JP2012507995A

JP2012507995A - Ｈｌａ−ｇポリペプチドおよびその医薬的使用

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Publication number: JP2012507995A
Application number: JP2011535102A
Authority: JP
Inventors: ファヴィエ，ブノア; カロゼッラ，エドガルド・ディ; ルモー，ジョエル
Original assignee: Hla G Technologies
Current assignee: Hla G Technologies
Priority date: 2008-11-07
Filing date: 2009-11-04
Publication date: 2012-04-05
Also published as: WO2010052229A1; CA2742521A1; US20110274711A1; EP2184297A1; EP2350125A1

Abstract

本発明は、新規タンパク質およびその医薬的使用に関する。より具体的には、本発明は、ｂ２ミクログロブリンの配列に融合されたＨＬＡ−５抗原の配列を含む新規タンパク質に関する。本発明はまた、そのようなポリペプチドを生産する方法、それを含む医薬組成物、および臓器／組織拒絶反応を含む様々な疾患を処置するためのその使用に関する。

Description

本発明は、新規タンパク質およびその医薬的使用に関する。より具体的には、本発明は、Ｂ２ミクログロブリンに融合されたＨＬＡ−Ｇ５抗原のドメインを含む新規融合タンパク質に関する。本発明はまた、そのようなタンパク質を生産する方法、それを含む医薬組成物、および臓器／組織拒絶反応を含む様々な疾患を処置するためのその使用に関する。

主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原は、３つの主要なクラス、すなわちクラスＩ抗原、クラスＩＩ抗原（ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＲ）、およびクラスＩＩＩ抗原に分けられる。

クラスＩ抗原は、３つの球状ドメイン（［アルファ］１、［アルファ］２および［アルファ］３）を示す従来型抗原ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃを含み、ならびに非従来型抗原ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇを含む。

ＨＬＡ−Ｇは、正常ヒト胎盤の絨毛外トロホブラストおよび胸線上皮細胞によって発現されている非古典的ＨＬＡクラスＩ分子である。ＨＬＡ−Ｇ抗原は、本質的に、胎盤のサイトトロホブラスト細胞によって発現されており、母性免疫系から胎児を防御する免疫調節剤として機能する（母親による拒絶反応の欠如）。ＨＬＡ−Ｇ遺伝子の配列は、すでに記載されており（例えば、Geraghty et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 9145-9149 ; Ellis; et al., J. Immunol., 1990, 144, 731-735）そして４３９６塩基対を含む。この遺伝子は、８つのエクソン、７つのイントロンおよび３’非翻訳末端から成り、各々が以下のドメインに対応している：エクソン１：シグナル配列、エクソン２：アルファ１細胞外ドメイン、エクソン３：アルファ２細胞外ドメイン、エクソン４：アルファ３細胞外ドメイン、エクソン５：膜貫通領域、エクソン６：細胞質ドメインＩ、エクソン７：細胞質ドメインＩＩ（非翻訳）、エクソン８：細胞質ドメインＩＩＩ（非翻訳）および３’非翻訳領域。

７つのＨＬＡ−Ｇのアイソフォームが、同定されており、そのなかで４つは、膜結合性であり（ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３およびＨＬＡ−Ｇ４）そして３つは、可溶性である（ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６およびＨＬＡ−Ｇ７）（例えば、Carosella et al., Blood 2008, vol. 111, p 4862を参照）。

成熟Ｇ１タンパク質アイソフォームは、３つの外部ドメイン（α１−α３）、膜貫通領域および細胞質ドメインを含む。
Ｇ２タンパク質アイソフォームは、α２を含まず、すなわち、α１およびα３ドメインが、直接連結され、その後に膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインが続く。
Ｇ３タンパク質アイソフォームは、α３およびα３ドメインの両方を欠いており、すなわち、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに直接連結されているα１ドメインを含む。
Ｇ４タンパク質アイソフォームは、α３ドメインを欠いており、すなわち、α１ドメイン、α２ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。

可溶性ＨＬＡ−Ｇアイソフォームは、全て膜貫通および細胞質ドメインを欠いている。より具体的には：
Ｇ５タンパク質アイソフォームはα１、α２およびα３ドメイン、ならびにイントロン４によりコードされている２１アミノ酸残基の外Ｃ末端ペプチド配列（転写スプライシングおよびＲＮＡ成熟後のイントロン４の保持の結果である）を含有する。
Ｇ６タンパク質アイソフォームは、α２を含有しないＧ５に対応し、すなわち、ＨＬＡ−Ｇ６はα１およびα３ドメイン、ならびにイントロン４によりコードされている２１アミノ酸残基の外Ｃ末端ペプチド配列（転写スプライシングおよびＲＮＡ成熟後のイントロン４の保持の結果である）を含有する。
Ｇ７タンパク質アイソフォームは、α１ドメインのみ、およびイントロン２にコードされている２つの付加的なＣ末端アミノ酸残基（転写スプライシングおよびＲＮＡ成熟後のイントロン２の保持の結果である）を含有する。

これらのアイソフォームは全て、例えば、Kirszenbaum M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 4209-4213；欧州出願EP 0 677 582； Kirszenbaum M. et al., Human Immunol., 1995, 43, 237-241； Moreau P. et al., Human Immunol., 1995, 43, 231-236）に記載されている。

以前の研究により、ＨＬＡ−Ｇタンパク質は、同種異系免疫反応、例えば増殖性Ｔリンパ球細胞反応、細胞障害性Ｔリンパ球を介した細胞溶解、およびＮＫ細胞を介した細胞溶解を抑制することができることが示されている（Rouas-Freiss N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, 94, 5249-5254 ； Semin Cancer Biol 1999, vol 9, p. 3）。その結果、ＨＬＡ−Ｇタンパク質は、同種異系間または異種間の臓器／組織移植における移植片拒絶反応を処置するために提案されている。ＨＬＡ−Ｇタンパク質はまた、がん（EP1 054 688）、炎症性疾患（EP1 189 627）および、より一般的には、免疫と関連する疾患の処置のために提案されている。ＨＬＡ−Ｇが特定の細胞または組織を標的とするようにＨＬＡ−Ｇタンパク質を特異的なリガンドに融合することもまた、提案されている（WO2007091078）。しかしながら、そのような標的化融合が活性であるということを示す結果や実験データは、いまだ提供されていないということに、留意しなければならない。

現在、医薬的目的のためにどのようなコンフォメーションが最も活性であるのか、どのようにＨＬＡ−Ｇの可溶型を用いることができるのか、そしてＨＬＡ−Ｇのどのドメインが最も効果的な療法に必要であるのかは、明らかになっていない。

本発明は、新規タンパク質またはポリペプチド、それを含む医薬組成物、およびその使用に関する。より具体的には、本発明は、Ｂ２ミクログロブリンの配列に融合したＨＬＡ−Ｇ５抗原の配列を含む、新規ポリペプチドに関する。実施例の節において示すように、このポリペプチドは、ｉｎｖｉｖｏにおいて生物学的に活性であり、二量体を形成することができ、そして移植片拒絶反応モデルにおいて強力な免疫応答を引き起こすことができる。このポリペプチドは従って、そのような障害、および他の免疫に関する疾患を処置するための薬剤候補を示す。

本発明の目的は従って、ＨＬＡ−Ｇ５抗原配列に融合したβ２ミクログロブリン配列を含む融合ポリペプチドに属する。より好ましい実施態様においては、ＨＬＡ−Ｇ５抗原は、ヒトＨＬＡ−Ｇ５抗原である。さらに、より好ましい実施態様においては、β２ミクログロブリン配列は、スペーサーグループを通じてＨＬＡ−Ｇ５抗原配列に融合し、そして／または該ポリペプチドのＮ末端部分に位置する。

本発明の好ましい目的は、以下の構造を含むポリペプチドである：
Ｂ２Ｍ − ＳＰＡＣＥＲ − ＨＬＡ−Ｇ５
ここで、Ｂ２Ｍは、β２ミクログロブリンの配列であり；ＳＰＡＣＥＲは、好ましくは５〜２０アミノ酸残基を含むスペーサーグループの配列であり；そしてＨＬＡ−Ｇ５は、ＨＬＡ−Ｇ５抗原の配列である。

本発明のさらなる目的は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に属する。

本発明はまた、上記で定義した核酸分子を含むベクターに関する。

本発明の別の目的は、上記で定義した核酸分子またはベクターを含むリコンビナント宿主細胞である。

本発明のさらなる目的は、上記で定義したポリペプチドを生産する方法であって、ここで、該方法は、該核酸分子の発現を可能にする条件下で本発明のリコンビナント宿主細胞を培養すること、そして生産された該ポリペプチドを回収すること、を含む。

本発明はさらに、本発明のポリペプチドの二量体（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体)に関する。

本発明はまた、本発明の融合ポリペプチドまたはその二量体に特異的に結合する抗体に関する。

本発明はまた、上記で定義したポリペプチドを、単量体としてまたは多量体として含む医薬組成物に関する。

本発明はまた、上記で定義したポリペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物、またはそのようなポリペプチドを発現するリコンビナント細胞に関する。

本発明はさらに、臓器または組織拒絶反応、炎症性疾患もしくは自己免疫疾患を処置するためのそのようなポリペプチドまたは医薬組成物に関する。

本発明のさらなる目的はまた、臓器／組織拒絶反応を処置する方法であって、有効量の本発明のポリペプチドまたは組成物をそれらを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。より具体的には、該方法は、組織／臓器移植の前に、最中におよび／またはその後に、該ポリペプチドまたは組成物を該対象に投与することを含む。

本発明のさらなる目的は、対象における移植片に対する寛容を促進する方法であって、それらを必要とする対象に有効量の上記で定義したようなポリペプチドまたは組成物を投与することを含む方法である。

本発明を、任意の哺乳類の対象に、好ましくはヒト対象に使用してもよい。以下にさらに開示されるように、本発明のポリペプチドは、ｉｎｖｉｖｏでの同種異系または異種移植の後の組織拒絶反応を実質的に抑制することができる。

図１：ＨＬＡ−Ｇ５−Ｂ２Ｍは、二量体を形成することができる。図２：ＨＬＡ−Ｇ５−Ｂ２Ｍは、ｉｎｖｉｖｏでの移植片生存を促進する。

発明の詳細な説明
本発明は、Ｂ２Ｍに融合したＨＬＡ−Ｇ５抗原を含む融合ポリペプチドに関する。本発明の融合ポリペプチドは、生物学的に活性であり、ｉｎｖｉｖｏでの移植片拒絶反応を効果的に抑制することが示されてきた。より具体的には、発明者らは、ＨＬＡ−Ｇ５抗原をＢ２Ｍに融合することにより、高い免疫効果を示す生物学的に活性であるタンパク質が得られることを明らかにした。本願で提示される結果は、そのようなポリペプチドが、ｉｎｖｉｖｏで非常に効果的に移植片寛容を促進することができ、そしてそれゆえに免疫に関する障害を処置するための、特に対象における望まれないまたは有害な免疫応答を低下させるための新規薬剤を代表することを示す。

従って、本発明の第一の目的は、ＨＬＡ−Ｇ５抗原のアミノ酸配列と融合されたＢ２Ｍのアミノ酸配列を含むポリペプチドに属する。

本発明に関連して、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマー（それらはアミノ結合を介してまたは改変された、ペプチド模倣の結合を通じて一緒に結合されていてもよい）を含む分子を指す。前記タンパク質またはポリペプチド中の該アミノ酸残基は、天然アミノ酸残基、もしくは非天然または改変されたアミノ酸残基のいずれであってもよい。それらはＬおよび／またはＤ型であってもよい。また、該ポリペプチドまたはタンパク質は、例えば、末端に保護されておよび／または改変されて（例えば、ラテラルファンクション（lateral functions）の化学的または物理的変化によって）いてもよい。

本発明のポリペプチドにおいて、種々のポリペプチドドメインは、共有結合により一緒に結合されており、その結果それらを、最も好ましくは、リコンビナント技術によって単一分子として生産できる。つまり、それらは、アミン結合により融合されている。

本発明のタンパク質において、Ｂ２Ｍ配列は、ＨＬＡ−Ｇ５配列のＮ末に位置しており、そしてそれらは、スペーサーグループを介して一緒に結合されており、それは以下の構造で表わされる：
Ｂ２Ｍ − ＳＰＡＣＥＲ − ＨＬＡ−Ｇ５
ここで、Ｂ２Ｍは、β２ミクログロブリンの配列であり；ＳＰＡＣＥＲは、スペーサーグループの配列であり、；そしてＨＬＡ−Ｇ５は、ＨＬＡ−Ｇ５抗原の配列である。

Ｂ２ミクログロブリン（“Ｂ２Ｍ”）は、１１．８ＫＤａの血清タンパク質であり、ほぼ全ての有核細胞の表面上で主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ重鎖との会合がみられる。ベータ２ミクログロブリンは、ＨＬＡ分子の細胞表面発現に必須である。

Ｂ２Ｍの配列の具体的な例を、配列番号２中に開示する（アミノ酸残基２１−１１９を参照）。別のＢ２Ｍ配列を、genebankよりまたは他の刊行物より得てもよいことを理解されたい（例えば、Genebank番号NC_000015、GeneID：567、該配列の最初の刊行物：Gussow et al., 1987 [PubMed 3312414]を参照）。更に、Ｂ２Ｍの天然変異（例えば、ポリモルフィズムの結果として）が、存在し、それは、本願に含まれる。また、上記配列の変異体で、ある程度（例えば、１〜１０、好ましくは１〜５、最も好ましくは１、２、３、４または５）のアミノ酸残基を欠き、そして／またはある程度（例えば、１〜１０、好ましくは１〜５、最も好ましくは１、２、３、４または５）のアミノ酸置換または挿入を含有する変異体も、本発明に含まれる。

スペーサーグループは、ポリペプチドの適切なリフォールディングを可能にする任意のグループ（例えば、ペプチド）を指す。該スペーサーは、可変の長さを有することができ、そして好ましくは生物学的に不活性であるべきである。典型的には該スペーサーは、８〜２０、より好ましくは８〜１５、さらにより好ましくは１２〜１５の長さのアミノ酸残基のペプチドである。特定の実施態様において、該スペーサーグループは、（Ｇ４Ｓ）ｎ配列（ここでｎは、２または３である）を有する。

該ポリペプチドに含まれるＨＬＡ−Ｇ５ドメインは、ＨＬＡ−Ｇ５抗原の、好ましくはヒトＨＬＡ−Ｇ５抗原のアミノ酸配列、またはその変異体を含む。前に示したように、ＨＬＡ−Ｇ５タンパク質アイソフォームは、α１、α２およびα３ドメイン、ならびに（リーディングフレームの改変の結果として）イントロン４にコードされる２１アミノ酸残基の外Ｃ末端ペプチド配列を含有する可溶性タンパク質である。ＨＬＡ−Ｇ５は、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインは含有しない。

本発明に関連して、用語「ＨＬＡ−Ｇ５抗原」は従って、ＨＬＡ−Ｇ抗原のα１、α２およびα３ドメインの配列を含有し、そして膜貫通および細胞質ドメインを欠く、ポリペプチドを指す。より好ましい実施態様において、ＨＬＡ−Ｇ５はさらに、ＨＬＡ−Ｇのイントロン４にコードされる２１アミノ酸残基の付加的なＣ末端ペプチド配列を含む。

ＨＬＡ−Ｇ５配列の具体的な例は、α１、α２およびα３ドメイン、ならびにイントロン４にコードされる２１アミノ酸残基のＣ末端ペプチド配列からなる配列である。

ヒトＨＬＡ−Ｇ５抗原のアミノ酸配列の例を、配列番号２中に提供する（アミノ酸残基１３５〜末端を参照）。他のＨＬＡ−Ｇ５配列は、オンライン（例えば、Fujii, T et al, Journal of Immunology, 1994. PMID: 7989753を参照）または例えば、米国特許番号ＵＳ５，８５６，４４２およびＵＳ６，２９１，６５９中で入手可能である。

当然のことながら、ＨＬＡ−Ｇ５の天然変異体（例えば、ポリモルフィズムの結果として）が、存在し、それは、本願に含まれる。また、上記配列の変異体で、ある程度（例えば、１〜１０、好ましくは１〜５、最も好ましくは１、２、３または４）のアミノ酸残基を欠き、そして／またはある程度（例えば、１〜１０、好ましくは１〜５、最も好ましくは１、２、３または４）のアミノ酸置換または挿入を含有する変異体も、本発明に含まれる。

本発明の融合ポリペプチドの具体的な例は、配列番号２のＨＬＡ−Ｇ５−Ｂ２Ｍである。ＨＬＡ−Ｇ５−Ｂ２Ｍにおいて、ヒトＢ２Ｍアミノ酸配列は、該ポリペプチドのＮ末側に位置しており、そして（Ｇ４Ｓ）３スペーサーグループを介してヒトＨＬＡ−Ｇ５抗原の配列と結合している。ＨＬＡ−Ｇ５−Ｂ２Ｍはさらに、該ポリペプチドの分泌を可能にするＢ２Ｍのリーダーペプチド配列（アミノ酸残基１〜２０）を含む。

本発明のさらなる具体的なポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基２１〜末端（すなわち、リーダーペプチド配列を欠く）を含むポリペプチドである。

実施例において言及するように、そのようなＢ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｇ５ポリペプチドは、ｉｎｖｉｖｏで移植片寛容を促進することができる。

この点において、本発明は、はじめて、ＨＬＡ−Ｇ抗原を、特異的な分子配列を介してＢ２Ｍ配列と融合し、十分に活性である生体分子を生産できることを実証する。従って本発明はまた、以下の構造を有するポリペプチドに属する：
Ｂ２Ｍ − ＳＰＡＣＥＲ − ＨＬＡ−Ｇ抗原
Ｎ末Ｃ末
ここで、Ｂ２Ｍは、上記で定義したβ２ミクログロブリン配列であり；ＳＰＡＣＥＲは、上記で定義したスペーサーグループであり；そしてＨＬＡ−Ｇは、ＨＬＡ−Ｇ抗原の配列である。ＨＬＡ−Ｇ抗原の配列は典型的には、ＨＬＡ−Ｇ抗原の、好ましくはヒトＨＬＡ−Ｇ抗原の少なくともα１ドメインの配列を含む。

本発明のさらなる目的は、上記で定義したポリペプチドの二量体である。該二量体は、ホモ二量体、例えば、同一のポリペプチド間であってもよく、またはヘテロ二量体、例えば、少なくとも１つの本発明のポリペプチドを含む二量体であってもよい。

本発明のポリペプチドを、当該技術分野でそれ自体公知の技術、例えば人工合成、リコンビナント技術、および／またはそれらの組み合わせを用いて得ることができる。典型的な実施態様において、実施例中に例証するように、該ポリペプチドを、キメラコードポリヌクレオチドから開始して、リコンビナント技術によって生産する。

この点において、本発明のさらなる目的は、上記で定義したポリペプチドをコードする核酸分子である。該核酸は、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ、一本鎖または二本鎖であってもよい。それを、当該技術分野でそれ自体公知の技術、例えば遺伝子工学、化学合成または酵素的合成などを用いて生産してもよい。特定の実施態様において、該核酸はさらに、該ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された、分泌のためのリーダーペプチドをコードする配列を含む。その結果、そのような核酸の発現は、選択された宿主細胞によるポリペプチドの分泌を導く。該リーダーペプチドは、ヒトまたは哺乳類の遺伝子から、例えば、Ｂ２Ｍ、インターロイキン、ＨＬＡ−Ｇなどの種々の起原のリーダーペプチドであってもよい。本発明の核酸の具体的な例は、配列番号１（またはそれのヌクレオチド残基６１〜末端、すなわちリーダー配列なし）を含む。

本発明のさらなる目的はまた、上記で定義した核酸を含むベクターに属する。該ベクターは、クローニングおよび／または発現ベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスベクター、人工染色体などであってもよい。そのようなベクターの具体的な例は、ｐＦＵＳＥプラスミド、ｐＵＣプラスミド、ｐｃＤＮＡプラスミド、ｐＢＲプラスミド、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ラムダファージベクターなどを含む。該ベクターは制御配列、例えばプロモーター、ターミネーター、複製開始点などを含んでいてもよい。該ベクターを、ｉｎｖｉｔｒｏでリコンビナント技術により、またはｉｎｖｉｖｏで直接的に、遺伝子治療法において本発明のポリペプチドを生産するために用いてもよい。

本発明のさらなる目的は、上記で定義した核酸またはベクターを含むリコンビナント宿主細胞である。該宿主細胞は、原核生物または真核生物であってもよい。原核生物宿主の例は、Ｅ．ｃｏｌｉといった任意のバクテリアを含む。真核生物の例は、酵母、真菌、哺乳動物細胞、植物細胞、または昆虫細胞を含む。本発明のリコンビナント細胞を、当該技術分野においてそれ自体公知の形質転換技術、例えばトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、プロトプラスト形質転換などによって調製してもよい。これらの細胞を、任意の適切な培養培地によって維持および培養してもよい。

本発明のリコンビナント細胞を使用して、例えばｉｎｖｉｔｒｏでまたはｅｘｖｉｖｏで本発明のポリペプチドを生産してもよく、または細胞治療製品として、ｉｎｖｉｖｏで該ポリペプチドを生産してもよい。

この点において、本発明の目的はまた、上記で開示したポリペプチドを生産する方法であって、核酸分子の発現を可能にする条件下で本発明のリコンビナント宿主細胞を培養すること、および生産された該ポリペプチドを回収することを含む方法に属する。該ポリペプチドを、当該技術分野でそれ自体公知の技術、例えば遠心、濾過、クロマトグラフ法などを用いて回収および／または精製してもよい。

生産において、本発明のポリペプチドを、改変して、それらの特性を改善してもよく、例えばそれらの薬物動態特性を改善してもよい。この点において、それらを、末端保護基（例えば、アミド、エステル）を付加することにより改変して、それらのプロテアーゼに対する安定性または抵抗性を向上させてもよい。それらをまた、キャリアサポート（carrier support）上にコートして、ポリペプチド密度を増加させてもよい。

本発明のさらなる目的は、上記で定義したポリペプチドおよび、好ましくは医薬的に許容できる賦形剤または担体を含む医薬組成物である。

本発明のさらなる目的は、上記で定義した核酸および、好ましくは医薬的に許容できる賦形剤または担体を含む医薬組成物である。

本発明のさらなる目的は、上記に定義したリコンビナント細胞および、好ましくは医薬的に許容できる賦形剤または担体を含む医薬組成物である。

適切な賦形剤または担体は、任意の医薬的に許容できるビヒクル、たとえば緩衝剤、安定化剤、希釈剤、塩、保存剤、乳化剤、甘味料などを含む。賦形剤は典型的には、等張の水溶液または非水溶液を含み、それらは公知の技術によって調製することができる。適切な溶液は、緩衝化溶質、例えばリン酸緩衝液、塩化物溶液、リンガー溶液などを含む。薬剤は典型的には、注射可能な組成物、好ましくは液体の注射可能な組成物の形態であるが、他の形態、例えば錠剤、カプセルゲル（gelules）、カプセル、シロップもまた、考慮してもよい。本発明の組成物を、複数の異なる経路によって、例えば全身性、非経口性、経口性、直腸性、経鼻性または膣性経路によって投与してもよい。それらを好ましくは、注射、例えば静脈内、動脈内、筋肉内、腹膜内、または皮下注射によって投与する。経皮性投与もまた、考慮する。具体的な投与量を、当業者によって調整してもよく（それは病態、対象、処置期間、他の活性成分の存在などに依存する）、典型的には、該組成物は、１０ng〜１mg、より好ましくは１０ng〜１００mg、さらにより好ましくは１０μg〜１００mgの単位用量の融合ポリペプチドを含む。

本発明の組成物を、好ましくは有効量、すなわち、経時的に、疾患の進行を少なくとも遅らせ、または妨げるのに十分な量を投与する。これに関して、本発明の組成物を、好ましくは、対象における有害なまたは望まれない免疫応答の低下を可能にする量で使用する。

上記で言及したように、本発明のポリペプチドは、強力な免疫制御活性を有し、よって異常なまたは望まれない免疫応答に関連する種々の疾患の状態を処置するのに使用してもよい。より具体的には、本発明のポリペプチドは、免疫に関連する障害、例えば特に、臓器または組織拒絶反応、炎症性疾患もしくは自己免疫疾患を処置することに適している。

実施例の節で開示されるように、本発明のポリペプチドは、ｉｎｖｉｖｏでの同種異系または異種移植片拒絶反応を実質的に抑制することができる。

本発明の目的は従って、移植片拒絶反応を処置するための上記で開示されたポリペプチドまたは組成物に属する。

本発明のさらなる目的は、対象における移植片拒絶反応を処置する方法であって、有効量の上記で開示された組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む方法に属する。

処置するという用語は、例えば（移植を）受けた対象での移植片寛容の促進を指す。該処置を、移植の前に、最中におよび／またはその後に、行うことができ、そして現存する免疫抑制剤の代替療法として、または実際の免疫抑制剤との併用療法として使用してもよい。本発明は、同種異系の、半同種異系の、または異種の移植にでさえ適用可能であり、そして移植された臓器または組織、それらは、限定せずに、固形組織、液体組織または細胞を含み、それらは心臓、皮膚、腎臓、肝臓、肺、肝腎などを含むが、その任意の型のために使用してもよい。

本発明のさらなる目的は、対象における臓器または組織を移植するための改善された方法であり、該改善は、有効量の上記で開示された組成物を、移植の前に、最中におよび／またはその後に、対象に投与することを含む。

本発明のさらなる目的は、対象における移植片寛容を促進するための方法であって、有効量の上記で開示された組成物を移植の前に、最中におよび／またはその後に、対象に投与することを含む方法である。

本発明のさらなる目的は、対象における移植片拒絶反応を低下させるための方法であって、有効量の上記で開示された組成物を移植の前に、最中におよび／またはその後に、対象に投与することを含む方法である。

本発明のさらなる目的は、自己免疫疾患を処置するための上記で開示されたポリペプチドまたは組成物に属する。本発明はまた、対象における自己免疫疾患を処置する方法であって、有効量の上記で開示された組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む方法に属する。自己免疫疾患は、関節リウマチ、クローン病または多発性硬化症であってもよい。そのような疾患の状態において、本発明は、病態の原因である有害な免疫応答を低下させることを可能にする。

本発明の他の目的は、炎症性疾患を処置するための上記で開示されたポリペプチドまたは組成物に属する。

本発明のさらなる目的は、対象における炎症性疾患を処置する方法であって、有効量の上記で開示された組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む方法に属する。

当然のことながら、実際に投与される該組成物の量を、関連する状況、処置される状態または状態群、投与された正確な組成物、年齢、体重、ならびに個々の患者の応答、患者の症状の重症度、および選択された投与経路を含む状況などを考慮して、医師によって決定しそして適応するべきである。従って、上記の用量の範囲は、本明細書における教示のための一般的なガイダンスおよびサポートを提供することを目的としており、本発明の範囲を限定することを目的としていない。

本発明のさらなる局面および利点は、本願の範囲を限定せず例示としてみなされるべき、以下の実施例で開示されるであろう。

材料および方法
ＰＣＲによる増幅
ＰＣＲを、ＤＮＡ２０ng、各プライマー２００nM、ｄＮＴＰ２００μM（Invitrogen）、ＰＣＲ緩衝液１０Ｘ（Perkin Elmer）２．５μl、Ｔａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer）２．５ユニットおよび水２７μlを含有する最終容量５０μlでＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６００（Perkin Elmer）により行った。

使用されたプログラムは、以下：
９４℃で５分間のＤＮＡ変性の後に３０サイクルの：
９４℃で３０秒
５８℃で３０秒
７２℃で１分
最後のサイクルの最後に７２℃で５分間ステップを行った。

ベクター
ｐＦＵＳＥ−ｈＦｃ１およびｐＦＵＳＥ−ｍＦｃ２ベクターを、いずれもInvivoGen社より購入した。

酵素消化
酵素の制限消化を、製造業者（invitrogen）が推奨する通りに行った。典型的には、消化を、ＤＮＡ１μgおよび制限酵素５ユニットで適切な緩衝液中で３７℃で１時間行った。

ライゲーション
ＰＣＲ断片の発現ベクターへのライゲーションを、PromegaのＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて製造業者が推奨する通りに行った。ＨＬＡ−Ｇ５−ベータ２ミクログロブリンのコンストラクションについては、ＰＣＲ断片のｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ．５−Ｈｉｓ−Ｔｏｐｏ（Invitrogen）へのライゲーションを、３．１ＤｉｒｅｃｔｉｏｎａｌＴＯＰＯ（登録商標）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて直接的に行った。

プラスミド精製
プラスミド精製を、ＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）ＰｌａｓｍｉｄＭｉｄｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ）を用いて製造業者が推奨する通りに行った。

タンパク質生産
融合タンパク質の生産のために、ＨＥＫ２９３細胞またはＨＥＬＡ細胞を、リポフェクトアミン法（invitrogen）を用いて様々なコンストラクトでトランスフェクションし、１０％ウシ胎仔血清および０．３Mグルタミンを添加したＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｃｏの改変ＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ）中で３７℃、５％ＣＯ_２で維持した。４８時間後に、上清を、回収し、０．２μMフィルターを通して濾過し、そして実験のためにまたはストックを調製するために使用した。

実施例１：ＨＬＡ−Ｇ５-Ｂ２Ｍのクローニングおよび合成
α１、α２およびα３ドメインと融合したベータ２ミクログロブリンを、プラスミドｐＦＵＳＥ−ｈＦｃ１−ＨＬＡＧ１−Ｂ２Ｍを鋳型として（未発表）、プライマー＜＜Ｂ２ＭｓｉｇＴＯＰＯセンス＞＞５’ＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣ（配列番号３）およびＨＬＡ−Ｇ５からのイントロン４配列を含有するプライマー＜＜アルファ３−ｉ４−Ｘｈｏ−終止アンチセンス＞＞：５’ＡＴＣＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧＡＧＧＴＣＴＴＣＡＧＡＧＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＴＴＣＣＣＴＡＡＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＣＴＣＣＴＴＡＣＴＣＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＡＧ３’（配列番号４）を用いてＰＣＲにより増幅した。該ＰＣＲ断片を次に、３．１ＤｉｒｅｃｔｉｏｎａｌＴＯＰＯ（登録商標）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＫｉｔ（Invitrogen）を用いてｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ．５−Ｈｉｓ−Ｔｏｐｏベクター（Invitrogen）にライゲーションした。
結果として得られたｃＤＮＡ配列を、配列番号１に記載する。該タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号２に記載する。

該タンパク質を、材料および方法で開示した通りに生産した。

実施例２：ＨＬＡ−Ｇ５-Ｂ２Ｍは、二量体を形成する
図１は、ポリアクリルアミド電気泳動による、ＨＬＡ−Ｇ５−ベータ２ミクログロブリン二量体（上側バンド）および単量体（下側バンド）のタンパク質移動を表わす。上清に存在するＨＬＡ−Ｇ５ベータ２ミクログロブリンタンパク質を、抗ＨＬＡ−Ｇ５抗体（ＭＥＭＧ／０９）によって前もってコートしたＰｒｏｔｅｉｎＧｓｅｐｈａｒｏｓｅｂｅａｄｓ（GE Healthcare）を用いて免疫沈降した。免疫沈降物を、１×ＰＢＳで三回洗浄した。タンパク質を次に非還元条件で試料緩衝液でインキュベーションすることにより溶出し、煮沸し、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、そしてＨｙｂｏｎｄＥＣＬニトロセルロースメンブレン（Amersham Pharmacia Biosciences）に転写した。１×ＰＢＳ中の５％脱脂乳でインキュベーションした後、該メンブレンを、抗ＨＬＡ−Ｇ（４Ｈ８４）抗体で一晩インキュベーションし、そして西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲーションしたヤギ抗マウス二次抗体を用いて処理した。該メンブレンをＥＣＬｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（Amersham Pharmacia Biosciences）を用いて処理した。

示された結果から、本発明の融合タンパク質が、二量体を形成する能力を有することを実証する。

実施例３：ＨＬＡ−Ｇ５-Ｂ２Ｍは、ｉｎｖｉｖｏでの同種異系皮膚移植片の生存を促進する
材料
硫酸ラテックスビーズ４％ｗ／ｖ５μm（Invitrogen）
ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅコート抗マウスＩｇＧＦｃ断片１．８mg/ml（Jackson ImmunoResearch）
ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅコート抗ヒトＩｇＧＦｃ断片１．３mg/ml（Jackson ImmunoResearch）
ＨｅＬａネガティブコントロール
ＨＬＡＧ５−Ｂ２Ｍ１．５μg/ml

方法
全てのＨＬＡ−Ｇ／Ｆｃ融合タンパク質について、１０^８硫酸ラテックスビーズを、２０μg/mlＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅコート抗マウス（または抗ヒト）ＩｇＧＦｃ断片を用いて３７℃で２時間コートし、その後ＢＳＡ（２mg/ml）をもちいて２時間インキュベーションした。洗浄後、該ビーズを０．５μg/mlのＨＬＡ−Ｇ／Ｆｃ融合タンパク質を用いて４℃で１６時間インキュベーションした。その後、該ビーズを、１×ＰＢＳで２回洗浄した。５mlのＨＬＡ−Ｇ／Ｆｃ融合タンパク質（１μg/ml）を、５×１０^６硫酸ラテックスビーズに対して使用した。ネガティブコントロールとして、硫酸ラテックスビーズを、ＨＬＡ−Ｇ／Ｆｃ融合タンパク質ではなく１×ＰＢＳまたはＨｅＬａネガティブコントロールを使用した以外は同様の方法で調製した。硫酸ラテックスビーズ（５×１０^６）を、皮膚移植の前日に腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した。

特定病原体除去のＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスおよびＩＬＴ４−トランスジェニックマウス（Ｈ−２ｂ）（８〜１０週齢）を、研究を通して皮膚移植レシピエントとして使用した。レシピエントマウスは、ＨＬＡ−Ｇを結合したマイクロスフェアを投与され、ドナー皮膚は、ＭＨＣクラスＩＩの異なるＢ６.ＣＨ−２ｂｍ１２（ｂｍ１２、Ｈ−２ｂ）マウスからである。同種異系皮膚移植を、標準方法により行った。簡単に述べると、ドナーマウス（１２〜１４週齢）の尾からの皮膚（１．０cm^２）を、レシピエントである麻酔されたマウスの側腹部に移植した。移植片を、ガーゼおよび絆創膏で覆い、１０日目に取り除いた。移植片を、拒絶反応（移植組織の８０％が壊死し、サイズが小さくなると定義される）まで毎日記録した。全ての皮膚移植生存データを、Kaplan-Meier生存分析により試験した。

結果
結果を、図２に示す。結果は、ＨＬＡ−Ｇ５-Ｂ２Ｍが、ｉｎｖｉｖｏでの移植片寛容を実質的に改善することが出来たことを示している。該モデルにおける移植生存の各日は、ヒト対象における移植生存の少なくともほぼ一カ月に相当することに留意しなければならない。

配列表
配列番号：１：ｃＤＮＡ

配列番号２：ＨＬＡ−Ｇ５／β２ｍのアミノ酸配列

Claims

Ｎ端からＣ端の向きに、β２ミクログロブリンのアミノ酸配列、スペーサーグループおよびＨＬＡ−Ｇ５抗原のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
β２ミクログロブリンが、ヒトｂ２ミクログロブリンである、請求項１に記載のポリペプチド。
β２ミクログロブリンが、配列番号２のアミノ酸残基２１−１１９を含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
ＨＬＡ−Ｇ５抗原が、ヒトＨＬＡ−Ｇ５抗原である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、ここでＨＬＡ−Ｇ５抗原が、下記より選択される：
ａ）ＨＬＡ−Ｇ抗原のα１、α２およびα３ドメインのアミノ酸配列；
ｂ）ＨＬＡ−Ｇ抗原のイントロン４によってコードされる２１アミノ酸残基のアミノ酸配列ならびにα１、α２およびα３ドメインのアミノ酸配列；
ｃ）配列番号２のアミノ酸残基１３５−末端；および
ｄ）a)からｃ）のいずれか一つによって定義されるアミノ酸配列であって、１〜５個のアミノ酸欠失、置換または挿入を有するアミノ酸配列
スペーサーグループが、８から２０アミノ酸残基、好ましくは（Ｇ４Ｓ）ｎ配列のペプチドであって、ここでｎは２または３である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
配列番号２またはそのアミノ酸残基２１−末端を含む、ポリペプチドＨＬＡ−Ｇ５-Ｂ２Ｍ。
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
請求項８に記載の核酸分子を含む、ベクター。
請求項８に記載の核酸分子または請求項９に記載のベクターを含む、リコンビナント宿主細胞。
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドを生産する方法であって、ここで前記核酸分子の発現を可能にする条件下で請求項１０に記載のリコンビナント宿主細胞を培養すること、そして生産された前記ポリペプチドを回収すること、を含む、前記ポリペプチドを生産する方法。
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドの二量体。
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
臓器または組織拒絶反応を処置するための、請求項１３に記載の医薬組成物。
炎症性疾患または自己免疫疾患を処置するための、請求項１４に記載の医薬組成物。