調べる。抗リン酸化ＭＡＰＫ抗体を用いて下流のエフェクター分子ＭＡＰＫの活性化を調べる。抗リン酸化Ａｋｔ抗体を用いて下流のエフェクター分子Ａｋｔの活性化を調べる。サンプル２および４由来の蛍光体ＦＧＦＲ−３のシグナルは、刺激されていない状態の受容体を表す、サンプル１由来のものに相当する。サンプル３のシグナルはサンプル１の３倍より大きい。これにより、抗体１が、ＦＧＦＲ−３活性化に対するＦＧＦ−９の効果を拮抗するという結論が下され得る。サンプル２および４由来の蛍光体ＭＡＰＫのシグナルは、刺激されていない状態の受容体を表す、サンプル１由来のものに相当する。サンプル３のシグナルは、サンプル１の２倍より大きい。これにより、抗体１が、ＭＡＰＫ活性化に対するＦＧＦ−９の効果を拮抗するという結論が下され得る。ＧＥＯはヒト大腸腫瘍由来の細胞株である。低血清培地（０．１％ＦＢＳ）中で一晩、細胞を休眠させる。次の日、これらの細胞を等しいサイズの６つのサンプルに分ける。サンプル１をコントロールサンプルとして３７℃にて１時間、取っておき、維持する。サンプル２を、３７℃にて１時間、２００ｎＭのアイソタイプが一致した非特異的コントロール抗体の２００ｎＭとともにインキュベートする。サンプル３を、３７℃にて１時間、２００ｎＭの抗体１とともにインキュベートする。サンプル４を、３７℃にて１時間、取っておき、次いでその同じサンプルを、３７℃にて１５分間、０．６７ｎＭのＦＧＦ−１リガンドに曝露する。サンプル５を、３７℃にて１時間、２００ｎＭのコントロール抗体とともにインキュベートし、次いでその同じサンプルを、３７℃にて１５分間、０．６７ｎＭのＦＧＦ−１に曝露する。サンプル６を、３７℃にて１時間、２００ｎＭの抗体１とともにインキュベートし、次いでその同じサンプルを、３７℃にて１５分間、０．６７ｎＭのＦＧＦ−１に曝露する。６つのサンプル全てを溶解し、それらをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてウェスタンブロッティングに供する。抗リン酸化チロシン抗体を用いてＦＧＦＲ−３の活性化を調べる。サンプル１、２および４は、同様の低レベルの蛍光体ＦＧＦＲ−３を有するが、サンプル３のみは、全ての３種類の分子に相当する著しく高いシグナルを有する。従って、１）ＦＧＦ−９曝露はＦＧＦＲ−３のリン酸化を増加させ；２）抗体１はそれらの増加を拮抗し、３）抗体１のみはいかなるアゴニスト活性も有さない。

ＲＴ−１１２はヒト膀胱癌由来の細胞株である。細胞を、低血清培地（０．１％ＦＢＳ）中で一晩、休眠させる。次の日、これらの細胞を、等しいサイズの４つのサンプルに分ける。サンプル１を、コントロールサンプルとして３７℃にて１時間、取っておき、維持する。サンプル２を、３７℃にて１時間、２００ｎＭの抗体１とともにインキュベートする。サンプル３を、３７℃にて１時間、取っておき、次いで、その同じサンプルを３７℃にて１５分間、１．３ｎＭのＦＧＦ−１リガンドに曝露する。サンプル４を、３７℃にて１時間、２００ｎＭの抗体１とともにインキュベートし、次いで、その同じサンプルを、３７℃にて１５分間、０．１３ｎＭのＦＧＦ−１に曝露する。次に、４つのサンプル全てを溶解し、各々の溶解したサンプルの１０％をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてウェスタンブロッティングに供する。抗リン酸化ＭＡＰＫ抗体を用いて、下流のエフェクター分子ＭＡＰＫの活性化を調べる。抗リン酸化Ａｋｔ抗体を用いて、下流のエフェクター分子Ａｋｔの活性化を調べる。各々の溶解物の他の９０％を免疫沈降実験に供する。サンプルを、４℃にて４〜１６時間、市販の抗ＦＧＦＲ−３抗体とともに混合し、抗体に溶解物中でＦＧＦＲ−３受容体を収集させ、次いで、２０μｇのプロテインＡ−プロテインＧビーズ混合物（５０：５０，Ｖ：Ｖ）とサンプルとを、４℃にて一晩混合することによって、抗ＦＧＦＲ−３抗体が結合したＦＧＦＲ−３を回収する。それらのビーズをＰＢＳで３回洗浄し、その後、それらをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングに供する。抗リン酸化チロシン抗体を用いて、ＦＧＦＲ−３の活性化を調べる。サンプル１、２および４は、同様の低レベルの蛍光体ＦＧＦＲ−３および蛍光体ＭＡＰＫを有するが、サンプル３のみは、全ての３種類の分子に相当する著しく高いシグナルを有する。従って、１）ＦＧＦ−１曝露はＦＧＦＲ−３およびＭＡＰＫのリン酸化を増加させ、２）抗体１はそれらの増加を拮抗し、３）抗体１のみはいかなるアゴニスト活性も有さない。サンプル４のみは、残りのものより低い蛍光体Ａｋｔシグナルを有し、抗体１は同様にＡｋｔシグナル伝達を拮抗できることを示す。

ＧＥＯ細胞を使用して、上記の６つのサンプルを調製し、次いで溶解し、それらを上記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてウェスタンブロッティングに供する。しかしながら、抗リン酸化ＭＡＰＫ抗体を用いて下流のエフェクター分子ＭＡＰＫの活性化を調べる。抗リン酸化Ａｋｔ抗体を用いて下流のエフェクター分子Ａｋｔの活性化を調べる。サンプル１、２、３および６は、同様の低レベルの蛍光体ＭＡＰＫを有するが、サンプル４および５は、３種類全ての分子に相当する著しく高いシグナルを有する。従って、１）ＦＧＦ−１曝露はＭＡＰＫのリン酸化を増加させ；２）抗体１はこの増加を拮抗し、３）抗体１のみはいかなるアゴニスト活性も有さない。従って、１）ＦＧＦ−１曝露はＭＡＰＫのリン酸化を増加させ；２）抗体１はこの増加を拮抗し、３）抗体１のみはいかなるアゴニスト活性も有さない。

（抗体１は腫瘍細胞増殖を阻害し、インビトロにおいて生存する）
腫瘍細胞の増殖に対する抗体１の阻害効果を示すために、細胞増殖アッセイを使用する。単層ＲＴ１１２細胞を、２４〜７２時間、低血清培地（０．１％のウシ胎仔血清、５μｇ／ｍＬのヘパリン）中で休眠させる。細胞を４つのサンプルに分ける。ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を、１０％（Ｖ：Ｖ）の最終濃度までサンプル１に加える。サンプル２を飢餓培地中に静置する。ＦＧＦ−１を、１ｎＭの最終濃度までサンプル３に加える。抗体１を、２００ｎＭの最終濃度までサンプル４に加え、３７℃にて１時間、インキュベートする。次に、ＦＧＦ−１を１ｎＭの最終濃度まで加える。上記のようにサンプル１〜４を調製後、３７℃にて５％ ＣＯ_２（ｖ：ｖ）で４８時間、組織培養インキュベーターセット中でサンプルをインキュベートする。標準的な^３Ｈ−チミジン導入アッセイを用いて、細胞増殖を検出する。インビトロにおいてＲＴ１１２細胞を１ｎＭの外因性ＦＧＦ−１で刺激した場合、腫瘍細胞増殖は２倍になる。この実験はまた、抗体１が、この外因性に刺激した増殖を効果的に減少させることを示す。

コロニー形成アッセイまたはコロニゲニックアッセイ（ｃｏｌｏｎｉｇｅｎｉｃ ａｓｓａｙ）としても知られている、軟寒天アッセイを、腫瘍細胞の生存に対する抗体１の阻害効果を示すために使用する。２００ｎＭの抗体１（１０％のＦＢＳ培地中）を含有する軟寒天中のＲＴ１１２細胞増殖は、１０％のＦＢＳ培地のみを含有するか、または２００ｎＭのアイソタイプが一致した非特異的コントロール抗体（１０％のＦＢＳ培地中）を含有する軟寒天中で増殖したものより約５０％少ないコロニーを形成する。これは、腫瘍細胞に対する抗体１の抗生存効果を示す。

（抗体１はＦＧＦＲ−３を保有する固形腫瘍に対する抗腫瘍効果を示す）
慣例の方法によってＲＴ１１２およびＧＥＯ異種移植腫瘍モデルを成長させる。この方法において、０〜１００％のマトリゲルと混合した１００万〜２０００万の腫瘍細胞を、各々の雌の無胸腺ヌードマウスに皮下注射する。皮下腫瘍の平均値がほぼ４００ｍｍ^２になると、抗体処置を開始する。両方とも異種移植腫瘍に相当する２つの腫瘍細胞株、ＲＴ１１２およびＧＥＯは、コントロール群中の同じタイプの腫瘍と比較して、週に３回の４０ｍｇ／ｋｇの抗体１の腹腔内注射処理によって効果的に阻害する。これらの効果がＦＧＦＲ−３シグナル伝達経路の付与から生じることを実証するために、同所性（Ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）ＰＣ−３腫瘍モデルを用いて有効性研究を行い、ここで、腫瘍細胞は、ＦＧＦＲ−３受容体リン酸化のウェスタンブロット解析からの陰性結果によって示唆されるようにＦＧＦＲ−３シグナル伝達経路を欠く。同所性ＰＣ−３モデルを、ルシフェラーゼをトランスフェクトしたＰＣ−３細胞（ＰＣ−３ＬＰ）を、外科手術によりＮｕ／ｎｕマウス（雄、７〜８週、１×１０^６細胞／マウス）の背葉前立腺に直接注入することにより生成した。細胞注入の２週間後、動物の生物発光画像を、腹側位置（後方に寝かせている動物）において捕捉し、製造業者の指示書（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）に従ってＩＶＩＳシステムを用いて定量化する。移植が成功したマウスを、所定のスケジュールで腹腔内に種々の試験薬剤を与える群にランダム化する。ＩＶＩＳによって捕捉したシグナルを、全身腫瘍組織量の代用物として用い、週に一度記録する。統計的解析を、反復ＡＮＯＶＡを用いて実施する。抗体１は、ＰＣ−３腫瘍の増殖に対して有意な効果を示さない。従って、抗体１は、機能的ＦＧＦＲ−３シグナル伝達経路を保有するそれらの固形腫瘍の増殖を阻害する。

（抗体１は変異ＦＧＦＲ−３受容体を有する骨髄腫瘍に対する抗腫瘍効果を示す）
ＯＰＭ−２およびＫＭＳ−１１は、ＦＧＦＲ−３を発現する多発性骨髄腫細胞株である。さらに、両方の細胞株における受容体は、単一の点突然変異：ＯＰＭ−２中のＫ６５０ＥおよびＫＭＳ−１１中のＹ３７３Ｃを保有する変異体である。２つの変異体は機能獲得型変異であり、構成的活性化、延長した半減期および増加したリガンド感受性などの機構を介して変異受容体の活性を増加させる。慣例の方法によってＯＰＭ−２異種移植モデルを成長させる。この方法において、０〜１００％のマトリゲルと混合した１００万〜２０００万の腫瘍細胞を、各々の雌の無胸腺ヌードマウスに皮下注射する。皮下腫瘍の平均体積がほぼ４００ｍｍ^２になると、注射処置を開始する。週に３回処置する。週に３回、腫瘍体積を測定する。処置の４週間後に最終測定を行う。抗体１で処置した動物の平均腫瘍サイズは、コントロール群のものより６４％小さい。スチューデントｔ検定を実施する。Ｐ値は０．０００１未満である。従って、実測値は非常に有意である。ＫＭＳ−１１骨生着モデルを、Ｘｉｎ Ｘら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６年，８月１５日；１２（１６）：４９０８−１５に従って確立する。腫瘍細胞注入後、１週間で抗体処置を開始する。週に３回処置する。研究の間に、腫瘍細胞によって放出されたシグナルを数回測定する。最初の注入の３３日後、最終測定を行う。抗体１で処置した動物からの平均シグナルは、コントロール動物からのものの１／４である。ログランク（マンテル−コックス）検定（Ｌｏｎｇ−ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）Ｔｅｓｔ）を実施する。Ｐ値は０．０００２である。従って、実測値は非常に有意である。両方のモデルにおいて、週に３回の４０ｍｇ／ｋｇの抗体１の腹腔内注射処置は、コントロール群と比べて腫瘍増殖を著しく阻害する。抗体１は、最初に、インビボにおいて、Ｋ６５０Ｅを有する腫瘍細胞およびＦＧＦＲ−３のＹ３７３Ｃ変異型を有するものに対する抗腫瘍活性を示すように見える。

（抗体１は細胞毒性剤の治療効果を高める）
シスプラチンは、癌治療において広範囲に使用される細胞毒性剤である。これはＤＮＡ架橋を生じ、細胞アポトーシスを誘発する。３つの膀胱異種移植モデルにおいてシスプラチンとＦＧＦＲ−３抗体とを混合する治療的有用性を調べる。慣例の方法によってＲＴ１１２、ＲＴ４およびＢＦＴＣ９０５異種移植腫瘍モデルを成長させる。この方法において、０〜１００％のマトリゲルと混合した１００万〜２０００万の腫瘍細胞を、各々の雌の無胸腺ヌードマウスに皮下注射する。皮下腫瘍の平均体積がほぼ４００ｍｍ^２になると、抗体処置を開始する。週に３回、４０ｍｇ／ｋｇの抗体１およびシスプラチンの最大耐容量（ＭＴＤ）の注射を使用する。研究の終わりまで、週に３回、平均腫瘍体積を測定する。ＲＴ１１２腫瘍モデルのデータの概要を以下の表に記録する。

表３：個々のＲＴ−１１２腫瘍体積（ｍｍ^３）−シスプラチン処置

ＲＭ ＡＮＯＶＯ統計的検定を実施する。シスプラチン処置の効果と、シスプラチン−抗体１の組み合わせの効果とを比較する。Ｐ値は０．０１８である。従って、シスプラチンの高い有効性に対する抗体１の効果は非常に有意である。

ＲＴ４腫瘍モデルのデータの概要を以下の表に記録する。

表４：個々のＲＴ４腫瘍体積（ｍｍ^３）−シスプラチン処置

ＲＭ ＡＮＯＶＯ統計的検定を実施する。シスプラチン処置の効果と、シスプラチン−抗体１の組み合わせの効果とを比較する。Ｐ値は０．０１６２である。従って、シスプラチンの増加した効果に対する抗体１の効果は非常に有意である。

ＢＦＴＣ９０５腫瘍モデルのデータの概要を以下の表に記録する。

表５：個々のＢＦＴＣ−９０５腫瘍体積（ｍｍ^３）−シスプラチン処置

ＲＭ ＡＮＯＶＯ統計的検定を実施する。シスプラチン処置の効果と、シスプラチン−抗体１の組み合わせの効果とを比較する。Ｐ値は０．０２０９である。従って、シスプラチンの増加した効果に対する抗体１の効果は非常に有意である。

これらの研究の全過程の間の処置に死んだ動物はなく、抗体１をシスプラチンのＭＴＤに加えることは、２つの薬物の副作用を著しく悪化させずに、後者の効果を高めることを示唆している。

Claims (19)

1. ヒトＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｂ）およびＦＧＦＲ−３（ＩＩＩｃ）に対して特異的に結合する、単離された抗体。
2. 室温（２０〜２５℃）にて約１×１０^−８Ｍ以下のＫ_Ｄを有するヒト抗体である、請求項１に記載の抗体。
3. ヒトＦＧＦＲ−３ドメイン２（配列番号１２）に対して特異的に結合する、請求項１または２に記載の抗体。
4. 配列ＧＹＭＦＴＳＹＧＩＳ（配列番号１）を有するＣＤＲＨ１、配列ＷＶＳＴＹＮＧＤＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号２）を有するＣＤＲＨ２、配列ＶＬＧＹＹＤＳＩＤＧＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号３）を有するＣＤＲＨ３、配列ＧＧＮＮＩＧＤＫＳＶＨ（配列番号４）を有するＣＤＲＬ１、配列ＬＤＴＥＲＰＳ（配列番号５）を有するＣＤＲＬ２、および、配列ＱＶＷＤＳＧＳＤＨＶＶ（配列番号６）を有するＣＤＲＬ３を含むヒトＦＧＦＲ−３に対して特異的に結合する、請求項１から３のうちいずれか一項に記載の抗体。
5. 重鎖可変アミノ酸配列：ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＭＦＴＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＶＳＴＹＮＧＤＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＶＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＬＧＹＹＤＳＩＤＧＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号７）、および、軽鎖可変アミノ酸配列：ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＬＳＶＡＰＧＫＴＡＴＦＴＣＧＧＮＮＩＧＤＫＳＶＨＷＹＲＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＭＹＬＤＴＥＲＰＳＧＩＰＥＲＭＳＧＳＮＦＧＮＴＡＴＬＴＩＴＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＳＧＳＤＨＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ（配列番号８）を含む抗体である、請求項１から４のうちいずれか一項に記載の抗体。
6. 配列番号９の重鎖および配列番号１０の軽鎖を含む、請求項１から５のうちいずれか一項に記載の抗体。
7. 配列番号９の２本の重鎖および配列番号１０の２本の軽鎖を含む、請求項１から６のうちいずれか一項に記載の抗体。
8. 請求項１から７のうちいずれか一項に記載の抗体における中和ヒトＦＧＦＲ−３結合フラグメント。
9. 単離された抗体またはそのフラグメントであって、当該抗体は、請求項５から８のうちいずれか一項に記載の競合抗体を用いる競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＦＧＦＲ−３の細胞外ドメインに対する結合と競合し、当該競合抗体は、室温（２０〜２５℃）にて約１×１０^−８Ｍ以下のＫ_ＤでＦＧＦＲ−３と結合することを特徴とする、単離された抗体またはそのフラグメント。
10. 変異ＦＧＦＲ−３に対して特異的に結合する、請求項９に記載の抗体。
11. 請求項１から９のうちいずれか一項に記載された抗体またはフラグメントと、薬学的に受容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む、薬学的組成物。
12. 治療における同時使用、別個使用または連続使用のための、請求項１から９のうちいずれか一項に記載された抗体またはフラグメントと、治療のための追加の抗癌剤とを組み合わせて含有する製品。
13. 医薬として用いられる、請求項１から９のうちいずれか一項に記載の抗体またはフラグメント。
14. 癌の治療に用いられる、請求項１から９のうちいずれか一項に記載の抗体またはフラグメント。
15. 前記癌が膀胱癌または多発性骨髄腫である、請求項１３に記載の抗体またはフラグメント。
16. 別の薬剤と共に用いられる請求項１４に記載の抗体またはフラグメント。
17. 患者に対して有効量の別の薬剤を、同時投与、別個投与、または、連続投与することを含む、請求項１６に記載の抗体。
18. 前記薬剤はシスプラチンである、請求項１７に記載の抗体。
19. 請求項１から１８のうちいずれか一項に記載の化合物と、薬学的に受容可能な担体および必要に応じて他の治療成分を共に含む、薬学的組成物。