JP2013103189A

JP2013103189A - タンパク質吸着材の処理方法、タンパク質吸着材のタンパク質吸着能の回復方法、及びタンパク質吸着材の製造方法

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Publication number: JP2013103189A
Application number: JP2011249583A
Authority: JP
Inventors: Tadashi Enzu; 正遠津; Hironobu Shirataki; 浩伸白瀧
Original assignee: Asahi Kasei Medical Co Ltd
Current assignee: Asahi Kasei Medical Co Ltd
Priority date: 2011-11-15
Filing date: 2011-11-15
Publication date: 2013-05-30

Abstract

【課題】タンパク質吸着材のタンパク質吸着能（吸着容量）を十分に向上させるための処理方法を提供すること。
【解決手段】タンパク質吸着材のタンパク質吸着能を向上させるための処理方法であって、タンパク質吸着材が、高分子基材と、該高分子基材の表面に結合し、タンパク質吸着能を有する官能基を含有する高分子鎖と、を含み、タンパク質吸着材を、有機溶媒又は有機溶媒を含有する水溶液により湿潤化された状態で加熱する工程を備える、処理方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、タンパク質吸着材の処理方法、タンパク質吸着材のタンパク質吸着能の回復方法、及びタンパク質吸着材の製造方法に関する。本発明はまた、タンパク質吸着材及びそれを用いたカラム又はモジュールに関する。

近年、バイオテクノロジー産業において、タンパク質の実利的な大量精製が重要な課題となっている。すなわち、タンパク質を効率的に大量産生及び大量精製することができる技術の確立が望まれている。そのための手段のひとつとして、タンパク質吸着膜あるいはビーズといった、タンパク質吸着材の開発が検討されている。

一般的に、タンパク質は、動物由来の細胞株を使用した細胞培養によって産生されるので、目的とするタンパク質（以下、単に「目的タンパク質」と記載する場合がある。）を分離、精製する必要がある。特に抗体を利用した医薬品（抗体医薬品）を実用化するためには、細胞デブリなどの濁質成分、及び細胞由来の溶存するタンパク質などの非濁質成分を細胞培養液から除去し、人間の治療用途にとって十分な純度にまで精製する必要がある。その精製工程においてタンパク質吸着材が用いられる。

特に最近は、抗体医薬の需要が急速に増加しており、抗体医薬品となるタンパク質の大量生産が指向されている。そして、培養技術の急速な進歩に伴い、精製工程の能力向上も望まれている。すなわち、タンパク吸着材の更なる性能向上が求められている状況にある。

タンパク質の大量精製のためのタンパク質吸着材に関する技術は、例えば、特許文献１〜５が開示されている。

特許文献１では、細孔表面にグラフト鎖を有し、このグラフト鎖にアニオン交換基が固定される多孔膜を用いてろ過する工程を含むタンパク質の精製方法が示されている。

特許文献２では、多孔質基材が第１アミン基の結合した架橋重合体を有する吸着材料で覆われた多孔質吸着媒体が示されている。

特許文献３では、複数の孔が延在している支持体構成部材および、該支持体構成部材の孔中に配置されかつ該支持体構成部材の孔を満たしているマクロ多孔質架橋ゲルを含んでなる複合材が示され、吸着による物質の分離としての使用に適しているとある。

特許文献４では、陽イオン官能基を有する架橋被膜と、多孔質基材からなる正に帯電した多孔質膜が提供され、タンパク質、核酸、エンドトキシンのような生体分子のろ過、精製に使用可能であることが示されている。

特許文献５では、高分子基材粒子の表面に、タンパク質吸着能を有する官能基が高分子鎖を介して固定された、タンパク質等の高速吸着精製が可能な吸着体およびその製造方法が示されている。

タンパク質と相互作用しうる官能基として一般的に知られる、アミノ基やスルホン酸基を導入した被膜によって、基材の表面改質を行った例が特許文献６で示されている。特許文献６では、高分子多孔質基材膜表面に、Ｎ−ハロゲン化された化合物（重合体あるいは重合体前駆体）の被膜を形成させ、グラフト開始剤とモノマーとを接触させて、基材上でグラフト重合する方法が示されている。さらに、前記モノマーとしてグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）を用いてグラフト重合させ、その後、ＧＭＡのエポキシ基に二級／三級アミンによる、三級アミノ基／四級アンモニウム基の導入、あるいはスルホン酸イオンでの処理によるエポキシ基のスルホン化によって得られる膜が記載されている。

国際公開第２００９／０５４２２６号特開２００９−５３１９１号公報特表２００６−５１９２７３号公報米国特許第６７８０３２７号明細書特開２００８−４５９０６号公報米国特許第５５４７５７５号明細書

ＫｙｏｉｃｈｉＳａｉｔｏ，ＣＨＡＲＧＥＤＰＯＬＹＰＥＲＢＲＵＳＨＧＲＡＦＴＥＤＯＮＴＯＰＯＲＯＵＳＨＯＬＬＯＷ−ＦＩＢＥＲＭＥＭＢＲＡＮＥＩＭＰＲＯＶＥＳＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮＡＮＤＲＥＡＣＴＩＯＮＩＮＢＩＯＴＥＣＮＯＬＯＧＹ，ＳｅｐａｒａｔｉｏｎＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＥＮＧＬＡＮＤ，Ｔａｙｌａｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，２００２，３７（３），５３５−５５４

一般的に、タンパク質吸着材は、タンパク質吸着の後、吸着したタンパク質を溶出させることにより再生可能（タンパク質吸着能を回復可能）であることが期待される。特許文献１にあるように、吸着したタンパク質を溶出する際には、塩溶液を用いるのが一般的である。

しかしながら、このような処理によって再生を繰返してタンパク質の吸着を行うと、徐々に吸着容量（単位吸着材体積あたりに吸着するタンパク質量）が減少していく傾向がある。抗体医薬の効率的な大量生産をするために、目的タンパク質の大量産生及び精製が望まれる現在、このような吸着容量の低下は、解決すべき課題である。

吸着材へのタンパク質吸着形態については、必ずしも特定されないが、例えば以下のように推察することができる。すなわち、タンパク質は、吸着材の官能基と作用し吸着されるが、吸着材被覆層の表面で吸着する場合（以下、表面吸着という）と、表面吸着に加えて吸着材被膜層の奥深くにタンパク質が吸着する場合とが考えられる。吸着されたタンパク質分子は、単層、あるいは、多層に積み重なって吸着され得る。吸着材被膜層の奥深くにタンパク質が吸着する例として、特許文献２に記載の吸着材が挙げられる。特許文献２では、基材を覆う皮膜重合体は、「蛋白質および他の不純物は、当該皮膜の奥底に捕捉され、・・・・」と記載されている。また、タンパク質分子が多層に積み重なって吸着される例として、非特許文献１で、イオン交換基を有するポリマーブラシ（直鎖状のグラフト高分子鎖）が孔表面に導入された多孔質中空糸膜にタンパク質が多層に吸着したことが報告されている。

このような、表面吸着に加えて吸着材被膜層の奥深くにタンパク質が吸着する吸着材、あるいはタンパク質分子が多層に積み重なって吸着される吸着材については、上記塩溶液によって吸着されたタンパク質が完全には溶出されない場合もある。そのため、繰り返し再生していくうちに、残留タンパク質の蓄積によって吸着容量の低下が引き起こされると考えられる。実際に、特許文献３の例では、吸着工程後の塩溶液を用いた脱着工程において、吸着させたタンパク質の回収率が６３〜９９％とあり、完全には溶出されていないことが報告されている。すなわち、このような形態でタンパク質が吸着される吸着材において、吸着容量の低下は、とりわけ大きな課題といえる。

そこで、本発明の主な目的は、タンパク質吸着材のタンパク質吸着能（吸着容量）を十分に向上させるための処理方法を提供することにある。また、本発明の目的は、タンパク質の吸着及び脱着後のタンパク質吸着材のタンパク質吸着能（吸着容量）を十分に大きく回復させる回復方法を提供することにある。さらに、本発明の目的は、十分に大きなタンパク質吸着能（吸着容量）を有するタンパク質吸着材の製造方法を提供することにある。

本発明者らは、課題を解決するために鋭意検討した結果、タンパク質吸着材を有機溶媒又は有機溶媒を含有する水溶液により湿潤化された状態で加熱する方法が、上記目的を達成するために有効であることを見出した。

すなわち、本発明は以下に関する。
［１］
タンパク質吸着材のタンパク質吸着能を向上させるための処理方法であって、
前記タンパク質吸着材が、高分子基材と、該高分子基材の表面に結合し、タンパク質吸着能を有する官能基を含有する高分子鎖と、を含み、
前記タンパク質吸着材を、有機溶媒又は有機溶媒を含有する水溶液により湿潤化された状態で加熱する工程を備える、処理方法。
［２］
前記タンパク質吸着材を、有機溶媒又は有機溶媒を含有する水溶液により湿潤化された状態で３０〜８０℃に加熱する、［１］に記載の処理方法。
［３］
前記有機溶媒がアルコール類、芳香族炭化水素類、エステル類、エーテル類及びケトン類からなる群より選択される少なくとも一種である、［１］又は［２］に記載の処理方法。
［４］
前記アルコール類がメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール及びペンタノールからなる群より選択される少なくとも一種である、［３］に記載の処理方法。
［５］
前記高分子鎖が、共有結合によって前記高分子基材に結合している、［１］〜［４］のいずれかに記載の処理方法。
［６］
前記高分子鎖が、グラフト重合によって前記高分子基材に結合している直鎖状高分子鎖である、［１］〜［５］のいずれかに記載の処理方法。
［７］
前記高分子基材が多孔質体である、［１］〜［６］のいずれかに記載の処理方法。
［８］
前記高分子基材が中空糸多孔膜である、［１］〜［７］のいずれかに記載の処理方法。
［９］
前記タンパク質吸着能を有する官能基がイオン交換基である、［１］〜［８］のいずれかに記載の処理方法。
［１０］
前記イオン交換基が三級アミノ基である、［９］に記載の処理方法。
［１１］
前記タンパク質吸着材が、少なくとも１回、タンパク質を吸着及び脱着させた吸着材である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の処理方法。
［１２］
タンパク質吸着材のタンパク質吸着能の回復方法であって、
前記タンパク質吸着材が、高分子基材と、該高分子基材の表面に結合し、タンパク質吸着能を有する官能基を含有する高分子鎖と、を含み、かつ、少なくとも１回、タンパク質を吸着及び脱着させたものであり、
前記タンパク質吸着材を、有機溶媒又は有機溶媒を含有する水溶液により湿潤化された状態で加熱する工程を備える、回復方法。
［１３］
高分子基材と、該高分子基材の表面に結合し、タンパク質吸着能を有する官能基を含有する高分子鎖と、を含む吸着材を得る工程と、
前記吸着材を、有機溶媒又は有機溶媒を含有する水溶液により湿潤化された状態で加熱する工程を備える、タンパク質吸着材の製造方法。
［１４］
前記加熱する工程の前に、前記吸着材に対し、タンパク質を吸着及び脱着する工程を更に備える、［１３］に記載の製造方法。
［１５］
［１３］又は［１４］に記載の製造方法により得ることのできる、タンパク質吸着材。
［１６］
［１５］に記載のタンパク質吸着材を備える、カラム。
［１７］
［１５］に記載のタンパク質吸着材を備える、モジュール。

本発明によれば、タンパク質吸着材のタンパク質吸着能（吸着容量）を十分に向上させるための処理方法が提供される。また、本発明によれば、タンパク質の吸着及び脱着後のタンパク質吸着材のタンパク質吸着能（吸着容量）を十分に大きく回復させる回復方法が提供される。さらに、本発明によれば、十分に大きなタンパク質吸着能（吸着容量）を有するタンパク質吸着材の製造方法が提供される。

本発明によれば、タンパク質吸着剤の効率的な使用が可能である。また、本発明によれば、タンパク質の吸着及び脱着に用いられた後のタンパク質吸着材の吸着容量を十分に大きく回復させることができる。

以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。

本実施形態に係るタンパク質吸着材の処理方法は、タンパク質吸着材を、有機溶媒又は有機溶媒を含有する水溶液により湿潤化された状態で加熱する工程を備える。本実施形態に係るタンパク質吸着材の処理方法によれば、タンパク質吸着材のタンパク質吸着能（吸着容量）を向上させることができる。タンパク質吸着材は、高分子基材と、該高分子基材の表面を被覆し、タンパク質吸着能を有する官能基を含有する高分子鎖と、を含むものであれば、特に限定されるものではない。

本実施形態において、「処理前吸着材」とは、単に、「有機溶媒又は有機溶媒を含有する水溶液により湿潤化された状態で加熱する工程に供される前のタンパク質吸着材」を意味する。「処理前吸着材」の用語は、「有機溶媒又は有機溶媒を含有する水溶液により湿潤化された状態で加熱する工程による処理後のタンパク質吸着材」と区別するために用いられる。「処理前吸着材」は、タンパク質の吸着及び脱着を経ていないタンパク質吸着材の意味に限定されることもない。「処理前吸着材」が有機溶媒又は有機溶媒を含有する水溶液により湿潤化された状態で加熱する工程により処理される前にタンパク質の吸着及び脱着を経た回数は、限定されない。すなわち、「処理前吸着材」は、例えば、未使用のもの（一度も吸着物を吸着していないもの）、吸着／脱着を繰り返し、吸着容量が低下したもの、本実施形態とは異なる熱処理によって吸着容量が低下したものであり得る。

有機溶媒としては、アルコール類、芳香族炭化水素類、エステル類、エーテル類及びケトン類からなる群より選択される少なくとも一種であることが好ましく、アルコール類であることがより好ましい。これらの有機溶媒は１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。有機溶媒が水溶性の場合、有機溶媒を含有する水溶液を用いてもよい。有機溶媒の水溶液濃度は、一般的には１０〜９９重量％であり、好ましくは１５〜７０重量％であり、特に好ましくは２０〜４０重量％である。

アルコール類としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール及びペンタノールが好ましく、メタノール及びエタノールが特に好ましい。これらのアルコール類は１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。さらに、アルコール類の水溶液濃度は、一般的には１０〜９９重量％であり、好ましくは１５〜７０重量％であり、特に好ましくは２０〜４０重量％である。

タンパク質吸着材の形態は、タンパク質が溶解した液が処理前吸着材の表面と接触する形態であれば、特に限定されず、非多孔質体又は多孔質体でありえる。タンパク質吸着材の形態は、主に高分子基材の形態により決定される。非多孔質体としては、フィルム、非多孔質ビーズ、繊維、キャピラリーが挙げられる。多孔質体としては、平膜、不織布、中空糸膜、モノリス、多孔質ビーズが挙げられる。吸着材単位体積当たりの吸着面積を大きくし、高吸着容量とする観点からは、多孔質体が好ましい。さらに、ハンドリングの容易さから、膜状形態、すなわち、平膜、不織布、中空糸膜がより好ましい。スケールアップ性、モジュール成型した際の流路構造が単純であることから、中空糸多孔膜がさらに好ましい。

本実施形態において、「中空糸多孔膜」とは、中空部分を有する円筒状又は繊維状の多孔体を意味する。中空糸多孔膜の中空側（内側）と外側とが貫通孔である細孔によって連続している。中空糸多孔膜は、その細孔によって内側から外側、あるいは外側から内側に、液体又は気体が透過する性質を有する。中空糸多孔膜の外径及び内径は、物理的に多孔膜が形状を保持することができれば、特に限定されない。

本実施形態における、高分子基材の素材について記述する。高分子基材は、特に限定されず、公知技術の素材を用いることができる。特に、機械的性質保持のためには、ポリオレフィン系重合体から構成されていることが好ましい。ポリオレフィン系重合体としては、例えば、エチレン、プロピレン、ブチレン及びフッ化ビニリデン等のオレフィンの単独重合体、該オレフィンの２種以上の共重合体、又は、１種若しくは２種以上のオレフィンとパーハロゲン化オレフィンとの共重合体等が挙げられる。これらの基材の中でも、機械的強度が特に優れることから、ポリエチレン又はポリフッ化ビニリデンが好ましく、ポリエチレンがより好ましい。

本実施形態において、高分子基材の表面（高分子基材が多孔質の場合は細孔内表面も含む。）の少なくとも一部には、タンパク質吸着能を有する官能基を含有する高分子鎖が結合している。高分子基材と高分子鎖との結合状態については、例えば、共有結合、物理的吸着による結合、アフィニティー結合などがあるが、これらに限定されるものではない。

高分子基材表面にタンパク質吸着能を有する官能基を含有する高分子鎖を導入する方法は、特に限定されない。高分子基材への放射線照射によってラジカルを生成し、グラフト重合する方法、タンパク吸着能を有する官能基を含有する高分子鎖を基材へ塗布し、架橋剤によって高分子鎖を基材表面に固定する方法、基材表面に、重合体あるいは重合体前駆体の被膜を形成させ、その被膜を構成する高分子鎖からグラフト重合体を得る方法などがある。特に高分子基材中の高分子鎖とそれを被覆するグラフト鎖との共有結合による強固な結合を期待する場合には、基材からのグラフト重合によってタンパク質吸着能を有する官能基を含有する高分子鎖を導入する方法が好ましい。

特に、基材からのグラフト重合によって、タンパク質吸着能を有する官能基を含有する直鎖状高分子鎖を導入する場合、（１）タンパク質吸着能を有する官能基を有するモノマーを直接重合させる方法、又は、（２）基材からのグラフト重合により、タンパク質吸着能を有する官能基を導入可能な官能基を含む高分子鎖を導入し、続いて、タンパク質吸着能を有する官能基を導入する方法を採用することができる。

（１）は一段階の反応でタンパク吸着能を有する被覆層（タンパク吸着能を有する官能基を含有する高分子鎖により形成される層であり、必ずしも、高分子基材の表面全てを被覆していなくてもよい。）が得られることから、簡便で、好ましい。上記モノマーとしては、特に限定されないが、メタクリレート誘導体、ビニル化合物、アリル化合物などが挙げられ、例えば、ジエチルアミノエチルメタクリレート、スルホプロピルメタクリレート、アリルアミンなどが選ばれる。

（２）は、種々のタンパク質吸着能を有する官能基のバリエーションを揃えやすい、あるいはタンパク質吸着能を有する官能基の導入率（詳細は後述する）のバリエーションを揃えやすいという観点からは、好ましい。（２）の場合のグラフト重合におけるモノマーとしては、反応性の高いエポキシ基を有するグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）が好ましい。

本実施形態において、タンパク質吸着能を有する官能基を含有する高分子鎖によって形成される被覆層の状態は限定されない。例えば、直鎖状の高分子鎖を形成する場合、基材表面上で高分子鎖同士がゆるく架橋しあうことでゲル状の被膜層を形成したり、高分子鎖が架橋高分子を形成したりするときがある。本実施形態のメカニズムの詳細は必ずしも明らかではないが、湿潤状態での加熱処理によって、タンパク質吸着能を有する官能基を含有する高分子鎖のコンディショングが施され、吸着点数が増加すると考えられる。中でも、吸着材被覆層の奥深くに吸着された、あるいは、多層に積み重なって吸着されたタンパク質が効率的に排出され、吸着点数の増加の効果が著しく高いと推測される。したがって、基材から直接形成された直鎖状のグラフト高分子鎖を有する吸着材や、タンパク質吸着能を有する官能基を含む高分子鎖同士がゆるく架橋しあったゲル状被膜を有する吸着材が好ましく、基材から直接形成された直鎖状のグラフト高分子鎖を有する吸着材がより好ましい。

本実施形態において、高分子基材へのタンパク質吸着能を有する官能基を含む高分子鎖の結合量については、通液時の圧力上昇等の問題がなければ、特に限定されない。また、高分子基材の構造、高分子鎖に含有される官能基やモノマーの特性の組み合わせに応じて最適な結合量を選ぶことができる。以下、結合量について、上記（２）として挙げた、（ｉ）基材からのグラフト重合により、タンパク質吸着能を有する官能基を導入可能な官能基を含む高分子鎖（グラフト鎖）を導入し、続いて、（ｉｉ）タンパク質吸着能を有する官能基を導入する方法を一例に挙げて説明する。

（ｉ）に関して、一般的に、基材に対するグラフト鎖の結合率（グラフト率、ｄｇ［％］）は、式（１）に示したように、グラフト鎖導入により増加した重量に基づいて定義される。

Ｗ_０：グラフト鎖導入前の高分子基材重量（ｇ）
Ｗ_１：グラフト鎖導入後の全体重量（ｇ）

（ｉｉ）に関して、被覆層における、グラフト鎖中のタンパク吸着能を導入可能な官能基に対する、タンパク質吸着能を有する官能基の存在割合は、式（２）で示される「リガンド転化率」で整理される。すなわち、タンパク質吸着能を有する官能基の存在割合は、グラフト鎖中のタンパク吸着能を導入可能な官能基のモル数に対して、タンパク質吸着能を有する官能基が導入されたモル数で表される。例えば、グラフト鎖がＧＭＡの重合体で、ＧＭＡのエポキシ環にジエチルアミンを導入した場合、式（２）ではＭ_１にＧＭＡの分子量１４２ｇ／ｍｏｌを、Ｍ_２にジエチルアミン分子量７３ｇ／ｍｏｌを代入する。

Ｗ_０：グラフト鎖導入前の高分子基材重量（ｇ）
Ｗ_１：グラフト鎖導入後の全体重量（ｇ）
Ｗ_２：タンパク質吸着能を有する官能基導入後の全体重量（ｇ）
Ｍ_１：グラフト鎖モノマー単位の分子量（ｇ／ｍｏｌ）
Ｍ_２：導入された官能基（タンパク質吸着能を有する官能基）の分子量（ｇ／ｍｏｌ）

グラフト率は、より高い吸着容量及び力学的に安定な強度をともに確保するという観点から、好ましくは５％〜２００％、より好ましくは２０％〜１５０％、更に好ましくは３０％〜９０％である。

リガンド転化率は、より高い吸着容量を得るという観点から、好ましくは２０％〜１００％、より好ましくは５０％〜１００％、更に好ましくは７０％〜１００％である。

本実施形態における、タンパク質吸着能を有する官能基について記述する。タンパク質吸着能を有する官能基として、イオン交換型、疎水性相互作用吸着型、郡特異性アフィニティ吸着型、個別特異性アフィニティ吸着型が挙げられるが、特に限定されない。

さらに、イオン交換基（イオン交換型官能基）として、強酸性陽イオン交換基、弱酸性陽イオン交換基、強塩基性陰イオン交換基又は弱塩基性陰イオン交換基が挙げられるが、これらについても特に限定されない。

例えば、強酸性陽イオン交換基としてはスルホン酸基（−ＳＯ_３ ⁻）が、弱酸性陽イオン交換基としてはカルボン酸基（−ＣＯＯ⁻）が挙げられる。

一方、強塩基性陰イオン交換基としては、例えば四級アンモニウム基（Ｑ、−Ｎ^＋Ｒ_３）、四級アミノエチル基（ＱＡＥ、−（ＣＨ_２）_２−Ｎ^＋Ｒ_３）などが挙げられる。ここで、Ｒは特に限定されず、同一のＮに結合するＲが同一又は異なっていてもよく、好適には、アルキル基、アリール基、アラルキル基などの炭化水素基を表す。より具体的には、トリメチルアミノ基（ＴＭＡ、−Ｎ^＋Ｍｅ_３）などが挙げられる。弱塩基性陰イオン交換基としては、一級アミノ基（−ＮＨ_２）、二級アミノ基（−ＮＲＨ）、三級アミノ基（−ＮＲ_２）、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ、−（ＣＨ_２）_２−ＮＥｔ_２）、ジエチルアミノプロピル基（ＤＥＡＰ、−（ＣＨ_２）_３−ＮＥｔ_２）などが挙げられる。ここでも、Ｒは特に限定されず、同一のＮに結合するＲが同一又は異なっていてもよく、好適には、アルキル基、アリール基、アラルキル基などの炭化水素基を表す。

イオン交換基として強酸性あるいは強塩基性イオン交換基を選択した場合、広いｐＨ領域で、ほぼ全てのイオン交換基が解離した状態に保持されるため、幅広いｐＨ領域で使用できる利点がある。すなわち、処理する液のｐＨを選ばず利用できるという点で好ましい。ただし、水和水を持つイオン交換基が高密度で存在する状態にあり、被覆層において、高分子鎖内や、隣接高分子鎖との間で立体反発が大きく、高分子鎖が伸張した状態になるので、多孔質体の吸着材では、液の流路が閉塞し、通液圧上昇／処理量低下を引き起こす傾向にある。したがって、高速処理を期待する場合には、弱酸性あるいは弱塩基性イオン交換基が好ましく、ジエチルアミノ基またはイソプロピルアミノ基がより好ましい。

疎水性相互作用吸着基（疎水性相互作用吸着型官能基）としては、フェニル基、アルキル基等がある。

郡特異性アフィニティ吸着基（郡特異性アフィニティ吸着型官能基）としては、ＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅＦ３Ｇ−Ａ、ＰｒｏｔｅｉｎＡ、コンカナバリンＡ、ヘパリン、タンニン、金属キレート基等がある。

個別特異性アフィニティ吸着基（個別特異性アフィニティ吸着型官能基）としては、抗原や抗体類がある。

本実施形態における、タンパク質吸着材の湿潤方法及び形態について記述する。本実施形態において、「湿潤化された状態」とは、タンパク質吸着材表面が液体により濡れた状態をいう。乾燥状態にあるタンパク質吸着材を湿潤化する場合は、一旦親水化した後に湿潤化のための溶液（有機溶媒又は有機溶媒を含有する水溶液）で置換するのが好ましい。親水化の方法としては、特に限定されないが水、アルコール水溶液、アルコール、蒸気で親水化することができる。中でも、アルコール又はアルコール水溶液による親水化は種々の素材や形状で実施することができる。アルコール親水化としては、例えば、タンパク質吸着材をエタノール又はエタノール水溶液と接触させ、徐々に水の比率を上げていき最終的に純水と接触させる方法がある。湿潤化のための溶液に置換する方法としても、十分にタンパク質吸着材が溶液（有機溶媒又は有機溶媒を含有する水溶液）で置換されれば限定されない。例えば膜を用いる場合、十分に溶液への置換を行うために、溶液を通液する方法が効果的であり、各溶液の通液量はモジュール体積の３倍以上が好ましく、５倍以上がより好ましく、１０倍以上が更に好ましい。なお、湿潤化のための溶液としてアルコール類又はアルコール類を含有する水溶液を用いる場合、親水化のステップを省略してもよい。

処理前吸着材を加熱する方法は、有機溶媒又は有機溶媒を含有する水溶液により湿潤化された状態のタンパク質吸着材が十分に加熱され、タンパク質吸着材の機械的強度に影響がない範疇であれば、特に限定されない。タンパク質吸着材が梱包された形態（例えばモジュール、カラムなど）での梱包容器外側からの加熱によって、タンパク質吸着材の加熱処理を行うことができる。加熱温度としては、室温（２５℃）以上に加熱すればよく、３０℃以上が好ましく、４０℃以上がより好ましい。加熱温度の上限は使用する有機溶媒又は有機溶媒を含有する水溶液の種類にもよるが、通常１００℃以下であり、８０℃以下が好ましく、７０℃以下がより好ましい。本実施形態に係る処理方法は、有機溶媒又は有機溶媒を含有する水溶液により湿潤化することから、それ程高い加熱温度を必要としない。加熱時間としては、十分に加熱することを目的として、１２時間以上がより好ましく、２４時間以上がさらに好ましい。加熱時間の上限は特に制限されるものではないが、通常７２時間以下である。

本実施形態において、上で挙げたようなタンパク質吸着材が、タンパク質が溶解した液と効率的に接触するために、タンパク質吸着材を梱包するのが好ましい。このような梱包形態を、一般的に、吸着材が膜の場合はモジュール、その他の吸着材の場合はカラムというが、それらの構造は限定されない。ただし、中空糸多孔膜であれば、中空部にタンパク質が溶解した液を流し、中空部外表面から漏出する液を受け採ることによる簡易的な通液方法も可能であるので、この場合は必ずしもモジュールにする必要はない。

モジュール構造の一例として、旭化成メディカル株式会社から販売されているＱｙｕＳｐｅｅｄＴＭＤ（中空糸型陰イオン交換吸着膜）が挙げられる。構造の特徴は、両端に開口部を有するハウジングと、ハウジング内に固定された一本又は複数本の中空糸膜と、を備える。中空糸膜の両端で、中空糸膜外側とハウジング内壁が固定され、ハウジング開口部から供給されたタンパク質が溶解した液は、中空糸内側から外側へと膜中を通液し、ハウジング側面に取り付けられたノズルより排出される。

本発明はまた、タンパク質吸着材を、有機溶媒又は有機溶媒を含有する水溶液により湿潤化された状態で加熱する工程を備える、タンパク質吸着材のタンパク質吸着能の回復方法ということもできる。ここでいうタンパク質吸着材は、高分子基材と、該高分子基材の表面に結合し、タンパク質吸着能を有する官能基を含有する高分子鎖と、を含み、かつ、少なくとも１回、タンパク質を吸着及び脱着させたものである。

本実施形態に係るタンパク質吸着能（吸着容量）の回復方法によれば、タンパク質の吸着及び脱着を繰り返すことにより低下した吸着容量を回復することが可能となる。

また、本実施形態に係るタンパク質吸着材の製造方法は、少なくとも、高分子基材と、該高分子基材の表面に結合し、タンパク質吸着能を有する官能基を含有する高分子鎖と、を含む吸着材を得る工程と、吸着材を、有機溶媒又は有機溶媒を含有する水溶液により湿潤化された状態で加熱する工程を備える。この加熱する工程を備えることにより、タンパク質吸着能（吸着容量）が向上したタンパク質吸着材が得られる。さらに、本実施形態に係る製造方法では、加熱する工程の前に、吸着材に対し、タンパク質（例えば、牛血清アルブミン）を吸着及び脱着する工程を更に備えていてもよい。これにより得られるタンパク質吸着材のタンパク質吸着能（吸着容量）をより一層向上させることができる。

以下、実施例を挙げて本発明についてさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。さらに、タンパク質吸着材は、実施例に使用したＱｙｕＳｐｅｅｄＴＭＤ１５０ｍＬ（中空糸型陰イオン交換吸着膜）に限定されるものではない。

［評価方法１］吸着容量測定方法
中空糸型陰イオン交換吸着膜であるＱｙｕＳｐｅｅｄＴＭＤ１５０ｍＬのタンパク質吸着容量の評価は、汎用ＨＰＬＣシステム（ＧＥヘルスケアジャパンＡＫＴＡｐｉｌｏｔ）を用いて行った。バイオテクノロジーの精製装置の性能表示を行う際、一般に、精製されたタンパク質溶液がモデルとして用いられる。本実施例では、モデルタンパク質として一般に用いられるＢＳＡ（牛血清アルブミン、シグマアルドリッチ製）を用いた。ｐＨ８に調整した２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（以下、緩衝液）１Ｌに対しＢＳＡ１ｇを溶解させ、０．４５μｍのフィルターを通し、ＢＳＡ溶液を得た。

ＨＰＬＣシステムにＱｙｕＳｐｅｅｄＴＭＤ１５０ｍＬを接続し、８００ｍＬ／ｍｉｎで、緩衝液、ＢＳＡ溶液、緩衝液、１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む緩衝液（以下、塩緩衝液）、１Ｎの水酸化ナトリウム、塩緩衝液の順に通液した。１回目の緩衝液通液は膜の平衡化を目的として、ＢＳＡ供給後の２回目の緩衝液通液は非吸着ＢＳＡの洗浄を目的として行った。さらにそれ以後の１Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液および１Ｎ水酸化ナトリウム溶液通液は、吸着したＢＳＡの脱着を目的として行った。

ろ液側へのＢＳＡの漏洩動向を、波長２８０ｎｍにおける吸光度で追跡し、原液のＢＳＡ溶液の吸光度に対するろ液の吸光度の比が１０％になる時点のろ液量を確認した。このろ液量を濃度１ｇ／Ｌに基づいてＢＳＡの重量に換算し、吸光度の比が１０％になる時点のタンパク質吸着量［ｍｇ］を算出した。さらに、算出した値を中空糸内外径、有効糸長から計算される円環部の体積で割り返すことで、膜体積あたりのタンパク質（ＢＳＡ）吸着容量（ｍｇ／ｍＬ）を求めた。この値は「動的吸着容量」と呼ばれ、バイオテクノロジーの分野で一般に用いられる。

［実施例１］
処理前吸着材としてのＱｙｕＳｐｅｅｄＴＭＤ１５０ｍＬが、２０重量％エタノールにより湿潤化された状態で４０℃に加熱されることにより、吸着容量が増大する例を示す。

まず、熱処理前のタンパク質吸着容量を上記評価方法１に従い測定した。動的吸着容量は５１．７ｍｇ／ｍＬであった。

続いて、２０重量％エタノールでモジュール内を満たしてから、モジュールを密閉した。その状態で、モジュールを４０℃に温調された乾燥機で２４時間加熱した。モジュールを室温まで冷却した。

その後、熱処理後のタンパク質吸着容量を上記評価方法１に従い測定した。動的吸着容量は５４．３ｍｇ／ｍＬであった。このときの性能向上率（＝熱処理後の動的吸着容量／熱処理前の動的吸着容量×１００）は１０５％であった。

［実施例２］
処理前吸着材としてのＱｙｕＳｐｅｅｄＴＭＤ１５０ｍＬが、２０重量％エタノールにより湿潤化された状態で６０℃に加熱されることにより、吸着容量が増大する例を示す。

まず、熱処理前のタンパク質吸着容量を上記評価方法１に従い測定した。動的吸着容量は５０．０ｍｇ／ｍＬであった。

続いて、２０重量％エタノールでモジュール内を満たしてから、モジュールを密閉した。その状態で、モジュールを６０℃に温調された乾燥機で２４時間加熱した。モジュールを室温まで冷却した。

その後、熱処理後のタンパク質吸着容量を上記評価方法１に従い測定した。動的吸着容量は５４．２ｍｇ／ｍＬであった。このときの性能向上率（＝熱処理後の動的吸着容量／熱処理前の動的吸着容量×１００）は１０８％であった。

［実施例３］
処理前吸着材としてのＱｙｕＳｐｅｅｄＴＭＤ１５０ｍＬが、１００重量％エタノールにより湿潤化された状態で３０℃に加熱されることにより、吸着容量が増大する例を示す。

まず、熱処理前のタンパク質吸着容量を上記評価方法１に従い測定した。動的吸着容量は５１．１ｍｇ／ｍＬであった。

続いて、１００重量％エタノールでモジュール内を満たしてから、モジュールを密閉した。その状態で、モジュールを３０℃に温調された乾燥機で２４時間加熱した。モジュールを室温まで冷却した。

その後、熱処理後のタンパク質吸着容量を上記評価方法１に従い測定した。動的吸着容量は５３．０ｍｇ／ｍＬであった。このときの性能向上率（＝熱処理後の動的吸着容量／熱処理前の動的吸着容量×１００）は１０４％であった。

［比較例１］
処理前吸着材としてのＱｙｕＳｐｅｅｄＴＭＤ１５０ｍＬが、２０重量％エタノールにより湿潤化された状態で室温（２５℃）にて保存された場合、吸着容量が増大しない例を実施例１〜３に対する比較例として示す。

まず、タンパク質吸着容量を上記評価方法１に従い測定した。動的吸着容量は５５．１ｍｇ／ｍＬであった。

２０重量％エタノールでモジュール内を満たしてから密閉し、その状態でモジュールを室温（２５℃）にて保存した。

その後、タンパク質吸着容量を上記評価方法１に従い測定した。動的吸着容量は５４．５ｍｇ／ｍＬであった。このときの性能向上率（＝熱処理後の動的吸着容量／熱処理前の動的吸着容量×１００）は９９％であった。

［比較例２］
処理前吸着材としてのＱｙｕＳｐｅｅｄＴＭＤ１５０ｍＬが、水により湿潤化された状態で４０℃に加熱された場合、吸着容量が増大しない例を実施例１〜３に対する比較例として示す。

まず、タンパク質吸着容量を上記評価方法１に従い測定した。動的吸着容量は４６．６ｍｇ／ｍＬであった。

水でモジュール内を満たしてから密閉し、その状態でモジュールを４０℃に加熱した。

その後、タンパク質吸着容量を上記評価方法１に従い測定した。動的吸着容量は４６．６ｍｇ／ｍＬであった。このときの性能向上率（＝熱処理後の動的吸着容量／熱処理前の動的吸着容量×１００）は１００％であった。

［実施例４］
未使用（一度も吸着物を吸着していない）の吸着材としてのＱｙｕＳｐｅｅｄＴＭＤ１５０ｍＬが、２０重量％エタノールにより湿潤化された状態で４０℃に加熱されることにより、吸着容量が増大する例を示す。

未使用（一度も吸着物を吸着していない）の吸着材（ＱｙｕＳｐｅｅｄＴＭＤ１５０ｍＬ）を２本用意し、１本は熱処理を行った後で、もう１本は熱処理を行わずに動的吸着容量を求めた。

熱処理を行う吸着材については、２０重量％エタノールでモジュール内を満たしてから、モジュールを密閉した。その状態で、モジュールを４０℃に温調された乾燥機で２４時間加熱した。モジュールを室温まで冷却した。その後、熱処理を行った吸着材のタンパク質吸着容量を上記評価方法１に従い測定した。動的吸着容量は５４．６ｍｇ／ｍＬであった。

続いて、熱処理を行っていない吸着材のタンパク質吸着容量を上記評価方法１に従い測定した。動的吸着容量は５２．０ｍｇ／ｍＬであった。

これらの結果より、性能向上率（＝熱処理を行った吸着材の動的吸着容量／熱処理を行っていない吸着材の動的吸着容量×１００）は１０５％であった。

本発明は、タンパク質吸着材の吸着容量を回復及び増大する方法を提供する。本発明は、抗体医薬の効率的な大量生産をする上で、目的タンパク質の精製において産業上の利用可能性を有する。

Claims

タンパク質吸着材のタンパク質吸着能を向上させるための処理方法であって、
前記タンパク質吸着材が、高分子基材と、該高分子基材の表面に結合し、タンパク質吸着能を有する官能基を含有する高分子鎖と、を含み、
前記タンパク質吸着材を、有機溶媒又は有機溶媒を含有する水溶液により湿潤化された状態で加熱する工程を備える、処理方法。
前記タンパク質吸着材を、有機溶媒又は有機溶媒を含有する水溶液により湿潤化された状態で３０〜８０℃に加熱する、請求項１に記載の処理方法。
前記有機溶媒がアルコール類、芳香族炭化水素類、エステル類、エーテル類及びケトン類からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１又は２に記載の処理方法。
前記アルコール類がメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール及びペンタノールからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項３に記載の処理方法。
前記高分子鎖が、共有結合によって前記高分子基材に結合している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の処理方法。
前記高分子鎖が、グラフト重合によって前記高分子基材に結合している直鎖状高分子鎖である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の処理方法。
前記高分子基材が多孔質体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の処理方法。
前記高分子基材が中空糸多孔膜である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の処理方法。
前記タンパク質吸着能を有する官能基がイオン交換基である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の処理方法。
前記イオン交換基が三級アミノ基である、請求項９に記載の処理方法。
前記タンパク質吸着材が、少なくとも１回、タンパク質を吸着及び脱着させた吸着材である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の処理方法。
タンパク質吸着材のタンパク質吸着能の回復方法であって、
前記タンパク質吸着材が、高分子基材と、該高分子基材の表面に結合し、タンパク質吸着能を有する官能基を含有する高分子鎖と、を含み、かつ、少なくとも１回、タンパク質を吸着及び脱着させたものであり、
前記タンパク質吸着材を、有機溶媒又は有機溶媒を含有する水溶液により湿潤化された状態で加熱する工程を備える、回復方法。
高分子基材と、該高分子基材の表面に結合し、タンパク質吸着能を有する官能基を含有する高分子鎖と、を含む吸着材を得る工程と、
前記吸着材を、有機溶媒又は有機溶媒を含有する水溶液により湿潤化された状態で加熱する工程を備える、タンパク質吸着材の製造方法。
前記加熱する工程の前に、前記吸着材に対し、タンパク質を吸着及び脱着する工程を更に備える、請求項１３に記載の製造方法。
請求項１３又は１４に記載の製造方法により得ることのできる、タンパク質吸着材。
請求項１５に記載のタンパク質吸着材を備える、カラム。
請求項１５に記載のタンパク質吸着材を備える、モジュール。