JP2013201911A - 台木と穂木の接ぎ木を介して植物の形質転換を行う方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 転写型遺伝子サイレンシングを発動させるためのｓｉＲＮＡを用い、全身性の遺伝子サイレンシングを起こすことで台木と穂木の接ぎ木を介して植物の形質転換を効果的に行う方法を提供すること。
【解決手段】 転写型遺伝子サイレンシングを発動させるためのｓｉＲＮＡとその標的配列に相補的な配列を有するＲＮＡを穂木において産生せしめ、穂木において産生されたｓｉＲＮＡとその標的配列に相補的な配列を有するＲＮＡを接ぎ木を介して台木に輸送し、転写型遺伝子サイレンシングを台木において発動させることによって台木の形質転換を行うことを特徴とする。
【選択図】 図２

Description

本発明は、台木と穂木の接ぎ木を介して植物の形質転換を行う方法に関する。

植物の品種改良（生産性や品質の向上、耐病性の付与など）の手段として、特定の標的遺伝子の発現を抑制することで植物の形質転換を行う方法が有効であることは当業者に周知の通りであり、近年、その方法の一つとして、遺伝子の発現機能を阻害する遺伝子サイレンシングが注目されている。遺伝子サイレンシングは、遺伝子の転写レベルで作用する転写型遺伝子サイレンシング（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ：ＴＧＳ）と、転写後に作用する転写後型遺伝子サイレンシング（Ｐｏｓｔ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ：ＰＴＧＳ）に分類されるが、いずれもｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）によって発動できることが知られている。ｓｉＲＮＡは、２０〜２５ｂｐの低分子ＲＮＡであり、細胞内で形成された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ：ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）がダイサーによって分断されて生成し、ヘリカーゼによって一本鎖に解離したものは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成して標的のｍＲＮＡに結合し、これを切断することができるものであって、ｓｉＲＮＡはこの機能によってＰＴＧＳを発動する。また、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子のプロモーター領域のメチル化を誘導し（ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ：ＲｄＤＭ）、さらにその領域のヒストンタンパク質の修飾などにも関与して、その領域をリモデリング化することで、ＴＧＳを発動する。ＴＧＳはエピジェネティック変異と称され、遺伝子サイレンシングが体細胞分裂や減数分裂を経ても維持されて後代へ遺伝することが知られている。

ｓｉＲＮＡは、伴細胞（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｃｅｌｌ）から原形質連絡糸を通して篩管（ｓｉｅｖｅ ｔｕｂｅ）へ送り出され、長距離輸送されることが知られており、こうした篩管輸送は接ぎ木を介しても行われる。ｓｉＲＮＡのこの性質を利用して、ＰＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡを穂木において産生せしめ、穂木において産生されたｓｉＲＮＡを接ぎ木を介して台木に輸送し、ＰＴＧＳを台木において発動させることによって台木の形質転換を行う方法が非特許文献１に記載されている。一方、ＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡを穂木において産生せしめ、穂木において産生されたｓｉＲＮＡを接ぎ木を介して台木に輸送し、ＴＧＳを台木において発動させることによって台木の形質転換を行う方法が本発明者らによって見出されている（非特許文献２）。前述の通り、ＴＧＳは遺伝子サイレンシングが体細胞分裂や減数分裂を経ても維持されて後代へ遺伝する。従って、非特許文献２に記載の方法は、台木と穂木の接ぎ木を介して行う植物の品種改良の手段の一つとして大いに期待される。しかしながら、ＴＧＳでは、ＰＴＧＳと異なって標的のＲＮＡが存在しないので、ＲＮＡ上でのトランジティビティ（Ｔｒａｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）現象が起動しない。よって、台木においてｓｉＲＮＡは増幅されず、ＰＴＧＳのような全身性（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ）の遺伝子サイレンシングが起こらないので、非特許文献２に記載の方法にはこの点で改良の余地がある。

Ｍｏｌｎａｒ Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２８：８７２−８７５．２０１０ Ｂａｉ Ｓ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．６２：４５６１−４５７０．２０１１

そこで本発明は、ＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡを接ぎ木を介して穂木から台木に篩管輸送し、台木において全身性の遺伝子サイレンシングを起こすことで、植物の形質転換を効果的に行う方法を提供することを目的とする。

上記の点に鑑みてなされた本発明の台木と穂木の接ぎ木を介して植物の形質転換を行う方法は、請求項１記載の通り、ＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡとその標的配列に相補的な配列を有するＲＮＡを穂木において産生せしめ、穂木において産生されたｓｉＲＮＡとその標的配列に相補的な配列を有するＲＮＡを接ぎ木を介して台木に輸送し、ＴＧＳを台木において発動させることによって台木の形質転換を行うことを特徴とする。
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、ＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡを穂木において産生せしめる方法として、標的遺伝子のプロモーター領域に相同な配列を有するｓｉＲＮＡを産生することができる、ＣｏＹＭＶプロモーターを用いたベクターを導入したアグロバクテリウムを穂木に感染させる方法を用いることを特徴とする。
また、請求項３記載の方法は、請求項１記載の方法において、ＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡの標的配列に相補的な配列を有するＲＮＡを穂木において産生せしめる方法として、プロモーター、ｓｉＲＮＡの標的配列の少なくとも一部を含むヌクレオチド、配列表の配列番号１に記載の配列を少なくとも含むヌクレオチド、ターミネーターを５’側からこの順番で有してなるベクターを導入したアグロバクテリウムを穂木に感染させる方法を用いることを特徴とする。
また、請求項４記載の方法は、請求項１記載の方法において、穂木としてタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）を用いることを特徴とする。
また、請求項５記載の方法は、請求項４記載の方法において、ＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡとその標的配列に相補的な配列を有するＲＮＡを、アグロインフィルトレーション法によって一過的にタバコにおいて産生せしめることを特徴とする。
また、請求項６記載の方法は、請求項４記載の方法において、台木がタバコと接ぎ木が成立する植物であることを特徴とする。
また、本発明の植物の形質転換個体の取得方法は、請求項７記載の通り、請求項１記載の方法によって台木の形質転換を行った後、台木の主根の側根からの再分化個体を形質転換個体として取得することを特徴とする。

本発明によれば、ＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡとともにその標的配列に相補的な配列を有するＲＮＡを穂木において産生せしめ、穂木から台木に輸送し、台木においてｓｉＲＮＡとその標的配列に相補的な配列を有するＲＮＡを共存させることで、ＲＮＡ上でのトランジティビティ現象を起動させてｓｉＲＮＡを増幅し、全身性の遺伝子サイレンシングを起こすことができるので、台木と穂木の接ぎ木を介して植物の形質転換を効果的に行うことができる。

実施例１において作製したｓｉＲＮＡ産生ベクター（ＣｏＹＭＶ：ＳｌＶｉｒｐ１ｐｒｏＩＲ）と標的相補ＲＮＡ産生ベクター（ＣｏＹＭＶ：ＳｌＶｉｒｐ１ｐｒｏ−２４３）のそれぞれのコンストラクトの主要部の概略図である。 同、台木としてのトマトにおけるＴＧＳ発動システムの概略図である。

本発明の台木と穂木の接ぎ木を介して行う植物の形質転換方法は、ＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡとその標的配列に相補的な配列を有するＲＮＡを穂木において産生せしめ、穂木において産生されたｓｉＲＮＡとその標的配列に相補的な配列を有するＲＮＡを接ぎ木を介して台木に輸送し、ＴＧＳを台木において発動させることによって台木の形質転換を行うことを特徴とするものである。以下、「ＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡ」を単に「ｓｉＲＮＡ」と略称し、「ＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡの標的配列に相補的な配列を有するＲＮＡ」を単に「標的相補ＲＮＡ」と略称することもある。

本発明において、ＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡを穂木において産生せしめる方法としては、標的遺伝子のプロモーター領域に相同な配列を有するｓｉＲＮＡを産生することができるベクターを、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＥＨＡ１０５株などのアグロバクテリウムに導入した後、ｓｉＲＮＡ産生ベクターを保持したアグロバクテリウムを穂木として用いる植物の葉片に自体公知の方法で感染させ、ベクター内のＴ−ＤＮＡの挿入によって目的とする形質転換が行われた細胞から再分化個体を取得し、この再分化個体を育成して穂木として用いる方法が挙げられる。また、穂木としてタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）を用いる場合、アグロインフィルトレーション法によってＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡを一過的にタバコにおいて産生せしめることもできる（必要であれば例えばＢｕｒｏｗ，Ｍ．Ｄ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．８：１２４−１３９．１９９０やＲａｔｃｈｌｉｆ，Ｆ．ＣＧ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１：１２０７−１２１６．１９９９などを参照のこと）。

ｓｉＲＮＡ産生ベクターとしては、プロモーターとターミネーターの間に、標的遺伝子のプロモーター領域のセンス鎖配列（ｓｉＲＮＡの標的配列：部分的であってもよい）とそのアンチセンス鎖配列との逆位方向反復塩基配列（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｒｅｐｅａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）構造を組み込んだ構成を有するものが挙げられる（逆位方向反復塩基配列構造の間にスペーサーを連結してもよい）。穂木において産生されたｓｉＲＮＡを篩管を通して台木に効率的に輸送するためには、プロモーターは、篩管輸送の起点である伴細胞で特異的に機能するプロモーター、例えば、ＣｏＹＭＶ（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｏｌｅ ｖｉｒｕｓ）プロモーターを用いることが望ましい。なお、ターミネーターとしては、植物体内でターミネーターとして機能する例えばＮＯＳターミネーターなどが挙げられる。

本発明において、ＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡの標的配列に相補的な配列を有するＲＮＡを穂木において産生せしめる方法としては、プロモーター、ｓｉＲＮＡの標的配列の少なくとも一部を含むヌクレオチド、配列表の配列番号１に記載の配列を少なくとも含むヌクレオチド、ターミネーターを５’側からこの順番で有してなる標的相補ＲＮＡ産生ベクターを、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＥＨＡ１０５株などのアグロバクテリウムに導入した後、標的相補ＲＮＡ産生ベクターを保持したアグロバクテリウムを穂木として用いる植物の葉片に自体公知の方法で感染させ、ベクター内のＴ−ＤＮＡの挿入によって目的とする形質転換が行われた細胞から再分化個体を取得し、この再分化個体を育成して穂木として用いる方法が挙げられる。また、穂木としてタバコを用いる場合、アグロインフィルトレーション法によって標的相補ＲＮＡを一過的にタバコにおいて産生せしめることもできる（前述の通り）。

標的相補ＲＮＡ産生ベクターは、本発明者らが提案した植物の篩管を通してＲＮＡを輸送するためのベクターシステムを用いて作製することができる（特開２０１０−７５１１６号公報）。配列表の配列番号１に記載の配列からなるヌクレオチドは、１９５１個の塩基から構成されるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＲＧＡ２遺伝子（ｃＤＮＡ：Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｙ１１３３７）の９５２〜１１９４ｂｐの領域の２４３個の塩基から構成されるヌクレオチドである。プロモーターは、篩管輸送の起点である伴細胞で特異的に機能するプロモーター、例えば、ＣｏＹＭＶプロモーターを用いることが望ましい。なお、ターミネーターとしては、植物体内でターミネーターとして機能する例えばＮＯＳターミネーターなどが挙げられる。

ＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡとその標的配列に相補的な配列を有するＲＮＡを穂木において産生せしめるための方法としては、例えば、ｓｉＲＮＡ産生ベクターを保持したアグロバクテリウムと標的相補ＲＮＡ産生ベクターを保持したアグロバクテリウムのそれぞれを穂木として用いる植物の葉片に感染させ、それぞれの目的とする形質転換が行われた細胞からそれぞれの再分化個体を取得し、それぞれの再分化個体を育成して両者を穂木とするＹ字接ぎ木法（Ｎｏｔａｇｕｃｈｉ Ｍ．ら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓ．１２２：２０１−２０４．２００９）を用いて行う方法が挙げられる。また、穂木としてタバコを用い、アグロインフィルトレーション法によってｓｉＲＮＡと標的相補ＲＮＡを一過的にタバコにおいて産生せしめるためには、タバコと台木を予め接ぎ木した後、タバコの異なる葉のそれぞれにｓｉＲＮＡ産生ベクターを保持したアグロバクテリウムと標的相補ＲＮＡ産生ベクターを保持したアグロバクテリウムのそれぞれを自体公知の方法で同時にまたは時を前後してインフィルトレートすればよい。できるだけ多くのｓｉＲＮＡと標的相補ＲＮＡを穂木において産生せしめ、穂木から台木に輸送するためには、Ｙ字接ぎ木法を用いて行う方法などを採用するよりも、穂木としてタバコを用い、アグロインフィルトレーション法によってｓｉＲＮＡと標的相補ＲＮＡを一過的にタバコにおいて産生せしめる方法を採用することが望ましい。

本発明の適用対象となる植物は、台木と穂木のいずれについても接ぎ木が成立する植物であれば特段の制限はない。接ぎ木の手法は自体公知の手法であってよい。本発明によれば、ソース力が強い穂木からシンク力が強い台木に接ぎ木を介してＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡとその標的配列に相補的な配列を有するＲＮＡを輸送することで、台木においてＲＮＡ上でのトランジティビティ現象が起動してｓｉＲＮＡが増幅され、全身性の遺伝子サイレンシングが起こることによって台木を効果的に形質転換することができる。台木において発動されたＴＧＳは後代に遺伝するので、台木の主根の篩管に隣接する内鞘細胞（ｐｅｒｉｃｙｃｌｅ ｃｅｌｌ）が分裂して形成される側根から組織培養を通して再分化個体を取得したり、いわゆる「ひこばえ」が見られる植物（例えばブルーベリーやリンゴなどの果樹）においては根系不定芽体（Ｒｏｏｔ ｓｕｃｋｅｒ）から組織培養を通して再分化個体として取得したり、台木の茎切片から組織培養を通して再分化個体を取得したりすれば、これらは遺伝子サイレンシングが維持された形質転換個体であるので、品種改良個体として育成することができる。とりわけ、穂木としてタバコを用いた場合、同じナス科植物（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）に属するナスやトマトやジャガイモを台木とすることで接ぎ木が成立するので、本発明はこうした作物の品種改良の手段として利用することができる。また、穂木としてタバコを用いた場合、タバコと接ぎ木が成立しない植物（例えばリンゴ）を台木としても、アグロインフィルトレーション法によってｓｉＲＮＡと標的相補ＲＮＡを一過的にタバコにおいて産生せしめ、台木との間で切り口を密着させる接ぎ木形態を短期間でもとりさえずれば、ｓｉＲＮＡと標的相補ＲＮＡがタバコから台木に輸送され、台木においてＴＧＳを発動させることができる。

以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。

実施例１：
台木としてトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）を、穂木としてタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）を用い、接ぎ木を介してトマトの内生遺伝子に対してＴＧＳを発動させ、遺伝子サイレンシングを起こす実験を以下のようにして行った。

（実験方法）
（１）ＴＧＳ発動ｓｉＲＮＡを穂木として用いるタバコにおいて産生させるためのｓｉＲＮＡ産生ベクターの作製
トマトの内生遺伝子として知られているウイロイド増殖に必須のＳｌＶｉｒｐ１遺伝子のプロモーターの−４４〜−１０２４ｂｐの領域（ｔｏｍａｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ ＳＬ２．４０ｃｈ０１）とそのアンチセンス鎖配列との逆位方向反復塩基配列構造の間にＣＡＴ１（カタラーゼ）遺伝子由来のイントロン（配列長：２０１ｂｐ、Ｏｈｔａ Ｓ．ら、Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ３１：８０５−８１３．１９９０）をスペーサーとして連結して組み込んだ。このユニットを、バイナリーベクターｐＥ２１１３−ＧＵＳ（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ Ｉ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ３７：４９−５９．１９９６）のＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ部位のＧＵＳ（ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）遺伝子と入れ換えて３５Ｓ：ＳｌＶｉｒｐ１ｐｒｏＩＲを構築した。次に、伴細胞で特異的に機能するプロモーターであるＣｏＹＭＶｐをｐＣＯＩ（Ｍａｔｓｕｄａ、Ｙ．ら、Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ ２２０：５１−５８．２００２）によりＰＣＲ増幅し、これを３５Ｓ：ＳｌＶｉｒｐ１ｐｒｏＩＲのＳａｌＩ／ＢａｍＩＨ部位と入れ換えることで、目的のｓｉＲＮＡ産生ベクター（ＣｏＹＭＶ：ＳｌＶｉｒｐ１ｐｒｏＩＲ）を得た（図１）。

（２）ＴＧＳ発動ｓｉＲＮＡの標的配列に相補的な配列を有するＲＮＡを穂木として用いるタバコにおいて産生させるためのＲＮＡ産生ベクターの作製
特開２０１０−７５１１６号公報に記載の方法に従って作製した。まず、バイナリーベクターｐＥ２１１３−ＧＵＳ（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ Ｉ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ３７：４９−５９．１９９６）からＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩ部位の３５ＳプロモーターとＧＵＳ遺伝子を切り出し、そこに配列表の配列番号１に記載のＲＧＡ２遺伝子（ｃＤＮＡ：Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｙ１１３３７）の９５２〜１１９４ｂｐの領域の２４３個の塩基から構成されるヌクレオチド（以下「−２４３」と略称）を制限酵素サイト付加プライマーを用いてＰＣＲ増幅して組み込んだ。次に、伴細胞で特異的に機能するプロモーターであるＣｏＹＭＶｐをｐＣＯＩ（Ｍａｔｓｕｄａ、Ｙ．ら、Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ ２２０：５１−５８．２００２）によりＰＣＲ増幅し、そのＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ部位に−２４３で挿入することでＣｏＹＭＶ：−２４３を構築した。最後に、ＳｌＶｉｒｐ１遺伝子のプロモーターの−４４〜−１０２４ｂｐの領域（ｔｏｍａｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ ＳＬ２．４０ｃｈ０１）をＰＣＲ増幅し、ＣｏＹＭＶ：−２４３のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位に組み込むことで、目的の標的相補ＲＮＡ産生ベクター（ＣｏＹＭＶ：ＳｌＶｉｒｐ１ｐｒｏ−２４３）を得た（図１）。

（３）ｓｉＲＮＡ産生ベクターと標的相補ＲＮＡ産生ベクターのそれぞれのアグロバクテリウムへの導入
アグロバクテリウムとしてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＥＨＡ１０５株を用い、その単一コロニーをＬＢ培地（組成は表１参照）に抗生物質（５０ｍｇ／ＬのＲｉｆａｍｐｉｃｉｎ）を添加した培地に植え付け、２８℃で２４時間振盪培養し、継代してさらに１２時間振盪培養した。その後、４℃にて６０００ｒｐｍで１０分間遠心し、回収した菌を滅菌水および１０％グリセロールで洗浄した。この菌のペレットを１０％グリセロール１ｍＬで懸濁し、そのうちの４０μＬを（１）と（２）のそれぞれで作製したｓｉＲＮＡ産生ベクターと標的相補ＲＮＡ産生ベクターのそれぞれ０．５〜１．０μｇと混合し、混合液をキュベットに移し、２０ｋＶ／ｃｍ，６ｍｓの条件でエレクトロポレーションすることで、ｓｉＲＮＡ産生ベクターと標的相補ＲＮＡ産生ベクターのそれぞれをアグロバクテリウムに導入した。電圧をかけたキュベット内の反応液にＬＢ培地１ｍＬを加え、１．５ｍＬチューブに回収し、２８℃で２４時間培養した。抗生物質（５０ｍｇ／ＬのＲｉｆａｍｐｉｃｉｎおよび５０ｍｇ／ＬのＫａｎａｍｙｃｉｎ）を含むＬＢ寒天培地上に培養液を塗布し、２８℃で３日間培養した。得られたコロニーを新しいＬＢ培地で培養し、アグロバクテリウム感染に用いた。

（４）台木としてのトマトと穂木としてのタバコの接ぎ木
トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ＣＶ．Ｒｕｔｇｕｒｓ）の種子とタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の種子のそれぞれを、２％次亜塩素酸ナトリウムと０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０の水溶液で殺菌し、ＭＳ寒天（０．７％）培地上に播種した。発芽から約７日後のそれぞれの幼苗体を、下胚軸中位部分で水平にカットし、実体顕微鏡下、内径０．７ｍｍの医療用マイクロシリコンチューブ（ＴｅｃｈＪａｍ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）内で、台木側のトマトのカット面と穂木側のタバコのカット面を密着させて接ぎ木し、ＭＳ寒天培地上で再度生育させた。７日後、実体顕微鏡下にてシリコンチューブをメスで切除し、接ぎ木個体を、液体肥料（Ｏｔｓｕｋａ Ｈｏｕｓｅ Ｎｏｓ．１ ａｎｄ ２，Ｏｔｓｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）に湿潤させた栽培用ロックウール（Ｎｉｔｔｏ Ｂｏｓｅｋｉ Ｃｏ．）に移植して培養庫内で約２週間栽培した。その後、接ぎ木個体の穂木側のタバコの第６〜８位に相当する２枚の葉のみを残して、その下の葉および上位にあたる葉をカミソリ刃で切除した。

（５）ｓｉＲＮＡ産生コンストラクトと標的相補ＲＮＡ産生コンストラクトのそれぞれの穂木タバコへのアグロインフィルトレーション
液体ＬＢ培地５ｍＬに抗生物質（５０ｍｇ／ＬのＲｉｆａｍｐｉｃｉｎおよび５０ｍｇ／ＬのＫａｎａｍｙｃｉｎ）を添加し、ｓｉＲＮＡ産生ベクター（ＣｏＹＭＶ：ＳｌＶｉｒｐ１ＰｒｏＩＲ）を保持したアグロバクテリウムと標的相補ＲＮＡ産生ベクター（ＣｏＹＭＶ：ＳｌＶｉｒｐ１Ｐｒｏ−２４３）を保持したアグロバクテリウムのそれぞれを２８℃で１６〜１８時間、前培養した。次に、液体ＬＢ培地に１０μＭのａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅを添加して調製した培地に１／５０量の前培養液を加えて２８℃で１２〜１６時間、本培養した。こうして得た本培養液を室温にて８０００ｒｐｍで５分間遠心し、回収した菌をＯＤ６００＝１．０になるように懸濁液（１０μＭのＭＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ５．２），１０ｍＭのＭｇＣｌ_２，１００μＭのａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ）に懸濁した後、２時間程度静置した。（４）において作製した接ぎ木個体の穂木タバコの２枚の葉の一方の裏側にｓｉＲＮＡ産生ベクターを保持したアグロバクテリウムを含む懸濁液０．５ｍＬを、他方の裏側に標的相補ＲＮＡ産生ベクターを保持したアグロバクテリウムを含む懸濁液０．５ｍＬを、それぞれシリンジ（ツベルクリン１ｍＬ、ニプロ）を用いて主葉脈（中肋）を避けて４箇所にインフィルトレートした。

（６）台木としてのトマトにおけるＴＧＳ発動の観察
（５）におけるアグロインフィルトレーションから７日後、接ぎ木してから新たに成長してきた側根をサンプリングし、ＴＲＩｚｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。ＴＵＲＢＯ ＤＮＡ−ｆｒｅｅ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈ．）を用いてサンプリングした側根より、抽出したｔｏｔａｌＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による逆転写反応を行った。得られたｃＤＮＡを鋳型にしてＳｓｏＦａｓｔ ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を行い、標的遺伝子としたＳｌＶｉｒｐ１遺伝子の側根における発現の程度を調べた。なお、ＳｌＶｉｒｐ１遺伝子転写物の定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析は、その２００５〜２１６８ｂｐの領域を増幅するためのプライマーセット（配列表の配列番号２に記載の５’−ＣＣＧＧＡＡＧＴＧＡＣＴＣＴＧＡＴＧＣＴ−３’と配列番号３に記載の５’−ＣＣＴＡＧＧＴＴＧＣＣＣＡＴＧＴＧＴＴＴ−３’）を用いて行った。また、内部補正には、アクチン遺伝子（Ｌｉ Ｌ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｆｏｏｄ ａｎｄ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ９１：２３０８−１４．２０１１）を用いた。

（実験結果）
実施例１において用いた台木としてのトマトにおけるＴＧＳ発動システムの概略を図２に示す。このシステムを利用してｓｉＲＮＡと標的相補ＲＮＡを穂木タバコにおいて産生せしめ、接ぎ木を介して両者を台木トマトに輸送することで、台木トマトの側根における標的遺伝子としたＳｌＶｉｒｐ１遺伝子の発現量が減少することを確認することができた。その減少の程度は、ｓｉＲＮＡだけを穂木タバコにおいて産生せしめ、接ぎ木を介して台木トマトに輸送した場合よりも効果的であった。これは、ｓｉＲＮＡとともに標的相補ＲＮＡを穂木タバコから台木トマトに輸送したことで、台木トマトにおいてＲＮＡ上でのトランジティビティ現象が起動し、ｓｉＲＮＡの増幅によって全身性の遺伝子サイレンシングが起きたことによるものと推察できた。以上の結果から、本発明によれば、台木と穂木の接ぎ木を介して植物の形質転換を効果的に行うことができることがわかった。

本発明は、ＴＧＳを発動させるためのｓｉＲＮＡを用い、全身性の遺伝子サイレンシングを起こすことで台木と穂木の接ぎ木を介して植物の形質転換を効果的に行う方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。

Claims (7)

1. 台木と穂木の接ぎ木を介して植物の形質転換を行う方法であって、転写型遺伝子サイレンシングを発動させるためのｓｉＲＮＡとその標的配列に相補的な配列を有するＲＮＡを穂木において産生せしめ、穂木において産生されたｓｉＲＮＡとその標的配列に相補的な配列を有するＲＮＡを接ぎ木を介して台木に輸送し、転写型遺伝子サイレンシングを台木において発動させることによって台木の形質転換を行うことを特徴とする方法。
2. 転写型遺伝子サイレンシングを発動させるためのｓｉＲＮＡを穂木において産生せしめる方法として、標的遺伝子のプロモーター領域に相同な配列を有するｓｉＲＮＡを産生することができる、ＣｏＹＭＶプロモーターを用いたベクターを導入したアグロバクテリウムを穂木に感染させる方法を用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 転写型遺伝子サイレンシングを発動させるためのｓｉＲＮＡの標的配列に相補的な配列を有するＲＮＡを穂木において産生せしめる方法として、プロモーター、ｓｉＲＮＡの標的配列の少なくとも一部を含むヌクレオチド、配列表の配列番号１に記載の配列を少なくとも含むヌクレオチド、ターミネーターを５’側からこの順番で有してなるベクターを導入したアグロバクテリウムを穂木に感染させる方法を用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
4. 穂木としてタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）を用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
5. 転写型遺伝子サイレンシングを発動させるためのｓｉＲＮＡとその標的配列に相補的な配列を有するＲＮＡを、アグロインフィルトレーション法によって一過的にタバコにおいて産生せしめることを特徴とする請求項４記載の方法。
6. 台木がタバコと接ぎ木が成立する植物であることを特徴とする請求項４記載の方法。
7. 植物の形質転換個体の取得方法であって、請求項１記載の方法によって台木の形質転換を行った後、台木の主根の側根からの再分化個体を形質転換個体として取得することを特徴とする方法。