JP2012507302A5

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Publication number: JP2012507302A5
Application number: JP2011534864A
Authority: JP
Filing date: 2009-11-03
Publication date: 2012-05-17
Anticipated expiration: 2029-11-03

Description

生弱毒化呼吸器合胞体ウイルス

関連出願への相互参照
本出願は、２００８年１１月５日に出願された米国仮出願第６１／１９８，３２７号の利益を主張するものであり、この出願は本明細書に参照により取り込まれる。

ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、マイナス一本鎖ＲＮＡウイルスであり、ニューモウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒａｓ）属、パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒａｄａｅ）科のウイルスである。ＲＳＶは１歳未満の乳児におけるウイルス性肺炎および細気管支炎の第一の原因であり、これら乳児における入院および致死性気道疾患の主要な原因である。ある種の基礎疾患（例えば免疫不全、先天性心疾患、気管支肺異形成症など）を有する小児においては、重篤な疾患も発症し得る。ほとんど全ての子供は２歳までに感染し、通常は年長児または成人になってから再感染する（Ｃｈａｎｏｃｋら、ＶｉｒａｌＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓｏｆＨｕｍａｎｓ、第３版、Ａ．Ｓ．Ｅｖａｎｓ編、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））。健康な成人では、大抵の感染は無症状であり、一般には軽度の上気道疾患に限られる。しかし、高齢の患者や免疫不全者では、重篤で、場合により致命的な感染症になりやすい。

ＲＳＶの２つの主要な抗原性サブグループＡおよびＢならびにそれぞれのサブグループにおける複数の遺伝子型が同定されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９８５、ＪＩｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５１：６２６−６３３；Ｍｕｆｓｏｎら、１９８５、Ｊ．Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ．６６：２１１１−２１２４）。正逆交雑中和分析（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌｃｒｏｓｓ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ）によれば、前記２つの抗原性サブグループは抗原的におよそ２５％関連している。温暖な気候において毎年秋の終わりから、冬、春にかけて起こる流行では、各サブグループの多様な異型が循環していることが確認されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９１、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６３：６８７−６９２）。２つの重要なＥＳＶサブグループのうちの一方に感染した子供は、同種サブグループによる再感染から保護され得ることを示す証拠がある（Ｍｕｆｓｏｎら、１９８７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６：１５９５−１５９７）。感染を繰り返した後で防御免疫が蓄積することを示す証拠とあわせて、このことは、重篤な疾患および死亡を防御する十分な免疫を提供する、乳児および小児へのＲＳＶワクチンレジメント（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｒｅｇｉｍｅｎｔ）の開発が可能であることを示唆している。

天然のＲＳＶゲノムは概してマイナス鎖ポリヌクレオチド分子を含み、このポリヌクレオチド分子は相補性ウイルスｍＲＮＡを介して１１種類のウイルスタンパク質、即ち、非構造種であるＮＳ１およびＮＳ２、Ｎ、Ｐ、マトリックス（Ｍ）、小疎水性（ＳＨ）、糖タンパク質（Ｇ）、融合体（Ｆ）、Ｍ２（ＯＲＦ１）、Ｍ２（ＯＲＦ２）、およびＬをコードしている。以上のことはＭｉｎｋら、１９９１、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１８５：６１５−６２４；Ｓｔｅｃら、１９９１、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１８３：２７３−２８７；およびＣｏｎｎｏｒｓら、１９９５、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０８：４７８−４８４において詳細に記載されている。

近年ようやく免疫予防薬シナジス（登録商標）が、早産高リスク新生児におけるＲＳＶ関連疾患の予防のために市販されたが、数十年の研究にもかかわらず、ＲＳＶ感染および関連疾患に対する安全でかつ有効なワクチンは未だにない。分泌型抗体は上気道の防御に最も重要であり、一方、高レベルの血清抗体は下気道におけるＲＳＶ感染への抵抗において重要な役割を担っていると考えられている。しかし、精製ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）製剤は、血液感染性ウイルスを伝染させる可能性が懸念され、一方、組み換えＩｇ製剤は製造費用が高い。

小児ワクチン接種の初期の試み（１９６６年）では、ホルマリン不活化ＲＳＶワクチンの非経口投与が用いられた。残念なことにいくつかの実地試験において、このワクチン投与がＲＳＶへの自然感染後の非常に激しい発症に明らかに関連していることが示された（Ｋａｐｉｋｉａｎら、１９６８、Ａｍ．ＪＥｐｉｄｅｍｉｏｌ８９：４０５−４２１；Ｋｉｍら、１９６９、Ａｍ．ＪＥｐｉｄｅｍｉｏｌ．８９：４２２−４３４；Ｆｕｌｇｉｎｉｔｉら、１９６９、Ａｍ．ＪＥｐｉｄｅｍｉｏｌ８９：４３５−４４８；Ｃｈｉｎら；１９６９、Ａｍ，ＪＥｐｉｄｅｍｉｏｌ８９：４４９−４６３）。このワクチンがＲＳＶ疾患を悪化させる原因は明らかではない。ＲＳＶ抗原に対する暴露によって異常な、あるいは、バランスの崩れた免疫応答が誘発され、これにより、本来の疾患が免疫病理学的に増強されたことが示唆されている（Ｋｉｍら、１９７６、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．１０：７５−７８；Ｐｒｉｎｃｅら、１９８６、ＪＶｉｒｏｌ５７：７２１−７２８）。

サブユニットあるいは不活化ウイルスワクチンに比較して、生弱毒化または生ベクターウイルスワクチンの利用には有利な点がいくつかある。生弱毒化ウイルスワクチンは天然のウイルス感染を再現し、効果的に宿主免疫系を作動させることができ、また、サブユニットあるいは不活化ワクチンに比べて液性要素および細胞性要素の両方を含む強力な免疫を付与しやすい。

Ｃｈａｎｏｃｋら、ＶｉｒａｌＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓｏｆＨｕｍａｎｓ、第３版、Ａ．Ｓ．Ｅｖａｎｓ編、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９８５、ＪＩｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５１：６２６−６３３Ｍｕｆｓｏｎら、１９８５、Ｊ．Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ．６６：２１１１−２１２４Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９１、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６３：６８７−６９２Ｍｕｆｓｏｎら、１９８７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６：１５９５−１５９７Ｍｉｎｋら、１９９１、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１８５：６１５−６２４Ｓｔｅｃら、１９９１、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１８３：２７３−２８７Ｃｏｎｎｏｒｓら、１９９５、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０８：４７８−４８４Ｋａｐｉｋｉａｎら、１９６８、Ａｍ．ＪＥｐｉｄｅｍｉｏｌ８９：４０５−４２１Ｋｉｍら、１９６９、Ａｍ．ＪＥｐｉｄｅｍｉｏｌ．８９：４２２−４３４Ｆｕｌｇｉｎｉｔｉら、１９６９、Ａｍ．ＪＥｐｉｄｅｍｉｏｌ８９：４３５−４４８Ｃｈｉｎら、１９６９、Ａｍ，ＪＥｐｉｄｅｍｉｏｌ８９：４４９−４６３Ｋｉｍら、１９７６，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．１０：７５−７８Ｐｒｉｎｃｅら、１９８６、ＪＶｉｒｏｌ５７：７２１−７２８

本発明は野生型の呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染に対して、対象（ヒトを含む）を免疫するために適したＲＳＶの生株を開示する。当該提供される株は、ＲＳＶ感染に関連した重篤な呼吸器疾患を防ぐ一方でその免疫自体に基づく呼吸器疾患をもたらすことがないような免疫応答を、ワクチン接種した対象において効果的に誘導するように適切に弱毒化されている。この弱毒株は、表現型としては野生型であるサブグループＡのヒトＲＳＶ株を一定の多重度でＶｅｒｏ細胞中において継代培養することによって得られた。継代培養過程で突然変異が誘導され、その結果として遺伝的に安定で、免疫原性および防御性を有し、かつ非病原性であるＲＳＶ株となったことが、配列分析によって示された。

本発明の他の側面は、（１）本明細書において同定される１以上のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の突然変異、（２）１以上のヌクレオチド突然変異を含み、および／または本明細書において開示される弱毒化ＲＳＶ中において同定された１以上のアミノ酸突然変異をコードするウイルスゲノム、および／または（３）本明細書において記載される１以上のヌクレオチド突然変異を有するか、あるいは本明細書において記載される１以上のアミノ酸突然変異をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む生弱毒化ＲＳＶに関する。

「突然変異」との記載は、それぞれタンパク質配列または遺伝子および／もしくはゲノム配列内の特定のアミノ酸またはヌクレオチドの位置において、参照配列あるいは野生型配列のアミノ酸またはヌクレオチドとは異なったアミノ酸またはヌクレオチドが存在することを意味している。示された突然変異が最終的に付与される限りにおいて、得られる突然変異は参照配列または野生型配列に直接導入され得るか、あるいは参照配列または野生型配列とは異なる配列によって提供され得る。

本発明の生弱毒化ＲＳＶは、ＲＳＶ感染またはＲＳＶ感染に関連した重篤な呼吸器疾患の発症のいずれかに対して免疫原性および防御性を有する。好ましい実施形態として、生弱毒化ＲＳＶはサブグループＡおよび／またはＢの野生型ＲＳＶ感染に対する免疫に適したヒトＲＳＶである。本明細書においては、当該生弱毒化ＲＳＶを含む医薬組成物および当該組成物を投与することによりＲＳＶ感染に対して対象、好ましくはヒトを治療する方法も記載される。

本明細書に記載される１以上のアミノ酸突然変異をコードするか、または本明細書に記載される、１以上のヌクレオチド突然変異を有する配列を含む核酸の例には、（１）特定の全長ＲＳＶ参照配列に基づく全長ＲＳＶゲノム配列、（２）本明細書に記載される特定のＲＳＶ核酸配列に基づく種々のＲＳＶ核酸領域、（３）本明細書に記載される１以上の特定のＲＳＶ核酸配列を含む部分的ゲノム配列、（４）本明細書に記載される１以上の特定のＲＳＶ核酸配列を含む全長ゲノム配列が含まれる。

用語「処置する」あるいは「処置」とは、感染または再感染の予防もしくは軽減、またはＲＳＶ感染に関連した症状、病気または状態の軽減もしくは除去を含む治療的および／または予防的処置を意味している。処置が必要なヒトには、ＲＳＶに感染した一般集団および／または患者が含まれる。処置が必要なヒトの例には、既にＲＳＶ関連疾患を発症したヒト、そのような疾患を発症しそうなヒト、および／またはそのような疾患を予防する必要があるヒトが含まれる。

「疾患」とはＲＳＶ感染に全部または一部起因する状態であり、肺炎および細気管支炎を含むがこれらに限定されるものではない。用語「疾患」には、哺乳動物を当疾患にかかりやすくさせる病理学的な状態を含む慢性および急性疾患および病気が含まれる。

用語「防御する」または「防御」は、本発明の弱毒化ウイルスまたは治療方法と関連して使用される場合には、ＲＳＶ感染、再感染、ＲＳＶ感染に起因する疾患の可能性を軽減すること、および感染、再感染および／または当該感染に起因する疾患の重症度を軽減することを意味している。

用語「有効量」とは、脊椎動物宿主、好ましくはヒト宿主の体内に導入された場合に、防御的免疫応答を生じる十分な量を意味している。当業者であれば、このレベルが多様であり得ることを理解している。

本明細書に記載される生弱毒化ＲＳＶはいずれかのＲＳＶサブグループ（ＡまたはＢ）または種族（例えばヒト、ウシ、マウス）から得られ、好ましくはヒトから得られる。防御免疫応答を誘導するために、このＲＳＶ株は免疫対象にとって内因性のものであってもよく、例えばヒトＲＳＶがヒトを免疫するために使用される。

ＲＳＶ株の記載において、用語「野生型」または「ｗｔ」は、弱毒に関する既知マーカーにおいて野生型であるゲノム配列を有するウイルスおよび／または弱毒化のｉｎｖｉｖｏモデル（例えばヒトまたは他の適当な動物モデル）またはｉｎｖｉｔｒｏモデルのいずれかにおいて示されるような表現型における野生型（即ち非毒性）のウイルスの両方を意味する。ＲＳＶタンパク質または核酸（例えば遺伝子、ゲノム）配列に対する記載における用語「野生型」は、弱毒表現型に寄与することが知られているマーカーを含まない配列を意味する。

本明細書に開示されるＲＳＶの記載における「生弱毒化ウイルス」は、遺伝子型において野生型ＲＳＶと異なる（即ちゲノム配列に相違を含む）とともに表現型において野生型ＲＳＶと異なる（即ち弱毒表現型によって証明されるような）ウイルスを意味している。弱毒化ウイルスは生存能力がある（即ち「生きている」）が、減弱された毒性を示す点において表現型が異なり、したがって、複数のウイルスは異なった程度の弱毒性を示し得る。本発明のこれら生弱毒化ＲＳＶは弱毒化されており、そのために対象宿主において非病原性である。不完全に弱毒化されたウイルスは病原性の減弱を示すが、依然として対象宿主において疾患応答を生じさせ得る。本願発明の生弱毒化ＲＳＶは（例えば野生型または不完全な弱毒化株の継代培養によって）自然に得られるか、または組み換え技術によって産生し得る。組み換え技術によって作られた場合には、組み換えＲＳＶは、組み換え発現系から直接または間接的に得られたＲＳＶもしくはＲＳＶ様ウイルスもしくはサブウイルス粒子、またはそれらより生成されたウイルスもしくはサブウイルス粒子から増幅されたものを意味する。本明細書において開示される生弱毒化ＲＳＶは、単離された形態であり、且つ、典型的には精製された形態である。

「実質的に類似」とは、特定の核酸またはアミノ酸配列が、参照配列に対して、明細書に記載されているように、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％または少なくとも９９％の同一性を有することを意味している。参照配列に対する配列同一性は、ある配列を参照配列とアライン（整列）させて、対応する領域内における同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の数を特定することにより決定する。この数を参照配列の総アミノ酸数で割り、１００倍してから小数点以下第１位で四捨五入して整数にする。配列同一性は、当技術分野において承認されている多数の配列比較アルゴリズムまたは目視検査によって決定することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ，ＦＭら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、４、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｒｏｏｋｌｙｎ、Ｎ．Ｙ．、Ａ．１Ｅ．１−Ａ．１Ｆ．１１、１９９６−２００４を総合的に参照のこと）。本願発明の実質的に類似な核酸配列またはアミノ酸配列は、ＮＳ２、Ｇ、ＬまたはＦタンパク質をコードするかまたはこれらから構成される場合には、後に詳述するように、ｐ１７内において見出される１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸突然変異を保持している。

「単離された」との記載は、天然で認められるものとは異なった形態あるいは感染者個人の鼻咽頭などの天然型ウイルスの本来の環境とは異なった環境中に存在する異なった形態を意味する。したがって単離されたウイルスは細胞培養その他の系の異種成分であり得る。例えば、当該異なった形態は、自然で認められるものとは異なった純度および／または自然で認められるのとは異なった構造であり得る。

「含む」等の開放型の用語の記載は、付加的な要素または工程を許容するものである。場合により「１以上」等の句が、付加的な要素または工程の可能性を強調するために、開放型の用語を伴って、あるいは伴わずに使用される。

明示しない限り、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」等の語は単数に限らず、文脈から明らかに反しない限り複数を示す語をも含む。例えば、「細胞（ａｃｅｌｌ）」は、「複数の細胞（ｃｅｌｌｓ）」を排除するものではない。場合により、「１以上」等の句が、複数の存在の可能性を強調するために使用される。

用語「哺乳動物」はヒトを含むあらゆる哺乳動物を意味する。

略語「Ｋｂ」はキロベースを意味する。

略語「ｐｆｕ」はプラーク形成単位を意味する。

略語「ＯＲＦ」は遺伝子のオープンリーディングフレームを意味する。

本発明の他の特徴や有利性は、種々の実施例を含む本明細書の他の記載から明らかである。提示される実施例は、本発明を実施する上で有用な種々の成分および手順を例示している。実施例は特許請求の範囲に係る本発明を限定するものではない。本明細書の開示に基づいて、当業者は本発明を実施する上で有用な他の成分および手順を特定し、用いることができる。

図１は、野生型ＲＳＶ株、ｈＲＳＶＳ２由来のＮＳ２タンパク質（配列番号２：ＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．Ｕ３９６６２；Ｔｏｌｌｅｙら、１９９６、Ｖａｃｃｉｎｅ１４：１６３７−１６４６参照）、Ｍｅｒｃｋ株２８７（配列番号４）およびｐ１７（配列番号６）のアミノ酸配列のアライメントを示す。下線１本で示されたアミノ酸はＭｅｒｃｋ２８７とｐ１７株の両方とｈＲＳＶＳ２株との間におけるＮＳ２タンパク質の相違を示している。Ｍｅｒｃｋ株ｐ１７ｐｐのＮＳ１アミノ酸配列は、ｐ１７のものと同じである（配列番号６）。図２は、ｈＲＳＶＳ２（配列番号８）、Ｍｅｒｃｋ株２８７（配列番号１０）およびｐ１７（配列番号１２）由来のＧタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。下線１本で示されたアミノ酸はＭｅｒｃｋ２８７とｐ１７株の両方とｈＲＳＶＳ２株との間におけるＧタンパク質の相違を示している。下線２本で示されたアミノ酸はｈＲＳＶＳ２とＭｅｒｃｋ２８７株の両方とｐ１７株との間における相違を示している。Ｍｅｒｃｋ株ｐ１７ｐｐのＧアミノ酸配列は、ｐ１７のものと同じである（配列番号１２）。図３Ａは、ｈＲＳＶＳ２（配列番号１４）、Ｍｅｒｃｋ株２８７（配列番号１６）およびｐ１７（配列番号１８）由来のＦタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。下線１本で示されたアミノ酸はＭｅｒｃｋ２８７とｐ１７株の両方とｈＲＳＶＳ２株との間におけるＦタンパク質の相違を示している。下線２本で示されたアミノ酸はｈＲＳＶＳ２とＭｅｒｃｋ２８７株の両方とｐ１７株との間における相違を示している。配列番号１８の第２９４位アミノ酸はＧｌｕかＬｙｓ残基のいずれかを表示する「Ｘ」で示されている。配列番号１８の第４８６位アミノ酸もＡｓｐかＧｌｙ残基のいずれかを表示する「Ｘ」で示されている。図３Ｂは、ｈＲＳＶＳ２（配列番号１４）、Ｍｅｒｃｋ株２８７（配列番号１６）およびｐ１７（配列番号１８）由来のＦタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。下線１本で示されたアミノ酸はＭｅｒｃｋ２８７とｐ１７株の両方とｈＲＳＶＳ２株との間におけるＦタンパク質の相違を示している。下線２本で示されたアミノ酸はｈＲＳＶＳ２とＭｅｒｃｋ２８７株の両方とｐ１７株との間における相違を示している。配列番号１８の第２９４位アミノ酸はＧｌｕかＬｙｓ残基のいずれかを表示する「Ｘ」で示されている。配列番号１８の第４８６位アミノ酸もＡｓｐかＧｌｙ残基のいずれかを表示する「Ｘ」で示されている。図４Ａは、ｈＲＳＶＳ２（配列番号２０）、Ｍｅｒｃｋ株２８７（配列番号２２）およびｐ１７（配列番号２４）由来のＬタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。下線１本で示されたアミノ酸はＭｅｒｃｋ２８７とｐ１７株の両方とｈＲＳＶＳ２株との間におけるＬタンパク質の相違を示している。下線２本で示されたアミノ酸はｈＲＳＶＳ２とＭｅｒｃｋ２８７株の両方とｐ１７株との間における相違を示している。配列番号２４の第１４８位アミノ酸はＡｓｐかＡｌａ残基のいずれかを表示する「Ｘ」で示されている。第２０５４位アミノ酸もＬｅｕかＰｈｅ残基のいずれかを表示する「Ｘ」で示されている。図４Ｂは、ｈＲＳＶＳ２（配列番号２０）、Ｍｅｒｃｋ株２８７（配列番号２２）およびｐ１７（配列番号２４）由来のＬタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。下線１本で示されたアミノ酸はＭｅｒｃｋ２８７とｐ１７株の両方とｈＲＳＶＳ２株との間におけるＬタンパク質の相違を示している。下線２本で示されたアミノ酸はｈＲＳＶＳ２とＭｅｒｃｋ２８７株の両方とｐ１７株との間における相違を示している。配列番号２４の第１４８位アミノ酸はＡｓｐかＡｌａ残基のいずれかを表示する「Ｘ」で示されている。第２０５４位アミノ酸もＬｅｕかＰｈｅ残基のいずれかを表示する「Ｘ」で示されている。図４Ｃは、ｈＲＳＶＳ２（配列番号２０）、Ｍｅｒｃｋ株２８７（配列番号２２）およびｐ１７（配列番号２４）由来のＬタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。下線１本で示されたアミノ酸はＭｅｒｃｋ２８７とｐ１７株の両方とｈＲＳＶＳ２株との間におけるＬタンパク質の相違を示している。下線２本で示されたアミノ酸はｈＲＳＶＳ２とＭｅｒｃｋ２８７株の両方とｐ１７株との間における相違を示している。配列番号２４の第１４８位アミノ酸はＡｓｐかＡｌａ残基のいずれかを表示する「Ｘ」で示されている。第２０５４位アミノ酸もＬｅｕかＰｈｅ残基のいずれかを表示する「Ｘ」で示されている。図４Ｄは、ｈＲＳＶＳ２（配列番号２０）、Ｍｅｒｃｋ株２８７（配列番号２２）およびｐ１７（配列番号２４）由来のＬタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。下線１本で示されたアミノ酸はＭｅｒｃｋ２８７とｐ１７株の両方とｈＲＳＶＳ２株との間におけるＬタンパク質の相違を示している。下線２本で示されたアミノ酸はｈＲＳＶＳ２とＭｅｒｃｋ２８７株の両方とｐ１７株との間における相違を示している。配列番号２４の第１４８位アミノ酸はＡｓｐかＡｌａ残基のいずれかを表示する「Ｘ」で示されている。第２０５４位アミノ酸もＬｅｕかＰｈｅ残基のいずれかを表示する「Ｘ」で示されている。図４Ｅは、ｈＲＳＶＳ２（配列番号２０）、Ｍｅｒｃｋ株２８７（配列番号２２）およびｐ１７（配列番号２４）由来のＬタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。下線１本で示されたアミノ酸はＭｅｒｃｋ２８７とｐ１７株の両方とｈＲＳＶＳ２株との間におけるＬタンパク質の相違を示している。下線２本で示されたアミノ酸はｈＲＳＶＳ２とＭｅｒｃｋ２８７株の両方とｐ１７株との間における相違を示している。配列番号２４の第１４８位アミノ酸はＡｓｐかＡｌａ残基のいずれかを表示する「Ｘ」で示されている。第２０５４位アミノ酸もＬｅｕかＰｈｅ残基のいずれかを表示する「Ｘ」で示されている。図４Ｆは、ｈＲＳＶＳ２（配列番号２０）、Ｍｅｒｃｋ株２８７（配列番号２２）およびｐ１７（配列番号２４）由来のＬタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。下線１本で示されたアミノ酸はＭｅｒｃｋ２８７とｐ１７株の両方とｈＲＳＶＳ２株との間におけるＬタンパク質の相違を示している。下線２本で示されたアミノ酸はｈＲＳＶＳ２とＭｅｒｃｋ２８７株の両方とｐ１７株との間における相違を示している。配列番号２４の第１４８位アミノ酸はＡｓｐかＡｌａ残基のいずれかを表示する「Ｘ」で示されている。第２０５４位アミノ酸もＬｅｕかＰｈｅ残基のいずれかを表示する「Ｘ」で示されている。図４Ｇは、ｈＲＳＶＳ２（配列番号２０）、Ｍｅｒｃｋ株２８７（配列番号２２）およびｐ１７（配列番号２４）由来のＬタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す。下線１本で示されたアミノ酸はＭｅｒｃｋ２８７とｐ１７株の両方とｈＲＳＶＳ２株との間におけるＬタンパク質の相違を示している。下線２本で示されたアミノ酸はｈＲＳＶＳ２とＭｅｒｃｋ２８７株の両方とｐ１７株との間における相違を示している。配列番号２４の第１４８位アミノ酸はＡｓｐかＡｌａ残基のいずれかを表示する「Ｘ」で示されている。第２０５４位アミノ酸もＬｅｕかＰｈｅ残基のいずれかを表示する「Ｘ」で示されている。図５は、各ウイルスを鼻腔内に接種されたコットンラットから得られた鼻および肺標本の両方における、野生型ｈＲＳＶＡ２株（ＨｕａｎｇおよびＷｅｔｚ、１９８２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４３：１５０）、Ｍｅｒｃｋ株２８７の継代３（ｐ３）およびＭｅｒｃｋ株２８７の継代１７（ｐ１７）のウイルス力価（ｐｆｕ／ｇ組織重量）の比較を示す。図６は、各ウイルスを鼻腔内経路および気管内経路の組合せで接種されたアフリカミドリザルから得られた鼻および肺標本の両方における、野生型ｈＲＳＶＡ２株、Ｍｅｒｃｋ株２８７の継代３（ｐ３）およびＭｅｒｃｋ株２８７の継代１７（ｐ１７）のウイルス力価（ｐｆｕ／ｇ組織重量）の比較を示す。図７は、各ウイルスを鼻腔内に接種されたコットンラットから得られた鼻および肺標本の両方における、Ｍｅｒｃｋ株２８７の継代３（ｐ３）、継代５（ｐ５）、継代１０（ｐ１０）、継代１５（ｐ１５）のウイルス力価（ｐｆｕ／ｇ組織重量）の比較を示す。図８は、コットンラットにおける、ｗｔｈＲＳＶＡ２、Ｍｅｒｃｋ株２８７の継代３（ｐ３）またはＭｅｒｃｋ株２８７の継代１７（ｐ１７）による免疫後１４、２８および５６日目での、野生型ｈＲＳＶＡ２に対する血清中和（ＳＮ）抗体価の比較を示す。ラットはこれらウイルスを筋肉内投与して免疫した。図９は、野生型ｈＲＳＶＡ２、Ｍｅｒｃｋ株２８７ｐ３またはＭｅｒｃｋ株２８７ｐ１７のいずれかで最初に筋肉内免疫されたかあるいは免疫されず、その後にｗｔＡ２ウイルスの１０^５．５ｐｆｕを鼻腔内暴露されたコットンラットの鼻および肺標本中におけるウイルス力価（ｐｆｕ／ｇ組織重量）の比較を示す。図１０は、Ｍｅｒｃｋ株２８７の継代１７（ｐ１７）を免疫したかあるいは免疫しなかったアフリカミドリザルにおける、免疫２８日後での野生型ｈＲＳＶＡ２に対する鼻および肺内の血清中和（ＳＮ）抗体価の比較を示す。サルは、筋肉内免疫した。図１１は、最初にＭｅｒｃｋ株２８７ｐ１７で免疫するかあるいは免疫せずに、その後ｗｔＡ２の１０^５．５ｐｆｕを鼻腔内および気管内暴露されたアフリカミドリザルの鼻および肺標本内の平均ウイルス力価（ｐｆｕ／ｍｌ）の比較を示す。

本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染および／またはＲＳＶ関連疾患の進行に対するワクチンとして使用するための生弱毒化ＲＳＶに関する。本明細書に開示されるウイルスは、対象、好ましくはヒト、に投与された場合に、非病原性であるが実質的に野生型ＲＳＶの抗原性および免疫原性特性を維持しているように弱毒化されている。したがって、本明細書に開示される弱毒化ウイルスは、接種された哺乳動物において野生型ウイルスによって起こる呼吸器の病的症状を誘発することなく防御免疫応答を刺激するために有用である。

Ｉ．生弱毒化ＲＳＶ
本明細書に記載される生弱毒化ＲＳＶウイルスはｈＲＳＶＡ型株（以後「Ｍｅｒｃｋ株２８７」、「株２８７」または「ｐ０．」と称する）を連続して継代することによって同定された。Ｍｅｒｃｋ株２８７は、ＧＭＫ細胞で最初に２回増幅されたＲＳＶ株に由来する。この最初の増幅の後、当該ウイルスはヒトニ倍体細胞株ＷＩ−３８中において更に５回の継代を経ている。この５回継代材料は、Ｍｅｒｃｋ株２８７と命名され、配列が決定されて、弱毒化の既知遺伝子マーカーについて遺伝学的に野生型であり且つ表現型も野生型であることが示された（後述の実施例参照）。

Ｍｅｒｃｋ株２８７はＶｅｒｏＣＣＬ−８１サル腎臓細胞内において一定の多重度で継代された。一連の継代をとおしてウイルス力価は一定であり、培養中のウイルスによる細胞変性効果も終始一定であった。継代されたウイルスの弱毒化は、ｉｎｖｉｖｏげっ歯類モデルおよび霊長類モデルにおけるウイルス排出の減少を測定することによってモニターした。コットンラットモデルおよびアフリカミドリザルの両方において、継代３（ｐ３）と継代１７（ｐ１７）の間で顕著な弱毒化が認められ、ウイルス量において２〜４対数減少率を示した。ｐ１７ウイルス個体群と起源種のＭｅｒｃｋ株２８７から単離されたゲノムＤＮＡの配列を比較した結果、ｐ１７ゲノム中に複数のヌクレオチド突然変異が確認され、それらの大半はＧ、ＦおよびＬタンパク質をコードする遺伝子（以下各々Ｇ、ＦおよびＬ遺伝子と称する）の中に存在した。ｐ１７はＭｅｒｃｋ株２８７と比較して、総数２１のヌクレオチドの相違と、１１アミノ酸の相違を有している。ｐ１７由来のプラーク純化したウイルス（ｐ１７ｐｐ）は、Ｍｅｒｃｋ株２８７と比較して更に１つのヌクレオチド突然変異を有している。継代５（ｐ５）、継代１０（ｐ１０）および継代１５（ｐ１５）において配列分析を更に行い、継代過程をとおして遺伝子の変化をモニターするとともに、継代１８（ｐ１８）および継代２２（ｐ２２）において配列分析を行い、誘導された突然変異の遺伝的安定性を評価した。免疫原性および防護試験も行った。これらの試験結果は、本明細書において開示されるｐ１７株が遺伝的に安定であり、免疫原性および防御性を有し、非病原性であることを示している。したがって、本発明の生弱毒化ＲＳＶはＲＳＶ感染に起因する疾患を防御するためのワクチンとして使用し得る。

Ｍｅｒｃｋ株２８７（継代０またはｐ０）とその様々な継代株との間での配列比較の詳細な一覧が後述の実施例２および４に記される。簡単に説明すると、ｐ０、ｐ１７およびｐ１７ｐｐ（ｐ１７由来のプラーク純化ウイルス）の全長ウイルスゲノムが配列決定、比較され、同様に継代５、１０、１５および１８の標的配列についても配列決定、比較がなされた。Ｍｅｒｃｋ株２８７のゲノム配列を配列番号２５として記す。ｐ１７およびｐ１７ｐｐ株のゲノム配列を、各々配列番号２６よび配列番号９１として記す。Ｍｅｒｃｋ株２８７とｐ１７のウイルスゲノム間において相違する２１ヌクレオチドの位置および具体的なヌクレオチド突然変異を表５（後記）に列挙する（例えば、５２９５位におけるアラニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への突然変異）。ｐ１７ｐｐ株のゲノム配列は、本明細書において配列番号９１として記す。ｐ１７ｐｐのゲノム配列は、ＮＳ１タンパク質をコードする遺伝子内（ＮＳ１遺伝子のヌクレオチド１６２位）において更に非表現ヌクレオチド突然変異を有することを除けば、ｐ１７のゲノム配列と同じである。表８（後記）には、Ｍｅｒｃｋ株２８７、ｐ１７およびｐ１７ｐｐ間におけるヌクレオチドの相違が記されている。表６および／または表９（後記）には、ｐ１７とｐ１７ｐｐゲノム配列内におけるヌクレオチド突然変異の位置が列挙されるとともに、ＲＳＶ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内の各突然変異の対応する位置が示されている。例えば、ｐ１７ウイルスゲノム５２９５位の突然変異はＧ遺伝子ＯＲＦのヌクレオチド６１０位の突然変異に対応する。表６および表９は更に特定の点突然変異（あるいは点突然変異の組合せ）によってアミノ酸置換が生じるか否かと、当該置換アミノ酸の位置を記している。例えば、ｐ１７ウイルスゲノムのヌクレオチド５２９５位における突然変異によって、Ｇタンパク質のアミノ酸２０４位においてリシン（ＬＹＳ）からグルタミン酸（ＧＬＵ）へのアミノ酸置換が生じる。ｐ１７およびＭｅｒｃｋ株２８７の間における２１のヌクレオチドの相違（およびｐ１７ｐｐおよびＭｅｒｃｋ株２８７の間における２２のヌクレオチドの相違）の中において、１つのヌクレオチドの相違がウイルスゲノムの非翻訳領域内（即ち、５’非翻訳領域内のヌクレオチド１５０４６）に位置している。

ｐ１７ウイルスゲノム内において同定された親ｐ０株（Ｍｅｒｃｋ株２８７）に対する２１ヌクレオチドの相違のうち、ＲＳＶウイルスゲノムのヌクレオチド６５３８位、７１１５位、８９３７位および１４６５６位に位置する４つのヌクレオチドの相違が、継代１７に含まれるウイルス個体群内において、多型を示し得る（後述の実施例２参照）。これらの位置は配列番号２６において「ｎ」で示される。６５３８位の「ｎ」はＧまたはＡのいずれかでありえ、７１１５位の「ｎ」はＡまたはＧのいずれかでありえ、８９３７位の「ｎ」はＡまたはＣでありえ、１４６５６位の「ｎ」はＧまたはＴのいずれかでありえる。これらのヌクレオチド多型は、ＦおよびＬ遺伝子（各々配列番号１７および２３）に対応する遺伝子配列中においても「ｎ」で示され、ＦおよびＬタンパク質（各々配列番号１８および２４）に対応するタンパク質配列中においては「ｘ」で示される。多型は２つ（またはそれ以上）の遺伝子の形態が１つの個体群の中に存在することを意味し、いずれの形態もあまりに多く存在するため、単に新規であるとの理由のみで重要でない突然変異と認識することはできない。これらの利用可能性がある多型のうちの２つがＦタンパク質のコード領域内に位置し、他の２つがＬタンパク質のコード領域内に位置している。これらの多型はシークエンシングクロマトグラムにおいてはっきりと表れており、少なくとも２つのヌクレオチドに対応する二重のピークによって示される。この多型の存在は、配列分析のためにＤＮＡが抽出されたｐ１７ウイルス集団の中にあるウイルスの個体群は、均一なウイルス個体群ではないことを示している。これら４つのヌクレオチド多型はいずれもアミノ酸置換の原因となる（後述の実施例２参照）。

ｐ１７ＲＳＶ株はクローン集団、ｐ１７ｐｐになるまでプラーク純化し、配列を決定した（後述の実施例４参照）。ｐ１７ｐｐゲノム内のＮＳ１タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド１６２における非表現突然変異の同定に加えて、ｐ１７のＬおよびＦタンパク質をコードする遺伝子内において見出された多型を解明した（後記の表８および９参照）。かくして、ｐ１７ｐｐウイルスのＦおよびＬタンパク質をコードする遺伝子が本明細書において各々配列番号９２および配列番号９４として記され、コードされるタンパク質が配列番号９３および配列番号９５として記される。

（後述の実施例２の中にある）表７は、本明細書に記されるＭｅｒｃｋ株２８７の継代を経て誘導された突然変異の進行過程を示す。例えば、継代５（ｐ５）ではＲＳＶゲノムのヌクレオチド９５４位に位置する１つのヌクレオチド突然変異のみが認められる。継代が進むにしたがってヌクレオチド突然変異の数が増え、ｐ１７内の２１ヌクレオチド突然変異のうち少なくとも２０がｐ１５までに存在することとなる。ｐ１７において見出された、５’非翻訳領域内のウイルスゲノムのヌクレオチド１５０４６に位置する２１番目のヌクレオチド相違はｐ１５において存在するであろうが、ｐ１５ウイルスゲノムの当領域を含む遺伝子断片の配列決定は行わなかった。

図７に示される結果は、ｐ３、ｐ５、ｐ１０およびｐ１５のｉｎｖｉｖｏ複製を比較することにより、ウイルス継代と弱毒化程度の関係を強調している（後述の実施例３も参照のこと）。継代５（ｐ５）はｐ３に比較してすでに複製の減弱を示している。継代１０（ｐ１０）および１５（ｐ１５）は、複製の更なる減弱を示し、ｐ１０とｐ１５の間で複製の顕著な減弱が示される。ｐ１５ウイルスは上記のｐ１７ウイルスと同様に弱毒化されていると考えられる（図５参照）。ｐ１０とｐ１５内に存在する突然変異の整列を比較すると、ｐ１５はＦおよびＬタンパク質のコーディング領域内に位置する２つの更なるヌクレオチド相違を有しているのみである。したがって、如何なる特定の理論にしばられるものではないが、Ｆおよび／またはＬタンパク質のコーディング領域の突然変異がＲＳＶの弱毒化に特に重要である可能性がある。ｐ１７のプラーク純化された誘導体、ｐ１７ｐｐの弱毒化の解析によって、このウイルスは親ｐ１７株と同様に弱毒化されていることが示された（後述の実施例４参照）。

表１は、Ｍｅｒｃｋ株２８７（ＭＲＫ２８７）、ｐ１７、ｐ１７ｐｐおよび公表されている野生型種ｈＲＳＶＳ２（ＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．Ｕ３９６６２；Ｔｏｌｌｅｙら、１９９６、Ｖａｃｃｉｎｅ１４：１６３７−１６４６）のＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ、ＦおよびＬ遺伝子のオープンリーディングフレームならびにコードされるタンパク質の配列番号を列挙する。

ＲＳＶは非分節型、マイナス一本鎖ＲＮＡゲノムである。そのため、遺伝子断片の再集合は起こらない。しかし、ＲＮＡ構成能および編集能を欠いているＲＮＡポリメラーゼに依存しているために、ＲＳＶゲノムは極めて変異しやすい。様々なＲＳＶ遺伝子の配列を研究することにより、ヒトＲＳＶが２つの大きなグループ（ＡおよびＢ）に分けられることが確認されているが、各々のグループ内においても多くの変異体や系統が同定されている（例えばＰｅｒｅｔら、１９９８、ＪＧｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９：２２２１−２２２９参照）。抗原性が異なる２種類のヒトＲＳＶサブグループの間では、アミノ酸配列の同一性は９６％（Ｎタンパク質について）から５３％（Ｇタンパク質について）の範囲にある（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９８７，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．ＳｃＬＵＳＡ８４：５６２５−５６２９）。グループＡ内とグループＢ内においては、Ｇタンパク質はそれぞれ２０％未満と９％のアミノ酸多様性を示す。（Ｃａｎｅら、１９９１、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ７２：６４９−３５７；Ｓｕｌｌｅｎｄｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ６５：５４２５−５４３４）。

この遺伝的不均一性の例として、図１、２、３および４において、各々Ｍｅｒｃｋ株２８７、ｐ１７およびｈＲＳＶＳ２由来のＮＳ２、Ｇ、ＦおよびＬタンパク質のアライメントが示される。図１中のＮＳ２タンパク質のアライメントに示されるように、Ｍｅｒｃｋ株２８７と本明細書に記載されるｐ１７継代株の間にはアミノ酸相違は存在しないが、Ｍｅｒｃｋ株２８７およびｐ１７の両方と野生型ｈＲＳＶＳ２株との間には２つのアミノ酸相違が存在する（図１において下線で示す）。しかし、Ｍｅｒｃｋ株２８７とｈＲＳＶＳ２はいずれも表現型は野生型であり、したがってＭｅｒｃｋ株２８７およびｐ１７の両方とｈＲＳＶＳ２との間に存在するアミノ酸相違はｐ１７またはｐ１７ｐｐの弱毒化を誘導するものでも、弱毒化に寄与するものでもないことに注目することが重要である。

同様に、Ｇ、ＦおよびＬタンパク質配列内においてＭｅｒｃｋ株２８７とｐ１７の両方と野生型ｈＲＳＶＳ２株との間にアミノ酸相違が存在する（各々図２、３および４において下線１本で示されたアミノ酸参照）。しかし、Ｍｅｒｃｋ株２８７とｐ１７のＧ、ＦおよびＬタンパク質配列の間にもアミノ酸相違が存在する（各々図２、３および４において下線２本で示されたアミノ酸参照）。これらの下線２本で示されたアミノ酸相違のうち１つ以上がｐ１７およびｐ１７ｐｐに対して証明された弱毒表現型に関与していると考えられる。

したがって、本発明は生弱毒化ＲＳＶに関するものであり、当該生弱毒化ＲＳＶは、Ｍｅｒｃｋ株２８７と比較してｐ１７および／またはｐ１７ｐｐにおいて記載されたヌクレオチド突然変異を１つ以上含み、および／または、本明細書でｐ１７において記載されたアミノ酸突然変異を１つ以上コードする、改変されたウイルスゲノムを有している。１つの実施態様では、当該弱毒化ＲＳＶのウイルスゲノムは例えば、配列番号２５で示されたＭｅｒｃｋ株２８７のゲノム配列またはその他の野生型の表現型を有するＲＳＶ株（例えばｈＲＳＶＳ２）に比較して、更なる相違ヌクレオチドを含むか、および／または、更なる相違アミノ酸をコードすることができ、ここで当該更なるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸突然変異は実質的に弱毒表現型に関与しないものである。

他の実施態様において、本発明の生弱毒化ＲＳＶは、弱毒化の既知遺伝子マーカー（例えばＣｏｎｎｅｒｓら、１９９５、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２０８：４７８−４８４；Ｃｒｏｗｅら、１９９６、ＶｉｒｕｓＧｅｎｅｓ１３：２６９−２７３；Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅら、１９９６、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２２５：４１９−４２２；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、１９９８、ＪＶｉｒｏｌ．７２：４４６７−４４７１参照）における更なる突然変異に加えて、ｐ１７および／ｐ１７ｐｐにおいて記載されたヌクレオチドおよび／またはアミノ酸突然変異を１つ以上含んでいてもよい。

ＩＩ．種々の実施態様の例
第１の実施態様として、本発明は生弱毒化呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に関するものであり、当該ウイルスに含まれるウイルスゲノムは、Ｇ遺伝子にコードされるタンパク質の２０４位のグルタミン酸、Ｇ遺伝子にコードされるタンパク質の２０５位のグルタミン酸、Ｇ遺伝子にコードされるタンパク質の２１１位のアラニン、Ｇ遺伝子にコードされるタンパク質の２１３位のグルタミン酸、Ｇ遺伝子にコードされるタンパク質の２２１位のグリシン、Ｇ遺伝子にコードされるタンパク質の２２３位のグリシン、Ｇ遺伝子にコードされるタンパク質の２３２位のグリシン、Ｆ遺伝子にコードされるタンパク質の２９４位のリシン、Ｆ遺伝子にコードされるタンパク質の４８６位のグリシン、Ｌ遺伝子にコードされるタンパク質の１４８位のアラニン、およびＬ遺伝子にコードされるタンパク質の２０５４位のフェニルアラニンからなる群より選択される１以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードする。したがって、この実施態様において、本発明の生弱毒化ＲＳＶはこの段落で言及されているアミノ酸残基の１つ、全てまたはサブセットを含む。列挙されたアミノ酸残基の位置は、ウイルスゲノム内の遺伝子にコードされる特定のアミノ酸配列内におけるそれらの位置により示される。Ｇ、ＦおよびＬタンパク質はそれぞれＧ、ＦおよびＬ遺伝子によってコードされる。

更なる実施態様において、本発明の生弱毒化ＲＳＶは、ＮＳ１遺伝子のヌクレオチド１６２位におけるアデニン、ＮＳ２遺伝子のヌクレオチド３２７位におけるアデニン、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６１０位におけるグアニン、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６１３位におけるグアニン、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６３０位におけるグアニン、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６３１位におけるグアニン、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６３７位におけるグアニン、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６３９位におけるグアニン、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６５４位におけるグアニン、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６６１位におけるグアニン、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６６２位におけるグアニン、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６６６位におけるグアニン、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６６７位におけるグアニン、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６６８におけるグアニン位、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６７５位におけるグアニン、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６９５位におけるグアニン、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６９６位におけるグアニン、Ｆ遺伝子のヌクレオチド８８０位におけるアデニン、Ｆ遺伝子のヌクレオチド１４５７位におけるグアニン、Ｌ遺伝子のヌクレオチド４４３位におけるシトシン、およびＬ遺伝子のヌクレオチド６１６２位におけるチミンからなる群より選択される１つ以上のヌクレオチドを含むウイルスゲノムを含む。ウイルスゲノムはこれら特定のヌクレオチドの１つ、全てまたは部分集合を含むことができる。

上記の特定されたアミノ酸残基および／またはヌクレオチドの１つ、全てまたは部分集合が本発明の生弱毒化ＲＳＶ内に含まれ得る。上記のアミノ酸残基およびヌクレオチドは、本明細書に記載されるｐ１７およびｐ１７ｐｐ内に存在する具体的なアミノ酸残基およびヌクレオチドの位置に対応している（後記の表５、６、８および９参照）。例えば、この実施態様に含まれる生弱毒化ＲＳＶは、Ｆ遺伝子にコードされるタンパク質の２９４位におけるリシン、Ｆ遺伝子にコードされるタンパク質の４８６位におけるグリシン、Ｌ遺伝子にコードされるタンパク質の１４８位におけるアラニン、およびＬ遺伝子にコードされるタンパク質の２０５４位におけるフェニルアラニンを含み得る。上述したように、本明細書において提示される結果は、ＦおよびＬタンパク質内の指定されたアミノ酸残基が、ｐ１７およびｐ１７ｐｐの弱毒化表現型に実質的に関与している。

第二の実施態様において、本発明は生弱毒化ＲＳＶに関するものであり、当該ウイルスに含まれるウイルスゲノムは、非弱毒化ＲＳＶウイルスゲノムに比較して１以上のヌクレオチド突然変異を含み、ここで１以上のヌクレオチド突然変異によって１以上のアミノ酸突然変異が生じ、この１以上のアミノ酸突然変異はＧ遺伝子にコードされる各タンパク質の２０４、２０５、２１１、２１３、２２１、２２３および２３２位、Ｆ遺伝子にコードされる各タンパク質の２９４および４８６位、Ｌ遺伝子にコードされる各タンパク質の１４８および２０５４位からなる群より選択されるアミノ酸位に位置している。非弱毒化ＲＳＶ株は遺伝的および／または表現型の上で野生型であることができ、参照配列を提示する。アミノ酸突然変異の位置は、ウイルスゲノム内の遺伝子によってコードされる特定のアミノ酸配列の中における位置によって示される。Ｇ、ＦおよびＬタンパク質は各々Ｇ、ＦおよびＬ遺伝子によってコードされる。上記のアミノ酸突然変異は、遺伝的に野生型であるＲＳＶ株（ＲＳＶＳ２株）および表現型の上で野生型であるＲＳＶ株（Ｍｅｒｃｋ株２８７）と比較した場合に本明細書に記載されるｐ１７およびｐ１７ｐｐ内に見出されるアミノ酸置換の位置に対応している（後記の表６および９参照）。

更なる実施態様において、Ｇ遺伝子にコードされるタンパク質の２０４位におけるアミノ酸突然変異はグルタミン酸へと変わる突然変異であり、Ｇ遺伝子にコードされるタンパク質の２０５位におけるアミノ酸突然変異はグルタミン酸へと変わる突然変異であり、Ｇ遺伝子にコードされるタンパク質の２１１位におけるアミノ酸突然変異はアラニンへと変わる突然変異であり、Ｇ遺伝子にコードされるタンパク質の２１３位におけるアミノ酸突然変異はグルタミン酸へと変わる突然変異であり、Ｇ遺伝子にコードされるタンパク質の２２１位におけるアミノ酸突然変異はグリシンへと変わる突然変異であり、Ｇ遺伝子にコードされるタンパク質の２２３位におけるアミノ酸突然変異はグリシンへと変わる突然変異であり、Ｇ遺伝子にコードされるタンパク質の２３２位におけるアミノ酸突然変異はグリシンへと変わる突然変異であり、Ｆ遺伝子にコードされるタンパク質の２９４位におけるアミノ酸突然変異はリシンへと変わる突然変異であり、Ｆ遺伝子にコードされるタンパク質の４８６位のアミノ酸突然変異はグリシンへと変わる突然変異であり、Ｌ遺伝子にコードされるタンパク質の１４８位のアミノ酸突然変異はアラニンへと変わる突然変異であり、およびＬ遺伝子にコードされるタンパク質の２０５４位におけるアミノ酸突然変異はフェニルアラニンへと変わる突然変異である。

更なる実施態様において、Ｇ遺伝子にコードされるタンパク質の２０４位におけるアミノ酸突然変異はＬｙｓ２０４Ｇｌｕであり、Ｇ遺伝子にコードされるタンパク質の２０５位におけるアミノ酸突然変異はＬｙｓ２０５Ｇｌｕであり、Ｇ遺伝子にコードされるタンパク質の２１１位におけるアミノ酸突然変異はＴｈｒ２１１Ａｌａであり、Ｇ遺伝子にコードされるタンパク質の２１３位におけるアミノ酸突然変異はＬｙｓ２１３Ｇｌｕであり、Ｇ遺伝子にコードされるタンパク質の２２１位におけるアミノ酸突然変異はＬｙｓ２２１Ｇｌｙであり、Ｇ遺伝子にコードされるタンパク質の２２３位におけるアミノ酸突然変異はＬｙｓ２２３Ｇｌｙであり、Ｇ遺伝子にコードされるタンパク質の２３２位におけるアミノ酸突然変異はＧｌｕ２３２Ｇｌｙであり、Ｆ遺伝子にコードされるタンパク質の２９４位におけるアミノ酸突然変異はＧｌｕ２９４Ｌｙｓであり、Ｆ遺伝子にコードされるタンパク質の４８６位におけるアミノ酸突然変異はＡｓｐ４８６Ｇｌｙであり、Ｌ遺伝子にコードされるタンパク質の１４８位におけるアミノ酸突然変異はＡｓｐｌ４８Ａｌａであり、およびＬ遺伝子にコードされるタンパク質の２０５４位におけるアミノ酸突然変異はＬｅｕ２０５４Ｐｈｅである。例として、Ｇタンパク質について使用される表示、Ｌｙｓ２０４Ｇｌｕは、Ｇタンパク質のアミノ酸位２０４におけるリシン（Ｌｙｓ）アミノ酸残基がグルタミン酸（Ｇｌｕ）アミノ酸残基で置換されていることを示している。アミノ酸残基の略語は後述する。上述したアミノ酸突然変異は本明細書において記載するｐ１７およびｐ１７ｐｐ内に存在するアミノ酸置換に対応している（後記の表６および表９参照）。

他の実施態様において、ウイルスゲノムは上記アミノ酸突然変異の全てまたは部分集団のいずれかを生じるヌクレオチド突然変異を含む。例えば、本実施態様に含まれる弱毒化ＲＳＶのウイルスゲノムは、ＦおよびＬ遺伝子にコードされるタンパク質内の提示されたアミノ酸位置の１つまたは全てにおいてアミノ酸突然変異を生じるヌクレオチド突然変異を含み得る。上述したように、本明細書において示される結果は、ＦおよびＬタンパク質内の突然変異が実質的にｐ１７およびｐ１７ｐｐの弱毒表現型に寄与していることを示唆している。

更なる実施態様において、上記の１以上のアミノ酸突然変異を生じる弱毒化ＲＳＶのウイルスゲノムに存在する１以上のヌクレオチド突然変異は、Ｇ遺伝子の６１０、６１３、６３１、６３７、６３９、６６１、６６２、６６７、６６８、６９５および６９６位、Ｆ遺伝子の８８０および１４５７位ならびにＬ遺伝子の４４３および６１６２位からなる群より選択されるヌクレオチド位に位置する。この実施態様において、アミノ酸置換を生じるためには、２つのヌクレオチド位が突然変異する必要のある場合がある。ヌクレオチド突然変異の位置は、ウイルスゲノム内に含まれる特定のＯＲＦ内におけるそれらの位置によって示される。あるいは、ヌクレオチド突然変異の位置は、ウイルスゲノム自体の内部におけるそれらの位置によって示され得る。例えば、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６１０位は、ＲＳＶゲノムのヌクレオチド５２９５位に対応している。本明細書に記載されているＯＲＦ内の特定の位置における突然変異とそれに対応するＲＳＶゲノム内における位置との関係は、後記の表６および表９に示される。

更なる実施態様においては、ウイルスゲノムは、ＮＳ２遺伝子の３２７位、Ｇ遺伝子の６３０位、Ｇ遺伝子の６５４位、Ｇ遺伝子の６６６位およびＧ遺伝子の６７５位からなる群より選択されるヌクレオチド位に位置する１以上の非表現突然変異を更に含む。ウイルスゲノムは更にＮＳ１遺伝子のヌクレオチド１６２位における非表現突然変異を更に含み得る。ウイルスゲノムは、これら非表現突然変異の全てまたは部分集団を含み得る。他の実施態様において、ウイルスゲノムは上述した（非表現および表現）ヌクレオチド突然変異の全てを含む。

他の実施態様において、ウイルスゲノムは、非弱毒化あるいは不完全弱毒化ＲＳＶ株のいずれかのウイルスゲノムに比較して１以上のヌクレオチド突然変異を含み、ここで、この１以上の突然変異はＮＳ１遺伝子の１６２位、ＮＳ２遺伝子の３２７位、Ｇ遺伝子の６１０、６１３、６３０、６３１、６３７、６３９、６５４、６６１、６６２、６６６、６６７、６６８、６７５、６９５および６９６位、Ｆ遺伝子の８８０および１４５７位ならびにＬ遺伝子の４４３および６１６２位からなる群より選択されるヌクレオチド位に位置している。上記の非弱毒化株は、遺伝的および／表現型の上から野生型ＲＳＶであり得る。更なる実施態様において、ウイルスゲノムは提示された全てのヌクレオチド位において突然変異を含む。

更なる実施態様において、ＮＳ１遺伝子のヌクレオチド１６２位におけるヌクレオチド突然変異はＴ２６０Ａであり、ＮＳ２のヌクレオチド３２７位におけるヌクレオチド突然変異はＧ３２７Ａであり、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６１０位におけるヌクレオチド突然変異はＡ６１０Ｇであり、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６１３位におけるヌクレオチド突然変異はＡ６１３Ｇであり、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６３０位におけるヌクレオチド突然変異はＡ６３０Ｇであり、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６３１位におけるヌクレオチド突然変異はＡ６３１Ｇであり、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６３７位におけるヌクレオチド突然変異はＡ６３７Ｇであり、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６３９位におけるヌクレオチド突然変異はＡ６３９Ｇであり、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６５４位におけるヌクレオチド突然変異はＡ６５４Ｇであり、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６６１位におけるヌクレオチド突然変異はＡ６６１Ｇであり、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６６２位におけるヌクレオチド突然変異はＡ６６２Ｇであり、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６６６位におけるヌクレオチド突然変異はＡ６６６Ｇであり、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６６７位におけるヌクレオチド突然変異はＡ６６７Ｇであり、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６６８位におけるヌクレオチド突然変異はＡ６６８Ｇであり、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６７５位におけるヌクレオチド突然変異はＡ６７５Ｇであり、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６９５位におけるヌクレオチド突然変異はＡ６９５Ｇであり、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６９６位におけるヌクレオチド突然変異はＡ６９６Ｇであり、Ｆ遺伝子のヌクレオチド８８０位におけるヌクレオチド突然変異はＧ８８０Ａであり、Ｆ遺伝子のヌクレオチド１４５７位におけるヌクレオチド突然変異はＡ１４５７Ｇであり、Ｌ遺伝子のヌクレオチド４４３位におけるヌクレオチド突然変異はＡ４４３Ｃであり、Ｌ遺伝子のヌクレオチド６１６２位におけるヌクレオチド突然変異はＧ６１６２Ｔである。例として、用語「Ｇ３２７Ａ」は、この実施態様における弱毒化ＲＳＶのＮＳ２遺伝子の説明において用いられる場合には、この位置におけるグアニンヌクレオチドがアデニン（Ａ）ヌクレオチドに突然変異したことを意味している。チミンおよびシトシンのヌクレオチド略称はそれぞれ「Ｔ」および「Ｃ」である。ウイルスゲノムは、提示されたヌクレオチド位の全てまたは部分集合においてヌクレオチド突然変異を含み得る。

更なる実施態様において、本発明は生弱毒化呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に関するものであり、当該ウイルスに含まれるウイルスゲノムは、非弱毒化または不完全弱毒化ＲＳＶ株のいずれかのウイルスゲノムに比較して１以上のヌクレオチド突然変異を含み、ここで１以上のヌクレオチド突然変異はＲＳＶゲノムの２６０、９５４、５２９５、５２９８、５３１５、５３１６、５３２２、５３２４、５３３９、５３４６、５３４７、５３５１、５３５２、５３５３、５３６０、５３８０、５３８１、６５３８、７１１５、８９３７および１４６５６位からなる群より選択されるヌクレオチド位に位置している。上記の各ヌクレオチド突然変異は本明細書に記載されるＲＳＶｐ１７および／またはｐ１７ｐｐ株内に存在する。更なる実施態様において、この改変されたウイルスゲノムは記載された全てのヌクレオチド位において突然変異を有している。

ＲＳＶタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、ＲＳＶゲノム配列の全長またはＲＳＶタンパク質のアミノ酸配列のいずれかの内部における特定の位置について記載する場合は、正確な位置は抗原性サブグループ（ＡおよびＢ）のグループ内および／またはグループ間ならびにウイルス種（例えばヒトウイルス対ウシウイルス）間でＲＳＶ株毎に若干の変動があり得ることは当然に理解される。よって、複数の参照配列をアラインすることによるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の比較分析を用いて、本明細書において記載される具体的な位置に対応する的確なヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の位置を特定することができる。したがって、具体的なアミノ酸またはヌクレオチドの位置を記す上記実施態様および以下の実施態様においては、参照配列の配列アライメントおよび分析ならびに参照配列との配列アライメントおよび分析によって決定される、それらの具体的に示された位置に対応する位置における１以上のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸残基および／または１以上のヌクレオチド突然変異および／またはアミノ酸突然変異を含むウイルスゲノムを含む生弱毒化ＲＳＶが含まれる。

第三の実施態様においては、本発明の弱毒化ＲＳＶのウイルスのゲノムは、野生型のＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ、Ｆおよび／またはＬタンパク質（例えば、ＲＳＶＳ２ＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ、Ｆおよび／またはＬタンパク質配列にそれぞれ対応する配列番号８８、２、８、１４および２０）に関連付けられるＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ、Ｆおよび／Ｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、これらＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ、Ｆおよび／またはＬタンパク質配列は、具体的なウイルスタンパク質のｐ１７および／またはｐ１７ｐｐアミノ酸配列と野生型アミノ酸配列との間で相違することが特定されているアミノ酸またはアミノ酸突然変異を、１つまたは組み合わせて含んでいる。ここで、当該関連付けられた配列は、異なったアミノ酸またはアミノ酸突然変異の１つまたは組合せの外側領域内において当該野生型ＲＳＶタンパク質配列と少なくとも９５％、好ましくは９９％の配列同一性を有している。

更なる実施態様において、本発明の弱毒化生ＲＳＶのウイルスゲノムは、野生型のＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ、Ｆおよび／またはＬ遺伝子（例えば、ＲＳＶＳ２ＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ、Ｆおよび／またはＬ遺伝子配列にそれぞれ対応する配列番号８７、１、７、１３および１９）に関連付けられるＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ、Ｆおよび／またはＬ遺伝子のヌクレオチド配列を含み、ここで、これらＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ、Ｆおよび／またはＬ遺伝子配列は具体的な遺伝子のｐ１７および／またはｐ１７ｐｐヌクレオチド配列と野生型ヌクレオチド配列との間で相違することが特定されているヌクレオチドまたはヌクレオチド突然変異を１つまたは組み合わせて含んでいる。ここで、当該関連付けられた配列は、異なったヌクレオチドまたはヌクレオチド突然変異の１つまたは組合せの外側領域内において当該野生型ＲＳＶ遺伝子配列と少なくとも９５％、好ましくは９９％の配列同一性を有している。

第四の実施態様においては、本発明に含まれる生弱毒化ＲＳＶのウイルスゲノムはＧ、Ｆおよび／またはＬタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、ここで、当該タンパク質はそれぞれ配列番号１２、配列番号１８または配列番号９３および配列番号２４または配列番号９５に記載されるアミノ酸配列からなる。配列番号１２、１８および２４は本明細書に記載されるｐ１７内のＧ、ＦおよびＬタンパク質のアミノ酸配列を示す（図２、３および４参照）。ＦおよびＬタンパク質内の多型は対応する記載配列（配列番号１８および２４）内において示される。したがって、更なる実施態様において、ｐ１７のＦタンパク質（配列番号１８）の２９４位はＬｙｓ残基であり、および／またはｐ１７のＦタンパク質の４８６位はＧｌｙ残基である。更なる実施態様において、ｐ１７のＬタンパク質（配列番号２４）の１４８位はＡｌａ残基であり、および／またはｐ１７のＬタンパク質の２０５４位はＰｈｅ残基である。配列番号９３と配列番号９５はそれぞれｐ１７のプラーク純化した誘導体であるｐ１７ｐｐ内のＦおよびＬタンパク質のアミノ酸配列を示している。これら配列内の多型はプラーク純化されたウイルス内においては消失しており、配列番号９３および９５において示される。

更なる実施態様において、生弱毒化ＲＳＶのウイルスゲノムはＧ、Ｆおよび／Ｌタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、これらタンパク質はそれぞれ配列番号１２、配列番号１８または配列番号９３および配列番号２４または配列番号９５に記載されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列からなる。

第五の実施態様においては、本明細書に記載される生弱毒化ＲＳＶのウイルスゲノムはＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ、Ｆおよび／またはＬタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、これらオープンリーディングフレームの１以上はそれぞれ配列番号８９または配列番号９０、配列番号５、配列番号１１、配列番号１７または配列番号９２および／または配列番号２３または配列番号９４に記載されるヌクレオチド配列からなる。配列番号８９、５、１１、１７および２３はそれぞれ本明細書に記載されるｐ１７内のＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ、ＦおよびＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。ｐ１７のＦおよびＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列は上述したヌクレオチド多型を含む。したがって、更なる実施態様において、ｐ１７のＦ遺伝子（配列番号１７）の８８０位はアデニンヌクレオチドであり、および／またはｐ１７のＦ遺伝子の１４５７位はグアニンヌクレオチドである。更なる実施態様において、ｐ１７のＬ遺伝子（配列番号２３）の４４３位はシトシンヌクレオチドであり、および／またはｐ１７のＬ遺伝子の６１６２位はチミンヌクレオチドである。配列番号９０、５、１１、９２および９４は、それぞれｐ１７ｐｐ内のＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ、ＦおよびＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。ｐ１７のＦおよびＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列内の多型はプラーク純化したウイルス内において消失しており、配列番号９２および９４において示される。

更なる実施態様において、生弱毒化ＲＳＶのウイルスゲノムは、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ、Ｆおよび／またはＬ遺伝子に対応するオープンリーディングフレームを含み、これらはそれぞれ配列番号９０、配列番号５、配列番号１１、配列番号１７もしくは配列番号９２および／または配列番号２３もしくは配列番号９４に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であり、本明細書においてｐ１７および／またはｐ１７ｐｐと野生型ヌクレオチド配列の間で相違することが確認されたこれらＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ、Ｆおよび／Ｌ遺伝子内の特定のヌクレオチドのいずれか１つまたはそれらの組合せが存在している。

第六の実施態様においては、上記各実施態様において記載された生弱毒化ＲＳＶのウイルスゲノムが更に、ウイルスゲノム内において１５０４６位のシトシン、１５０４６位の突然変異、１５０６４位におけるシトシンへの突然変異またはＡ１５０４６Ｃの突然変異のいずれかを含んでいる。ヌクレオチド１５０４６位はＲＳＶゲノムの５’非翻訳領域内に位置している。

第七の実施態様においては、上記各実施態様において記載された生弱毒化ＲＳＶのウイルスゲノムが、ＲＳＶの弱毒化の既知遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸突然変異またはＲＳＶ（好ましくはヒトＲＳＶ）に弱毒表現型を付与することが知られているヌクレオチドおよび／またはアミノ酸のいずれかを更に含む。本実施態様には、例えば化学的突然変異、冷順応または遺伝子組み換え（例えば部位特異的突然変異）によって更に弱毒化された上記実施態様に記載されたもの由来の株を含む、生弱毒化ＲＳＶの誘導株の全てが含まれる。したがって、本明細書においてｐ１７およびｐ１７ｐｐの弱毒化に寄与していることが記載されているヌクレオチドおよび／またはアミノ酸を導入することにより、当該技術分野で既に知られている不完全な弱毒化ＲＳＶ突然変異株を更に弱毒化（例えばより完全な弱毒化）することができる。
第八の実施態様においては、上記各実施態様に記載された生弱毒化ＲＳＶはＲＳＶの抗原性サブグループＡまたはＢのいずれかに属している。更なる実施態様においては、生弱毒化ＲＳＶはヒトＲＳＶである。

第九の実施態様においては、本発明の生弱毒化ＲＳＶのウイルスゲノムは、配列番号２６または配列番号９１に示されるヌクレオチド配列を含む。配列番号２６は、本明細書に記載されるｐ１７のウイルスゲノムのヌクレオチド配列を示している。配列番号２６のヌクレオチド６５３８位、７１１５位、８９３７位および１４６５６位は多型を含むことが見込まれる。したがって、配列番号２６内のこれらの位置におけるヌクレオチドはＧまたはＡ（６５３８位）、ＡまたはＧ（７１１５位）、ＡまたはＣ（８９３７位）およびＧまたはＴ（１４６５６位）のいずれか一方である。更なる実施態様において、６５３８位はアデニンヌクレオチドであり、７１１５位はグアニンヌクレオチドであり、８９３７位はシトシンヌクレオチドであり、および／または１４６５６位はチミンヌクレオチドである。配列番号９１は、本明細書に記すｐ１７ｐｐのウイルスゲノムのヌクレオチド配列を示す。更なる実施態様において、生弱毒化ＲＳＶは配列番号２６または配列番号９１に示されるヌクレオチド配列に対して、ゲノム全体に亘って少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であり、本明細書においてｐ１７および／またはｐ１７ｐｐヌクレオチド配列と野生型ヌクレオチド配列の間で相違することが同定された特定のヌクレオチドのうちの１つまたはそれらの組合せが存在している。

第十の実施態様において、本発明の弱毒化生ＲＳＶは、上記各実施態様に記載された弱毒化ＲＳＶ内に含まれる配列と実質的に類似する変異タンパク質および／または核酸配列を含み、当該弱毒化ＲＳＶは上記各実施態様に記載された弱毒化ＲＳＶに対応し、実質的に同一の物理的／構造的特性および機能的特性の両方を有するものである。１つの実施態様において、本生弱毒化ＲＳＶは、ｐ１７またはｐ１７ｐｐウイルス内部に存在する改変されたタンパク質の１つ以上をコードする核酸分子の相補鎖とストリンジェントな条件化でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる実質的に類似なタンパク質を含む。更なる実施態様において、当該生弱毒化ＲＳＶは、ｐ１７またはｐ１７ｐｐウイルス内部に存在する改変された核酸分子または（コード領域が非コード領域のいずれかである）その領域の１つ以上とストリンジェントな条件化でハイブリダイズする核酸分子を含んでいる。

第十一の実施態様において、上記の各実施態様において記載された生弱毒化ＲＳＶが生弱毒化ＲＳＶの個体群に含まれる。弱毒化ＲＳＶの個体群とは、当該ウイルスの個体群が必ずしも１種類のウイルスに対して相同ではないことを意味している。例えば、本明細書において記載するように、本明細書に記載するＲＳＶ株の継代後期において、多型の存在が見出されている。本明細書に記載されるｐ１７ゲノム内には４つの多型部位が存在している。したがって、ｐ１７によって示されるようなウイルスの個体群は、本明細書に記される特定のヌクレオチド突然変異（即ち非多型）に加えて、４つの多型部位、６５３８、７１１５、８９３７および１４６５６位において２つの候補ヌクレオチドのうちの１つを含むゲノムを有する複数の弱毒化ウイルスから構成され得る。ＲＳＶ個体群は、本明細書（後述の実施例１参照）に記載するように細胞培養中で非弱毒化または不完全弱毒化ＲＳＶ株のいずれかを連続的に継代することによって作ることができ、この連続継代には配列番号２５に示すウイルスゲノムを有するＭｅｒｃｋ株２８７の連続継代が含まれるがこれに限定されるものではない。ウイルス個体群は、適当な細胞型において継代するか、または１以上の一連のクローニング工程を実施することにより均一、あるいは実質的に均一にまで精製することができる。

本発明の更なる実施態様には、上記各実施態様に記載される生弱毒化ＲＳＶまたはその個体群であって、ここで、本明細書において特定のウイルスタンパク質または遺伝子のｐ１７またはｐ１７ｐｐ配列と野生型配列の間で相違することが見出された１以上のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸が、遺伝子組み換え方法によって非弱毒化または不完全弱毒化ＲＳＶ株に導入されることによって当該ウイルスが産生されたものを含む。本発明の更なる実施態様において、上記各実施態様において記載されたような生弱毒化ＲＳＶまたはその個体群は、（配列番号２５に示すゲノム配列を有する）Ｍｅｒｃｋ株２８７を後述の実施例１に記載する方法によって連続的に継代することを含む工程により作られる。したがって、当該実施態様には、配列番号２５に記載されるウイルスゲノムを含む非弱毒化ＲＳＶ株を（アフリカミドリザル腎臓細胞株、ＶｅｒｏＣＣＬ−８１を含むがこれに限定されない）細胞株中において一定の感染多重度（ＭＯＩ）（例えば１：１００から１：１０００の間）で継代することを含む。

本発明の更なる実施態様には、特定のウイルス遺伝子またはタンパク質のｐ１７またはｐ１７ｐｐヌクレオチドまたはアミノ酸配列と野生型ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間で相違することが見出されている（本記載の前または後において詳述する）１以上のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸を遺伝子組み換え方法により非弱毒化または不完全弱毒化ＲＳＶ株に導入することを含むＲＳＶの弱毒化方法が含まれる。本発明の更なる実施態様には、後述の実施例１において記載する方法によって（配列番号２５に示すゲノム配列を有する）Ｍｅｒｃｋ株２８７を連続的に継代することを含むＲＳＶの弱毒化方法が含まれる。

本発明は、（ａ）（例えば人体の）治療、（ｂ）薬、（ｃ）ＲＳＶ複製の阻害、（ｄ）ＲＳＶ感染の治療または予防、または（ｅ）ＲＳＶ関連疾患の治療、予防または発症もしくは進行の遅延について、（ｉ）これらのために使用するか、（ｉｉ）これらのための医薬として使用するか、（ｉｉｉ）これらのための医薬の製造において使用するための、上記各実施態様に記載された１以上の生弱毒化ＲＳＶ、その個体群または当該弱毒化ウイルスを含むワクチンをも含む。

ＩＩＩ．医薬組成物
本明細書に記載される生弱毒化ＲＳＶまたは当該生弱毒化ＲＳＶを含むウイルス個体群および医薬上許容される担体を含む医薬組成物も本発明によって提供される。
したがって、本明細書に記載される生弱毒化ＲＳＶは、生物学的活性の維持を補助し、また許容可能な温度範囲内での保存期間における安定性を向上させるために、医薬上許容可能な担体とともに製剤化することができる。本明細書で用いる場合、「医薬上許容可能な担体」との用語は、当業界で周知でありＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓのような様々なテキストに記載されている適当な製剤用担体を含む。担体として使用可能なものには生理的平衡培養液、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルション（例えば油／水または水／油エマルション）、タンパク質、ペプチドもしくは加水分解物（例えばアルブミン、ゼラチン）等の安定化剤もしくは凍結保護用添加剤、糖（例えばラクトース、ソルビトール）、アミノ酸（例えばグルタミン酸ナトリウム）またはその他利用可能な薬品が含まれるが、これらに限定されない。得られた水溶液はそのまま使用するように容器に入れられるか、または凍結乾燥される。凍結乾燥された配合剤は無菌液と組み合わされて単回投与または複数回投与のいずれかで投与される。製剤化された組成物、特に液剤は、保存時における分解を防止または軽減するために、有効濃度（通常は１％ｗ／ｖ以下）のベンシルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール、メチルパラベンおよび／またはプロピルパラベンを含む（但しこれらに限定はされない）静菌薬を含んでいても良い。静菌薬はある種の患者には禁忌であり、したがって凍結乾燥された製剤は、これらの成分を含む溶液か含まない溶液のいずれかに溶かすことができる。

この医薬組成物は、宿主の免疫応答を亢進させるためにアジュバントを含んでいても良い。適当なアジュバントは、例えば、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、ａｌｕｍ、ＡＩＰＯ４、アルハイドロゲル、Ｌｉｐｉｄ−Ａおよびそれらの誘導体または変異体、油エマルション、サポニン、中性リポソーム、当該ワクチンおよびサイトカインを含むリポソーム、非イオン性ブロック共重合体およびケモカインである。ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥのようなポリオキシエチレン（ＰＯＥ）およびポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）を含む非イオン性ブロック共重合体をアジュバントとして使用することができる（Ｎｅｗｍａｎら、１９９８、ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ１５：８９−１４２）。これらのアジュバントは、非特異的に免疫系に対する刺激を促進し、その結果薬剤に対する免疫応答を亢進する点において好都合である。

ある特定のＲＳＶサブグループまたは株由来の本明細書に記載する生弱毒化ＲＳＶは、別のサブグループまたは株由来の他の弱毒化ＲＳＶと組み合わせることが可能である。他のウイルスは、混合製剤中に含ませることができ、同時に、または別々に投与することができる。ＲＳＶの特定の株の間で干渉効果現象が起こることから、ある株による免疫によって、同じ、または異なったサブグループに属する複数の他のウイルス株に対する防御が可能である。したがって、本明細書に記載する単離された弱毒化ＲＳＶは、他の非−自然発生的ＲＳＶと組合せられるか、弱毒化ＲＳＶの個体群中に存在し得る。

場合によっては、本明細書に記載される生弱毒化ＲＳＶまたはその組成物を、別の病原体、特に他の小児疾患の原因となる病原体に対して防御応答を誘発する他の医薬品（例えばワクチン）と組み合わせることが望ましい。例えば、本明細書に記載する弱毒化ＲＳＶ組成物は、標的とする年齢群（例えば、生後約１から６ヶ月齢の乳児）に対して予防接種実施諮問委員会（ＡＣＩＰｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｖａｃｃｉｎｅｓ／ｒｅｃｓ／ＡＣＩＰ／ｄｅｆａｕｌｔ．ｈｔｍ）が推薦する他のワクチンと同時に（典型的には別々に）または連続的に投与することができる。これらの追加ワクチンには、他の非経口投与ワクチンが含まれるが、これに限定するものではない。したがって、本明細書に記載する生弱毒化ＲＳＶ組成物は、例えばＢ型肝炎（ＨｅｐＢ）、ジフテリア、破傷風および百日咳（ＤＴａＰ）、肺炎球菌（ＰＣＶ）、ヘモフィルス‐インフルエンザｂ型菌（Ｈｉｂ）、ポリオ、インフルエンザおよびロタウイルスに対するワクチンと同時または連続的に投与することができる。

ＩＶ．使用方法
生弱毒化ＲＳＶまたは当該生弱毒化ウイルスを含むウイルス個体群を含む医薬組成物は、ＲＳＶ感染およびそれに関連する疾患を処置することを目的として対象者に接種するために有用である。本発明の範囲は、母子免疫を含むことを意図している。

したがって、本発明は更に、上記の医薬組成物の有効量を対象に投与することによって、ＲＳＶに感染しないよう対象に予防接種する方法を提供する。この対象は動物、例えばチンパンジーやヒトなどの哺乳動物を含む。本明細書に記載する生弱毒化ＲＳＶを含む医薬組成物をＲＳＶに感染しやすい人、あるいはＲＳＶ感染または（再感染を含む）ＲＳＶ感染に関連する重篤な疾患の発症の危険にさらされている人に投与して、対象者自身の免疫応答能を亢進させる。特に、新生児、血清反応陰性および陽性の乳児および小児ならびに高齢者においてＲＳＶ感染は潜在的に重大な影響を有することから、開示される生弱毒化ＲＳＶ組成物による免疫はこのような人達にとって有益であろう。したがって、記載される医薬品による免疫に特に適した対象者は、乳児、子供、高齢者および免疫抑制治療を受けている成人である。血清反応陰性者とは、サブグループＡまたはＢのＲＳＶにかつて感染したことを示す免疫学的痕跡を有さない者である。血清反応陽性者とは、母親から受動的に、あるいは過去におけるＲＳＶ感染の結果として、検出可能なＲＳＶ抗体を獲得した者である。

本明細書に記載する生弱毒化ＲＳＶを含む医薬組成物は、対象者が後に野生型ＲＳＶに感染または再感染した場合に、肺炎や細気管支炎などの重篤な下気道疾患を防ぐ免疫応答の発現を誘導する。自然に循環しているウイルスは、依然として感染症、特に上気道における感染症の原因となり得るが、予防接種およびその後の野生型ウイルス感染によって生じる可能性がある抵抗性の増大により、鼻炎発症の可能性が大きく減少する。予防接種の後に、宿主は検出可能なレベルの血清抗体および分泌性抗体を産生し、これら抗体は（同じサブグループの）相同性野生型ウイルスをｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏで中和することができる。多くの場合、宿主抗体は異なった非ワクチンサブグループの野生型ウイルスをも中和するであろう。例えば別のサブグループの異種株に対してより高いレベルの干渉効果を得るために、サブグループＡおよびＢの両方の少なくとも１つの主要な株由来の本明細書に記載する生弱毒化ＲＳＶで予防接種することができる。したがって、本明細書に記載する生弱毒化ＲＳＶは抗原性サブグループＡまたはＢのいずれかに属することが可能であり、流行しているＲＳＶ感染に対してより広い適応範囲を得るために両サブグループ由来のウイルスをワクチン製剤において組み合わせることができる。

本明細書に記載する生弱毒化ワクチンおよびその医薬組成物は、対象、好ましくはヒトにおいてＲＳＶに対する効果的な免疫応答を誘導または亢進させるために有効な量で提供される。所望の免疫応答を得るために、有効投与量においてウイルスの増殖および拡散がある程度許容されるが、ＲＳＶ関連症状あるいは疾患の原因とはならない。本明細書において示される指針に基づいて、当業者は容易に生ワクチンにおいて使用するウイルスの適切な量を決定することができるであろう。正確な量は、いくつかの要因、例えば対象者の健康状態および体重、投与方法、ウイルスの弱毒化程度、製剤の特性による影響を受け、また、対象者の免疫系が損傷しているか否かによって変動するであろう。１つの実施態様において、（ヒト対象1人あたり約１０^４から約１０^５プラーク形成単位（ＰＦＵ）ウイルスを含め）ヒト対象1人あたり約１０^３から約１０^７ＰＦＵ以上のウイルスである。

投与は、防御免疫応答の誘導に有効であることが知られている形態であればよく、選択肢には非経口投与、静脈内投与、経口投与または局所的に粘膜表面へ塗付することが含まれる。大抵の場合、本明細書で記載される生弱毒化ＲＳＶは非経口投与される。

本明細書に記載される生弱毒化ＲＳＶおよびその医薬組成物の単回または複数回投与が実施可能である。新生児および乳児においては、十分な免疫レベルを得るために複数回の投与が必要となり得る。天然の（野生型）ＲＳＶ感染にたいして十分な防御レベルを維持する必要があることから、投与は生後一ヶ月以内に開示されて、小児期にわたって間をおいて繰り返し継続される。例えば、一ヶ月目に最初の投与を行い、その後二ヶ月、六ヶ月、一年および／または二年目に投与するスケジュールが可能である。予防接種の頻度は、他の併用ワクチンの最新のガイドラインと適合するように調整することができる。誘導免疫のレベルは中和分泌抗体および血清抗体の量を測定することによってモニターすることが可能であり、所望の防御レベルを維持するために、必要に応じて用量を調節し、またワクチン接種を反復して行う。

いずれにせよ、ワクチン製剤、投与のためのその有効量および具体的な投与経路は、例えば補体結合アッセイ、プラーク中和アッセイおよび／または酵素結合免疫吸着測定法、その他の方法（例えば、モニタリング対象の応答を、上気道および下気道疾患の兆候および症状からの防御と関連付ける方法）によって測定できるような抗ＲＳＶ免疫応答を、効果的に刺激し、誘導し、または増強するのに十分な量の本明細書に記載の生弱毒化ＲＳＶを提供するものでなければならない。

Ｖ．生弱毒化ＲＳＶの生成
本明細書に記載される生弱毒化ＲＳＶは、生物学的に誘導するか、または遺伝子組み換えによって産生される。「生物学的に誘導されたＲＳＶ」とは、組み換え技術によって産生されたものではないＲＳＶ（例えば継代培養によるＲＳＶ）を意味している。「遺伝子組み換えによって産生されたＲＳＶ」とは、ウイルスクローニング技術（例えばリバースジェネティクス法）によって産生されたＲＳＶを意味している。生弱毒化ＲＳＶは参照ＲＳＶ配列と比較するとゲノム変異を含んでおり、ここで参照ＲＳＶ配列とは野生型または不完全に弱毒化されたＲＳＶである。

したがって、本明細書に記載された特定のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸残基が導入されたＲＳＶゲノムは、遺伝的および／または表現型の上で野生型であるウイルスまたは既に部分的に弱毒化されたウイルスのような野生型ウイルスの誘導体を基に得られ、後者の場合には新たに導入されたヌクレオチドおよび／またはアミノ酸残基は（例えば哺乳動物宿主内では複製が制限され、一方ワクチン接種された対象内において防御を付与する十分な免疫原性を維持している所望のレベルまで）その株を更に弱毒化するように働く。生物学的に誘導されたか、または遺伝子組み換えによって産生されたいずれかのサブグループＡまたはＢのＲＳＶは、例えば、冷却継代（ｃｏｌｄ−ｐａｓｓａｇｉｎｇ）、化学的突然変異誘発または部位特異的変異誘導（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって部分的に弱毒化することができる。冷却継代によるウイルスの弱毒化では、ウイルスを漸次低温化するような細胞培養中において継代する。例えば、野生型ウイルスは典型的には約３４〜３７℃で培養されるが、部分的に弱毒化されたウイルスは準最適温度、例えば２０〜２６℃において細胞培養（例えばウシ腎臓細胞の初代培養）中において継代することによって産生することができる。化学的突然変異誘発によるウイルスの弱毒化には、例えば、約１０^−３から１０^−５Ｍ、好ましくは１０^−４Ｍの５−フルオロウリジンまたは５−フルオロウラシル等の突然変異原の存在下でのウイルスの複製または約１００μｇ／ｍｌの濃度のニトロソグアニジンへのウイルスの暴露等の例えばＧｈａｒｐｕｒｅら、１９６９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３：４１４−４２１およびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎら、１９７８、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．３：９１−１００に記載された一般的な手法による方法が含まれる。その他の化学的突然変異原も使用することができる。部分的に弱毒化されたＲＳＶは、弱毒化突然変異（不完全な弱毒化突然変異であってもよい）を野生型ＲＳＶのゲノム内に導入することによって遺伝子組み換え的に作ることもできる。様々な選択技術を組み合わせて、部分的に弱毒化された突然変異体を非弱毒化サブグループＡまたはＢ株から作ることが可能であり、この突然変異体は本明細書に記載されるような更なる誘導体を作るために有用である。

本明細書に記載される生弱毒化ＲＳＶは、遺伝子組み換えによって、例えばｃＤＮＡから作製することができる。ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の変異は、単独あるいは組合せて野生型または部分的に弱毒化されたＲＳＶのゲノム内に挿入することができる。これらの変異によって、後述の実施例に記載される生物学的に誘導された弱毒化ＲＳＶの所望の表現型特性が特定される。感染性ＲＳＶは、生弱毒化ＲＳＶのゲノムまたはアンチゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡを、随伴性のタンパク質およびゲノムＲＮＡを含む転写、複製ヌクレオカプシドを産生するために必要なウイルスタンパク質とともに哺乳動物の細胞中で共発現させることによって作製することができる（例えば、Ｐａｌｅｓｅ、１９９５、ＴｒｅｎｄｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、３：１２３−１２５；Ｌａｗｓｏｎら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：４４７７−４４８１；Ｓｃｈｎｅｌｌら、１９９４、ＥＭＢＯＪ．１３：４１９５−４２０３参照）。ＲＳＶアンチゲノムとは、単離されたプラス鎖ポリヌクレオチド分子であって、子孫マイナス鎖ＲＳＶゲノムを合成するための鋳型として機能するものを意味している。したがって、１以上の単離されたポリヌクレオチド、例えば１以上のｃＤＮＡ、由来の本明細書に記載される１以上のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸を有する生弱毒化ＲＳＶを産生する方法も本発明に含まれる。

周知技術によって、以上定義したヌクレオチド／アミノ酸残基を（単独または組み合わせて）感染性ＲＳＶクローンに導入することができる。「感染性クローン」との用語は、ｃＤＮＡまたはその産物、合成物その他であって、感染性ウイルスまたはサブウイルス粒子のゲノムを作るための鋳型として機能し得るゲノムＲＮＡまたはアンチゲノムＲＮＡに転写され得るものを意味している。特定された突然変異を、従来技術（例えば部位特異的突然変異）によって、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムのｃＤＮＡコピーに導入することができる。アンチゲノムまたはゲノムｃＤＮＡサブフラグメントを用いて完全なアンチゲノムまたはゲノムｃＤＮＡを構築することは、それぞれの領域を個別に処理し（小さなｃＤＮＡは大きなｃＤＮＡに比較して処理が簡単である）、その後容易に完全なｃＤＮＡを構築することができる点において有利である。例えば、突然変異されたサブフラグメントで、野生型または不完全に弱毒化されたＲＳＶのゲノムまたはアンチゲノム配列由来の対応サブフラグメントを置換することができる。対応サブフラグメントは、選択された突然変異サブフラグメントと実質的に同一の配列を有している。したがって、完全なアンチゲノムもしくはゲノムｃＤＮＡまたはそれらのいずれかのサブフラグメントを、オリゴヌクレオチド指定突然変異のための鋳型として用いることができる。これは一本鎖ファージミド形態の中間体を経るものであってよく、例えば、Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ．）のＭｕｔａ−ｇｅｎｅ（登録商標）キットを使用するものであったり、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）のＣｈａｍｅｌｅｏｎｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット等の二本鎖プラスミドを直接鋳型として使用する方法、あるいは目的の突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーまたは鋳型のいずれかを用いるポリメラーゼ連鎖反応によるものであってもよい。ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムは、例えばＲＳＶｍＲＮＡまたはゲノムＲＮＡの逆転写コピーのポリメラーゼ連鎖反応（本明細書において参考として援用するＰＣＲプロトコル：ＡＧｕｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓら編集、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ（１９９０））によるクローン化ｃＤＮＡフラグメントを集合させて、集合体中に完全なアンチゲノムを復元することによって構築することもできる。あるいは、アンチゲノムまたはゲノムＲＮＡはｉｎｖｉｔｒｏで合成することができる。

ｃＤＮＡ発現ゲノムまたはアンチゲノムから感染性ＲＳＶを作るために、ゲノムまたはアンチゲノムを、（ｉ）ＲＮＡ複製が可能なヌクレオカプシドを産生し、および（ｉｉ）子孫ヌクレオカプシド構成成分をＲＮＡ複製と転写のために提供するために必要なＲＳＶ補助的タンパク質と共に発現させる。ゲノムヌクレオカプシドによる転写によって、その他のＲＳＶタンパク質が提供され、有効な感染が開始される。あるいは、有効な感染のために必要な他のＲＳＶタンパク質が共発現によって供給される。

例えば、本明細書に記載される生弱毒化ウイルスゲノムの感染性ＲＳＶクローンは最初にプラスミドベクター内に導入され得る。その後の感染および哺乳類宿主細胞内における転写に適したプラスミドベクターは市販されている。更にｃＤＮＡを含むプラスミドベクターはバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する宿主細胞にトランスフェクションすることができる。ＲＳＶ主要ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、ヌクレオカプシドリン（Ｐ）タンパク質、大（Ｌ）ポリメラーゼタンパク質を発現し、かつ、任意で転写伸長因子Ｍ２ＯＲＦ１タンパク質を発現してもよい、別のプラスミドベクターを宿主細胞中に同時トランスフェクションすることができる。ｃＤＮＡは転写されて完全長のマイナス鎖（ゲノム）ＲＮＡを作る。Ｎ、ＬおよびＰタンパク質の発現および任意のＭ２（ＯＲＦ１）タンパク質の発現によって、子孫ウイルスの製造が促進される。続いてビリオンを単離する。この方法において、転写、複製ヌクレオカプシドの産生に必要なタンパク質をコードする相補配列（例えばＮ、Ｐ、ＬおよびＭ２（ＯＲＦ１）タンパク質をコードする配列）のプラス鎖転写体とハイブリダイズする可能性をできる限り小さくするために、ｃＤＮＡは複製中間体ＲＮＡに対応するＲＳＶゲノムのプラス鎖型として構築されることが好ましい。ＲＳＶミニゲノムシステムを用いる場合には、ゲノムおよびアンチゲノムは、ＲＳＶまたはプラスミドのいずれかによって補完され、レスキューにおいて共に活性であり、このことは、方法論またはその他の理由にしたがってゲノムまたはアンチゲノムのいずれかが使用できることを示している。

Ｎ、Ｐ、Ｌおよび任意にＭ２（ＯＲＦ１）タンパク質は、ゲノムまたはアンチゲノムをコードする発現ベクターと同じであっても異なっていてもよい１つ以上の発現ベクターおよびそれらの様々な組合せによってコードされ得る。所望により、新たな別のベクターまたはＮ、Ｐ、ＬあるいはＭ２（ＯＲＦ１）タンパク質をコードするベクターまたは完全なゲノムまたはアンチゲノムをコードするベクターによってコードされる別のタンパク質が含まれていても良い。トランスフェクションされたプラスミドからのゲノムもしくはアンチゲノムおよびタンパク質は、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの制御下にあるそれぞれのｃＤＮＡによって発現が可能であり、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの発現系、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスＭＶＡ株組換体で感染、トランスフェクションまたは形質転換することにより、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼも同様に提供される（Ｗｙａｔｔら、１９９５、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２１０：２０２−２０５）。

ゲノムもしくはアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド（例えばｃＤＮＡ）と、別にＮ、Ｐ、Ｌ（および任意にＭ２（ＰＲＦ１））タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、機械的挿入（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）、形質導入等によって、増殖性ＲＳＶ感染を補助し得る細胞、例えばＨＥｐ−２、ＦＲｈＬ−ＤＢＳ２、ＭＲＣおよびＶｅｒｏ細胞等に挿入することができる。単離されたポリヌクレオチド配列のトランスフェクションを、例えばリン酸カルシウム媒介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒら、１９７８、Ｃｅｌｌ１４：７２５；Ｃｏｒｓａｒｏ＆Ｐｅａｒｓｏｎ、１９８１、ＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌＧｅｎｅｔｉｃｓ７：６０３；Ｇｒａｈａｍ＆ＶａｎｄｅｒＥｂ、１９７３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２：４５６）、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、１９８２、ＥＭＢＯＪ１：８４１−８４５）、ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ媒介トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌら、（編集）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ（１９８７））、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション（Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎら、１９９３、Ｆｏｃｕｓ１５：７３−７９）または市販されているトランスフェクション用試薬、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔＡＣＥ（登録商標）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて培養細胞に導入することができる。ウイルスタンパク質および／またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを、形質転換した哺乳類細胞から得ることも、あるいは予め形成されたｍＲＮＡまたはタンパク質のトランスフェクションによって得ることもできる。

本願発明の生弱毒化ＲＳＶが（例えば上記のクローニングおよびレスキュー実験によって）作製されれば、ＲＳＶ増殖が可能な多数の細胞株内において弱毒化ウイルスを殖やすことができる。ＲＳＶは様々なヒトおよび動物細胞内において増殖する。この生弱毒化ＲＳＶの増殖に適した細胞株の例としてＤＢＳ−ＦＲｋＬ−２、ＭＲＣ−５およびＶｅｒｏ細胞が挙げられる。Ｖｅｒｏ細胞等の上皮細胞株において通常最も高いウイルス産生量が得られる。典型的には、約０．００１から約１．０以上の感染多重度で細胞にウイルスを植え付け、ウイルスの複製が可能な条件下、例えば約３０〜３７℃で約３〜５日間、またはウイルスが適当な力価に達するのに必要な限り培養する。ウイルスを細胞培養から回収し、典型的には遠心分離等の周知の浄化手法によって細胞成分から分離し、必要に応じて当業者に周知の手法を用いて更に精製する。

本明細書において記載される弱毒化されたＲＳＶは、ｉｎｖｉｖｏおよび／またはｉｎｖｉｔｒｏモデルで試験を行い、適切な弱毒化、遺伝的安定性および免疫原性を確認することができる。遺伝的に改変されたＲＳＶの弱毒化レベルは、例えば感染者の気道内に存在するウイルスの総量を測定し、その量を表現型が野生型であるＲＳＶ（例えばＲＳＶＡ２、Ｍｅｒｃｋ株２８７）による総量と比較することで決定し得る。弱毒化ウイルスは、Ｍｅｉｇｎｅｒら編集のＡｎｉｍａｌＭｏｄｅｌｓｏｆＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＳｙｎｃｙｔｉａｌＶｉｒｕｓＩｎｆｅｃｔｉｏｎ、ＭｅｒｉｅｕｘＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ（１９９１）に記載され、概要が記されている様々なＲＳＶ感染の動物モデルで試験することができる。例えば、ＲＳＶ感染のコットンラットモデルは、古くからヒトにおける弱毒化および有効性を予測させると認められている（米国特許第４８０００７８号、Ｐｒｉｎｃｅら１９８５、ＶｉｒｕｓＲｅｓ．３：１９３−２０６、Ｐｒｉｎｃｅら、１９８７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１８５１−１８５４）。マウスを含む他のげっ歯類においてもＲＳＶ増幅が可能であり、これら動物はむしろヒトに近いコア体温を有することから、同様に有用である（Ｗｉｇｈｔら、１９７０、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２２：５０１−５１２、ＢｙｒｄおよびＰｒｉｎｃｅ、１９９７、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２５：１３６３−１３６８）。特に、霊長類モデルはＲＳＶ感染を試験する上で遺伝的、免疫学的に適切な宿主系である（ＭｃＡｒｔｈｕｒ−ＶａｕｇｈａｎおよびＧｅｒｓｈｗｉｎ、２００２、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．３１：６１−７３）。例えば、チンパンジーを用いたＲＳＶ感染の霊長類モデルは、ヒトにおける弱毒化および有効性を予測させる（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、１９７８、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．３：９１−１００；Ｗｒｉｇｈｔら、１９９２、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３７：３９７−４００；Ｃｒｏｗｅら、１９９３、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．３：９１−１００；Ｗｒｉｇｈｔら、１９８２、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３７：３９７−４００；Ｃｒｏｗｅら１９９３、Ｖａｃｃｉｎｅ１１：１３９５−１４０４参照）。アフリカミドリザルもＲＳＶ感染のモデルとして使用されている（Ｃｈｅｎｇら、２００１、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２８３：５９−６８；Ｋａｋｕｋら、１９９３、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６７：５５３−６１；Ｗｅｉｓｓら、２００３、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．３２：８２−８８）。更に、弱毒化のｉｎｖｉｔｒｏ分析にはヒト気道上皮細胞におけるウイルス増殖の評価が含まれる（Ｗｒｉｇｈｔら、２００５、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：８６５１−８６５４）。

本明細書に記載される生弱毒化ＲＳＶは、サルやコットンラットなどの高感受性宿主の上気道および下気道の両方で、野生型ウイルスの複製レベルに比較して複製の制限の程度が大きく、例えば１０００分の１以下の複製しか示さない。感染宿主の鼻咽頭内ＲＳＶレベルを測定する方法は文献によってよく知られている。簡単に説明すると、鼻咽頭分泌物を吸引または洗浄することによって標本が得られ、組織培養または他の実験手法によりウイルスが定量される。例えば、Ｂｅｌｓｈｅら、１９７７、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１：１５７−１６２；Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄら、１９６８、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２０４：６９０−６９４；Ｇｈａｒｐｕｒｅら、１９６９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３：４１４−４２１；および、Ｗｒｉｇｈｔら、１９７３、Ａｒｃｈ．Ｇｅｓ．Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈ．４１：２３８−２４７参照。

生存能力、弱毒化および免疫原性の評価基準に加えて、本明細書に記載される生弱毒化ＲＳＶの特性は、所望の属性が維持されるように可能な限り安定でなければならない。理想的には、医薬製品（例えばワクチン）の成分として有用であるウイルスは、その生存能力、弱毒特性および（より低レベルではあるが）免疫された宿主内における複製能力を維持していなければならず、接種を受けた対象においてその後の野生型ウイルスの感染による重篤な疾患に対する防御を付与するのに十分な免疫応答の発生を効果的に誘導する能力を維持していなければならない。

ＶＩ．組み換え核酸
本明細書に記載される弱毒化ＲＳＶゲノムもしくはアンチゲノムの全長または一部のいずれかを含む核酸分子、本明細書に記載される改変されたウイルスタンパク質もしくはその一部をコードするヌクレオチド配列、または本明細書に記載される改変されたウイルスゲノムもしくはその一部のヌクレオチド配列（上記ＩＩ節における本願発明の生弱毒化ＲＳＶ内に含まれる核酸の記載参照）も、本願発明の範囲内に含まれる。これらの核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、相補性ＤＮＡ分子（ｃＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子であり得る。

４つの候補ヌクレオチド塩基のトリプレットコドンは、６０以上の種類が存在し得る。これらのコドンは２０種類の異なったアミノ酸（および転写開始および終止）のみのメッセージを提供するため、いつくかのアミノ酸は複数のコドンによってコードされることが可能であり、この現象はコドン重複性として知られている。したがって、遺伝子コドンのこの重複性によって、あるタンパク質をコードするために、多数の異なったコーディング核酸配列が使用できる。アミノ酸は以下のＲＮＡコドンによってコードされる。

Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ、ＵＧＵ
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ、ＧＡＵ
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ、ＧＡＧ
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ、ＵＵＵ
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ、ＣＡＵ
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ
Ｋ＝Ｌｙｓ＝ロイシン：コドンＡＡＡ、ＡＡＧ
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ、ＡＡＵ
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ、ＣＡＧ
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵ
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドンＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ、ＵＡＵ
したがって、本願発明は、開示された核酸分子とは異なるが同じタンパク質配列をコードしている核酸を含む。

本願発明のＲＳＶの非コード配列（即ち非翻訳配列）を含む核酸分子も本願発明に包含される。これらの非コード領域には５’非コード領域、３’非コード領域、遺伝子間配列ならびに転写、翻訳およびその他の調節領域を含むがこれらに限定されないウイルスゲノムの他の非コード領域が含まれる。これらの核酸分子もＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。

本明細書に記載される生弱毒化ＲＳＶのＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ、Ｆおよび／またはＬ遺伝子を含む（但し、これらに限定されない）本願発明の生弱毒化ＲＳＶの１以上のタンパク質をコードする核酸分子と実質的に類似な核酸分子も本願発明に含まれる。上記ＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ、Ｆおよび／またはＬ遺伝子は、ＲＳＶウイルスゲノムに取り込まれると、同等の弱毒表現型効果を奏する。本願発明は、最終的なウイルス産物の表現型を変えない非コード領域における変化を特徴とする実質的に類似の核酸分子をも含む。

したがって、本願発明の範囲には、本明細書に記載される生弱毒化ＲＳＶ内に含まれるタンパク質の変異体をコードするヌクレオチド配列または本明細書に記載される生弱毒化ＲＳＶ内に含まれる非コードヌクレオチド配列の変異配列を含む核酸分子のいずれかを含む核酸分子が含まれる。

１または複数の指定されたヌクレオチドを含む核酸分子であって、ストリンジェントな条件下で本発明の核酸分子の相補体とハイブリダイズする核酸分子は本願発明の範囲に含まれる。非限定的な例示として、高ストリンジェントな条件下での手順を以下に記す。６ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト溶液および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む緩衝液中において、ＤＮＡを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションを約２時間から一晩の間行う。１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡと５−２０ｘ１０^６ｃｐｍの^３２Ｐ標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合液中において、フィルターを約１２から４８時間ハイブリダイズさせる。２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む溶液中、３７℃で約１時間フィルターを洗浄する。更に０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で４５分間洗浄し、オートラジオグラフィーを行う。高ストリンジェントな条件を用いる他の手順には、５ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト溶液、５０％ホルムアミド中、約４２℃で約１２から４８時間実施するハイブリダイゼーション工程または０．２ｘＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、約６５℃で約３０から６０分間実施する洗浄工程のいずれかが含まれる。上記の高ストリンジェントハイブリダイゼーションを実施する手順の中に記載される試薬は、当業界でよく知られたものである。これら試薬組成の詳細は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ（２００１）に記載されている。上記に加えて、使用可能な他の高ストリンジェントな条件も当業界でよく知られている。

本願発明の核酸分子は、作動可能にＲＮＡ転写のプロモーターおよび他の調節配列と結合されていてもよい。本明細書で用いる場合、「作動可能に結合した」とは、プロモーターが核酸分子のＲＮＡ転写を指示するような位置に置かれたことを意味している。プロモーターの例はＴ７プロモーターである。プロモーターおよび挿入された核酸部分がプロモーターと作動可能に結合されているクローニング部位の両方を含むベクターは当業界でよく知られている。これらのベクターはｉｎｖｉｔｒｏとｉｎｖｉｖｏで核酸を転写することができるものであり得る。これらのベクターの例には、（他の弱毒化サブタイプおよび野生型株の両方を含む）他のＲＳＶタイプのウイルスゲノム由来の核酸を含むベクターが含まれ、このベクターは本明細書に記載される生弱毒化ＲＳＶのポリペプチドをコードする核酸領域および／または非コード領域を当該他のＲＳＶタイプの核酸と置換することによって改変されている。更に、本願発明の核酸分子によってコードされる組み換えウイルスも提供される。

本願発明の種々の特性を更に説明するために以下に実施例を示す。実施例は発明の実施に有用な方法も説明する。これら実施例は特許請求された発明を限定するものではない。

実施例１
ＭＲＫＲＳＶ株２８７の継代
細胞およびウイルス
アフリカミドリザルの腎臓細胞株ＶｅｒｏＣＣＬ−８１をウイルス増殖試験およびプラークアッセイの両方に用いてウイルス生産をモニターした。使用した親ウイルスは‐２０℃で保存、凍結乾燥されていたＭｅｒｃｋ２８７株ｈＲＳＶを用いた。親Ｍｅｒｃｋ２８７ウイルスはＧＭＫ細胞中において２回継代され、その後ＷＩ−３８細胞（Ｂｕｎｙａｋら、１９７８、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１５７：６３６−６４２：Ｂｕｎｙａｋら、１９７９、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１６０：２７２−２７７；Ｂｅｌｓｈｅら、１９８２、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１４５：３１１−３１９）中において更に５回継代された。配列分析によって、弱毒化に関連する既知の全ての位置において野生型の遺伝子型が保持されていることが確認された。

ウイルス継代およびウイルス保存調製物
親ウイルスを用いて、１週間目のコンフルエントなＶｅｒｏ単層細胞に、３２℃、１：１００または１：１０００ＭＯＩで１時間接触させて感染させ；ウィリアム培地Ｅ（Ｇｉｂｃｏ）、１．６％組み換えヒトアルブミン（Ｄｅｌｔａｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）および５０μｇ／ｍｌネオマイシン（Ｓｉｇｍａ）からなる維持培地によって接触後に被覆した。９０％以上の最大細胞変性効果（ＣＰＥ）が認められまで培養を観察した後、回収し、ＣＰＥが上昇し過ぎて適切なウイルス産生ができなくなるまで栄養補給して２４時間間隔で更に回収を行った。

プラークアッセイ
回収したウイルスサンプルは、プラークアッセイによって連続１０倍希釈における力価検定に供し、１２穴アッセイフォーマット（Ｃｏｓｔａｒ：１００μｌ／ｗｅｌｌ、連続１０倍希釈の１希釈あたり３ウェル、１プレート当たり４希釈）中のコンフルエント（４８〜７８時間）ＶＥＲＯ単層への接種に使用した。３５℃±１℃、５．０％ＣＯ_２の条件下で１時間プレートをインキュベートし、ウィリアム培地Ｅ（Ｇｉｂｃｏ）、１．６％組み換えヒトアルブミン（Ｄｅｌｔａｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、５０μｇ／ｍｌネオマイシン（Ｓｉｇｍａ）および最終濃度０．５％ＳｅａＰｌａｑｕｅ（登録商標）アガロースからなる維持培地で被覆する。３５℃±１℃、５．０％ＣＯ_２の条件下、６〜８日でプラークが生じる。５ｍｇ／ｍｌＭＴＴ（ＴｈｉａｌｚｏｌｙｌＢｌｕｅＴｅｔｒａｚｏｌｉｕｍＢｒｏｍｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））のＰＢＳ溶液）を１ウェル当たり２５０μｌ加え、細胞が染色剤を代謝するまで２〜６時間待ってプラークを可視化した。

ウイルスの生成量をモニターするのみでなく、力価を正確に測定してウイルスの継代に適したＭＯＩを得るための希釈倍率を算出するために、各継代の間に全ての回収サンプルについて力価を求めた。

結果
ＭｅｒｃｋＨＲＳＶ株２８７が、ＧＭＫ細胞で最初に２回増幅した単離ｈＲＳＶ株から得られた。最初の増幅の後、このウイルスをヒトニ倍体細胞株ＷＩ−３８中で更に５回継代した。この５回継代材料を、非経口投与経路によるワクチン用途のためのヒト臨床試験に使用した。Ｍｅｒｃｋ株２８７、ｈＲＳＶＡ型、は配列分析およびｉｎｖｉｖｏ動物排出実験（後記参照）のいずれにおいても野生型（ＷＴ）表現型を示した。Ｍｅｒｃｋ株２８７を一定の多重度でＶＥＲＯ−ＣＣＬ−８１単層中において連続して２２回継代した（継代１（ｐ１）〜継代２２（ｐ２２））。継代の間において、ウイルス力価は一定に維持され、培養中のウイルスによる細胞変性効果も一定に維持されていた。ウイルス収量は１０^６〜１０^７ｐｆｕ／ｍｌの範囲であった。

実施例２
ＭＲＫＲＳＶ株２８７および継代された保存ウイルスの配列決定
ＲＳＶサンプル
材料は、感染ＶＥＲＯ細胞から回収されたウイルス上清液の５００〜１０００μｌアリコットとして供された。１）ＭＲＫＲＳＶ株２８７、２）ＭＲＫＲＳＶ株２８７、継代１７（ｐ１７）、および３）ＭＲＫＲＳＶ株２８７、継代２２（ｐ２２）について、完全長の配列が作製された。１）ＭＲＫＲＳＶ株２８７、継代５（ｐ５）、２）ＭＲＫＲＳＶ株２８７、継代１０（ｐ１０）、３）ＭＲＫＲＳＶ株２８７、継代１５（ｐ１５）および４）ＭＲＫＲＳＶ株２８７、継代１８（ｐ１８）について、（標的の）部分配列を作製した。

ＲＮＡ抽出
ＱｉａＡＭＰウイルスＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号５２９０４）をメーカー手順書に基づいて使用し、ウイルス培養上清からＲＮＡを抽出した。簡単に説明すると、ウイルス培養上清１４０μｌを溶解バッファーに加え、結合フィルター上にのせた後、洗浄し、ＲＮａｓｅを含まない水６０μｌで溶出させた。抽出されたＲＮＡサンプルを−２０℃で保存した。抽出されたＲＮＡサンプルを鋳型として用いて、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってゲノムを二本鎖ＤＮＡ断片の形で増幅した。ＲＴ−ＰＣＲ増幅のために十分な量の材料を得るために、各サンプルにおいて複数回の抽出を行った。

ＲＴ−ＰＣＲによるＲＳＶゲノムの増幅
ＱｉａｇｅｎＯｎｅＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２１０２１２）を用いて、サンプルのＲＳＶゲノムを二本鎖ＤＮＡの形で増幅した。完全長の配列（ＭＲＫＲＳＶ２８７および継代ｐ１７およびｐ２２）を決定するために、それぞれ約５００塩基対（ｂｐ）で隣接する断片とオーバーラップする各断片を用いて、１０００ｂｐ断片の増幅を３０回実施した。増幅反応は（プライマー対について）１から３０まで付番し、以下に示す表のように実施した。部分長配列決定（ＭＲＫＲＳＶ２８７継代ｐ５、ｐ１０、ｐ１５およびｐ１８）のために、プライマー対２、１０、１１、１３、１４、１８および２９を用いて１０００塩基対（ｂｐ）断片の増幅を７回実施した。増幅反応は下記表に示すように（プライマー対について）付番し、実施した。

（反応ごとの）マスターミックス：１０μｌ５ｘＱＩＡＧＥＮＯｎｅＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲバッファー；２μｌｄＮＴＰ混合液；３μｌプライマーＡ（フォワードプライマー）−１０μＭ保存液、最終６００ｎＭ；３μｌプライマーＢ（リバースプライマー）−１０μＭ保存液、最終６００ｎＭ；２μｌＱＩＡＧＥＮＯｎｅＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲ酵素混合塩基；５μｌＲＮＡ鋳型；２５μｌ分子生物学用グレードの水。

以下の条件を用いて、バイオメトラのサーマルサイクラー内で増幅反応を実施した。３０分、５０℃−逆転写工程；１５分、９５℃−ＰＣＲ初期活性化工程（ＤＮＡポリメラーゼの活性化）３ステップサイクリング（合計４０サイクル繰り返す）；１分、９４℃−変性；１分、５５℃−アニーリング；１分、７２℃−エクステンション；１０分、７２℃−最終エクステンション。

ＲＴ−ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーを表２および３に示す。

ＱＩＡＧＥＮＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮカタログ番号２８１０４）をメーカー手順書にしたがって使用して、増幅されたＲＴ−ＰＣＲ産物を精製した。精製されたＲＴ−ＰＣＲ産物は（プライマー対に基づいて）１から３０まで付番し、−２０℃で保存し、配列決定のためにＧｅｎｅＷｉｚ（ＳｏｕｔｈＰｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）に送った。

増幅されたＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定
精製されたＲＴ−ＰＣＲ産物を、ダイ−ターミネーション配列決定（ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）のために、ＧｅｎｅＷｉｚ（ＳｏｕｔｈＰｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）に提出した。ＲＴ−ＰＣＲ産物と共に提出したＲＴ−ＰＣＲ増幅プライマーを用いて配列決定が行われた。それぞれのＲＴ−ＰＣＲ産物についてフォワードプライマーを使用した配列とリバースプライマーを使用した配列の２つの配列が作製された。

ＲＴ−ＰＣＲ産物配列分析およびＲＳＶゲノムの構築
得られたＲＴ−ＰＣＲ断片の配列をＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）配列分析ソフトウェア（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ、ＡｎｎＡｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）にインポートし、「コンティグ」構築を実施して配列を構築した。この工程は、６０のＲＴ−ＰＣＲ産物配列（３０産物のそれぞれについて２配列）すべてをインポートし、５００ｂｐのオーバーラップ領域をスキャフォールドとして使用して完全長の配列を構築することから構成されている。無関係なピークあるいは欠失したピークについて、通常許容されている慣行に基づいて、配列を編集した。ｐ５、ｐ１０、ｐ１５およびｐ１８の目標とする配列の決定のために、完全長のゲノム構築ではなくむしろ個々の断片構築（即ち断片２、１０、１１等）を行った。最終的な配列をＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（商標）にインポートし、配列比較および分析を行った。

結果
起源材料（ＭＲＫ２８７）ならびに継代１７（ｐ１７）および継代２２（ｐ２２）から完全長のゲノム配列を作製した。その他の継代レベルの標的配列を継代５（ｐ５）、１０（ｐ１０）、１５（ｐ１５）および１８（ｐ１８）から得た。ウイルスＲＮＡを培養上清サンプルから抽出し、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、このＲＮＡからゲノムの二本鎖ＤＮＡ断片を作製した。ＲＴ−ＰＣＲ産物を精製し、配列を決定した。作製した配列を完全長ウイルスゲノム内に構築した。

以下の比較および分析を行った。

１）共通データベース（Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ）中の既知配列に対して、ＭＲＫＲＳＶ２８７株配列のホモロジー「ｂｌａｓｔ」分析を行い、ＭＲＫＲＳＶ２８７の他のＲＳＶ配列に対する配列類似性を決定した。

２）起源ＭＲＫＲＳＶ株２８７とｐ１７との間における配列相違を決定するために、ＭＲＫＲＳＶｐ１７に対するＭＲＫＲＳＶ株の配列アライメントを行った。

３）起源ＭＲＫＲＳＶ株２８７とｐ１７の間における核酸配列の相違に関連したアミノ酸配列の相違を決定するために、両者の間の配列相違についてアミノ酸分析を行った。

４）ウイルスゲノム中の他の位置で点突然変異が更に生じていないか確認することを目的として、ＭＲＫＲＳＶｐ２２に対するＭＲＫＲＳＶ２８７株ｐ１７の配列アライメントを行いＭＲＫＲＳＶ株２８７ｐ１７とｐ２２の間における配列の相違を決定した。

５）継代レベルが進むにつれて点突然変異が生じること、および可能性のある弱毒化のマーカーについて理解するために、ＭＲＫＲＳＶ株２８７とｐ５、ｐ１０、ｐ１５、ｐ１７、ｐ１８およびｐ２２由来の遺伝子セグメント２、１０、１１、１３、１４、１８および２９を比較して、起源ＭＲＫＲＳＶ株２８７と関連する継代材料の間の配列相違を決定した。

配列分析の結果を以下に要約する。

１）ＭＲＫＲＳＶ株２８７配列分析
ＭＲＫＲＳＶ株２８７を既知のＲＳＶの野生型および（表４に記載される）ワクチン株と比較した結果、ＭＲＫＲＳＶ２８７は既に弱毒化マーカーとして同定されている点突然変異を含まないことが示された（データ示さず）。ＭＲＫＲＳＶ株２８７から１５２０５ヌクレオチドの配列が得られた。継代１７および２２から末端の５’終末が欠損した１５０００ヌクレオチドが得られた。ＭＲＫＲＳＶ株２８７は既知のＲＳＶサブグループＡ株と類似し、９５％以上の相同性スコアを有していた。

２）ＭＲＫＲＳＶ株２８７配列および継代１７配列の比較
ＭＲＫＲＳＶ株２８７およびｐ１７由来のゲノム配列を比較した結果、２つの配列の間において２１の配列相違（点突然変異）が存在することが示された。配列相違の概要を表５に示す。

３）ＭＲＫＲＳＶ株２８７のアミノ酸配列と継代１７のアミノ酸配列の比較
起源ＭＲＫＲＳＶ株２８７配列と比較してｐ１７において同定された各点突然変異の遺伝子位置をマッピングし、点突然変異を含む各遺伝子についてアミノ酸配列を作成した。２１の点突然変異のうち、１つは５’非翻訳領域（ウイルスＬ遺伝子に対して３’側）内にあり、２０はオープンリーディングフレーム（ウイルス遺伝子）内にある。２０のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）突然変異のうち、５つは非表現突然変異であり、残りの１５は３つの遺伝子内において１１のアミノ酸に影響している。影響された３つのＯＲＦはＧタンパク質（糖タンパク質）、Ｆタンパク質（融合タンパク質）およびＬタンパク質（巨大タンパク質、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）をコードしている。１つの非表現突然変異はＮＳ２遺伝子ＯＲＦ内にあり、４つの非表現突然変異はＧ遺伝子ＯＲＦ内にある。配列相違の概要を表６に示す。

４）ＭＲＫＲＳＶｐ２２に対するＭＲＫＲＳＶｐ１７の配列アライメント
ｐ１７とｐ２２の配列を比較することによって、両者の配列が同一であることが確認された。ヌクレオチド第１４６５６番において多型レベルで相違する可能性があるが、定量的に確認されていない。

５）ＭＲＫＲＳＶ株２８７ならびに継代５、１０、１５、１７、１８および２２由来の遺伝子セグメント２、１０、１１、１３、１４、１８および２９の比較
ＭＲＫＲＳＶ株２８７継代ｐ５、ｐ１０、ｐ１５およびｐ１８の選択した遺伝子セグメントから配列を作成した。これらの配列をＭＲＫＲＳＶ株２８７ならびにＭＲＫＲＳＶ株継代１７および継代２２と比較した。表７は、既に同定されているＲＳＶｐ１７点突然変異の位置においてこれら配列を比較した結果を示す。示されたデータから、非表現ＮＳ２突然変異は５回目の継代で生じ、一方Ｇ遺伝子突然変異は１０回目の継代で生じたことが明らかである。ＦおよびＬ遺伝子中の突然変異は継代１０までに出現し始め、全点突然変異の証拠は継代１７に存在する。１４６５６位の多型は依然明白であるが、他の多型の存在には疑問がある。表７は分析した様々な継代レベルの比較の概要を示す。

実施例３
ＭＲＫＲＳＶ２８７継代株の弱毒化
アフリカミドリザル暴露試験
全ての動物を、血清中和抗体価について予めスクリーニングした。抗体価が４以下の動物のみこの試験に使用した。１０ｍｇ／ｋｇのケタミン筋肉注射によってサルを麻酔し、それぞれ１０^５．５ｐｆｕのウイルスに２回暴露させた。鼻内及び気道内接種を組合せてウイルスを投与し、１回の投与あたりそれぞれの部位に１ｍｌ投与した。暴露の後、１２日間連日それぞれのサルから鼻咽頭スワッブを採取し、気管支肺胞洗浄液を４、５、７および１０日目に採取した。鼻咽頭サンプルは、Ｄａｒｃｏｎスワッブを用いて中咽頭領域の２、３箇所を穏やかにこすり、０．２Ｍスクロース、３．８ｍＭＫＨ２ＰＯ４、７．２ｍＭＫ_２ＰＯ_４および４．４ｍＭグルタミン酸ナトリウム（ＳＰＧ）および０．１％ゼラチンを含むハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に先端を入れて採取した。気管支肺胞洗浄には、約５〜７ｍｌのＨＢＳＳを直接肺内に吸入させ滅菌したフレンチカテーテルおよびシリンジで吸引した。回収したサンプルに１／１０量の１０ｘＳＰＧと１／１０量の１％ゼラチンを加え、一定量に小分けして直ちに−７０℃で凍結保存した。

コットンラット抗原暴露試験
４〜８週齢の雌性コットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎｈｉｓｐｉｄｕｓ）に、開始日（ｄａｙ０）において０．１ｍｌ中のウィルス１０^５．５ｐｆｕを鼻腔内に接種した。接種から４日後に肺（左葉）と鼻甲介を取り出し、氷上で、ＳＰＧを含む１０倍容量のハンクス平衡塩溶液（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中においてホモジナイズした。サンプルを２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して清浄化し、分注して-７０℃で直ちに冷凍保存した。

ウイルス力価
Ｈｅｐ−２細胞を用いてウイルス力価を測定した。簡単に説明すると、試験サンプルを無菌的に希釈し、サンプルの０．１ｍｌをコンフルエントなＨｅｐ−２細胞を含む２４穴プレートに加えた。３７℃で１時間細胞をインキュベートした。インキュベーションの後、ＰＢＳで細胞を１度洗浄し、１ウェル当たり０．５ｍｌの１％アガロース含有ＭＥＭで被覆し、３７℃で４日間インキュベートした。インキュベーションの後、アガロース被覆を取り除き、クリスタルバイオレットで細胞を染色し、ウイルスプラークを計測した。ウイルス力価は組織１グラム当たりのプラーク形成単位（ｐｆｕ）で表示した。

ウイルス中和アッセイ
ウイルス中和アッセイのために、全ての血清を５６℃で３０分間非働化した。イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）で試験血清を連続２倍希釈しインキュベートした。野生型Ａ２ウイルスを標的ウイルスとして、１０^３ｐｆｕ／ｍｌの最終力価までＥＭＥＭ中に希釈した。同容量の血清とウイルスを混合し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、０．１ｍｌのウイルスを２４穴プレートの１ウェルに移し、上記のウイルスプラークアッセイを行った。中和力価は、ウイルスプラークを５０％以上抑制する最大希釈率で定義した。

結果
１）ＭＲＫ２８７ｐ１７はコットンラットおよびアフリカミドリザルモデルにおいて高度に弱毒化されている。

Ｉｎｖｉｖｏ複製特性を評価するために、コットンラットおよびアフリカミドリザルモデルにおいてｐ１７ウイルスとその親ウイルスであるｐ３ウイルスおよびｗｔＡ２株を比較した。コットンラットおよび非ヒト霊長類試験からのデータでは、ｐ１７ウイルスが高度に弱毒化されていることが総じて示唆された。

コットンラット試験では、１群当たり６匹のラットに１０^５．５ｐｆｕの試験ウイルスを鼻内に接種し、ウイルス暴露の４日後に鼻および肺サンプルを採取し、ウイルス力価検定に使用した（図５）。ｐ３親ウイルスは完全に複製能力を有し、鼻および肺両組織においておよそ５ｌｏｇのウイルスを生じることが認められた。鼻内の力価はｗｔＡ２株の力価に匹敵したが、肺内の力価は約１ｌｏｇ低かった。これに対して、ｐ１７ウイルスの増幅は限定的であった。下方アッセイ検出限界、４０ｐｆｕ／ｇ組織重量、に基づけば、鼻内においてウイルスは回収されず、肺ウイルスは４匹の動物のうち１匹において検出されたのみある。検出できた動物のウイルス力価も低く、２００ｐｆｕ／ｇ組織重量であった。ｐ３親ウイルスに比較して、ｐ１７は鼻内および肺内においてそれぞれ少なくとも４および２．５ｌｏｇ低い力価を有していた。

アフリカミドリザル試験においては、１群当たり４匹の動物に総量２ｘ１０^５．５ｐｆｕのウイルスを接種し、半分には鼻内接種し、残り半分には気道内接種した。ウイルス暴露後に、複数の時点で鼻咽頭スワブと肺洗浄液を採取し、ウイルス力価検定に使用した。結果を図６に示す。コットンラットの結果と同様に、ｐ３親ウイルスは鼻および肺内において顕著なウイルス増幅を示し、ピーク力価は鼻および肺においてそれぞれ約１０^４および１０^５ｐｆｕ／ｍｌであった。更に、総合的なウイルス排出特性はむしろｗｔＡ２ウイルスに近いものであり、力価ピークは４〜７日の間で、１０日間持続した。これに対して、ｐ１７ウイルスは散発的に検出されるだけで、その力価も低いものであった。例えば、鼻のウイルスは２日目に２匹のサル、８日目に１匹のサルで検出されただけであり、肺のウイルスも２、３、７日目にそれぞれ１匹、３匹および１匹のサルで検出されただけである。全ての陽性サンプルの中で最も高い力価は２日目の鼻サンプルのうちの１つであり、４００ｐｆｕ／ｇ組織重量であった。

ウイルス継代とｉｎｖｉｖｏ複製との関係をより理解するために、継代１７以前の継代ＭＲＫ２８７ウイルスについてもコットンラットモデルで試験を行った。１群当たり６匹の動物を１０^５ｐｆｕのウイルスに暴露させ、４日後にサンプルを採取した。図７に示すように、継代５（ｐ５）において既に複製の低下が始まり、継代１０（ｐ１０）および１５（ｐ１５）において更に進んだ複製の低下が示された。ｐ１５ウイルスは上記のｐ１７と同様に弱毒化されていた（図５）。ｐ１７ウイルスは肺からは回収されず、鼻サンプルのみにおいて検出されたが、その力価はｐ３親ウイルスの力価よりも３ｌｏｇ以上低い価であった。

２）ＭＲＫ２８７ワクチンウイルスによる筋肉内単回免疫によって、コットンラットおよびアフリカミドリザルにおいて強い血清中和（ＳＮ）抗体応答が誘導され、ｗｔウイルス暴露に対して顕著な防御が得られた。

免疫原性および防御試験をコットンラットおよびアフリカミドリザルの両方で実施した。弱毒化ワクチン株ＭＲＫ２８７ｐ１７による単回全身性免疫によって顕著なＳＮ価を誘導することができ、この動物モデルにおいてｗｔウイルス暴露に対する防御を付与し得ることがデータによって示された。

コットンラット試験では、１群当たり４匹の動物に１０^４．５ｐｆｕのｗｔＡ２、ＭＲＫ２８７ｐ３またはＭＲＫ２８７ｐ１７ウイルスを筋肉内投与することにより免疫した。ｗｔＡ２ウイルスに対する血清中和（ＳＮ）抗体を測定するために、１４、２８および５６日目に血液サンプルを採取した。５６日目に免疫動物と未処置動物群の両方を、１０^５．５ｐｆｕのｗｔＡ２ウイルスで鼻内暴露させ、暴露４日目に鼻と肺の組織を採取した。３種類の全てのウイルスは単回筋肉内免疫によって顕著なＳＮ力価を誘導し、この価は２８日目当たりでピークに達し、動物にウイルスを暴露した５６日目まで持続した（図８）。Ａ２ウイルス投与を受けた動物は、ＭＲＫ２８７ウイルス投与を受けた動物に比較してより高いＳＮ力価を示した。これは、Ａ２株に対してＳＮ力価を測定したことによると考えられた。ｐ１７ウイルスの投与を受けた動物はＭＲＫ２８７ｐ３親ウイルスの投与を受けた動物に比較して２８日目と５６日目においてより高いＳＮ力価を誘導する傾向があったが、両者のＳＮ力価は同程度のものであった。ウイルス暴露の後、３種類の免疫群全ての肺組織からはウイルスが検出されず（図９）、このことはワクチン接種により下気道において完全な防御が得られたことを示している。鼻サンプルについては、ｗｔＡ２の投与を受けた動物からはウイルスが検出されず、ＭＲＫ２８７ｐ３またはｐ１７のいずれかの投与を受けた動物は非常に低い力価、即ち未処置動物の力価よりも約３ｌｏｇ低い力価を示した。

アフリカミドリザル試験では、それぞれ４匹の実験群と未処置対象群の２群を使用した。実験群では、０日目に１０^５．５ｐｆｕのＭＲＫ２８７ｐ１７ウイルスで動物を筋肉内免疫した。いずれの群も２８日目に２ｘ１０^５．５ｐｆｕのｗｔＡ２ウイルスを鼻内および気道内接種することによりウイルスに暴露させた。ウイルス力価検定のために、暴露後７日目に鼻スワブおよび肺洗浄を採取した。図１０は２８日目におけるＳＮ力価を示している。ワクチン接種を受けた動物は約１：１２８（７ｌｏｇ２）の平均ＳＮ力価を示した。ウイルス暴露の後、未処置の動物は７日目で鼻サンプルと肺サンプルにおいてそれぞれ３．５および５ｌｏｇｐｆｕ／ｍｌのウイルスを有していた（図１１）。ワクチン接種した動物は未処置の動物と比較して、鼻において約１ｌｏｇ低いウイルス力価、肺において３ｌｏｇ低い力価を示した。

実施例４
プラーク精製されたｐ１７
プラーク精製
継代１７ウイルスの遺伝的に単一な（クローン）個体群を得ることを目標として、それぞれのプラークを単離、回収することを目的に、ｐ１７ウイルス継代の力価を測定した。１ウェル当たり１０個以下のプラークを目標に定めてウイルスの力価を測定した。ウイルスストックの出発力価は１．７ｘ１０^６ｐｆｕ／ｍｌであり、アッセイに用いるための最終希釈は１：１０，０００、１：２０，０００および１：４０，０００の範囲であった。接種後７日目に、単層上の単一のプラークについて、肉眼および顕微鏡下の両方でプレートを目視した。継代１７ウイルスは２種類の異なったプラーク形態、即ち大形態（直径約２ｍｍ）と小形態（直径１ｍｍ以下）を形成した。最初の単離のために、１０の小形態（＃１−１０）と１０の大形態（＃１１−２０）を単離した。滅菌した１ｍＬ血清ピペットをアガロースに差込み、単離するプラークの周辺に円を描くことで単離を行った。吸引しながら領域を引き上げて、試料を１ｍＬのＲＳＶ維持培地に移し、分散させた後に５ｘ２００μＬに分注した。プラーク＃１と＃１１を選択して力価検定を行い、Ｖｅｒｏ組織培養プレート中で直ちに増幅した。分注試料の残りは液体窒素を用いて凍結し、−７０℃で保存した。二回目の増幅では、Ｖｅｒｏプレート中、１：２０、１：２００および１：２０００でプラークの力価検定を行った。親プラークから第２集団のプラークを作製するために、何枚かのプレートにはアガロースを重層し、また、その後の配列分析のために親プラーク＃１と＃１１のストックを作製するために他のプレートにはＲＳＶ維持液体培地を重層した。プラーク＃１と＃１１の二回目のプラークアッセイの中から２つのプラークが単離された。これらのプラークは、プレート上で他のプラークから離れて位置していたこと（したがって、混合集団を得る可能性が減少する）、プラークの形態が親と類似していたことから選択された。親プラークから各々２つのプラークを単離して、＃１−１および＃１−２と標識した（例えば、プラーク＃１１から単離されたプラークは＃１１−１および＃１１−２と命名した）。プラーク＃１−２を選択して力価検定を行い、３回目のプラーク精製において増幅し、１ｘ２００μｌのプラーク＃１−２をプラーク精製と増幅のために同時に力価検定して、親＃１−２の追加のストックを作った。＃１−２から単離されたプラークを＃１−２．１、＃１−２．２、＃１−２．３、＃１−２．４、＃１−２．５および＃１−２．６と標識した。＃１−２．１の分析の後に休止させた単離体において配列分析を行った結果、クローン化された集団であることが示された。

ウイルスストックのためのプラーク＃１−２．１の増幅
ウイルスストックの培養は既に概要を記した標準手順にしたがった。２００μｌの初代プラークをＶｅｒｏ細胞の１２ウェル培養中に増幅した。最初の増幅で得られたストック（ｐｐ１）を使用してＶｅｒｏＴ１５０培養に植え付け、回収した試料（ｐｐ２）を更に１回増幅して実験に使用するための大量（約１Ｌ）の材料を作製した。各スケールアップから得られた＃１−２．１のアリコットを用いて配列分析を行った。ｐｐ３材料はコットンラット研究のために利用した。

コットンラット暴露研究
４−８週齢の雌性コットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎｈｉｓｐｉｄｕｓ）４匹に、イソフルラン麻酔下で、０．１ｍｌ容量のウイルス１０^５ｐｆｕを０日目に鼻内接種した。肺（左肺）および鼻甲介を接種後４日に取り出し、氷上でＳＰＧ含有ハンクス平衡塩溶液（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）の１０倍量の中でホモジナイズした。サンプルを２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して浄化し、分注して直ちに−７０℃で凍結保存した。上記ウイルスには（１）ＭＲＫ２８７ｐ２２、（２）ＭＲＫ２８７ｐ１７、（３）プラーク精製したＭＲＫ２８７ｐ１７、（４）ＭＲＫ２８７ｐ１５、（５）ＭＲＫ２８７ｐ１０、（６）ＭＲＫ２８７ｐ５、（７）ＭＲＫ２８７ｐ３、および（８）ＲＳＶＡ２野生型が含まれる。鼻および肺ホモジネートをＶｅｒｏ細胞中で力価検定し、組織１グラム当たりのプラーク形成単位（ｐｆｕ）として示した。

結果
ＭＲＫ２８７継代１７（ｐ１７）をクローン化集団（"ｐ１７ｐｐ"）になるまでプラーク精製し、実施例２に記載したように配列決定した。プラーク精製されたウイルス中には、ＮＳ１タンパク質をコードする遺伝子内のヌクレオチド１６２位に該当するＲＳＶゲノム内のヌクレオチド２６０位において、１つの新たなヌクレオチド突然変異が認められた。これは非表現突然変異（即ち、アミノ酸変異の原因とはならない変異）である。配列番号８７は（例えばＳ２株の）ＮＳ１をコードする野生型遺伝子配列に該当する。配列番号８９はＭＲＫ２７とｐ１７内のＮＳ１をコードするヌクレオチド配列に該当する。配列番号９０はｐ１７ｐｐ内のＮＳ１をコードするヌクレオチド配列に該当する。表８および９は、ＭＲＫ２８７ｐ１７およびプラーク精製したもの（ｐ１７ｐｐ）における突然変異を比較した結果を示す。配列番号８８は（ｗｔＳ２ウイルス、ＭＲＫ２８７、ＭＲＫ２８７ｐ１７およびＭＲＫ２８７ｐ１７ｐｐにおいて同じである）ＮＳ１のアミノ酸配列に該当する。

（１）ＭＲＫ２８７ｐ２２、（２）ＭＲＫ２８７ｐ１７、（３）プラーク精製されたＭＲＫ２８７ｐ１７、（４）ＭＲＫ２８７ｐ１５、（５）ＭＲＫ２８７ｐ１０、（６）ＭＲＫ２８７ｐ５、（７）ＭＲＫ２８７ｐ３、または（８）ＲＳＶＡ２野生型を接種されたそれぞれの動物について、コットンラット暴露研究における４匹の動物の平均力価ならびに下側および上側信頼区間（ＣＩ）を表１０に示す。ＲＳＶＡ２野生型およびＭＲＫ２８７ｐ３のウイルス力価は約４ｌｏｇｐｆｕ／ｇ組織であった。ＭＲＫ２８７ｐ５肺サンプルは依然約４ｌｏｇウイルスｐｆｕ／ｇであった。これに対して、継代１０およびプラーク精製したＭＲＫ２８７ｐ１７を含むそれ以降の継代ウイルスは、肺および鼻サンプルのいずれにおいても野生型株に比較して２ｌｏｇを超えた減少を示した。更に、これらのデータは、プラーク精製されたＭＲＫ２８７ｐ１７がＭＲＫ２８７ｐ１７と同様に弱毒化されていることを証明している。

Claims

生弱毒化呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）であって、Ｇ、ＦおよびＬ遺伝子にコードされるタンパク質が、それぞれ配列番号１２、配列番号１８および配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、これらタンパク質が、配列番号１２の２０４位におけるグルタミン酸、配列番号１２の２０５位におけるグルタミン酸、配列番号１２の２１１位におけるアラニン、配列番号１２の２１３位におけるグルタミン酸、配列番号１２の２２１位におけるグリシン、配列番号１２の２２３位におけるグリシン、配列番号１２の２３２位におけるグリシン、配列番号１８の２９４位におけるリシン、配列番号１８の４８６位におけるグリシン、配列番号２４の１４８位におけるアラニンおよび配列番号２４の２０５４位におけるフェニルアラニンを含む前記生弱毒化呼吸器合胞体ウイルス。
Ｇ、ＦおよびＬ遺伝子にコードされるタンパク質が、それぞれ配列番号１２、配列番号１８および配列番号２４のアミノ酸配列から成る請求項１に記載の弱毒化ＲＳＶ。
ウイルスゲノムを含む生弱毒化呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）であって、ウイルスゲノムが、それぞれ配列番号９０、配列番号５、配列番号１１、配列番号１７および配列番号２３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％同一であるＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ、ＦおよびＬ遺伝子を含み、Ｇ遺伝子にコードされるタンパク質が、配列番号１２の２０４位におけるグルタミン酸、配列番号１２の２０５位におけるグルタミン酸、配列番号１２の２１１位におけるアラニン、配列番号１２の２１３位におけるグルタミン酸、配列番号１２の２２１位におけるグリシン、配列番号１２の２２３位におけるグリシンおよび配列番号１２の２３２位におけるグリシンを含み、Ｆ遺伝子にコードされるタンパク質が、配列番号１８の２９４位におけるリシンおよび配列番号１８の４８６位におけるグリシンを含み、Ｌ遺伝子にコードされるタンパク質が、配列番号２４の１４８位におけるアラニンおよび配列番号２４の２０５４位におけるフェニルアラニンを含む、前記生弱毒化呼吸器合胞体ウイルス。
ウイルスゲノムが、それぞれ配列番号９０、配列番号５、配列番号１１、配列番号１７および配列番号２３のヌクレオチド配列から成るＮＳ１、ＮＳ２、Ｇ、ＦおよびＬ遺伝子を含む請求項３に記載の弱毒化ＲＳＶ。