JP2013509194A - Ａｘ２１３およびａｘ１３２ｐｃｓｋ９アンタゴニストおよびバリアント - Google Patents

Ａｘ２１３およびａｘ１３２ｐｃｓｋ９アンタゴニストおよびバリアント Download PDF

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Abstract

ヒトプロタンパク質転換酵素スブチリシン−ケキシン９型（「ＰＣＳＫ９」）のアンタゴニストを開示する。開示したアンタゴニストは、ＰＣＳＫ９機能の阻害に有効であり、したがって、ＰＣＳＫ９活性と関連している病状の処置における使用のための望ましいアンタゴニストを提示する。また、本発明は、前記アンタゴニストをコードする核酸、ベクター、宿主細胞、および該アンタゴニストを含む組成物を開示する。また、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの作製方法、ならびにＰＣＳＫ９機能を阻害またはアンタゴナイズするための該アンタゴニストの使用方法も開示され、本開示の重要なさらなる態様を構成する。

Description

関連出願の相互参照
該当なし。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
該当なし。
マイクロフィッシュ付属物の参照
該当なし。
プロタンパク質転換酵素スブチリシン−ケキシン９型（以下、本明細書において「ＰＣＳＫ９」という）は、神経アポトーシス調節転換酵素１（「ＮＡＲＣ−１」）としても知られており、分泌性スブチラーゼファミリーの９番目の構成員として同定されたプロテイナーゼＫ様スブチラーゼである；Ｓｅｉｄａｈら，２００３ ＰＮＡＳ １００：９２８−９３３参照。ＰＣＳＫ９の遺伝子は、ヒト染色体Ｉｐ３３−ｐ３４．３に位置している；Ｓｅｉｄａｈら（上掲）。ＰＣＳＫ９は、増殖と分化が可能な細胞、例えば、肝細胞、腎臓間葉細胞、回腸、および結腸上皮ならびに胚の脳の終脳神経単位などにおいて発現される；Ｓｅｉｄａｈら（上掲）。
ＰＣＳＫ９の最初の合成体は、約７２ｋＤａの不活性な酵素前駆体あるいはチモーゲンの形態であり、これは、小胞体（「ＥＲ」）内で自己触媒性の細胞内プロセッシングを受け、機能体を活性化させる。この内部プロセッシング事象は、ＳＳＶＦＡＱ↓ＳＩＰＷＮＬ１５８モチーフ（それぞれ、配列番号：１９および２０）で起こると報告されている；Ｂｅｎｊａｎｎｅｔら，２００４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４８８６５−４８８７５。かかる内部プロセッシングは、ＥＲからの逸出に必要であると報告されている；Ｂｅｎｊａｎｎｅｔら（上掲）；Ｓｅｉｄａｈら（上掲）。切断され、それにより活性化された該タンパク質は、その切断ペプチドと会合した状態で分泌される（上掲）。
ヒトＰＣＳＫ９の配列（約２２ｋｂ長で、６９２個のアミノ酸のタンパク質をコードする１２個エキソンを有する）は、一例において、寄託番号ＮＰ＿７７７５９６．２に見られるものであり得る。ヒト、マウスおよびラットのＰＣＳＫ９の核酸配列は寄託されている。例えば、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＸ２１３２７５３０（また、ＡＸ２０７６８６）、ＮＰ＿７０５７９３（また、Ｑ８０Ｗ６５）、およびＰ５９９９６を参照のこと。ＰＣＳＫ９は、他のプロタンパク質転換酵素にも見られるいくつかのドメイン、例えば、Ｎ末端シグナル配列、プロドメイン、触媒性ドメインおよびシステインリッチＣ末端ドメインを有する。ＰＣＳＫ９の触媒性ドメインは、スブチラーゼのプロテイナーゼＫファミリーとの高い配列類似性ならびに、注目すべきことに、触媒性トライアッドＤ１８６、Ｈ２２６およびＳ３８６を共有している。
ＰＣＳＫ９は、いくつかの特許公開公報に開示および／または特許請求されている（限定されないが、以下の：ＰＣＴ国際公開第０１／３１００７号、同第０１／５７０８１号、同第０２／１４３５８号、同第０１／９８４６８号、同第０２／１０２９９３号、同第０２／１０２９９４号、同第０２／４６３８３号、同第０２／９０５２６号、同第０１／７７１３７号、および同第０１／３４７６８号、米国特許出願公開第２００４／０００９５５３号および同第２００３／０１１９０３８号、ならびに欧州特許第１４４０９８１号明細書、同第１０６７１８２号明細書および同第１４７１１５２号明細書が挙げられる）。
ＰＣＳＫ９は、肝細胞および神経単位細胞の分化において役割を果たしており（Ｓｅｉｄａｈら（上掲））、胚肝臓において高度に発現され、コレステロールの恒常性に強く関与している。試験により、コレステロールの生合成または取込みにおけるＰＣＳＫ９の具体的な役割が示唆されている。コレステロール給餌ラットの試験において、Ｍａｘｗｅｌｌらにより、ＰＣＳＫ９が、コレステロールの生合成に関与している３つの他の遺伝子と同様の様式で下方調節されることが見い出された（Ｍａｘｗｅｌｌら，２００３ Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４４：２１０９−２１１９）。実際、ＰＣＳＫ９の発現は、コレステロールの代謝に関与している他の遺伝子の場合で見られるように、ステロール調節エレメント結合タンパク質（「ＳＲＥＢＰ」）によって調節されることが示されている（上掲）。後に、この所見は、ＰＣＳＫ９の転写調節試験によって裏付けられ、該試験により、かかる調節が、リポタンパク質の代謝に関与している他の遺伝子にかなり典型的なものであることが示された；Ｄｕｂｕｃら，２００４ Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ ２４：１４５４−１４５９。スタチンは、ＰＣＳＫ９発現を、該薬物のコレステロール低下効果に起因する様式で上方調節することが示されている（上掲）。さらに、ＰＣＳＫ９プロモーターは、コレステロールの調節に関与している２つの保存された部位、ステロール調節エレメントとＳｐｌ部位を有することが示されている（上掲）。
いくつかの一連の証拠により、ＰＣＳＫ９は、特に、肝ＬＤＬＲタンパク質の量を低下させ、したがって、肝臓が循環系からＬＤＬコレステロールを除去する能力を障害することが示されている。マウスの肝臓においてＰＣＳＫ９のアデノウイルス媒介性過剰発現を行うと、肝ＬＤＬＲタンパク質が劇的に減少するため（ＬＤＬＲ ｍＲＮＡレベルに対する影響はない）、循環ＬＤＬ−Ｃの蓄積がもたらされる；Ｂｅｎｊａｎｎｅｔら，２００４ Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７９：４８８６５−４８８７５；Ｍａｘｗｅｌｌ ＆ Ｂｒｅｓｌｏｗ，２００４ ＰＮＡＳ １０１：７１００−７１０５；Ｐａｒｋら，２００４ Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７９：５０６３０−５０６３８；およびＬａｌａｎｎｅら，２００５ Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４６：１３１２−１３１９。マウスにおける循環ＬＤＬ−Ｃレベルの上昇に対するＰＣＳＫ９過剰発現の効果は、完全にＬＤＬＲの発現に依存性であり、これによっても、ＰＣＳＫ９によるＬＤＬ−Ｃの調節がＬＤＬＲタンパク質の下方調節によって媒介されていることが示される。この所見と整合して、ＰＣＳＫ９欠損マウスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害薬によってＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡを低下させたマウスは、肝ＬＤＬＲタンパク質レベルが高くなり、循環ＬＤＬ−Ｃのクリアランス能力が大きくなる；Ｒａｓｈｉｄら，２００５ ＰＮＡＳ １０２：５３７４−５３７９；およびＧｒａｈａｍら，２００７ Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４８（４）：７６３−７６７。また、培養ヒト肝細胞において、ｓｉＲＮＡによりＰＣＳＫ９レベルを低下させても、より高いＬＤＬＲタンパク質レベルおよびＬＤＬ−Ｃ取込み能力の増大がもたらされる；Ｂｅｎｊａｎｎｅｔら，２００４ Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７９：４８８６５−４８８７５；およびＬａｌａｎｎｅら，２００５ Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４６：１３１２−１３１９。総合すると、これらのデータは、ＰＣＳＫ９の作用により、ＬＤＬＲタンパク質レベルを低下させることによってＬＤＬ−Ｃの増大がもたらされることを示す。
また、ＰＣＳＫ９の遺伝子におけるいくつかの変異も、確定的に、常染色体優性高コレステロール血症（「ＡＤＨ」）（血漿中の低密度リポタンパク質（「ＬＤＬ」）粒子の著しい上昇（これは、早発心血管不全に至ることがあり得る）を特徴とする遺伝性の代謝障害）と関連している；Ａｂｉｆａｄｅｌら，２００３ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３４：１５４−１５６；Ｔｉｍｍｓら，２００４ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１１４：３４９−３５３；Ｌｅｒｅｎ，２００４ Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．６５：４１９−４２２参照。後に公表されたＡｂｉｆａｄｅｌらのＳ１２７Ｒ変異に関する試験（上掲）により、かかる変異を保有している患者は、（１）ａｐｏＢ１００含有リポタンパク質（低密度リポタンパク質（「ＬＤＬ」）、極低密度リポタンパク質（「ＶＬＤＬ」）および中密度リポタンパク質（「ＩＤＬ」）など）の過剰産生、ならびに（２）随伴する前記リポタンパク質のクリアランスまたは変換の低減（Ｏｕｇｕｅｒｒａｍら，２００４ Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２４：１４４８−１４５３）に起因する、高い血漿中総コレステロールおよびａｐｏＢ１００を示すことが報告された。
したがって、ＰＣＳＫ９がＬＤＬの調節に役割を果たしていることは疑いの余地がない。ＰＣＳＫ９の発現または上方調節は、ＬＤＬコレステロールの血漿レベルの増大と関連し、対応するＰＣＳＫ９の発現の阻害または欠如は、ＬＤＬコレステロールの血漿レベルの低減と関連する。ＰＣＳＫ９における配列変異と関連しているＬＤＬコレステロールレベルの減少により、冠動脈性心疾患に対する保護がもたらされることがわかっている；Ｃｏｈｅｎ，２００６ Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５４：１２６４−１２７２。
心血管罹病の処置に有効な化合物および／または薬剤の同定は非常に望ましい。臨床試験において、ＬＤＬコレステロールレベルの低減は、冠動脈性事象の割合と直接関連している；Ｌａｗら，２００３ ＢＭＪ３２６：１４２３−１４２７。これより最近に、血漿ＬＤＬコレステロールレベルを生涯にわたって穏やかに低減させることは、冠動脈性事象の発生率の相当な低減と相関することがわかった；Ｃｏｈｅｎら（上掲）。これは、非脂質関連の心血管リスクファクターの有病率が高い集団においてもそうである；上掲。したがって、ＬＤＬコレステロールレベルのコントロールのマネージメントにより、大きな有益性が得られることになる。
本発明は、種々の治療条件におけるＰＣＳＫ９の活性およびそれに対応するＰＣＳＫ９が果たす役割の阻害するための使用についてＰＣＳＫ９のアンタゴニストを提供することにより、このような利益を高めるものである。
国際公開第０１／３１００７号 国際公開第０１／５７０８１号 国際公開第０２／１４３５８号 国際公開第０１／９８４６８号 国際公開第０２／１０２９９３号 国際公開第０２／１０２９９４号 国際公開第０２／４６３８３号 国際公開第０２／９０５２６号 国際公開第０１／７７１３７号 国際公開第０１／３４７６８号 米国特許出願公開第２００４／０００９５５３号 米国特許出願公開第２００３／０１１９０３８号 欧州特許第１４４０９８１号明細書 欧州特許第１０６７１８２号明細書 欧州特許第１４７１１５２号明細書
Ｓｅｉｄａｈら，２００３ ＰＮＡＳ １００：９２８−９３３ Ｂｅｎｊａｎｎｅｔら，２００４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４８８６５−４８８７５ Ｍａｘｗｅｌｌら，２００３ Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４４：２１０９−２１１９ Ｄｕｂｕｃら，２００４ Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ ２４：１４５４−１４５９ Ｍａｘｗｅｌｌ ＆ Ｂｒｅｓｌｏｗ，２００４ ＰＮＡＳ １０１：７１００−７１０５ Ｐａｒｋら，２００４ Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７９：５０６３０−５０６３８ Ｌａｌａｎｎｅら，２００５ Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４６：１３１２−１３１９ Ｒａｓｈｉｄら，２００５ ＰＮＡＳ １０２：５３７４−５３７９ Ｇｒａｈａｍら，２００７ Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４８（４）：７６３−７６７ Ａｂｉｆａｄｅｌら，２００３ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３４：１５４−１５６ Ｔｉｍｍｓら，２００４ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１１４：３４９−３５３
本発明は、ＰＣＳＫ９タンパク質特異的アンタゴニスト、具体的な実施形態では、ヒトＰＣＳＫ９を阻害するアンタゴニストに関する。広義には、ＰＣＳＫ９タンパク質特異的アンタゴニスト（または本明細書において「ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト」という）は、ＰＣＳＫ９タンパク質結合分子、または選択的なＰＣＳＫ９結合およびＰＣＳＫ９機能阻害に有効な分子である。具体的な実施形態において、本発明は、高い親和性および治療上の観点から所望される特性を有するモノクローナル抗体バリアントに関する。このような分子は、ＰＣＳＫ９機能と関連している病状または該機能の影響を受ける病状、例えば限定されないが、高コレステロール血症、冠動脈性心疾患、メタボリックシンドローム、急性冠症候群および関連病状の処置において重要である。ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、ＰＣＳＫ９に対する選択的な認識および結合を特徴とする。ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、該アンタゴニストが、ＰＣＳＫ９特異的結合成分に対してさらなる明確な特異性が付与されるように補給または設計される特定の場合以外、ＰＣＳＫ９以外のタンパク質には有意な結合を示さない。
本明細書における具体的な実施形態を構成するＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、（ａ）配列番号：１〜５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３〜６３、１５アミノ酸長である前述の配列の残基４〜１２、ならびに、ＰＣＳＫ９に対する特異性を５０％より大きく（特定の実施形態では、６０％、７０％、８０％および９０％より大きく）低下させない１つ以上（特定の実施形態では、１〜５つまたは１〜３つ）のアミノ酸置換を有することが特徴であるその等価体（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）からなる群より選択される配列を含む（選択された実施形態では、該配列からなる）ＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域、および／または（ｂ）配列番号：２９５〜３０１、配列番号：３０３、配列番号：３０５〜３３４、１６アミノ酸長である前述の配列の残基４〜１３、ならびに、ＰＣＳＫ９に対する特異性を５０％より大きく（特定の実施形態では、６０％、７０％、８０％および９０％より大きく）低下させない１つ以上（特定の実施形態では、１〜５つまたは１〜３つ）のアミノ酸置換を有することが特徴であるその等価体からなる群より選択される配列を含む（選択された実施形態では、該配列からなる）ＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含むものである。
本明細書におけるさらなる実施形態を構成するＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、（ａ）配列番号：６４〜６８、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７４、配列番号：７６〜１８２、２３アミノ酸長である前述の配列の残基４〜２０、ならびに、ＰＣＳＫ９に対する特異性を５０％より大きく（特定の実施形態では、６０％、７０％、８０％および９０％より大きく）低下させない１つ以上（特定の実施形態では、１〜５つまたは１〜３つ）のアミノ酸置換を有することが特徴であるその等価体からなる群より選択される配列を含む（選択された実施形態では、該配列からなる）ＣＤＲ２ドメインを含む重鎖可変領域、および／または（ｂ）配列番号：３３５〜３３９、配列番号：３４１、配列番号：３４３〜３４６、１３アミノ酸長である前述の配列の残基４〜１０、ならびに、ＰＣＳＫ９に対する特異性を５０％より大きく（特定の実施形態では、６０％、７０％、８０％および９０％より大きく）低下させない１つ以上（特定の実施形態では、１〜５つまたは１〜３つ）のアミノ酸置換を有することが特徴であるその等価体からなる群より選択される配列を含む（選択された実施形態では、該配列からなる）ＣＤＲ２ドメインを含む軽鎖可変領域を含むものである。
特定の実施形態において、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストはヒトＰＣＳＫ９に、１．２×１０−６Ｍ以下のＫＤで結合するものである。より特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストはヒトＰＣＳＫ９に、１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合するものである。さらなる実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストはヒトＰＣＳＫ９に、１×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合するものである。さらなる実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストはヒトＰＣＳＫ９に、５×１０−９Ｍ以下または１×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するものである。選択された実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストはヒトＰＣＳＫ９に、１×１０−１０Ｍ以下のＫＤ、１×１０−１１Ｍ以下のＫＤ、または１×１０−１２Ｍ以下のＫＤで結合するものである。特定の実施形態において、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストはＰＣＳＫ９以外のタンパク質に、ＰＣＳＫ９に対する結合について示した上記のレベルで結合しないものである。
本発明の具体的な実施形態は、上記に規定したうちの１つのレベルのＰＣＳＫ９に対する結合を示し、ＰＣＳＫ９に対する結合について、ＡＸ１３２および本明細書に記載のそのバリアントと競合するＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを含む。ＡＸ１３２および開示したそのバリアント（本開示全体を通して示した本記載、配列および／または機能的限定に適合する任意の抗体分子として記載）は、本明細書における重要なＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを構成する。
ＡＸ１３２抗体分子は、（ｉ）配列番号：３６０または配列番号：３６１を含む重鎖可変領域（「ＶＨ」）、および（ｉｉ）配列番号：５１１を含む軽鎖可変領域（「ＶＬ」）を含むことが特徴である。前記ＶＨおよびＶＬ領域は、それぞれ、ＶＨの開示したＣＤＲ１、２および３の完全相補鎖［配列番号：１８９（または配列番号：１９１）をＣＤＲ１として、配列番号：６８（または配列番号：７０）をＣＤＲ２として、および配列番号：５（または配列番号：７）をＣＤＲ３として］、ならびにＶＬ領域の開示したＣＤＲ１、２および３の完全相補鎖［配列番号：３４９（または配列番号：３５１）をＣＤＲ１として、配列番号：３３９（または配列番号：３４１）をＣＤＲ２として、および配列番号：３０１（または配列番号：３０３）をＣＤＲ３として］を含むものである。ＡＸ１３２抗体分子の例としては、限定されないが：（ｉ）配列番号：５５４を含む軽鎖と、配列番号：５５２のアミノ酸１〜２２１（または配列番号：５５２）を含むアミノ酸を含むＦｄ鎖を含むＦａｂ、（ｉｉ）配列番号：５５８を含む軽鎖と配列番号：５５６を含む重鎖を含む完全長抗体分子、および（ｉｉｉ）配列番号：５６０の発現によって生成される抗体が挙げられる。
ＡＸ２１３抗体分子は、本明細書に記載の特異的バリアントの一例であり、（ｉ）配列番号：３６２または配列番号：３６３を含む重鎖可変領域（「ＶＨ」）、および（ｉｉ）配列番号：５１１を含む軽鎖可変領域（「ＶＬ」）を含むことが特徴である。前記ＶＨおよびＶＬ領域は、それぞれ、ＶＨの開示したＣＤＲ１、２および３の完全相補鎖［配列番号：１９３（または配列番号：１９５）をＣＤＲ１として、配列番号：７２（または配列番号：７４）をＣＤＲ２として、および配列番号：９（または配列番号：１１）をＣＤＲ３として）］、ならびにＶＬ領域の開示したＣＤＲ１、２および３の完全相補鎖［配列番号：３４９（または配列番号：３５１）をＣＤＲ１として、配列番号：３３９（または配列番号：３４１）をＣＤＲ２として、および配列番号：３０１（または配列番号：３０３）をＣＤＲ３として］を含むものである。ＡＸ２１３抗体分子の例としては、限定されないが：（ｉ）配列番号：５５４を含む軽鎖と、配列番号：５６２のアミノ酸１〜２２１（または配列番号：５６２）を含むアミノ酸を含むＦｄ鎖を含むＦａｂ、（ｉｉ）配列番号：５６６を含む軽鎖と配列番号：５６４を含む重鎖を含む完全長抗体分子、および（ｉｉｉ）配列番号：５６９の発現によって生成される抗体が挙げられる。
ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、細胞内ＬＤＬ取込みのＰＣＳＫ９依存性阻害、特に、細胞内ＬＤＬ取込みのヒトＰＣＳＫ９依存性阻害に反作用するのに有効である。繰り返すが、本明細書に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストにより、ＬＤＬ取込みに対するＰＣＳＫ９の効果の用量依存性阻害が示された。したがって、開示したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、血漿ＬＤＬコレステロールレベルを低下させるのに重要である。また、開示したアンタゴニストは、種々の診断目的（例えば、ＰＣＳＫ９の検出および定量）にも有用性を有する。
具体的な実施形態において、本発明は、開示した重鎖および／または軽鎖の可変領域、実質的に機能に影響を及ぼさない１つ以上のアミノ酸置換を有する前記領域の等価体を含む抗体分子、ならびにそのホモログを包含する。選択された実施形態は、開示したＣＤＲドメインあるいは重鎖および／または軽鎖のＣＤＲドメインの組、ならびに１つ以上のアミノ酸置換を有することが特徴であるかかるドメインの等価体を含む、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを含むものである。当業者には認識されるように、ＰＣＳＫ９をアンタゴナイズ（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）する能力を保持しているＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの断片が、種々のフレームワーク内に挿入され得る。例えば、米国特許第６，８１８，４１８号明細書およびそれに記載された参考文献（その全体の開示は引用により本明細書に組み込まれ、これらには、抗原結合に基づいて事前に選択した抗体ループをディスプレイするために使用され得る種々の骨格が論考されている）を参照のこと。択一例において、ＶＬとＶＨをコードする遺伝子は、組換え法を用いて、例えば、ＶＬ領域とＶＨ領域のペアが一価の分子（あるいは、単鎖Ｆｖ（「ＳｃＦＶ」）として知られている）を形成している単一のタンパク質鎖として生成させることが可能な合成リンカーを用いて接合され得る。例えば、Ｂｉｒｄら，１９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６、およびＨｕｓｔｏｎら，１９８８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３（これらの開示は引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。別の択一例では、ＶＨとＶＬを２つの相互作用性ドメインと融合させ、Ｆａｂ様分子（例えば、ｃｃＦｖ、Ｗａｎｇら，米国特許第６，８３３，４４１号明細書および同第７，４２９，６５２号明細書参照）が形成され得る。
ＰＣＳＫ−９特異的アンタゴニストおよび断片は、種々の非抗体系骨格の形態、例えば限定されないが、アビマー（Ａｖｉｄｉａ）、ＤＡＲＰｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ）、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（Ａｄｎｅｘｕｓ）、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（Ｐｉｅｒｉｓ）およびＡｆｆｉｂｏｄｙ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）であり得る。タンパク質結合のための択一的な骨格の使用は、科学文献において充分に認識されよう。例えば、Ｂｉｎｚ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２００５ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１−１１を参照のこと。その開示は引用により本明細書に組み込まれる。
したがって、任意のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、例えば、（ｉ）開示した重鎖および／または軽鎖の可変領域のＣＤＲ３配列（配列番号：１〜５、７、９、１１、１３〜６３、および１５アミノ酸長である前述の配列の残基４〜１２から選択される重鎖可変領域のＣＤＲ３配列；配列番号：２９５〜３０１、３０３、３０５〜３３４、および１６アミノ酸長である前述の配列の残基４〜１３から選択される軽鎖可変領域のＣＤＲ３配列）、（ｉｉ）開示した重鎖および／または軽鎖の可変領域のＣＤＲ２配列（配列番号：６４〜６８、７０，７２、７４、７６〜１８２、および２３アミノ酸長である前述の配列の残基４〜２０から選択される重鎖可変領域のＣＤＲ２配列；配列番号：３３５〜３３９、３４１、３４３〜３４６および１３アミノ酸長である前述の配列の残基４〜１０から選択される軽鎖可変領域のＣＤＲ２配列）、（ｉｉｉ）開示した重鎖および／または軽鎖の可変領域のＣＤＲ１配列（配列番号：１８３〜１８９、１９１、１９３、１９５、１９７〜２９４、および１６アミノ酸長である前述の配列の残基４〜１３から選択される重鎖可変領域のＣＤＲ１配列；配列番号：３４７〜３４９、３５１、３５３〜３５９および１７アミノ酸長である前述の配列の残基４〜１４から選択される軽鎖可変領域のＣＤＲ１配列）、（ｉｖ）開示した重鎖の可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列または開示した軽鎖の可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、（ｖ）それぞれ、ヒト重鎖および／または軽鎖の配列の可変領域フレームワーク内の開示した重鎖および軽鎖ＣＤＲの完全相補鎖（ＣＤＲ１、２および３）、あるいは（ｖｉ）開示した重鎖および／または軽鎖の可変領域（配列番号：３６０〜５１０から選択される重鎖可変配列；配列番号：５１１〜５４９から選択される軽鎖可変配列）を含む抗体分子および非抗体系骨格は、本発明の重要な実施形態を構成し、該アンタゴニスト、抗体分子または骨格は、ＰＣＳＫ９に対する選択性を示し、細胞内ＬＤＬ取込みのＰＣＳＫ９依存性阻害に反作用する。
別の態様において、本発明は、開示したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸、具体的な実施形態では、開示した重鎖および軽鎖、開示した可変重鎖および軽鎖領域ならびにその選択された成分（例えば、ＣＤＲ１、２および／または３）、特に、開示したそれぞれのＣＤＲ３またはＣＤＲ２領域を含むＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸を提供する。別の態様において、本発明は、前記核酸を含むベクターを提供する。本発明は、さらに、開示したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸を含む単離された細胞（１つまたは複数）を提供する。別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはベクターを含む単離された細胞（１つまたは複数）を提供する。
本発明は、本明細書に開示したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト（例えば限定されないが、抗体、抗原結合断片、誘導体、前述の任意のものと別のポリペプチドとのキメラ分子、融合体、またはＰＣＳＫ９に特異的に結合することができ、開示した配列を含む択一的な構造体／組成物）の作製方法を提供する。該方法は、（ｉ）ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト（１種類または複数種）をコードする核酸を含む、あるいはその１種類以上の成分をコードする個々の核酸（前記核酸は、発現されると、集合的に該アンタゴニスト（１種類または複数種）を生成させる）を含む細胞を、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト（１種類または複数種）の発現および／またはアセンブリが可能な条件下でインキュベートすること、ならびに（ｉｉ）前記アンタゴニスト（１種類または複数種）を該細胞から単離することを含む。また、当業者は、標準的な組換えＤＮＡ手法の使用によっても同様に、本明細書に開示したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを取得することができよう。
本発明は、ＰＣＳＫ９を発現する（またはヒトＰＣＳＫ９で処理した、もしくはヒトＰＣＳＫ９を内包している）対象の細胞、細胞集団または組織試料を本明細書に開示したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストと、前記アンタゴニストがＰＣＳＫ９に結合することが可能な条件下で接触させることを含む、ＰＣＳＫ９の活性もしくは機能またはＰＣＳＫ９の顕明な効果をアンタゴナイズする方法を提供する。本発明の特定の実施形態は、細胞がヒト細胞である、かかる方法を含む。さらなる実施形態は、細胞がヒト由来ＰＣＳＫ９を発現するものである。
別の態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９活性と関連している病状、またはＰＣＳＫ９の機能発揮が特定の被検体に対して禁忌である病状を示す被検体において、ＰＣＳＫ９の活性もしくは機能またはＰＣＳＫ９の顕明な効果をアンタゴナイズする方法であって、該被検体に、医薬組成物または他の組成物にて治療有効量の本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを投与することを含む方法を提供する。
したがって、本発明は、ＰＣＳＫ９活性と関連している病状、またはＰＣＳＫ９の機能発揮が特定の被検体に対して禁忌である病状の処置方法であって、該被検体に、医薬組成物または他の組成物にて治療有効量の本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを投与することを含む方法を包含する。選択された実施形態では、該病状は、高コレステロール血症、冠動脈性心疾患、メタボリックシンドローム、急性冠症候群または関連病状である。
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に開示したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを含む治療有効量の医薬組成物または他の組成物を送達することを含む、開示したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを被検体に投与する方法を包含する。
別の態様において、本発明は、薬学的に許容され得る担体（例えば、限定されないが、賦形剤、希釈剤、安定剤、緩衝剤、または処置対象の個体に所望される量の該アンタゴニストの投与が助長されるように設計された択一的物質）を含むことが特徴である、本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを含む医薬組成物または他の組成物を提供する。
以下の表に、本出願書類において論考する配列の一般的概要を示す。配列表（注釈、配列および特徴すべて含む）は、本出願書類の開示の明白な一部分を構成する。
Figure 2013509194
図１は、ＰＣＳＫ９−ＬＤＬ受容体相互作用に対するＰＤＬ１ Ｆａｂの影響を示す。このＢｉａｃｏｒｅ系アッセイは、ＡＸ１、ＡＸ９、およびＡＸ１１４がＰＣＳＫ９に結合すると、ＰＣＳＫ９−ＬＤＬＲおよびＰＣＳＫ９−ＥＧＦ＿ＡＢドメインの相互作用が阻害されることを示す。ＬＤＬＲ内のＥＧＦ＿ＡＢドメインは、ＰＣＳＫ９との相互作用に関与している。 図２は、１０個の最適化ライブラリーから単離した１３４ ＡＸ１１４バリアント由来のＶＨ−ＣＤＲ１、２、３領域内のアミノ酸置換を示す。 図３は、１０個の最適化ライブラリーから単離した１３４ ＡＸ１１４バリアント由来のＶＫ−ＣＤＲ１、２、３領域内のアミノ酸置換を示す。 図４Ａ〜Ｂは、ＰＤＬ１ライブラリーから単離したＰＣＳＫ９アンタゴニスト抗体の、コンピュータドッキングプログラムによって提案された考えられ得る３つの結合ビン（ｂｉｎ）を示す（Ａ）。ビン＃１は、ＬＤＬ受容体のＥＧＦ＿ＡＢドメインに対する結合に関与しており、ＡＸ１３２抗体に対する結合領域であると予測される。表面アミノ酸残基を示す（Ｂ）。 図５Ａ〜Ｂは、ビン＃１においてラットＰＣＳＫ９由来のＤ１９２ＧおよびＦ３７９Ｙ置換を有するヒトＰＣＳＫ９キメラ変異型＃１の構造を示す（Ｂ）。ＥＬＩＳＡの結果は、ＰＣＳＫ９におけるこれらの置換により、ＡＸ１３２抗体に対する結合活性の有意な減損が引き起こされることを示す（Ａ）。このデータにより、予測どおり、ビン＃１に対するＡＸ１３２の結合が確認される。 図６は、ＡＸ１３２およびＡＸ２１３抗体のＨＤ交換プロフィールを示す。ＡＸ２１３結合またはＡＸ１３２結合に対して最も大きなジュウテリウム化の差を示すＰＣＳＫ９消化断片は、１５５−ＰＷＮＬ−１５８（配列番号：５７６）と３６４−ＰＧＥＤＩＩＧＡＳＳＤＣＳＴＣ−３７８（配列番号：５７７）である。 図７は、ＡＸ１３２およびＡＸ２１３エピトープ（ハイライトしている）を含む２つの消化断片を有するＰＣＳＫ９を示す。これらの消化断片は、１５５−ＰＷＮＬ−１５８（配列番号：５７６）と３６４−ＰＧＥＤＩＩＧＡＳＳＤＣＳＴＣ−３７８（配列番号：５７７）である。ＨＤ交換データは、実施例７のＰＣＳＫ９変異誘発データと整合している。１５５−ペプチドおよび３６４−ペプチドはともに、図４に示すエピトープビン＃１に存在している。 図８は、ＡＸ１３２抗体に結合されたＰＣＳＫ９の結晶構造を示す。 図９は、ＡＸ１３２エピトープを有するＰＣＳＫ９の表面領域の図を示す。図９は、ＡＸ１３２結合におけるＰＣＳＫ９上のＦ３７９残基の関与を示す。 図１０Ａ〜Ｆは、それぞれ、ＰＣＳＫ９−ＬＤＬＲ相互作用のＴＲ−ＦＲＥＴ形式アッセイにおけるＡＸ１１４、ＡＸ１３２、ＡＸ２１０、ＡＸ２１１、ＡＸ２１２およびＡＸ２１３抗体の活性を示す。試験したＩｇＧ２抗体はすべて、効力があり、ＡＦ６４７標識野生型ヒトＰＣＳＫ９とＥｕ８０４４標識ＬＤＬ受容体の相互作用を阻害する［ＡＦ６４７ ＰＣＳＫ９＝１０ｎＭ；［Ｅｕ ８０４４ ｓＬＤＬＲ］約５ｎＭ（Ｆ１６２０ｎＭで計数２０，０００）。 図１１Ａ〜Ｆは、細胞内ＬＤＬ取込みのヒト、マウスおよびアカゲザルＰＣＳＫ９依存性減損のＡＸ１１４およびＡＸ１３２ ＩｇＧの用量依存性阻害を示す（図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃはそれぞれ、ＡＸ１１４のもの、ならびに図１１Ｄ、１１Ｅおよび１１Ｆはそれぞれ、ＡＸ１３２のもの）。ＡＸ１１４およびＡＸ１３２ ＩｇＧは、ヒト、マウスおよびアカゲザルのＰＣＳＫ９と交差反応する。 図１２Ａ〜Ｆは、細胞内ＬＤＬ取込みのヒト、マウスおよびアカゲザルＰＣＳＫ９依存性減損のＡＸ２１０およびＡＸ２１１ ＩｇＧの用量依存性阻害を示す（図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃはそれぞれ、ＡＸ２１０のもの、ならびに図１２Ｄ、１２Ｅおよび１２Ｆはそれぞれ、ＡＸ２１１のもの）。ＡＸ２１０およびＡＸ２１１ ＩｇＧは、ヒト、マウスおよびアカゲザルのＰＣＳＫ９と交差反応する。 図１３Ａ〜Ｆは、細胞内ＬＤＬ取込みのヒト、マウスおよびアカゲザルＰＣＳＫ９依存性減損のＡＸ２１２およびＡＸ２１３ ＩｇＧの用量依存性阻害を示す（図１３Ａ、１３Ｂおよび１３Ｃはそれぞれ、ＡＸ２１２のもの、ならびに図１３Ｄ、１３Ｅおよび１３Ｆはそれぞれ、ＡＸ２１３ものもの）。ＡＸ２１２およびＡＸ２１３ ＩｇＧは、ヒト、マウスおよびアカゲザルのＰＣＳＫ９と交差反応する。 図１４Ａ〜Ｄは、Ｂｉａｃｏｒｅでの、ＡＸ１１４、ＡＸ１３２、ＡＸ２１０およびＡＸ２１１のそれぞれの固定化ヒトＦｃＲｎに対する結合を示す。 図１５Ａ〜Ｂは、Ｂｉａｃｏｒｅでの、ＡＸ２１２およびＡＸ２１３のそれぞれの固定化ヒトＦｃＲｎに対する結合を示す。 図１６Ａ〜Ｂは、それぞれ、単回１０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ投与後のヒトＦｃＲｎマウスにおけるＡＸ１３２およびＡＸ１１４の薬物動態プロフィールを示す。 図１７は、アカゲザルにおける薬力学試験の結果を示す。単回用量後、ＡＸ１３２によりＬＤＬコレステロールは有意に低下し、最大平均減少率は６０％であり、４２日間でＬＤＬ−Ｃは＞２５％低下した。 図１８は、ＡＸ１１４エピトープビンにおけるモノクローナル抗体の時間点ゼロ生成物のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。 図１９は、ＡＸ１３２抗体の発現のためのベクターマップを示す。 図２０Ａ〜Ｆは、ＡＸ１３２抗体用の発現プラスミドの配列を示す。 図２０Ａ〜Ｆは、ＡＸ１３２抗体用の発現プラスミドの配列を示す。 図２０Ａ〜Ｆは、ＡＸ１３２抗体用の発現プラスミドの配列を示す。 図２０Ａ〜Ｆは、ＡＸ１３２抗体用の発現プラスミドの配列を示す。 図２０Ａ〜Ｆは、ＡＸ１３２抗体用の発現プラスミドの配列を示す。 図２０Ａ〜Ｆは、ＡＸ１３２抗体用の発現プラスミドの配列を示す。
本発明は、ＰＣＳＫ９タンパク質特異的アンタゴニスト、具体的な実施形態では、ヒトＰＣＳＫ９を阻害するアンタゴニストに関する。本発明によるＰＣＳＫ９タンパク質特異的アンタゴニスト（または「ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト」）は、ＰＣＳＫ９機能に対する選択的な結合および阻害に有効であり、したがって、ＰＣＳＫ９機能と関連しているか、または該機能に影響される病状、例えば限定されないが、高コレステロール血症、冠動脈性心疾患、メタボリックシンドローム、急性冠症候群および関連病状の処置に重要である。用語「アンタゴニスト」の使用は、主題の分子がＰＣＳＫ９の機能発揮をアンタゴナイズすることができることをいう。用語「アンタゴナイズすること」またはその派生語の使用は、ＰＣＳＫ９の１つ以上の機能に対抗する、反作用する、阻害する、中和する、または縮小する作用をいう。本明細書におけるＰＣＳＫ９機能またはＰＣＳＫ９活性に対する言及は、ＰＣＳＫ９によって駆動される、必要とされる、または増悪する、もしくは向上する任意の機能または活性をいう。本明細書に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、細胞内ＬＤＬ取込みのヒトＰＣＳＫ９依存性阻害に反作用するのに有効であることが証明された。
本発明の重要な一実施形態は、ＡＸ１３２抗体分子およびそのバリアントに関する。本発明の特定の実施形態は、（ｉ）配列番号：３６０または配列番号：３６１を含む、または該配列番号からなる重鎖可変領域（「ＶＨ」）、および（ｉｉ）配列番号：５１１を含む軽鎖可変領域（「ＶＬ」）を含むことが特徴であるＡＸ１３２抗体分子を含む。前記ＶＨおよびＶＬ領域は、それぞれ、ＶＨの開示したＣＤＲ１、２および３の完全相補鎖［配列番号：１８９（または配列番号：１９１）をＣＤＲ１として、配列番号：６８（または配列番号：７０）をＣＤＲ２として、および配列番号：５（または配列番号：７）をＣＤＲ３として］、ならびにＶＬ領域の開示したＣＤＲ１、２および３の完全相補鎖［配列番号：３４９（または配列番号：３５１）をＣＤＲ１として、配列番号：３３９（または配列番号：３４１）をＣＤＲ２として、および配列番号：３０１（または配列番号：３０３）をＣＤＲ３として］を含むものである。ＡＸ１３２抗体分子の例としては、限定されないが：（ｉ）配列番号：５５４を含む軽鎖と、配列番号：５５２のアミノ酸１〜２２１（または配列番号：５５２）を含むアミノ酸を含むＦｄ鎖を含むＦａｂ、（ｉｉ）配列番号：５５８を含む軽鎖と配列番号：５５６を含む重鎖を含む完全長抗体分子、および（ｉｉｉ）配列番号：５６０の発現によって生成される抗体が挙げられる。
特定の実施形態において、ＡＸ１３２バリアントは、連続的に順に、重鎖または軽鎖の一方または両方の：（ａ）フレームワーク１（ＦＲ１）配列、（ｂ）ＣＤＲ１配列、（ｃ）フレームワーク２（ＦＲ２）配列、（ｄ）ＣＤＲ２配列、（ｅ）フレームワーク３（ＦＲ３）配列、（ｆ）ＣＤＲ３配列、および（ｇ）フレームワーク４（ＦＲ４）配列を含むものである。特定の実施形態において、重鎖は、連続的に順に：（ａ）配列番号：５８３のＦＲ１配列、（ｂ）配列番号：１８３、１８５、１８７、１８９、１９３、および１９７〜２９４からなる群より選択されるＣＤＲ１配列、（ｃ）配列番号：５８４のＦＲ２配列、（ｄ）配列番号：６４、６６、６８、７２、および７６〜１８２からなる群より選択されるＣＤＲ２配列、（ｅ）配列番号：５８５のＦＲ３配列、（ｆ）配列番号：１、３、５、９、および１３〜６３からなる群より選択されるＣＤＲ３配列、ならびに（ｇ）ＦＲ４配列 配列番号：５８６を含むものである。特定の実施形態において、軽鎖は、連続的に順に：（ａ）配列番号：５８７のＦＲ１配列、（ｂ）配列番号：３４７、３４９および３５３〜３５９からなる群より選択されるＣＤＲ１配列、（ｃ）配列番号：５８８のＦＲ２配列、（ｄ）配列番号：３３５、３３７、３３９、および３４３０〜３４６からなる群より選択されるＣＤＲ２配列、（ｅ）配列番号：５８９のＦＲ３配列、（ｆ）配列番号：２９５、２９７、２９９、３０１、および３０５〜３３４からなる群より選択されるＣＤＲ３配列、ならびに（ｇ）配列番号：５９０のＦＲ４配列を含むものである。本発明は、上記の重鎖と軽鎖の両方並びに、ＰＣＳＫ９に対する特異性を５０％より大きく（特定の実施形態では、６０％、７０％、８０％および９０％より大きく）低減させない１つ以上（特定の実施形態では、１〜５つまたは１〜３つ）のアミノ酸置換を有することが特徴であるその等価体を有する（ｈａｖｅ）抗体分子を含む。選択される例示的なＡＸ１３２抗体の群は、限定されないが、本明細書において開示するＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストがヒトＰＣＳＫ９を有効に阻害することを実証するものである。
具体的なＡＸ１３２バリアントの一例はＡＸ２１３である。ＡＸ２１３抗体分子は、（ｉ）配列番号：３６２または配列番号：３６３を含む重鎖可変領域（「ＶＨ」）、および（ｉｉ）配列番号：５１１を含む軽鎖可変領域（「ＶＬ」）を含むことが特徴である。前記ＶＨおよびＶＬ領域は、それぞれ、ＶＨの開示したＣＤＲ１、２および３の完全相補鎖［配列番号：１９３（または配列番号：１９５）をＣＤＲ１として、配列番号：７２（または配列番号：７４）をＣＤＲ２として、および配列番号：９（または配列番号：１１）をＣＤＲ３として）］、ならびにＶＬ領域の開示したＣＤＲ１、２および３の完全相補鎖［配列番号：３４９（または配列番号：３５１）をＣＤＲ１として、配列番号：３３９（または配列番号：３４１）をＣＤＲ２として、および配列番号：３０１（または配列番号：３０３）をＣＤＲ３として］を含むものである。ＡＸ２１３抗体分子の例としては、限定されないが：（ｉ）配列番号：５５４を含む軽鎖と、配列番号：５６２のアミノ酸１〜２２１（または配列番号：５６２）を含むアミノ酸を含むＦｄ鎖を含むＦａｂ、（ｉｉ）配列番号：５６６を含む軽鎖と配列番号：５６４を含む重鎖を含む完全長抗体分子、および（ｉｉｉ）配列番号：５６９の発現によって生成される抗体が挙げられる。
本明細書において想到および開示されるＣＤＲの規定は、Ａｂｍａｘｉｓのインシリコプログラム（Ｌｕｏら，米国特許第７，１１７，０９６号明細書および米国特許出願公開第２００４／００１０３７６号または国際公開第０３／０９９９９９号）を用いて規定した。しかしながら、ＣＤＲ配列の始点および終点を表記および規定するのに種々の他の方法も利用可能であることに注意されたい（限定されないが、Ｋａｂａｔ，１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１−３２４２ Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｃｌｏｔｈｉａら，１９８７ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｌｏｔｈｉａら，１９８９ Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８８３；Ｌｅｆｒａｎｃ，１９９７ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１８：５０９；およびＣｈｅｎら，１９９９ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１が挙げられる）。これらおよび他の方法は検証されており、充分に当業者が有する技能の範囲内のものである。例えば、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２００１ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０を参照のこと。本発明者は、ＣＤＲを規定するのにＡｂｍａｘｉｓプログラムを使用したが、本発明は、任意の異なる解析ソフトウェアまたは方法の使用によって想到される配列上の異なる規定および種々のＣＤＲ表示法も充分に包含する。例えば、ＣＤＲを、エピトープに結合する抗体分子の成分または抗原結合に関与する抗体分子の成分として規定してもよい。ＣＤＲは、５〜２０個のアミノ酸を含むものであり得る。具体的な実施形態において、ＣＤＲは、さらに、ＣＤＲの各辺のフレームワーク領域内に２〜６個のフランキングアミノ酸を含むものであり得る。上記の方法およびそれによる本開示の配列に基づくＣＤＲ規定は、充分に本開示の範囲内であり、本明細書において予測される。
また、ＰＣＳＫ９特異的分子は、ＰＣＳＫ９の検出および定量において種々の診断目的の有用性を有するものである。
開示したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、さらに、選択された実施形態で、プロセッシングされたＰＣＳＫ９（ＰＣＳＫ９の活性形態）の優先的認識が明示された点において特殊である。
本明細書において開示するＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、血漿ＬＤＬコレステロールレベルを低下させるための望ましい分子であり、商業上または飼育上、獣医学的に重要な任意の霊長類、哺乳動物または脊椎動物に有用である。また、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、ＬＤＬ受容体を有する任意の細胞集団または組織集団において、ＰＣＳＫ９の活性を阻害するためにも同様に有用である。開示したアンタゴニストの有用性は、当業者に容易に利用可能なアッセイによって直接測定可能である。ＬＤＬ取込みを測定するための手段は文献に記載されている。例えば、Ｂａｒａｋ ＆ Ｗｅｂｂ、１９８１ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９０：５９５−６０４、およびＳｔｅｐｈａｎ ＆ Ｙｕｒａｃｈｅｋ，１９９３ Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３４：３２５３３０を参照のこと。また、血漿中のＬＤＬコレステロールを測定するための手段は文献に充分に記載されている。例えば、ＭｃＮａｍａｒａら，２００６ Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３６９：１５８−１６７を参照のこと。また、細胞内ＬＤＬ取込みに対する開示したアンタゴニストの具体的な影響は、精製ＰＣＳＫ９および標識ＬＤＬ粒子を細胞試料に供給すること、ＰＣＳＫ９アンタゴニストを該細胞試料に供給すること、前記細胞試料を、該細胞によるＬＤＬ粒子取込みが可能であることが充分な期間、インキュベートすること、該細胞内に組み込まれた標識の量を定量すること、ならびにＰＣＳＫ９を単独で投与した場合に観察される量と比べて、該細胞によって取り込まれる定量対象の標識の量の増大をもたらすアンタゴニストを同定することを含む方法によって測定され得る。開示したアンタゴニストの影響を測定するためのさらなる方法は、精製ＰＣＳＫ９および標識ＬＤＬ粒子を細胞試料に供給すること、ＰＣＳＫ９アンタゴニストを該細胞試料に供給すること、前記細胞試料を、該細胞によるＬＤＬ粒子取込みが可能であることが充分な期間、インキュベートすること、該細胞試料の細胞を、上清み（ｓｕｐｅｒｎａｔｅ）を除去することにより単離すること、標識ＬＤＬ粒子の非特異的会合を低減させること（プレート、細胞またはＬＤＬ受容体以外の任意のもののいずれに対するものであれ）、該細胞を溶解させること、細胞ライセート中に保持され標識の量を定量すること、ならびにＰＣＳＫ９を単独で投与した場合に観察される量と比べて、該細胞によって取り込まれた定量対象の標識の量の増大をもたらすアンタゴニストを同定することを含むものである。定量される標識量の増大をもたらすアンタゴニストはＰＣＳＫ９アンタゴニストである。
ＬＤＬ受容体を有する任意の型の細胞が上記の方法において使用され得、限定されないが、ＨＥＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、およびＣＨＯ細胞が挙げられる。任意の供給源に由来するＬＤＬ粒子が、上記のアッセイにおいて有用である。具体的なアッセイにおいて、ＬＤＬ粒子は血液由来の新鮮粒子である。これは、当業者に利用可能な任意の方法、例えば限定されないが、Ｈａｖｅｌら，１９５５ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３４：１３４５−１３５３の方法によって行われ得る。ＬＤＬ粒子は蛍光で標識され得る。標識ＬＤＬ粒子には、その内部に、可視光波長励起フルオロフォア３，３’−ジオクタデシルインドカルボシアニンアイオダイド（ｄｉｌ（３））が組み込まれ、高度に蛍光性のＬＤＬ誘導体ｄｉｌ（３）−ＬＤＬが形成され得る。当業者が細胞ライセート中のＬＤＬを検出することが可能な任意の標識が使用され得る。細胞内で代謝された場合、または例えば、インターナリゼーション状態になる過程で他の分子と会合（または他の分子から解離）状態になった場合（例えば、ＬＤＬアナログが二次フルオロ体（ｆｌｕｏｒ）と会合状態あるいはクエンチャーから解離状態になり得るＦＲＥＴアッセイ）にのみ検出可能となる（例えば、異なる波長で蛍光性となるまたは蛍光を発するなど）ＬＤＬアナログを使用してもよい。標識ＬＤＬ粒子のインターナリゼーションを検出するための当該技術分野で利用可能な任意の手段が使用され得る。ＬＤＬ粒子およびＰＣＳＫ９と細胞とのインキュベーション時間は、細胞によるＬＤＬ粒子取込みが可能な充分な時間量である。この時間は、５分間〜３６０分間の範囲内であり得る。細胞に添加されるＰＣＳＫ９の濃度は１ｎＭ〜５μΜの範囲、特定の方法では０．１ｎＭ〜３μΜの範囲であり得る。当業者が具体的なＰＣＳＫ９タンパク質の様々な濃度を測定することができる特定の手段の一例は、ＬＤＬ取込みアッセイにおいて用量応答曲線を作成することである。ＬＤＬ取込みの最大減損近くまで進むが、なお用量応答曲線の線形範囲内であるＰＣＳＫ９濃度が選択され得る。典型的には、この濃度は用量応答曲線から抽出したタンパク質のＥＣ−５０の約５倍である。この濃度はタンパク質により異なり得る。
広義には、本明細書において規定するＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、ＰＣＳＫ９を選択的に認識して特異的に結合するものである。抗体は、典型的には、解離定数が≦１μΜ、好ましくは≦１００ｎＭ、最も好ましくは、≦１０ｎＭである場合、抗原に特異的に結合するといわれる。本明細書における用語「選択的」または「特異的」の使用は、さらに、開示したアンタゴニストがＰＳＣＫ９以外のタンパク質に対して有意な結合を示さないことをいうが、該アンタゴニストが、ＰＣＳＫ９特異的結合部分にさらなる明確な特異性を付与する（例えば、分子が２種類の分子に結合するように、または２つの機能を奏功する（そのうち少なくとも１つはＰＣＳＫ９に特異的に結合する）ように設計された二重特異性または二官能性分子の場合）ために補給または設計される特定の場合は除く。特定の実施形態において、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストはヒトＰＣＳＫ９に、１．２×１０−６Ｍ以下のＫＤで結合するものである。より特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストはヒトＰＣＳＫ９に、５×１０−７Ｍ以下、２×１０−７Ｍ以下または１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合するものである。さらなる実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストはヒトＰＣＳＫ９に、１×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合するものである。さらなる実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストはヒトＰＣＳＫ９に、５×１０−９Ｍ以下または１×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するものである。選択された実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストはヒトＰＣＳＫ９に、１×１０−１０Ｍ以下のＫＤ、１×１０−１１Ｍ以下のＫＤ、または１×１０−１２Ｍ以下のＫＤで結合するものである。特定の実施形態において、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、ＰＣＳＫ９以外のタンパク質に上記のＫＤで結合しないものである。ＫＤは、Ｋａ（具体的な結合分子−標的タンパク質相互作用の会合速度）に対するＫｄ（具体的な結合分子−標的タンパク質相互作用の解離速度）の比率から得られる解離定数、またはモル濃度（Ｍ）で示されるＫｄ／Ｋａをいう。ＫＤ値は、当該技術分野で充分確立された方法を用いて求めることができる。結合分子のＫＤを求めるための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴の使用、例えば、バイオセンサーシステムＢｉａｃｏｒｅＴＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）システムなど）を使用することである。
本明細書に開示したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、ＬＤＬ取込みに対するヒトＰＣＳＫ９依存性効果を用量依存的に阻害することが示された。したがって、本明細書において開示するＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、細胞内へのＬＤＬ取込みのＰＣＳＫ９依存性阻害に反作用する能力を特徴とする。このＬＤＬ受容体による細胞内へのＬＤＬの取込みを、本明細書では「細胞内ＬＤＬ取込み」と称する。特定の実施形態において、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは細胞内へのＬＤＬ取込みのヒトＰＣＳＫ９依存性阻害に反作用する、または該阻害をアンタゴナイズし、１．０×１０−６Ｍ未満、または（好ましい順に）１×１０−７Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満、１×１０−９Ｍ未満、１×１０−１０Ｍ未満、１×１０−１１Ｍ未満および１×１０−１２Ｍ未満のＩＣ５０を示す。任意のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストによる阻害の程度は、対照との統計学的比較にて、またはＰＣＳＫ９機能に対する負の効果もしくは阻害を評価するための当該技術分野で利用可能な任意の択一的な方法（すなわち、ＰＣＳＫ９機能の拮抗作用を評価することができる任意の方法）によって定量的に測定され得る。特定の実施形態において、阻害は少なくとも約１０％の阻害である。他の実施形態では、阻害は少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０，％、８０％、９０％、または９５％である。したがって、このようなレベルのＰＣＳＫ９機能阻害をもたらすことができるＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、本明細書における具体的な実施形態を構成する。特定の実施形態では、被検体に投与されると、ＬＤＬを少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％およびそれより大きく低下させる記載のＰＣＳＫ９アンタゴニストを提供する。特定の実施形態において、ＰＣＳＫ９アンタゴニストは、ＬＤＬを該レベルで、少なくとも７日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、３０日間、３５日間、４０日間およびそれより長期間低下させるものである。具体的な実施形態において、低下される割合は１０、１５、２０および２５％で２０、３０または４０日間以上にわたる。具体的な実施形態は、２５％以上の低下を４０日間以上にわたってもたらすものである（例えば、実施例１９および図１７参照）。また、特定の実施形態では、ヒトＦｃＲｎに、およそｐＨ６．０で結合し、およそｐＨ７．３で解離するＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを提供する（例えば、実施例１７および図１４〜１５参照）。具体的な実施形態は、開示したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストが中性ｐＨで＜５％（特定の実施形態では、３％未満または１％未満）の解離を示すものである。解離（または結合分の％）は、実施例１７に記載のようにして計算され得る。また、特定の実施形態では、マウスにおいて５０、６０、７０、８０、９０または９５時間より長い半減期を有する本明細書に記載のＰＣＳＫ−９特異的アンタゴニストを提供する（例えば、実施例１８および図１６参照）。具体的な実施形態では、霊長類において５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０および１４５時間より長い半減期を有するＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを提供する（例えば、実施例１８参照）。また、本発明は、特定の実施形態において、４５℃での１週間のストレス後（実施例２０に記載のものと同様の条件下）、ｐＨ５、６、７または８のバッファー中で、本質的にオリゴマー、高次凝集塊の増大がなく、クリッピングを示さないＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを提供する（例えば、実施例２０および表１３参照）。特定の実施形態において、上記の効果は、ヒトおよび非ヒト霊長類（または特別な指定されたマウス）において見られるものである。特定の実施形態において、上記の効果は静脈内または皮下投与後に見られる。
本明細書によるＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、ヒトＰＣＳＫ９タンパク質に特異的に結合する任意の結合分子であり得、限定されないが、以下のものが挙げられる。以下に定義する抗体分子、任意のＰＣＳＫ９特異的結合構造、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する任意のポリペプチドまたは核酸構造、および
種々のタンパク質骨格内に組み込まれる前述の任意のもの、例えば限定されないが、種々の非抗体系骨格、およびＰＣＳＫ９に対する選択的結合をもたらす、または該選択的結合を可能にすることができる種々の構造、例えば限定されないが、小モジュール免疫薬（または「ＳＭＩＰ」；Ｈａａｎ ＆ Ｍａｇｇｏｓ，２００４ Ｂｉｏｃｅｎｔｕｒｙ Ｊａｎ ２６参照）；免疫タンパク質（例えば、Ｃｈａｋら，１９９６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：６４３７−６４４２参照）；シトクロムｂ５６２（ＫｕおよびＳｃｈｕｌｔｚ，１９９５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６５５２−６５５６参照）；ペプチドα２ｐ８（Ｂａｒｔｈｅら，２０００ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．９：９４２−９５５参照）；アビマー（Ａｖｉｄｉａ；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら，２００５ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１５５６−１５６１参照）；ＤＡＲＰｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ；Ｂｉｎｚら，２００３ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２：４８９−５０３参照；ならびにＦｏｒｒｅｒら，２００３ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５３９：２−６）；テトラネクチン（Ｋａｓｔｒｕｐら，１９９８ Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５４：７５７−７６６参照）；アドネクチン（Ａｄｎｅｘｕｓ；Ｘｕら，２００２ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：９３３−９４２参照）、アンチカリン（Ｐｉｅｒｉｓ；Ｖｏｇｔ ＆ Ｓｋｅｒｒａ，２００４ Ｃｈｅｍｏｂｉｏｃｈｅｍ．５：１９１−１９９；Ｂｅｓｔｅら，１９９９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１８９８−１９０３；Ｌａｍｌａ ＆ Ｅｒｄｍａｎｎ，２００３ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２９：３８１−３８８；およびＬａｍｌａ ＆ Ｅｒｄｍａｎｎ，２００４ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．３３：３９−４７参照）；Ａ−ドメインタンパク質（Ｎｏｒｔｈ ＆ Ｂｌａｃｋｌｏｗ，１９９９ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：３９２６−３９３５参照）、リポカリン（Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒ ＆ Ｓｋｅｒｒａ，２００５ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ １０：２３−３３参照）；リピート−モチーフタンパク質、例えば、アンキリンリピートタンパク質（Ｓｅｄｇｗｉｃｋ ＆ Ｓｍｅｒｄｏｎ，１９９９ Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４：３１１−３１６；Ｍｏｓａｖｉら，２００２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１６０２９−１６０３４；およびＢｉｎｚら，２００４ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５７５−５８２参照）；昆虫ディフェンシンＡ（Ｚｈａｏら，２００４ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２５：６２９−６３５参照）；Ｋｕｎｉｔｚドメイン（Ｒｏｂｅｒｔｓら，１９９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２４２９−２４３３；Ｒｏｂｅｒｔｓら，１９９２ Ｇｅｎｅ １２１：９−１５；Ｄｅｎｎｉｓ ＆ Ｌａｚａｒｕｓ，１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２１２９−２２１３６；およびＤｅｎｎｉｓ ＆ Ｌａｚａｒｕｓ，１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２１３７−２２１４４参照）；ＰＤＺ−ドメイン（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，１９９９ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７０−１７５参照）；サソリ毒素、例えば、カリブドトキシン（Ｖｉｔａら，１９９８ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ４７：９３−１００参照）；第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（または１０Ｆｎ３；Ｋｏｉｄｅら，１９９８ Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２８４：１１４１−１１５１、およびＸｕら，２００２ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：９３３−９４２参照）；ＣＴＬＡ−４（細胞外ドメイン；Ｎｕｔｔａｌｌら，１９９９ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ３６：２１７−２２７；およびＩｒｖｉｎｇら，２００１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：３１−４５参照）；ノッティン（Ｋｎｏｔｔｉｎ）（Ｓｏｕｒｉａｕら，２００５ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４：７１４３−７１５５およびＬｅｈｔｉｏら，２０００ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ４１：３１６−３２２参照）；ネオカルジノスタチン（Ｈｅｙｄら，２００３ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：５６７４−５６８３参照）；糖質結合モジュール４−２（ＣＢＭ４−２；Ｃｉｃｏｒｔａｓら，２００４ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１７：２１３−２２１参照）；テンダミスタット（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ ＆ Ｈｏｅｓｓ，１９９５ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０：４６０−４７０、およびＬｉら，２００３ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１６：６５−７２参照）；Ｔ細胞受容体（Ｈｏｌｌｅｒら，２０００ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：５３８７−５３９２；Ｓｈｕｓｔａら，２０００ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：７５４−７５９；およびＬｉら，２００５ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３４９−３５４参照）；アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ；Ｎｏｒｄら，１９９５ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：６０１−６０８；Ｎｏｒｄら，１９９７ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：７７２−７７７；Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎら，１９９９ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２：８７３−８７８参照）；ならびに文献において認識される他の選択的結合タンパク質または骨格；例えば、Ｂｉｎｚ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２００５ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１−１１；Ｇｉｌｌ ＆ Ｄａｍｌｅ，２００６ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１−６；Ｈｏｓｓｅら，２００６ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５：１４−２７；Ｂｉｎｚら，２００５ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１２５７−１２６８；Ｈｅｙら，２００５ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：５１４−５２２；Ｂｉｎｚ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２００５ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：４５９−４６９；Ｎｙｇｒｅｎ ＆ Ｓｋｅｒｒａ，２００４ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９０：３−２８；Ｎｙｇｒｅｎ ＆ Ｕｈｌｅｎ，１９９７ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：４６３−４６９（これらの開示は引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。抗体および抗原結合断片の使用は、文献において充分に定義され、理解されている。タンパク質結合のための択一的な骨格の使用も同様に、科学文献において充分に認識されており、例えば、Ｂｉｎｚ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２００５ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１−１１；Ｇｉｌｌ ＆ Ｄａｍｌｅ，２００６ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１−６；Ｈｏｓｓｅら，２００６ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５：１４−２７；Ｂｉｎｚら，２００５ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１２５７−１２６８；Ｈｅｙら，２００５ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：５１４−５２２；Ｂｉｎｚ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２００５ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：４５９−４６９；Ｎｙｇｒｅｎ ＆ Ｓｋｅｒｒａ，２００４ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９０：３−２８；Ｎｙｇｒｅｎ ＆ Ｕｈｌｅｎ，１９９７ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：４６３−４６９（これらの開示は引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。したがって、ＰＣＳＫ９に対する選択性を示し、細胞内ＬＤＬ取込みのＰＣＳＫ９依存性阻害に反作用する本明細書による非抗体系骨格またはアンタゴニスト分子は、本発明の重要な実施形態を構成する。アプタマー（標的分子に選択的に結合することができる核酸またはペプチド分子）は、特定の例の１つである。これは、ランダム配列プールから選択され得るか、または天然の供給源から同定され得る（リボスイッチなど）。ペプチドアプタマー、核酸アプタマー（例えば、核酸構造、ＤＮＡ系およびＲＮＡ系のどちらの構造も含む）ならびにデコイ核酸は、目的タンパク質の選択的な結合および阻害に有効であり得る。例えば、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ＆ Ｂｕｔｚ，２０００ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７８：４２６−４３０；Ｂｏｃｋら，１９９２ Ｎａｔｕｒｅ ３５５：５６４−５６６；Ｂｕｎｋａ ＆ Ｓｔｏｃｋｌｅｙ，２００６ Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：５８８−５９６；Ｍａｒｔｅｌｌら，２００２ Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．６：３０−３４；Ｊａｙａｓｅｎａ，１９９９ Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：１６２８−１６５０（これらの開示は引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
ＡＸ１３２ ＦＡｂとの複合体の状態のＰＣＳＫ９の３次元構造（ｘ線結晶学を用いて測定）により、ＳＱＹＶＧＳＹＬＮ（配列番号：６４３）の配列を有する残基２６〜３４を含むこのＦＡｂの軽鎖の線形配列が、ＬＤＬＲのＥＧＦ−Ａドメインとの結合のために使用されるＰＣＳＫ９の表面との相互作用を特異的にしていることが明らかになった。この観察結果は、このアミノ酸配列を含むペプチド、非相同タンパク質、または他の存在体を設計し、使用すると、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲ間の相互作用を特異的に破壊され得ることを示唆する。また、この配列より小さいサブセットも有用であり得、構造試験により、残基２８〜３２（ＹＶＧＳＹ）（配列番号：６４４）が、ＰＣＳＫ９表面の特異的認識をもたらし得るかかる配列の最小部分のようであることが示唆されている。さらに、ＰＣＳＫ９：ＡＸ１３２ Ｆａｂ複合体の結晶構造を使用すると、該結晶構造で観察されるものと同様の相互作用が具現化される新たな化学的存在体が合理的に設計され得る。したがって、配列番号：６４３または配列番号：６４４を含む（または本質的に該配列番号からなる）ポリペプチドまたはペプチドが本明細書において想定される。
ＡＸ１３２の有意な中和活性およびそのバリアントの活性を考慮すると、ＡＸ１３２またはそのバリアントの１つと同じ様式でＰＣＳＫ９に結合する他のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストが同定されることが重要であるのは明白である。アンタゴニスト、具体的には、ＡＸ１３２もしくはそのバリアントと同じ領域もしくはエピトープまたはオーバーラップエピトープに結合する抗体を同定する手段の一例は、競合アッセイまたは同様のアッセイによるものであり、この場合、候補抗体または結合分子は、該エピトープについてＡＸ１３２（もしくはバリアント）と競合して勝る（ｏｕｔ−ｃｏｍｐｅｔｅ）ものでなければらない。本明細書に包含される競合アンタゴニストは、阻害（すなわち、対照と比較してＡＸ１３２（もしくはバリアント）への結合を抑制または干渉）する分子、あるいはＡＸ１３２（もしくはバリアント）への結合を、好ましい順に少なくとも５０％、６０％、７０％、および８０％（さらに、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％）、ＡＸ１３２（もしくはバリアント）に対して１μΜ以下またはそのＫＤ未満で低減させる分子、特に、（ｉ）ＬＤＬ受容体に対するＰＣＳＫ９結合、（ｉｉ）細胞内へのＰＣＳＫ９インターナリゼーション、または（ｉｉｉ）ＬＤＬ受容体に対するＰＣＳＫ９結合と細胞内へのＰＣＳＫ９インターナリゼーションの両方をアンタゴナイズする分子である。結合構成員間の競合はインビトロで、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて、および／または溶液中で該抗体とＰＣＳＫ９の相互作用をモニタリングすることにより容易にアッセイされ得る。解析を行うための厳密な手段は重要でない。ＰＣＳＫ９は、９６ウェルプレートに固定化してもよく、均一な溶液中に入れてもよい。特定の実施形態において、非標識候補抗体（１種類または複数種）が標識ＡＸ１３２（もしくはバリアント）の結合をブロックする能力は、放射性、酵素または他の標識を用いて測定され得る。リバースアッセイでは、非標識抗体が標識ＡＸ１３２（もしくはバリアント）とＰＣＳＫ９との相互作用（この場合、前記ＡＸ１３２（もしくはバリアント）とＰＣＳＫ９は既に結合されている）を妨げる能力が測定される。特定の実施形態において、（ｉ）ＰＣＳＫ９を標識ＡＸ１３２（もしくはバリアント）と接触させる、（ｉｉ）ＰＣＳＫ９を候補抗体または抗体プールと接触させる、および（ｉｉｉ）ＰＣＳＫ９とＡＸ１３２（もしくはバリアント）間の複合体形成を中断または抑制することができる抗体が同定される。かかる例における読み出し情報は、結合標識の測定によるものである。ＡＸ１３２（もしくはバリアント）および候補抗体（１種類または複数種）は任意の順に、または同時に添加され得る。
上記のアッセイまたは他の適当なアッセイでＡＸ１３２（もしくはバリアント）競合体と同定された抗体は、（ｉ）ＬＤＬ受容体に対するＰＣＳＫ９結合、および／または（ｉｉ）細胞内へのＰＣＳＫ９インターナリゼーションをアンタゴナイズまたは中和する能力について試験され得る。このようなパラメータは、本明細書において使用または記載しているものと同様のアッセイの使用によって測定され得る。特定の実施形態において、該競合抗体によって示される阻害は少なくとも約１０％の阻害である。他の実施形態では、該阻害は少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％である。
本発明は、特に、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、具体的には、ＡＸ１３２（もしくはバリアント）と同じエピトープまたはオーバーラップエピトープに選択的に結合して、ＰＣＳＫ９に対するＡＸ１３２（またはバリアント）の結合を干渉するモノクローナル抗体分子（ならびに対応するそのアミノ酸および核酸配列）を包含する。ＡＸ１３２（もしくはバリアント）のエピトープまたはオーバーラップエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体は、（ｉ）ＬＤＬ受容体に対するＰＣＳＫ９結合、（ｉｉ）細胞内へのＰＣＳＫ９インターナリゼーション、または（ｉｉｉ）両方をアンタゴナイズまたは中和するものである。本明細書によるモノクローナル抗体分子は、インタクトな（完全体もしくは完全長）抗体、実質的にインタクトな抗体、または抗原結合部分を含む抗体の一部分または断片、例えば、マウス抗体またはキメラ抗体またはヒト化抗体またはヒト抗体のＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片またはＦ（ａｂ’）２断片であり得る。モノクローナルは、本明細書で用いる場合、均一または実質的に均一（または純粋）な抗体集団をいう（すなわち、集団内の抗体の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、より好ましくは少なくとも約９７％もしくは９８％、または最も好ましくは少なくとも９９％が同一であり、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて同じ抗原またはエピトープについて競合し得る）。本発明の特定の実施形態において、本発明は、（ｉ）ＰＣＳＫ９に対する結合について、ＡＸ１３２（もしくはバリアント）抗体分子と競合し、ＡＸ１３２（もしくはバリアント）に対して１μΜ以下またはそのＫＤ未満でＡＸ１３２（もしくはバリアント）結合を少なくとも５０％低減させる、（ｉｉ）ＬＤＬ受容体に対するＰＣＳＫ９結合をブロックする、（ｉｉｉ）細胞内へのＰＣＳＫ９インターナリゼーションを阻害する、および（ｉｖ）特定の抗原結合領域、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲの組あるいは重鎖ＣＤＲ３、重鎖および／または軽鎖あるいは本明細書に記載のこれらの成分の任意のバリアントを含む、モノクローナル抗体を提供する。
ＡＸ１３２（もしくはバリアント）と同じまたはオーバーラップエピトープ領域に結合する抗体を同定するための上記の任意のアッセイにおいて、既知の結合剤（すなわち、ＡＸ１３２（もしくはバリアント）抗体分子）の結合は、候補結合剤の結合と比べて識別可能なでなければならない。これは（必要ではないが）、いずれかまたは両方の分子に対する標識の使用によって行われ得、当業者に容易に認識されよう。標識は、本明細書で用いる場合、抗体分子に組み込まれる／固定される別の分子または薬剤をいう。一実施形態において、標識は検出可能なマーカー、例えば、放射性標識アミノ酸、またはマーキングしたアビジン（例えば、蛍光マーカー含有ストレプトアビジン、あるいは光学的もしくは比色的方法によって検出され得る酵素活性）によって検出され得るポリペプチドへのビオチニル部分の結合である。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法が当該技術分野で知られており、使用され得る。ポリペプチド用の標識の例としては、限定されないが、以下のもの：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタノイド系リン光体）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、磁性薬剤（ガドリニウムキレートなど）、毒素（百日咳毒素など）、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトザントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシンならびにそのアナログまたはホモログが挙げられる。一部の実施形態では、標識は、立体障害の可能性の低減するため、種々の長さのスペーサーアームによって結合される。
具体的な実施形態において、本発明は、配列番号：５７６、５７７、５７９〜５８２および２３７〜ＲＤＡ、またはこれらの間の領域（１５７−ＮＬ−１５８または配列番号：５７８など）からなる群より選択される任意のエピトープ配列に特異的に結合することが特徴である本明細書に記載のアンタゴニストを包含する。具体的な実施形態において、エピトープ配列は、配列番号：５７６および／または５７７、あるいはこれらの間の下位領域（例えば、１５７−ＮＬ−１５８または配列番号：５７８）内に存在している。具体的な実施形態において、本明細書に記載のアンタゴニストは、配列番号：５７９、５８０、５８１および５８２、ならびに２３７−ＲＤＡに結合するものである。このようなエピトープを、実施例８および図４にさらに記載する。数値は、ヒトＰＣＳＫ９の開始および／または終了の位置を示す。
特定の実施形態において、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの結合は、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５つ、もしくはそれ以上）の変異を以下の残基位置：１９２および３７９に有する変異型ＰＣＳＫ９タンパク質に対して（ｏｒ）、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（配列番号：６４２）と比べて有意に低い。一部のある実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの結合は、以下の変異：Ｄ１９２ＧおよびＦ３７９Ｙの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５つ、もしくはそれ以上）を有する変異型ＰＣＳＫ９タンパク質に対して有意に低い。
競合アッセイの標準として使用されるＡＸ１３２（もしくはバリアント）抗体は、本明細書に記載の任意の抗体分子であり得る。試験対象の分子（ペプチド、アンタゴニスト、抗体分子など）は、任意の供給源またはライブラリーに由来するものであり得る。具体的な実施形態において、該分子は、ファージディスプレイライブラリーから選択される。特定の実施形態において、該分子は、ＡＸ１３２と実施例１１に記載のものと同様の様式で競合するＥＧＦ＿ＡＢペプチド（２９３−ＤＫＶＣＮＭＡＲＤＣＲＤＷＳＤＥＰＩＫＥＣＧＴＮＥＣＬＤＮＮＧＧＣＳＨＶＣＮＤＬＫＩＧＹＥＣＬＣＰＤＧＦＱＬＶＡＱＲＲＣＥＤＩＤＥＣＱＤＰＤＴＣＳＱＬＣＶＮＬＥ−３７２；配列番号：６４５）を用いて選択される。
本出願書類に記載の任意のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの発現および選択は、適当な手法、例えば限定されないが、ファージディスプレイ（例えば、国際公開第９２／０１０４７号，Ｋａｙら，１９９６ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ参照）、Ｗａｎｇら，２０１０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０８８−１１０１；Ｗａｎｇら，米国特許第７，１７５，９８３号、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、Ｔ７ディスプレイ、およびリボソームディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｅ ＆ Ｊｅｒｍｕｔｕｓ，２００４ Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５１７−５２７参照）を用いて行われ得る。
本発明の一部を構成する具体的なＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは抗体分子または抗体である。本明細書において記載する「抗体分子」または「抗体」は、ヒトＰＣＳＫ９に対する選択的結合性を有する免疫グロブリン由来構造、例えば限定されないが、完全長抗体または完全抗体、抗原結合断片（抗体構造から物理的または概念的に誘導される断片）、前述の任意のものの誘導体、前述の任意のものと別のポリペプチドとの融合体、あるいはＰＣＳＫ９に選択的に結合／その機能を阻害する目的で前述の任意のものが組み込まれた任意の択一的な構造／組成物をいう。抗体分子は、例えば、インタクトな免疫グロブリンとして存在するものであっても、例えば種々のペプチダーゼでの消化によって生成されるいくつかの充分に特性評価された断片として存在するものであってもよい。認識されている免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、γ、μ、α、δまたはεに分類され、これらにより、免疫グロブリンクラスがそれぞれのＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと規定される。「完全体」抗体または「完全長」抗体は、大抵の場合、ジスルフィド結合によって内部連結された２つの重（Ｈ）鎖と２ｔの軽（Ｌ）鎖を含み、（１）重鎖に関連して、可変領域（本明細書において「ＶＨ」と略記する）と、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む重鎖定常領域、ならびに（２）軽鎖に関連して、軽鎖可変領域（本明細書において「ＶＬ」と略記する）と、１つのドメインＣＬを含む軽鎖定常領域を含むタンパク質をいう。ペプシンは、抗体をヒンジ領域内のジスルフィド結合下で消化し、Ｆａｂ（これ自体は、ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に接合された軽鎖である）の二量体であるＦ（ａｂ）’２、を生成させる。Ｆ（ａｂ）’２を温和な条件下で還元するとヒンジ領域内のジスルフィド結合が分解され、それにより、Ｆ（ａｂ）’２二量体がＦａｂ’単量体に変換される。Ｆａｂ’単量体は、本質的には、分解されたヒンジ領域部分を有するＦａｂである。インタクトな抗体の消化に関連して種々の抗体断片が規定されるが、当業者には、かかるＦａｂ’断片は、化学的または組換えＤＮＡ方法論の使用のいすれかにより、デノボ合成されたものであってもよいことが認識されよう。したがって、抗体という用語は、本明細書で用いる場合、完全抗体または組換えＤＮＡ方法論を用いてデノボ合成されたものの修飾によって作製されるいずれかの抗体断片も包含する。
抗体断片、より詳しくは、抗原結合断片は、ＰＣＳＫ９（具体的には、ヒトＰＣＳＫ９）に対する選択的結合付与する抗体可変領域またはそのセグメント（これは、適宜、開示したＣＤＲ３またはＣＤＲ２ドメイン１つ以上（重鎖および／または軽鎖）を重鎖および／または軽鎖のフレームワーク領域内に含む）を有する分子である。かかる抗体可変領域を含む抗体断片としては、限定されないが、以下の抗体分子：Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｃｃＦｖ、二重特異性抗体分子（該抗体と異なる結合特異性を有する第２の機能性部分、例えば限定されないが、別のペプチドもしくはタンパク質（抗体、あるいは受容体リガンドなど）に連結された本明細書において開示したＰＣＳＫ９特異的抗体または抗原結合断片を含む抗体分子）、二重特異性単鎖Ｆｖ二量体、単離されたＣＤＲ３、ミニボディ、「ｓｃＡｂ」、ｄＡｂ断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ならびにタンパク質骨格を基礎とする人工抗体、例えば限定されないが、フィブロネクチンＩＩＩ型ポリペプチド抗体（例えば、米国特許第６，７０３，１９９号および国際公開第０２／３２９２５号および同第００／３４７８４号参照）またはシトクロムＢ（例えば、Ｎｙｇｒｅｎら，１９９７ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：４６３−４６９（これらの開示は引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）が挙げられる。抗体部分または結合断片は、天然のものであってもよく、一部または完全に合成により作製されたものであってもよい。かかる抗体部分は、当業者に知られた種々の手段、例えば限定されないが、パパインまたはペプシン消化などの慣用的な手法によって調製され得る。当業者には、さらに、上記の任意の抗体分子（完全長ならびに種々の抗体断片を含む）が、化学的または組換えＤＮＡ方法論の使用のいすれかにより、デノボ合成されたものであってもよいことが認識されよう。抗体という用語は、本明細書で用いる場合、完全長抗体および完全抗体または組換えＤＮＡ方法論を用いてデノボ合成されたものの作製もしくは修飾によって作製されるいずれかの抗体断片も包含する。
用語「単離された」は、抗体分子、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト一般、コード核酸などに関して本明細書で用いる場合、開示したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、核酸、その他自然界に見られるものとは違ったものに関する性質を示す。この違いは、例えば、自然界に見られるものと異なる純度であること、または自然界に見られるものと異なる構造であること、もしくは異なる構造の一部を構成していることであり得る。例えば、自然界に見られない構造としては、組換えヒト免疫グロブリン構造、例えば限定されないが、最適化されたＣＤＲを有する組換えヒト免疫グロブリン構造が挙げられる。自然界に見られない構造の他の例は、実質的に他の細胞性物質を含有していないＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストまたは核酸である。単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、一般的に、異なるタンパク質特異性を有する他のタンパク質特異的アンタゴニスト有していない（すなわち、ＰＣＳＫ９以外に対して親和性を有する）。
具体的な一態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９機能アンタゴナイズする単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを提供する。具体的な実施形態において、前記ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、ＬＤＬ受容体に対するＰＣＳＫ９結合およびその結果起こるＰＣＳＫ９の細胞インターナリゼーションに干渉することにより、細胞内ＬＤＬ取込みのヒトＰＣＳＫ９の拮抗作用を阻害するものである。したがって、開示したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、血漿ＬＤＬ−コレステロールレベルを低下させるための望ましい分子を構成する。例えば、Ｃｏｈｅｎら，２００５ Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３７：１６１−１６５（この場合、対立遺伝子ＰＣＳＫ９のナンセンス変異に対してヘテロ接合性の個体において、有意に低い血漿ＬＤＬコレステロールレベルが認められた）；Ｒａｓｈｉｄら，２００５ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：５３７４−５３７９（この場合、ＰＣＳＫ９ノックアウトマウスは、肝細胞内のＬＤＬＲ数の増大、血漿ＬＤＬクリアランスの加速、および有意に低い血漿コレステロールレベルを示した）；ならびにＣｏｈｅｎら，２００６ Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５４：１２６４−１２７２（この場合、変異型機能喪失ＰＣＳＫ９に対してヘテロ接合性のヒトは、アテローム硬化性心臓疾患の発症の長期リスクの有意な低減を示した）を参照のこと。
反復実験により、本明細書において試験した抗体分子は、本明細書において、ＬＤＬ取込みに対するヒトＰＣＳＫ９の効果の両方を用量依存的に阻害した。したがって、特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、ならびに等価体（開示したＡＸ１３２またはバリアント抗体分子のＰＣＳＫ９選択性を破壊しない１つ以上（特定の実施形態では、１〜５つまたは１〜３つ）のアミノ酸置換を有することが特徴である）またはそのホモログを包含する。具体的な実施形態では、本明細書において開示したＣＤＲドメインあるいは本明細書において開示した重鎖および／または軽鎖ＣＤＲドメインの組を含む単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、または１つ以上のアミノ酸置換を有することが特徴であるその等価体を含む。
本明細書における用語「ドメイン」または「領域」の使用は、単純に、本題のその配列またはセグメントが後に存在するか、あるいは現在存在している抗体分子のそれぞれの部分をいう。
特定の実施形態において、本発明は、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、より特定の実施形態では、（ｉ）重鎖可変領域：配列番号：３６０〜５１０からなる群より選択されるおよび／または（ｉｉ）配列番号：５１１〜５４９からなる群より選択される軽鎖可変領域を含む抗体分子、１つ以上の（具体的な実施形態では、１〜５または１〜３）アミノ酸置換を有することが特徴であるその等価体、ならびにそのホモログを提供する。また、この群は、配列番号：３６０、３６２および３６４〜５１０については、配列内の最後の３つのアミノ酸残基を有しないＰＣＳＫ９抗体分子（例えば、配列番号：３６１および３６３参照）（可変領域の境界に関しての種々の解釈のため）も包含する。開示したアンタゴニストは、細胞内ＬＤＬ取込みのヒトＰＣＳＫ９依存性阻害に反作用または阻害するものでなければならない。特定の実施形態において、本発明は、配列において、それぞれ（ｉ）配列番号：３６０〜５１０からなる群より選択される重鎖可変領域および／または（ｉｉ）配列番号：５１１〜５４９からなる群より選択される軽鎖可変領域のいずれかまたは両方と少なくとも９０％（または特定の実施形態では、少なくとも９５％、９７％または９９％）同一である重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含むことが特徴である開示したアンタゴニストのホモログであって、前記アンタゴニストが、細胞内ＬＤＬ取込みのヒトＰＣＳＫ９依存性阻害を少なくとも１０％阻害するものである、ホモログを提供する。
具体的な実施形態において、本発明は、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、より特定の実施形態では、（ｉ）配列番号：１〜５、７、９、１１、１３〜６３ならびに配列番号：１、３、５、９および１３〜６３の残基４〜１２からなる群より選択される可変重鎖ＣＤＲ３配列および／または（ｉｉ）配列番号：２９５〜３０１、３０３、３０５〜３３４ならびに配列番号：２９５、２９７、２９９、３０１および３０５〜３３４の残基４〜１３からなる群より選択される可変軽鎖ＣＤＲ３配列を含むＰＣＳＫ９抗体分子、ならびに１つ以上の（具体的な実施形態では、１〜５または１〜３）アミノ酸置換を有することが特徴であるその等価体を提供し、その特定の実施形態は、細胞内ＬＤＬ取込みのヒトＰＣＳＫ９依存性阻害を少なくとも１０％阻害するものである。特定の実施形態では、さらに、重鎖および／または軽鎖内に、本明細書に記載の可変領域のＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２配列を含む単離されたアンタゴニスト、あるいは任意の１つ以上のＣＤＲ配列内に１つ以上（特定の実施形態では、１〜５つまたは１〜３つ）のアミノ酸置換を有することが特徴であるその等価体を提供する。特定の実施形態において、本発明は、ＣＤＲ３配列と、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列の各々において少なくとも９０％（特定の実施形態では、９５％、９７％または９９％）同一であることが特徴である、開示したアンタゴニストのホモログであって、前記アンタゴニストが、細胞内ＬＤＬ取込みのヒトＰＣＳＫ９依存性阻害を少なくとも１０％阻害するものである、ホモログを提供する。
具体的な実施形態において、本発明は、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、より特定の実施形態では、（ｉ）配列番号：６４〜６８、７０、７２、７４、７６〜１８２ならびに配列番号：６４、６６、６８、７２および７６〜１８２の残基４〜２０からなる群より選択される可変重鎖ＣＤＲ２配列および／または（ｉｉ）配列番号：３３５〜３３９、３４１、３４３〜３４６、ならびに配列番号：３３５、３３７、３３９および３４３〜３４６の残基４〜１０からなる群より選択される可変軽鎖ＣＤＲ２配列を含むＰＣＳＫ９抗体分子、ならびに１つ以上の（具体的な実施形態では、１〜５または１〜３）アミノ酸置換を有することが特徴であるその等価体を提供し、その特定の実施形態は、細胞内ＬＤＬ取込みのヒトＰＣＳＫ９依存性阻害を少なくとも１０％阻害するものである。特定の実施形態では、さらに、本明細書に記載の重鎖および／または軽鎖の可変領域のＣＤＲ１および／またはＣＤＲ３配列を含む、単離されたアンタゴニスト、あるいは任意の１つ以上のＣＤＲ配列内に１つ以上（特定の実施形態では、１〜５つまたは１〜３つ）のアミノ酸置換を有することが特徴であるその等価体を提供する。特定の実施形態において、本発明は、ＣＤＲ２配列と、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列の各々において少なくとも９０％（特定の実施形態では、９５％、９７％または９９％）同一であることが特徴である、開示したアンタゴニストのホモログであって、前記アンタゴニストが、細胞内ＬＤＬ取込みのヒトＰＣＳＫ９依存性阻害を少なくとも１０％阻害するものである、ホモログを提供する。
選択された可変重鎖ＣＤＲ１領域は、配列番号：１８３〜１８９、１９１、１９３、１９５ １９７〜２９４、ならびに配列番号：１８３、１８５、１８７、１８９、１９３および１９７〜２９４の残基４〜１３、ならびに１つ以上の（具体的な実施形態では、１〜５または１〜３）アミノ酸置換を有することが特徴であるその等価体からなる群より選択される配列を含むものである。
選択された可変軽鎖ＣＤＲ１領域は、配列番号：３４７〜３４９、３５１、３５３〜３５９、ならびに配列番号：３４７、３４９および３５３〜３５９の残基４〜１４、ならびに１つ以上の（具体的な実施形態では、１〜５または１〜３）アミノ酸置換を有することが特徴であるその等価体からなる群より選択される配列を含むものである。
特定の実施形態では、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、より特定の実施形態では、本明細書において開示した重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列の１つ以上（具体的な実施形態では、ＣＤＲ１、２および３領域の各々を１つ）を含む抗体分子、ならびに任意の１つ以上のＣＤＲ配列内に１つ以上の（具体的な実施形態では、１〜５または１〜３）アミノ酸置換を有することが特徴であるその等価体を提供し、その特定の実施形態は、細胞内ＬＤＬ取込みのヒトＰＣＳＫ９依存性阻害を少なくとも１０％阻害するものである。特定の実施形態において、本発明は、開示した重鎖および軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列において、それぞれ、少なくとも９０％（特定の実施形態では、９５％、９７％または９９％）同一であることが特徴である、開示したアンタゴニストのホモログであって、該アンタゴニストが、細胞内ＬＤＬ取込みのヒトＰＣＳＫ９依存性阻害を少なくとも１０％阻害するものである、ホモログを提供する。
本発明の具体的な一態様は、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを包含し、より特定の実施形態では、細胞内ＬＤＬ取込みのヒトＰＣＳＫ９依存性阻害を少なくとも１０％阻害する上記に開示したもののバリアントである抗体分子を包含する。
さらなる相違する実施形態は、（ａ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ここで、（ｉ）ＣＤＲ１配列は、配列番号：１８３〜１８９、１９１、１９３、１９５、１９７〜２９４、ならびに配列番号：１８３、１８５、１８７、１８９、１９３および１９７〜２９４の残基４〜１３からなる群より選択される、（ｉｉ）ＣＤＲ２配列は、配列番号：６４〜６８、７０，７２、７４、７６〜１８２ならびに配列番号：６４、６６、６８、７２および７６〜１８２の残基４〜２０からなる群より選択される、ならびに（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列は、配列番号：１〜５、７、９、１１、１３〜６３、ならびに配列番号：１、３、５、９および１３〜６３の残基４〜１２からなる群より選択される、および／または（ｂ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域、ここで、（ｉ）ＣＤＲ１配列は、配列番号：３４７〜３４９、３５１、３５３〜３５９、ならびに配列番号：３４７、３４９および３５３〜３５９の残基４〜１４からなる群より選択される、（ｉｉ）ＣＤＲ２配列は、配列番号：３３５〜３３９、３４１、３４３〜３４６ならびに配列番号：３３５、３３７、３３９および３４３〜３４６の残基４〜１０からなる群より選択される、および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列は、配列番号：２９５−３０１、３０３、３０５〜３３４、ならびに配列番号：２９５、２９７、２９９、３０１および３０５〜３３４の残基４〜１３からなる群より選択されるを含む単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、ならびに１つ以上の（具体的な実施形態では、１〜５または１〜３）アミノ酸置換を有することが特徴である（ｃｈａｃｔｅｒｉｚｅｄ）その等価体を包含し、その特定の実施形態は、細胞内ＬＤＬ取込みのヒトＰＣＳＫ９依存性阻害を少なくとも１０％阻害するものである。
本明細書における特定の実施形態において、該ＣＤＲは、ＡＸ１３２（もしくは開示したバリアント）またはアミノ酸置換（特定の実施形態では、１〜５つまたは１〜３つ）を有する、もしくは有しない択一的なアンタゴニスト、抗体分子もしくは骨格構造の対応する領域の代わりに存在している。その特定の実施形態は、細胞内ＬＤＬ取込みのヒトＰＣＳＫ９依存性阻害を少なくとも１０％阻害するものである。
具体的な実施形態は、完全長抗体に上記のＶＨおよびＶＬ領域を含む、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストである。本明細書における特定の実施形態は、さらに、配列番号：５７２（ＩｇＧｌ）、配列番号：５７３（ＩｇＧ２）、配列番号：５７４（ＩｇＧ４）および配列番号：５７５（ＩｇＧ２ｍ４）からなる群より選択される一連のアミノ酸を含むものである。
本明細書において包含されるアミノ酸置換は、保存的または非保存的アミノ酸置換であり得る。アミノ酸置換は、当業者に認識されるように、アミノ酸残基を、同様またはさらに良好な（意図される目的のため）機能的および／または化学的特徴を付与するものと置き換える置換である。
アミノ酸置換を有するアンタゴニストは、活性が保持されているか、またはさらに良好であるかについて、当該技術分野で利用可能な機能アッセイまたは本明細書に記載の機能アッセイを用いて試験され得る。１つ以上のアミノ酸置換を有し、ヒトＰＣＳＫ９に選択的に結合して、ＰＣＳＫ９機能を本明細書に記載のＡＸ１３２（もしくはバリアント）抗体分子と同じまたはさらに良好なレベルでアンタゴナイズする能力を保持しているＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを、本明細書において開示したアンタゴニストの「機能的等価体」と称し、本発明の特定の実施形態を構成する。保存的アミノ酸置換は、大抵の場合、あるアミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において規定されている。このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、無極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。上記の修飾は、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの結合特性または機能的阻害特性を有意に変更するために設計されたものであっても、そうでなくてもよく、かかる特性を改善するものであってもよい。置換を行う目的は重要でなく、なんら限定されないが、残基を、分子の構造、分子の電荷もしくは疎水性、または分子の大きさをより良好に維持または向上させることができるものでの置き換えが挙げられ得る。例えば、単純に、あまり所望でない残基を同じ極性または電荷のもので置換することが所望され得る。かかる修飾は、当該技術分野で知られた標準的な手法（部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発など）によって導入することができる。当業者が保存的アミノ酸置換を行う特定の手段の１つは、例えば、ＭａｃＬｅｎｎａｎら，１９９８ Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５−６７およびＳａｓａｋｉら，１９９８ Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１−２４に論考されているアラニンスキャニング変異誘発である。
本発明の特定の一実施形態において、本明細書において開示したＣＤＲは、より安定なバリアントまたはより高レベルで組換え発現されるバリアントが作製されるように改変される。例えば、Ａｓｎ−ＧｌｙまたはＡｓｐ−ＧｌｙがＣＤＲ内に存在する場合、本発明は、ＡｓｐもしくはＡｓｎがＧｌｕもしくはＡｌａに変化した、またはＧｌｙがＡｌａに変化したバリアントを包含する。かかる変化の有益性は、イソアスパルテートの形成の可能性が除かれることである。また、Ｍｅｔが露出した位置のＣＤＲに存在する場合、本発明の範囲は、ＭｅｔがＬｙｓ、Ｌｅｕ、ＡｌａまたはＰｈｅに変化したバリアントを包含する。かかる変化の有益性は、メチオニンの酸化の可能性が除かれることである。Ａｓｎが本発明のＣＤＲに存在する場合、本発明の範囲は、ＡｓｎがＧｌｎまたはＡｌａに変化したバリアントを包含する。かかる変化の有益性は、脱アミド化の可能性が除かれることである。さらに、Ａｓｎ−Ｐｒｏが本発明のＣＤＲに存在する場合、本発明は、ＡｓｎがＧｌｎもしくはＡｌａに変化した、またはＰｒｏがＡｌａに変化したバリアントを包含する。かかる変化の有益性は、切断可能なＡｓｎ−Ｐｒｏペプチド結合の可能性が除かれることである。本発明の範囲は、開示した任意の抗体分子の重鎖または軽鎖ＣＤＲが上記の１つ以上の位置において独立して変化した実施形態を含む。
別の態様において、本発明は、単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、より特定の実施形態では、開示した抗体の対応するアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含む重鎖および／または軽鎖の可変領域を含む抗体分子であって、細胞内ＬＤＬ取込みのＰＣＳＫ９依存性阻害を阻害する抗体分子を提供する。特定の実施形態は、開示した重鎖および／または軽鎖の可変領域（あるいは重鎖および／または軽鎖）とそれぞれ、少なくとも９０％同一である重鎖および／または軽鎖の可変領域を含むアンタゴニストである。「少なくとも９０％同一」に対する言及は、本明細書において開示した分子の全長に沿って少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９および１００％同一である配列を含む。
本明細書に記載のアンタゴニストのアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を有するＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、典型的には、ＰＣＳＫ９に対する特異性にマイナスの影響を及ぼすことなく該アンタゴニストの特性の１つ以上が改善されるように作製される。かかる配列を得るための方法の一例（当業者に利用可能な唯一の方法ではない）は、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストまたはその特異性決定領域（１つまたは複数）をコードする配列を変異させ、該変異配列（１つまたは複数）を含むアンタゴニストを発現させ、コードアンタゴニストを保持された機能について、利用可能な機能アッセイ（例えば、本明細書に記載のもの）を用いて試験することである。変異は、部位特異的であってもランダム変異誘発であってもよい。しかしながら、当業者には認識されるように、他の変異誘発方法によりほぼ同じ効果を容易にもたらし得る。例えば、特定の方法では、アミノ酸化学特性またはアミノ酸構造特性、あるいは他タンパク質構造を考慮することに基づいて、変異型スペクトルは非ランダム標的アミノ酸置換により制約される。親和性成熟実験では、ランダム選択であろうと非ランダム選択であろうと、１つの選択分子中にいくつかのかかる変異が認められ得る。様々な構造ベースの親和性成熟に対するアプローチも存在し、例えば、米国特許第７，１１７，０９６号明細書、国際公開第０２／０８４２７７号および同第０３／０９９９９９号（これらの開示は引用により本明細書に組み込まれる）に示される。
本明細書で用いる場合、２つのアミノ酸配列間または核酸配列間の相同性割合は、該２つの配列間の同一性割合に相当し、これらの２つの用語は、全体を通して互換的に用いる。本明細書で用いる場合、２つの核酸配列間またはアミノ酸配列間の同一性％は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズムを用いて求められる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラムを用いてスコア＝１００、ワード長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝１２で行われ、本発明の核酸分子に相同な核酸配列が得られる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用いてスコア＝５０、ワード長＝３で行われ、本明細書において開示したアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列が得られる。比較目的のギャップ含有アラインメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されたＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが使用される。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用される。
開示した１種類以上のＰＣＳＫ９特異的分子の成分を使用し、同様またはより良好な特異性を有する他の結合分子を作製することは、充分当業者の技能の範囲である。これは、例えば、組換えＤＮＡ技術の手法を用いて行われ得る。この具体例の１つは、抗体の免疫グロブリン可変領域または１つ以上のＣＤＲをコードするＤＮＡを、適宜、異なる免疫グロブリンの可変領域、定常領域または定常領域＋フレームワーク領域に導入することを伴うものである。かかる分子は、本発明の重要な態様を構成する。開示した具体的な配列が挿入され得る、あるいはまた本質的にその一部分を構成し得る特定の免疫グロブリンまたは対応する配列としては、限定されないが、本発明の具体的な実施形態を構成する以下の抗体分子：Ｆａｂ（可変軽鎖（ＶＬ）、可変重鎖（ＶＨ）、定常軽鎖（ＣＬ）および定常重鎖１（ＣＨ１）ドメインを有する一価の断片）、Ｆ（ａｂ’）２（ジスルフィド結合によって、または択一的にヒンジ領域で連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片）、Ｆｄ（ＶＨおよびＣＨ１ドメイン）、Ｆｖ（ＶＬおよびＶＨドメイン）、ｓｃＦｖ（ＶＬとＶＨがリンカー（例えば、ペプチドリンカー）によって接合された単鎖Ｆｖ、例えば、Ｂｉｒｄら，１９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６、Ｈｕｓｔｏｎら，１９８８ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）、二重特異性抗体分子（該抗体と異なる結合特異性を有する第２の機能性部分、例えば限定されないが、別のペプチドもしくはタンパク質（抗体、あるいは受容体リガンドなど）に連結された本明細書において開示したＰＣＳＫ９特異的抗体または抗原結合断片を含む抗体分子）、二重特異性単鎖Ｆｖ二量体（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５参照）、単離されたＣＤＲ３、ミニボディ（約８０ｋＤａの二価の二量体に自己組織化するに単鎖−ＣＨ３融合体）、「ｓｃＡｂ」（ＶＨおよびＶＬならびにＣＬまたはＣＨ１のいずれかを含む抗体断片）、ｄＡｂ断片（ＶＨドメイン、例えば、Ｗａｒｄら，１９８９ Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６、およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，１９９０ Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４；またはＶＬドメイン；Ｈｏｌｔら，２００３ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：４８４−４８９を参照のこと）、ダイアボディ（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，１９９３ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８および国際公開第９４／１３８０４号参照）、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ（ＣＨ３に接合されたｓｃＦｖ；例えば、Ｈｕら，１９９６ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５−３０６１を参照のこと）、ＩｇＧ、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはその任意の誘導体、ならびにタンパク質骨格を基礎とする人工抗体、例えば限定されないが、フィブロネクチンＩＩＩ型ポリペプチド抗体（例えば、米国特許第６，７０３，１９９号および国際公開第０２／３２９２５号参照）あるいはシトクロムＢ；例えば、Ｋｏｉｄｅら，１９９８ Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２８４：１１４１−１１５１、およびＮｙｇｒｅｎら，１９９７ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：４６３−４６９を参照のこと（これらの開示は引用により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。一部の特定の抗体分子、例えば限定されないが、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ分子またはドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ）は、ジスルフィド結合組み込んでＶＨドメインとＶＬドメインを並べることにより安定化され得る。例えば、Ｒｅｉｔｅｒら，１９９６ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１２３９−１２４５（その開示は引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。二重特異性抗体は慣用的な手法（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ，１９９３ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：４４６−４４９参照、その特定の方法としては、化学的またはハイブリッドハイブリドーマからの作製が挙げられる）ならびに他の手法、例えば限定されないが、ＢｉＴＥＴＭ技術（ペプチドリンカーを有する異なる特異性の抗原結合領域を有する分子）およびノブ−インツ−ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）操作（例えば、Ｒｉｄｇｅｗａｙら，１９９６ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９：６１６−６２１参照。その開示は引用により本明細書に組み込まれる）を用いて作製され得る。二重特異性ダイアボディは大腸菌内で作製され得、当業者に認識される他のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストとしてのこのような分子は、適切なライブラリーにてファージディスプレイを用いて選択され得る（例えば、国際公開第９４／１３８０４号参照。その開示は引用により本明細書に組み込まれる）。
対象のＣＤＲが挿入される可変ドメインは、任意の生殖細胞系列または再配列ヒト可変ドメインから得られ得る。また、可変ドメインは合成により作製されたものであってもよい。ＣＤＲ領域は、それぞれの可変ドメイン内に組換えＤＮＡ技術を用いて導入され得る。これが行われ得る手段の一例は、Ｍａｒｋｓら，１９９２ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３に記載されており、その開示は引用により本明細書に組み込まれる。可変重鎖ドメインを可変軽鎖ドメインとペアにし、抗原結合部位を提供してもよい。また、独立した領域（例えば、可変重鎖ドメイン単独）を使用し、抗原をさせてもよい。また、当業者には、同様に、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬとＶＨは、おそらく別々の遺伝子にコードされているが、組換え法を使用し、これらを、ＶＬ領域とＶＨ領域がペアになって一価の分子（ｓｃＦｖ）を形成する単一のタンパク質鎖にすることを可能にする合成リンカーによって接合され得ることも充分認識されよう。
特定の実施形態では、生殖細胞系列のフレームワーク領域内にＣＤＲ（１つまたは複数）を提供する。フレームワーク領域は、例えば限定されないが、ヒトフレームワーク領域は、当業者に知られている（例えば、ヒトまたは非ヒトフレームワーク）。フレームワーク領域は天然に存在するものであっても、コンセンサスフレームワーク領域であってもよい。一態様において、本発明の抗体のフレームワーク領域はヒト由来である（例えば、ヒトフレームワーク領域の列挙はＣｌｏｔｈｉａら，１９９８ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９を参照のこと。前記の開示は引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本明細書における特定の実施形態では、それぞれＶＨ３またはＶＫ３内の該当するＣＤＲの代わりの開示した重鎖および／または軽鎖の可変領域のＣＤＲ３配列を提供する。本明細書における特定の実施形態では、それぞれＶＨ３またはＶＫ３内の該当するＣＤＲの代わりの開示した重鎖および／または軽鎖の可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を提供する。
本発明は、ヒト由来、ヒト型、脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）、キメラおよび霊長類化抗体分子を包含する。また、本発明は、ベニア化プロセス（例えば、Ｍａｒｋら，１９９４ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，第１１３巻：Ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ｐｐ．１０５−１３４を参照のこと。その開示は引用により本明細書に組み込まれる）によって作製される抗体分子を包含する。開示した抗体分子に関する「ヒト」は、具体的には、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変および／または定常領域を有する抗体分子であって、前記配列は（そうである必要はないが）、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列にコードされたものでない特定のアミノ酸置換または残基を有するように修飾／改変されたものであり得る抗体分子をいう。かかる変異は、限定されないが、ランダムもしくは部位特異的変異誘発などの方法によってインビトロで、または体細胞変異によってインビボで導入され得る。文献において論考された変異手法の具体例は、Ｇｒａｍら，１９９２ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：３５７６−３５８０；Ｂａｒｂａｓら，１９９４ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９１：３８０９−３８１３、およびＳｃｈｉｅｒら，１９９６ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−５６７（これらの開示は引用により本明細書に組み込まれる）に開示されたものである。これらは、特定の例にすぎず、利用可能な唯一の手法を表すものはない。科学文献には数多くの変異手法が見られ、これらは当業者に利用可能であり、広く認識されている。開示した抗体分子に関する「ヒト化」は、具体的には、別の哺乳動物種（マウスなど）に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフティングされている抗体分子をいう。開示した抗体分子に関する「霊長類化」は、非霊長類のＣＤＲ配列が霊長類のフレームワーク配列内に挿入されている抗体分子をいう。例えば、国際公開第９３／０２１０８号および同第９９／５５３６９号を参照のこと。これらの開示は引用により本明細書に組み込まれる。
本発明の特定の抗体は、モノクローナル抗体であり、具体的な実施形態では、以下の抗体形式：ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４あるいは前述の任意のものの任意の誘導体のいずれか１つのものである。これに関する文言「その誘導体」または「誘導体」としては、とりわけ、（ｉ）一方または両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）にアミノ酸修飾を有する抗体および抗体分子、（ｉｉ）重鎖および／または軽鎖の定常領域内に操作がなされた抗体および抗体分子、および／または（ｉｉｉ）通常は免疫グロブリン分子の一部分でないさらなる化学的部分（例えば、ペグ化）を含む抗体および抗体分子が挙げられる。
可変領域の操作は、１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ領域の範囲内であり得る。部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発または配列もしくは分子の多様性の生成のための他の方法を用いて変異型が作出され得、続いて、これは、目的の具体的な機能特性について、利用可能なインビトロまたはインビボアッセイ（例えば、本明細書に記載のもの）において試験され得る。
また、本発明の抗体は、目的の抗体の１つ以上の特性を改善するためにＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に対して修飾がなされたものも包含する。典型的には、かかるフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低減するために行われる。例えば、アプローチの一例は、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系列の配列に「復帰変異」することである。より詳しくは、体細胞変異が行われた抗体には、該抗体を誘導した生殖細胞系列の配列と異なるフレームワーク残基が含有され得る。かかる残基は、該抗体フレームワーク配列を、抗体を誘導した生殖細胞系列の配列と比較することにより同定され得る。かかる「復帰変異」された抗体も、本発明に包含されることを意図する。別の型のフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内、さらには１つ以上のＣＤＲ領域内の１つ以上の残基を変異させてＴ細胞エピトープを除去することを伴うものであり、それにより、抗体の潜在的免疫原性が低減される。このアプローチは「脱免疫化」とも称され、Ｃａｒｒらによる米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号に、さらに詳細に記載されており、その開示は引用により本明細書に組み込まれる。
フレームワークまたはＣＤＲ領域内に行われる修飾に加えて、または択一的に、本発明の抗体は、Ｆｃまたは定常領域内に修飾が含まれるように操作してもよく、存在させると、典型的には、抗体の１つ以上の機能的特性、例えば、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞性細胞傷害性が改変される。
所望のエフェクター機能性に絞るために種々の抗体アイソタイプを含めた「ハイブリッド」または「コンビナトリアル」ＩｇＧ形態を作製するという概念が一般的に報告されている。例えば、Ｔａｏら，１９９１ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１０２５−１０２８を参照のこと。本発明の特定の実施形態は、抗体上の一部においてＦｃγＲ受容体、ＣｌｑまたはＦｃＲｎへの結合の低減または改変がもたらされることがわかっているＦｃ領域における特定の操作を有する抗体分子を包含する。したがって、本発明は、抗体依存性細胞性細胞傷害性（「ＡＤＣＣ」）、補体媒介性細胞傷害性（「ＣＭＣ」）を誘発しない（または誘発する程度が低い）もしくは免疫複合体を形成しないが、通常の薬物動態学的（「ＰＫ」）特性は保持している、本記載による抗体を包含する。本発明の特定の実施形態は、その免疫グロブリン構造の一部として配列番号：５７５、具体的な実施形態では、配列番号：５７５の残基１０７〜３２６を免疫グロブリン構造の一部として含む、本発明により規定される抗体分子を提供する。本発明は、（ｉ）配列番号：５１１〜５４９からなる群より選択される（特定の実施形態では、配列番号：５１１〜５１８、５２０〜５２４および５２６〜５４９からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎ ｏｆ）群より選択される）軽鎖可変領域、ならびに（ｉｉ）配列番号：３６０〜５１０からなる群より選択される重鎖可変領域、順に（隣接して）またはその後に配列番号：５７２（ＩｇＧ１）、配列番号：５７３（ＩｇＧ２）、配列番号：５７４（ＩｇＧ４）および配列番号：５７５（ＩｇＧ２ｍ４）からなる群より選択される一連のアミノ酸を含む抗体分子を包含する。具体的な実施形態において、上記の（ｉ）と（ｉｉ）の軽鎖と重鎖のペアリングは（ａ）配列番号：３６０および５１１および（ｂ）配列番号：３６２および５１１である。
また、本発明は、結晶を包含する。本発明は、ＰＣＳＫ９またはそのペプチドエピトープと複合体形成された本発明の任意のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを含む結晶を含む。
いくつかの結晶化方法が当該技術分野で知られている（Ｇｉｅｇｅら，（１９９４）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５０：３３９−３５０；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，（１９９０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８９：１−２３）。かかる方法としては、マイクロバッチ、懸滴、種晶添加および透析が挙げられる。好ましくは、懸滴蒸気拡散（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，（１９７６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：６３００−６３０３）またはマイクロバッチ法（Ｃｈａｙｅｎ（１９９７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：１２６９−１２７４）が使用される。これらの各方法では、核生成後、溶液を過飽和状態に維持することにより、継続的に結晶成長を促進させることが重要である。マイクロバッチ法では、ポリペプチドを沈殿剤と混合して過飽和にし、槽を密封し、結晶が出現するまで放置する。透析法では、ポリペプチドを密封透析膜内に保持し、これを沈殿剤含有溶液中に入れる。膜内外の平衡により沈殿剤濃度が増大し、それにより、ポリペプチドの過飽和レベルへの到達が引き起こされる。
本発明の結晶は成長したら、Ｘ線回折データが収集され得る。Ｘ線回折データにより構造を調べるための方法の一例として、標準的な極低温条件下でのシンクロトロン放射の使用が挙げられる。しかしながら、択一的な方法も使用され得る。例えば、結晶は、慣用的な供給源（密封管または回転陽極）によって得られるＸ線を使用することによりキャラクタライズされ得る。キャラクタライゼーション法としては、限定されないが、プリセッション写真術、振動写真術および回折計データ収集が挙げられる。
本発明によって提供される結晶化可能な組成物は、ＰＣＳＫ９／ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト複合体の３次元構造を得るためのＸ線結晶学を行い易い。本発明は、ＰＣＳＫ９／ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト複合体の原子座標の測定のためにＸ線を、約５．０オングストロームより高い（例えば、約４．５Å、約４．０Å、約３Å、約２．５Å、約２Å、約１．９５Å、約１Å）、好ましくは、約４．０オングストロームより高い（例えば、約３Å、約２．５Å、約２Å、約１．９５Å、約１Å）、より好ましくは、約２．８オングストロームより高い（例えば、約２．５Å、約２Å、約１．９５Å、約１Å）、最も好ましくは、約２．０オングストロームより高い（例えば、約１．９５Å、約１．５Å、約１．０Å）分解度まで有効に回折させる結晶を含む。
また、本発明の範囲は、本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト（例えば、配列番号：５５２に示す重鎖アミノ酸配列と配列番号：５５４に示す軽鎖アミノ酸配列を含むＦａｂ）とＰＣＳＫ９の空間群の結晶性複合体も包含する。ＰＣＳＫ９およびＡＸ１３２ Ｆａｂ断片の複合体は、空間群Ｐ６５において結晶化され、ａ＝１５５．９４６Å、ｂ＝１５５．９４６Å、ｃ＝１６０．０３７Åおよびα＝９０°、β＝９０°、γ＝１２０°の単位格子寸法を含み、ここで、Ｆａｂは、本明細書に記載の抗体ＡＸ１３２由来のものである。
本発明は、３次元構造が表１４に示す構造座標によって記述される、ＰＣＳＫ９／ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト複合体の結晶を含む。また、本発明の範囲は、表１４に示したものと同様の構造座標を有する結晶も包含する。結晶間の構造類似性は以下に詳細に論考する。
用語「構造座標」は、分子の原子（散乱中心）によるＸ線ビームの回折において得られたパターンに関する数学的方程式から誘導されるカーテシアン座標をいう。回折データを用いて電子密度マップが計算され、該分子の個々の原子の位置が確立される。
当業者には、酵素または酵素複合体またはその一部分に関する構造座標の組は、形状を３次元に規定する相対的な点の組であることは理解されよう。したがって、全く異なる座標の組によって同様または同一の形状が規定され得ることが起こり得る。さらに、個々の座標におけるわずかなばらつきは、形状全体に対してほとんど影響しない。
本発明は、表１４に示したものと同様の構造座標を示すが、構造座標の結晶学的置換については、構造座標の分割、構造座標の組に対する加算、減算、回転もしくは変換または上記の任意の組合せを示す結晶を含む。
あるいはまた、アミノ酸の変異、付加、置換および／または欠失、あるいは結晶を構成する任意の成分における他の変化による結晶構造の改良も、構造座標におけるバリエーションの原因となる。かかるバリエーションが表１４の座標と比べて許容され得る標準誤差の範囲内である場合、得られる３次元形状は同じとみなし、したがって、改良された結晶は本発明の範囲に含まれるとみなす。
結晶が、構造座標が表１４に示すものである結晶と充分に同様であるかどうかを判定して同じとみなすのに、種々のコンピュータ解析が使用され得る。かかる解析は、現行のソフトウェアアプリケーション、例えば、ＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙアプリケーションのバーション４．１において、添付のユーザーガイドに記載のとおりに行われ得る。
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙアプリケーションは、異なる構造間、同じ構造の異なるコンホメーション間、および同じ構造の異なる部分間の比較が可能である。一般に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙにおいて構造比較のために使用される手順は、４段階：１）比較対象の構造の入力、２）これらの構造における原子の等価性の規定、３）フィッティング操作の実行、および４）結果の解析に分けられる。各構造は、名称によって特定される。１つの構造が標的（すなわち、固定構造）として特定される。残りの構造はすべて動作（ｗｏｒｋｉｎｇ）構造である（すなわち、移動（ｍｏｖｉｎｇ）構造）。ＱＵＡＮＴＡにおける原子の等価性はユーザーの入力によって規定されるため、本発明の解釈上、本発明者らは、等価原子をα炭素原子（Ｃａ）に、または比較対象の２つの構造間で保存されたすべての残基ではタンパク質骨格のすべての原子（Ｎ、Ｃａ、ＣおよびＯ）に規定する。リジッドフィッティング法が使用される場合、動作構造を変換および回転させて、標的構造との最適フィットを得る。フィッティング操作には、最小二乗法フィッティングアルゴリズムが使用され、このアルゴリズムにより、指定された等価原子のペアにおけるフィットの二乗平均平方根の差が絶対最小値となるような、移動構造に適用されるべき最適な変換および回転がコンピュータ計算される。この値は、オングストロームで示され、ＱＵＡＮＴＡによって報告されている。
用語「二乗平均平方根偏差」（ＲＭＳＤ）は、当該技術分野で一般的に知られている用語であり、一般に、対応する原子の平均距離の偏差の二乗の算術平均の平方根を意味する。これは、傾向または目標からの偏差または変動を示す方法の１つである。
用語「最小二乗法」は、最良推定値は、観測値の偏差の二乗和が最小となるときという原則に基づいた方法に関する。
本発明の解釈上、表１４の該当する構造座標と重ね合わせたとき（骨格原子またはα炭素原子を使用）、保存された残基の骨格原子（Ｎ、Ｃα、Ｃ、Ｏ）またはα炭素原子（Ｃａ）のみのＲＭＳＤが約１．５Å未満である構造座標の組を特徴とする任意の結晶性の分子を同一とみなし、本発明の範囲に含める。一実施形態において、二乗平均平方根偏差は約１．５Åまたは約１．０Åまたは約０．７５Åまたは約０．５Åまたは約０．２５Åまたは約０．１０Åである。
また、本発明は、Ｆａｂ形式に変換すると、表１４の該当する構造座標と重ね合わせたとき（骨格原子またはα炭素原子を使用）、保存された残基の骨格原子（Ｎ、Ｃα、Ｃ、Ｏ）またはα炭素原子（Ｃａ）のみのＲＭＳＤが約１．５Å未満である構造座標の組を特徴とする３次元構造を特徴とする様式でヒトＰＣＳＫ９に結合する任意の非結晶性のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストも包含し、同一とみなし、本発明の範囲に含める。一実施形態において、二乗平均平方根偏差は、約１．５Åまたは約１．０Åまたは約０．７５Åまたは約０．５Åまたは約０．２５Åまたは約０．１０Åである。
具体的な実施形態において、本発明は、ＰＣＳＫ９上の以下の残基：Ｓ１５３、１１５４、Ｐ１５５、Ｗ１５６、Ｎ１５７、Ｌ１５８、Ｄ１９２、Ｈ１９３、Ｒ１９４、Ｅ１９５、Ｉ１９６、Ｅ１９７、Ｇ１９８、Ｒ１９９、Ｓ２２１、Ｈ２２９、Ｇ２３２、Ｓ２３５、Ｇ２３６、Ｒ２３７、Ｄ２３８、Ａ２３９、Ｇ２４０、Ｋ２４３、Ｇ２４４、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ａ３７１、Ｓ３７２、Ｓ３７３、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｓ３７６、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３８０、Ｓ３８１の少なくとも１個（特定の実施形態では、少なくとも２、４、１０、１５、２０、２５、３０もしくは３５個、または全部）から１０Å以下以内でＰＣＳＫ９に結合するＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを包含する。特定の実施形態において、本発明は、ＰＣＳＫ９上の以下の残基：Ｓ１５３、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｅ１９５、Ｒ２３７、Ｄ２３８、Ａ２３９、Ｉ３６９、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｓ３７６、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９の少なくとも１個（特定の実施形態では、少なくとも２、４もしくは１０個、または全部）から５Å以下以内でＰＣＳＫ９に結合するＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを包含する。
特定のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、検出可能な標識を担持していてもよく、毒素（例えば、細胞毒素）、放射性同位体、放射性核種、リポソーム、標的化部分、バイオセンサー、カチオンテイル、または酵素（例えば、ペプチジル結合もしくはリンカーにより）コンジュゲートされていてもよい。かかるＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト組成物は本発明のさらなる態様を構成する。
別の態様において、本発明は、開示したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする単離された核酸を提供する。前述の「単離された」は、自然界に見られるものとは違ったものにすることに言及しているものの性質をいう。この違いは、例えば、自然界に見られるものと異なる純度であること、または自然界に見られるものと異なる構造であること、もしくは異なる構造の一部を構成していることであり得る。自然界に見られない核酸の一例は、例えば、実質的に他の細胞性物質を含有していない核酸である。核酸は、全細胞中、細胞ライセート中、または一部精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在するものであり得る。特定の場合では、核酸は、他の細胞成分または他の夾雑物（例えば、他の細胞内核酸もしくはタンパク質）から、例えば、標準的な手法、例えば限定されないが、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当該技術分野で知られた他の適当な方法を用いて精製するときに単離され得る。核酸としては、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）および／またはＲＮＡが挙げられ得る。本発明の核酸は、標準的な分子生物学的手法を用いて得られ得る。ハイブリドーマ（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスから調製したハイブリドーマ）によって発現させた抗体の場合は、ハイブリドーマによって作製される抗体の軽鎖と重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング手法によって得られ得る。免疫グロブリン遺伝子ライブラリー（例えば、ファージディスプレイ手法の使用）から得られる抗体の場合は、該抗体をコードする核酸はライブラリーから回収することができる。
本発明は、開示した可変重鎖および／または軽鎖ならびにその選択された成分、具体的には、開示した可変またはそれぞれのＣＤＲ領域をコードする単離された核酸を包含する。本明細書の特定の実施形態において、抗体フレームワーク領域内、具体的な実施形態では、ヒトフレームワーク領域内のＣＤＲ（１つまたは複数）を提供する。特定の実施形態において、生殖細胞系列のフレームワーク領域内、例えば限定されないが、ヒト生殖細胞系列のフレームワーク領域内のＣＤＲ（１つまたは複数）をコードする単離された核酸を提供する。本明細書における特定の実施形態では、配列番号：１〜５、７、９、１１、１３〜６３、ならびに配列番号：１、３、５、９、および１３〜６３の残基４〜１２（特定の実施形態では、前記核酸は、配列番号：６、８、１０および１２からなる群より選択される配列を含む）からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ３配列をコードする単離された核酸を提供する。本明細書における特定の実施形態では、配列番号：６４〜６８、７０、７２、７４、７６〜１８２、ならびに配列番号：６４、６６、６８、７２および７６〜１８２の残基４〜２０（特定の実施形態では、前記核酸は、配列番号：６９、７１、７３および７５からなる群より選択される配列を含む）からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２配列をコードする単離された核酸を提供する。本明細書における特定の実施形態では、配列番号：１８３〜１８９、１９１、１９３、１９５、１９７〜２９４ならびに配列番号：１８３、１８５、１８７、１８９、１９３および１９７〜２９４の残基４〜１３（特定の実施形態では、前記核酸は、配列番号：１９０、１９２、１９４および１９６からなる群より選択される配列を含む）からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１配列をコードする単離された核酸を提供する。本明細書における特定の実施形態では、該当するＣＤＲの代わりにＶＨ３内の開示した重鎖の可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列をコードする核酸を提供する。本明細書における特定の実施形態では、配列番号：２９５〜３０１、３０３、３０５〜３３４、ならびに配列番号：２９５、２９７、２９９、３０１および３０５〜３３４の残基４〜１３（特定の実施形態では、前記核酸は、配列番号：３０２および３０４からなる群より選択される配列を含む）からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ３配列をコードする単離された核酸を提供する。本明細書における特定の実施形態では、配列番号：３３５〜３３９、３４１、３４３〜３４６、ならびに配列番号：３３５、３３７、３３９および３４３〜３４６の残基４〜１０（特定の実施形態では、前記核酸は、配列番号：３４０および３４２からなる群より選択される配列を含む）からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ２配列をコードする単離された核酸を提供する。本明細書における特定の実施形態では、配列番号：３４７〜３４９、３５１、３５３〜３５９ならびに配列番号：３４７、３４９および３５３〜３５９残基４〜１４（特定の実施形態では、前記核酸は、配列番号：３５０および３５２からなる群より選択される配列を含む）からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ１配列をコードする単離された核酸を提供する。本明細書における特定の実施形態では、該当するＣＤＲの代わりにＶＫ３（またはＶＫ１）内の開示した軽鎖の可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列をコードする核酸を提供する。特定の実施形態において、重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲ（１、２および３）またはその１種類以上のいくつかの組合せを提供する。
該可変領域をコードする単離された核酸は、任意の所望の抗体分子形式、例えば、限定されないが、以下：Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体分子（該抗体と異なる結合特異性を有する第２の機能性部分、例えば限定されないが、別のペプチドもしくはタンパク質（抗体、あるいは受容体リガンドなど）に連結された本明細書において開示したＰＣＳＫ９特異的抗体または抗原結合断片を含む抗体分子）、二重特異性単鎖Ｆｖ二量体、ミニボディ、ｄＡｂ断片、ダイアボディ、トリアボディもしくはテトラボディ、ミニボディ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはその任意の誘導体にて提供され得る。
特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする単離された核酸、より特定の実施形態では、（ｉ）配列番号：３６０〜５１０（その特定の実施形態は配列番号：５５０または配列番号：５６１の核酸配列を含む）からなる群より選択される重鎖可変ドメイン、および／または（ｉｉ）配列番号：５１１〜５４９（その特定の実施形態は配列番号：５５１の核酸配列を含む）からなる群より選択される軽鎖可変ドメインを含む抗体分子を提供する。本発明は、さらに、特定の実施形態では、重鎖および／または軽鎖の可変領域全体において少なくとも９０％（特定の実施形態では、９５％、９７％または９９％）同一であることが特徴である上記に開示したアンタゴニストのホモログを提供する。
さらなる実施形態では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする単離された核酸、より特定の実施形態では、（ｉ）配列番号：５５８、５６６、および５５４（その特定の実施形態は、配列番号：５５９、５６７、５６８および５５５からなる群より選択される核酸を含む）からなる群より選択される軽鎖、および／または（ｉｉ）配列番号：５５２、５６２、５５６、５６４ならびに配列番号：５６２および５５２のアミノ酸１〜２２１（その特定の実施形態は、配列番号：５５３、５６３、５５７、５６５ならびに配列番号：５５３および５６３のヌクレオチド１〜６６３からなる群より選択される核酸を含む）からなる群より選択される重鎖またはＦｄ鎖を含む抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。本発明は、さらに、特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖において少なくとも９０％同一であることが特徴である、上記に開示したアンタゴニストのホモログを提供する。
本発明の特定の実施形態は、Ｆｃ領域において、抗体上の一部においてＦｃγＲ受容体、ＣｌｑまたはＦｃＲｎへの結合の低減または改変をもたらす操作を有する抗体分子をコードする核酸を包含する。本発明の特定の一実施形態は、その免疫グロブリン構造の一部として配列番号：５７５、具体的な実施形態では、配列番号：５７５の残基１０７〜３２６を含む抗体分子をコードする単離された核酸である。特定の実施形態では、適当な発現ベクター内で合成およびアセンブリングさせたオリゴヌクレオチドから作製した核酸からの発現により、合成のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストが作製され得る。例えば、Ｋｎａｐｐｉｃｋら，２０００ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６、およびＫｒｅｂｓら，２００１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５４：６７−８４を参照のこと。
本発明は、（ｉ）軽鎖可変領域をコードする開示した核酸、ならびに（ｉｉ）重鎖可変領域をコードする開示した核酸、続いて、順に（隣接して）、配列番号：５７２（ＩｇＧ１）、配列番号：５７３（ＩｇＧ２）、配列番号：５７４（ＩｇＧ４）および配列番号：５７５（ＩｇＧ２ｍ４）からなる群より選択されるアミノ酸の組をコードするヌクレオチドの組を含む抗体分子をコードする核酸を包含する。ＡＸ１３２抗ＰＣＳＫ９抗体分子の重鎖および軽鎖の配列を含むプラスミド配列は配列番号：５６０を見るとよい。ＡＸ２１３抗ＰＣＳＫ９抗体分子の重鎖および軽鎖の配列を含むプラスミド配列は配列番号：５６９を見るとよい。かかる抗体分子をコードする核酸は、本明細書の重要な実施形態を構成する。開示したプラスミド配列に存在するものを改変した領域で置き換えることにより、さらなるプラスミド配列が得られ得る。
また、完全長の本明細書に記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一、より好ましくは少なくとも約９５％同一であるヌクレオチド配列であって、細胞内ＬＤＬ取込みのＰＣＳＫ９依存性阻害を少なくとも１０％阻害するＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸も本発明に含まれる。
「少なくとも約９０％同一である」に対する言及は、本出願書類を通して、少なくとも約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一であることを含む。
さらに、本発明は、少なくとも一部分が、本明細書において開示した可変重鎖、可変軽鎖、重鎖および軽鎖領域のいずれか１つをコードする核酸の相補鎖に、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、単離された核酸を提供し、前記核酸は、抗体分子に対して、ＰＣＳＫ９に特異的に結合してＰＣＳＫ９機能アンタゴナイズする能力を付与するものであり、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは前記核酸を用いて発現させたものである。核酸をハイブリダイズさせるための方法当該技術分野でよく知られている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，６．３．１−６．３．６，１９８９を参照のこと。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、５×ＳＳＣ／５×デンハルト液（または同等液）／１．０％ＳＤＳ中６８℃でのハイブリダイズ、および０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中室温での洗浄を伴うものである。中ストリンジェント条件としては、３×ＳＳＣ中、４２℃での洗浄が挙げられる。塩濃度および温度のパラメータは、プローブと標的核酸間の至適レベルの存在体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）が得られるように変更され得る。当業者は、本明細書において開示した可変重鎖、可変軽鎖、重鎖領域および／または軽鎖領域と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％同一であるハイブリダイズさせる部分の核酸が特異的に標的化されるように、種々のハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を操作することができよう。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本パラメータおよび好適な条件を考案するための手引きは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，第９章および１１章，１９８９ならびにＡｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，セクション２．１０および６．３−６．４，１９９５（これらの開示は引用により本明細書に組み込まれる）に示されており、当業者によって容易に決定され得る。開示した重鎖、軽鎖、可変重鎖または可変軽鎖領域にストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸を含む１つ以上の領域を有するＰＣＳＫ９アンタゴニストは、ＰＣＳＫ９の１つ以上の機能をアンタゴナイズするのに有効なはずである。したがって、前記アンタゴニストおよびコード核酸は、本発明の重要な実施形態を構成する。
別の態様において、本発明は、本明細書において開示した核酸を含むベクターを提供する。本発明によるベクターとしては、限定されないが、プラスミド、および所望の抗体分子を意図される目的のため適切なレベルで発現させるのに適した他の発現構築物（例えば、適宜ファージまたはファージミド）が挙げられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（その開示は引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。ほとんどのクローニング目的には、ＤＮＡベクターが使用され得る。典型的なベクターとしては、プラスミド、修飾ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体、細菌人工染色体、および他の形態のエピソーム型または組込み型のＤＮＡが挙げられる。具体的な遺伝子導入、組換えＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの作製、または他の使用のために適切なベクターを決定することは、充分に当業者の能力の範囲内である。特定の実施形態において、ベクターには、組換え遺伝子に加えて、宿主細胞内での自律的複製のための複製起点、適切な調節配列、例えば、プロモーター、終始配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、選択可能なマーカー、限定的な数の有用な制限酵素部位および／または他の配列（適宜、および高いコピー数となる可能性のため）も含有され得る。タンパク質特異的アンタゴニストの作製のための発現ベクターの例は当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｐｅｒｓｉｃら，１９９７ Ｇｅｎｅ １８７：９−１８；Ｂｏｅｌら，２０００ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３９：１５３−１６６、およびＬｉａｎｇら，２００１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４７：１１９−１３０（これらの開示は引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。所望により、該アンタゴニストをコードする核酸を、当該技術分野でよく知られた手法を用いて宿主の染色体に組み込んでもよい。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９９、およびＭａｒｋｓら，国際公開第９５／１７５１６号を参照のこと。また、該核酸を、エピソーム型に維持したプラスミドまたは人工染色体に組み込んだプラスミドにおいて発現させてもよい。例えば、Ｃｓｏｎｋａら，２０００ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１３：３２０７−３２１６；Ｖａｎｄｅｒｂｙｌら，２００２ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：１０を参照のこと。具体的に抗体分子に関して、抗体軽鎖遺伝子と抗体重鎖遺伝子は、別々のベクター内に挿入され得るか、またはより典型的には、両遺伝子は同じ発現ベクター内に挿入され得る。任意のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストまたはその成分をコードする核酸は、発現ベクター内に、標準的な方法（例えば、核酸断片およびベクターにおける相補制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合は平滑端ライゲーション）を用いて挿入され得る。これをどのようにして行うかの別の特定の例は、リコンビナショナル（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ）法、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ「ＩｎＦｕｓｉｏｎ」系、もしくはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ「ＴＯＰＯ」系（ともにインビトロ）、または細胞内（例えば、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系）の使用によるものである。具体的に抗体分子に関して、軽鎖および重鎖の可変領域を使用し、これらを、既に所望のアイソタイプの重鎖定常領域と軽鎖定常領域をコードしている発現ベクター内に、ＶＨセグメントが該ベクター内のＣＨセグメント（１つまたは複数）に作動可能に連結され、ＶＬセグメントが該ベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子が作出され得る。さらにあるいはまた、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸を含む組換え発現ベクターに、宿主細胞からの該アンタゴニストの分泌を助長するシグナルペプチドをコードさせてもよい。該核酸はベクター内に、シグナルペプチドをコードする核酸が、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストコード核酸に隣接してインフレームに連結されるようにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであっても非免疫グロブリンシグナルペプチドであってもよい。宿主細胞への核酸の導入には、当業者に利用可能な任意の手法が使用され得る。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１２０２を参照のこと。対象の核酸分子を発現ベクターにサブクローニングし、該ベクターを含む宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする方法、ならびにそれぞれの発現ベクターを宿主細胞内に導入する工程、および該宿主細胞を適切な条件下で培養する工程を含む、実質的に純粋なタンパク質を作製する方法は、よく知られている。そのようにして産生されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、宿主細胞から慣用的な様式で回収され得る。対象の細胞内への核酸の導入に適した手法は、使用されている細胞の型に依存する。一般的な手法としては、限定されないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性トランスフェクションおよび対象の細胞株に適切なウイルス（例えば、レトロウイルス、ワクシニア、バキュロウイルス、またはバクテリオファージ）を用いた形質導入が挙げられる。
別の態様において、本発明は、開示したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸を含む単離された細胞（１つまたは複数）を提供する。様々な異なる細胞株が、本明細書において想定され、組換えＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの作製に使用され得、限定されないが、原核生物（例えば、大腸菌、バチルス属、およびストレプトミセス属）由来のもの、ならびに真核生物（例えば、酵母、バキュロウイルス、および哺乳動物）由来のものが挙げられる。例えば、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ抗体，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９９を参照のこと。その開示は引用により本明細書に組み込まれる。また、本明細書において開示した核酸またはアンタゴニストを含む植物細胞（トランスジェニック植物を含む）、および動物細胞（トランスジェニック動物（ヒト以外）を含む）も本発明の一部として想定される。好適な哺乳動物細胞または細胞株、例えば限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣由来のもの（ＣＨＯ細胞、例えば限定されないが、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，１９８０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０に記載）これは、例えば、ＤＨＦＲ選択可能なマーカーとともに使用される（例えば、ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ，１９８２ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載）、ＮＳ０骨髄腫細胞（この場合、国際公開第８７／０４４６２号、同第８９／０１０３６号および欧州特許第３３８，８４１号明細書に記載のＧＳ発現系が使用され得る）、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２細胞、ＨｅＬ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト胚腎臓細胞、ヒト胚網膜細胞、ならびに本明細書において開示した核酸またはアンタゴニストを含む他のものは、本発明のさらなる実施形態を構成する。先に挙げたものの開示は引用により本明細書に組み込まれる。開示したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸を含む本発明の特定の実施形態としては、限定されないが、大腸菌（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９１ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５４５−５５１を参照のこと）、または酵母（ピキア属など）、およびその組換え誘導体（例えば、Ｌｉら，２００６ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２１０−２１５参照）（先のものの開示は、引用により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。本発明の特定の実施形態は、開示したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸を含む真核生物細胞に関する。Ｃｈａｄｄ ＆ Ｃｈａｍｏｗ，２００１ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：１８８−１９４，Ａｎｄｅｒｓｅｎ ＆ Ｋｒｕｍｍｅｎ，２００２ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：１１７，Ｌａｒｒｉｃｋ ＆ Ｔｈｏｍａｓ，２００１ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：４１１−４１８を参照のこと。これらの開示は引用により本明細書に組み込まれる。本発明の特定の実施形態は、適正な翻訳後修飾を有するＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを作製することができる開示したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸を含む哺乳動物細胞に関する。翻訳後修飾としては、なんら限定されないが、ジスルフィド結合の形成およびグリコシル化が挙げられる。別の型の翻訳後修飾はシグナルペプチドの切断である。本明細書において好ましい実施形態は適切なグリコシル化を有する。ｅ．．，Ｙｏｏら，２００２ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６１：１−２０を参照のこと。その開示は引用により本明細書に組み込まれる。天然に存在する抗体には、重鎖に結合された少なくとも１種類のＮ結合型糖質が含まれている（同上）。効率的な翻訳後修飾を得るために種々の型の哺乳動物宿主細胞が使用され得る。かかる宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、Ｃ６、ＰＣ１２、および骨髄腫細胞が挙げられる。Ｙｏｏら，２００２ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６１：１−２０、およびＰｅｒｓｉｃら，１９９７ Ｇｅｎｅ １８７：９−１８を参照のこと。これらの開示は引用により本明細書に組み込まれる。
別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを含む単離された細胞（１つまたは複数）を提供する。
別の態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸を含む細胞、あるいはヒトＰＣＳＫ９に対する特異性を有する所望のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの重鎖および／または軽鎖あるいはその断片（例えば、ＶＨおよび／またはＶＬ、あるいは開示した重鎖および／または軽鎖の可変領域のＣＤＲの１つ以上）（所望のアンタゴニストによって決定される）を含む細胞を、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの発現、または前記重鎖および／または軽鎖あるいは断片の発現およびＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストへのアセンブリが可能な条件下でインキュベートすること、ならびに前記ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを該細胞から単離することを含む、本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの作製方法を提供する。所望の具体的な重鎖および／または軽鎖の配列あるいは断片の作製の一例は、まず、生殖細胞系列の重鎖および／または軽鎖の可変配列あるいは断片をＰＣＲを用いて増幅（および修飾）することである。ヒト重鎖および／または軽鎖の可変領域の生殖細胞系列の配列は当業者に容易に利用可能である。例えば、「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖細胞系列の配列データベース、ならびにＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら，１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．ら，１９９２「Ｔｈｅ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ ＶＨ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａｂｏｕｔ Ｆｉｆｔｙ Ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ＶＨ Ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｌｏｏｐｓ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；およびＣｏｘ，Ｊ．Ｐ．Ｌ．ら，１９９４「Ａ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ ＶＫ Ｓｅｇｍｅｎｔｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｓｔｒｏｎｇ Ｂｉａｓ ｉｎ ｔｈｅｉｒ Ｕｓａｇｅ」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６を参照のこと。これらの開示は引用により本明細書に組み込まれる。生殖細胞系列の配列の変異誘発は、標準的な方法、例えば、ＰＣＲ媒介性変異誘発（この場合、変異はＰＣＲプライマー内に組み込まれる）、または部位特異的変異誘発を用いて行われ得る。完全長抗体が所望される場合、ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列が利用可能である。例えば、Ｋａｂａｔ．Ｅ．Ａ．ら，１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２を参照のこと。このような領域を含む断片は、例えば、標準的なＰＣＲ増幅によって得られ得る。あるいはまた、当業者は、既に重鎖および／または軽鎖の定常領域をコードしているベクターを利用することができよう。
Ｆａｂの発現および精製は、いくつかの様式で行われ得る。一般的な様式の一例は、完全体のＩｇＧ１のパパイン消化を行い、Ｆａｂの２つの等価体とＦｃ領域の１つの等価体を放出させることである。しかしながら、ファージディスプレイ型ライブラリー（これも、大腸菌内での発現が必要とされる）では、Ｆａｂは、典型的には、タンパク質への共有結合によって、また、ヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−タグ）への共有結合によってもディスプレイされる。典型的な様式では、ＩＰＴＧによる誘導後、Ｆａｂの細胞内発現が行われる。続いて、全細胞を溶解させ、所望のＦａｂを、ニッケルアフィニティカラムを用いて精製する。おそらく、ミスフォールディングＦａｂ、一部フォールディングＦａｂ、ジスルフィドスクランブル型ＦａｂまたはＨｉｓ−タグを含有するタンパク質分解型Ｆａｂ（Ｈｉｓ−タグは、これらおよび正しくフォールディングされたＦａｂを区別しないため）から、特定の場合によっては、解析用ＳＥ−ＨＰＬＣにおいて高いバックグラウンドが生じることがあり得る。したがって、特定の実施形態では、Ｆａｂの発現は以下のようにして行われる：ファージからのペリプラズム輸送シグナル（ｐＩＩＩおよびｐＶＩＩＩ外被タンパク質リーダー配列など）を発現ベクターにおいて使用し、Ｆａｂポリペプチドをペリプラズム空間の酸化環境に配置する。そこでは、シャペロン様酵素によって正しいＦａｂのフォールディングが助長され得、したがって正しいジスルフィド結合の形成が可能となり得る。初期の一夜培養は３０℃に設定され得る。続いて、この細菌培養物に対し、低濃度のＩＰＴＧ（１ｍＭ、０．５ｍＭまたは０．１ｍＭ）を用いてＦａｂ産生を誘導させると、ｌａｃオペロンが誘導され、Ｆａｂ遺伝子の翻訳が開始され得る。温度が２２〜２３℃まで低下され得る。ペリプラズムフォールディング機構の過負を回避するため、低ＩＰＴＧおよび低温の両方により、大腸菌タンパク質の合成を遅滞させる。次いで、細胞が低速遠心分離（約４０００ｇ）によって回収され得、ペリプラズム抽出が行われ得る。ペリプラズム抽出は、主に、細菌の細胞壁の外側を軽度の浸透圧ショックによって漏出性し、Ｆａｂがペリプラズムから周囲の培地中に逸出することを可能にすることを目的とした温和な浸透圧放出プロセスである。抽出後、細胞は、次いで高速（＞１５０００ｇ）で遠心分離され得、放出された可溶性Ｆａｂを含有する上清みをアフィニティクロマトグラフィーのために確保される。
上記の特定の実施形態では、アフィニティクロマトグラフィーは以下のとおりであり得る：プロテインＧ樹脂を用いたアフィニティ精製により、Ｆａｂのフォールディングされた定常領域が、中性ｐＨで選択的に結合される（典型的には、ＰＢＳまたはＨＢＳを約７．０〜７．４で使用）。結合されたＦａｂは、酸性ｐＨ（典型的には、グリシン−ＨＣｌ，ｐＨ２．７〜４．０を使用）下で放出させ、Ｆａｂが酸性ｐＨに曝露されることを最小限にするために１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基（ｐＨ９）を入れたチューブ内に溶出させ得る。あるいはまた、ペリプラズム抽出による抽出物は全細胞ライセートと比べて比較的清浄であるため、ニッケルアフィニティカラムを用いて、Ｈｉｓ−タグを有するＦａｂを精製してもよい。どちらの場合も、溶出されたＦａｂは、保存バッファー（典型的にはＰＢＳ、または任意の好ましい配合バッファー）にバッファー交換される（例えば、透析または３０ｋＤ ＭＷカットオフフィルターを用いた遠心濾過により）。試料は、解析用サイズ排除（ＳＥ）ＨＰＬＣを用いて解析され得、一般的には、＞９５％所望の生成物からなる単一のピークが示される。所望により、オルソゴナル型の方法（カチオン（ＣＥＸ）またはアニオン交換（ＡＥＸ）または疎水性相互作用（ＨＩＣ）クロマトグラフィーなど）を用いて、さらなる洗練を行ってもよい。
したがって、特定の実施形態では、開示したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの発現に使用される発現ベクターは、ファージ外被タンパク質ｐＩＩＩの配列もしくはｐＶＩＩＩリーダー配列、または発現されたアンタゴニストを細菌ペリプラズム内に輸送（ｅｘｐｏｒｔ）するための他の輸送リーダー配列を含むものである。特定の実施形態において、これは、Ｆａｂ発現用のものである。特定の実施形態において、本発明は、（ａ）本明細書に記載のベクターを細胞内に挿入すること（具体的な実施形態では、該ベクターはＦａｂをコードしている）、ここで、該ベクターは、ファージ外被タンパク質ＰＩＩＩまたはｐＶＩＩＩリーダー配列を含む、（ｂ）該細胞をＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの生成に適切な条件下で培養すること、および（ｃ）主に細胞壁の外側を破壊してペリプラズムの内容物を放出させ、かつ細胞内の内容物による夾雑を最小限にするための温和な溶解条件を用いたペリプラズム抽出によって、生成されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを単離することを含む、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの作製方法を包含する。特定の実施形態において、これに、さらに、（ｉ）プロテインＧに対する定常ドメインの親和性（正しくフォールディングされたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト（Ｆａｂなど）を精製するため）、（ｉｉ）ニッケルアフィニティカラムに対するＨｉｓ−タグの親和性、または（ｉｉｉ）他の適当な精製手法によってＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを精製することを含めてもよい。次いで、この後に、バッファー交換したＦａｂまたは単離したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを、最終生成物のＱＣのためにＳＤＳ−ＰＡＧＥ、解析用ＳＥ−ＨＰＬＣまたは質量分析を用いて解析してもよい。
元の抗体の特異性を保持している他の抗体分子を組換え産生させるために利用可能な手法も存在している。その特定の例は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡまたはＣＤＲを、別の抗体分子の定常領域、または定常領域とフレームワーク領域、または単純にフレームワーク領域内に導入するものである。例えば、欧州特許第１８４１８７号明細書、英国特許第２１８８６３８号明細書、および欧州特許第２３９４００号明細書を参照のこと。これらの開示は引用により本明細書に組み込まれる。抗体分子（キメラ抗体を含む）のクローニングおよび発現は文献に記載されている。例えば、欧州特許第０１２０６９４号明細書および同第０１２５０２３号明細書を参照のこと。これらの開示は引用により本明細書に組み込まれる。
本発明による抗体分子は、一例において、既知の手法を用いて生成させ、次いで、本明細書において特定した特性についてスクリーニングされ得る。モノクローナル抗体の調製のための基本的な手法は、文献に記載されている。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）を参照のこと。その開示は引用により本明細書に組み込まれる。完全ヒトモノクローナル抗体は、利用可能な方法によって作製され得る。このような方法としては、なんら限定されないが、免疫機構を有する遺伝子操作マウス系統の使用が挙げられ、該マウスは、マウス抗体遺伝子が不活化されており、代わりに機能的ヒト抗体遺伝子のレパートリーに置き換えられているが、マウス免疫機構の他の成分は変化されていない。かかる遺伝子操作マウスにより、天然のインビボ免疫応答および親和性成熟プロセスが可能になり、それにより高親和性の完全ヒトモノクローナル抗体が得られる。この技術は当該技術分野でよく知られており、種々の刊行物、例えば限定されないが、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８７７，３９７号、同第５，６６１，０１６号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７４，２９９号、同第５，７７０，２４９号（ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌに譲渡、「ＵｌｔｒａＭａｂ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ」の傘下のＭｅｄａｒｅｘから入手可能である）、ならびに米国特許第５，９３９，５９８号、同第６，０７５，１８１号、同第６，１１４，５９８号、同第６，１５０，５８４および関連ファミリーメンバー（Ａｂｇｅｎｉｘに譲渡、そのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を開示）（これらの開示は引用により本明細書に組み込まれる）に充分に詳述されている。また、ＫｅｌｌｅｒｍａｎおよびＧｒｅｅｎ，２００２ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５９３−５９７、ならびにＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＆ Ｓｔｅｆａｎ，２００１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌｓ（これらの開示は引用により本明細書に組み込まれる）の概説も参照のこと。
あるいはまた、潜在的ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを有するライブラリーまたは任意の抗体分子ライブラリーをＰＣＳＫ９と接触させ、特異的結合性を示し得るものを選択してもよい。次いで、適正な機能性（例えば、細胞内ＬＤＬ取込みのＰＣＳＫ９依存性阻害の阻害）を確実にするため、機能試験が行われ得る。富化手法を使用し、ライブラリーからタンパク質特異的分子を選択するために当業者に利用可能な種々の手法が存在し、限定されないが、以下のものが挙げられる：ファージディスプレイ（例えば、米国特許第７，１７５，９８３号および同第７，１１７，０９６号、国際公開第０３／０９９９９９号に開示されたＡｂｍａｘｉｓの技術、ならびにＷａｎｇら，２０１０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９５：１０８８−１１０１、ならびに米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，７３３，７４３号、同第５，８７１，９０７号、同第５，８７２，２１５号、同第５，８８５，７９３号、同第５，９６２，２５５号、同第６，１４０，４７１号、同第６，２２５，４４７号、同第６，２９１，６５０号、同第６，４９２、１６０号、同第６，５２１，４０４号、同第６，５４４，７３１号、同第６，５５５，３１３号、同第６，５８２，９１５号、同第６，５９３，０８１、ならびに他の米国ファミリーメンバーおよび／または英国特許第９２０６３１８号明細書（１９９２年５月２４日出願）の優先権を主張する出願に開示された Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（「ＣＡＴ」）を参照のこと。また、Ｖａｕｇｈｎら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０９−３１４も参照のこと）、リボソームディスプレイ（例えば、ＨａｎｅｓおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９７ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４９３７−４９４２参照）、細菌ディスプレイ（例えば、Ｇｅｏｒｇｉｏｕら，１９９７ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：２９−３４参照）および／または酵母ディスプレイ（例えば、Ｋｉｅｋｅら，１９９７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０：１３０３−１３１０、およびＷａｎｇら，２０１０ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５４：１１−１９参照）。先のものの開示は、引用により本明細書に組み込まれる。ライブラリーは、例えば、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする発現された核酸またはその断片が、バクテリオファージ粒子表面上にディスプレイされるもの、および自身の表面上にディスプレイされるものであり得る。次いで、核酸は、所望の活性レベルを示すバクテリオファージ粒子から単離され得、該核酸が所望のアンタゴニストの開発に使用され得る。ファージディスプレイは充分に文献に記載されている。例えば、Ｗａｎｇら，２０１０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９５：１０８８−１１０１、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＆ Ｓｔｅｆａｎ（上掲）および国際公開第９２／０１０４７号を参照のこと。これらの開示は引用により本明細書に組み込まれる。具体的に抗体分子に関して、本発明による個々の重鎖または軽鎖のクローンを使用し、それぞれ、相互作用して重鎖と軽鎖が結合された分子を形成し得る相補的な重鎖または軽鎖のスクリーニングを行ってもよい。例えば、国際公開第９２／０１０４７号を参照のこと。当業者に利用可能な任意のパニング方法が、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの同定に使用され得る。これを行うための別の特定の方法は、溶液中の標的抗原（例えば、ビオチニル化した可溶性ＰＣＳＫ９）に対してパニングし、次いで、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト−ファージ複合体をストレプトアビジンコート磁気ビーズ上に捕捉し、次いで、これを洗浄して非特異的結合ファージを除去することである。次いで、捕捉されたファージはビーズから、本明細書に記載のようなプレート表面からの回収と同様にして回収され得る。
ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、当業者に利用可能な手法によって精製され得る。該当するアンタゴニスト調製物、腹水、ハイブリドーマ培養液または関連試料の力価は、種々の血清学的または免疫学的アッセイ（限定されないが、沈降、受動凝集、酵素免疫測定法（「ＥＬＩＳＡ」）手法およびラジオイムノアッセイ（「ＲＩＡ」）手法が挙げられる）によって測定され得る。
本発明は、一部において、本明細書に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを、ＰＣＳＫ９機能をアンタゴナイズすることために使用する方法に関する。前記方法は、以下にさらに詳細に記載する。用語「アンタゴナイズすること」の使用は、本出願書類全体を通して、ＰＣＳＫ９の１つ以上の機能に対抗する、阻害する、反作用する、中和する、または抑制する作用をいう。ＰＣＳＫ９関連機能的特性の１つ以上の阻害または拮抗作用は、当該技術分野で知られた方法論に従って容易に測定され得る（例えば、Ｂａｒａｋ ＆ Ｗｅｂｂ，１９８１ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９０：５９５−６０４；Ｓｔｅｐｈａｎ ＆ Ｙｕｒａｃｈｅｋ，１９９３ Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３４：３２５３３０；およびＭｃＮａｍａｒａら，２００６ Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３６９：１５８−１６７）ならびに本明細書に記載のものを参照のこと。該阻害または拮抗作用は、該アンタゴニストの非存在下で見られるもの、または例えば、無関連の特異性の対照アンタゴニストが存在している場合に見られるものと比べてＰＣＳＫ９活性の減少が達成されるものである。好ましくは、本発明によるＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストはＰＣＳＫ９機能発揮を、測定したパラメータ（例えば、限定されないが、本明細書において開示した活性）の少なくとも１０％の減少、より好ましくは、測定したパラメータの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および９５％の減少が認められる点までアンタゴナイズするものである。ＰＣＳＫ９機能発揮のかかる阻害／拮抗作用は、ＰＣＳＫ９機能発揮が、少なくとも一部において、被検体にマイナスの影響を及ぼしている特定の表現型、疾患、障害もしくは病状の一因となっている場合に特に有効である。
一態様において、本発明は、ＰＣＳＫ９によって影響され得る（すなわち、ＬＤＬ受容体を発現するおよび／または含む）細胞、細胞集団または組織試料を、本明細書に開示したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストと、存在するとき前記アンタゴニストがＰＣＳＫ９に結合し、細胞内ＬＤＬ取込みのＰＣＳＫ９の阻害を阻害することが可能な条件下で接触させることを含む、ＰＣＳＫ９の活性をアンタゴナイズする方法を提供する。本発明の特定の実施形態は、細胞がヒト細胞である、かかる方法を含む。
別の態様において、本発明は、被検体に治療有効量の本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを投与することを含む、被検体においてＰＣＳＫ９の活性をアンタゴナイズする方法を提供する。特定の実施形態において、ＰＣＳＫ９機能をアンタゴナイズする方法は、ＰＣＳＫ９関連の疾患、障害または病状、あるいはまた、ＰＣＳＫ９アンタゴニストの効果の恩恵を被り得る疾患、障害または病状の処置のためのものである。その医薬は、ＰＣＳＫ９活性と関連している病状、またはＰＣＳＫ９の機能発揮が特定の被検体に対して禁忌である病状を示す被検体（１人または複数）において有用であり得る。選択された実施形態では、該病状は高コレステロール血症、冠動脈性心疾患、メタボリックシンドローム、急性冠症候群または関連病状であり得る。
したがって、本発明では、ＰＣＳＫ９機能をアンタゴナイズすることが望ましい種々の処置方法における本明細書に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの使用が想定される。該処置方法は、本質において予防的であっても治療的であってもよい。特定の実施形態において、本発明は、被検体に治療有効量の本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを投与することを含む、ＰＣＳＫ９活性と関連／起因している、またはＰＣＳＫ９の機能発揮が特定の被検体に対して禁忌である病状の処置方法に関する。選択された実施形態では、該病状は高コレステロール血症、冠動脈性心疾患、メタボリックシンドローム、急性冠症候群または関連病状であり得る。
本発明による処置方法は、個体に、治療（または予防）有効量の本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを投与することを含む。量に関する用語「治療（上）有効」または「予防（上）有効」の使用は、意図される投薬量で所望の治療効果／予防効果を所望の期間、得るのに必要な量をいう。所望の効果は、例えば、処置対象の病状と関連している少なくとも１つの症状の改善であり得る。このような量は、当業者には認識されるように、種々の要素、例えば限定されないが、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の効果を誘発できるＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの能力に応じて異なる。応答は、インビトロアッセイ、インビボ非ヒト動物試験によって記録され得る、および／または臨床試験によりさらにサポートされ得る。
本発明は、コレステロールまたは脂質の恒常性の障害、ならびにこれに関連している障害および合併症、例えば、高コレステロール血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、シトステロール血症、アテローム性動脈硬化、動脈硬化、冠動脈性心疾患、メタボリックシンドローム、急性冠症候群、血管炎症、黄色腫および関連病状を処置または予防するための方法を提供する。
また、本発明は、心臓疾患のリスクの増大と関連している血中コレステロールマーカーを改善するための方法を提供する。このようなマーカーとしては、限定されないが、高い総コレステロール、高ＬＤＬ、ＨＤＬに対する総コレステロールの高比率、およびＨＤＬに対するＬＤＬの高比率が挙げられる。
一般に、総コレステロールは、２００ｍｇ／ｄＬ未満を望ましいとみなし、２００〜２３９ｍｇ／ｄＬを高いボーダーラインとみなし、２４０ｍｇ／ｄＬ以上を高いとみなす。例えば、本発明は、治療有効量の本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを投与することにより、総コレステロールを例えば約２００ｍｇ／ｄＬ以下まで低減させるための方法を含む。
一般に、血中ＬＤＬレベルは、１００ｍｇ／ｄＬ未満を最適とみなし、１００〜１２９ｍｇ／ｄＬをほぼ最適／最適以上よりとみなし、１３０〜１５９ｍｇ／ｄＬを高いボーダーラインとみなし、１６０〜１８９ｍｇ／ｄＬを高いとみなし、１９０ｍｇ／ｄＬ以上を非常に高いとみなす。例えば、本発明は、治療有効量の本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを投与することにより、ＬＤＬを例えば約１００ｍｇ／ｄＬ未満まで低減させるための方法を含む。
一般に、正常とみなされるＨＤＬレベルは少なくとも３５〜４０ｍｇ／ｄＬである。例えば、本発明は、治療有効量の本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片を投与することにより、ＨＤＬを例えば約３５〜４０ｍｇ／ｄＬ以上まで増大させるための方法を含む。
心臓疾患リスクの別の指標は、ＨＤＬに対する総コレステロールの比率である。一般に、心臓疾患の極低リスクは、比率＜３．４（男性））または＜３．３（女性）と相関しており、低リスクは比率４．０（男性）または３．８（女性）と関連しており、平均リスクは比率５．０（男性）または４．５（女性）と関連しており、中等度リスクは比率９．５（男性）または７．０（女性）と関連しており、高リスクは比率＞２３（男性）または＞１１（女性）と関連している。例えば、本発明は、治療有効量の本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを投与することにより、ＨＤＬに対する総コレステロールの比率を例えば約４．５未満または５．０未満まで低減させるための方法を含む。
心臓疾患リスクのさらなる指標は、ＨＤＬに対するＬＤＬの比率である。一般に、極低リスクは比率１（男性）または１．５（女性）と関連しており、平均リスクは比率３．６（男性）または３．２（女性）と関連しており、中等度リスクは比率６．３（男性）または５．０（女性）と関連しており、高リスクは比率８（男性）または６．１（女性）と関連している。例えば、本発明は、治療有効量の本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを投与することにより、例えば、約３．２以下または３．６以下までのＨＤＬに対するＬＤＬの比率のための方法を含む。
ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは医薬組成物として投与され得る。したがって、本発明は、本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストおよび薬学的に許容され得る担体（例えば限定されないが、賦形剤、希釈剤、安定剤、緩衝剤、または該アンタゴニストの投与が助長されるように設計された択一的物質）を、処置対象の個体に所望される形式および量で含む薬学的に許容され得る組成物を提供する。
医薬組成物は、当該技術分野で知られた任意の数のストラテジーによって製剤化され得る。例えば，ＭｃＧｏｆｆ ａｎｄ Ｓｃｈｅｒ，２０００ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ／Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｉｎ−ＭｃＮａｌｌｙ，Ｅ．Ｊ．編．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ；ｐｐ．１３９−１５８；Ａｋｅｒｓ ＆ Ｄｅｆｉｌｉｐｐｉｓ，２０００，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｉｎ−Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ；ｐｐ．１４５−１７７；Ａｋｅｒｓら，２００２，Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：４７−１２７を参照のこと。患者への投与に適した薬学的に許容され得る組成物は、生物学的活性が保持されるとともに、許容され得る温度範囲での保存時の最大安定性も促進される製剤の状態で有効量のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを含むものである。
該アンタゴニストの薬学的に許容され得る組成物は、具体的な実施形態では、液状もしくは固形形態、またはガス粒子もしくはエーロゾル化粒子の形態であり得る。液状または固形の製剤を作製するための任意の手法が使用され得る。かかる手法は、充分に当業者の能力の範囲内である。固形製剤は、任意の利用可能な方法、例えば限定されないが、凍結乾燥、噴霧乾燥、または超臨界流体技術による乾燥によって作製され得る。経口投与のための固形製剤は、該アンタゴニストを、患者に対して所定の量で所定の期間以内に到達可能にする任意の形態であり得る。経口製剤には、いくつかの固形製剤、例えば限定されないが、錠剤、カプセル剤または散剤の形態が採用され得る。あるいはまた、固形製剤を凍結乾燥させ、投与前に、当業者によく知られた方法による単回投与または複数回投与のいずれかのための液剤にしてもよい。アンタゴニスト組成物は、一般的に、生物学的に関連性のあるｐＨ範囲内で製剤化するのがよく、保存中において適正なｐＨ範囲が維持されるように緩衝化してもよい。液状製剤および固形製剤はいずれも、一般的に、長期間の安定性を保持するため、低温（例えば、２〜８℃）保存が必要とされる。製剤化されたアンタゴニスト組成物（特に、液状製剤）には、保存時のタンパク質分解を抑制または最小限にするための静菌剤、例えば限定されないが、有効濃度（例えば、≦１％ｗ／ｖ）のベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール、メチルパラベン、および／またはプロピルパラベンが含有され得る。静菌剤は一部の患者には禁忌であり得る。したがって、凍結乾燥製剤を、かかる成分を含有するか、または含有しないかのいずれかである溶液中で再構成させてもよい。緩衝液状または固形いずれかのアンタゴニスト製剤に、さらなる成分、例えば限定されないが、抗凍結剤としての糖類（例えば、限定されないが、ポリヒドロキシ炭化水素（ソルビトール、マンニトール、グリセロールおよびダルシトールなど）および／または二糖類（スクロース、ラクトース、マルトースもしくはトレハロースなど））ならびに、一部の場合では、該当する塩類（例えば、限定されないが、ＮａＣｌ、ＫＣ１、またはＬｉＣｌ）を添加してもよい。長期保存で粘結するかかるアンタゴニスト製剤（特に、液状製剤）は、例えば２〜８℃またはそれ以上の温度での長期安定性を向上させるとともに、製剤を非経口注射に有用なものとするため、有用な範囲の総オスモル濃度に依存性である。適宜、保存料、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤および／または他の添加剤を含めてもよい。製剤には、二価カチオン（例えば、限定されないが、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、およびＭｎＣｌ２）、および／または非イオン系界面活性剤（例えば、限定されないが、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ）、ポリソルベート−６０（Ｔｗｅｅｎ ６０ＴＭ）、ポリソルベート−４０（Ｔｗｅｅｎ ４０ＴＭ）、およびポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ ２０ＴＭ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、例えば限定されないが、Ｂｒｉｊ ５８ＴＭ、Ｂｒｉｊ３５ＴＭ、ならびに他のもの、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ＴＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ＴＭ、ＮＰ４０ＴＭ、Ｓｐａｎ ８５ およびＰｌｕｒｏｎｉｃシリーズの非イオン系界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ １２１））が含有され得る。かかる成分の任意の組合せは本発明の特定の実施形態を構成する。
液状形式の医薬組成物には、液状担体、例えば、水、石油、動物性油、植物油、鉱油、または合成油が含められ得る。また、液状形式には、生理食塩水液、デキストロースもしくは他の糖類溶液またはグリコール（エチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなど）も含められ得る。
好ましくは、医薬組成物は、パイロジェンフリーであり、適当なｐＨ、張度および安定性を有する非経口に許容され得る水性液剤の形態であり得る。
医薬組成物は、等張性ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム注射用液、リンゲル液注射用液、または乳酸加リンゲル液注射用液中での希釈後に投与するために製剤化されるものであってもよい。
本発明の一態様は、（ｉ）約５０〜約２００ｍｇ／ｍＬの本明細書に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、（ｉｉ）ポリヒドロキシ炭化水素（例えば、限定されないが、ソルビトール、マンニトール、グリセロールおよびダルシトール）および／または二糖類（例えば、限定されないが、スクロース、ラクトース、マルトースおよびトレハロース）、前記ポリヒドロキシ炭化水素および／または二糖類は合わせて製剤の約１％〜約６％（重量／容量）（「ｗ／ｖ」）である、（ｉｉｉ）約５ｍＭ〜約２００ｍＭのヒスチジン、イミダゾール、医薬組成物の貯蔵寿命中のｐＨドリフトを抑制するための緩衝剤として、および張度改良剤としての機能を果たすリン酸塩または酢酸塩、（ｉｖ）約５ｍＭ〜約２００ｍＭのアルギニン、プロリン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはメチオニン（凝集に対する反作用のため）、（ｖ）約５．５〜約７．５の範囲のｐＨが得られるのに充分な量の約０．０１Ｍ〜約０．１Ｍの塩酸（「ＨＣｌ」）、ならびに（ｖｉ）液状担体、限定されないが、滅菌水、石油、動物性油、植物油、鉱油、合成油、生理食塩水液、デキストロースもしくは他の糖類溶液またはグリコール（エチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなど）などを含む医薬組成物であり、ここで、前記医薬組成物は約５．５〜約７．５の範囲のｐＨを有し、前記医薬組成物は、任意選択で、約０．０１％〜約１％ｗ／ｖの非イオン系界面活性剤配合物（例えば、限定されないが、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ）、ポリソルベート−６０（Ｔｗｅｅｎ ６０ＴＭ）、ポリソルベート−４０（Ｔｗｅｅｎ ４０ＴＭ）、およびポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ ２０ＴＭ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、例えば限定されないが、Ｂｒｉｊ ５８ＴＭ、Ｂｒｉｊ３５ＴＭ、ならびに他のもの、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ＴＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ＴＭ、ＮＰ４０ＴＭ、Ｓｐａｎ ８５ およびＰｌｕｒｏｎｉｃシリーズの非イオン系界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ １２１））を含む。
ＨＣｌは、遊離の酸、ヒスチジン−ＨＣｌまたはアルギニン−ＨＣｌとして添加され得る。ヒスチジン−ＨＣｌまたはアルギニン−ＨＣｌとして供給される場合、ＨＣｌ形態中のヒスチジンまたはアルギニンの総量が上記に明示した値であるべきである。したがって、ヒスチジンおよび／またはアルギニンの量に応じて、適宜、該ＨＣｌの一部または全部がヒスチジン−ＨＣｌおよび／またはアルギニン−ＨＣｌとして供給され得る。本明細書において開示した量に関する用語「約」の使用は、明示した数値の１０％以内を示すことを意味する。示されたある範囲（例えば「約５０〜約２００」）は、前記範囲内の各数値を相違する実施形態として明示的に含む。したがって、上記の例において、限定されないが、５０、１００、１２５、１５０および２００を有するなどの実施形態は、本明細書における特定の実施形態を構成する。本明細書において開示した医薬組成物は、投与様式にかかわらず一般的な適用性を有する。特定の実施形態において、開示した医薬組成物は、液剤として、または凍結乾燥形態の再構成時の皮下投与に有用である。開示した製剤に使用され得るタンパク質としては、治療的有益性をもたらす目的で送達される共有結合アミノ酸残基を含むことが特徴である任意の高分子タンパク質またはポリペプチドが挙げられる。本発明の組成物に有用なタンパク質としては、限定されないが、本明細書において規定した任意の抗体分子または任意の非抗体もしくは非免疫グロブリンタンパク質、ペプチド、ペグ化タンパク質および融合タンパク質が挙げられる。
本発明の特定の態様は、（ｉ）約５０〜約２００ｍｇ／ｍＬの本明細書に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、（ｉｉ）約１％〜約６％（具体的な実施形態では、約２％〜約６％）ｗ／ｖのマンニトール、トレハロースまたはスクロース、（ｉｉｉ）約１０ｍＭ〜約１００ｍＭのヒスチジン、（ｉｖ）約２５ｍＭ〜約１００ｍＭのアルギニンまたはプロリン、（ｖ）約５．８〜約７の範囲のｐＨが得られるのに充分な量の約０．０２Ｍ〜約０．０５Ｍの塩酸（「ＨＣｌ」）、および（ｖｉ）液状担体、例えば限定されないが、滅菌水、石油、動物性油、植物油、鉱油、合成油、生理食塩水液、デキストロースもしくは他の糖類溶液またはグリコール（エチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなど）を含む、上記に開示した医薬組成物に関する。ここで、前記医薬組成物は約５．８〜約７の範囲のｐＨを有し、前記医薬組成物は、任意選択で、約０．０１％〜約１％ｗ／ｖの非イオン系界面活性剤配合物（例えば、限定されないが、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ）、ポリソルベート−６０（Ｔｗｅｅｎ ６０ＴＭ）、ポリソルベート−４０（Ｔｗｅｅｎ ４０ＴＭ）、およびポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ ２０ＴＭ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、例えば限定されないが、Ｂｒｉｊ ５８ＴＭ、Ｂｒｉｊ３５ＴＭ、ならびに他のもの、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ＴＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４ＴＭ、ＮＰ４０ＴＭ、Ｓｐａｎ ８５およびＰｌｕｒｏｎｉｃシリーズの非イオン系界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ １２１））を含む。
特定の実施形態では、（ｉ）５０〜２００ｍｇ／ｍＬの本明細書に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、（ｉｉ）約１％〜約６％（具体的な実施形態では、約２％〜約６％）ｗ／ｖのマンニトール、トレハロースまたはスクロース、（ｉｉｉ）約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭのヒスチジン、（ｉｖ）約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭのアルギニンまたはプロリン、（ｖ）約５．８〜約６．５の範囲のｐＨが得られるのに充分な量の約０．０３Ｍ〜約０．０５Ｍの塩酸（「ＨＣｌ」）、および（ｖｉ）液状担体、例えば限定されないが、滅菌水、石油、動物性油、植物油、鉱油、合成油、生理食塩水液、デキストロースもしくは他の糖類溶液またはグリコール（エチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなど）を含む医薬組成物を提供し、ここで、前記医薬組成物は約５．８〜約６．５の範囲のｐＨを有し、前記医薬組成物は、任意選択で、約０．０１％〜約１％ｗ／ｖのポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ）またはポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ ２０ＴＭ）を含む。
本明細書における特定の実施形態では、（ｉ）５０〜２００ｍｇ／ｍＬの本明細書に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、（ｉｉ）約１％〜約６％（具体的な実施形態では、約２％〜約６％）ｗ／ｖのスクロース、（ｉｉｉ）約２５ｍＭ〜約１００ｍＭのヒスチジン、（ｉｖ）約２５ｍＭ〜約１００ｍＭのアルギニン、（ｖ）約６のｐＨが得られるのに充分な量の約０．０４０Ｍ〜約０．０４５Ｍの塩酸（「ＨＣｌ」）、および（ｖｉ）滅菌水を含む医薬組成物を提供し、ここで、前記医薬組成物は約６のｐＨを有し、前記医薬組成物は、任意選択で、約０．０１％〜約１％ｗ／ｖのポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ）またはポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ ２０ＴＭ）を含む。その特定の実施形態において、ヒスチジンとアルギニンのレベルは、互いの２５ｍＭの以内であり、他の実施形態では同じである。
本明細書における特定の実施形態では、（ｉ）５０〜２００ｍｇ／ｍＬの本明細書に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、（ｉｉ）以下のうちの１つの量のスクロース、ヒスチジンおよびアルギニン：（ａ）約１％ｗ／ｖのスクロース、約１０ｍＭのヒスチジンおよび約２５ｍＭのアルギニン、（ｂ）約２％ｗ／ｖのスクロース、約２５ｍＭのヒスチジンおよび約２５ｍＭのアルギニン、（ｃ）約３％ｗ／ｖのスクロース、約５０ｍＭのヒスチジンおよび約５０ｍＭのアルギニン、または（ｄ）約６％ｗ／ｖのスクロース、約１００ｍＭのヒスチジンおよび約１００ｍＭのアルギニン、（ｉｉｉ）約０．０４ｍｏｌ、あるいはまた、約１．４６ｇのＨＣｌ、および（ｉｖ）滅菌水を含む医薬組成物を提供し、ここで、前記医薬組成物は約６のｐＨを有し、前記医薬組成物は、任意選択で、約０．０１％〜約１％ｗ／ｖのポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ）またはポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ ２０ＴＭ）を含む。本明細書における特定の実施形態は、上記の（ｉｉ）のスクロース、ヒスチジンおよびアルギニンの量が（ｃ）または（ｄ）に記載のものである。スクロース、ヒスチジンおよびアルギニンの量が（ｉｉ）の（ｃ）に明示したものである上記の医薬製剤が使用された特定の実施形態は、生理学的値３００ｍＯｓｍと類似したオスモル濃度をもたらし、液状形態および凍結乾燥形態のいずれにおいても規定の安定性をもたらすことがわかった。
本明細書における特定の実施形態では、５０〜２００ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の種々のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストのいずれか１つを含む記載の医薬組成物を提供する。例示の目的のためであって、限定と解釈されるべきでないが、相違する一実施形態は、以下の：（ａ）配列番号：５５８を含む軽鎖、および（ｂ）配列番号：５５６を含む重鎖を含むＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを含む上記の医薬製剤であり、ここで、前記ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、細胞内ＬＤＬ取込みのＰＣＳＫ９の阻害をアンタゴナイズする抗体分子である。さらなる実施形態は：（ａ）配列番号：５６６を含む軽鎖、および（ｂ）配列番号：５６４を含む重鎖を含むＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを含む上記の医薬製剤であり、ここで、前記ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、細胞内ＬＤＬ取込みのＰＣＳＫ９の阻害をアンタゴナイズする抗体分子である。
本明細書における具体的な実施形態は、凍結乾燥させて再構成させる上記による医薬組成物である。特定の実施形態において、前記凍結乾燥させて再構成させた液剤中の前記タンパク質の濃度は、先に凍結乾燥させた組成物中よりも２倍高くまでである。特定の実施形態において、凍結乾燥および／または再構成させる医薬組成物中の該タンパク質またはＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの濃度は約５０ｍｇ／ｍＬ〜約３００ｍｇ／ｍＬの範囲である。凍結乾燥医薬組成物を再構成させるのに有用な希釈剤としては、限定されないが、滅菌水、静菌注射用水（「ＢＷＦＩ」）、リン酸緩衝生理食塩水、滅菌生理食塩水液、生理食塩水液、リンゲル液またはデキストロース液が挙げられ、特定の実施形態では、０．０１〜１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ）またはポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ ２０ＴＭ）が含有され得る。特定の実施形態において、凍結乾燥粉剤は、元の容量の１／６０．２倍（または０．１６７ｍＬ）から１倍（ｌｍＬ）までで再構成され得る。
本発明の例示的な実施形態は、安定な本明細書に記載の医薬組成物である。本発明の他の実施形態は、凍結乾燥と再構成に対して安定な本明細書に記載の医薬組成物である。凍結乾燥組成物の調製には、種々の方法が当業者に利用可能である。例えば、Ｍａｒｔｉｎ ＆ Ｍｏ，２００７「Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ」Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｖを参照のこと。「安定な」は、本明細書で用いる場合、該タンパク質またはＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの、その物理的もしくは化学的安定性、コンホメーションの完全性を保持する性質、または対照試料と比べて、４〜３７℃の範囲の温度で少なくとも約３０日間に示される変性、タンパク質クリッピング、凝集、断片化、酸性バリアントの形成もしくは生物学的活性の低下が少ないという能力をいう。他の実施形態では、上記の温度で３ヶ月間、６ヶ月間、１２ヶ月間、２年間まで、またはそれより長期間安定に維持される。特定の実施形態では、製剤は、２〜８℃で少なくとも６ヶ月間、好ましくは、１２ヶ月間、２年間またはそれより長期間（順に好ましい）有意な変化を示さないものである。特定の実施形態は、対照試料と比べて、２５〜４５℃（あるいはまた、２〜８℃）の範囲の温度で少なくとも約３０日間、３ヶ月間、６ヶ月間、１２ヶ月間、２年間またはそれより長期間に起こる変性、タンパク質クリッピング、凝集、断片化、酸性バリアントの形成または生物学的活性の低下が１０％未満、または具体的な実施形態では５％未満のものである。製剤の安定性は、当業者に知られたいくつかの手段によって試験され得、限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）（凝集および断片化の測定ため）、動的光散乱（ＤＬＳ）（濃縮試料粒径の測定ため）、キャピラリーＳＤＳ−ＰＡＧＥ（断片化の測定ため）およびキャピラリー等電点電気泳動法（ｃＩＥＦ）またはカチオン交換クロマトグラフィー（「ＣＥＸ」）（酸性バリアントの形成の測定ため）が挙げられる。タンパク質の安定性の解析に適した手法は当業者に充分理解されている：Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）およびＪｏｎｅｓ，１９９３ Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９−９０の概説を参照のこと。
本明細書に記載の医薬組成物は滅菌されたものであるべきである。これを行うのに種々の手法が当業者に利用可能であり、限定されないが、滅菌濾過膜に通す濾過が挙げられる。凍結乾燥させて再構成させる組成物が使用される特定の実施形態において、これは、凍結乾燥と再構成の前に行っても、後に行ってもよい。
アンタゴニスト治療薬の投与は充分当業者の技能の範囲であり（例えば、Ｌｅｄｅｒｍａｎら，１９９１ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４７：６５９−６６４；Ｂａｇｓｈａｗｅら，１９９１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ４：９１５−９２２を参照）、いくつかの要素、例えば限定されないが、使用される具体的なＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト、処置対象の患者、患者の体調、処置対象の面積、投与経路、および所望される処置に基づいて異なる。当業者である医師または獣医は、アンタゴニストの有効な治療量を決定し、処方することが容易にできよう。投薬量範囲は、宿主の体重に対して約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常には０．０５〜２５ｍｇ／ｋｇであり得る。例えば、投薬量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示の目的で、限定されないが、特定の実施形態では、５ｍｇ〜２．０ｇの用量が該アンタゴニストの全身送達に使用され得る。特定の実施形態において、提供される用量濃度は約８ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの範囲である。他の実施形態では、本発明における使用に想定される用量は、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬである。特定の実施形態において、用量は約０．１ｍＬ〜約１．５ｍＬであり、特定の実施形態（ｅｍｂｏｄｉｍｎｔ）では１ｍＬである。毒性なく有効性がもたらされる範囲内のアンタゴニスト濃度を得ることにおける最適精度には、標的部位（１つまたは複数）に対する薬物の利用可能性速度論に基づいたレジメンが必要とされる。これには、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの分布、平衡および排出の考慮を伴う。本明細書に記載のアンタゴニストは、適切な投薬量で単独で使用してもよい。あるいはまた、他の薬剤との共投与または逐次投与が望ましい場合もある。本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの治療的投与レジメン（ｒｅｇｉｍｅ）を、択一的な処置レジメンとともに提示することが可能である。例えば、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、他の薬物（治療的および／または予防的）と併用して、または該薬物とともに使用され得る。特定の実施形態において、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、コレステロール降下薬、例えば、コレステロール吸収阻害薬（例えば、Ｚｅｔｉａ（登録商標））ならびにコレステロール合成阻害薬（例えば、Ｚｏｃｏｒ（登録商標）およびＶｙｔｏｒｉｎ（登録商標））と併用して、または該薬物とともに使用される。本発明では、かかる併用が想定され、本発明の重要な実施形態を構成する。したがって、本発明は、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストが別の薬物（１種類または複数種）（治療的および／または予防的）、例えば限定されないが、コレステロール降下薬（コレステロール吸収阻害薬など）と同時、該薬物の後または該薬物の前に投与／送達される上記の処置方法に関する。
本明細書に記載の処置が可能な個体（被検体）としては、霊長類、ヒトおよび非ヒトが挙げられ、商業上または飼育上獣医学的に重要な任意の非ヒト哺乳動物または脊椎動物を含む。
ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは個体に、当該技術分野で認められた任意の投与経路、例えば限定されないが、経口投与、注射による投与（特定の実施形態としては、静脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射が挙げられる）、または吸入による投与、鼻腔内、もしくは経表面投与によって、単独で、または個体の処置が補助されるように設計された他の薬剤との併用のいずれかで投与され得る。また、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを、注射デバイス、ペン型注射器、無針デバイス、および皮下パッチ送達系で投与してもよい。投与経路は、当業者によって認識されるいくつかの考慮事項、例えば限定されないが、処置剤の所望の物理化学的特性に基づいて決定されるべきである。処置は、毎日、毎週、隔週もしくは毎月ベースで、または適切な量のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストが個体に所定の時点で所望の処置が奏功および維持されるように送達される任意の他のレジメンで施され得る。製剤は、単回用量で投与してもよく、１回以上の用量で隔離した時点で投与してもよい。
また、開示したアンタゴニストを、ＰＣＳＫ９関連の疾患、障害もしくは病状、あるいはまた、ＰＣＳＫ９アンタゴニストの効果の恩恵を被り得る疾患、障害もしくは病状の処置のための医薬の製造に使用する方法も想定される。該医薬は、ＰＣＳＫ９活性と関連している病状、またはＰＣＳＫ９の機能発揮が特定の被検体に対して禁忌である病状を示す被検体（１人または複数）において有用なものであり得る。選択された実施形態では、該病状は高コレステロール血症、冠動脈性心疾患、メタボリックシンドローム、急性冠症候群または関連病状であり得る。
また、本明細書に開示したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、ＰＣＳＫ９の診断方法としても使用され得る。選択された実施形態では、本発明は、試料（例えば、限定されないが、生物学的試料、例えば、血清または血液）中に存在するＰＣＳＫ９を同定またはそのレベルを定量する方法であって、該試料を本明細書に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストと接触させること、およびＰＣＳＫ９に対する結合をそれぞれ、検出または定量することを含む方法を包含する。ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、当業者に知られた種々のアッセイ形式において使用され得、キットの一部を構成するものであってもよい（キットの一般的な特徴は、以下にさらに詳細に記載する）。
さらに、本発明は、遺伝子療法の目的で開示した抗ＰＣＳＫ９アンタゴニストの投与を提供する。かかる方法により、被検体の細胞を、本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸で形質転換する。その結果、該核酸を含む被検体では、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストが内生的に生成される。
以前に、Ａｌｖａｒｅｚら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０８１−３０８７，２０００により、一本鎖の抗ＥｒｂＢ２抗体が被検体に、遺伝子療法アプローチを用いて導入された。Ａｌｖａｒｅｚら（上掲）によって開示された方法は、被検体への本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体をコードする核酸の導入に容易に適合され得る。
任意のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸が被検体に導入され得る。
該核酸は被検体の細胞に、当該技術分野で知られた任意の手段によって導入され得る。好ましい実施形態において、該核酸は、ウイルスベクターの一部として導入される。ベクターを誘導し得る好ましいウイルスの例としては、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、アルファウイルス、インフルエンザウイルス、および望ましい細胞向性を有する他の組換えウイルスが挙げられる。
様々な企業によって市販のウイルスベクターが作製されており、なんら限定されないが、Ａｖｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，Ｃａｌｉｆ．；ＡＡＶベクター）、Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ；レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶベクター、およびレンチウイルスベクター）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（レトロウイルスおよびバキュロウイルスベクター）、Ｇｅｎｏｖｏ，Ｉｎｃ．（Ｓｈａｒｏｎ Ｈｉｌｌ，Ｐａ．；アデノウイルスおよびＡＡＶベクター）、Ｇｅｎｖｅｃ（アデノウイルスベクター）、ＩｎｔｒｏＧｅｎｅ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；アデノウイルスベクター）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、およびヘルペスウイルスベクター）、Ｎｏｒｇｅｎ（アデノウイルスベクター）、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ；レンチウイルスベクター）、ならびにＴｒａｎｓｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ；アデノウイルス、ワクシニア、レトロウイルス、およびレンチウイルスベクター）が挙げられる。
ウイルスベクターの構築および使用のための方法は当該技術分野で知られている（例えば、Ｍｉｌｌｅｒら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０，１９９２を参照のこと）。好ましくは、ウイルスベクターは複製欠陥型、すなわち、自律的に複製することができず、したがって標的細胞において感染性でないものである。好ましくは、複製欠陥型ウイルスは最小限のウイルス、すなわち、そのゲノム内において、該ゲノムを封入してウイルス粒子を生成させるのに必要な配列のみを保持しているウイルスである。ウイルス遺伝子が完全またはほぼ完全に欠損している欠陥型ウイルスが好ましい。欠陥型ウイルスベクターの使用により、細胞に対して、該ベクターが他の細胞に感染し得ることを懸念せずに特定の局所領域内に投与することが可能になる。したがって、特定の組織を特異的に標的化することができる。
弱毒化または欠陥型のＤＮＡウイルス配列を含むベクターの例としては、限定されないが、欠陥型ヘルペスウイルスベクター（Ｋａｎｎｏら，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．６：１４７−１５４，１９９９；Ｋａｐｌｉｔｔら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ．７１：１２５−１３２，１９９７およびＫａｐｌｉｔｔら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃ．１９：１３７−１４７，１９９４）が挙げられる。
アデノウイルスは真核生物系ＤＮＡウイルスであり、これは、本発明の核酸が様々な細胞型に効率的に送達されるように修飾され得る。弱毒化アデノウイルスベクター（Ｓｔｒａｆｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０，１９９２に記載されたベクターなど）が、一部の場合において望ましい。種々の複製欠陥型アデノウイルスおよび最小限のアデノウイルスベクターが記載されている（ＰＣＴ国際公開第９４／２６９１４号、同第９４／２８９３８号、同第９４／２８１５２号、同第９４／１２６４９号、同第９５／０２６９７号および同第９６／２２３７８号）。本発明による複製欠陥型の組換えアデノウイルスは、当業者に知られた任意の手法によって調製され得る（Ｌｅｖｒｅｒｏら，Ｇｅｎｅ １０１：１９５，１９９１、欧州特許第１８５５７３号明細書、Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯ Ｊ．３：２９１７，１９８４、Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９，１９７７）。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、比較的小さい大きさのＤＮＡウイルスであり、安定で部位特異的な様式で、感染する細胞のゲノム内に組み込まれ得る。該ウイルスは、細胞の増殖、形態または分化に対してなんら効果を誘導することなく広範な細胞に感染することができ、ヒトの病態に関与しないようである。ＡＡＶから誘導されるインビトロおよびインビボでの遺伝子導入のためのベクターの使用が記載されている（Ｄａｌｙら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１３４３−１３４６，２００１，Ｌａｒｓｏｎら，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏ．４８９：４５−５７，２００１、ＰＣＴ国際公開第９１／１８０８８号および同第９３／０９２３９号、米国特許第４，７９７，３６８号明細書および同第５，１３９，９４１号明細書ならびに欧州特許第４８８５２８号明細書参照）。
別の実施形態では、該遺伝子は、例えば、米国特許第５，３９９，３４６号明細書、同第４，６５０，７６４号明細書、同第４，９８０，２８９号明細書、および同第５，１２４，２６３号明細書、Ｍａｎｎら，Ｃｅｌｌ ３３：１５３，１９８３、Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、６２：１１２０，１９８８、欧州特許第４５３２４２号明細書および同第１７８２２０号明細書に記載のようなレトロウイルスベクター内に導入され得る。レトロウイルスは組込み型ウイルスであり、これは分裂細胞に感染する。
レンチウイルスベクターは、本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする核酸を、いくつかの組織型、例えば、脳、網膜、筋肉、肝臓および血液に直接送達および持続的発現のための薬剤として使用され得る。該ベクターにより、このような組織の分裂細胞および非分裂細胞が効率的に形質導入され得、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの長期発現が維持され得る。概説については、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−８０，１９９８およびＫａｆｒｉら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３：３１６−３２６，２００１を参照のこと。レンチウイルスパッケージング細胞株が利用可能であり、当該技術分野で一般に知られている。該細胞株では、遺伝子療法のための高力価のレンチウイルスベクターの生成が助長される。一例は、テトラサイクリン誘導性ＶＳＶ−Ｇシュードタイプレンチウイルスパッケージング細胞株であり、１０６ＩＵ／ｍｌより高力価のウイルス粒子が少なくとも３〜４日間生成され得る。Ｋａｆｒｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：５７６−５８４，１９９９参照。誘導細胞株によって生成されたベクターは、インビトロおよびインビボでの非分裂細胞の効率的な形質導入の必要に応じて濃縮され得る。
シンドビスウイルスは、アルファウイルス属の構成員であり、１９５３年を初めに世界中の種々の箇所で発見されて以来、広く研究されている。アルファウイルス、具体的にはシンドビスウイルスに基づいた遺伝子形質導入は、インビトロで充分に研究されている（Ｓｔｒａｕｓら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５８：４９１−５６２，１９９４；Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：６４３９−６４４６，１９９３；Ｉｊｉｍａら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８０：１１０−１１８，１９９９ ａｎｄ Ｓａｗａｉら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｒ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２４８：３１５−３２３，１９９８参照）。アルファウイルスベクターは、その特性の多く（発現構築物の迅速な操作、高力価の感染性粒子ストックの生成、非分裂細胞の感染、高いレベル発現など）により、開発中の他のウイルス由来のベクター系の望ましい代替物となっている（Ｓｔｒａｕｓｓら，１９９４（上掲））。遺伝子療法のためのシンドビスウイルスの使用が報告されている（Ｗａｈｌｆｏｒｓら，Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．７：４７２−４８０，２０００およびＬｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｒｅｃｅｐ．Ｓｉｇ．Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．１９（１−４）：６７３−６８６，１９９９。
別の実施形態では、ベクターは細胞に、リポフェクションまたは他のトランスフェクション助長剤（ペプチド、ポリマーなど）によって導入され得る。合成カチオン脂質を使用し、マーカーコード遺伝子のインビボおよびインビトロトランスフェクションのためのリポソームが調製され得る（Ｆｅｉｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７，１９８７およびＷａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１−７８５５，１９８７）。核酸導入に有用な脂質化合物および組成物は、ＰＣＴ国際公開第９５／１８８６３号および同第９６／１７８２３号、ならびに米国特許第５，４５９，１２７号明細書に記載されている。
また、ベクターをインビボで裸のＤＮＡプラスミドとして導入することも可能である。遺伝子療法のための裸のＤＮＡベクターは所望の宿主細胞内に、当該技術分野で知られた方法、例えば、エレクトロポレーション、マイクロ注入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクター輸送体の使用によって導入され得る（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７，１９９２；Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２７２６−２７３０，１９９１参照）。プラスミドのトランスフェクションに一般的に使用される他の試薬としては、なんら限定されないが、ＦｕＧｅｎｅ、リポフェクチン、およびリポフェクタミンが挙げられる。また、受容体媒介性ＤＮＡ送達アプローチも使用され得る（Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４，１９８８）。米国特許第５，５８０，８５９号明細書および同第５，５８９，４６６号明細書には、トランスフェクション助長剤なしでの哺乳動物への外因性ＤＮＡ配列の送達が開示されている。最近、エレクトロトランスファー（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ）と称される比較的低電圧での高効率インビボＤＮＡ導入手法が報告された（Ｖｉｌｑｕｉｎら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１０９７，２００１；Ｐａｙｅｎら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２９：２９５−３００，２００１；Ｍｉｒ，Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５３：１−１０，２００１；ＰＣＴ国際公開第９９／０１１５７号、同第９９／０１１５８号および同第９９／０１１７５号）。
かかる遺伝子療法アプローチに適しており、本発明の抗ＰＣＳＫ９アンタゴニストをコードする核酸を含む医薬組成物は、本発明の範囲に含まれる。
別の態様において、本発明は、本発明のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを用いて、対象の試料中のＰＣＳＫ９を同定、単離、定量またはアンタゴナイズするための方法を提供する。ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストは、免疫化学的アッセイ、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学的アッセイ、免疫沈降、または当該技術分野で知られた他の免疫化学的アッセイ（例えば、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｇｏｅｒｓ編，Ｊ．１９９３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ参照）あるいは種々の精製プロトコルにおける研究用ツールとして使用してもよい。該アンタゴニストは、関連活性の容易な特定または測定が助長されるように標識が組み込まれていてもよく、または結合されていてもよい。当業者には、上記のプロトコルに有用であり得る種々の型の検出可能な標識（例えば、酵素、色素、または容易に検出可能であるか、もしくは容易に検出可能ななんらかの活性／結果をもたらすかのいずれかである他の適当な分子）が、すぐにわかるであろう。
本発明のさらなる態様は、本明細書において開示したＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストまたは医薬組成物および使用説明書を含むキットである。キットには、典型的には（そうである必要はないが）キットの内容物の意図される使用を示すラベル表示が含まれている。ラベル表示という用語は、キット上またはキットとともに提供された、あるいはキットに付随する任意の文書または記録された資料を含む。医薬組成物を凍結乾燥して提供する特定の実施形態では、キットには、製剤を液状形態に再構成するための滅菌水または生理食塩水が含まれ得る。特定の実施形態において、該水または生理食塩水の量は約０．１ｍｌ〜１．０ｍｌである。
以下の実施例は本発明を例示するために示し、本発明は該実施例に限定されない。
ＰＣＳＫ９タンパク質に対するＡＢＭＡＸＩＳ ＰＤＬ１ファージライブラリーのパニング
合成ヒトＦａｂライブラリーを、ヒトＰＣＳＫ９に対してパニングした。抗原タンパク質ＰＣＳＫ９を、Ｍａｘｉｓｏｒｐウェルストライプ（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｍｏｄｕｌｅｓ）上に、１−１０μｇ／ｍｌの濃度で４℃にて一晩コーティングした。抗原の多数のウェルは各ライブラリーについて調製した。５％乳汁含有ＰＢＳを使用し、コートウェルを室温で１〜２時間ブロックした。ＰＢＳで洗浄後、１００μｌのファージライブラリー液／ウェル（通常、２％乳汁−ＰＢＳ中、１〜５×１０１２）を４つの並行ウェルに添加し、設計した時間（通常、１〜２時間）インキュベートした。ＰＢＳＴおよびＰＢＳで数回洗浄後、結合ファージをウェルから新鮮調製１．４％トリエチルアミン含有ｄｄＨ２０で溶出させ（室温で１０分間インキュベーション）、その直後に、５０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）を添加することによって中和した。
溶出した富化ファージプールを、さらに、以下の工程によって増幅させた：まず、ＴＧ１細胞を、溶出ファージに３７℃で１時間感染させ、次いで、２％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む２ＹＴ寒天プレート上にプレーティングし、一晩培養した。このような富化ファージミドライブラリー保有するＴＧ１細胞をプレートから回収し、ヘルパーファージＧＭＣＴに１時間感染させた。次いで、Ｆａｂ−ディスプレイファージを、ライブラリーファージミドとＧＭＣＴヘルパーファージゲノムの両方を保有するＴＧ１細胞から、２×ＹＴ／カルベニシリン／カナマイシン中、２２℃で一晩増殖させることによって作製した。ファージミド粒子を一夜培養物の上清みからＰＥＧ／ＮａＣｌでの沈殿によって精製し、ＰＢＳ中に再懸濁させた。ＰＥＧ−沈殿を１回繰り返した。ファージ濃度をＯＤ２６８の測定によって測定した。
初回の増幅ファージについて、上記のパニングプロセスを２回繰り返し、ＰＣＳＫ９結合ファージをさらに富化させた。３回目のパニングからの溶出ファージをＴＧ１細胞の感染に使用した。３回目のパニングからのファージミドを保有するＴＧ１細胞を、Ｆａｂ ＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイのために２ＹＴ寒天プレートから選出した。
ＰＣＳＫ９結合体に関するＦａｂ ＥＬＩＳＡスクリーニング
３回目のパニングから１０，０００個を超えるクローンをＭｅｇａＰｉｘ Ｐｉｃｋｉｎｇ Ｒｏｂｏｔ（Ｇｅｎｅｔｉｘ）によって選出し、６０μｌの２ＹＴ／２％グルコース／カルベニシリンを入れた３８４ウェルプレート内に播種し、４５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩培養した。各ウェルの約１〜３μｌの一夜培養物を、５０μｌ／ウェルの２ＹＴ／０．１％グルコース／カルベニシリンを入れた新たなプレートに移すことにより、二連のプレートを作製した。この二連のプレートを振盪機内で３０℃で６時間インキュベートし、次いで、１０μｌ／ウェルのＩＰＴＧを終濃度１ｍＭで添加した。２２℃で一番培養後、各ウェルにリゾチームを添加することにより、ＩＰＴＧ−誘導プレート内の可溶性Ｆａｂを放出させた。
上記の実験で作製された可溶性Ｆａｂの抗原結合活性を検出するため、５μｇ／ｍｌのヒトＰＣＳＫ９抗原を一晩コーティングすることにより抗原プレートを作製した。５％乳汁−ＰＢＳでブロックし、ＰＢＳＴで洗浄した後、ＩＰＴＧ−誘導プレートからの１５〜２０μｌのＦａｂ試料を抗原プレートに移し、室温で１〜２時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、１：２０００希釈ヤギ抗ヒトκ−ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈカタログ番号２０６０−０５）または１：１０，０００希釈ヤギ抗ヒトＦａｂ−ＨＲＰ（５％ＭＰＢＳ中）を添加し、インキュベーション１時間した。未結合ＨＲＰ−コンジュゲートをＰＢＳＴで洗い流し、次いで、基質溶液ＱｕａｎｔａＢｌｕ ＷＳ（Ｐｉｅｒｃｅ １５１６９）を各ウェルに添加し、５〜１５分間インキュベートした。各ウェルの相対蛍光単位（ＲＦＵ）を測定し、励起波長３３０ｎｍおよび発光検出波長４１０ｎｍを使用することによりＦａｂ結合活性を求めた。
ＥＬＩＳＡの結果により、個々のＰＤＬ１サブライブラリーの３回目のパニングからのクローンの３０〜８０％が抗原ＰＣＳＫ９に結合したことが示された。次いで、陽性クローンをＤＮＡ配列決定のために送られた。合計１２８個の特殊なＦａｂ配列がＰＤＬ１ライブラリーから同定された。
以下の可変重鎖および可変軽鎖領域を含む、対象の具体的なＰＣＳＫ９アンタゴニストの１つであるＡＸ１１４が、ＰＤＬ１−ＶＨ３／ＶＫ３サブライブラリーから同定された。
＞ＳＥＱ ３６０（ＡＸ１１４ ＶＨ）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳＳＹＧＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＷＩＤＰＧＳＧＧＴ ＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＲＹＧＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴ ＶＳＳＡＳ
＞ＳＥＱ５１２（ＡＸ１１４ ＶＫ）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＩＴＣＲＡＳＱＹＶＧＴＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＶＷＤＳＳＰＰＶＡＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＴＧ１細胞からのＦａｂタンパク質の発現および精製
２ＹＴ／２％グルコース／カルベニシリン１００μｇ／ｍｌ中の個々のクローンの５０ｍｌの一夜培養物を、３７℃の振盪インキュベータ内で培養した。２日目、７５０ｍＬ〜１Ｌの２ＹＴ／０．１％グルコース／１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンに各クローンを、５〜１０ｍｌの一夜培養物を移すことにより播種した。培養物は、３０℃で振盪しながら、ＯＤ６００が１になるまでおよそ３〜４時間培養した。培養物にＩＰＴＧを終濃度が０．１〜０．５ｍＭに達するまで添加した。２２℃で一晩のＩＰＴＧ誘導後、１０，０００ｒｐｍで１０〜１５分間の遠心分離によって細胞ペレットを収集し、ペリプラズムの調製用とした。
可溶性Ｆａｂを細胞ペリプラズムから抽出した。ペリプラズム調製は以下のようにして行った。ＴＧ１ペレットを、２０ｍＬの予備冷却ＰＰＢバッファー（２０％スクロース＋２ｍＭのＥＤＴＡ＋３０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ＝８）中に再懸濁させ、氷上で１時間インキュベートした。可溶性Ｆａｂを含む上清みを遠心分離によって収集した。続いて、細胞ペレットを、さらに、２０ｍＬ予備冷却５ｍＭの硫酸マグネシウム中に再懸濁させ、氷上で１時間インキュベーションした。２つの上清みを合わせ、さらにＦａｂ精製した。
ペリプラズム抽出物からの可溶性Ｆａｂを、ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。カラムは、最初に平衡バッファー（ＰＢＳ ｏｒ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．３）で平衡化させた。ペリプラズム調製による上清みをｌｍｌまたは５−ｍＬ容のタンパク質−Ｇカラム（ＨｉＴｒａｐ，ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に負荷した。１０カラム容量（ＣＶ）の平衡バッファーで洗浄後、Ｆａｂタンパク質を８ＣＶの溶出バッファー（０．３Ｍ酢酸，ｐＨ３）で溶出させた。溶出画分を収集し、０．５容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ９バッファーで中和した。１０ｋＤ分子量カットオフのＡｍｉｃｏｎ遠心フィルターを使用し、Ｆａｂ試料をＰＢＳにバッファー−交換した。精製Ｆａｂの量をサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を用いて解析した。また、精製ＦａｂをＥＬＩＳＡアッセイおよびＢｉａｃｏｒｅアッセイ（後述）にも使用した。全体的に、概ね、Ｆａｂの収量は約１〜２ｍｇ／Ｌであり、１ｍｇ／Ｌ未満から１０ｍｇ／Ｌ超までウェル間で高度にばらついている。すべてのＦａｂは、ＳＥ−ＨＰＬＣによる単一のメインピークを示す。ＥＬＩＳＡアッセイの結果により、ＰＤＬ１ライブラリーから単離されたすべてのＦａｂがヒトＰＣＳＫ９抗原に結合することが確認された。
ＢＩＡＣＯＲＥ系ＰＣＳＰ９−ＬＤＬ受容体相互作用アッセイ
ＬＤＬ−受容体（ＬＤＬＲ）およびＬＤＬＲのＥＧＦ＿ＡＢドメイン（このドメインはＰＣＳＫ９との相互作用を伴う）を、ＬＤＬＲまたはＥＧＦ＿ＡＢドメインのアミン基を、センサーチップのカルボキシル化表面上に、Ａｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＥ／Ｂｉａｃｏｒｅ）の使用説明書に従ってカップリングさせることにより、同じＣＭ５チップ内の２つの異なるフローセルに固定化した。簡単には、ＬＤＬＲおよびＥＧＦ＿ＡＢをｐＨ４．５の１０ｍＭの酢酸バッファー中で２０μｇ／ｍｌに希釈し、同じＣＭ５チップ上の２つのフローセルに注入し、約１５００ＲＵの固定化レベルを得た。１００ｎＭのヒトＰＣＳＫ９単独を含む泳動バッファー（０．１ｍＭのＣａＣ２を含む１×ＨＢＳＰ）をフローセル内に注入し（２０μｌ／分で２．５分間）、ＰＳＫ９とＬＤＬＲおよびＥＧＦ＿ＡＢドメインとの相互作用を測定した。注入後、フローセルを１０ｍＭのＨＣｌによって再生させた。
ＰＣＳＫ９に対するＦａｂ抗体の結合の影響を調べるため、各精製Ｆａｂ試料（泳動バッファー中１μΜ）をヒトＰＣＳＫ９とともに１００ｎＭの濃度で室温で３０分間インキュベートした。調製したＰＣＳＫ９／Ｆａｂ試料をＣＭ５チップ内に注入し、ＰＣＳＫ９／Ｆａｂ複合体の結合を測定した。図１に示されるように、ヒトＰＣＳＫ９は単独でＬＤＬＲとＥＧＦ＿ＡＢドメインの両方に結合した。Ｆａｂ抗体の結合によってＰＣＳＫ９−ＬＤＬＲ相互作用が阻害されなかった場合、ＬＤＬＲまたはＥＧＦ＿ＡＢへのＰＣＳＫ９／Ｆａｂ複合体の結合により、ＲＵ、次いでＰＣＳＫ９単独への高い結合がもたらされた。試験したＦａｂ抗体の中でも、ＡＸ１１４ Ｆａｂでは、ＬＤＬＲまたはＥＧＦ＿ＡＢドメインへのＰＣＳＫ９結合に対する有意な阻害が示された。
エピトープビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）結合に関するＢＩＡＣＯＲＥ系競合アッセイ
ヒトＰＣＳＫ９タンパク質を、ＰＣＳＫ９の第１級アミン基をセンサーチップのカルボキシル化表面上に、Ａｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＥ／Ｂｉａｃｏｒｅ）の使用説明書に従ってカップリンツさせることにより、ＣＭ５チップ上に固定化した。簡単には、ｈＰＣＳＫ９タンパク質をｐＨ５．５／１０ｍＭの酢酸溶液中で５０μｇ／ｍｌに希釈し、ＮＨＳ／ＥＤＣ 活性化表面上に注入して１０００〜２０００ＲＵの固定化レベルを得た後、エタノールアミンの注入によって表面を不活化した。次いで、ＦａｂまたはＩｇＧタンパク質（ＨＢＳ−Ｐバッファー中１μΜ）を３分間注入して結合させた後、５分間解離させた。この結合エピトープビニングアッセイでは、２つのフローセルを同じ量のｈＰＣＳＫ９タンパク質で固定化し、抗体１と抗体２間の結合の競合を検出した。フローセル１には、抗体１を２回注入して結合エピトープで占め、次いで、抗体２を注入して結合させた。フローセル２は参照として設定し、抗体２のみを注入して結合させた。抗体１と抗体２間に競合が見られるかどうかを調べるため、両方のフローセルの抗体２のセンサーグラムを重ねた。２種類の抗体が競合している場合、予め占められた抗体１により、抗体１結合が有意にまたは完全に阻害される。ＰＤＬ１ライブラリーの１９種類の抗体について交差競合が競合し、ヒトＰＣＳＫ９上の３つの独立したエピトープビンが同定された。表２参照。
Figure 2013509194
ＡＸ１１４の最適化
ＡＸ１１４の最適化ライブラリーを設計し、構築した。すべてのＡＸ１１４ライブラリーをＰＣＳＫ９抗原に対して３〜６回、実施例１に記載のようにしてパニングした。Ｆａｂ ＥＬＩＳＡスクリーニング用のクローンを実施例２に記載のようにして選出した。ＰＣＳＫ９結合クローンをＴＧ１細胞において発現させ、Ｆａｂを分泌させた。精製Ｆａｂタンパク質（実施例３）を、Ｂｉａｃｏｒｅにおいて親和性の測定を行った（実施例１４参照）。これらのライブラリーから、ＡＸ１３２（それぞれ、配列番号：３６０および５１１のＶＨおよびＶＬ領域を含む）を含む、ヒトＰＣＳＫ９に結合するＡＸ１１４バリアントを合計１３５種類同定した（表３に記載）。
Figure 2013509194
 ＞配列番号：３６０（ＡＸ１３２ ＶＨ）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳＳＹＧＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＷＩＤＰＧＳＧＧＴ ＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＲＹＧＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳ ［特定の実施形態では、配列番号：３６１］
＞配列番号：５１１（ＡＸ１３２ ＶＫ）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＩＴＣＲＡＳＱＹＶＧＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧ１ＰＡ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＶＷＤＳＳＰＰＶＶＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞配列番号：３６２（ＡＸ２１３ ＶＨ）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳＲＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＧＮＧＧＴＲ ＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＮＤＧＹＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶ ＳＳＡＳ ［特定の実施形態では、配列番号：３６３］
＞配列番号：５１１（ＡＸ２１３ ＶＫ）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＩＴＣＲＡＳＱＹＶＧＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧ１ＰＡ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＶＷＤＳＳＰＰＶＶＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＡＸ１１４バリアントのＣＤＲ領域内の配列変化を図２および３に示す。
ＡＸ１３２エピトープマッピングのためのコンピュータドッキングおよびＰＣＳＫ９変異誘発
規定：ＰＣＳＫ９残基のＣα（例えば、「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」，Ｃａｒｌ Ｂｒａｎｄｅｎ ＆ Ｊｏｈｎ Ｔｏｏｚｅ，第２版，１９９９ Ｇａｒｌａｎｄ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ参照）原子が所与の抗体のＣＡの１０オングストローム以内に存在している場合、ＰＣＳＫ９上の残基は所与の抗体と接触しているとみなす。Ｘ線構造では、接触している残基をエピトープと規定する。所与のエピトープビンのドッキングポーズでは、閾値（＞５０〜７５％）より高い周波数で接触している残基をエピトープと規定する。２つのタンパク質（例えば、ＬＤＬ受容体のＥＧＦ＿ＡＢドメインに対する結合について、ＡＸ１１４と競合する対照Ｆａｂを有するＡＸ１１４）は、これらのタンパク質の任意のＣα原子間の距離が５Åよりも短い場合、構造モデルに基づいて、競合すると規定する。
ドッキング手順：ＡＸ１３２のエピトープを調べるため、側鎖の最適化を有する他方に対する一方のパートナーのリジッド−ボディ変換／回転を伴うプログラムを用いて、ドッキングを行った。Ｇｒａｙ，ＪＪら，２００３ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３１：２８１−２９９を参照のこと。ＡＸ１１４とＡＸ１３２は対照Ｆａｂについて競合するため、初期構成を、およそ１５オングストローム引き離した抗体を伴う対照ＦａｂのＸ線構造から開始した。低スコアリングポーズをクラスタリングし、エピトープを判定するために接触について解析した。配列類似性および競合データに基づき、ＡＸ２１３のエピトープは、ＡＸ１１４／ＡＸ１３２と同様であると推定される。
コンピュータドッキング試験に基づき、図４に示す３つのビンが判定された。ヒトとラットのＰＣＳＫ９間のＡＸ１３２結合の違いに基づき（表４）、ラットＰＣＳＫ９残基に対するヒトＰＣＳＫ９キメラ変異を選択し、エピトープビンを識別して試験した。合計６種類のキメラ変異型を設計した。各変異型はＰＣＳＫ９上に斑（ｐａｔｃｈ）を示す。表５参照。変異型＃１はビン１に存在し、異種間結合データに基づくと、Ａ１１４／ＡＸ１３２／ＡＸ２１３の結合を消去することが推定される。変異型＃２（ビン２由来）または変異型３（ビン３由来）は、他の抗体の結合を消去することが推定される。
Figure 2013509194
Figure 2013509194
 ヒトＰＣＳＫ９変異型タンパク質はＨＥＫ２９３細胞から生成させた。簡単には、Ｈｉｓ−タグを有する哺乳動物発現ベクター内の完全長ヒトＰＣＳＫ９の遺伝子を部位特異的変異誘発によって修飾し、表５に基づく対応する変異を誘導した。次いで、ＰＣＳＫ９変異型のベクターをヒトＨＥＫ２９３細胞内に一過的にトランスフェクトさせ、３７℃で７〜１０日間培養した。Ｈｉｓ−タグ化ＰＣＳＫ９変異型タンパク質を培養上清みからＮＴＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）によって精製した。ＰＣＳＫ９タンパク質の量は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて解析された。
抗ＰＣＳＫ９抗体ＡＸ１３２に対するＰＣＳＫ９変異型の結合を試験するため、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。簡単には、ＰＣＳＫ９変異型タンパク質をＰＢＳで５μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／各ウェルで、４℃にて一晩コーティングした。５％乳汁−ＰＢＳでブロックした後、ＡＸ１３２試料（５％乳汁−ＰＢＳ中、４ｎＭの開始濃度で１：２に連続希釈）をウェルに添加し、個々のＰＣＳＫ９変異型でコーティングし、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳでの洗浄後、ＨＲＰとコンジュゲートした抗ヒトＫ抗体を添加し、さらに１時間インキュベートした。次いで、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＰＢＳ洗浄プレートに１０〜２０分間添加して発展させた。停止溶液を添加後、プレートを４５０ｎＭにおける吸光度について測定した。
図５Ａに示したＥＬＩＳＡの結果により、抗体ＡＸ１３２に対するＰＣＳＫ９変異型＃１の結合の有意な減損が示された。この結果により、ＡＸ１３２は推定ビンＩに結合することが示された。ＰＣＳＫ９変異型＃１は、Ｄ１９２ＧおよびＦ３７９Ｙのアミノ酸置換を有する（図５Ｂ）。この領域は、ＬＤＬ受容体のＥＧＦ＿ＡＢドメインに対する結合に関与している。
水素−ジュウテリウム交換質量分析（ＤＸＭＳ）によるエピトープマッピング
抗ＰＣＳＫ９抗体によって認識されるＰＣＳＫ９の種々のエピトープ領域を特定するため、ＷｏｏｄおよびＨａｍｕｒｏ（２００１）のプロトコルに基づいて、水素ジュウテリウム交換をＰＣＳＫ９に適用した後、ペプチド消化および質量分析を行い、さらに開発して自動化した。Ｈａｍｕｒｏら，２００３ Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｔｅｃｈ．１４：１７１−１８２；およびＣｏａｌｅｓら，２００９ Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２３：６３９−６４７参照。この多段階手順を以下に記載する。
抗体アフィニティカラムの調製：臭化シアン活性化Ｐｏｒｏｓ ＡＬ樹脂との一晩のインキュベーションによって抗体を固定化した後、濾過漏斗を用いてＰＢＳで洗浄した。乾燥樹脂をエタノールアミン溶液中に２時間再懸濁させることにより反応液をキャッピングした後、濾過漏斗を用いてＰＢＳで洗浄した。樹脂をＰＢＳ中に再懸濁させ、次いで、カラム内に充填した。カラムを２ｍＭのＮａＣｌを含むＰＢＳ（ｐＨ７）で交換バッファーＨ中にて３℃で平衡化させた。カラム注入およびインキュベーションはすべて、シリンジポンプを用いて行った。
オン−溶液（ｏｎ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ）およびオフ−カラムジュウテリウム交換：交換Ｈバッファーは、水中のＰＢＳとして調製した。交換ＤバッファーはＤ２Ｏ中のＰＢＳとして調製した。交換ＨＤバッファーは５０％Ｄ２Ｏ中のＰＢＳとして調製した。交換工程はすべて３℃で行った。０．８％ギ酸でｍＡｂカラムを清浄にし、洗浄し、交換ＨＤバッファーで平衡化させた。ＰＣＳＫ９試料を１：１で交換Ｄバッファーと混合することにより重陽子のオン−溶液交換を開始し、所定の時間インキュベートした。次いで、混合物をｍＡｂカラムに注入し、交換ＨＤバッファーで洗浄した。オフ−カラム交換は、交換Ｈバッファーで洗浄し、所定の時間インキュベートすることにより開始した。オフ−カラム交換をクエンチし、０．８％ギ酸を用いてＰＣＳＫ９を溶出させた。画分を収集し、解析した。
オン−およびオフ−カラムジュウテリウム交換：交換工程はすべて３℃で行った。ｍＡｂカラムを０．８％ギ酸で清浄にし、洗浄し、交換ＨＤバッファーで平衡化させた。交換Ｈバッファー中のＰＣＳＫ９をｍＡｂカラムに負荷し、交換Ｈバッファーで洗浄した。重陽子のオン−カラム交換を、交換ＨＤバッファーの注入により開始し、所定の時間インキュベートした。オフ−カラム交換を行い、上記のようにしてクエンチした。画分を収集し、解析した。
ＰＣＳＫ９の完全ジュウテリウム化：ＰＣＳＫ９を、Ｄ２Ｏ中で調製したＰＢＳ中で平衡化させ、６０℃で３時間インキュベートした。これを室温まで冷却し、氷上で保存した。完全にジュウテリウム化したＰＣＳＫ９をＨＤ交換バッファー中の抗体アフィニティカラムに負荷し、同じバッファー中で洗浄した。溶出および解析を上記と同様にして行った。
質量分析によるペプチド解析：溶出したＰＣＳＫ９を固定化ペプシンカラム内に注入し、次いで、Ｃ１８逆相ＬＣ−ＭＳに負荷して断片を同定した。溶出画分からのＰＣＳＫ９を変性させ、２Ｍ尿素、１Ｍ ＴＣＥＰ（ｐＨ３）中で、０℃で２分間還元した。次いで、試料をバッファーＡ（０．０５％ＴＦＡを含む水）中の固定化ペプシンカラムに通した。消化断片を逆相ｔｒａｐカラムに負荷し、バッファーＡ中で脱塩処理した。消化断片をＣ１８カラムによって１３〜４０％バッファーＢ（９５％アセトニトリル、５％水、０．００２５％ＴＦＡ）の線形勾配を用いて２３分間で分離し、ペプチドを質量分析によって検出した。
ＭＳによって検出された既知の消化断片の質量のシフトを使用し、ＨＤ交換レベルを求める。交換割合は、結合ＰＣＳＫ９と未結合ＰＣＳＫ９（対比）のＨＤ交換比率から求められ、抗体によるエピトープ保護の度合を示す。ジュウテリウム化の割合の変化のカットオフは、閾値として５％としノイズを除去する。
ＡＸ１３２およびＡＸ２１３抗体のＨＤ交換プロフィールを図６に示す。ＡＸ２１３結合またはＡＸ１３２結合に対して最大のジュウテリウム化の差を示すＰＣＳＫ９消化断片は１５５−ＰＷＮＬ−１５８（配列番号：５７６）と３６４−ＰＧＥＤＩＩＧＡＳＳＤＣＳＴＣ−３７８（配列番号：５７７）であり、ここで、部分断片１５７−ＮＬ−１５８と３７０−ＧＡＳＳＤＣＳＴＣ−３７８（配列番号：５７８）にエピトープが含まれているようである。他にも弱い相互作用性部位が存在し得るが、これらはカットオフ閾値（５％）未満であり、おそらく、間接的または局所の構造的乱れによるものである。
図７は、ハイライトしたＡＸ１３２およびＡＸ２１３ エピトープを含む２つの消化断片を有するＰＣＳＫ９（ＰＤＢ：２ＰＭＷ）を示す。灰色は１５５−ＰＷＮＬ−１５８（配列番号：５７６）に対応し、濃い灰色は３６４−ＰＧＥＤＩＩＧＡＳＳＤＣＳＴＣ−３７８（配列番号：５７７）に対応する。自己切断されたプロドメインの大部分は隠れて見ていない。
ＨＤ交換データは、実施例７のＰＣＳＫ９変異誘発データと整合している。１５５−ペプチドと３６４−ペプチドはともに、図４に示すエピトープビン＃１に存在している。
ＦＡＢドメインの熱安定性
ＦａｂおよびＦａｂドメインの熱安定性を、ＤＳＣ実験から、Ｏｒｉｇｉｎ ５．０において過剰熱容量関数の解析およびデコンヴォルーションによって調べた。ＦａｂまたはＦａｂドメインの融解転移温度（Ｔｍ）を表６に示す。種々のＦａｂおよびＦａｂドメインのＴｍはＰＤＬ１由来抗体で７２〜７８℃の範囲であり、これは、抗体Ｆａｂ領域の充分なフォールディングと整合している。
Figure 2013509194
ＡＸ１３２−ＦＡＢ／ＰＣＳ９の結晶構造
発現
ＡＸ１３２ Ｆａｂを発現する核酸をファージライブラリーディスプレイベクターに組み込み、Ｆａｂを発現させて精製して結晶化させる前に、外来Ｎ−およびＣ末端残基を該ベクターから以下のようにして除去した。
１）ベクター内のｐ３リーダーとＨ鎖ＦＲ１間の３個の余分なアミノ酸（ＡＧＳ）を発現するコドンを除去すると、大腸菌内のｐ３シグナルペプチドが切断された後、真正重鎖Ｎ末端が得られた。
２）Ｆａｂの結晶化を助長するため、Ｆａｂの発現と精製の前に、ベクター内の重鎖Ｃ末端のＧＲ１アダプタードメインコード領域を除去し、ＨＡおよびＨｉｓタグのコード配列の直後に終止コドンを導入した。これは、該修飾を有するプラスミドｐＭＡＢ９内での軽鎖および重鎖のＦａｂ発現カセット（ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘｈｏｌ）のサブクローニングによって行った。
精製のための最終発現プラスミドを図２０Ａ〜Ｅに示し、ベクターマップを図１９に示す。このプラスミドは、軽鎖と重鎖の両方をバイシストロニックメッセージでｌａｃプロモーター外で発現させる。軽鎖のオープンリーディングフレームは該メッセージの５’末端のｐ８リーダーの後ろで発現され、次いで、重鎖がｐ３リーダーの後に続く。
ＡＸ１３２の精製
ＡＸ１３２を大腸菌からニッケルアフィニティカラムで精製した後、ＳＰセファロースカラム クロマトグラフィーで精製した。
ＰＣＳＫ９の精製：
分泌されたＰＣＳＫ９をＨＥＫ ２９３細胞からｃａｐｔｏ Ｑカラムで捕捉した。結合タンパク質をプールし、ニッケルアフィニティカラムでさらに精製した後、サイズ排除カラム（Ｓ２００）クロマトグラフィーで精製した。
複合体生成：
精製ＡＸ１３２を精製ＰＣＳＫ９とモル比率１．５：１で混合し、４℃で１２時間インキュベートした。混合物をさらに２×Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００（１６−６０）カラム上で分画し、非複合体形成ＡＸ１３２を取り除いた。精製複合体を１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、なんら凍結−解凍は行なわずに結晶化させた。
結晶化
ＰＣＳＫ９：ＡＸ１３２複合体は、種々の結晶化条件下で結晶が得られた。一般的には、複合体を抗凍結剤の存在下で凍結させた。結晶は、シンクロトロンで３．０９Åまで回折した。ＡＸ１３２ Ｆａｂ断片に結合されたＰＣＳＫ９の構造を分子置換法によって調べた。ＡＸ１３２はＥＧＦ−Ａ結合部位に結合する。抗体ＡＸ１３２の軽鎖が主にＰＣＳＫ９との相互作用を担う。多数の水素結合および疎水性相互作用が界面に観察される。
図８は、ＡＸ１３２抗体に結合されたＰＣＳＫ９の結晶構造を示す。図９は、ＡＸ１３２エピトープを有するＰＣＳＫ９の表面領域の図を示す。論考した結晶構造の座標を表１４、実施例２１に示す。
結合に関与している残基は、ＡＸ１３２：ＰＣＳＫ９の結晶構造とＰＣＳＫ９単独の構造間の到達可能な表面積の差を計算することにより特定される。ＡＸ１３２抗体との複合体形成時に埋没表面領域を示すＰＣＳＫ９残基は、エピトープの一部として含める。溶媒が到達可能なタンパク質表面は、該タンパク質のファンデルワールス表面上を転がるため、プローブ球体（溶媒分子を表す）の中心の位置と規定する。溶媒到達可能な表面積を、プログラムＡＲＥＡＩＭＯＬ（Ｌｅｅら，１９９７ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：５−１１およびＳａｆｆら，１９９７ Ｔｈｅ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅｒ １９：５−１１参照）を使用することにより計算した。このプログラムより、各原子の周りの延びた球体上の表面点が得られ（原子の中心から原子とプローブの半径の和に等しい間隔をあけて）、隣接原子と会合した同等の球体内に存在するものが排除される（Ｂｒｉｇｇｓ，Ｐ．Ｊ．２０００，ＣＣＰ４ Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ Ｎｏ．３８，ＣＣＬＲＣ，Ｄａｒｅｂｕｒｙ）。
ＰＣＳＫ９上のＡＸ１３２エピトープに対する抗体結合の選択
ＡＸ１３２結合エピトープを有する抗体は、ファージディスプレイ抗体ライブラリーからも、ＡＸ１３２と競合するＥＧＦ＿ＡＢ ペプチドを用いて選択され得る。プレート上にコーティングされたヒトＰＣＳＫ９へのファージライブラリーの結合後、ＥＧＦ＿ＡＢタンパク質が添加され得、結合ファージが溶出され得る。次いで、ＥＧＦ＿ＡＢ溶出ファージプールの個々のクローンが、ヒトＰＣＳＫ９およびＰＣＳＫ９変異型＃１に対してスクリーニングされ得る。図５Ａに示されるようにＡＸ１３２はヒトＰＣＳＫ９に高い親和性で結合するが、ヒトＰＣＳＫ９変異型＃１には親和性が非常に低い（実施例７参照）。ヒトＰＣＳＫ９に結合するＦａｂは、ＰＣＳＫ９変異型＃１タンパク質に対する結合スクリーニングアッセイに供され得、ヒトＰＣＳＫ９に対して強い結合を有するがＰＣＳＫ９変異型＃１に対する結合は弱いＦａｂはＡＸ１３２結合エピトープを共有する。
哺乳動物細胞からの抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の発現と精製
ＶｋｌまたはＶＫ３軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列をプラスミド鋳型からポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させた。この増幅産物を、事前にＦｓｐｌおよびＢｍｔｌで、ＩｎＦｕｓｉｏｎ クローニング系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて消化したプラスミドｐＶＵＮＳＡＧＳ−ＦＢ−ＬＣＫ内にクローニングした。得られたプラスミドを可変領域全域のＤＮＡ配列決定によって確認した。内毒素無含有プラスミド調製物を、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏ−Ｆｒｅｅプラスミドｍａｘｉｐｒｅｐキットを用いて作製した。ＶＨ３の重鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させ、増幅産物を、事前にＦｓｐｌおよびＢｍｔｌで消化したプラスミドｐＶｌ ＪＮＳＡ−ＢＦ−ＨＣＧ２Ｍ４内にクローニングした。得られたプラスミドを可変領域全域のＤＮＡ配列決定によって確認した。内毒素無含有プラスミド調製物を、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏ−Ｆｒｅｅプラスミドｍａｘｉｐｒｅｐキットを用いて作製した。
重鎖と軽鎖のプラスミドＤＮＡを１：３で混合し、ＨＥＫ２９３細胞内にコトランスフェクトした。５〜７日間の培養後、上清みを回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａカラム精製に進んだ。簡単には、無細胞上清みを３カラム容量の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で予備平衡化したプロテイン−Ａカラムに５．０ｍＬ／分の流速で負荷した。カラムを３カラム容量の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で洗浄した後、１Ｍ ＮａＣｌを含有する５カラム容量の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で洗浄し、宿主細胞タンパク質を除去した。抗ＰＣＳＫ９抗体を５カラム容量の１００ｍＭのグリシン、１００ｍＭのアルギニン（ｐＨ３．０）で溶出させ、すぐに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。
糖鎖操作Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからの抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の発現と精製
抗ＰＣＳＫ９ ＩｇＧ２モノクローナル抗体を、糖鎖操作Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＦＩ ５．０宿主ＹＧＬＹ８３１６において発現させた。該宿主は、その複雑なＮ結合型グリカンの末端ガラクトースを転移させ得るものである。抗ＰＣＳＫ９重鎖および軽鎖をコドン最適化し、メタノール厳密誘導性プロモーターＡＯＸ１の下で、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅα接合因子のプレ配列を分泌シグナル配列として用いて発現させた。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＦＩ ５．０宿主ＹＧＬＹ８３１６からの抗ＰＣＳＫ９抗体を無細胞上清み培地から、アフィニティクロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭ培地（カタログ番号１７−５１９９−０１）を使用）によって捕捉した。
無細胞上清みを、３カラム容量の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で予備平衡化させたＭａｂｓｅｌｅｃｔカラム（ＸＫ １６／２０、１．６ｃｍ×１０．０ｃｍ）上に５．０ｍＬ／分の流速で負荷した。カラムを３カラム容量の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で洗浄した後、１Ｍ ＮａＣｌを含有する５カラム容量の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で洗浄し、宿主細胞タンパク質を除去した。抗ＰＣＳＫ９抗体を、５カラム容量の１００ｍＭのグリシン、１００ｍＭのアルギニン（ｐＨ３．０）で溶出させ、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）ですぐに中和した。ＡＸ２１３抗体をＰｉｃｈｉａにおいて充分に発現させ、小規模醗酵プロセスにおいて約３００〜７００ｍｇ／Ｌのタンパク質を得た。ＡＸ１１４の収量は小規模で５ｍｇ／Ｌであった。
ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（カタログ番号１７−１２７３−０２）製のＳｏｕｒｃｅ ３０Ｓ樹脂を用いた強力カチオン交換クロマトグラフィーを、クリッピング種および凝集塊を除去するための第２段階の精製として使用した。抗ＰＣＳＫ９抗体のＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）プールを２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で５倍希釈し、３カラム容量の２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で予備平衡化させたＳｏｕｒｃｅ ３０Ｓカラム上に負荷した。負荷後、カラムを３カラム容量の２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で洗浄し、１００ｍＭのからｌ５０ｍＭまでの範囲の塩化ナトリウムを含む２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）の１０カラム容量での線形勾配で展開することにより溶出を行った。良好にアセンブリングされた抗ＰＣＳＫ９抗体を含有する画分を一緒にプールした。抗ＰＣＳＫ９抗体を含むＳｏｕｒｃｅ３０Ｓプール画分を、６％スクロース、１００ｍＭのアルギニン、１００ｍＭのヒスチジンを含有する配合バッファー（ｐＨ６．０）（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標） カタログ番号ＲＲ１０８０４．０２）中でバッファー交換し、０．２μｍのＰＥＳ（ＰｏｌｙＥｔｈｅｒＳｕｌｆｏｎｅ）膜フィルターを用いて滅菌濾過し、放出まで４℃で保存した。
親和性測定のためのＢＩＡＣＯＲＥアッセイ
ＰＣＳＫ９に対するＦａｂの結合親和性を調べるため、Ｆａｂ捕捉系Ｂｉａｃｏｒｅアッセイを開発した。まず、ヤギ抗Ｆａｂ ＩｇＧを、上記のアミンカップリングによってＣＭ５チップ上の固定化した。抗Ｆａｂ ＩｇＧをｐＨ５／１０ｍＭの酢酸溶液中で２００μｇ／ｍｌに希釈し、ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化表面上に、固定化レベルが約１０，０００ＲＵがとなるように注入した後、エタノールアミンの注入によって表面を不活化した。次いで、ＨＢＳ−Ｐ泳動バッファー中２μｇ／ｍｌの濃度のＦａｂ試料を２０ｕｌ／分の流速で３分間注入した後、１０〜１００ｎＭの濃度でＰＣＳＫ９のＫ−注入を行なった（会合では３分間注入および解離では６分間）。１００ｍＭのリン酸の３０秒間の注入によってセンサーチップの表面を再生させた。結合のセンサーグラムを１：１でＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルにフィットさせ、結合親和性を測定した。ＡＸ１１４、ＡＸ１３２および他のバリアントのＦａｂ親和性を表７に示す。
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細胞系アッセイにおいて機能的有効性を示したＦａｂをＩｇＧ分子に変換し、また、このＩｇＧ分子親和性をＢｉａｃｏｒｅアッセイによって測定した。簡単には、Ｂｉａｃｏｒｅによって得られるＨｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔの（ｆｏｒｍ）抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体をＣＭ５チップ上に、８０００〜１００００ＲＵのレベルで固定化した。約０．４μｇ／ｍｌの濃度のＩｇＧ試料をセンサーチップ上に２０μｌ／分の流速で２分間注入し、次いで、５種類の濃度（３．７５〜６０ｎＭ）のＰＣＳＫ９タンパク質をＩｇＧ捕捉フローセル上に注入し、結合速度論解析を行った。各回の注入後、３０秒間の３Ｍ塩化マグネシウムの注入によってセンサーチップの表面を再生させた。ＡＸ１１４、ＡＸ１２１３および他のバリアントの親和性を表８および表９に示す。
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ＰＣＳＫ９−ＬＤＬＲ ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイ
このアッセイは、Ｆｉｓｈｅｒら，２００７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：２０５０２−２０５１２に記載されているものの変形型である。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識ＰＣＳＫ９（終濃度１０ｎＭ）を種々の量のＡＸ１３２およびバリアントと合わせ、これに、Ｅｕ（８０４４）標識ＬＤＬＲエクトドメインを、約４ｎＭの（ＲｕｂｙｓｔａｒにおいてＦ１６２０ｎＭでほぼ計数２０，０００が得られるのに充分な）終濃度まで（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．０５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中）、５０μＬの総容量で９６ウェル黒色Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｕ字底プレートを用いて添加した。少なくとも９０分間の平衡後、Ｒｕｂｙｓｔａｒ ｒｅａｄｅｒ（ＢＭＧ Ｃｏｒｐ．）において、２０回のフラッシュ／ウェル、５０μ秒積分ディレイ、および２００μ秒の総積分時間を用いて試料の読み出しを行った。データを（Ｆ１６６５／Ｆ１６２０×１００００）の比率で示し、ＡＸ１３２およびバリアントのＩＣ５０をシグモイド用量応答曲線の屈折点から標準的な４パラメータフィットを用いて求めた。
図１０は、ＰＣＳＫ９−ＬＤＬＲ相互作用ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイでのＡＸ１３２およびそのバリアントの活性を示す。ＡＸ１３２およびそのバリアントのＩｇＧは効力があり［ＩＣ５０は２．４〜５．９ｎＭ］、ＰＣＳＫ９−ＬＤＬＲ相互作用を充分に阻害する。
ＥＸＯＰＯＬＡＲアッセイ：細胞内ＬＤＬ取込みに対する外因性ＰＣＳＫ９の効果
１日目、３０，０００個のＨｅｐＧ２またはＨＥＫ細胞／ウェルを９６ウェルポリＤ−リジンコートプレート内にプレーティングした。２日目、培地を血清無含有ＤＭＥＭ培地に交換した。３日目、培地を除去し、細胞をＯｐｔｉＭＥＭで洗浄した。精製ＰＣＳＫ９を、ＬＰＤＳとｄｌ−ＬＤＬを含有する１００μｌのＤＭＥＭ培地に添加した。プレートを３７℃で６．５時間インキュベートした。細胞を、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ含有ＴＢＳ中ですばやく洗浄し、次いで、ＴＢＳ−ＢＳＡ中で２分間洗浄し、次いで、ＴＢＳで２回洗浄した（すばやく）。細胞を１００μｌのＲＩＰＡバッファー中で溶解させた。次いで、プレート内の蛍光を励起波長５２０、発光波長５８０ｎｍを用いて測定した。各ウェル内における総細胞内タンパク質をＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙを用いて測定し、次いで、蛍光単位を総タンパク質に対して標準化した。
Ｅｘｏｐｏｌａｒ Ａｓｓａｙは、ＬＤＬ取込みに対するバリアント効果の特性評価に有効である。ＰＣＳＫ９変異型の効力が、Ｅｘｏｐｏｌａｒ Ａｓｓａｙにおいて、どのように血漿ＬＤＬ−コレステロールと相関しているかを示す以下の表１０を参照のこと。
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 結果：表１１に示す５４種類のＦａｂは、ＬＤＬ取込みに対するヒト（「ｈ」）、アカゲザル（「ｒｈ」）およびマウス（「ｍ」）ＰＣＳＫ９の効果を用量依存的様式で阻害し、ＩＣ５０（ヒトＰＣＳＫ９）は４〜１７８．７ｎＭの範囲であった。
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 ＩｇＧについて、表１２に示す７種類の抗体は、ＬＤＬ取込みに対するヒトおよびアカゲザル両方のＰＣＳＫ９の効果を用量依存的に阻害した（図１１〜１３）。該効果は再現可能に観察された。細胞に添加したＰＣＳＫ９の量は約５〜３２０ｎＭであった。
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 図１１Ａ〜Ｆは、（ｉ）細胞内ＬＤＬ取込みのヒトＰＣＳＫ９依存性減損のＡＸ１１４またはＡＸ１３２（ＩｇＧ）の用量依存性阻害（Ａ、Ｄ）、（ｉｉ）細胞内ＬＤＬ取込みのマウスＰＣＳＫ９依存性減損のＡＸ１１４またはＡｘｌ３２（ＩｇＧ）の用量依存性阻害（Ｂ、Ｅ）、および（ｉｉｉ）細胞内ＬＤＬ取込みのアカゲザルＰＣＳＫ９依存性減損のＡＸ１１４またはＡＸ１３２（ＩｇＧ）の用量依存性阻害（Ｃ、Ｆ）を示す。
図１２Ａ〜Ｆは、（ｉ）細胞内ＬＤＬ取込みのヒトＰＣＳＫ９依存性減損のＡＸ２１０またはＡＸ２１１（ＩｇＧ）の用量依存性阻害（Ａ、Ｄ）、（ｉｉ）細胞内ＬＤＬ取込みのマウスＰＣＳＫ９依存性減損のＡＸ２１０またはＡＸ２１１（ＩｇＧ）の用量依存性阻害（Ｂ、Ｅ）、および（ｉｉｉ）細胞内ＬＤＬ取込みのアカゲザルＰＣＳＫ９依存性減損 ＡＸ２１０またはＡＸ２１１（ＩｇＧ）の用量依存性阻害（Ｃ、Ｆ）を示す。
図１３Ａ〜Ｆは、（ｉ）細胞内ＬＤＬ取込みのヒトＰＣＳＫ９依存性減損のＡＸ２１２またはＡＸ２１３（ＩｇＧ）の用量依存性阻害（Ａ、Ｄ）、（ｉｉ）細胞内ＬＤＬ取込みのマウスＰＣＳＫ９依存性減損のＡＸ２１２またはＡＸ２１３（ＩｇＧ）の用量依存性阻害（Ｂ、Ｅ）、および（ｉｉｉ）細胞内ＬＤＬ取込みのアカゲザルＰＣＳＫ９依存性減損のＡＸ２１２またはＡＸ２１３（ＩｇＧ）の用量依存性阻害（Ｃ、Ｆ）を示す。
インビトロＦｃＲｎ解離アッセイ
本発明者らの内部データにより、同一のＦｃ配列を有するがＦａｂドメインは異なるモノクローナル抗体は、ＦｃＲｎに対してかなりの差を伴って結合し得ることが示された。さらに、中性ｐＨでの解離とインビボ薬物動態学との間には明白な相関が観察された：解離が遅い（すなわち、「結合％」が＞５％）ｍＡｂは、インビボで短い最終排泄相の半減期（ｔｌ／２）を示す傾向にある）。この特徴を、抗体薬物動態学のインビトロスクリーニングツールとして使用した。
ヒトＦｃＲｎからのｍＡｂの中性ｐＨ解離を、ＳＰＲにより、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ−１００機器を用いて測定した。簡単には、精製ＦｃＲｎタンパク質をＢｉａｃｏｒｅ ＣＭ５ ｂｉｏセンサーチップ上に固定化し、ＰＢＳＰ（５０ｍＭのＮａＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤 ２０）（ｐＨ７．３）を泳動バッファーとして使用した。ｍＡｂをＰＢＳＰ（ｐＨ６．０）で１００ｎＭに希釈し、平衡に達するまでＦｃＲｎに３分間結合させた後、ｐＨ７．３の泳動バッファー中で１分間の解離を行なわせた。報告点（安定性）をｍＡｂ結合終了後、５秒の時点で挿入し、「結合％」をＲＵ安定性／ＲＵ結合性（％）として計算した。
図１４〜１５は、Ｂｉａｃｏｒｅでの固定化ヒトＦｃＲｎに対するＡＸ１１４、ＡＸ１３２、ＡＸ２１０−２１３の結合を示す。センサーグラムは、ｐＨ６．０での結合とｐＨ７．３での解離の両方を示す。報告点（安定性）をｐＨ６．０結合の終了後、５秒の時点で挿入し、「結合％」をＲＵ安定性／ＲＵ結合性（％）として計算した。
ヒトＦｃＲｎマウスにおける薬物動態試験
ＩｇＧとＦｃＲｎ間の相互作用は種特異的である。最近、ヒトＦｃＲｎマウスは、ｍＡｂの薬物動態学を評価するための重要なサロゲート系であることが提案された；Ｐｅｔｋｏｖａら，２００６ Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１７５９−６９。この試験で使用したヒトＦｃＲｎマウス（ヘテロ接合型Ｔｇ２７６）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から取得した。これは、マウスＦｃＲｎ−α鎖が欠損しており、ヒトＦｃＲｎ−α鎖遺伝子を有する（同上）。本発明者らの内部データにより、マウスまたはラットのＦｃＲｎとは異なり、この「ハイブリッド」ＦｃＲｎは、ヒトおよびサルＦｃＲｎのものと同等のヒトＩｇＧ結合特性を有することが示された。また、このヒトＦｃＲｎマウスと非ヒト霊長類のものと間に、良好な最終排泄相の半減期の相関が観察された。
薬物動態学試験では、各動物（２〜３匹／群）に、単回静脈内注入のｍＡｂを１０ｍｇ／ｋｇで尻静脈から与えた。一連の１０μｌの血液を指定された時間点で収集した。有効な抗ヒトＩｇＧイムノアッセイを使用し、全ｍＡｂレベルを測定した。
ＡＸ１１４、ＡＸ１３２およびＡＸ２１３の薬物動態プロフィールを、単回１０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ投与後のヒトＦｃＲｎマウスにおいて調べた。図１６は、それぞれ、７９．６および６５．５時間であると測定されたＡＸ１１４およびＡＸ１３２の半減期を示す。ＡＸ２１３の半減期は９７時間であると求められた。
また、ＡＸ１３２の薬物動態プロフィールを、単回１０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ投与後のアカゲザルにおいても測定した。ＡＸ１３２の半減期は１４７時間であると求められた。
アカゲザルでの薬物動態試験
ＡＸ１３２の薬物動態、薬力学および標的結合を特性評価するため、６匹のアカゲザルにおいて、１ｍｇ／ｋｇで皮下投与経路により単回用量試験を行なった。試験に使用したアカゲザルはすべて、生物学的試験は未経験であった。血液試料を伏在／大腿の血管から投与後の指定された時間点に採取し、得られた血漿／血清を解析まで−７０℃で保存した。
リポタンパク質プロフィールを得るため、血漿または血清をＳｕｐｅｒｏｓｅ−６サイズ排除カラム（ＧＥ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）でのクロマトグラフィーによって分画した。カラム溶出液中の総コレステロールレベルを、市販の酵素比色コレステロール検出試薬（Ｔｏｔａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅ，Ｗａｋｏ ＵＳＡ）とのインライン混合物によって継続的に測定した後、６００ｎｍ吸光度での反応生成物の下流の分光測光的検出を行った。カラムから溶出されたコレステロールの最初のピークをＶＬＤＬに、２番目のピークをＬＤＬに、３番目をＨＤＬに帰属させ、各ピーク下面積を、ＨＰＬＣに備えられたソフトウェアを用いて計算した。各リポタンパク質画分のコレステロール濃度を計算するため、総ピーク面積に対する対応するピーク面積の比率に、試料において測定された総コレステロール濃度を乗算した。
血清試料のリポタンパク質解析を上記のようにして行った。市販の試薬を用いた抗ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡを使用し、Ａｘｌ３２レベルを定量した。
図１７に示されるように、単回用量後、ＡＸ１３２によりＬＤＬコレステロールは有意に低下し、最大平均減少率は６０％であり、４２日間でＬＤＬ−Ｃは＞２５％低下した。
解析用サイズ排除クロマトグラフィー
高速−サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）は、順に漸減するサイズに基づいてタンパク質を分離するために使用される解析方法である。この方法を使用し、処理および精製（時間ゼロ）後および加速安定性試験後のタンパク質の凝集および／または断片化レベルを定量した。サイズ排除クロマトグラフィーは、Ｗａｔｅｒｓ ２６９０ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｍｏｄｕｌｅ／９９６ Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒを用いて行った。物質は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ｐｒｅ−ｆｉｌｔｅｒ ＧＦＣ ４０００（４×３ｍｍ）を有するＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（４．６×３００ｍｍ）カラムを用いて分離した。カラムに１０μｇの物質を負荷し、２５ｍＭのリン酸ナトリウム ３００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）の移動相で０．５ｍｌ／分の流速で３０分間溶出させた。２００〜５００ｎｍでデータを取得し、２２０ｎｍプロフィールを報告した。
モノクローナル抗体をｐＨ５、６、７および８のバッファー中、０．５ｍｇ／ｍｌで製剤化した。このバッファーは、ｐＨ５、６、７および８のそれぞれについて、１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび１０ｍＭの酢酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、およびＴＲＩＳを含むものであった。ＨＰ−ＳＥＣを使用し、時間ゼロおよび４５℃で１週間（ｗｅａｋ）後での物質の純度を特性評価した。安定性の結果を以下の表１３にまとめる。図１８は、時間ゼロでのＳＥＣプロフィールを示す。図中の囲みの表示は、高次凝集塊（ＨＯＡ）、オリゴマー、単量体、およびクリッピングタンパク質のおよその溶出時間を画定している。
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結晶座標
実施例１０で論考した結晶構造の座標を表１４に示す（完全長ＰＣＳＫ９およびＡＸ１３２ Ｆａｂ）。
表１４：ＰＣＳＫ９およびＡＸ１３２ Ｆａｂ複合体のｘ線構造
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配列
ＶＨの配列表
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ＶＫの配列表
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ＶＨ−ＣＤＲ１の配列表
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ＶＨ−ＣＤＲ２の配列表
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ＶＨ−ＣＤＲ３の配列表
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ＶＫ＿ＣＤＲ１の配列表
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ＶＫ＿ＣＤＲ２の配列表
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ＶＫ＿ＣＤＲ３の配列表
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Claims (25)

  1. （ａ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域（ここで、
    （ｉ）ＣＤＲ１配列は、配列番号：１８３〜１８９、１９１、１９３、１９５、１９７〜２９４、ならびに配列番号：１８３、１８５、１８７、１８９、１９３および１９７〜２９４の残基４〜１３からなる群より選択され；
    （ｉｉ）ＣＤＲ２配列は、配列番号：６４〜６８、７０，７２、７４、７６〜１８２ならびに配列番号：６４、６６、６８、７２および７６〜１８２の残基４〜２０からなる群より選択され；
    （ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列は、配列番号：１〜５、７、９、１１、１３〜６３、ならびに配列番号：１、３、５、９および１３〜６３の残基４〜１２からなる群より選択される）、および／または
    （ｂ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域（ここで、
    （ｉ）ＣＤＲ１配列は、配列番号：３４７〜３４９、３５１、３５３〜３５９、ならびに配列番号：３４７、３４９および３５３〜３５９の残基４〜１４からなる群より選択され；
    （ｉｉ）ＣＤＲ２配列は、配列番号：３３５〜３３９、３４１、３４３〜３４６ならびに配列番号：３３５、３３７、３３９および３４３〜３４６の残基４〜１０からなる群より選択され；
    （ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列は、配列番号：２９５〜３０１、３０３、３０５〜３３４、ならびに配列番号：２９５、２９７、２９９、３０１および３０５〜３３４の残基４〜１３からなる群より選択される）
    を含み；
    細胞内ＬＤＬ取込みのヒトＰＣＳＫ９依存性阻害を少なくとも１０％阻害する、
    単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
  2. （ａ）それぞれ配列番号：５８３、５８４、５８５および５８６である重鎖フレームワーク（ＦＲ）配列１、２、３および４；および／または
    （ｂ）それぞれ配列番号：５８７、５８８、５８９および５９０である軽鎖ＦＲ配列１、２、３および４
    を含むフレームワーク（ＦＲ）１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の配列を、連続的に順に有する重鎖領域および／または軽鎖領域を含む、請求項１に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
  3. （ａ）（ｉ）配列番号：１８９のＣＤＲ１配列；
    （ｉｉ）配列番号：６８のＣＤＲ２配列；および
    （ｉｉｉ）配列番号：５のＣＤＲ３配列
    を含む重鎖可変領域；ならびに
    （ｂ）（ｉ）配列番号：３４９のＣＤＲ１配列；
    （ｉｉ）配列番号：３３９のＣＤＲ２配列；および
    （ｉｉｉ）配列番号：３０１のＣＤＲ３配列
    を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項１に記載のＰＣＳＫ−９特異的アンタゴニスト。
  4. （ａ）配列番号：３６０〜５１０からなる群より選択される配列を含む重鎖可変領域および／または
    （ｂ）配列番号：５１１〜５４９からなる群より選択される配列を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項１に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
  5. （ａ）配列番号：３６０または配列番号：３６１を含む重鎖可変領域；および
    （ｂ）配列番号：５１１を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項４に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
  6. （ａ）配列番号：３６２または配列番号：３６３を含む重鎖可変領域；および
    （ｂ）配列番号：５１１を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項４に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
  7. （ａ）配列番号：５５２、５６２、５５６および５６４からなる群より選択される配列を含む重鎖；および／または
    （ｂ）配列番号：５５４、５５８および５６６からなる群より選択される配列を含む軽鎖
    を含む、請求項１に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
  8. （ａ）配列番号：５５６を含む重鎖；および
    （ｂ）配列番号：５５８を含む軽鎖
    を含む、請求項７に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
  9. （ａ）配列番号：５６４を含む重鎖；および
    （ｂ）配列番号：５６６を含む軽鎖
    を含む、請求項７に記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
  10. （ａ）ＰＣＳＫ９について請求項１に記載の抗体と競合し；
    （ｂ）配列番号：５７６〜５８２および２３７〜ＲＤＡからなる群より選択される１つ以上の配列内のＰＣＳＫ９に特異的に結合し；
    細胞内ＬＤＬ取込みのヒトＰＣＳＫ９依存性阻害を少なくとも１０％阻害する、
    単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
  11. ＰＣＳＫ９上の以下の残基：Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｗ１５６、Ｎ１５７、Ｌ１５８、Ｄ１９２、Ｈ１９３、Ｒ１９４、Ｅ１９５、Ｉ１９６、Ｅ１９７、Ｇ１９８、Ｒ１９９、Ｓ２２１、Ｈ２２９、Ｇ２３２、Ｓ２３５、Ｇ２３６、Ｒ２３７、Ｄ２３８、Ａ２３９、Ｇ２４０、Ｋ２４３、Ｇ２４４、Ｄ３６７、Ｉ３６８、Ｉ３６９、Ｇ３７０、Ａ３７１、Ｓ３７２、Ｓ３７３、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｓ３７６、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３８０、Ｓ３８１から１０Å以下以内でＰＣＳＫ９に結合する単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
  12. ＰＣＳＫ９上の以下の残基：Ｓ１５３、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｅ１９５、Ｒ２３７、Ｄ２３８、Ａ２３９、Ｉ３６９、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｓ３７６、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９から５Å以下以内でＰＣＳＫ９に結合する単離されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
  13. ヒトＰＣＳＫ９に５ｎＭ未満のＫＤで結合する、請求項１〜１２のいずれかに記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
  14. 細胞内ＬＤＬ取込みのＰＣＳＫ９の阻害を１００ｎＭ未満のＩＣ５０でアンタゴナイズする、請求項１〜１２のいずれかに記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
  15. 細胞内取込みのＰＣＳＫ９の阻害を少なくとも５０％アンタゴナイズする、請求項１〜１２のいずれかに記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
  16. 抗体分子である、請求項１〜１２のいずれかに記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニスト。
  17. 請求項１〜１６のいずれかに記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストおよび薬学的に許容され得る担体を含む組成物。
  18. 請求項１〜１６のいずれかに記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを投与することを含む、ＰＣＳＫ９機能をアンタゴナイズする方法。
  19. ＰＣＳＫ９機能によって引き起こされる、および／または増悪する障害、病状または疾患を改善するための医薬の製造における請求項１〜１６のいずれかに記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの使用。
  20. 請求項１〜１６のいずれかに記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストをコードする単離された核酸。
  21. 請求項２０に記載の核酸を含むベクター。
  22. 請求項２０に記載の核酸を含む、インビトロまたはインサイチュの単離された宿主細胞または宿主細胞集団。
  23. （ａ）請求項２２に記載の細胞（１つまたは複数）を、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの生成に適切な条件下で培養すること；および
    （ｂ）生成されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを単離すること
    を含む、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの作製方法。
  24. （ａ）請求項２１に記載のベクターを細胞内に挿入すること；ここで、該ベクターはファージ外被タンパク質ＰＩＩＩまたはｐＶＩＩＩリーダー配列を含む；
    （ｂ）該細胞をＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの生成に適切な条件下で培養すること；
    （ｃ）生成されたＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを、温和な溶解条件を用いたペリプラズム抽出によって単離すること
    を含む、ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストの作製方法。
  25. 請求項１〜１６のいずれかに記載のＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを含む、インビトロまたはインサイチュの単離された宿主細胞または宿主細胞集団。
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